CN115850513A - 一种重组nmda受体蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及生物技术的技术领域，具体公开了一种重组NMDA受体蛋白及其应用，所述重组NMDA受体蛋白包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。本申请还提供了稳定过表达上述重组NMDA受体蛋白的细胞，并将其应用于抗NMDA受体抗体脑炎检测产品的制备中。本申请通过将HSP70蛋白的核心序列与NMDA受体蛋白的完整序列组合，构建的重组NMDA受体蛋白的表达量更高，与抗NMDA受体抗体的结合能力更强。稳定过表达重组NMDA受体的细胞与抗NMDA受体抗体的结合效率更高，进一步提高了检测反应的灵敏性，检测结果更加准确。

Description

一种重组NMDA受体蛋白及其应用

技术领域

本申请涉及生物技术的技术领域，更具体地说，涉及一种重组NMDA受体蛋白及其应用。

背景技术

NMDA受体(N-methyl-D-asparticacidreceptor)即为N-甲基-D-天冬氨酸受体，是离子型谷氨酸受体的一个亚型，分子结构复杂。NMDA受体通过和与其共轭的离子通道以及调节部位三者形成复合体，进而发挥生物学功能。功能性的NMDA受体必须含有NR1亚单位，多个NR2亚单位与NR1共同形成四聚体(或五聚体)。NR1是构成离子通道的基本亚单位；NR2是调节亚单位，不同NR2组成的NMDA受体表现出不同的脑内分布与生理学特性。

NMDA受体是中枢神经系统内一类重要的兴奋性氨基酸(excitatoryaminoacid，EAA)受体。NMDA受体不仅在神经系统发育过程中发挥着重要的生理作用，如调节神经元的存活、调节神经元树突、轴突结构发育及参与突触可塑性的形成等，在神经元回路的形成中NMDA受体亦起着关键性作用，有资料表明NMDA受体是学习与记忆过程中一类至关重要的受体。

抗NMDA受体抗体脑炎是一种由抗NMDA受体抗体介导的自身免疫性脑炎，主要是由于神经元表面的NMDA受体可逆性减少而引起的一种神经元障碍性疾病，其主要病因包括肿瘤及感染性疾病，无传染性，好发人群为女性、患肿瘤的人群，感染或劳累均是潜在的诱发因素。

典型的抗NMDA受体抗体脑炎在病程中经历5个阶段，分别为：1.前驱期(头痛、乏力、发热等流感样症状)；2.精神障碍期：此期患者表现为严重的精神障碍，如双向情感障碍或精神分裂症，多就诊于精神科；3.无反应低通气期：此期患者对外界反应能力下降，且表现为中枢性低通气，需要气管插管；4.运动障碍和自主神经功能紊乱期：此期患者表现为明显的运动障碍(不能自主运动)和多种多样的自主神经功能紊乱；5.恢复期或死亡。

目前，主要使用纯化后的NMDA受体蛋白对脑脊液中的抗NMDA受体抗体进行检测。但NMDA受体蛋白为跨膜蛋白，直接表达纯化获得的蛋白的空间构象与天然状态下的构象存在一定的差异，且容易受到外界环境的影响导致蛋白的表达量较低，从而产生假阴性结果，准确性较差。

发明内容

为了降低抗NMDA受体抗体检测中的假阴性现象，本申请提供一种重组NMDA受体蛋白及其应用，所述重组NMDA受体蛋白融合了热休克蛋白70(Heatshockproteins70，HSP70)的核心序列与NMDA受体蛋白的完整序列，进一步构建稳定过表达上述重组NMDA受体蛋白的细胞，从而在保证重组NMDA受体蛋白构象正确的基础上提高蛋白的表达量，进而进行检测，对抗NMDA受体抗体的检测更加灵敏，降低了假阴性出现的概率，结果更加准确。

第一方面，本申请提供一种重组NMDA受体蛋白，采用如下技术方案：

一种重组NMDA受体蛋白，所述重组NMDA受体蛋白包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

本申请中，选取HSP70蛋白的核心序列与NMDA受体蛋白的完整序列构建上述重组NMDA受体蛋白，仅选取HSP70蛋白的核心序列可以避免因序列过长而影响蛋白的表达效果，从而提高转录、翻译的效率，进而提高蛋白的表达量。重组NMDA受体蛋白中，NMDA受体蛋白的完整序列保留了与抗NMDA受体抗体结合的功能，HSP70蛋白的核心序列则具有促进NMDA受体蛋白表达与折叠的作用，使重组NMDA受体蛋白在保证蛋白构象接近天然构象的基础上提高其表达量，与抗NMDA受体抗体的结合效率更高，从而提高检测反应的灵敏性与准确性。

第二方面，本申请提供一种核酸分子，采用如下技术方案：

一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的重组NMDA受体蛋白。

优选地，所述核酸分子包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

本申请中，对编码上述重组NMDA受体蛋白的核酸分子进行了密码子优化，进一步提高了蛋白的表达量。

第三方面，本申请提供一种载体，采用如下技术方案：

一种载体，所述载体表达第一方面所述的重组NMDA受体蛋白。

优选地，所述载体含有至少一个拷贝的第二方面所述的核酸分子。

优选地，所述载体包括慢病毒载体。

第四方面，本申请提供一种重组慢病毒，采用如下技术方案：

一种重组慢病毒，所述重组慢病毒含有至少一个拷贝的第三方面所述的载体。

优选地，所述重组慢病毒的基因组中含有至少一个拷贝的第二方面所述的核酸分子。

第五方面，本申请提供一种稳定过表达重组NMDA受体的细胞，采用如下技术方案：

一种稳定过表达重组NMDA受体的细胞，所述稳定过表达重组NMDA受体的细胞稳定过表达第一方面所述的重组NMDA受体蛋白。

优选地，所述稳定过表达重组NMDA受体的细胞中含有第四方面所述的重组慢病毒。

优选地，所述稳定过表达重组NMDA受体的细胞中含有第三方面所述的载体。

优选地，所述稳定过表达重组NMDA受体的细胞的基因组中整合有至少一个拷贝的第二方面所述的核酸分子。

本申请中，通过重组慢病毒将上述重组NMDA受体蛋白的编码序列整合到受体细胞的基因组中，从而实现蛋白的持续性稳定表达。一方面，构建持续性稳定表达重组蛋白的稳转细胞有利于提高蛋白的表达量；另一方面，构建持续性稳定表达重组蛋白的稳转细胞可以帮助合成的重组蛋白形成更接近于天然状态下的构象，从而提升与抗NMDA受体抗体的结合效率，提高灵敏度，进一步保证检测结果的准确性。

第六方面，本申请提供一种第五方面所述的稳定过表达重组NMDA受体的细胞的制备方法，采用如下技术方案：

一种稳定过表达重组NMDA受体的细胞的制备方法，所述稳定过表达重组NMDA受体的细胞的制备方法包括：

将第四方面所述的重组慢病毒侵染受体细胞，筛选，得到所述稳定过表达重组NMDA受体的细胞。

第七方面，本申请提供第一方面所述的重组NMDA受体蛋白和/或第五方面所述的稳定过表达重组NMDA受体的细胞在制备抗NMDA受体抗体脑炎检测产品中的应用。

第八方面，本申请提供一种抗NMDA受体抗体脑炎检测产品，采用如下技术方案：

一种抗NMDA受体抗体脑炎检测产品，所述抗NMDA受体抗体脑炎检测产品包括第一方面所述的重组NMDA受体蛋白和/或第五方面所述的稳定过表达重组NMDA受体的细胞。

第九方面，本申请提供一种抗NMDA受体抗体脑炎检测载片，采用如下技术方案：

一种抗NMDA受体抗体脑炎检测载片，所述抗NMDA受体抗体脑炎检测载片包括第五方面所述的稳定过表达重组NMDA受体的细胞。

本申请中，在细胞内表达重组NMDA受体蛋白，形成的蛋白构象更接近于天然状态下的构象；再将稳定过表达重组NMDA受体的细胞固定在载片上，使其与样本中的抗NMDA受体抗体结合，模拟了天然状态下NMDA受体蛋白与抗NMDA受体抗体的结合，从而提高了检测反应的灵敏度，使检测结果更加准确。

第十方面，本申请提供一种抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒，采用如下技术方案：

一种抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒，所述抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒包括第五方面所述的稳定过表达重组NMDA受体的细胞和/或第九方面所述的抗NMDA受体抗体脑炎检测载片。

优选地，所述抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒还包括FITC标记的人IgG单克隆抗体。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1.本申请通过将HSP70蛋白的核心序列与NMDA受体蛋白的完整序列融合，构建了重组NMDA受体蛋白，其C端的NMDA受体蛋白的完整序列保留了与抗NMDA受体抗体结合的功能，其N端的HSP70蛋白核心序列具有促进蛋白表达及正确折叠的作用，通过二者的配合，从而保证上述重组NMDA受体蛋白的高级结构尽可能接近天然NMDA受体蛋白的结构，增加与抗NMDA受体抗体的结合能力，并提高重组NMDA受体蛋白在细胞内的表达水平，从而提高检测反应的灵敏性。

2.本申请还构建了稳定过表达重组NMDA受体的细胞，并将其固定在载片上，再对样本进行检测。与直接使用表达纯化后的NMDA受体蛋白进行检测相比，上述稳定过表达重组NMDA受体的细胞显著提升了蛋白的表达水平，有利于降低检测反应中假阴性出现的概率；此外，细胞中的重组NMDA受体蛋白的构象也更接近天然的NMDA受体蛋白，与抗NMDA受体抗体的结合效率更高，进一步提高了检测反应的灵敏性，保证了检测结果的准确性。

3.本申请构建的稳定过表达重组NMDA受体的细胞可进行稳定的蛋白表达及传代培养，使用本申请制备的抗NMDA受体抗体脑炎检测产品对样本进行检测时，仅需培养上述稳定过表达重组NMDA受体的细胞，再将其固定在载片上即可进行后续的检测；直接使用NMDA受体蛋白进行检测时还需要进行复杂的诱导蛋白表达、收集蛋白并进行纯化的过程，操作更为复杂，检测效率比较低，对操作人员的技术水平要求也较高。

附图说明

图1为实施例5中瞬时表达重组NMDA受体的细胞对抗NMDA受体抗体的检测结果图片(放大倍数＝100倍)。

图2为实施例5中稳定过表达天然NMDA受体的细胞对抗NMDA受体抗体的检测结果图片(放大倍数＝100倍)。

图3为实施例5中稳定过表达重组NMDA受体的细胞对抗NMDA受体抗体的检测结果图片(放大倍数＝100倍)。

图4为实施例8中使用实施例7中的抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒的检测结果图片(放大倍数＝100倍)。

图5为实施例8中使用市售抗谷氨酸受体抗体检测试剂盒的检测结果图片(放大倍数＝100倍)。

具体实施方式

本申请提供一种重组NMDA受体蛋白，所述重组NMDA受体蛋白包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

本申请还提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码上述的重组NMDA受体蛋白。

具体地，所述核酸分子包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

本申请还提供了一种载体，所述载体表达上述的重组NMDA受体蛋白。

具体地，所述载体含有至少一个拷贝的上述核酸分子。

本申请还提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒含有至少一个拷贝的上述载体。

具体地，所述重组慢病毒的基因组中含有至少一个拷贝的上述核酸分子。

本申请还提供了稳定过表达重组NMDA受体的细胞，所述稳定过表达重组NMDA受体的细胞稳定过表达上述重组NMDA受体蛋白。

具体地，所述稳定过表达重组NMDA受体的细胞中含有上述重组慢病毒。

具体地，所述稳定过表达重组NMDA受体的细胞中含有上述载体。

具体地，所述稳定过表达重组NMDA受体的细胞的基因组中整合有至少一个拷贝的上述核酸分子。

本申请还提供了上述稳定过表达重组NMDA受体的细胞的制备方法，具体包括：

将上述的重组慢病毒侵染受体细胞，筛选，得到所述稳定过表达重组NMDA受体的细胞。

本申请还提供了一种抗NMDA受体抗体脑炎检测产品，所述抗NMDA受体抗体脑炎检测产品包括上述重组NMDA受体蛋白和/或稳定过表达重组NMDA受体的细胞。

本申请还提供了一种抗NMDA受体抗体脑炎检测载片，所述抗NMDA受体抗体脑炎检测载片包括上述稳定过表达重组NMDA受体的细胞。

本申请还提供了一种抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒，所述抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒包括上述稳定过表达重组NMDA受体的细胞和/或抗NMDA受体抗体脑炎检测载片。

具体地，所述抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒还包括FITC标记的人IgG单克隆抗体。

以下结合实施例1～8以及附图1～5对本申请的技术方案作进一步说明。

实施例1

本实施例提供一种重组NMDA受体蛋白，所述重组NMDA受体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

上述重组NMDA受体蛋白根据HSP70蛋白的核心序列与NMDA受体蛋白的完整序列构建得到，其在细胞内的表达量高，且折叠后形成的高级结构十分接近NMDA受体蛋白的天然结构。

实施例2

本实施例提供一种慢病毒载体，所述慢病毒载体为插入了实施例1中的重组NMDA受体蛋白的编码序列的pHAGE-puro载体。

上述慢病毒载体通过如下方法进行制备：

(1)人工合成编码上述重组NMDA受体蛋白的核苷酸序列(如SEQ ID No.2所示)，合成时在编码序列的两端分别加入NotI和XbaI的酶切位点。

(2)使用NotI和XbaI(ThermoFisher公司)在37℃下水浴酶切pHAGE-puro(优宝生物技术有限公司)载体4h，使用胶回收试剂盒(ThermoFisher公司)回收酶切后的线性化质粒片段，利用同源重组试剂盒(南京诺维赞科技有限公司)与人工合成的编码序列进行同源重组。同源重组体系如表1所示。

表1同源重组体系

组分	体积(μL)
		线性化pHAGE-puro载体	2
人工合成的编码序列	3
		2×cloneExpressMix	5
总体积	10

反应条件为在50℃下孵育10min，降温至4℃后立即置于冰上。

重组产物转化大肠杆菌DH5α，涂板后在37℃的培养箱中过夜培养，次日挑选阳性菌落，扩大培养后进行测序鉴定，鉴定正确后，使用去内毒素质粒提取试剂盒(ThermoFisher公司)抽提质粒，获得慢病毒载体puro-rNMDA。

实施例3

本实施例提供一种重组慢病毒，所述重组慢病毒的基因组中整合有编码上述重组NMDA受体蛋白的核苷酸序列。

上述重组慢病毒通过如下方法进行制备：

取生长状态良好的293T细胞，接种于10cm的培养皿中。

待细胞密度达到约70％时，将慢病毒载体puro-rNMDA、辅助质粒pMD2.G(优宝生物技术有限公司)和psPAX2(优宝生物技术有限公司)共转染至293T细胞内，质粒溶液总体积与转染试剂Transport5^TM(ThermoFisher公司)的使用体积的比例为1:2。

60h后收取集细胞上清，4℃、3000g离心15min，收集上清液使用0.45μm滤膜过滤，滤液即为上述重组慢病毒的病毒悬液。将重组慢病毒的病毒悬液在-80℃下保存。

实施例4

本实施例提供一种稳定过表达重组NMDA受体的细胞，所述稳定过表达重组NMDA受体的细胞的基因组中整合实施例1中的重组NMDA受体蛋白的编码序列。

上述稳定过表达重组NMDA受体的细胞通过如下方法进行制备：

(1)确定最佳嘌呤霉素筛选浓度。

取对数期生长的293T细胞，接种于24孔板。

培养24h后，加入梯度浓度的嘌呤霉素，梯度浓度依次为0、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL及0.7μg/mL，在37℃、5％CO₂浓度的培养箱中培养。

48h后，观察24孔板中细胞的死亡情况，以杀死全部细胞的最小浓度为最佳嘌呤霉素筛选浓度。

最终确定最佳嘌呤霉素筛选浓度为0.3μg/mL。

(2)病毒侵染及稳定过表达重组NMDA受体的细胞的筛选。

取对数生长期的293T细胞接种于6孔板中，待细胞密度达到约70％时，按培养基与病毒悬液的体积比为1:1加入实施例3制备的重组慢病毒的病毒悬液以及终浓度为0.3μg/mL的嘌呤霉素，侵染48h后吸除液体，并补加培养基，同时加入终浓度为0.3μg/mL的嘌呤霉素继续筛选。向未经处理的293T细胞中加入相同浓度的嘌呤霉素作为阴性对照。

48h后，阴性对照细胞全部死亡，加入病毒悬液的孔板中存活的细胞即为抗性细胞。

挑取抗性细胞重复上述过程3～5次，继续筛选，最终获得稳定过表达重组NMDA受体的细胞，并进行冻存。

实施例5

本实施例验证实施例4制备的稳定过表达重组NMDA受体的细胞与抗NMDA受体抗体的结合能力，同时使用稳定过表达天然NMDA受体的细胞以及瞬时表达重组NMDA受体的细胞作为对照。

稳定过表达天然NMDA受体的细胞通过如下方法进行制备：

人工合成编码天然NMDA受体蛋白的核苷酸序列(如SEQ ID No.3所示)，合成时在编码序列的两端分别加入NotI和XbaI的酶切位点，通过同源重组的方式连入pHAGE-puro载体中，获得慢病毒载体puro-NMDA。再利用上述慢病毒载体puro-NMDA包装重组慢病毒，再侵染293T细胞并进行筛选，获得稳定过表达天然NMDA受体的细胞。具体步骤参见实施例2～4。

瞬时表达重组NMDA受体的细胞通过如下方法进行制备：

(1)人工合成编码重组NMDA受体蛋白的核苷酸序列(如SEQ ID No.2所示)，合成时在编码序列的两端分别加入NotI和XbaI的酶切位点。

(2)使用NotI和XbaI在37℃下水浴酶切pCDNA3.1(优宝生物技术有限公司)载体4h，使用胶回收试剂盒回收酶切后的线性化质粒片段，利用同源重组试剂盒与人工合成的编码序列进行同源重组。同源重组体系参见表1。

反应条件为在50℃下孵育10min，降温至4℃后立即置于冰上。

重组产物转化大肠杆菌DH5α，涂板后在37℃的培养箱中过夜培养，次日挑选阳性菌落，扩大培养后进行测序鉴定，鉴定正确后，使用去内毒素质粒提取试剂盒抽提质粒，获得表达载体pc3.1-rNMDA。

(3)取生长状态良好的293T细胞，接种于10cm的培养皿中。

待细胞密度达到约70％时，将表达载体pc3.1-rNMDA转染至293T细胞内，质粒溶液体积与转染试剂Transport5^TM的使用体积的比例为1:2。

转染成功后，将细胞置于37℃、5％CO₂浓度的培养箱中继续培养96h，获得瞬时表达重组NMDA受体的细胞。

对稳定过表达重组NMDA受体的细胞、稳定过表达天然NMDA受体的细胞以及瞬时表达重组NMDA受体的细胞与抗NMDA受体抗体的结合能力进行检测，步骤如下：

将细胞爬片置于6孔板中，再向6孔板中分别接种稳定过表达重组NMDA受体的细胞、稳定过表达天然NMDA受体的细胞以及瞬时表达重组NMDA受体的细胞，每孔接种约1×10⁶个细胞。细胞贴壁后，使用PBS轻柔漂洗3次，去除未贴壁的细胞，再使用4％多聚甲醛固定，取出细胞爬片，并进行检测。

检测步骤如下：

1.取出细胞爬片，室温放置10min。

2.样品孵育：向细胞爬片上固定细胞的反应区内加入待检测样品，室温孵育1h。

3.清洗：吸去待检测样品，在洗涤盒中加入20mL磷酸盐缓冲液清洗玻片3次，每次5min。

4.孵育：向每个反应区内加入FITC标记的人IgG单克隆抗体(购自Merck公司)，室温孵育30min。

5.清洗：吸去反应区中的FITC标记的人IgG单克隆抗体，在洗涤盒中加入20mL磷酸盐缓冲液清洗玻片3次，每次5min。

6.封片：向每个反应区内加入甘油，防止荧光淬灭。

7.盖上盖玻片，避免产生气泡。

8.在显微镜下读取绿色荧光结果，在20倍物镜下观察。

9.结果分析：对结果进行分析。

瞬时表达重组NMDA受体的细胞对抗NMDA受体抗体的检测结果图片如图1所示。稳定过表达天然NMDA受体的细胞对抗NMDA受体抗体的检测结果图片如图2所示。稳定过表达重组NMDA受体的细胞对抗NMDA受体抗体的检测结果图片如图3所示。

对比图1和图3，可以看出，与瞬时表达相比，构建的稳定过表达重组NMDA受体的细胞的荧光更强，表达重组NMDA受体蛋白的细胞的数量也更多，说明相比于瞬时表达，构建稳定过表达重组NMDA受体蛋白的细胞可以提高蛋白的表达量，从而提高检测反应的灵敏度。此外，构建的稳定过表达重组NMDA受体的细胞可以进行连续传代培养，检测时仅需培养细胞再进行固定即可，相比于每次检测均需要进行质粒提取以及细胞转染的瞬时表达重组NMDA受体的细胞的获取方法，使用稳定过表达重组NMDA受体的细胞进行检测的操作更加简单，检测效率更高，成本也更低。

对比图2和图3，可以看出，与天然NMDA受体蛋白相比，本申请中的重组NMDA受体蛋白与抗NMDA受体抗体的结合效果更好，荧光更强。本申请仅选取HSP70蛋白的核心序列与NMDA受体蛋白的完整序列构建重组蛋白，蛋白序列短，表达效率高；HSP70有助于进一步提高蛋白的表达效率，同时帮助NMDA受体蛋白正确折叠，形成更接近天然蛋白构象的高级结构，从而提升与抗NMDA受体抗体的结合能力。

综合上述结果，可以看出稳定过表达重组NMDA受体的细胞与抗NMDA受体抗体的结合效果更好，荧光更强，适合应用于抗NMDA受体抗体脑炎的相关检测中。

实施例6

本实施例提供一种抗NMDA受体抗体脑炎检测载片，所述抗NMDA受体抗体脑炎检测载片通过如下方法进行制备：

将细胞爬片置于6孔板中，再向6孔板中接种稳定过表达重组NMDA受体的细胞，每孔接种约1×10⁶个细胞。

细胞贴壁后，使用PBS轻柔漂洗3次，去除未贴壁的细胞，再使用4％多聚甲醛固定，取出细胞爬片，即为抗NMDA受体抗体脑炎检测载片。

实施例7

本实施例提供一种抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒，所述抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒包括实施例6中的抗NMDA受体抗体脑炎检测载片、FITC标记的人IgG单克隆抗体和清洗液(即磷酸盐缓冲液)。

实施例8

本实施例对实施例7制备的抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒以及市售抗谷氨酸受体抗体检测试剂盒(间接免疫荧光法)(欧蒙医学实验诊断股份公司，货号为FA111m-2010-3)的检出限、特异性以及NMDA受体蛋白的表达量进行检测。

检出限检测

对抗NMDA受体抗体阳性的样品按1:320、1:640和1:1280的比例依次进行稀释，稀释后的血清分别使用市售抗谷氨酸受体抗体检测试剂盒和实施例7中的抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒进行检测，对试剂盒的检出限进行判断。

市售抗谷氨酸受体抗体检测试剂盒的检测方法参照产品的使用说明书，实施例7中的抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒的检测方法参照实施例5中的检测步骤。

市售抗谷氨酸受体抗体检测试剂盒和实施例7中的抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒的检测限的检测结果如表2所示。

表2抗谷氨酸受体抗体检测试剂盒的检测限检测结果

稀释比例	1:320	1:640	1:1280
				市售抗谷氨酸受体抗体检测试剂盒	+	+	-
抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒	+	+	+

表2中，“+”代表检测结果为阳性，“-”代表检测结果为阴性。

由表2可以看出，与市售试剂盒相比，本申请中的抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒的检出限更低，表明其具有更高的灵敏性，降低了假阴性结果的出现概率，提高了检测结果的准确性。

特异性检测

分别使用市售抗谷氨酸受体抗体检测试剂盒和实施例7中的抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒，对200例临床样本进行检测，其中抗谷氨酸受体抗体阳性样本76例，抗谷氨酸受体抗体阴性样本124例。具体的检测过程参见检出限检测。对检测结果进行统计，结果如表3所示。

表3抗谷氨酸受体抗体检测试剂盒对临床样本的检测结果

由表3可以看出，两种试剂盒的阳性符合率和阴性符合率均为100％。以市售抗谷氨酸受体抗体检测试剂盒的检测结果作对照，本申请构建的抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒对于血清样本中的抗NMDA受体抗体的检测结果与市售产品的一致率能够达到100％，证明其与市售产品在临床使用中具有等效性，检测结果具有良好的特异性，结果十分准确。

NMDA受体蛋白的表达量检测

分别使用市售抗谷氨酸受体抗体检测试剂盒和实施例7中的抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒，对相同的已知为NMDA受体抗体阳性的样本进行检测，具体的检测步骤参见实施例5，检测结果如图4和图5所示。

图4为使用实施例7中的抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒的检测结果图片，图5为使用市售抗谷氨酸受体抗体检测试剂盒的检测结果图片。

对比图4和图5，可以看出，对相同的待测样本进行检测，使用实施例7中的抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒的检测图片荧光强度较亮，而使用市售抗谷氨酸受体抗体检测试剂盒的检测图片的荧光强度较弱，说明本申请中的稳定过表达重组NMDA受体的细胞中的重组NMDA受体的蛋白表达量更多，从而与更多的抗NMDA受体抗体结合，进而结合更多的荧光标记后的二抗，发出更多的荧光。重组NMDA受体蛋白的表达量较高也能够提高检测反应的灵敏度，增加结果的准确性。

综上，本申请构建的稳定过表达重组NMDA受体的细胞能够应用于抗NMDA受体抗体的检测中，制备的抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒与市售试剂盒的检测结果具有极高的一致性，可以认为其在临床使用中具有等效性。与市售试剂盒相比，本申请制备的抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒具有更低的检测限，NMDA受体蛋白的表达量也更高，从而与抗NMDA受体抗体的结合效果更好，提高了检测反应的灵敏度，降低了假阴性出现的概率，增加了检测结果的准确性。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1. 一种重组NMDA受体蛋白，其特征在于，所述重组NMDA受体蛋白包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的重组NMDA受体蛋白；

优选地，所述核酸分子包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

3.一种载体，其特征在于，所述载体表达权利要求1所述的重组NMDA受体蛋白；

优选地，所述载体含有至少一个拷贝的权利要求2所述的核酸分子。

4.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒含有至少一个拷贝的权利要求3所述的载体；

优选地，所述重组慢病毒的基因组中含有至少一个拷贝的权利要求2所述的核酸分子。

5.一种稳定过表达重组NMDA受体的细胞，其特征在于，所述稳定过表达重组NMDA受体的细胞稳定过表达权利要求1所述的重组NMDA受体蛋白；

优选地，所述稳定过表达重组NMDA受体的细胞中含有权利要求4所述的重组慢病毒；

优选地，所述稳定过表达重组NMDA受体的细胞中含有权利要求3所述的载体；

优选地，所述稳定过表达重组NMDA受体的细胞的基因组中整合有至少一个拷贝的权利要求2所述的核酸分子。

6.一种权利要求5所述的稳定过表达重组NMDA受体的细胞的制备方法，其特征在于，所述稳定过表达重组NMDA受体的细胞的制备方法包括：

将权利要求4所述的重组慢病毒侵染受体细胞，筛选，得到所述稳定过表达重组NMDA受体的细胞。

7.权利要求1所述的重组NMDA受体蛋白和/或权利要求5所述的稳定过表达重组NMDA受体的细胞在制备抗NMDA受体抗体脑炎检测产品中的应用。

8.一种抗NMDA受体抗体脑炎检测产品，其特征在于，所述抗NMDA受体抗体脑炎检测产品包括权利要求1所述的重组NMDA受体蛋白和/或权利要求5所述的稳定过表达重组NMDA受体的细胞。

9.一种抗NMDA受体抗体脑炎检测载片，其特征在于，所述抗NMDA受体抗体脑炎检测载片包括权利要求5所述的稳定过表达重组NMDA受体的细胞。

10.一种抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒，其特征在于，所述抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒包括权利要求5所述的稳定过表达重组NMDA受体的细胞和/或权利要求9所述的抗NMDA受体抗体脑炎检测载片；

优选地，所述抗NMDA受体抗体脑炎检测试剂盒还包括FITC标记的人IgG单克隆抗体。

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