CN112342242A - sting敲除猪源细胞的构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及sting敲除猪源细胞的构建方法及应用，属于细胞构建技术领域。本发明利用CRISPR‑Cas9载体及慢病毒包装技术构建猪源细胞Sting敲除细胞株。本发明所述构建方法能够成功构建猪源Sting蛋白缺失的稳定细胞株，该细胞株可作为工具细胞，用于研究Sting蛋白在细胞抗病毒感染过程中的作用抑制；探索其作为疫苗生产细胞株，保护易感动物免受口蹄疫病毒感染的可能性。

Description

sting敲除猪源细胞的构建方法及应用
技术领域
本发明涉及细胞构建技术领域，具体涉及sting敲除猪源细胞的构建方法及应用。
背景技术
Sting蛋白在细胞抗病毒感染过程具有重要作用，然而目前Sting蛋白在猪源病毒感染中的作用研究较少；主要原因是在猪源细胞中缺乏研究sting蛋白功能的相应工具，如抗体、特异性激活剂和抑制剂；由于猪源Sting蛋白和人源Sting蛋白的氨基酸序列存在差异，针对人源Sting蛋白开发的抗体、特异性激活剂和抑制剂往往不能识别猪源Sting蛋白。开发针对猪源Sting蛋白的修饰抗体以及特异性抑制剂周期漫长，需要不同研究方向的课题组共同合作，目前实施难度很大。
发明内容
本发明的目的在于提供sting敲除猪源细胞的构建方法及应用。本发明所述方法能够成功构建猪源Sting蛋白缺失的稳定细胞株，该细胞株可作为工具细胞，用于研究Sting蛋白在细胞抗病毒感染过程中的作用抑制；探索其作为疫苗生产细胞株，保护易感动物免受口蹄疫病毒感染的可能性。
本发明提供了sting敲除猪源细胞的构建方法，包括以下步骤：
1)针对核苷酸序列如SEQ ID NO.1～5所示的sgRNA序列中的任意一条，设计引物，合成引物，退火，得到引物二聚体，将所述引物二聚体连入慢病毒CRISPR-Cas9载体，得到靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体；
2)提取无内毒素步骤1)所述靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体，得到无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体，将无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2混合，共转染293T包装细胞，收获慢病毒；
3)将步骤2)得到的慢病毒感染猪源细胞后在细胞培养液中培养，24小时后更换细胞培养液，加入puromycin或者hygromycin B进行筛选，筛选存活的细胞；
4)加入puromycin或者hygromycin B 48小时后，消化细胞，以每孔1个细胞的密度接种于96孔板，使用完全培养液连续培养1～2周后，将细胞传代至12孔板；细胞长满后传代，传代同时取部分细胞提取核酸和蛋白，通过western blot和DNA测序鉴定筛选出sting敲除猪源细胞。
优选的是，步骤1)所述退火的条件为：将引物稀释成100mM浓度，按照体积比为1:1，与含ATP的缓冲溶液混合，95℃孵育5min，降温。
优选的是，步骤1)所述连入的方法为：使用T4连接酶将引物二聚体与经酶切后的慢病毒CRISPR-Cas9载体进行连接。
优选的是，步骤2)所述无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2的混合比例为4:1:2或3:1:2或3:0.75:1.5。
优选的是，步骤2)所述共转染用试剂包括Fugene HD、Lipofectamine 2000或Lipofectamine 3000。
优选的是，步骤2)所述慢病毒包括直接收获的慢病毒液，或经高速离心浓缩的慢病毒液；所述高速离心条件为20000g/min高速离心1小时以上。
优选的是，步骤3)所述猪源细胞包括PK15或ST40。
优选的是，步骤3)所述puromycin的终浓度为1～10g/ml，所述hygromycin B的终浓度为200～500g/ml。
本发明还提供了上述技术方案所述构建方法构建得到的sting敲除猪源细胞。
本发明还提供了上述技术方案所述构建方法得到的sting敲除猪源细胞或上述技术方案所述sting敲除猪源细胞在研究Sting蛋白在细胞抗病毒感染过程中的作用抑制中的应用。
本发明提供了sting敲除猪源细胞的构建方法。本发明所述构建方法利用CRISPR-Cas9载体及慢病毒包装技术构建猪源细胞Sting敲除细胞株，敲除猪源细胞Sting基因后，可以直接研究Sting蛋白在各种猪源病毒感染中的作用，本发明所述构建对于研究猪源病毒感染后天然免疫系统响应具有广泛应用，鉴于Sting蛋白在抗病毒感染过程具有重要作用，敲除Sting蛋白有利于病毒的复制，因而，本发明所述方法得到的基因敲除细胞株具有作为疫苗生产细胞株的潜在价值。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的Sting敲除PK-15细胞单克隆鉴定结果。
具体实施方式
本发明提供了sting敲除猪源细胞的构建方法，包括以下步骤：
1)针对核苷酸序列如SEQ ID NO.1～5所示的sgRNA序列中的任意一条，设计引物，合成引物，退火，得到引物二聚体，将所述引物二聚体连入慢病毒CRISPR-Cas9载体，得到靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体；
2)提取无内毒素步骤1)所述靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体，得到无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体，将无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2混合，共转染293T包装细胞，收获慢病毒；
3)将步骤2)得到的慢病毒感染猪源细胞后在细胞培养液中培养，24小时后更换细胞培养液，加入puromycin或者hygromycin B进行筛选，筛选存活的细胞；
4)加入puromycin或者hygromycin B 48小时后，消化细胞，以每孔1个细胞的密度接种于96孔板，使用完全培养液连续培养1～2周后，将细胞传代至12孔板；细胞长满后传代，传代同时取部分细胞提取核酸和蛋白，通过western blot和DNA测序鉴定筛选出sting敲除猪源细胞。
本发明针对核苷酸序列如SEQ ID NO.1～5所示的sgRNA序列中的任意一条，设计引物，合成引物，退火，得到引物二聚体，将所述引物二聚体连入慢病毒CRISPR-Cas9载体，得到靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体。本发明对引物的设计合成方法均没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规引物设计合成方法即可。在本发明中，五条sgRNA序列的核苷酸序列如下：CAGCAGTCCTATCTGCTGGG(SEQ ID NO.1)、CCCTGAGGCCCCTGGGCTGT(SEQ ID NO.2)、AGCCACCGGAGCGTGTATTC(SEQ ID NO.3)、GCCCTGAGGCCCCTGGGCTG(SEQ ID NO.4)和CCCCCAAAGGGCCACCAAG(SEQ ID NO.5)。在本发明中，所述退火的条件为：将引物稀释成100mM浓度，按照体积比为1:1，与含ATP的缓冲溶液混合，95℃孵育5min，降温。在本发明中，所述降温优选缓慢进行。在本发明中，所述连入的方法为：使用T4连接酶将引物二聚体与经酶切后的慢病毒CRISPR-Cas9载体进行连接。本发明对所述慢病毒CRISPR-Cas9载体的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的商品化慢病毒CRISPR-Cas9载体即可。
得到靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体后，本发明提取无内毒素靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体，得到无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体，将无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2混合，共转染293T包装细胞，收获慢病毒。在本发明中，所述无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2的混合比例为4:1:2或3:1:2或3:0.75:1.5。在本发明中，所述共转染用试剂包括Fugene HD、Lipofectamine 2000或Lipofectamine 3000。本发明对所述共转染用试剂的来源没有特殊限定，采用商品化共转染用试剂即可。在本发明中，所述慢病毒包括直接收获的慢病毒液，或经高速离心浓缩的慢病毒液；所述高速离心条件为20000g/min高速离心1小时以上。
得到慢病毒后，本发明将慢病毒感染猪源细胞后在细胞培养液中培养，24小时后更换细胞培养液，加入puromycin或者hygromycin B进行筛选，筛选存活的细胞。在本发明中，所述猪源细胞包括PK15或ST40。在本发明中，所述puromycin的终浓度为1～10g/ml，所述hygromycin B的终浓度为200～500g/ml。
本发明在加入puromycin或者hygromycin B 48小时后，消化细胞，以每孔1个细胞的密度接种于96孔板，使用完全培养液连续培养1～2周后，将细胞传代至12孔板；细胞长满后传代，传代同时取部分细胞提取核酸和蛋白，通过westernblot和DNA测序鉴定筛选出sting敲除猪源细胞。
本发明还提供了上述技术方案所述构建方法构建得到的sting敲除猪源细胞。
本发明还提供了上述技术方案所述构建方法得到的sting敲除猪源细胞或上述技术方案所述sting敲除猪源细胞在研究Sting蛋白在细胞抗病毒感染过程中的作用抑制中的应用。
下面结合具体实施例对本发明所述的sting敲除猪源细胞的构建方法及应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
靶向猪源Sting蛋白的CRISPR-Cas9慢病毒感染PK15细胞后获得10个单细胞克隆，对每个细胞克隆提取细胞蛋白，进行Westernblot分析检测Sting蛋白在不同克隆中的表达水平。使用b-tubulin抗体作为内参抗体，指示蛋白上样量一致。Sting敲除PK-15细胞单克隆鉴定结果如图1所示，4号和9号克隆完全检测不到Sting蛋白，说明这两个克隆发生了基因标记，Sting基因被敲除。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> sting敲除猪源细胞的构建方法及应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagcagtcct atctgctggg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccctgaggcc cctgggctgt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agccaccgga gcgtgtattc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccctgaggc ccctgggctg 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccccaaagg gccaccaag 19

Claims (10)

1.sting敲除猪源细胞的构建方法，包括以下步骤：
1)针对核苷酸序列如SEQ ID NO.1～5所示的sgRNA序列中的任意一条，设计引物，合成引物，退火，得到引物二聚体，将所述引物二聚体连入慢病毒CRISPR-Cas9载体，得到靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体；
2)提取无内毒素步骤1)所述靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体，得到无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体，将无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2混合，共转染293T包装细胞，收获慢病毒；
3)将步骤2)得到的慢病毒感染猪源细胞后在细胞培养液中培养，24小时后更换细胞培养液，加入puromycin或者hygromycin B进行筛选，筛选存活的细胞；
4)加入puromycin或者hygromycin B 48小时后，消化细胞，以每孔1个细胞的密度接种于96孔板，使用完全培养液连续培养1～2周后，将细胞传代至12孔板；细胞长满后传代，传代同时取部分细胞提取核酸和蛋白，通过western blot和DNA测序鉴定筛选出sting敲除猪源细胞。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1)所述退火的条件为：将引物稀释成100mM浓度，按照体积比为1:1，与含ATP的缓冲溶液混合，95℃孵育5min，降温。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1)所述连入的方法为：使用T4连接酶将引物二聚体与经酶切后的慢病毒CRISPR-Cas9载体进行连接。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2)所述无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2的混合比例为4:1:2或3:1:2或3:0.75:1.5。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2)所述共转染用试剂包括FugeneHD、Lipofectamine 2000或Lipofectamine 3000。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2)所述慢病毒包括直接收获的慢病毒液，或经高速离心浓缩的慢病毒液；所述高速离心条件为20000g/min高速离心1小时以上。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤3)所述猪源细胞包括PK15或ST40。
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤3)所述puromycin的终浓度为1～10g/ml，所述hygromycin B的终浓度为200～500g/ml。
9.权利要求1～8任一项所述构建方法构建得到的sting敲除猪源细胞。
10.权利要求1～8任一项所述构建方法得到的sting敲除猪源细胞或权利要求9所述sting敲除猪源细胞在研究Sting蛋白在细胞抗病毒感染过程中的作用抑制中的应用。
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