CN109112129B - 用于靶向敲除人OC-2基因的特异性sgRNA及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于靶向敲除人OC‑2基因的特异性sgRNA及应用。本发明以人基因组上OC‑2基因为靶标，设计并通过一系列筛选、分析，获得了能够高效、特异、精准靶向人OC‑2基因的sgRNA分子，如SEQ ID NO.2～4所示。本发明还提供了含有所述的特异性sgRNA的慢病毒载体、慢病毒。同时，本发明也提供了一种利用CRISPR‑Cas9系统敲除人OC‑2基因的方法，可获得稳定的OC‑2基因敲除株。本发明的特异性sgRNA可通过CRISPR/Cas系统阻断卵巢细胞中OC‑2基因的表达，显著抑制卵巢癌细胞的增殖，迁移和侵袭能力，为卵巢癌的研究和临床治疗治疗提供了新的方向和思路，具有良好的应用前景。

Description

用于靶向敲除人OC-2基因的特异性sgRNA及应用

技术领域

本发明属于分子生物学与生物医学技术领域，特别涉及用于靶向敲除人OC-2基因的特异性sgRNA及应用。

背景技术

规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR,Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeats)是在20世纪80年代后期在多种古细菌的基因组上发现的特殊序列，是大多数细菌及古细菌中不断的进化适应的一种免疫防御机制。根据参与作用的Cas蛋白基因的序列和结构特点，CRISPR-Cas系统可分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型三种类型，现在使用的CRISPR/Cas9系统是由最简单的II型CRISPR改造而来的，该系统由单链guide RNA(sgRNA)和一种具有核酸内切酶活性的Cas9蛋白构成。通过Cas9蛋白形成DNA双链的断裂，而细胞通过NHEJ的修复会造成INDEL效应，进而造成基因的移码突变而达到基因敲除的目的。

II型CRISPR/Cas9技术具有强大的基因编辑效率和简单的操作，在编辑各种癌症相关基因时简便快捷。近来许多文献报道了CRISPR/Cas9系统可以破坏一些抗癌基因以加速肿瘤形成或破坏癌基因以抑制肿瘤形成。

ONECUT2(One Cut Homeobox 2,OC-2)是1999年发现的新基因，位于人类基因组第18号染色体，属于ONECUT转录因子家族。它是一种转录因子，其蛋白结构包括一个短片段和不典型结构同源域，能与相应基因的DNA序列结合而激活其表达。OC-2参与肝脏、胰腺、免疫系统、视网膜、神经系统、小肠等不同器官和组织的发育和细胞分化。

虽然CRISPR/Cas9系统是目前基因编辑工具之一，但要应用于特定靶向基因，如何选择合适的序列、并针对该序列进行精心设计并获得高效、特异、精确靶向目标基因的sgRNA是关键，而这也是目前的技术难点之一，这关系到sgRNA是否能够正确结合在目的基因上，是否会脱靶，能否引发Cas9蛋白正确、精确地行使其切割功能，将直接影响CRISPR/Cas9系统对目标基因的特异性敲除。切割成功后，蛋白确实没有表达，还是存在部分表达，是敲低还是敲除，这对实验的成功带来了比较大的困难。

目前，尚未见成功通过CRISPR/Cas9系统对ONECUT2实现精确敲除的报道。

发明内容

本发明的第一目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供用于靶向敲除人OC-2基因的特异性sgRNA。所述的特异性sgRNA能够高效地靶向人OC-2基因，尤其是卵巢癌细胞OC-2基因，并可通过CRISPR/Cas系统阻断卵巢细胞中OC-2基因的表达，从而抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移。

本发明的第二目的在于提供一种CRISPR/Cas慢病毒载体。

本发明的第三目的在于提供一种慢病毒。

本发明的第四目的在于提供一种利用CRISPR-Cas9系统敲除人OC-2基因的方法，构建了CRISPR/Cas-sgRNA表达系统，实现了人OC-2基因的特异性敲除。

本发明的第五目的在于提供所述的特异性sgRNA或CRISPR/Cas慢病毒载体的应用。通过对本发明得到的OC-2基因细胞敲除株进行功能分析，发现敲除OC-2基因后可以显著抑制肿瘤的生长，从而为卵巢癌的研究和临床治疗治疗提供了新的方向和思路。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明参考CRISPR/Cas9系统sgRNA的设计原则，成功选取了OC-2基因的CDS的合适序列进行sgRNA设计，获得了三个sgRNA，并以LentiCRISPRv2为表达载体，构建了CRISPR/Cas9-sgRNA表达系统，实现对靶序列的精确切割。通过筛选和一系列分析验证，最终筛选出高效的sgRNA，并在卵巢癌细胞株SKOV3和CAOV3细胞株中筛选出了OC-2基因敲除株。

用于靶向敲除人OC-2基因的特异性sgRNA，所述的sgRNA在人OC-2基因上的靶序列符合5'-N(20)-NGG3'或5'CCN-N(20)-3'的序列排列规则，在人OC-2基因上的靶序列是唯一的，所述sgRNA在人OC-2基因的靶向位点位于人OC-2基因的1号外显子上。所述sgRNA指导的CRISPR/Cas系统能够显著抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力。

所述的sgRNA对应的核苷酸序列优选自如下任意一条序列：

(1)sgRNA#1(SEQ ID NO.2)：

ACTTTGCACGGGCCGGCCGG；

(2)sgRNA#2(SEQ ID NO.3)：

TTTGGTGAGGCATCGATAGG；

(3)sgRNA#3(SEQ ID NO.4)：

GTCTTTGGTGAGGCATCGAT。

基于序列SEQ ID NO.2～4合成的双链寡核苷酸(SEQ ID NO.5～10)能与OC-2基因靶位点进行特异性结合，从而引导Cas蛋白(如Cas9蛋白)对DNA双链进行切割，进而使DNA双链进行断裂，而细胞通过NHEJ的修复会造成INDEL效应，进而造成基因的移码突变而达到基因敲除的目的。

一种CRISPR/Cas慢病毒载体，含有所述的靶向敲除人OC-2基因的特异性sgRNA。

所述的CRISPR/Cas慢病毒载体优选由慢病毒载体lentiCRISPR经BsmBI酶切后，连入带BsmBI粘性末端的OC-2基因的特异性sgRNA重组得到。所述的特异性sgRNA对应的DNA序列优选如SEQ ID NO.2～4任意一条所示。

所述的慢病毒载体lentiCRISPR优选为lentiCRISPRv2。

一种慢病毒，含有所述的CRISPR/Cas慢病毒载体。

所述的慢病毒优选由辅助质粒psPAX2和pMD2G帮助所述的CRISPR/Cas慢病毒载体在细胞中包装而获得。

一种利用CRISPR-Cas9系统敲除人OC-2基因的方法，包括如下步骤：

(1)在所述的特异性sgRNA的5'端加上CACCG得到正向寡核苷酸；同时根据特异性sgRNA获得其对应的DNA互补链，并且在其5'端加上AAAC得到反向寡核苷酸；分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性，退火，形成双链；

(2)将步骤(1)得到的双链与Cas载体连接，得到重组表达载体；

(3)将步骤(2)得到的重组表达载体与包装系统共转染包装细胞，收获病毒后纯化、浓缩，达到病毒颗粒；

(4)将步骤(3)制得的病毒颗粒感染细胞，筛选稳转细胞，得到成功敲除OC-2基因的细胞。

步骤(2)中所述的Cas载体优选Cas9载体，进一步优选为lentiCRISPRv2载体。

步骤(3)中所述的包装细胞优选为293T细胞。

步骤(3)中所述的包装系统中的包装载体优选为psPAX2和/或pMD2G。

步骤(4)中所述病毒颗粒为至少一种含有所述的特异性sgRNA的病毒颗粒，也即至少一种由含有所述的特异性sgRNA的重组表达载体转染包装细胞后得到的病毒颗粒，具体来说，可以为含有相同的特异性sgRNA的重组表达载体转染包装细胞后得到的病毒颗粒，例如，含有sgRNA#1的病毒颗粒、含有sgRNA#2的病毒颗粒或含有sgRNA#3的病毒颗粒中的一种实施后续的细胞感染；也可以是含有sgRNA#1的病毒颗粒、含有sgRNA#2的病毒颗粒和含有sgRNA#3的病毒颗粒中的至少两种病毒颗粒，对细胞进行混合感染，进一步增强敲除效率。

优选为含有sgRNA#1的病毒颗粒，或者含有sgRNA#1的病毒颗粒、含有sgRNA#2的病毒颗粒和含有sgRNA#3的病毒颗粒按体积比1:1:1实施混合感染。

步骤(4)中所述的细胞优选为卵巢癌细胞，进一步优选为人卵巢癌细胞株SKOV3或CAOV3。

通过所述的利用CRISPR-Cas9系统敲除人OC-2基因的方法得到的OC-2基因敲除细胞株。

所述的细胞株敲除位点基本都位于ATG起始密码子下游50～300bp处。

所述的OC-2基因敲除细胞株优选为本发明得到的命名为SKOV3-O1D5，SKOV3-X-B10，CAOV3-G4和CAOV3-H8的OC-2基因敲除细胞株。

所述的用于靶向敲除人OC-2基因的特异性sgRNA、所述的CRISPR/Cas慢病毒载体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

所述癌细胞为卵巢癌细胞，优选为人卵巢癌细胞株SKOV3或CAOV3。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.如何选取OC-2基因的CDS的合适序列进行sgRNA的设计是最重要的，也是目前CRISPR-Cas技术的难点，这关系到sgRNA能否稳定结合在目的序列上，sgRNA脱靶效率，能否实现对靶序列的精确切割具有重要意义，也是实验成败的重要环节。本发明基于CRISPR/Cas9系统，成功以人基因组上OC-2基因为靶标，获得了高效、特异、精准靶向人OC-2基因的sgRNA分子，能够靶向卵巢癌细胞内OC-2基因，从而引导Cas9蛋白对OC-2基因的特异性切割，最终达到敲除OC-2基因的目的。

2.在体外实验中，通过本发明的构建的CRISPR/Cas-sgRNA表达系统敲除OC-2能够显著降低卵巢癌细胞的增殖，迁移和侵袭能力。因此，以OC-2基因为切入点有望为卵巢癌的研究和临床治疗治疗提供了新的方向和思路，本发明的特异性sgRNA、所述的CRISPR/Cas慢病毒载体可以用于制备治疗卵巢癌的药物，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是将本发明设计的3个sgRNA连接到LentiCRISPRv2质粒构建慢病毒载体的示意图。

图2是LentiCRISPRv2重组质粒EcoRV酶切验证的琼脂糖凝胶电泳结果图；其中，泳道1为1000DNA ladder marker，泳道2～5为连接了sgRNA#1的LentiCRISPRv2的重组质粒通过EcoRV酶切后的条带，6～9为连接了sgRNA#2的LentiCRISPRv2的重组质粒通过EcoRV酶切后的条带，10～13为连接了sgRNA#3的LentiCRISPRv2的重组质粒通过EcoRV酶切后的条带。

图3是Cruiser^TM酶验证不同sgRNA切割效率的结果；其中，图A是正常单克隆细胞基因组DNA扩增目的片段，泳道1为DL1000Ladder Marker，泳道2～4扩增的目的片段(3次重复实验)；图B是用琼脂糖凝胶电泳验证不同sgRNA切割效率结果图，其中，泳道2为sgRNA#2的酶切结果，泳道3为sgRNA#3的酶切结果，泳道4为sgRNA#1的酶切结果，泳道5为sgRNA#1,#2,#3混合后的酶切结果。

图4是验证单克隆细胞OC-2蛋白表达量的Western blot结果图；其中，图A为Western blot验证OC-2蛋白表达量；图B是SKOV3组细胞OC-2表达量灰度分析；图C是CAOV3组细胞OC-2表达量灰度分析。

图5是实施例8中不同单克隆细胞株的序列测定结果图。

图6是CCK-8法检测敲除OC-2后卵巢癌细胞在不同时间点的细胞活性结果分析图；其中，图A是SKOV3细胞敲除株在24h，48h，72h的细胞活性，图B是CAOV3细胞敲除株在24h，48h，72h的细胞活性。

图7是Transwell实验检测敲除OC-2后卵巢癌细胞的迁移能力的结果图；图A为敲除OC-2基因后SKOV3组和CAOV3组细胞迁移数目，图B是敲除OC-2基因后SKOV3组和CAOV3组细胞迁移抑制率统计分析结果。

图8是划痕实验检测敲除OC-2基因对卵巢癌细胞SKOV3和CAOV3迁移能力的影响的结果图；图A是敲除OC-2基因对SKOV3组细胞和CAOV3组细胞迁移距离的影响(24h)，图B为敲除OC-2基因后SKOV3组和CAOV3组细胞迁移抑制率统计分析。

图9是侵袭实验检测敲除OC-2基因对卵巢癌细胞SKOV3和CAOV3侵袭能力的影响结果图；图A为敲除OC-2基因后SKOV3组和CAOV3组细胞迁移数目，图B敲除OC-2基因后SKOV3组和CAOV3组细胞迁移抑制率统计分析。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1CRISPR/Cas9基因敲除载体构建

1.靶向人OC-2基因的sgRNA的选择和设计

在NCBI数据库中对OC-2基因的CDS区序列进行分析，确定待敲除位点，最后确定敲除位点为OC-2基因的1号外显子。通过sgRNA在线设计网站(http://crispr.mit.edu/)设计针对ONECUT2基因的1号外显子序列3个评分较高的特异性sgRNA，并对sgRNA的脱靶效率进行评估。

1号外显子序列如下(SEQ ID NO.1)：

ATGAAGGCTGCCTACACCGCCTATCGATGCCTCACCAAAGACCTAGAAGGCTGCGCCATGAACCCGGAGCTGACAATGGAAAGTCTGGGCACTTTGCACGGGCCGGCCGGCGGCGGCAGTGGCGGGGGCGGCGGCGGGGGCGGCGGGGGCGGCGGCGGGGGCCCGGGCCATGAGCAGGAGCTGCTGGCCAGCCCCAGCCCCCAC……

sgRNA#1(SEQ ID NO.2)：

ACTTTGCACGGGCCGGCCGG

sgRNA#2(SEQ ID NO.3)：

TTTGGTGAGGCATCGATAGG

sgRNA#3(SEQ ID NO.4)：

GTCTTTGGTGAGGCATCGAT

将设计的三条sgRNA转化成与其自身互补的双链结构，并添加BsmBI酶切位点，进行碱基序列合成。sgRNA序列添加完酶切位点后由上海生工(上海)有限公司合成。

SgRNA#1 5’-----CACCGACTTTGCACGGGCCGGCCGG---------3’

3’-----CTGAAACGTGCCCGGCCGGCCCAAA------5’

SgRNA#2 5’------CACCGTTTGGTGAGGCATCGATAGG----------3’

3’-----CAAACCACTCCGTAGCTATCCCAAA------5’

SgRNA#3 5’-----CACCGGTCTTTGGTGAGGCATCGAT------------3’

3’-----CCAGAAACCACTCCGTAGCTACAAA------5’

2.LentiCRISPRv2-sgRNA基因敲除载体的构建

将合成的双链sgRNA与经过BsmBI酶切后的LentiCRISPRv2载体进行连接。

LentiCRISPRv2-sgRNA基因敲除载体构建连接示意图如图1所示：

(1)用BsmBI酶切5μg LentiCRISPRv2质粒(购买自Addgene)，37℃，30min。

表1

(2)磷酸化和寡核苷酸链退火。

表2

P4连接酶缓冲液含有ATP，PNK酶没有ATP。

表3退火程序

(3)稀释步骤(2)的退火引物，用DEPC水按照1:100的比例进行稀释。

(4)建立连接反应和室温孵化10min。

表4

阴性对照(用水代替寡核苷酸引物和载体相连)

(5)转化进感受态Stbl3菌株(暨南大学生命科学技术学院石智教授实验室馈赠)，筛选阳性克隆。

①将连接的目的基因加入50μL Stbl3感受态细胞，并用指尖轻弹管壁上下颠倒混匀，然后冰上静置30～35min。

②42℃的水浴45s，迅速将感受态细胞放回冰上并静置90s。

③加入650μL LB液体培养基，然后放入恒温摇床，185rpm摇1h。

④将上述步骤③的菌液用离心机(3000rpm)离心1～2min，吸去菌液上清，然后加入100μL LB液体培养基轻轻吹打重悬菌液沉淀并涂布到氨苄LB固体培养基平板上。

⑤将涂布好的平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

3.LentiCRISPRv2重组载体酶切验证

在上述的LB固体培养基平板上挑取单克隆，摇菌，提取质粒进行酶切验证。将提取出的质粒DNA应用微量蛋白核酸检测仪进行OD260/280测量DNA的纯度，并用琼脂糖凝胶电泳法进行验证，然后将重组质粒进行扩增后，进行EcoRV酶切验证。Vector NTI 11.5.2软件分析可知EcoRV酶切LentiCRISPRv2重组质粒时，两条带大小分别为2144bp和10844bp。琼脂糖凝胶电泳进行验证，发现条带大小和理论相符(图2)，成功构建得到包含上述3条sgRNA的LentiCRISPRv2重组质粒，然后将提取的无内毒素质粒DNA放入-20℃冰箱中进行保存。

实施例2细胞培养

人卵巢癌细胞株SKOV3、CAOV3、人胚肾上皮细胞(293T)，均购买自ATCC菌种中心。细胞用含10％FBS的DMEM培养基(Gibco公司)培养，所述的培养基中加入青霉素和链霉素(Invitrogen公司)，其终浓度分别为100U/mL和100μg/mL，培养于37℃二氧化碳培养箱。

实施例3慢病毒包装

将处于对数生长期的人源293T细胞，进行胰酶消化后，最终制备成单细胞悬液。对细胞进行计数(重复三次)，用DMEM完全培养基将细胞浓度调整为5×10⁴个/mL。将293T细胞接种于100mm的细胞培养皿里，加入7mL DMEM完全培养基进行培养。

在转染前一天，将293T细胞培养液替换成DMEM基础培养基(未添加双抗)进行饥饿培养。核心质粒(LentiCRISPRv2重组质粒)4μg、psPAX2(购买自Addgene)3μg、pMD2G(购买自Addgene)1μg、转染试剂(FuGENE6)24μL补充DMEM基础培养基(未添加双抗)配制成总体积为200μL转染体系，在37℃细胞培养箱孵育30min后，逐滴加入到几乎完全贴壁且汇聚率达50％～60％的293T细胞培养皿里。6～8h后，吸取培养皿中的培养基，加入7mL DMEM完全培养基，开始计时，分别在24h，48h，72h连收3次病毒原液。将病毒原液置于100KD的超滤柱内，4℃，4000g离心30min后，收集滤膜内剩余约250～300μL病毒浓缩液，50μL每管分装于1.5mLEP管内，置于-80℃可长期保存，避免反复冻融。

实施例4细胞株基因组DNA序列检测

将包含不同sgRNA的慢病毒去感染卵巢癌SKOV3细胞：将装有慢病毒的1.5mL EP管从-80℃冰箱取出，置于冰上，使其缓慢解冻。然后将聚凝胺(polybrene)从-20℃取出，冰上融化，并轻轻混匀，将其加入六孔板中，使其终浓度为8μg/mL。将加入polybrene的六孔板轻轻“∞”字混匀，放入37℃培养箱中孵育30min。待30min后，将解冻的600μL的病毒原液缓慢滴入六板孔中，轻轻混匀，24h换为DMEM完全培养基(10％FBS)，48h后换为用嘌呤霉素筛选。设置对照组，待对照组内细胞全部死亡后，将存活的细胞嘌呤霉素浓度减半并维持两个星期。有限稀释法获得单克隆细胞，提取单克隆细胞基因组DNA。

根据北京擎科新业生物有限公司DNA提取试剂盒说明书操作来提取细胞基因组DNA。

(1)通过胰蛋白酶消化收集细胞：计算细胞数目，吸净细胞培养液，用PBS缓冲液洗涤细胞1次，加入终浓度为0.25％的胰蛋白酶，当细胞从培养瓶上脱落后收集所需体积细胞，300×g离心5min，小心将上清完全吸弃，切勿吸走细胞沉淀。

(2)将核酸纯化柱置于收集管中，加入250μL Buffer BL，12,000g离心1.5min，活化硅胶膜。

(3)加入20μL的蛋白酶K至1.5mL离心管底部，然后加入200μL高纯水悬浮的细胞沉淀，涡旋振荡10s；再加入250μL的Buffer gA1，涡旋振荡10～15s，56℃孵育0.5h，期间震荡3～5次。

(4)随后加入200μL的无水乙醇，快速振荡使其充分混匀。

(5)将步骤(4)所得溶液全部转入核酸纯化柱中，12,000g离心1.5min，弃去收集管中的废液。

(6)向核酸纯化柱中加入500μL的PW缓冲液，12,000g离心1min，弃去收集管中的废液。

(7)重复步骤(6)一次。

(8)向核酸纯化柱中加入500μL的清洗缓冲液，12,500g离心1min，弃去收集管中的废液。

实施例5Cruiser^TM酶验证sgRNA酶切效率

将提取的单克隆细胞基因组DNA进行PCR反应，扩增OC-2基因片段，OC-2扩增目的片段大小为525bp(图3A)。

(1)向PCR反应管中加入CruiserTM核酸酶和5×Cruiser^TM缓冲液，总体积为10μL，用移液器吹打混匀，此步骤应置于冰上操作。具体酶切体系如表5所示：

表5

(2)将处理组(慢病毒感染细胞株的OC-2基因片段)和对照组(正常细胞株OC-2基因片段)置于PCR仪中45℃反应20min左右。

(3)酶切反应结束后，在上述10μL反应体系中加入2μL终止缓冲液，随后进行琼脂糖电泳检测酶切效率。

结果发现分别包含sgRNA#2和sgRNA#3的慢病毒切割目的片段突变位点的能力显著弱于包含sgRNA#1的慢病毒。而将分别包含sgRNA#1，sgRNA#2和sgRNA#3的三种慢病毒按体积比1：1：1混合起来后对目的片段的切割能力相对sgRNA#1效率略微提升。因此混合感染也可以作为一种敲除手段来增强敲除效率(图3B)。

实施例6将筛选到的含高效sgRNA的慢病毒去感染卵巢癌细胞

用包含sgRNA#1/sgRNA#1，2，3(三者混合配比为体积比为1:1:1)的慢病毒去感染卵巢癌SKOV3和CAOV3细胞株，然后通过嘌呤霉素筛选，有限稀释挑选单克隆细胞。将单克隆细胞进行扩大培养，以便提取总蛋白进行验证。

实施例7Western Blot检测对单克隆细胞OC-2蛋白的敲除效果

(1)收集扩大后的单克隆细胞，通过Western Blot鉴定OC-2蛋白的表达量。

(2)将样品蛋白裂解液进行SDS-PAGE电泳。

(3)电泳完成后取出分离胶，将海绵、滤纸(3层)、分离胶、已用甲醇活化的PVDF膜、滤纸(3层)、海绵依次叠放于转膜板负极面(黑色面)上，排除气泡。

(4)在冰浴条件下以100V恒压转膜60min，取出PVDF膜，用含5％脱脂奶粉的1×PBST 37℃封闭2h，1×PBST洗膜3次(每次5min)。

(5)一抗孵育：加入以1:1,000体积比稀释的兔抗人OC-2蛋白抗体(Abcam公司，1：1000稀释)，4℃孵育12h。

(6)1×PBST洗膜3次(每次3min)。

(7)二抗孵育：加入以1:5,000体积比稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗(EarthOx公司，1：4000稀释)，37℃孵育1h。

(8)1×PBST洗膜5次(每次3min)。

(9)加入ECL化学发光底物溶液显色(Millipore)，于凝胶成像仪中获取发光图像。

结果如图4所示，其中SKOV3细胞株O1D5和X-B10为由包含sgRNA#1的病毒感染得到，X-G1和X-C1为包含sgRNA#2的病毒感染得到，J-E10由包含SgRNA#1、SgRNA#2和SgRNA#3的病毒按体积比1:1:1混合感染筛选得到；CAOV3细胞株E1，G4，H8，G5，G8均是由包含SgRNA#1、SgRNA#2、SgRNA#3的病毒按照体积比1:1:1混合感染筛选而来。从Western blot验证的结果可以看出SKOV3细胞株O1D5(编号1)以及X-B10(编号3)的OC-2蛋白表达量相对对照组(未敲除细胞株SKOV3,编号6)来说已无表达。对细胞株J-E10(编号2)OC-2蛋白表达量进行灰度分析，结果显示OC-2蛋白表达量下降了97％左右(图4B)。而X-G1(编号4)和X-C1(编号5)则仅下降了45％～50％。

CAOV3细胞株G4(编号1)和H8(编号2)的OC-2蛋白表达量相对于对照组CAOV3(编号5)也已经无表达。而细胞株E1(编号3)，G5(编号4)和G8(编号6)OC-2蛋白表达量分别下降了60％，35％和45％(图4C)。

实施例8OC-2蛋白完全敲除的细胞株进行序列测定

将上述筛选的SKOV3细胞株O1D5和X-B10提取基因组DNA，通过普通PCR扩增OC-2基因敲除位点的片段，然后送至北京擎科新业生物有限公司进行序列测定，并与NCBI的数据库里OC-2基因的序列进行比对。具体步骤如下：

根据北京擎科新业生物有限公司DNA提取试剂盒说明书操作来提取细胞基因组DNA。

(1)通过胰蛋白酶消化收集细胞：计算细胞数目，吸净细胞培养液，用PBS缓冲液洗涤细胞1次，加入终浓度为0.25％的胰蛋白酶，当细胞从培养瓶上脱落后收集所需体积细胞，300×g离心5min，小心将上清完全吸弃，切勿吸走细胞沉淀。

(2)将核酸纯化柱置于收集管中，加入250μL Buffer BL，12,000g离心1.5min，活化硅胶膜。

(3)加入20μL的蛋白酶K至1.5mL离心管底部，然后加入200μL高纯水悬浮的细胞沉淀，涡旋振荡10s；再加入250μL的Buffer gA1，涡旋振荡10～15s，56℃孵育0.5h，期间震荡3～5次。

(4)随后加入200μL的无水乙醇，快速振荡使其充分混匀。

(5)将步骤4所得溶液全部转入核酸纯化柱中，12,000g离心1.5min，弃去收集管中的废液。

(6)向核酸纯化柱中加入500μL的PW缓冲液，12,000g离心1min，弃去收集管中的废液。

(7)重复步骤(6)一次。

(8)向核酸纯化柱中加入500μL的清洗缓冲液，12,500g离心1min，弃去收集管中的废液。

(9)将核酸纯化柱放回收集管中，12,500g离心2.5min，开盖晾干5min。

(10)取出核酸纯化柱，放入一个无菌的1.5mL离心管中，在吸附膜的中央处加入70μL的TE Buffer(最好提前放在65℃水浴锅中，预热5min可以使洗脱效果更佳)，然后12,500g离心2min。将洗脱下来的DNA溶液收集起来，然后放入-20℃，做好记号进行保存。

对于CAOV3细胞株，则挑选G4和H8进行序列测定。

结果如图5所示，测序结果显示，用包含sgRNA#1慢病毒感染SKOV3筛选出的细胞株O1D5在1号外显子区缺失了1个碱基，而细胞株X-B10则在1号外显子区添加了1个碱基，CAOV3细胞株G4和H8，分别在1号外显子区域删除了56bp和221bp，这些DNA序列中的碱基缺失或插入非3的倍数，使翻译的阅读框发生改变，从而导致位点以后的氨基酸序列的错乱变成不同的蛋白或因结构不完整被降解掉，以此达到敲除OC-2蛋白的目的。

实施例9敲除OC-2对卵巢癌细胞活性的影响

将SKOV3和CAOV3细胞敲除株铺到96孔细胞培养板中，接种密度为3×10³个/孔，重复3个孔。以正常组细胞为对照。分别测定卵巢癌细胞株24h、48h和72h时的实验组细胞和对照组细胞的OD₄₅₀值，所述测定方法为：将混合的100μL DMEM(Gibco公司)和10μL CCK8(CellCounting Kit-8，Dojingo公司)加入到每孔中，培养箱孵育1h，在波长450nm处用酶标仪(BioTex)测定OD值，制定生长曲线。

CCK-8检测结果如图6所示，随着时间延长抑制SKOV3和CAOV3基因敲除细胞株细胞的增殖，在72h达到最大程度。SKOV3细胞株X-B10和O1D5增殖最高抑制率分别为达40％和45％(P<0.01)(图6A)，CAOV3细胞敲除株G4和H8最高抑制率为42％和44％(P<0.01)(图6B)。结果表明，OC-2基因被敲除后卵巢癌细胞的增殖会被显著抑制。

实施例10敲除OC-2对卵巢癌细胞迁移能力的影响

1.Transwell细胞迁移实验

(1)Transwell(8μm，BD Biosciences)小室每孔加入200μL SKOV3/CAOV3敲除株细胞(1×10⁵个/mL)，以正常组细胞为对照，小室下室加入含10％胎牛血清的700μL DMEM，37℃培养24h后，用棉签擦去微孔膜上层的和未侵袭人基底膜的细胞，将侵袭至下层面的细胞用75％的酒精进行固定15min，结晶紫染色15min，1×PBS清洗3次，洗去多余的结晶紫。

(2)拍照观察：200倍倒置显微镜下观察，拍照，随机计数5个视野，取均值，计算穿过小室的卵巢癌细胞。

结果如图7所示，结果显示，OC-2基因敲除细胞株穿过小孔的细胞数显著低于正常卵巢癌细胞(P<0.01)。SKOV3组细胞SKOV3，X-B10和O1D5穿过小室的细胞平均数分别为90,50,和40(图7A)。X-B10和O1D5细胞迁移的抑制率分别达到了42％和53％(图7B)(P<0.01)。CAOV3组细胞CAOV3，G4和H8穿过小孔的细胞平均数分别为94，42和35(图7A)。G4和H8细胞迁移的抑制率分别达到了52％和58％(图7B)(P<0.01)。这些结果说明敲除OC-2能显著抑制卵巢癌细胞的迁移能力。

2.划痕试验

(1)SKOV3/CAOV3正常组和敲除组细胞(5×10⁴个/mL)放置于37℃培养箱中继续培养24h，吸出培养基，用无菌10μL小Tip头在每个孔中长满的单层细胞上迅速而轻轻划线，每条划痕宽约1mm。然后用无菌的1×PBS冲洗去掉脱落的细胞，加入含0.5％FBS(Gibco公司)的DMEM培养基(Gibco公司)继续培养，正常组和敲除组各设3个复孔。

(2)拍照观察：随机选取5～6个视野，记录位置并持续观察比较0h、24h正常组和敲除组细胞迁移入划痕的距离，以检测卵巢癌细胞划痕修复速度。

结果如图8所示，结果显示，SKOV3和CAOV3组OC-2基因敲除细胞株迁移距离显著小于对照组细胞。其中SKOV3组细胞X-B10和O1D5细胞迁移抑制率分别为28％(P<0.05)和56％(P<0.01)，CAOV3组细胞G4和H8细胞迁移抑制率为59％和71％(P<0.01)(图8B)。这些结果表明，敲除OC-2基因可以显著抑制卵巢癌细胞的迁移能力。

实施例11敲除OC-2对卵巢癌细胞侵袭能力的影响

(1)先将Matrigel置于4℃中融化过夜，同时将所用Tip头、0.5mL EP管和8μmTranswell小室在冰上预冷30min。

(2)Matrigel胶用预冷的无血清DMEM培养基按1:3稀释备用，所有操作在冰上进行。

(3)每个小室内加入45μL Matrigel胶稀释液(尽量不出现气泡，否则重新铺孔)，先平放于冰上10min，再置于室温15min，最后平放于37℃培养箱30min。

(4)待Matrigel胶凝固后，吸出小室内残余溶液，每孔加入100μL无血清DMEM培养基，37℃孵育30min，吸去培养基(水化基底膜)。

(5)将SKOV3/CAOV3正常组和敲除组细胞消化并制成细胞悬液，调整细胞浓度为2.5×10⁵个/mL。下室加入含10％胎牛血清的DMEM培养基约600μL，上室加入细胞悬液200μL。放置于配套的24孔板上，每组设置3个复孔。

(6)将细胞置于5％CO₂、37℃培养箱中孵育24h。

(7)吸去小室内培养液，用1×PBS洗涤3次；70％乙醇固定20min；0.1％结晶紫染色15～30min；1×PBS冲洗3遍以上；用棉签擦去上室内未迁移的细胞以及Matrigel胶。

(8)显微镜400×视野下随机取5个视野，计数，取平均数作为实验结果。拍照存档。

迁移率＝(敲除组迁移细胞数/正常组迁移细胞数)×100％

结果如图9显示，Transwell结果显示，SKOV3组(SKOV3，X-B10，O1D5)穿过小室的细胞平均数分别为82，43和30个(图9A)。SKOV3组细胞株X-B10，O1D5和J-E10细胞迁移抑制率达到了45％，60％和55％(P<0.01)(图9B)。而CAOV3组细胞(CAOV3，G4，H8)穿过小孔的数目为97，38和24个(图9A)，G4和H8细胞迁移抑制率为57％和70％(P<0.01)(图9B)。这些数据表明，敲除OC-2基因能显著抑制卵巢癌细胞的侵袭能力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 暨南大学

<120> 用于靶向敲除人OC-2基因的特异性sgRNA及应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaaggctg cctacaccgc ctatcgatgc ctcaccaaag acctagaagg ctgcgccatg 60

aacccggagc tgacaatgga aagtctgggc actttgcacg ggccggccgg cggcggcagt 120

ggcgggggcg gcggcggggg cggcgggggc ggcggcgggg gcccgggcca tgagcaggag 180

ctgctggcca gccccagccc ccac 204

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

actttgcacg ggccggccgg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttggtgagg catcgatagg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtctttggtg aggcatcgat 20

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caccgacttt gcacgggccg gccgg 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctgaaacgtg cccggccggc ccaaa 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caccgtttgg tgaggcatcg atagg 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caaaccactc cgtagctatc ccaaa 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caccggtctt tggtgaggca tcgat 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccagaaacca ctccgtagct acaaa 25

Claims (8)

1.用于靶向敲除人OC-2基因的特异性sgRNA，所述的sgRNA在人OC-2基因上的靶序列符合5'-N(20)-NGG3'或5'CCN-N(20)-3'的序列排列规则，在人OC-2基因上的靶序列是唯一的，其特征在于：

所述sgRNA在人OC-2基因的靶向位点位于人OC-2基因的1号外显子上；所述的sgRNA对应的核苷酸序列选自如下情况之一：

(1)为sgRNA#1：

ACTTTGCACGGGCCGGCCGG；

(2)同时包含sgRNA#1，sgRNA#2，sgRNA#3:

sgRNA#1：

ACTTTGCACGGGCCGGCCGG；

sgRNA#2：

TTTGGTGAGGCATCGATAGG；

sgRNA#3：

GTCTTTGGTGAGGCATCGAT。

2.一种CRISPR/Cas慢病毒载体，其特征在于：

含有权利要求1所述的靶向敲除人OC-2基因的特异性sgRNA。

3.根据权利要求2所述的CRISPR/Cas慢病毒载体，其特征在于：

所述的CRISPR/Cas慢病毒载体由慢病毒载体lentiCRISPR经BsmBI酶切后，连入带BsmBI粘性末端的权利要求1所述的靶向敲除人OC-2基因的特异性sgRNA重组得到。

4.一种慢病毒，其特征在于：

含有权利要求2或3任一项所述的CRISPR/Cas慢病毒载体。

5.一种利用CRISPR-Cas9系统在体外培养的细胞中敲除人OC-2基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)在权利要求1所述的特异性sgRNA的5'端加上CACCG得到正向寡核苷酸；同时根据权利要求1所述的特异性sgRNA获得其对应的DNA互补链，并且在其5’端加上AAAC得到反向寡核苷酸；分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性，退火，形成双链；

(2)将步骤(1)得到的双链与Cas载体连接，得到重组表达载体；

(3)将步骤(2)得到的重组表达载体与包装系统共转染包装细胞，收获病毒后纯化、浓缩，得到病毒颗粒；

(4)将步骤(3)制得的病毒颗粒感染细胞，筛选稳定转染的细胞，得到成功敲除OC-2基因的细胞。

6.根据权利要求5所述的利用CRISPR-Cas9系统在体外培养的细胞中敲除人OC-2基因的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的Cas载体为Cas9载体；

步骤(3)中所述的包装细胞为293T细胞；

步骤(3)中所述的包装系统中的包装载体为psPAX2和/或pMD2G；

步骤(4)中所述病毒颗粒为至少一种含有权利要求1所述的特异性sgRNA的病毒颗粒；

步骤(4)中所述的细胞为卵巢癌细胞。

7.根据权利要求6所述的利用CRISPR-Cas9系统在体外培养的细胞中敲除人OC-2基因的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的Cas载体为lentiCRISPRv2载体；

步骤(4)中所述病毒颗粒为含有sgRNA#1的病毒颗粒，或者为含有sgRNA#1的病毒颗粒、含有sgRNA#2的病毒颗粒和含有sgRNA#3的病毒颗粒按1:1:1混合得到的混合物；

步骤(4)中所述的细胞为人卵巢癌细胞株SKOV3或CAOV3。

8.权利要求1所述的用于靶向敲除人OC-2基因的特异性sgRNA或权利要求2～3任一项所述的CRISPR/Cas慢病毒载体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

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