CN113698466B - Ccnd1在制备禽反转录病毒生产增强剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及病毒学领域，具体提供了CCND1在制备禽反转录病毒生产增强剂中的应用，所述的CCND1为细胞周期蛋白D1(G1/S‑specific cyclin‑D1，CCND1),其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，发明人首次建立了CCND1作为禽反转录病毒生产增强剂的制备和使用方法；首次明确了CCND1促进禽反转录病毒复制的机理：CCND1通过调控病毒宿主细胞的周期由G1期向S期转变，并延长S期时间，从而促进反转录病毒的复制。

Description

CCND1在制备禽反转录病毒生产增强剂中的应用
技术领域
本发明涉及病毒学领域，涉及CCND1在制备禽反转录病毒生产增强剂中的应用。
背景技术
反转录病毒(Retrovirus)，又称逆转录病毒，属于RNA病毒中的一类，它们的遗传信息储存在核糖核酸(RNA)上。反转录病毒基因组由两条单链RNA组成，拥有典型反转录病毒基因组结构：5′-LTR-UTR-gag-pol-env-UTR-LTR-3′，分别包括两端非编码区(Uncodingregion，UTR)、中间编码区(gag-pol-env)、5′帽子结构(m7GpppGmp)和3′多聚腺核苷酸尾巴(PolyA)。
禽类反转录病毒中较常见的J亚群禽白血病病毒(ALV-J)和禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)主要临床表现为免疫耐受、高死亡率、生长迟缓和多组织器官出现肿瘤等主要特征。ALV-J和REV感染不仅普遍存在，并且这两种病毒常常同时感染同一个鸡群甚至是同一只鸡。早在刚发现ALV-J之初，自然界就有许多ALV-J与REV共感染病例，并且ALV-J与REV共感染除了水平传播外，还可以垂直传播。由于ALV-J和REV病毒囊膜蛋白的超变性及其自身的免疫逃避能力，尚无有效控制和防治的药物或疫苗，只能通过淘汰感染鸡进行大群净化，但不合理、不科学的净化措施，还会加速病毒的进化和突变，使疾病愈加复杂。
ALV-J和REV具有典型的慢病毒特性，二者复制周期较长，并且在自然感染状态下，病毒载量较低，现有的复制增强剂无法满足相关企业和单位研究人员对ALV-J和REV日益增长的需求，因此如何提高病毒的载量，提供新的复制增强剂成为本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明的发明人针对现有技术存在的空白之处，提供了CCND1在制备禽反转录病毒生产增强剂中的应用，所述的CCND1为细胞周期蛋白D1(G1/S-specific cyclin-D1，CCND1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，发明人首次建立了CCND1作为禽反转录病毒生产增强剂的制备和使用方法；首次明确了CCND1促进禽反转录病毒复制的机理：CCND1通过调控病毒宿主细胞的周期由G1期向S期转变，并延长S期时间，从而促进反转录病毒的复制。
细胞周期(cell cycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段，而间期又分为三期、即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G2期)。其中发明人发现细胞周期蛋白D1(G1/S-specificcyclin-D1，CCND1)是调控细胞从G1期向S期的过渡的关键蛋白，通过大量实验，发明人意外的发现CCND1可以促进禽反转录病毒囊膜蛋白ENV的表达和病毒的复制，在禽反转录病毒生产增强剂中具有广泛的应用前景。
基于上述发现，本发明的具体技术方案是：
CCND1在制备禽反转录病毒生产增强剂中的应用，CCND1为细胞周期蛋白D1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的禽反转录病毒为ALV-J或REV。
在具体的应用过程中，一般采用CCND1过表达载体作为禽反转录病毒生产增强剂；除此之外，还可以采用干扰CCND1的方式来抑制ALV-J的复制；
发明人具体研究过程如下：
反转录病毒的复制必须依赖于宿主细胞，病毒RNA经逆转录酶合成双链DNA，双链DNA被整合酶整合至宿主细胞染色体DNA上形成前病毒，前病毒DNA只能伴随着宿主自身DNA的复制而复制。在细胞有丝分裂过程中，宿主细胞的DNA只能在细胞周期S期进行复制，意味着S期对反转录病毒复制起着关键的影响。CCND1作为细胞周期调控的关键基因，它的主要功能就是促进细胞从G1期向S期进行转变，但现有关于CCND1功能的研究主要停留在其他生物学功能的调控，而其与禽反转录病毒的关联尚未有报道出现。
基于发明人的努力，通过对禽反转录病毒感染细胞后细胞周期状态的检测，利用蛋白组学、western blot、qRT-PCR等大量实验方法，首次发现了禽反转录病毒感染细胞后可上调CCND1的表达；并基于此验证并建立了CCND1作为禽反转录病毒生产增强剂的制备和使用方法；首次明确了CCND1促进禽反转录病毒复制的机理：CCND1通过调控病毒宿主细胞的周期由G1期向S期转变，并延长S期时间，从而促进反转录病毒的复制。
具体步骤获得的：
为检测禽反转录病毒感染细胞后细胞周期状态的变化，对ALV-J(NX0101株，病毒滴度为TCID50＝10-3.8/100μL)感染72h后的DF-1细胞和REV(SNV株，病毒滴度为TCID50＝10-3.4/100μL)感染72h后的DF-1细胞进行流式细胞术检测发现，与正常细胞对比，禽反转录病毒可促进宿主细胞周期由G1期向S期的转变，并延长S期时间。
为筛选到对ALV-J、REV复制起作用的关键功能基因，选用ALV-J和REV分别感染DF-1细胞并维持72h后，进行蛋白组学检测。通过对相关差异的细胞周期蛋白表达的基因进行生物信息学分析及western blot验证发现，与正常细胞对比，CCND1在ALV-J组和REV组中均上调了1.31倍。
为验证CCND1与禽反转录病毒复制的关联，发明人构建了CCND1的过表达载体，该载体对CCND1的碱基序列进行密码子优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，替换了稀有碱基，以提高其表达量；DF-1细胞过表达CCND1重组质粒后，分别接种ALV-J和REV，实验结果显示：过表达CCND1极显著促进细胞周期由G1向S期转变，延长S期持续时间，提高细胞中病毒载量，比另一ALV-J复制增强剂CTHRC1相比显著上调1.37倍；相反，敲低CCND1后，细胞周期由G1向S期转变收到抑制，S期持续时间缩短，ALV-J的病毒载量显著下降。
上述过程的更为具体的步骤如下：
首先，进行真核表达载体的构建，选用pcDNA3.1真核表达质粒，将测序完整无突变的已优化基因序列插入到质粒中，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，然后将构建好的质粒转化进感受态细胞DH5 α中，转化完成后摇菌提取质粒，并测序，测序无误后进行细胞转染；
当DF-1转染CCND1过表达质粒8h后，分别接种ALV-J病毒和REV病毒，维持72h后对细胞周期和病毒的载量进行验证。结果显示：与转染pcDNA3.1空载体组相比，转染过表达CCND1质粒的细胞中，细胞周期由G1向S期转变，延长S期持续时间，G1/S值缩减了1.14倍，ALV-J和REV的病毒载量显著(3倍以上)上调，比另一ALV-J复制增强剂CTHRC1相比显著上调1.37倍，这说明CCND1具有病毒复制依赖性。
干扰CCND1显著抑制ALV-J的复制：
对CCND1促进ALV-J病毒复制的结果进行反向验证——构建dgRNA(CCND1-dgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，通过crispr/cas9技术敲低CCND1的蛋白表达量。将干扰质粒转染细胞，然后分别接种ALV-J和REV，结果发现：干扰CCND1后，细胞周期由G1向S期转变收到抑制，S期持续时间缩短，G1/S值增加了1.26倍，ALV-J和REV的病毒载量显著下调，这再次说明，CCND1是ALV-J复制过程中不可或缺的宿主蛋白。
基于上述实验，发明人发现可以采用CCND1过表达载体作为禽反转录病毒生产增强剂，与现有技术相比，本发明的优点为：
1.发明人发现了禽反转录病毒感染细胞后可上调CCND1的表达，该蛋白可作为禽反转录病毒生产增强剂的应用，收取病毒时与对照组相比，病毒载量增加了3倍以上，比现有ALV-J复制增强剂CTHRC1还要提高1.37倍。
2.建立了CCND1重组质粒促进禽反转录病毒复制的新方法，该方法使CCND1在细胞中可以持续表达，持续促进病毒复制。
3.明确了CCND1促进禽反转录病毒复制的机理：CCND1通过调控病毒宿主细胞的周期由G1期向S期转变，并延长S期时间，从而促进反转录病毒的复制，填补了本领域的空白。
附图说明
图1为禽反转录病毒感染细胞周期检测结果图，
图中A：细胞周期图；B：A图的定量；
图2为蛋白质组学方法筛选到对ALV-J、REV复制起作用的关键功能基因CCND1的示意图，
图中A：相关周期蛋白热力图；B：ALV-J和REV促进CCND1蛋白表达的western blot图；
图3为过表达CCND1显著增加ALV-J和REV载量相关示意图，
图中A：过表达CCND1后细胞周期图；B：A图的定量；C：过表达CCND1后ALV-J env和REV env蛋白表达的western blot图；D：过表达CCND1后ALV-J RNA表达的qRT-PCR图；E：过表达CCND1后REV RNA表达的qRT-PCR图；
图4为干扰表达CCND1显著降低ALV-J和REV载量相关示意图，
图中A：干扰CCND1后细胞周期图；B：A图的定量；C：干扰CCND1后ALV-J env和REVenv蛋白表达的western blot图；D：干扰CCND1后ALV-J RNA表达的qRT-PCR图；E：干扰CCND1后REV RNA表达的qRT-PCR图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例用于解释本发明，而非对本发明的限定。本实施例中除特殊说明外，其他均采用现有技术完成。
实施例1检测禽反转录病毒感染细胞后细胞周期状态的变化
1.细胞的准备：DF-1细胞培养于25cm2细胞培养瓶，经过细胞计数调整细胞密度为0.8×108/孔，分成3个组别，每组3个重复：
组别1，DF-1细胞达到70％融合度时，加入1mL ALV-J NX0101病毒液，维持2h，弃掉毒液，加入含有1％胎牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)培养基，在37℃的5％CO2培养箱内培养维持72h，进行细胞收集。
组别2，DF-1细胞达到70％融合度时，加入1mL REV SNV病毒液，维持2h，弃掉毒液，加入含有1％胎牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)培养基，在37℃的5％CO2培养箱内培养维持72h，进行细胞收集。
组别3，DF-1细胞达到70％融合度时，加入含有1％胎牛血清的DMEM，在37℃的5％CO2培养箱内培养维持72h，进行细胞收集。
2.细胞固定：加入1mL冰浴预冷70％乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定12h。1000g左右离心5min，沉淀细胞。
3.碘化丙啶染色：使用细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(碧云天，中国)进行碘化丙啶染色液的配制，加入到固定好的细胞，并在37℃避光温浴30min，进行流式细胞仪检测。
4.细胞周期检测：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用ModFit分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。
结果如图1所示，与正常组细胞周期G1/S值相比，无论是ALV-J感染组还是REV感染组的细胞周期G1/S值均显著降低并且S期延长，说明禽反转录病毒感染细胞后细胞周期会出现G1/S值减少并且S期延长的现象。
实施例2对感染ALV-J的DF-1细胞和感染REV的DF-1细胞进行蛋白质组学分析
1.细胞的准备：将实施例1中相同分组的同一细胞样本加入细胞裂解液RIPA∶PMSF(100∶1)，收获细胞蛋白。
2.蛋白提取：细胞用胰酶消化后，分别加入4倍体积裂解缓冲液(8M尿素，1％蛋白酶抑制剂，3μM TSA，50mM NAM和2mM EDTA)，超声裂解。4℃，13400×g离心10min，去除细胞碎片，上清液转移至新的离心管，利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。
3.胰酶酶解：蛋白溶液中加入二硫苏糖醇使其终浓度为5mM，56℃还原30min。之后加入碘代乙酰胺使其终浓度为11mM，室温避光孵育15min。最后将样品的尿素浓度稀释至低于2M。以1∶50的质量比例(胰酶∶蛋白)加入胰酶，37℃酶解过夜。再以1∶100的质量比例(胰酶：蛋白)加入胰酶，继续酶解3h。
4.TMT标记：胰酶酶解的肽段用Strata X C18(Phenomenex)除盐后真空冷冻干燥。以0.5M TEA溶解肽段，根据TMT试剂盒操作说明标记肽段。操作简单描述如下：标记试剂解冻后用乙腈溶解，与肽段混合后室温孵育2h，标记后的肽段混合后除盐，真空冷冻干燥。
5.HPLC分级：肽段用高pH反向HPLC分级，色谱柱为Agilent300Extend C18(5μm粒径，4.6mm内径，250mm长)。操作如下：肽段分级梯度为8％-32％乙腈、pH＝9，60min时间分离60个组分，随后肽段合并为18个组分，合并后的组分经真空冷冻干燥后进行后续操作。
6.液相色谱-质谱联用分析：肽段用液相色谱流动相A相溶解后使用EASY-nLC1000超高效液相系统进行分离。流动相A为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；流动相B为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液。液相梯度设置：0-26min，7％-25％B；26-34min，25％-38％B；34-37min，38％-80％B；37-40min，80％B，流速维持在350nL/min。
7.数据库搜索：二级质谱数据使用Maxquant(v1.5.2.8)进行检索。检索参数设置：数据库为UniProt Gallus(29480条序列)，添加了反库以计算随机匹配造成的假阳性率(FDR)，并且在数据库中加入了常见的污染库，用于消除鉴定结果中污染蛋白的影响；酶切方式设置为Trypsin/P；漏切位点数设为2；肽段最小长度设置为7个氨基酸残基；肽段最大修饰数设为5；First search和Main search的一级母离子质量误差容忍度分别设为20ppm和5ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为0.02Da。将半胱氨酸烷基化设置为固定修饰，可变修饰为甲硫氨酸的氧化，蛋白N端的乙酰化。定量方法设置为TMT-10plex，蛋白鉴定、PSM鉴定的FDR都设置为1％。
8.蛋白质组学分析：GO富集分析，蛋白的GO注释被分为3个大类：生物进程、细胞组成、分子功能。费歇尔精确双端检验方法(Fisher′s exact test)被用于检验差异表达蛋白在以鉴定到的蛋白为背景。GO富集检验p-value值小0.05被认为是显著的。聚类分析，基于1.3倍差异蛋白，我们首先收集所用蛋白分组富集到的功能分类信息和对应的富集p-value值，然后筛选出至少在一个蛋白分组中为显著富集(p-value＜0.05)的功能分类。筛选得到的p-value数据矩阵首先经过以-log10的对数变换，然后将变换后的数据矩阵对各功能分类运用Z变换。最后将Z变换后得到的数据集使用分层聚类(欧式距离，平均连接聚类)方法做单边聚类分析。聚类关系使用R语言包ggplots中的函数heatmap.2绘制出的热图进行可视化展示。
通过上述分析，发明人分别在感染ALV-J和感染REV的1.5倍差异细胞周期蛋白中发现了一个在家禽反转录病毒领域尚未有相关功能报道的一个细胞周期相关蛋白“CCND1”，如图2(A)所示，ALV-J感染DF-1细胞和REV感染的DF-1细胞中有8种显着差异表达细胞周期蛋白。组学数据以log2比率输入。暗色表示在DF-1细胞中上调的蛋白质，亮色表示下调的蛋白质。该CCND1核苷酸序列见SEQ ID NO.1，氨基酸序列见SEQ ID NO.2。经比对发现，其与人源CCND1氨基酸序列同源性为85.08％。
9.ALV-J和REV促进CCND1蛋白表达：为了进一步确证ALV-J和REV对CCND1的促进作用，本实施例建立了ALV-J和REV感染的体外细胞模型。通过western blot检测ALV-J或REV感染72h后CCND1表达量的变化：
将ALV-J感染72h和REV感染72h的细胞收获，使用PMSF和RIPA混合物液(100：1)裂解细胞；调整各蛋白样品为均一浓度，加入蛋白上样缓冲液于100℃水中加热5min。样品加入电泳仪，浓缩胶在80V状态下稳压进行，分离胶在110V状态下稳压进行。电泳完成后，将蛋白胶上的蛋白转移到0.22μm PVDF膜上，使用5％脱脂奶粉37℃封闭2h，TBST洗涤后加入一抗37℃孵育1h，TBST洗涤后，加入二抗37℃孵育1h，最后使用Western blot显影仪进行观察，结果如图2B所示，Western blot检测ALV-J感染细胞、REV感染细胞和正常细胞中CCND1蛋白表达量。通过图2B能够说明，ALV-J能够激活细胞内CCND1蛋白的表达。
实施例3过表达CCND1显著增加ALV-J和REV病毒载量
为了明确CCND1的激活能够促进ALV-J和REV复制，本实施例构建了CCND1过表达质粒，通过过表达CCND1，验证CCND1对ALV-J和REV载量的促进作用。
1.构建CCND1过表达质粒。
(1)进行真核表达载体的构建。对CCND1基因进行优化，优化后的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，真核表达载体的构建交由吉玛基因公司采用现有技术完成，本发明选用pcDNA3.1真核表达质粒，将测序完整无突变的CCND1基因序列插入到质粒中，然后将构建好的质粒转化进感受态细胞DH5α中，转化完成后摇菌提取质粒，并测序，测序结果与目的序列完全匹配；
(2)然后将构建的CCND1真核表达质粒转染DF-1细胞；当DF-1瞬时转染CCND1过表达质粒8h，维持72h后收获细胞，提取细胞RNA、裂解细胞蛋白、收获细胞上清，通过流式细胞术和western blot检测转染后细胞周期的变化和CCND1表达量，结果如图3A-C所示，(A)DF-1细胞转染pcDNA3.1-CCND1或对照质粒(pcDNA3.1)后细胞周期的变化；(B)A图的定量，(C)细胞转染pcDNA3.1-CCND1或对照质粒(pcDNA3.1)，通过western blot检测细胞内CCND1蛋白的表达量。
结果显示，过表达CCND1组细胞内CCND1蛋白的表量显著高于对照组，并且过表达CCND1组细胞周期G1/S值显著降低，S期显著延长。
2.过表达CCND1检测对ALV-J和REV复制的影响。
(1)实验分成3个组别，每组3个重复：ALV-J感染组、REV感染组和阴性对照组；
(2)转染前细胞培养于12孔板，确保细胞保持最佳浓度和状态；
(3)试剂复温：X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent、CCND1过表达质粒和稀释液升温至20℃左右，短暂漩涡混匀X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent；
(4)溶液配制：使用Opti-MEM培养基作为稀释液，将CCND1过表达质粒稀释至终浓度为1μg/100μL培养基，轻柔混匀。将含有1μg CCND1过表达质粒的100μL稀释液分别加入无菌离心管中。X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent直接添加到含有稀释DNA的培养基中，质粒DNA和转染试剂的比例为1∶3，在此过程中，枪头切勿接触离心管管壁；使用的稀释剂体积多于100μL；
(5)孵育：转染复合物在20℃左右环境中孵育15min；
(6)转染：培养箱中取出的细胞，无需弃掉原有培养基，转染复合物直接滴加到细胞中；
(7)病毒感染细胞：细胞瞬时转染8h后弃掉原有培养基，使用PBS洗涤3次，每孔加入600mL ALV-J NX0101株毒液或REV SNV株毒液，37℃维持2h后弃掉毒液，加入含有1％胎牛血清的DMEM培养基继续维持72h；
(8)检测ALV-J和REV载量：收获细胞，分别通过qRT-PCR和western blot检测ALV-J和REV载量，结果如图3C-E所示，(C)DF-1细胞转染pcDNA3.1-CCND1或对照质粒(pc DNA3.1)后分别接种ALV-J和REV，维持72h。通过western blot检测细胞内ALV-J env蛋白水平和REVenv蛋白水平的表达量；
结果显示，过表达CCND1组ALV-J env蛋白水平和REV env蛋白水平显著高于对照组。(D-E)DF-1细胞转染pcDNA3.1-CCND1或对照质粒(pcDNA3.1)后分别接种ALV-J和REV，维持72h后提取细胞RNA。通过qRT-PCR检测ALV-J载量，结果显示，过表达CCND1组细胞内ALV-J和REV RNA表达量显著高于对照组。
通过图3C-E证明，与Mock组相比，过表达CCND1能够促进ALV-J和REV载量3倍以上，比现有ALV-J复制增强剂CTHRC1还要提高1.37倍。通过以上结果说明，过表达CCND1能够显著促进ALV-J复制。
实施例4干扰CCND1显著抑制ALV-J和REV的复制
为了明确CCND1的表达量对ALV-J和REV载量的重要性，本实施例构建了CCND1干扰质粒，通过敲低CCND1，验证CCND1对ALV-J复制的重要性。
1.CCND1干扰质粒的构建。
(1)对CCND1促进ALV-J病毒复制的结果通过cripsr/cas9技术进行反向验证，由吉玛公司构建了一条CCND1-dgRNA干扰质粒(靶点1：ACATCAGCTGCTGTGCTGCG；靶点2：AGGAAATCTTGCCATATATG)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(2)将干扰质粒瞬时转染细胞8h，维持72h，收获细胞；
(3)通过流式细胞术、western blot和qRT-PCR分别检测细胞周期的变化及CCND1表达量，结果如图4A-C所示，干扰CCND1组细胞内CCND1蛋白的表量显著低于对照组，并且干扰CCND1组细胞周期G1/S值显著降低，S期显著延长。
图4A-C能够证明：转染CCND1干扰质粒后，能够在细胞中敲低CCND1的表达。因此说明，本实施例构建了良好的CCND1干扰细胞模型，为后续实验明确CCND1是ALV-J复制依赖性蛋白奠定了基础。
2.干扰CCND1检测对ALV-J和REV复制的影响。
(1)实验分成3个组别，每组3个重复：ALV-J感染组、REV感染组和阴性对照组；
(2)转染前细胞培养于12孔板，确保细胞保持最佳浓度和状态；
(3)试剂复温：X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent、CCND1干扰质粒和稀释液升温至20℃左右，短暂漩涡混匀X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent；
(4)溶液配制：使用0pti-MEM培养基作为稀释液，将CCND1干扰质粒稀释至终浓度为1μg/100μL培养基，轻柔混匀。将含有1μg CCND1干扰质粒的100μL稀释液分别加入无菌离心管中。X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent直接添加到含有稀释DNA的培养基中，质粒DNA和转染试剂的比例为1：3，在此过程中，枪头切勿接触离心管管壁；使用的稀释剂体积多于100μL；
(5)孵育：转染复合物在20℃左右环境中孵育15min；
(6)转染：培养箱中取出的细胞，无需弃掉原有培养基，转染复合物直接滴加到细胞中；
(7)病毒感染细胞：细胞瞬时转染8h后弃掉原有培养基，使用PBS洗涤3次，每孔加入600mL ALV-J NX0101株毒液或REV SNV株毒液，37℃维持2h后弃掉毒液，加入含有1％胎牛血清的DMEM培养基继续维持72h；
(8)检测ALV-J和REV载量：收获细胞，分别通过qRT-PCR和western blot检测ALV-J和REV载量，结果如图4C-E所示，(C)DF-1细胞转染CCND1-dgRNA干扰质粒或对照质粒后分别接种ALV-J和REV，维持72h。通过western blot检测细胞内ALV-J env蛋白水平和REV env蛋白水平的表达量，结果显示，干扰CCND1组ALV-J env蛋白水平和REV env蛋白水平显著低于对照组。(D-E)DF-1细胞转染CCND1-dgRNA干扰质粒或对照质粒后分别接种ALV-J和REV，维持72h后提取细胞RNA。通过qRT-PCR检测ALV-J载量，结果显示，过表达CCND1组细胞内ALV-J和REV RNA表达量显著低于对照组。
通过图4C-E证明，敲低CCND1能够抑制ALV-J复制。通过以上结果说明，ALV-J复制需要CCND1的参与；CCND1是ALV-J复制依赖性蛋白。
序列表
<110> 山东农业大学
<120> CCND1在制备禽反转录病毒生产增强剂中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1310
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
ctcagcacta tcccaagact gccagcaaca gcgagttcct ggggaaaacc ccagggcaaa 60
acgctcaggg actatacagg agagttttgt tggaattaga aagtttttca gcctccagag 120
ggctgtagcg gcagtagcag cagcagcatc caagggactc ctggaagggg aagagagaga 180
gcgagcgaga gactgactca gtccttgagg aactgactcg agacgaagga ggcagacatg 240
gaacatcagc tgcagtgctg cgaggtggag accatccgac gagcctacct ggacgccaac 300
ctgctcaatg acagggtgct gcagaccatg ctgaaggcgg aggagacctg ctcgccctcg 360
gtgtcctact tcaagtgcgt gcagaaggaa atcttgccat atatgaggaa aatagtcgcc 420
acttggatgc tggaggtctg cgaggagcag aagtgcgaag aggaagtttt ccccttggcg 480
atgaattatt tggacaggtt tttgtcgttc gaacccctca agaaaagccg gttgcaattg 540
ctcggagcta cctgcatgtt tgtggcttcc aaaatgaagg aaacgattcc tctgaccgca 600
gaaaaactgt gcatttacac cgacaactcc atcagacccg acgagttact gcaaatggag 660
ctgctgctgg tgaataagct gaaatggaat ctggctgcaa tgacccccca cgatttcatt 720
gaacatttcc tcactaaaat gcctctggca gaggacacca aacagatcat ccgtaaacat 780
gctcagactt ttgtggctct gtgcgctaca gatgttaaat ttatttcaaa cccaccttcc 840
atgatcgcag ctggcagtgt ggtagcagct gtgcaaggcc tgcatctggg gaacactaac 900
actttcctct cctatcaatg cctcacacat ttcctatcac aagttatcaa atgtgatccg 960
gattgtttac gagcctgcca agaacagatt gaatccctcc ttgaatccag tctacgccag 1020
gcacagcagc acaacgtatc ttcagaaaca aagactgtag aggacgaagc agacctttcc 1080
tgcacaccca ctgatgtgcg agatgtgaac atttaagagg acttcttcta atgggtttgc 1140
ttggcaagag aagcagacaa agaaagggca tctgagaagg aatcagcatc gggatctccc 1200
ccccagaaac ccttttctcc aggacgtttt tataccagaa gggaaaacca gtcttgttat 1260
attttttctt gctctgtctc ccttccatct gtgacttcaa acaaacatca 1310
<210> 2
<211> 1310
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
ctcagcacta tcccaagact gccagcaaca gcgagttcct ggggaaaacc ccagggcaaa 60
acgctcaggg actatacagg agagttttgt tggaattaga aagtttttca gcctccagag 120
ggctgtagcg gcagtagcag cagcagcatc caagggactc ctggaagggg aagagagaga 180
gcgagcgaga gactgactca gtccttgagg aactgactcg agacgaagga ggcagacatg 240
gagcaccagc tgcagtgctg cgaggtggag accatcagga gggcctacct ggacgccaac 300
ctgctgaacg acagggtgct gcagaccatg ctgaaggccg aggagacctg cagccccagc 360
gtgagctact tcaagtgcgt gcagaaggag atcctgccct acatgaggaa gatcgtggcc 420
acctggatgc tggaggtgtg cgaggagcag aagtgcgagg aggaggtgtt ccccctggcc 480
atgaactacc tggacaggtt cctgagcttc gagcccctga agaagagcag gctgcagctg 540
ctgggcgcca cctgcatgtt cgtggccagc aagatgaagg agaccatccc cctgaccgcc 600
gagaagctgt gcatctacac cgacaacagc atcaggcccg acgagctgct gcagatggag 660
ctgctgctgg tgaacaagct gaagtggaac ctggccgcca tgacccccca cgacttcatc 720
gagcacttcc tgaccaagat gcccctggcc gaggacacca agcagatcat caggaagcac 780
gcccagacct tcgtggccct gtgcgccacc gacgtgaagt tcatcagcaa cccccccagc 840
atgatcgccg ccggcagcgt ggtggccgcc gtgcagggcc tgcacctggg caacaccaac 900
accttcctga gctaccagtg cctgacccac ttcctgagcc aggtgatcaa gtgcgacccc 960
gactgcctga gggcctgcca ggagcagatc gagagcctgc tggagagcag cctgaggcag 1020
gcccagcagc acaacgtgag cagcgagacc aagaccgtgg aggacgaggc cgacctgagc 1080
tgcaccccca ccgacgtgag ggacgtgaac atctaagagg acttcttcta atgggtttgc 1140
ttggcaagag aagcagacaa agaaagggca tctgagaagg aatcagcatc gggatctccc 1200
ccccagaaac ccttttctcc aggacgtttt tataccagaa gggaaaacca gtcttgttat 1260
attttttctt gctctgtctc ccttccatct gtgacttcaa acaaacatca 1310
<210> 3
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
Met Glu His Gln Leu Gln Cys Cys Glu Val Glu Thr Ile Arg Arg Ala
1 5 10 15
Tyr Leu Asp Ala Asn Leu Leu Asn Asp Arg Val Leu Gln Thr Met Leu
20 25 30
Lys Ala Glu Glu Thr Cys Ser Pro Ser Val Ser Tyr Phe Lys Cys Val
35 40 45
Gln Lys Glu Ile Leu Pro Tyr Met Arg Lys Ile Val Ala Thr Trp Met
50 55 60
Leu Glu Val Cys Glu Glu Gln Lys Cys Glu Glu Glu Val Phe Pro Leu
65 70 75 80
Arg Met Asn Tyr Leu Asp Arg Phe Leu Ser Phe Glu Pro Leu Lys Lys
85 90 95
Ser Arg Leu Gln Leu Leu Gly Ala Thr Cys Met Phe Val Ala Ser Lys
100 105 110
Met Lys Glu Thr Ile Pro Leu Thr Ala Glu Lys Leu Cys Ile Tyr Thr
115 120 125
Asp Asn Ser Ile Arg Pro Asp Glu Leu Leu Gln Met Glu Leu Leu Leu
130 135 140
Val Asn Lys Leu Lys Trp Asn Leu Ala Ala Met Thr Pro His Asp Phe
145 150 155 160
Ile Glu His Phe Leu Thr Lys Met Pro Leu Ala Glu Asp Thr Lys Gln
165 170 175
Ile Ile Arg Lys His Ala Gln Thr Phe Val Ala Leu Cys Ala Thr Asp
180 185 190
Val Lys Phe Ile Ser Asn Pro Pro Ser Met Ile Ala Ala Gly Ser Val
195 200 205
Val Ala Ala Val Gln Gly Leu His Leu Gly Asn Thr Asn Thr Phe Leu
210 215 220
Ser Tyr Gln Cys Leu Thr His Phe Leu Ser Gln Val Ile Lys Cys Asp
225 230 235 240
Pro Asp Cys Leu Arg Ala Cys Gln Glu Gln Ile Glu Ser Leu Leu Glu
245 250 255
Ser Ser Leu Arg Gln Ala Gln Gln His Asn Val Ser Ser Glu Thr Lys
260 265 270
Thr Val Glu Asp Glu Ala Asp Leu Ser Cys Thr Pro Thr Asp Val Arg
275 280 285
Asp Val Asn Ile
290
<210> 4
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
ggcaccgagt cggtgctttt 80

Claims (2)

1.CCND1在制备禽反转录病毒生产增强剂中的应用，其特征在于：CCND1为细胞周期蛋白D1,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其优化后的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的禽反转录病毒为ALV-J或REV。
2.根据权利要求1所述CCND1在制备禽反转录病毒生产增强剂中的应用，其特征在于：采用CCND1过表达载体作为禽反转录病毒生产增强剂。
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