CN108220422B - 组蛋白去甲基化酶在筛选治疗脂肪肝及其相关疾病药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了组蛋白去甲基化酶在筛选治疗脂肪肝及其相关疾病药物中的应用。以人正常肝细胞L02细胞系、组蛋白去甲基化酶KDM5C过表达的L02细胞系以及KDM5C(CRISPR‑Cas9)敲除的L02细胞系为实验对象，通过棕榈酸、油酸联合诱导的脂肪肝细胞模型来研究KDM5C基因的功能。研究发现，当KDM5C过表达时，PA+OA刺激诱导的L02细胞脂质累积显著增多；当KDM5C表达下降时，PA+OA刺激诱导的L02细胞脂质累积显著减少，即KDM5C基因的表达能够促进脂肪肝及其相关疾病的发生发展。基于KDM5C在恶化脂肪肝中的功能，其为研制预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物提供靶标。

Description

组蛋白去甲基化酶在筛选治疗脂肪肝及其相关疾病药物中的 应用
技术领域
本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种组蛋白去甲基化酶(lysine(K)demethylase 5C,KDM5C)作为药物靶标在筛选治疗脂肪肝药物中的应用,以及KDM5C的抑制剂在制备治疗脂肪肝药物中的应用。
背景技术
随着居民生活水平的日益提升，脂肪肝的发病率也在逐年上升，脂肪肝是以肝细胞内脂肪过度沉积为特征的临床病理综合征。临床上根据患者是否有过量饮酒史可将其分为酒精性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝病，其中酒精性脂肪肝患者的比例为5％而非酒精性脂肪性肝病患者占绝大多数并呈逐年上升趋势。非酒精性脂肪肝病是一种进展性疾病，最终可发展为原发性肝癌。原发性肝癌的发生发展是一个复杂的过程，常涉及到一些基因调控、信号通过等生命过程[1,2]，而基因的调控常与表观遗传有关，组蛋白甲基化是表观遗传的重要领域之一。有研究表明[3]，组蛋白甲基化异常可导致基因错误表达导致发育异常、代谢紊乱甚至肿瘤发生。
KDM5C是一种组蛋白去甲基化酶，可催化H3K4me3/me2去甲基化而转换为H3K4me2/me1[4]。KDM5C通过降低H3K4三甲基化水平使基因转录处于非活化状态[5]。研究表明，KDM5C在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等多种肿瘤组织中有高表达并参与抑癌基因表达的调控[6-9]。然而KDM5C在肝细胞中的作用目前仍不清楚。
参考文献
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发明内容
为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种组蛋白去甲基化酶KDM5C基因的表达与脂肪肝及相关疾病之间的相互关系，提供KDM5C基因作为靶基因在筛选治疗脂肪肝及其相关疾病的新用途，进而把KDM5C基因应用于脂肪肝及相关疾病的治疗。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明以人正常肝细胞L02细胞系、KDM5C过表达的L02细胞系以及KDM5C(CRISPR-Cas9)敲除的L02细胞系为实验对象，通过棕榈酸、油酸联合诱导的脂肪肝细胞模型来研究KDM5C基因的功能。研究发现，当KDM5C过表达时，PA+OA刺激诱导的L02细胞脂质累积显著增多；当KDM5C表达下降时，PA+OA刺激诱导的L02细胞脂质累积显著减少，即KDM5C基因的表达能够促进脂肪肝及其相关疾病的发生发展。
因此，KDM5C基因可作为药物靶点，构建KDM5C基因过表达的体外细胞模型或动物模型，用于筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝病的药物；KDM5C基因也可作为基因治疗中的靶基因，设计并制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝病的药物和/或生物学试剂，通过基因工程技术达到预防、缓解和/或治疗脂肪肝病的目的。例如以KDM5C为靶基因，设计可干扰KDM5C表达的双链siRNA，通过化学方法合成以后，注射入人体通过RNA干扰的方法使KDM5C基因沉默来治疗脂肪肝病；还可以设计并构建KDM5C的突变体，注射后进入细胞，竞争KDM5C原形的作用底物，从而抑制KDM5C的功能，起到治疗目的；此外，还可以以KDM5C为靶点设计小分子化合物抑制剂，利用KDM5C基因过表达的体外细胞模型或动物模型，通过筛选，发现其中能够特异性抑制KDM5C的分子，从而为脂肪肝病的治疗提供新的治疗性分子。
针对KDM5C的上述功能，
本发明第一方面，提供组蛋白去甲基化酶KDM5C作为药物靶标在筛选保护肝脏的药物中的应用。
本发明第二方面，提供组蛋白去甲基化酶KDM5C作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病药物中的应用。
优选地，所述的预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病药物是抑制组蛋白去甲基化酶KDM5C表达的药物。
本发明第三方面，提供组蛋白去甲基化酶KDM5C的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病药物中的应用。
所述的KDM5C的抑制剂优选为KDM5C基因的siRNA、KDM5C基因的RNA干扰载体，KDM5C的抗体及其他能够抑制KDM5C表达的抑制剂。
所述脂肪肝及相关疾病包括但不限于：胰岛素抵抗、代谢综合征、肥胖、糖尿病、高血糖、高血脂症、单纯性肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎，肝纤维化、肝硬化、肝癌等。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明发现KDM5C的新功能，即KDM5C具有恶化脂肪肝病的作用。
(2)基于KDM5C在恶化脂肪肝中的功能，其为研制预防、缓解和/或治疗脂肪肝病的药物提供靶标。
(3)KDM5C的抑制剂可用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝病的药物。
附图说明
图1是KDM5C敲低及过表达的L02稳定转染细胞系鉴定。
图2是正常L02细胞(L02)和KDM5C-KO L02细胞油红O染色结果图。
图3是空载L02(Vector L02)细胞和KDM5C-TG L02细胞油红O染色结果图。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
以下实施例所用化学试剂都是常规试剂，均可商购获得。未做特殊说明的实验方法都是采用本领域已知的常规方法。
实验细胞及培养
人肝脏细胞系L02购自中国科学院细胞库(目录号GNHu6)，人胚肾HEK293T细胞购自美国菌种保藏中心(American type culture collection，ATCC)。上述细胞均采用DMEM高糖培养基(含10％FBS，1％青霉素-链霉素)置于5％CO2的37℃恒温细胞专用培养箱培养，实验用细胞培养时间不超过三个月，每三个月进行一次支原体检测。细胞冻存采用含10％DMSO的FBS冻存。
WB详细操作过程：
1)细胞中蛋白提取
细胞加入裂解液，裂解完成后离心取上清，运用BCA Protein Assay Kit定量收集蛋白样品。
3)上样与电泳
配置好电泳凝胶，并在电泳槽内加入电泳液。把蛋白样品上样到SDS-PAGE胶加样孔内，点样完成后开始电泳。
4)转膜
①配制转膜液，于4℃预冷。
②取出凝胶板中的凝胶，用转膜液洗涤凝胶，将凝胶平铺在负极的滤纸上，将Nc膜覆盖其上，夹上夹板。
③将夹板入转膜槽中，灌满转膜液以淹没凝胶。
④转膜槽接通电源，转膜条件为：恒流0.4A，2h。
⑤转移结束后，取出Nc膜。
5)封闭
把蛋白膜放置到预先准备好的TBST中，洗去膜上的转膜液。蛋白膜放入封闭液中，在摇床上缓慢摇动，室温封闭1h。
6)孵育一抗
①用TBST洗涤蛋白膜3次，每次5min。
②封口机将薄膜封入杂交袋中，加上一抗。
③将杂交袋放入4℃摇床中，过夜。
7)孵育二抗
①将薄膜取出用TBST洗涤3次，每次5min，回收一抗。
②将膜放入对应的加有二抗(北京博奥龙免疫技术有限公司，BF03008/BF03008X)的稀释液中，避光孵育1h。
8)蛋白检测
孵育后用TBST洗涤3次，每次5min。利用ECL+显影仪检测目的条带。
油红O染色操作流程：
取出细胞观察状态，密度。密度在50％左右最好→吸出培养基，加PBS漂洗3次，洗净后尽量吸干PBS→4％多聚甲醛固定10-15min(甲醛固定时间可以延长，无影响，6孔板每孔1-1.5ml)→固定结束后，吸弃甲醛。加入PBS漂洗3次，每次3分钟，使用平动的摇床→准备60％异丙醇,异丙醇：PBS＝3:2(异丙醇最好是专用的，保证无杂质污染)→加入60％异丙醇作用30s→可选步骤：用PBS洗3次→超净台内吹干水分，水分完全干透后，皿底呈白色→准备油红O的工作液，RedOil：PBS＝3：2配制，6孔板每孔200-400μl,油红配置好后室温静置10min,然后用0.45μm滤器过滤，即可使用→吹干后加工作液，悬空加入皿底，不要对壁吹入，否则很难洗干净，影响观察，滴加速度稍快尽量保持操作工作一致。染色过程中及时观察，达到要求后吸弃染色液→用PBS洗3次，(若染色结束后液面会有一层漂浮物，尽量吸掉该漂浮物，避免该漂浮物沉积在皿底或者皿壁，可选用60％异丙醇分化后用PBS洗3次)→加PBS浸润拍照观察，不同倍数视野各拍数张。
稳定转染细胞系的构建及表达量检测
1.过表达phage-KDM5C质粒构建：
1)PCR扩增KDM5C基因，引物为：
正向：5’-tagcaagcttagatggagccggggtccgacga-3’；
反向；5’-gacggtcgaccaactgttgctgaggcgg-3’；
2)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后使用DNA凝胶回收试剂盒(天根)进行DNA片段的回收；
3)将所得DNA产物和载体质粒用限制性内切核酸酶酶切，置于37℃条件下反应。使用
Figure BDA0001540812510000061
AxyPrepTMPCR Clean-Up Kit(Axygen)回收酶切产物；
4)使用Ligation High进行连接反应，16℃，3h；
5)制作大肠杆菌感受态细胞，将上述连接产物进行转化实验，涂板，置于37℃培养箱，过夜培养；
6)从37℃培养箱中取出过夜培养的平板，挑克隆摇菌，并检测菌落PCR阳性克隆；
7)将PCR鉴定为阳性的菌液吸取5-10μl接种至5ml LB(含抗性)培养基中，在220rpm，37℃摇床中过夜培养；
8)取出过夜培养的菌液，对已经混浊的菌液进行质粒提取(天根质粒DNA小提试剂盒)；
9)提取后的质粒可直接用于L02瞬时转染或构建慢病毒稳定转染细胞系。
2.KDM5C-KO(CRISPR Cas9)干扰质粒构建，购于上海复旦大学。
3.慢病毒载体的包装及生产
3.1慢病毒的培养
1)选用的是293T细胞，6孔板(可获得大量病毒悬液)，转染试剂为Lipofectamine2000(Invitrogen).
2)第一天：待293T的密度达到60％左右(比普通转染质粒时密度大)，共转染，一般目的质粒3孔，空载2孔，留1孔正常细胞作对照。每孔转染2.4μgDNA(1.2μg目的质粒+0.6μgpsPAX2+0.6μg pMD2.G)，共转空载(目的质粒的空载+psPAX2(Addgene，12260)+pMD2.G(Addgene，12259))作为对照。
3)第二天：转染后6-8h后换液，此步骤不可省略。
3.2慢病毒的收集
在转染48h后，可以收集293T细胞悬液，并用0.45μm的滤膜过滤(不可低于此孔径)，收集滤液，病毒即在滤液中。24h后可再次收集一次病毒。收集后的病毒可放在-80℃一个月，用的时候需放在冰上慢融。(注意：此处碰过病毒的枪头，滤器都要用84浸泡杀掉病毒后才能扔掉)
3.3细胞的感染
将病毒液与待感染细胞(和普通转染密度一致)培养基混合，混合比率取决于病毒滴度和细胞承受能力(一般用六孔板，每孔600μl病毒液)，并随后加入聚凝胺(8mg/ml)，使其终浓度为8μg/ml(2ml+0.5ml＝2.5ml,即加2.5μl聚凝胺)。混匀后，常温，3000rpm，离心1.5h(离心时做好保护，防污染)。感染后最快6-8h即可换液，终止感染，若细胞承受力强，最长可持续感染24h。建议感染24h后，再感染一次。
3.4加药筛细胞
感染48h后，将六孔板每孔的细胞分别传部分到大皿中(293T大概是20/1,U2OS是10/1，正常细胞不用传)，剩下的细胞可用于WB验证是否转染成功。待12h贴壁后，开始加药嘌呤霉素(一般细胞的耐药浓度是2ug/ml，最低致死浓度是未转染的正常完全死亡，而转染过的无死亡最小药物浓度)，一般加药24-36h后就可以看到细胞的死亡。
3.5挑细胞单克隆
待大皿中的细胞长成单克隆，选用滤纸或者小枪头挑单克隆，到24孔板中，培养基中加药。
3.6单克隆的扩大培养
待24孔板中的细胞长得差不多了，将细胞转移到6孔板中，6孔板的细胞生长良好时，可收部分做WB验证表达量的大小。将表达量高的细胞冻存。
3.7相关药品的配置
1)聚凝胺：用灭菌超纯水溶解后，配成浓度8mg/mL，0.22um滤膜过滤，存于4℃，可稳定保存一年；
2)嘌呤霉素：用灭菌超纯水溶解后，配成浓度2mg/mL，0.22um滤膜过滤，分装存于-20℃。
【实施例1】建立KDM5C过表达的L02稳定转染细胞系
根据实施方式中L02过表达稳转细胞系建立的步骤，建立KDM5C过表达的L02稳转细胞系。之后收集细胞，WB验证KDM5C的表达情况。WB结果如图1所示，与对照组细胞对比，KDM5C-TG L02细胞中KDM5C的蛋白表达量显著升高，说明稳定转染细胞系构建有效。
【实施例2】KDM5C敲低对肝细胞脂肪堆积的影响
1.实验细胞分组：正常L02细胞、KDM5C-KO L02细胞各分为2组，即正常L02细胞对照组、KDM5C-KO L02细胞对照组、正常L02细胞实验组、KDM5C-KOL02细胞实验组。
2.脂肪肝细胞模型的建立与检测：待细胞贴壁，细胞密度为30％左右时，分别向两个实验组中加入棕榈酸酯(palmitate，PA)及油酸(oleic acid，OA)(PA0.2mM+OA 0.4mM)进行刺激，对照组中加入同等量的BSA，12h后收集各组细胞样品，进行油红O染色。
油红O染色结果如图2所示，对照组细胞无明显红色脂肪滴，而当加入PA+OA刺激后，被油红O染红的细胞面积相比于对照组显著增多。两个实验组中，与正常L02细胞实验组相比较，KDM5C-KO L02细胞实验组的红色脂肪滴面积显著减少。以上结果说明，敲低KDM5C基因的表达可有效抑制PA+OA联合诱导产生的肝细胞脂质沉积。
【实施例3】KDM5C基因过表达对肝细胞脂肪堆积的影响
1.实验细胞分组：Vector L02细胞、KDM5C-TG L02细胞各分为2组：VectorL02细胞对照组、KDM5C-TG L02细胞对照组、Vector L02细胞实验组、KDM5C-TG L02细胞实验组。
2.脂肪肝细胞模型的建立与检测：待细胞贴壁，细胞密度达30％左右时，分别向两个实验组中加入PA及油酸OA(PA 0.2mM+OA 0.4mM)进行刺激，对照组中加入等量的BSA，12h后进行油红O染色，染色步骤如实例2所述。
油红O染色结果如图3所示，对照组细胞无明显红色脂肪滴，而当加入PA+OA刺激后，被油红O染红的脂肪滴相比于对照组显著增多，且KDM5C-TG L02细胞实验组着色面积的增加程度比Vector L02细胞实验组大。该结果说明，KDM5C基因的过表达可加剧PA+OA联合刺激产生的肝细胞脂质沉积。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 组蛋白去甲基化酶在筛选治疗脂肪肝及其相关疾病药物中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tagcaagctt agatggagcc ggggtccgac ga 32
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacggtcgac caactgttgc tgaggcgg 28

Claims (2)

1.人的组蛋白去甲基化酶KDM5C作为药物靶标在筛选药物中的应用，其特征在于，所述药物是预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的药物，所述药物是抑制组蛋白去甲基化酶KDM5C表达的药物，所述的药物具有抑制肝脏脂质沉积的功能。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制组蛋白去甲基化酶KDM5C表达的药物为KDM5C基因的siRNA、KDM5C基因的RNA干扰载体。
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