CN108866099A - 特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体及其构建方法 - Google Patents

特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异性抑制肺腺癌细胞miRNA‑21‑5p表达的重组慢病毒载体，包括plvx‑shRNA2‑Puro病毒载体的基本序列、Zsgreen1绿色荧光基因序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和Hsa‑miRNA‑21‑5p干扰基因序列；所述多克隆位点序列包括EcoRI酶切位点和BamH I酶切位点；所述Hsa‑miRNA‑21‑5p干扰基因序列包括EcoR I酶切位点和BamH I酶切位点，正向插入所述多克隆位点序列中。本发明属于基因工程技术领域，本发明提供的重组慢病毒载体的转染效率高，能特异、持续、高效、稳定地抑制人肺腺癌细胞A549中miRNA‑21‑5p的表达。

Description

特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体 及其构建方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体及其构建方法。
背景技术
肺癌是严重影响人类健康、发病率居高不下且异质性极高的恶性肿瘤，根据WHO统计显示，每年约有160万人罹患肺癌，接近四分之一的癌症死亡与其相关。其中，肺腺癌占非小细胞肺癌的比例非常大，且不同于鳞状细胞肺癌及大多数与吸烟有关的肺癌病例，肺腺癌在非吸烟者中发病率亦很高。SET作为在多种肿瘤细胞中转录及表达水平发生变化的原癌基因，对生物体内多种生理过程有关键的调控作用，SET蛋白(蛋白磷酸酶2抑制剂)是一种癌蛋白，在许多肿瘤中均表达异常。
miRNA是一类进化保守的内源性的非编码小分子，普遍存在于多样性生物体内参与基因调控。miRNA主要调控着编码蛋白的基因表达，其作用机制是降解与其互补结合的mRNA或抑制不完全配对的mRNA翻译，具有非常重要的生物学作用。对miRNA进行Tud(ToughDecoy)处理得到TudmiRNA，通常可以提高miRNA的抑制效果，但是实际应用中，由于TudmiRNA的结构较复杂，使表达TudmiRNA的重组载体构建难度较大。
徐驰等在《肿瘤学杂志》发表了题为“miRNA-145抑制肺癌细胞系A549迁移侵袭的研究”的论文，发现mi RNA-145的过表达能够抑制肺癌细胞系A549的迁移、侵袭和克隆形成,由此提示miRNA-145有可能成为肺癌治疗的潜在靶点。杨伟等人在《江苏医药》发表了题为“miR-21慢病毒干扰载体的构建及其对胆管癌细胞增殖和迁移能力的影响”的论文，根据人miRNA-21-5p的基因序列，制备出下调miRNA-21-5p的双链DNA oligo，设计包含目的基因序列和酶切位点的互补序列，将形成的带粘性末端的双链DNA连接至GV159载体中构建得到慢病毒干扰载体并在胆管癌细胞中表达，但其稳定转染细胞中miRNA-21表达量仅下调至0.54倍左右，干扰调控效果有待提高，该载体对于miRNA-21-5p在细胞中的功能研究作用仍不够理想。
现有技术中，尚未发现可在人源肺腺癌细胞中持续、稳定且高效抑制miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体及其构建方法，该重组慢病毒载体的转染效率高，能特异、持续、高效、稳定地抑制人肺腺癌细胞A549中miRNA-21-5p的表达，miRNA-21-5p表达量下调至0.25倍左右，干扰调控效果明显优于现有技术，进而对SET基因和SET蛋白的表达起到高效的调控作用。
通过miRNA靶基因预测软件查找发现：能与SET基因3’-UTR互补结合的miRNAs包括miRNA-20a、miRNA-21、miRNA-23a、miRNA-29b、miRNA-129、miRNA-194、miRNA-199b等。在预测分析的基础上，本发明进一步通过试验确定了以人肺腺癌细胞A549为人源细胞，选取plvx-shRNA2-Puro病毒载体作为慢病毒载体，选取miRNA-21-5p作为目的基因，设计如SEQID NO：1的序列作为干扰基因序列(引入了EcoR I酶切位点和BamH I酶切位点)，由通用生物系统有限公司根据发明人的设计思路合成多克隆位点中含有正向插入SEQ ID NO：1序列(Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列)的pUC57载体，保持了Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列的稳定性，将含有Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列的pUC57载体及plvx-shRNA2-Puro病毒载体双酶切后，分别回收Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列与plvx-shRNA2-Puro病毒载体长片段，通过T4DNA连接酶连接得到重组慢病毒载体，并可特异性抑制肺腺癌细胞A549miRNA-21-5p表达，干扰调控效果好。
本发明提供一种特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体，包括plvx-shRNA2-Puro病毒载体的基本序列、Zsgreen1绿色荧光基因序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列；所述多克隆位点序列包括EcoRI酶切位点和BamH I酶切位点；所述Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列包括EcoR I酶切位点和BamH I酶切位点，正向插入所述多克隆位点序列中。
优选地，所述Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列为：GGACGAGGATCCGGCGCTAGGATCATCAACTCAACATCAGTCATCTTGATAAGCTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCAACATCAGTCATCTTGATAAGCTACAAGATGATCCTAGCGCCACCTTTTTTGAATTCT，即SEQ IDNO：1。本发明基于Tough Decoy技术设计干扰基因序列，其主体框架的示例图如图1所示。其中，核心部分miRNA Bind Sites(MBS)基于miRBase中Has-miR21-5p的序列设计相应的反向互补序列(TCAACATCAGTCTGATAAGCTA，具体如下划线部分所示)，并在距反向互补序列3’端10个碱基处插入ATCT四个碱基以加强对miRNA的干扰效果。
优选地，所述肺腺癌细胞为A549细胞。
优选地，所述plvx-shRNA2-Puro病毒载体购自深圳市博奥康生物科技有限公司。该病毒载体由美国Clontech公司的pLVX-shRNA2表达载体改建得到。
此外，本发明还提供了特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体的构建方法，包括如下步骤：
S1：含Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列的pUC57载体的获得：根据miRNA-21-5p的基因序列，基于Tough Decoy技术设计相应的干扰基因序列，在主体框架的基础上引入EcoR I酶切位点和BamH I酶切位点，合成多克隆位点中含有正向插入的Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列的pUC57载体；
S2：特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体的构建和鉴定：plvx-shRNA2-Puro病毒载体与含Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列的pUC57载体分别经EcoRI和BamH I限制性内切酶双酶切后，分别回收Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列与plvx-shRNA2-Puro病毒载体长片段，T4DNA连接酶连接得到连接产物，将该连接产物转化到感受态大肠杆菌中，均匀涂布到含氨苄青霉素TB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并提取其质粒进行酶切和PCR初步鉴定，对初步鉴定结果显示Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列插入成功的菌液进行测序鉴定；
S3：特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体的抽提：将测序鉴定正确的大肠杆菌培养，使用质粒提取试剂盒抽提，得到特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体。
基于Tough Decoy技术设计干扰基因序列后，由通用生物系统有限公司根据发明人的设计思路合成多克隆位点中含有正向插入SEQ ID NO：1序列(Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列)的pUC57载体。未插入SEQ ID NO：1序列时，pUC57载体图谱如图2所示。通过将设计的干扰基因序列(引入了EcoR I酶切位点和BamH I酶切位点)导入pUC57载体的多克隆位点中，保持了Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列的稳定性，且便于后续的双酶切。
优选地，所述肺腺癌细胞为A549细胞；所述感受态大肠杆菌为JM 109；所述plvx-shRNA2-Puro病毒载体购自深圳市博奥康生物科技有限公司；所述质粒提取试剂盒采用Endo-free Plasmid Maxi Kit。
此外，本发明还提供特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体在制备治疗SET基因或miRNA-21-5p基因表达异常相关疾病的药物中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明选取miRNA-21-5p作为目的基因，选取plvx-shRNA2-Puro病毒载体作为慢病毒载体，基于Tough Decoy技术设计干扰基因序列并插入了加强碱基，通过将设计的干扰基因序列导入pUC57载体的多克隆位点中，保持了Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列的稳定性，且便于后续的双酶切，将含有Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列的pUC57载体及plvx-shRNA2-Puro病毒载体双酶切后，分别回收Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列与plvx-shRNA2-Puro病毒载体长片段，通过T4DNA连接酶提供了一种特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体。该重组慢病毒载体的转染效率高，能特异、持续、高效、稳定地抑制人肺腺癌细胞A549中miRNA-21-5p的表达，miRNA-21-5p表达量下调至0.25倍左右，干扰调控效果明显优于现有技术，进而对SET基因和SET蛋白的表达起到高效的调控作用。此外，本发明还提供了特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体的构建方法，可构建得到重组慢病毒载体，且性能稳定，转染效率高。
附图说明
图1本发明设计的干扰基因序列的主体框架示例图。
图2 pUC57载体的图谱。
图3 QPCR验证三种miRNA在不同肺癌/肺细胞中的表达结果。
图4 plvx-shRNA2-Puro病毒载体的图谱。
图5本发明实施例二中酶切鉴定凝胶电泳图。
图6本发明实施例二中Hsa-miRNA-21-5p干扰基因重组质粒的测序结果图。
图7本发明实施例三中病毒上清感染293T细胞后的荧光显微镜图；其中7-1指明视野，7-2指暗视野。
图8本发明实施例四中实时荧光定量PCR检测miR-21-5p相对表达结果图；其中，A549-C指未感染的对照组，A549-Tud21指经含有miR-21-5p结合位点重组慢病毒载体感染的A549细胞，而A549-N指经过空白慢病毒载体感染的A549细胞。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明中所用到的材料可通过常规市售得到或通过本领域的常规方法得到。如：A549细胞购自ATCC，plvx-shRNA2-Puro病毒载体购自深圳市博奥康生物科技有限公司，Rneasy Mini Kit试剂盒和逆转录试剂盒购自德国QIAGEN公司，Endo-free Plasmid MaxiKit购自美国Omega公司，病毒包装辅助试剂盒Lipofectamine 2000购自美国ThermoFisher Scientific公司，T4DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司。
实施例一 Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列的设计和获得
通过Target Scan等miRNA靶基因预测软件查找发现：能与SET基因3’-UTR互补结合的miRNAs包括miRNA-20a、miRNA-21、miRNA-23a、miRNA-29b、miRNA-129、miRNA-194、miRNA-199b等。在预测分析的基础上，优选出miR-21-5p、miR-23a-3p及miR-199b-5p作为目的基因的筛选对象，经过QPCR对包括肺腺癌细胞A549，肺鳞癌细胞NCIH520、SW900以及正常肺细胞BEAS2B的筛选发现miR-21-5p在肺腺癌细胞A549中的表达量无论相对于鳞癌细胞或正常肺细胞而言均差异显著，如图3所示，提示其为A549中特异性高表达的miRNA，确定了以人肺腺癌细胞A549为人源细胞，选取miRNA-21-5p作为靶基因位点。
基于Tough Decoy技术设计干扰基因序列，其主体框架的示例图如图1所示。其中，核心部分miRNA Bind Sites(MBS)基于miRBase中Has-miR21-5p的序列设计相应的反向互补序列(具体如下划线部分所示)，并在距反向互补序列3’端10个碱基处插入ATCT四个碱基以加强其对miRNA的干扰能力。设计干扰基因序列后，由通用生物系统有限公司合成并正向插入pUC57载体的多克隆位点中，合成得到含Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列的pUC57载体。未插入SEQ ID NO：1序列时，pUC57载体的图谱如图2所示。含Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列的pUC57载体由通用生物系统有限公司根据发明人的设计思路合成得到。含Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列的pUC57载体经EcoR I和BamH I双酶切后，可获得Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列：
GGACGAGGATCCGGCGCTAGGATCATCAACTCAACATCAGTCATCTTGATAAGCTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCAACATCAGTCATCTTGATAAGCTACAAGATGATCCTAGCGCCACCTTTTTTGAATTCT，即SEQ IDNO：1。
实施例二 特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体的获得
plvx-shRNA2-Puro经深圳博奥康生物科技有限公司改造插入了Zsgreen 1绿色荧光基因，便于后期通过荧光显微镜观察慢病毒载体转染效果，plvx-shRNA2-Puro病毒载体的图谱如图4所示。plvx-shRNA2-Puro病毒载体和所述含Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列的pUC57载体分别经EcoR I和BamH I限制性内切酶双酶切后，分别回收Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列与plvx-shRNA2-Puro病毒载体长片段，用T4DNA连接酶连接得到连接产物。酶切反应体系如表1所示，DNA连接酶体系如表2所示。
表1 酶切反应体系
表2 DNA连接酶体系
将该连接产物转化到感受态大肠杆菌JM 109中，均匀涂布到含氨苄青霉素TB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并提取其质粒进行酶切，琼脂糖凝胶电泳初步鉴定，回收Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列(简称为Tud21)，结果如图5所示，结果说明菌落PCR鉴定结果为阳性，可用于挑取质粒进行扩大培养。初步鉴定结果说明Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列插入成功的菌液进行测序鉴定，结果如图6所示，与预期相符。培养测序鉴定正确的大肠杆菌，并使用Endo-free Plasmid Maxi Kit进行抽提，得到含Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列的重组慢病毒载体。
实施例三 转染重组慢病毒载体进行病毒包装
培养293T细胞，取实施例二抽提的重组慢病毒载体转染293T细胞，按照病毒包装辅助试剂盒Lipofectamine 2000操作说明书进行操作，48h后在荧光显微镜下观察到病毒感染效果如图7所示。从图7可知，病毒上清的感染效率很高，观察结束后收集Hsa-miRNA-21-5p干扰基因病毒上清，4000g离心12min后取上清，计算出病毒的滴度为1×108TU/mL。
实施例四 Hsa-miRNA-21-5p干扰基因重组慢病毒载体的病毒上清感染效果的检测
分别用含Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列的病毒上清以及空白慢病毒载体感染A549细胞，将感染成功的A549细胞、空白慢病毒载体感染的A549细胞和未感染的正常A549细胞分别培养2个月后，分别提取总RNA，进行实时荧光定量PCR检测miRNA-21-5p的相对表达情况，结果如图8所示。从图8可知，Hsa-miRNA-21-5p干扰基因重组慢病毒感染A549肺腺癌细胞后的miRNA-21-5p的相对表达量远远低于两个对照组的相对表达量，约为正常A549表达量的0.25倍。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳市疾病预防控制中心（深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所）
<120> 特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体及其构建方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 142
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 1
ggacgaggat ccggcgctag gatcatcaac tcaacatcag tcatcttgat aagctacaag 60
tattctggtc acagaataca actcaacatc agtcatcttg ataagctaca agatgatcct 120
agcgccacct tttttgaatt ct 142

Claims (7)

1.特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体，其特征在于：包括plvx-shRNA2-Puro病毒载体的基本序列、Zsgreen1绿色荧光基因序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列；所述多克隆位点序列包括EcoRI酶切位点和BamH I酶切位点；所述Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列包括EcoR I酶切位点和BamH I酶切位点，正向插入所述多克隆位点序列中。
2.根据权利要求1所述的特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体，其特征在于：所述Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列为：GGACGAGGATCCGGCGCTAGGATCATCAACTCAACATCAGTCATCTTGATAAGCTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCAACATCAGTCATCTTGATAAGCTACAAGATGATCCTAGCGCCACCTTTTTTGAATTCT，即SEQ IDNO：1。
3.根据权利要求1或2所述的特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体，其特征在于：所述肺腺癌细胞为A549细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体，其特征在于：所述plvx-shRNA2-Puro病毒载体购自深圳市博奥康生物科技有限公司。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1：含Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列的pUC57载体的获得：根据miRNA-21-5p的基因序列，基于Tough Decoy技术设计相应的干扰基因序列，在主体框架的基础上引入EcoR I酶切位点和BamH I酶切位点，合成多克隆位点中含有正向插入的Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列的pUC57载体；
S2：特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体的构建和鉴定：plvx-shRNA2-Puro病毒载体与所述含Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列的pUC57载体分别经EcoR I和BamH I限制性内切酶双酶切后，分别回收Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列与plvx-shRNA2-Puro病毒载体长片段，T4DNA连接酶连接得到连接产物，将该连接产物转化到感受态大肠杆菌中，均匀涂布到含氨苄青霉素TB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并提取其质粒进行酶切和PCR初步鉴定，对初步鉴定结果显示Hsa-miRNA-21-5p干扰基因序列插入成功的菌液进行测序鉴定；
S3：特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体的抽提：将测序鉴定正确的大肠杆菌培养，使用质粒提取试剂盒抽提，得到特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体。
6.根据权利要求5所述的特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体的构建方法，其特征在于：所述肺腺癌细胞为A549细胞；所述感受态大肠杆菌为JM 109；所述plvx-shRNA2-Puro病毒载体购自深圳市博奥康生物科技有限公司；所述质粒提取试剂盒采用Endo-free Plasmid Maxi Kit。
7.权利要求1至6中任一项所述的特异性抑制肺腺癌细胞miRNA-21-5p表达的重组慢病毒载体在制备治疗SET基因或miRNA-21-5p基因表达异常相关疾病的药物中的用途。
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