CN113925877A - 基因增强型免疫细胞在肺癌中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了基因增强型免疫细胞在肺癌中的应用，属于免疫学技术领域。本发明所提供的基因增强型免疫细胞为转染lnc‑AL592494.1的siRNA的NK细胞。本发明所提供的NK细胞具有更强的增殖能力，并且对于肺癌细胞具有更强的杀伤活性。

Description

基因增强型免疫细胞在肺癌中的应用
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，尤其涉及一种基因增强型免疫细胞在肺癌中的应用。
背景技术
自然杀伤细胞（NK细胞）是20世纪70年代由Rolf Kiessling 和 Ronald Heberman发现的一种机体内主要的天然免疫系统淋巴细胞，作为与T细胞、B细胞并列的一大类淋巴细胞群体，是天然免疫系统的重要成员。NK细胞在抵抗外来病原菌的感染和清楚恶化的癌细胞中发挥了重要作用。NK在识别和杀伤肿瘤细胞中无需抗原致敏和MHC的限制，并且可以分泌多种细胞因子和趋化因子，调节免疫应答，因此NK在肿瘤的细胞免疫治疗中具有重要的作用。
肺癌是我国最常见的恶性肿瘤，肺癌的是全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。据统计每年大约有180万人被诊断为肺癌，并且有大约160w人死于肺癌。因此，利用免疫疗法来实现肺癌的有效治疗具有重要意义。目前，NK细胞存在着扩增困难和杀伤能力不足的缺点，因此有效的解决这两个缺点可以有效的提高NK细胞在肺癌治疗中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基因增强型免疫细胞在肺癌中的应用。
首先，本发明提供了基因增强型免疫细胞在肺癌治疗中的应用，所述基因增强型免疫细胞为转染lnc-AL592494.1的siRNA的NK细胞。
优选地，所述lnc-AL592494.1的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述lnc-AL592494.1的siRNA的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
其次，本发明提供了lnc-AL592494.1的siRNA在制备促进NK细胞杀伤活性药物中的应用，所述lnc-AL592494.1的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
其次，本发明提供了lnc-AL592494.1的siRNA在制备促进NK细胞增殖增强剂中的应用，所述lnc-AL592494.1的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述lnc-AL592494.1的siRNA的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
最后，本发明提供了lnc-AL592494.1的siRNA在制备促进NK细胞GraB和PFP蛋白表达增强剂中的应用，所述lnc-AL592494.1的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述lnc-AL592494.1的siRNA的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
本发明的有益效果是：
当使用本发明所提供的lnc-AL592494.1的siRNA转染NK细胞时，可以有效的提高NK细胞的增殖能力，并且可以有效的增强NK的杀伤活力，因此可以将转染si-lnc-AL592494.1的基因增强NK细胞用于治疗肺癌患者。
附图说明
图1为si-lnc-AL592494.1 的抑制效果的检测结果；
图2为si-lnc-AL592494.1对于NK细胞的增殖促进效果的检测结果；
图3为si-lnc-AL592494.1对于NK细胞的GraB和PFP的蛋白表达促进效果的检测结果；
图4为si-lnc-AL592494.1对于NK细胞对于肺癌细胞的杀伤活性的促进效果的检测效果。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
实施例1
lnc-AL592494.1的siRNA促进NK细胞增殖
（1）根据lnc-AL592494.1的cDNA序列SEQ ID NO.1去设计lnc-AL592494.1的siRNA，设计的si-lnc-AL592494.1的序列如下：
si-lnc-AL592494.1的正义链序列为：AUUACAUAUGUAACAAUAC，SEQ ID NO.2；
si-lnc-AL592494.1的反义链序列为：GUAUUGUUACAUAUGUAAU，SEQ ID NO.3；
（2）将si-NC和si- lnc-AL592494.1转染至NK-92细胞中，
（3）转染48h之后，提取RNA，检测lnc-AL592494.1的表达情况，引物序列如下：
上游引物：TCACGCATTCATGATTCACTGA，SEQ ID NO.4；
下游引物：TTGCTGGCCTATGGAATGCA,SEQ ID NO.5；
（4）将转染之后的NK细胞制备成细胞悬液接种于细胞培养板中，每孔500个，si-NC和si- lnc-AL592494.1分别设置5个复孔；
（5）培养72h后，使用MTT检测各孔的吸光度。
实验结果
si-lnc-AL592494.1的抑制效果如图1所示，从图中可以看出本发明所提供的si-lnc-AL592494.1能够有效的抑制lnc-AL592494.1的表达。
MTT检测结果如图2所示，从图中可以看出转染si-lnc-AL592494.1后，NK-92细胞的增殖能力加强（转染si-NC的细胞OD值为0.654±0.035，转染si-lnc-AL592494.1的细胞OD值为0.896±0.023）。
实施例2
lnc-AL592494.1的siRNA促进NK细胞的GraB（颗粒酶B）和PFP（穿孔素）表达
1.蛋白提取
（1）收集转染48后的NK细胞至离心管中，离心去除培养基，PBS清洗后，加入蛋白裂解液；
（2）充分裂解30min之后，将离心管置于离心机中离心，吸取上清于新的离心管中；
（3）参照BCA蛋白浓度检测试剂盒的说明书检测蛋白的浓度，加入上样缓冲液调整为统一浓度，之后将蛋白样品放入到沸水中煮5min，得到最终的蛋白样品；
2.Western blot检测
（1）配置电泳胶，安装电泳架，进行蛋白样品和蛋白Marker点样，打开电泳仪调整为恒压90V进行电泳；
（2）电泳25min之后，电泳仪调整为130V，直至溴酚蓝跑出电泳胶；
（3）电泳结束后，将电泳胶取出，组装电转夹，调整电转仪的参数为恒流250mA；
（4）电转1.5h后，将膜取出置于5%的脱脂奶粉中，封闭1h后，使用TBST洗膜3次，孵育GraB和PFP一抗，置于4℃孵育过夜；
（5）孵育结束后，回收一抗，孵育相应的二抗，孵育1h后，TBST洗膜后，进行显影。
Western Blot的检测结果如图2所示，从图中可以看出，转染si-lnc-AL592494.1后，NK-92细胞中的GraB和PFP的表达水平明显高于对照组，说明转染si-lnc-AL592494.1可以通过增加GraB和PFP的表达来增强NK细胞的杀伤能力。
实施例3
lnc-AL592494.1的siRNA促进NK细胞对于肺癌细胞A549的杀伤活性
（1）将转染si-NC和si-lnc-AL592494.1的NK细胞配制成2×106/ml的细胞悬液，作为效应细胞；
（2）将肺癌A549细胞配成2×105/ml的细胞悬液，作为靶细胞；
（3）将1.5ml的A549细胞分别和1.5ml的si-NC细胞和1.5ml的si-lnc-AL592494.1细胞混合；
（4）同时设置效应细胞及靶细胞自然释放孔，靶细胞最大释放孔及培养基自然释放孔；
（4）混合之后，将细胞置于细胞培养箱中培养4h，之后置于离心机中离心10min，收集上清；
（5）结束后，每孔吸50ulLDH酶反应液和50ul上清液加入到96孔板中，室温避光反应30min后，加入反应终止液50ul，使用酶标仪检测OD值；
（7）计算杀伤活性：
杀伤活性=（测定的OD值-靶细胞自然释放OD值-效应细胞自然释放OD值）/（靶细胞最大释放OD值-靶细胞自然释放OD值）×100%。
实验结果如图4所示，转染si-NC的NK细胞的自然杀伤活性为56.51±2.23，转染si-lnc-AL592494.1的NK细胞的自然杀伤活性为80.44±3.36，说明转染si-lnc-AL592494.1的NK细胞对于肺癌细胞A549的杀伤活性明显增强，从而可以更好的治疗肺癌。
本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述，当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 青岛西凯生物技术有限公司
<120> 基因增强型免疫细胞在肺癌中的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 426
<212> DNA
<213> 人源(Human)
<400> 1
gcagcattaa atagtattgt tacatatgta ataaatctaa cattgtgcta cattattttc 60
taaagtaaat taaaaattaa atagcaaaat cagtttttat aaacaaagtt tttgaacata 120
ataagccaac acataaaaaa taatatacat agttgttgca ggttaatcat gtgattaaaa 180
gtaattttga caatgttatt catgaattat cttcactgac ttcataaaca aattttattg 240
taaaagcata atcacgcatt catgattcac tgagaatcac acagacatta ttattatgac 300
acatgaatca gaagatatgc aagtccaaag aattctccgg tgcattccat aggccagcaa 360
aaacatgact ttgccagctt ctcttacaat ttgtgaatca tacttttgaa tgccaataaa 420
tctcaa 426
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
auuacauaug uaacaauac 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
guauuguuac auauguaau 19
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcacgcattc atgattcact ga 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttgctggcct atggaatgca 20

Claims (9)

1.基因增强型免疫细胞在肺癌治疗中的应用，其特征在于，所述基因增强型免疫细胞为转染lnc-AL592494.1的siRNA的NK细胞。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述lnc-AL592494.1的cDNA序列如SEQ IDNO.1所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述lnc-AL592494.1的siRNA的序列如SEQID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
4. lnc-AL592494.1的siRNA在制备促进NK细胞杀伤活性药物中的应用，特征在于，所述lnc-AL592494.1的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。
6. lnc-AL592494.1的siRNA在制备促进NK细胞增殖增强剂中的应用，其特征在于，所述lnc-AL592494.1的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述lnc-AL592494.1的siRNA的序列如SEQID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
8. lnc-AL592494.1的siRNA在制备促进NK细胞GraB和PFP蛋白表达增强剂中的应用，其特征在于，所述lnc-AL592494.1的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述lnc-AL592494.1的siRNA的序列如SEQID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
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