CN112342243A - 表达人源sting蛋白的猪源细胞的构建方法和应用 - Google Patents

表达人源sting蛋白的猪源细胞的构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及表达人源sting蛋白的猪源细胞的构建方法和应用，属于细胞构建技术领域。本发明利用CRISPR‑Cas9载体构建猪源细胞Sting敲除细胞株，在此基础上利用慢病毒表达载体表达人源sting蛋白。本发明所述构建方法使用人源化Sting蛋白替换猪源细胞内源性sting蛋白，替换后所有针对人源sting蛋白的抗体和抑制剂、激活剂都可以猪源细胞中使用，对于研究Sting蛋白在猪源病毒感染过程中的作用具有广泛的应用。

Description

表达人源sting蛋白的猪源细胞的构建方法和应用
技术领域
本发明涉及细胞构建技术领域，具体涉及表达人源sting蛋白的猪源细胞的构建方法和应用。
背景技术
Sting蛋白在抗病毒感染过程具有重要作用，针对Sting蛋白的抗体研发，特异性抑制剂、激活剂开发主要以人源Sting蛋白为靶标。由于猪源Sting蛋白与人源蛋白存在氨基酸序列的差异，这些针对人源蛋白开发的抗体、抑制剂和激活剂通常无法在猪源细胞上使用，严重制约了Sting蛋白的在猪源病毒感染中作用的研究以及Sting抑制剂、激活剂在抗猪源病毒感染作用的研究和应用。
发明内容
本发明的目的在于提供表达人源sting蛋白的猪源细胞的构建方法和应用。本发明所述构建方法使用人源化Sting蛋白替换猪源细胞内源性sting蛋白，替换后所有针对人源sting蛋白的抗体和抑制剂、激活剂都可以猪源细胞中使用，对于研究Sting蛋白在猪源病毒感染过程中的作用具有广泛的应用。
本发明提供了表达人源sting蛋白的猪源细胞的构建方法，包括以下步骤：
1)针对核苷酸序列如SEQ ID NO.1～5所示的sgRNA序列中的任意一条，设计引物，合成引物，退火，得到引物二聚体，将所述引物二聚体连入慢病毒CRISPR-Cas9载体，得到靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体；
2)提取无内毒素步骤1)所述靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体，得到无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体，将无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2混合，共转染293T包装细胞，收获慢病毒；
3)将步骤2)得到的慢病毒感染猪源细胞后在细胞培养液中培养，24小时后更换细胞培养液，加入puromycin或者hygromycinB进行筛选，筛选第一存活的细胞；
4)加入puromycin或者hygromycin B 48小时后，消化细胞，以每孔1个细胞的密度接种于96孔板，使用完全培养液连续培养1～2周后，将细胞传代至12孔板；细胞长满后传代，传代同时取部分细胞提取核酸和蛋白，通过western blot和DNA测序鉴定筛选出sting敲除猪源细胞；
5)将人源sting基因连入慢病毒表达载体，得到人源sting过表达病毒载体；将所述人源sting过表达病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2混合，共转染293T包装细胞，得到人源sting过表达慢病毒；
6)将步骤5)得到的人源sting过表达慢病毒感染步骤4)得到的sting敲除猪源细胞后在细胞培养液中培养，24小时后更换细胞培养液，加入puromycin或者hygromycin B进行筛选，筛选第二存活的细胞；
7)将步骤6)得到的第二存活的细胞，按照步骤4)对第二存活细胞进行操作，鉴定筛选出表达人源sting蛋白的猪源细胞；
所述步骤1)和步骤5)没有时间先后顺序的限定。
优选的是，步骤1)所述退火的条件为：将引物稀释成100mM浓度，按照体积比为1:1，与含ATP的缓冲溶液混合，95℃孵育5min，降温。
优选的是，步骤1)所述连入的方法为：使用T4连接酶将引物二聚体与经酶切后的慢病毒CRISPR-Cas9载体进行连接。
优选的是，步骤2)所述无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2的混合比例为4:1:2或3:1:2或3:0.75:1.5；步骤5)所述人源sting过表达病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2的混合比例为4:1:2或3:1:2或3:0.75:1.5。
优选的是，步骤2)和步骤5)所述共转染用试剂包括Fugene HD、Lipofectamine2000或Lipofectamine 3000。
优选的是，步骤2)所述慢病毒包括直接收获的慢病毒液，或经高速离心浓缩的慢病毒液；步骤5)所述人源sting过表达慢病毒包括直接收获的人源sting过表达慢病毒液，或经高速离心浓缩的人源sting过表达慢病毒液；所述高速离心条件为20000g/min高速离心1小时以上。
优选的是，步骤3)和步骤6)中所述puromycin的终浓度为1～10g/ml，所述hygromycin B的终浓度为200～500g/ml。
优选的是，步骤5)所述人源sting基因含有Flag标签。
本发明还提供了上述技术方案所述构建方法构建得到的表达人源sting蛋白的猪源细胞。
本发明还提供了上述技术方案所述构建方法得到的表达人源sting蛋白的猪源细胞或上述技术方案所述表达人源sting蛋白的猪源细胞在研究Sting蛋白在猪源病毒感染过程中的作用中的应用。
本发明提供了表达人源sting蛋白的猪源细胞的构建方法。利用CRISPR-Cas9载体构建猪源细胞Sting敲除细胞株，在此基础上利用慢病毒表达载体表达人源sting蛋白。本发明所述构建方法得到的表达人源sting蛋白的猪源细胞表达人源sting蛋白，可以使用针对人源sting蛋白的抗体以及修饰特异抗体(如Sting 366位磷酸化抗体)进行Westernblot、非变性电泳、免疫荧光、免疫电镜等实验；研究sting蛋白的磷酸化修饰、sting蛋白的聚集和细胞内分布情况；同时该细胞保留了猪源细胞的特征，可以进行猪源病毒的感染实验；解决了目前在猪源细胞研究Sting蛋白抗病毒作用的限制。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的Sting敲除PK-15细胞单克隆鉴定结果；
图2为本发明实施例2提供的Sting敲除PK-15细胞回复表达人源Sting蛋白鉴定。
具体实施方式
本发明提供了表达人源sting蛋白的猪源细胞的构建方法，包括以下步骤：
1)针对核苷酸序列如SEQ ID NO.1～5所示的sgRNA序列中的任意一条，设计引物，合成引物，退火，得到引物二聚体，将所述引物二聚体连入慢病毒CRISPR-Cas9载体，得到靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体；
2)提取无内毒素步骤1)所述靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体，得到无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体，将无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2混合，共转染293T包装细胞，收获慢病毒；
3)将步骤2)得到的慢病毒感染猪源细胞后在细胞培养液中培养，24小时后更换细胞培养液，加入puromycin或者hygromycin B进行筛选，筛选第一存活的细胞；
4)加入puromycin或者hygromycin B 48小时后，消化细胞，以每孔1个细胞的密度接种于96孔板，使用完全培养液连续培养1～2周后，将细胞传代至12孔板；细胞长满后传代，传代同时取部分细胞提取核酸和蛋白，通过western blot和DNA测序鉴定筛选出sting敲除猪源细胞；
5)将人源sting基因连入慢病毒表达载体，得到人源sting过表达病毒载体；将所述人源sting过表达病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2混合，共转染293T包装细胞，得到人源sting过表达慢病毒；
6)将步骤5)得到的人源sting过表达慢病毒感染步骤4)得到的sting敲除猪源细胞后在细胞培养液中培养，24小时后更换细胞培养液，加入puromycin或者hygromycin B进行筛选，筛选第二存活的细胞；
7)将步骤6)得到的第二存活的细胞，按照步骤4)对第二存活细胞进行操作，鉴定筛选出表达人源sting蛋白的猪源细胞；
所述步骤1)和步骤5)没有时间先后顺序的限定。
本发明针对核苷酸序列如SEQ ID NO.1～5所示的sgRNA序列中的任意一条，设计引物，合成引物，退火，得到引物二聚体，将所述引物二聚体连入慢病毒CRISPR-Cas9载体，得到靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体。本发明对引物的设计合成方法均没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规引物设计合成方法即可。在本发明中，五条sgRNA序列的核苷酸序列如下：CAGCAGTCCTATCTGCTGGG(SEQ ID NO.1)、CCCTGAGGCCCCTGGGCTGT(SEQ ID NO.2)、AGCCACCGGAGCGTGTATTC(SEQ ID NO.3)、GCCCTGAGGCCCCTGGGCTG(SEQ ID NO.4)和CCCCCAAAGGGCCACCAAG(SEQ ID NO.5)。在本发明中，所述退火的条件为：将引物稀释成100mM浓度，按照体积比为1:1，与含ATP的缓冲溶液混合，95℃孵育5min，降温。在本发明中，所述连入的方法为：使用T4连接酶将引物二聚体与经酶切后的慢病毒CRISPR-Cas9载体进行连接。
得到靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体后，本发明提取无内毒素靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体，得到无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体，将无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2混合，共转染293T包装细胞，收获慢病毒。在本发明中，所述无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2的混合比例为4:1:2或3:1:2或3:0.75:1.5。在本发明中，所述共转染用试剂包括Fugene HD、Lipofectamine 2000或Lipofectamine 3000。在本发明中，所述慢病毒包括直接收获的慢病毒液，或经高速离心浓缩的慢病毒液；
得到慢病毒后，本发明将慢病毒感染猪源细胞后在细胞培养液中培养，24小时后更换细胞培养液，加入puromycin或者hygromycin B进行筛选，筛选第一存活的细胞。在本发明中，所述puromycin的终浓度为1～10g/ml，所述hygromycinB的终浓度为200～500g/ml。
本发明在加入puromycin或者hygromycin B 48小时后，消化细胞，以每孔1个细胞的密度接种于96孔板，使用完全培养液连续培养1～2周后，将细胞传代至12孔板；细胞长满后传代，传代同时取部分细胞提取核酸和蛋白，通过westernblot和DNA测序鉴定筛选出sting敲除猪源细胞。
本发明将人源sting基因连入慢病毒表达载体(如clonetech公司pLVX-Puro等)，得到人源sting过表达病毒载体；将所述人源sting过表达病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2混合，共转染293T包装细胞，得到人源sting过表达慢病毒。在本发明中，所述慢病毒表达载体为常规市售产品，如clonetech公司pLVX-Puro等。在本发明中，所述人源sting过表达病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2的混合比例为4:1:2或3:1:2或3:0.75:1.5。在本发明中，所述共转染用试剂包括Fugene HD、Lipofectamine 2000或Lipofectamine 3000。在本发明中，所述人源sting过表达慢病毒包括直接收获的人源sting过表达慢病毒液，或经高速离心浓缩的人源sting过表达慢病毒液；所述高速离心条件为20000g/min高速离心1小时以上。在本发明中，所述人源sting基因含有Flag标签。
得到人源sting过表达慢病毒和sting敲除猪源细胞后，本发明将人源sting过表达慢病毒感染sting敲除猪源细胞后在细胞培养液中培养，24小时后更换细胞培养液，加入puromycin或者hygromycin B进行筛选，筛选第二存活的细胞。在本发明中，所述puromycin的终浓度为1～10g/ml，所述hygromycin B的终浓度为200～500g/ml。
得到第二存活的细胞后，本发明将第二存活的细胞，按照上述对第一存活细胞进行操作的技术方案对第二存活细胞进行操作，鉴定筛选出表达人源sting蛋白的猪源细胞。
本发明还提供了上述技术方案所述构建方法构建得到的表达人源sting蛋白的猪源细胞。
本发明还提供了上述技术方案所述构建方法得到的表达人源sting蛋白的猪源细胞或上述技术方案所述表达人源sting蛋白的猪源细胞在研究Sting蛋白在猪源病毒感染过程中的作用中的应用。
下面结合具体实施例对本发明所述的表达人源sting蛋白的猪源细胞的构建方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
靶向猪源Sting蛋白的CRISPR-Cas9慢病毒感染PK15细胞后获得10个单细胞克隆，对每个细胞克隆提取细胞蛋白，进行Western blot分析检测Sting蛋白在不同克隆中的表达水平。使用b-tubulin抗体作为内参抗体，指示蛋白上样量一致。Sting敲除PK-15细胞单克隆鉴定结果如图1所示，4号和9号克隆完全检测不到Sting蛋白，说明这两个克隆发生了基因标记，Sting基因被敲除。
实施例2
在实施例1得到的Sting基因敲除的9号克隆(标注为sg-Sting 9)基础上，构建回复表达人源Sting蛋白的细胞株。通过Western blot对PK-15细胞、sg-Sting 9细胞以及在sg-Sting 9细胞中回复表达Flag-sting(人源sting)的细胞进行鉴定。Sting敲除PK-15细胞回复表达人源Sting蛋白鉴定如图2所示，在人源Sting蛋白回复表达细胞中，Sting蛋白高度表达。-tubulin作为内参蛋白，指示蛋白上样量一致。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 表达人源sting蛋白的猪源细胞的构建方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagcagtcct atctgctggg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccctgaggcc cctgggctgt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agccaccgga gcgtgtattc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccctgaggc ccctgggctg 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccccaaagg gccaccaag 19

Claims (10)

1.表达人源sting蛋白的猪源细胞的构建方法，包括以下步骤：
1)针对核苷酸序列如SEQ ID NO.1～5所示的sgRNA序列中的任意一条，设计引物，合成引物，退火，得到引物二聚体，将所述引物二聚体连入慢病毒CRISPR-Cas9载体，得到靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体；
2)提取无内毒素步骤1)所述靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体，得到无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体，将无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2混合，共转染293T包装细胞，收获慢病毒；
3)将步骤2)得到的慢病毒感染猪源细胞后在细胞培养液中培养，24小时后更换细胞培养液，加入puromycin或者hygromycin B进行筛选，筛选第一存活的细胞；
4)加入puromycin或者hygromycinB48小时后，消化细胞，以每孔1个细胞的密度接种于96孔板，使用完全培养液连续培养1～2周后，将细胞传代至12孔板；细胞长满后传代，传代同时取部分细胞提取核酸和蛋白，通过westernblot和DNA测序鉴定筛选出sting敲除猪源细胞；
5)将人源sting基因连入慢病毒表达载体，得到人源sting过表达病毒载体；将所述人源sting过表达病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2混合，共转染293T包装细胞，得到人源sting过表达慢病毒；
6)将步骤5)得到的人源sting过表达慢病毒感染步骤4)得到的sting敲除猪源细胞后在细胞培养液中培养，24小时后更换细胞培养液，加入puromycin或者hygromycinB进行筛选，筛选第二存活的细胞；
7)将步骤6)得到的第二存活的细胞，按照步骤4)对第二存活细胞进行操作，鉴定筛选出表达人源sting蛋白的猪源细胞；
所述步骤1)和步骤5)没有时间先后顺序的限定。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1)所述退火的条件为：将引物稀释成100mM浓度，按照体积比为1:1，与含ATP的缓冲溶液混合，95℃孵育5min，降温。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1)所述连入的方法为：使用T4连接酶将引物二聚体与经酶切后的慢病毒CRISPR-Cas9载体进行连接。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2)所述无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2的混合比例为4:1:2或3:1:2或3:0.75:1.5；步骤5)所述人源sting过表达病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2的混合比例为4:1:2或3:1:2或3:0.75:1.5。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2)和步骤5)所述共转染用试剂包括Fugene HD、Lipofectamine 2000或Lipofectamine 3000。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2)所述慢病毒包括直接收获的慢病毒液，或经高速离心浓缩的慢病毒液；步骤5)所述人源sting过表达慢病毒包括直接收获的人源sting过表达慢病毒液，或经高速离心浓缩的人源sting过表达慢病毒液；所述高速离心条件为20000g/min高速离心1小时以上。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤3)和步骤6)中所述puromycin的终浓度为1～10g/ml，所述hygromycin B的终浓度为200～500g/ml。
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤5)所述人源sting基因含有Flag标签。
9.权利要求1～8任一项所述构建方法构建得到的表达人源sting蛋白的猪源细胞。
10.权利要求1～8任一项所述构建方法得到的表达人源sting蛋白的猪源细胞或权利要求9所述表达人源sting蛋白的猪源细胞在研究Sting蛋白在猪源病毒感染过程中的作用中的应用。
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