CN103388001B - 一种含凝血酶切割位点gst膜型表达载体及转染阳性细胞的方法 - Google Patents
一种含凝血酶切割位点gst膜型表达载体及转染阳性细胞的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种含凝血酶切割位点GST膜型表达载体及转染阳性细胞的方法，GST表达后在信号肽的引导下穿出细胞膜，并在跨膜区的作用下固着于细胞膜表面，成为转染细胞新的筛选标签——膜型GST（mGST），通过针对GST单克隆抗体的特异性结合、免疫磁珠吸附进行分选细胞，简化筛选步骤，富集阳性细胞，提高转染阳性细胞比率。本发明可以有效富集阳性细胞，提高转染阳性细胞的比率，是一种可以高效分选出转染阳性细胞的技术手段，通过本发明的分选，富集阳性细胞，使阳性细胞比例上升到95%以上。
Description
技术领域
本发明属于细胞转染技术领域，涉及一种含凝血酶切割位点GST膜型表达载体及转染阳性细胞的方法。
背景技术
在现代生命科学研究中，为了探寻某一特定基因的功能，往往需要在真核细胞中过表达该基因编码的蛋白产物；或者利用过表达某一蛋白分子来改变真核细胞的生物学状态，以研究细胞的功能；又或是大规模培养真核细胞以生产特定的蛋白产物。在这种情况下，最为常用的技术手段是利用质粒或病毒载体将外源基因导入宿主细胞，使外源基因在宿主细胞中扩增、转录、翻译出蛋白产物。该项技术有一个关键的瓶颈问题，就是转染效率低下，其后果就是转染处理的细胞群中，只有一部分表达外源性目的基因，同时还有相当多的细胞不表达外源基因，两者比例随细胞系和转染试剂的不同而不同。转染效率是进行实验设计时必须要考虑的关键问题。由于效率不是百分之百，转染后大量野生型的细胞不表达外源基因，这样的异质性细胞群体不能用于研究外源基因对细胞功能的影响。因此，基因转染后从数量巨大的细胞群中检测并分选出转染阳性细胞，就成为该类实验研究的关键步骤。
目前，解决这一技术瓶颈常用的方法主要集中于三个领域：
一、研究开发新的转染试剂，提高转染效率。国际上多家知名的大型生物技术公司均推出了各自的转染试剂，例如Invitrogen公司的lipefectamin系列产品，Roche公司的X-tremeGENE系列产品，Qiagen公司的Activateddendrimers技术等等。尽管技术各自不同，但是转染效率达不到百分之百是相同的。其它如电穿孔等技术方法同样也有难以解决的技术难题，突出问题就是细胞存活率低下，后续实验技术要求高。
二、在真核表达载体中插入特定药物的抗性基因，转染细胞后在培养基中加入细胞毒性药物，利用选择压力进行筛选。例如，氨基糖苷类抗生素新霉素及其类似物G418可以通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成杀死真核细胞。多种真核表达载体中具有新霉素抗性基因（neor），其编码的蛋白产物氨基糖苷磷酸转移酶能够分解新霉素和G418，转染了目的载体的阳性细胞表达抗性基因，从而能在含有G418的选择性培养基中生长，而未转染的阴性细胞则被G418选择性杀死。通过一定时间的筛选培养，最终获得较高纯度的转染阳性细胞。与此原理类似的还有Zeocin抗性选择、Hygromycine抗性选择、Puromycine抗性选择等。
这一技术目的在于去除未导入质粒的野生型细胞，扩大基因转染技术的应用范围，但仍存在不足之处。具体说来，因为转染后具有细胞毒性的抗生素在不能在短时间内有效的杀死未转染的野生型细胞，所以该方案主要用于获得可以长期表达目的基因的稳定细胞株。一般而言，质粒的抗性基因与目的基因分别属于不同启动子控制下的两个转录本，其整合到宿主细胞基因组的过程是随机、非定点的。这样，外源性目的基因和抗性基因的整合、表达均是不可控的。
为了维持转染细胞持续表达外源基因的阳性表型，通常的方案是在培养基中持续添加筛选用的抗生素，这在一定程度上增加了实验成本。而且，更为重要的是，转染阳性细胞经过长时间培养，在外源抗生素这种单一生存压力持续存在的情况下，最终存活并得以大量增殖的细胞是对该种抗生素具有最大抵抗活性的细胞，而实验的根本目的是研究外源性目的基因表达阳性的细胞，两者南辕北辙，这一状况必将大大影响实验结果的科学性和可靠性。这种方案既耗时效率又低，要分选出表达了目的基因的细胞株通常需耗费一个甚至几个月的时间，而最终获得的细胞株很有可能仍然是异质性细胞群。所以往往还需要进一步的表型筛选，这一步骤涉及PCR、Westernblot、单一细胞克隆化培养等操作，工作量极大。
三、转染阳性细胞的机械性分选技术。例如：流式细胞仪分选，该技术可以利用特异性抗体的免疫荧光染色分选出不同亚群的原代细胞，例如利用荧光标记的抗CD3单克隆抗体可以从外周血样本中高纯度的分选出T细胞。同样也可以利用转染细胞所获得的某些新特性（如新的膜表面分子特异性染色或表达外源性荧光蛋白），通过流式细胞术来进行分选转染阳性细胞。但是，流式分选技术依赖于大型仪器设备，所需费用高，无菌环境要求高，对操作人员的技术要求高，且对处理细胞有一定的损伤，使其推广应用受到限制。而且，该方案局限于只能分选细胞膜表面表达外源目的基因的情况。如果外源基因是胞内或者核内定位表达，则无法利用免疫荧光染色的方法分选。
近年来，基于免疫学原理，利用细胞表面的特定蛋白分子，发展出一类通过特异性抗体结合反应分选某种类型的细胞的方法。例如军事医学科学研究院裴雪涛等人的发明“含有CD34标志基因用于转染细胞分选的载体的构建及其应用”（公开号：CN1712535A）利用CD34分子作为筛选标志，可以分选出同时表达目的基因和CD34分子的转染阳性细胞，但该方案仍然存在影响其广泛应用的弊端：CD34分子是哺乳动物细胞的天然蛋白，表达于多种细胞表面，如造血干/祖细胞，以CD34作为标签蛋白分子，其应用范围就受到局限。CD34分子可以与CD62L分子发生特异性相互作用，转染细胞异位表达CD34会对部分细胞学实验造成干扰。公开号为：CN101985634A的发明专利，公开了利用绿色荧光蛋白GFP作为膜型筛选标记的真核表达载体，该技术方案利用GFP分子作为筛选标志，可以分选出同时表达目的基因和GFP分子的转染阳性细胞。GFP蛋白来源于水母，一般常用的细胞系和原代细胞没有内源性表达，也不存在天然配体，避免了CD34分子的缺陷。但该方案仍然存在不足之处：利用抗GFP的抗体和免疫磁珠分选后，阳性细胞表面仍然结合有GFP、抗体、免疫磁珠等成分，对于后续的细胞生物学研究造成了一定的影响；GFP本身发出绿色荧光，如果进行免疫染色和荧光显微镜或流式细胞术分析，GFP占用了最为常用的488/515nm荧光通道，给实验设计带了一定的不便，增加了实验试剂的消耗和成本。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种含凝血酶切割位点GST膜型表达载体及转染阳性细胞的方法，可以简化传统转染细胞筛选烦琐耗时的过程，提高转染细胞的分选效率，高效的清除分选标志和分选试剂，提高了细胞转染相关实验的科学性和简便性。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种含凝血酶切割位点GST膜型表达载体，包括两端分别设有MCSA和MCSB的IRES序列，其中MCSA用于外源目的基因的插入，MCSB插入有mGST基因，插入目的基因后与mGST基因构成双顺反子，受同一启动子控制；
所述的mGST基因包括GST基因，在GST基因上游连接有穿膜信号肽序列LS，在其下游连接有凝血酶切割的识别位点和疏水性氨基酸的跨膜区序列MT。
所述的含凝血酶切割位点GST膜型表达载体转染宿主细胞并被表达后，宿主细胞在膜上表达GST蛋白，同时表达外源目的基因。
所述的LS的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，所述的MT的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
所述的含凝血酶切割位点GST膜型表达载体为pIRES-mGST载体，在pIRES载体中的IRES序列下游的MCSB中依次插入LS序列、GST基因序列和MT序列；MCSA位点用于外源目的基因的插入。
一种含凝血酶切割位点GST膜型表达载体的构建方法，包括以下操作：
1）合成两端设有酶切位点的LS序列，并将其接入pIRES载体的MCSB相应位点，构建得到pIRES-LS载体；
2）扩增两端设有酶切位点的GST基因，酶切后连入pIRES-LS载体，构建得到pIRES-LS-GST，其中GST基因插入到LS序列的下游，并保持读框正确；
3）合成两端设有酶切位点的MT序列，定向连接入pIRES-LS-GST载体的MCSB相应位点，构建得到pIRES-mGST载体，其中MT序列插入到GST基因的下游，并保持读框正确；
4）扩增两端设有酶切位点的外源目的基因，酶切后连入pIRES-LS载体的MCSA相应位点。
基于所述含凝血酶切割位点GST膜型表达载体的阳性细胞的筛选方法，其特征在于，包括以下操作：
1）在多克隆位点MCSA处插入外源目的基因构建得到表达载体，转染宿主细胞后，宿主细胞在膜上表达GST蛋白，同时表达外源目的基因，收集待分离的细胞制成单细胞悬浮液；
2）将抗GST单克隆抗体与二抗磁珠混合均匀，使抗GST单克隆抗体结合到磁珠表面；
3）在制成的单细胞悬浮液在加入结合有抗GST单克隆抗体的磁珠，充分混匀，使之与表达膜型GST的转染阳性细胞结合；
4）将细胞磁珠混悬液置于磁架上，利用外界磁场分选出吸附有磁珠的表达膜型GST的转染阳性细胞；
5）再利用含有凝血酶的切割缓冲液对表达膜型GST的转染阳性细胞进行切割，细胞表面表达的GST分子和结合的抗GST抗体、磁珠与阳性细胞分离，得到分选后纯化的转染阳性细胞。
利用脂质体介导法或是磷酸钙介导法或是电穿孔法等方法将构建成功的表达载体转染宿主细胞，24～48小时后收集转染细胞，制成单细胞悬浮液；
如果宿主细胞是悬浮培养细胞，则离心，弃上清，用新鲜培养基重悬细胞沉淀；
如果是贴壁培养的细胞，吸尽培养基后用0.25%胰酶-0.02%EDTA-PBS缓冲液进行消化，使细胞变为悬浮状态，然后离心，弃上清，用新鲜培养基重悬细胞沉淀，制成单个细胞悬浮液。
抗GST的单克隆抗体与二抗磁珠的结合为：取二抗磁珠混悬液充分洗涤后，于磁架上静置，吸弃上清，加入缓冲液混匀；再加入抗GST的特异性单抗FMU-GST.3，置于垂直混匀仪上4℃颠倒混匀；于磁架上静置，吸弃上清，再用缓冲液洗涤；
抗GST的单克隆抗体与二抗磁珠结合后加入到单个细胞悬浮液中，在液相缓冲系统中，固相化的特异性结合GST的GST抗单克隆抗体高亲和力的结合表达膜型GST的转染细胞。
利用外界磁场分选表达特定膜表面标志的细胞包括以下操作：
1）用缓冲液调整转染细胞密度为1×107/毫升，将细胞悬液与结合有单抗的磁珠混匀，置垂直混匀仪上4℃颠倒混匀；然后于磁架上静置，吸弃上清以去除未结合磁珠的阴性细胞；加入缓冲液混匀，于磁架上静置，吸弃上清，重复3次洗涤细胞，最后一次吸尽上清；
2）加入凝血酶缓冲液重悬细胞，于37℃预热后加入凝血酶消化GST与跨膜区之间的凝血酶切割位点，于37℃颠倒混匀，吹打混悬液5～10次以使免疫磁珠与阳性细胞解离；于磁架上静置，吸取上清转移至清洁无菌的EP管，获得的细胞即为高纯度的转染阳性细胞。
所述的凝血酶缓冲液为HBSS液，并添加试剂：20mMTris-HCl，2.5mMCaCl2。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1、本发明提供了一种谷胱甘肽转移酶GST作为分选标记的真核表达载体，GST表达后在信号肽的引导下穿出细胞膜，并在跨膜区的作用下固着于细胞膜表面，成为转染细胞新的筛选标签——膜型GST（mGST），通过针对GST单克隆抗体的特异性结合、免疫磁珠吸附进行分选细胞，简化筛选步骤，富集阳性细胞，提高转染阳性细胞比率。
2、常用的真核细胞不表达膜型GST基因，作为鉴定或选择标记不会造成假阳性结果；而且，真核细胞膜上不存在可以与GST高亲和力结合的蛋白分子，不会影响表达GST细胞的生物学行为，减少了实验操作对结果的干扰。
3、外源目的基因插入MCS后与mGST转录成为一条双顺反子mRNA，GST氨基端连接有信号肽序列，羧基端连接有凝血酶切割的识别位点和疏水性氨基酸的跨膜区序列，细胞转染该表达载体后可以在膜上表达GST蛋白，同时表达外源目的基因。在同一个启动子下分别表达两段基因的开放读框，使得外源目的基因的表达和细胞表面新标志的表达具有良好的相关性，而这种相关性保证了分选出的表达膜标志mGST的细胞同时也是表达目的基因的细胞。
4、本发明利用基因工程方法使GST通过跨膜区序列固定于细胞膜表面，该序列为29个疏水性氨基酸构成，插入细胞膜脂质双层从而将GST分子固定于细胞膜外表面，并不含有胞质区部分，所以不会转导外界信号而影响细胞的生物学行为。
5、外源表达的膜型GST分子仅在转染后作为鉴定和纯化标签使用，利用抗GST抗体和免疫磁珠纯化细胞后，立即用凝血酶将GST标签蛋白从细胞膜表面切除，同时也去除了GST抗体和免疫磁珠，最终获得的细胞是没有干扰的纯化细胞，提高了细胞学实验的可靠性和科学性。
6、本发明提供的GST抗原抗体特异性结合、免疫磁珠吸附进行分选细胞的方案，简化了筛选步骤，可以有效富集阳性细胞，提高转染阳性细胞的比率，是一种可以高效分选出转染阳性细胞的技术手段。一般而言，普通哺乳动物细胞的转染效率在20%左右，即转染后的细胞群中有大约20%的细胞表达目的基因；而通过本技术的分选，富集阳性细胞，使阳性细胞比例上升到95%以上。
附图说明
图1为pIRES载体的质粒图谱；
图2为pIRES-mGST的质粒图谱；
图3为本发明的阳性细胞分选方法。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
针对现有技术中转染效率低、耐药细胞假阳性高、分选技术存在局限的问题，本发明设计的技术方案可以简化传统转染细胞筛选烦琐耗时的过程，提高转染细胞的分选效率，高效的清除分选标志和分选试剂，进一步降低了转染和分选等操作对细胞生物学功能的影响，提高了细胞转染相关实验的科学性和简便性。
本发明将多基因共表达载体的构建策略、抗原抗体特异性结合、免疫磁珠吸附为基础的细胞分选方法以及凝血酶特异性识别切割手段相结合，应用于转染细胞的分选。
首先，在细胞表面标志分子的选择中，选择的标签蛋白是谷胱甘肽转移酶（GST）。GST为分子量26kDa的蛋白，1988年史密斯和约翰逊两人构建了pGEX载体，首次将其作为融合标签蛋白使用（SmithDB,JohnsonKS.Single-steppurificationofpolypeptidesexpressedinEscherichiacoliasfusionswithglutathioneS-transferase.Gene.1988Jul15;67(1):31-40.）。GST作为细胞表面标志，有以下几方面的优点：1.GST是真核细胞来源的蛋白，外源性过表达对细胞几乎没有毒性，瞬时和稳定表达均不影响细胞的存活与生物学行为；2.GST性质稳定，可耐受抗体识别与亲和纯化的操作步骤；3.GST作为标签蛋白广泛应用于生命科学研究，针对GST的特异性抗体早已商品化，几乎所有抗体公司均供应多种不同种属动物来源的单克隆、多克隆抗体，很容易购买和使用，可方便的对GST阳性的转染细胞进行免疫印迹分析或者免疫荧光染色，进而使用荧光显微镜、板式荧光定量仪或流式细胞仪等多种仪器定性定量的检测转染细胞；4.GST天然蛋白存在于某些特定类型细胞的胞质溶胶内，哺乳动物细胞不表达膜型GST分子，作为鉴定或选择标记不会造成假阳性结果。以上几点，构成了GST作为细胞分选标志的必要条件。
其次，将GST表达于细胞膜表面是本发明的关键特征。现有的表达载体中GST标签一般位于多克隆位点（MCS）上游，目的基因插入MCS后与GST形成融合表达，即成熟蛋白的N端带有GST标签。本发明基于pIRES载体进行了基因改构，保留该载体MCSA作为外源目的基因的克隆位点；在核糖体进入位点IRES下游的MCSB位点处插入GST基因，GST上游添加来源于免疫球蛋白kappa链的信号肽序列（leadingsequence，LS），GST序列下游按顺序添加凝血酶识别位点、来源于I型跨膜糖蛋白CD155分子的跨膜区序列（trans-membrane，TM）和终止密码子。通过该基因工程操作，使得GST表达后在信号肽引导下穿出并锚定于细胞膜外侧表面，成为转染细胞新的筛选标签----膜型GST，简称mGST，同时，GST近膜端添加有凝血酶识别位点。由于IRES序列的作用，外源目的基因插入MCSA后与mGST转录成为一条双顺反子mRNA，在同一个启动子下分别表达两段基因的开放读框（ORF）。因此，宿主细胞经过转染操作后，如果膜上表达GST标签蛋白，则一定会表达外源目的基因。这样的基因工程改建，可以使得外源目的基因的表达和细胞表面新标志的表达具有良好的相关性，而这种相关性保证了分选出的表达膜标志mGST的细胞同时也是表达目的基因的细胞。
第三，在特异性结合GST的多株小鼠源性单克隆抗体的基础上，并筛选出可用于免疫磁珠分选的单抗（克隆号FMU-GST.3）。在液相缓冲系统中，固相化的单抗FMU-GST.3可以高亲和力的结合GST蛋白分子，或者结合表达膜型GST的转染细胞。针对GST的特异性抗体，是该高效细胞分选系统关键的试剂组分。
第四，分选表达特定膜表面标志的细胞已有十分成熟的方法，有许多商品化的试剂及设备供应，价格相对低廉，供货渠道畅通，已在生命科学研究领域广泛应用。配合单抗FMU-GST.3使用，可以方便、高效地分选表达mGST的阳性转染细胞。主要的商品化试剂包括可以结合小鼠源性单抗的羊抗小鼠二抗磁珠、磁架及相应的配套缓冲液等。供应商主要有戴诺公司和美天旎公司。
最后，通过GST特异性抗体与免疫磁珠的识别、捕获，转染阳性细胞得以富集，其表面还结合有抗体和磁珠，进而采用凝血酶处理细胞，将抗体、磁珠连同外源性GST分子从细胞膜表面切割下来，从而获得高纯度、无干扰的转染阳性细胞群。
综上，本发明构建了可以表达含凝血酶切割位点的膜型mGST的真核表达载体，在将目的基因转染入宿主细胞时，将新标志基因GST一起转入细胞。由于IRES序列的作用，目的基因与mGST基因在同一双顺反子上，受同一启动子控制，转染细胞在表达目的基因的同时亦获得mGST表面标志，从而利用mGST标签蛋白分子和相应的单克隆抗体结合免疫磁珠，方便的分选转染细胞。分选后富集的细胞采用凝血酶处理，可以高效快捷的将外源性的GST分子从细胞膜上切下，同时GST抗体、免疫磁珠也与细胞解离，收获的细胞是高纯度、无干扰的转染阳性细胞群。
所述LS核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，含有凝血酶切割位点编码的TM核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示：
SEQ.ID.NO.1:
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC；
SEQ.ID.NO.2:
CTGGTCCCCCGGGGCAGCCTCTTTGTGGCTGGAGGGACAGTTTTATTGTTGTTGTTTGTTATCTCAATTACCACCATCATTGTCATTTTCCTT。
参见图3，所述GST蛋白作为分选标记的真核表达载体进行转染细胞分选的方法，包括以下步骤：
1）在多克隆位点MCSA处插入外源目的基因，构建表达载体并转染宿主细胞后，收集待分离的细胞制成单细胞悬浮液；
2）将抗GST单克隆抗体与商品化的抗小鼠二抗磁珠混合均匀，使抗GST单克隆抗体结合到磁珠表面；
3）在制成的单细胞悬浮液加入结合有抗GST单克隆抗体的磁珠，充分混匀，使之与表达膜型GST的转染阳性细胞结合；
4）将细胞磁珠混悬液置商品化磁架上，利用外界磁场分选出表达膜型GST的转染阳性细胞；
5）再利用切割缓冲液（ReleasingBuffer）将GST分子、GST抗体、磁珠与表达膜型GST的转染阳性细胞分离，得到分选后纯化的转染阳性细胞。
反应体系：HBSS液，并添加试剂：20mMTris-HCl，2.5mMCaCl2，37℃，切割1小时。
下面以图1所示的pIRES载体到图2所示的pIRES-mGST的构建为实施例，说明GST作为分选标记的真核表达载体的构建过程。
pIRES载体到pIRES-mGST的构建步骤：
①化学合成编码信号肽的寡核苷酸正义链和反义链（LS），正义链的5’端和反义链的3’端添加BamHI位点，正义链的3’端和反义链的5’端添加XbaI位点，退火形成带有粘性末端的双链DNA；通过定向连接入pIRES载体的MCSB相应位点，命名为pIRES-LS；
②以pGEX-4T-3载体为模板，设计引物扩增出GST，在GST片段两端添加XbaI和SalI酶切识别位点，酶切后连入上述pIRES-LS载体，命名为pIRES-LS-GST；
扩增GST序列引物
上游引物：tctagaatgtcccctatactaggtta（XbaI酶切识别位点）
下游引物：gtcgacgtcagtcacgatgcggcc（SalI酶切识别位点）
③化学合成编码凝血酶识别肽和跨膜肽的寡核苷酸正义链和反义链（TM），正义链的5’端和反义链的3’端添加SalI位点，正义链的3’端和反义链的5’端添加NotI位点，退火形成带有粘性末端的双链DNA；通过定向连接入pIRES-LS-GST载体的MCSB相应位点，命名为pIRES-mGST，目标载体构建成功。
通过上述基因工程操作，原有的pIRES载体改构成为表达膜结合形式GST蛋白的pIRES-mGST载体。
所述GST蛋白作为分选标记的真核表达载体进行转染细胞分选的方法，包括以下步骤：
通过基因工程方法，将需要研究的目的基因核酸片段插入到如上所述的pIRES-mGST载体多克隆位点MCSA处，构建表达外源目的基因的载体；利用脂质体介导法或是磷酸钙介导法或是电穿孔法等方法将构建成功的表达载体转染宿主细胞，24～48小时后收集转染细胞，制成单细胞悬浮液；
在制成的单细胞悬浮液加入结合有抗GST单克隆抗体的二抗磁珠，抗GST单克隆抗体与表达膜型GST的转染阳性细胞结合；
利用外界磁场分选出表达膜型GST的转染阳性细胞，再利用切割缓冲液（ReleasingBuffer）作用，使表达膜型GST的转染阳性细胞与免疫磁珠分离，从而得到分选纯化的转染阳性细胞。
下面对该方法做详细说明。
主要的商品化试剂和器材：抗鼠二抗磁珠：CELLectionTMPanMouseIgGKit试剂盒（Dynal公司，货号115-31D）；磁架，用来提供外界磁场，采用DynalMPC-S型磁架（Dynal公司，货号120-20D）；HBSS液、RPMI1640细胞培养基（Hyclone公司）；新生牛血清（四季青公司）；垂直混合仪（宁波新芝公司HS-3型）。
自行配制试剂：PBS缓冲液：0.15mol/L，pH7.4；Buffer1：含质量/体积比为0.1%BSA的PBS缓冲液；Buffer2（切割缓冲液）：HBSS液，含20mMTris-HCl，2.5mMCaCl2；特异性结合GFP的鼠源性单克隆抗体（克隆号：FMU-GFP.3）；
1、转染细胞的收集
利用脂质体介导法或是磷酸钙介导法或是电穿孔法等方法将构建成功的表达载体转染宿主细胞，24～48小时后收集转染细胞，制成单个细胞悬浮液。
如果宿主细胞是悬浮培养细胞，则1200rpm，5min离心，弃上清，用适当体积的新鲜培养基重悬细胞沉淀；如果是贴壁培养的细胞，需要吸尽培养基，用0.25%胰酶-0.02%EDTA-PBS缓冲液进行消化，使细胞变为悬浮状态，然后1200rpm，5min离心，弃上清，用适当体积的新鲜培养基重悬细胞沉淀，制成单个细胞悬浮液。
2、加入结合有抗GST单克隆抗体的二抗磁珠
抗GST的单克隆抗体与二抗磁珠结合后加入到制成的单个细胞悬浮液中，在液相缓冲系统中，固相化的特异性结合GST的GST抗单克隆抗体可以高亲和力的结合表达膜型GST的转染细胞。
抗GST的单克隆抗体与二抗磁珠的结合：取100微升二抗磁珠混悬液（含4×107个磁珠），加入1毫升Buffer1充分洗涤后，于磁架上静置1min，吸弃上清，加入1毫升Buffer1混匀；再加入20微克单抗FMU-GST.3，置于垂直混匀仪上4℃颠倒混匀30～60min；于磁架上静置1min，吸弃上清，再用Buffer1洗涤2次。
抗GST的单克隆抗体可以是商品化试剂或者自行制备，商品化试剂：包括SantaCruz、碧云天等在内的多家生物技术公司都有商品化抗体提供。
本发明的实施例选择FMU-GST.3单抗，该单抗的制备方法：免疫原采用的是原核表达的重组GST蛋白，免疫Balb/c小鼠，取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，经间接ELISA法筛选、有限稀释法克隆化得到可以结合GST蛋白的单克隆抗体。具体方法见已公开文献：抗3种标签蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定，细胞与分子免疫学杂志，2005,21(5)：613-614，618。本领域的研究人员可以方便的从上述文献公开的实验室索取FMU-GST.3单抗。本步骤所需抗GST特异性单抗也可以从生物技术公司购买获得，例如碧云天生物技术公司（产品货号:AG768）。
3、利用外界磁场分选表达特定膜表面标志的细胞
1）用Buffer1调整转染细胞密度为1×107/毫升，取1毫升细胞悬液与结合有单抗的磁珠混匀，置垂直混匀仪上4℃颠倒混匀20min；然后于磁架上静置2min，吸弃上清以去除未结合磁珠的阴性细胞；加入1毫升Buffer1混匀，于磁架上静置1min，吸弃上清，重复3次洗涤细胞，最后一次吸尽上清。
2）加入200微升于37℃预热的Buffer2重悬细胞，加入凝血酶消化GST与跨膜区之间的凝血酶切割位点，将颠倒混匀仪置37摄氏度孵箱，颠倒混匀60min，用移液器吸头用力吹打混悬液5～10次以使免疫磁珠与阳性细胞解离。于磁架上静置2min，吸取上清转移至清洁EP管，获得的细胞即为高纯度的转染阳性细胞。
其中，Buffer1：标准PBS缓冲液，pH值7.4，添加牛血清白蛋白（BSA）至终浓度1%；Buffer2：标准HBSS缓冲液，添加试剂：20mMTris-HCl，2.5mMCaCl2。
实施例1：pIRES-mGST-CD155载体的构建
CD155基因插入pIRES-mGST载体。CD155基因来源于人外周血单个核细胞PBMC的cDNA，根据pIRES-mGST多克隆位点限制性酶切位点和CD155的开放读框（ORF）基因序列，设计引物引入XhoI和EcoRI酶切位点，引物序列和高保真PCR反应条件如下：
P1:ccgctcgagatggcccgagccatggccgc（下划线为XhoI位点）
P2:cggaattcccttgtgccctctgtctgtg（下划线为EcoRI位点）
PCR反应体系包括:人源cDNA：1微克，引物P1和P2（10微摩尔/升）各5微升，dNTP混合物20皮摩尔，高保真DNA聚合酶PrimerStar（TaKaRa公司）5单位，5×PCRBuffer20微升，双蒸水81.4微升。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30sec；59℃退火45sec，72℃延伸90sec；35个循环；72℃延伸10min。
PCR产物经快速纯化试剂盒提纯后，采用XhoI和EcoRI进行双酶切，再次进行快速纯化；同时取pIRES2-mGST用XhoI和EcoRI进行双酶切，使用快速纯化试剂盒提纯。酶切后的PCR产物和线性载体在T4DNA连接酶作用下连接，条件为：16℃，过夜反应。转化大肠杆菌E.coli，铺Amp抗性LB平板，37℃过夜培养后挑取克隆进行鉴定，获得质粒pIRES-mGST-CD155。
实施例2：pIRES-mGST-CD155载体转染CHO细胞
用含有10%新生牛血清的DMEM细胞培养基在75cm2培养瓶中培养CHO细胞，至80%汇合率，吸尽培养基，用0.25%胰酶-0.02%EDTA-PBS缓冲液进行消化，使细胞变为悬浮状态，将细胞转入15毫升离心管中，1200rpm，5min离心，弃上清，用适当体积的电穿孔缓冲液重悬细胞沉淀，然后1200rpm，5min离心弃上清，洗涤细胞2次，制成单个细胞悬浮液，计数细胞，将细胞重新悬浮于电穿孔缓冲液中，调整细胞终浓度为1×107个细胞/毫升。取1毫升细胞悬液放入电转杯中，加入50微克重组载体pIRES-mGST-CD155，冰浴10min，电穿孔法转染CHO细胞，电穿孔仪参数设置：电压300V，电量250μF。转染后用适量的培养基稀释细胞，G418选择性培养48h，按前述方法收获细胞。
实施例3：转染阳性细胞的免疫磁珠分选
主要的商品化试剂和器材：二抗磁珠CELLectionTMPanMouseIgGKit试剂盒（Dynal公司，货号115-31D）；磁架DynalMPC-S（Dynal公司，货号120-20D）；RPMI1640细胞培养基（Hyclone公司）；新生牛血清（四季青公司）；牛血清白蛋白BSA（Sigma公司）；垂直混合仪（宁波新芝公司HS-3型）。特异性结合GST的鼠源性单克隆抗体（mAb，克隆号FMU-GST.3）。
分选步骤：
取100ul二抗磁珠混悬液（含4×107个磁珠），加入1mlBuffer1充分洗涤，于磁架上静置1min，吸弃上清，加入1mlBuffer1混匀，加入2μg单抗FMU-GST.3，置于垂直混匀仪上颠倒混匀，4℃，30～60min。于磁架上静置1min，吸弃上清，再用Buffer1洗涤2次；
电穿孔转染后CHO细胞常规培养48小时，使外源基因得以表达。吸尽培养基，用0.25%胰酶-0.02%EDTA-PBS缓冲液进行消化，使细胞变为悬浮状态，将细胞转入15ml离心管中，1200rpm，5min离心，弃上清，用适当体积Buffer1洗涤细胞2次，并调整细胞密度为1×107/毫升，取1毫升细胞悬液与结合有单抗的磁珠混匀，置垂直混匀仪上4℃颠倒混匀20min；然后于磁架上静置2min，吸弃上清以去除未结合磁珠的阴性细胞；加入1毫升Buffer1混匀，于磁架上静置1min，吸弃上清，重复3次洗涤细胞，最后一次吸尽上清。
2、加入200微升于37℃预热的Buffer2重悬细胞，加入凝血酶消化GST与跨膜区之间的凝血酶切割位点，将颠倒混匀仪置37摄氏度孵箱，颠倒混匀60min，用移液器吸头用力吹打混悬液5～10次以使免疫磁珠与阳性细胞解离。于磁架上静置2min，吸取上清转移至清洁EP管，获得的细胞即为高纯度的转染阳性细胞，可直接进行下一步的分析或者加入培养基后继续培养。
Claims (6)
1.一种含凝血酶切割位点GST膜型表达载体，其特征在于，包括两端分别设有MCSA和MCSB的IRES序列，其中MCSA用于外源目的基因的插入，MCSB插入有mGST基因，插入目的基因后与mGST基因构成双顺反子，受同一启动子控制；
所述的mGST基因包括GST基因，在GST基因上游连接有穿膜信号肽序列LS，在其下游连接有凝血酶切割的识别位点和疏水性氨基酸的跨膜区序列MT；
所述的含凝血酶切割位点GST膜型表达载体转染宿主细胞并被表达后，宿主细胞在膜上表达GST蛋白，同时表达外源目的基因；
所述的含凝血酶切割位点GST膜型表达载体为pIRES-mGST载体，在pIRES载体中的IRES序列下游的MCSB中依次插入LS序列、GST基因序列和MT序列；MCSA位点用于外源目的基因的插入。
2.如权利要求1所述的含凝血酶切割位点GST膜型表达载体，其特征在于，所述的LS的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，所述的MT的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
3.一种含凝血酶切割位点GST膜型表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下操作：
1）合成两端设有酶切位点的LS序列，并将其接入pIRES载体的MCSB相应位点，构建得到pIRES-LS载体；
2）扩增两端设有酶切位点的GST基因，酶切后连入pIRES-LS载体，构建得到pIRES-LS-GST，其中GST基因插入到LS序列的下游，并保持读框正确；
3）合成两端设有酶切位点的MT序列，定向连接入pIRES-LS-GST载体的MCSB相应位点，构建得到pIRES-mGST载体，其中MT序列插入到GST基因的下游，并保持读框正确；
4）扩增两端设有酶切位点的外源目的基因，酶切后连入pIRES-LS载体的MCSA相应位点。
4.基于权利要求1所述含凝血酶切割位点GST膜型表达载体的阳性细胞的筛选方法，其特征在于，包括以下操作：
1）在多克隆位点MCSA处插入外源目的基因构建得到表达载体，转染宿主细胞后，宿主细胞在膜上表达GST蛋白，同时表达外源目的基因，收集待分离的细胞制成单细胞悬浮液；
2）将抗GST单克隆抗体与二抗磁珠混合均匀，使抗GST单克隆抗体结合到磁珠表面；
3）在制成的单细胞悬浮液中加入结合有抗GST单克隆抗体的磁珠，充分混匀，使之与表达膜型GST的转染阳性细胞结合；
抗GST的单克隆抗体与二抗磁珠的结合为：取二抗磁珠混悬液充分洗涤后，于磁架上静置，吸弃上清，加入缓冲液混匀；再加入单抗FMU-GST.3，置于垂直混匀仪上4℃颠倒混匀；于磁架上静置，吸弃上清，再用缓冲液洗涤；
抗GST的单克隆抗体与二抗磁珠结合后加入到单个细胞悬浮液中，在液相缓冲系统中，固相化的特异性结合GST的抗GST单克隆抗体高亲和力的结合表达膜型GST的转染细胞；
4）将细胞磁珠混悬液置于磁架上，利用外界磁场分选出吸附有磁珠的表达膜型GST的转染阳性细胞；
5）再利用含有凝血酶的切割缓冲液对表达膜型GST的转染阳性细胞进行切割，细胞表面表达的GST分子和结合的抗GST抗体、磁珠与阳性细胞分离，得到分选后纯化的转染阳性细胞；
含有凝血酶的切割缓冲液为HBSS液，并添加试剂：20mMTris-HCl，2.5mMCaCl2。
5.如权利要求4所述的的阳性细胞的筛选方法，其特征在于，利用脂质体介导法、磷酸钙介导法或是电穿孔法将构建成功的表达载体转染宿主细胞，24～48小时后收集转染细胞，制成单细胞悬浮液；
如果宿主细胞是悬浮培养细胞，则离心，弃上清，用新鲜培养基重悬细胞沉淀；
如果是贴壁培养的细胞，吸尽培养基后用0.25%胰酶-0.02%EDTA-PBS缓冲液进行消化，使细胞变为悬浮状态，然后离心，弃上清，用新鲜培养基重悬细胞沉淀，制成单个细胞悬浮液。
6.如权利要求4所述的的阳性细胞的筛选方法，其特征在于，利用外界磁场分选表达特定膜表面标志的细胞包括以下操作：
1）用缓冲液调整转染细胞密度为1×107/毫升，将细胞悬液与结合有单抗的磁珠混匀，置垂直混匀仪上4℃颠倒混匀；然后于磁架上静置，吸弃上清以去除未结合磁珠的阴性细胞；加入缓冲液混匀，于磁架上静置，吸弃上清，重复3次洗涤细胞，最后一次吸尽上清；
2）加入凝血酶缓冲液重悬细胞并于37℃预热，加入凝血酶消化GST与跨膜区之间的凝血酶切割位点，于37℃颠倒混匀，吹打混悬液5～10次以使免疫磁珠与阳性细胞解离；于磁架上静置，吸取上清转移至清洁无菌的EP管，获得的细胞即为高纯度的转染阳性细胞。
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