CN110261620B

CN110261620B - 测定人血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的细胞免疫荧光试剂盒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110261620B
Application number: CN201910602135.8A
Authority: CN
Inventors: 段俗言; 邢昌赢; 袁杨刚; 张承宁; 张波
Original assignee: Jiangsu Province Hospital First Affiliated Hospital With Nanjing Medical University
Current assignee: Jiangsu Province Hospital First Affiliated Hospital With Nanjing Medical University
Priority date: 2019-07-05
Filing date: 2019-07-05
Publication date: 2022-09-09
Anticipated expiration: 2039-07-05
Also published as: CN110261620A

Abstract

本发明公开了测定人血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的细胞免疫荧光试剂盒及其制备方法和应用，其包括，盒体、设在盒体内的生物载玻片、盖玻片和设在盒体内的试剂；所述生物载玻片上包被有磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA转染细胞；所述盒体内的试剂包括荧光抗体试剂、阳性对照品、阴性对照品、血清样本稀释液、浓缩洗液、封片剂。所述试剂盒能够检测狼疮肾炎、糖尿病肾病及IgAN、MN、FSGS足细胞病的病人血清中的血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的浓度，作为诊断试剂盒，诊断特异性为100％，敏感性为98.1％。

Description

测定人血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的细胞免疫荧光试剂盒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于免疫学检测技术领域，具体涉及测定人血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的细胞免疫荧光试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

足细胞在维持肾脏血液滤过屏障的完整性方面起着关键作用。这些特殊的上皮细胞延伸出一个以肌动蛋白为基础的交叉足突网络，这个网络由一个独特的细胞连接处桥接，称为裂孔隔膜。裂孔隔膜的一个基本组成部分是跨膜蛋白-肾素nephrin，通过其胞外结构域的顺式和反式相互作用，nephrin有助于滤过孔径的形成，这在很大程度上决定了滤过蛋白的选择性。肾素和其他裂孔隔膜分子(如podocin)的异常表达导致足突消失，必要的血浆蛋白丢失到尿液中 (形成蛋白尿)。越来越多的证据表明，细胞表面稳定的nephrin表达是由内吞作用调节的，nephrin转换缺陷可能导致蛋白尿的产生。

建立一种有效、快速、简单、灵敏的用于检测狼疮肾炎、糖尿病肾病及 IgAN、MN、FSGS等足细胞病的试剂盒具有重要意义。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种测定人血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的细胞免疫荧光试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种测定人血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的细胞免疫荧光试剂盒，其包括，盒体、设在盒体内的生物载玻片、盖玻片和设在盒体内的试剂；

所述生物载玻片上包被有磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA转染细胞；

所述盒体内的试剂包括荧光抗体试剂、阳性对照品、阴性对照品、血清样本稀释液、浓缩洗液、封片剂。

作为本发明所述的测定人血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的细胞免疫荧光试剂盒的一种优选方案：所述荧光抗体试剂，为异硫氰酸荧光素(FITC) 标记的羊抗人IgG。

作为本发明所述的测定人血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的细胞免疫荧光试剂盒的一种优选方案：所述阳性对照品，为人源抗ShcA抗体阳性血清；所述阴性对照品，为人源ShcA抗体阴性血清。

作为本发明所述的测定人血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的细胞免疫荧光试剂盒的一种优选方案：所述血清样本稀释液，为pH＝7.2的0.05mol/L 磷酸盐缓冲液。

作为本发明所述的测定人血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的细胞免疫荧光试剂盒的一种优选方案：所述浓缩洗涤液，为含有体积分数为0.1％吐温 -20的pH＝7.2、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。

作为本发明所述的测定人血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的细胞免疫荧光试剂盒的一种优选方案：所述封片剂为甘油：PBS的体积比为1：1的封片剂。

作为本发明所述的测定人血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的细胞免疫荧光试剂盒的一种优选方案：所述盖玻片的尺寸为62mm×23mm。

作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供所述的测定人血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的细胞免疫荧光试剂盒的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：所述的测定人血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的细胞免疫荧光试剂盒的制备方法：为将所述磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA的三种异构体p46shc、p52shc和p66shc同时转染HEK 293细胞后接种于生物载玻片上。

作为本发明所述的方法的一种优选方案：所述转染，其转染参数为：

转染细胞密度：1×10⁷个/mL，

转染PEI浓度：4μg/mL，

转染质粒浓度：8μg/mL，

转染PEI：质粒：2：1，

细胞转染时间：4h，

抑制细胞生长素VPA浓度：3.8mmol/L，

表达培养细胞密度：2×10⁶个/mL，

表达时长：4d，

ShcA蛋白的表达量在40μg/mL。

作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供所述的测定人血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的细胞免疫荧光试剂盒的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：所述的测定人血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的细胞免疫荧光试剂盒的应用：所述试剂盒能够检测狼疮肾炎、糖尿病肾病及IgAN、MN、FSGS足细胞病的病人血清中的血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的浓度，作为诊断试剂盒，诊断特异性为 100％，敏感性为98.1％。

本发明的有益效果：本发明制备的试剂盒能够检测狼疮肾炎、糖尿病肾病及IgAN、MN、FSGS足细胞病的病人血清中的血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA 抗体的浓度，作为诊断试剂盒，诊断特异性为100％，敏感性为98.1％，操作简单、精确度高、耗时短。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明测定人血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的免疫荧光试剂盒检测流程图。

图2为本发明用于测定人血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的免疫荧光试剂盒的阳性对照品及阴性对照品荧光反应图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明制备细胞荧光免疫检测试剂盒，将表达ShcA蛋白的转染细胞包被于生物载片中，固定在载玻片上，样品中(阳性对照品、阴性对照品、待检测人血清样品)的ShcA抗体与转染细胞上的ShcA蛋白结合，荧光抗体与ShcA 抗体结合，最终形成细胞-ShcA蛋白-ShcA抗体-荧光抗体复合物，形成荧光显微镜下所观察到的特异性荧光模式，最后用荧光显微镜观察结果。在整个反应过程中，样品中抗ShcA抗体含量越高，反应体系中荧光强度越高；反之，样品中抗ShcA抗体含量越少，荧光强度越低。

本发明血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的半定量检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的化学发光板和设在盒体内的试剂为：

1、生物载片，每张载片有5×3个反应区，每个反应区上包被有ShcA转染细胞细胞。

2、荧光抗体试剂：异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗人IgG。

3、阳性对照品：人源抗ShcA抗体阳性血清。

4、阴性对照品：人源ShcA抗体阴性血清。

5、血清样本稀释液：pH＝7.2，0.05mol/L磷酸盐缓冲液。

6、浓缩洗涤液：含有体积分数0.1％吐温-20的pH＝7.2，0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBST)。使用前用双蒸水稀释至工作浓度后使用，用于实验过程中洗涤载玻片。

7、封片剂：甘油溶液(甘油：PBS体积比为1：1)。

8、盖玻片：尺寸为62mm×23mm。

本发明提供血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的半定量检测试剂盒适用于检测蛋白尿患者中的血清样本中的ShcA抗体含量。

本发明用于测定血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的免疫荧光试剂盒，测定方法的检测步骤如下：

1.试剂准备：使用前，将试剂盒所有组分于室温下放置20分钟，浓缩洗液(20×)在使用前必须用纯化水稀释20倍。

2.样本准备：待测样本用样本稀释液进行1：10、1：100、1：1000稀释。例如：取10μL样本加90μL样本稀释液充分混匀即得1：10稀释样本；取1 μL样本加99μL样本稀释液充分混匀即得1：100稀释样本；取1μL样本加 999μL样本稀释液充分混匀即得1：1000稀释样本。

3.样本孵育：滴加30μL样本(阳性对照品、阴性对照品、待检测人血清稀释样品)至加生物载片反应区，避免产生气泡。确保每个样品与生物载片充分接触，且各个样品不会相互接触，室温(+18℃至+25℃)下孵育20分钟。

4.清洗：先用已稀释的洗液(PBST)冲洗生物载片，然后立即将生物载片浸入含有PBST的洗杯中5分钟。建议用旋转摇床摇动。取出生物载片用吸水纸擦去背面和边缘的水分。

5.荧光抗体孵育：滴加25μL荧光抗体至生物载片反应区，确保荧光抗体与生物载片充分接触，且各个反区荧光抗体不会相互接触，室温(+18℃至 +25℃)下孵育20分钟。

6.清洗：先用已稀释的洗液(PBST)冲洗生物载片，然后立即将生物载片浸入含有PBST的洗杯中5分钟。建议用旋转摇床摇动。取出生物载片用吸水纸擦去背面和边缘的水分。

7.封片：滴加10μL封片剂置盖玻片上，生物载片载玻片(覆有生物载片的一面朝下)，盖在盖玻片上，避免产生气泡。

8.荧光检测：用荧光显微镜读取荧光强度。

实施例1：

表达ShcA转染细胞的生物载片的制备：

1.细胞转染：

ShcA是一种与酪氨酸激酶受体结合的衔接蛋白，存在三种剪接异构体： p46shc、p52shc和p66shc，我们认为三种结构同时检测为最优诊断检测方案，在细胞转染生物载片中，将三种结构的质粒同时进行细胞转染。

转染用质粒：

①p46shc质粒：

以SchA基因DNA为模板，设计引物扩增目的片段，BamHI、HindIII酶切连接到pet28a质粒上转化E.coliDH5α，挑取阳性克隆测序，测序正确的克隆提取质粒。

引物名称	序列5'-3'
		p46shc上游引物	5'TTAGTGAGGCCGGAAGTGAGT 3'
p46shc下游引物	5'AGCAATGGAAAAGAAAATAGGAAAG 3'

②p52shc质粒：

以DNA为模板，设计引物扩增目的片段，BamHI、HindIII酶切连接到pet28a 质粒上转化E.coliDH5α，挑取阳性克隆测序，测序正确的克隆提取质粒。

引物名称	序列5’-3’
		p52shc上游引物	5'CATTGGCTAACTCGGGAAAGTG 3'
p52shc下游引物	5'TTCAGGAGGAAGGGCTGCA 3'

③p66shc质粒：

引物名称	序列5’-3’
		p66shc上游引物	5'GGCCACAGAGGTCCAACCA 3'
p66shc下游引物	5'CCAAACGAGGTCCCGAGAG 3'

本发明SchA基因的来源：人源

SchA基因的NCBI编号：

SchA基因	NCBI编号
		p46shc	NM_001202859.2
p52shc	NM_001130041.2
		p66shc	NM_183001.5

细胞转染过程：

转染前16小时将HEK 293细胞从10mL无血清培养基中接种到10cm培养皿中，使用Turbofect试剂(Thermo Fisher Scientific)将HEK293细胞对p46shc、 p52shc和p66shc同时进行转染。

转染前将细胞传至2*10⁶，细胞转染密度是1*10⁷，每100ml密度为2*10⁶的细胞中加入DNA，将100ml、密度为2*10⁶的细胞离心，1500rpm，5min， 10ml培养基重悬，转入三角瓶，加入DNA，摇匀，加入PEI 400ul，混匀，放入培养箱，培养4h，125rpm，取500ml三角瓶，加入90ml预热培养基，800ulVPA，将10ml转染细胞加入预热培养基，37℃、125rpm培养5天，收样取上清纯化。

转染参数：

转染细胞密度：1×10⁷个/mL，

转染PEI(sigma公司25kDa)浓度：4μg/mL，

转染质粒浓度：8μg/mL，

转染PEI：质粒：2：1，

细胞转染时间：4h，

抑制细胞生长素VPA浓度：3.8mmol/L，

表达培养细胞密度：2×10⁶个/mL，

表达时长：4.5～5.5d，

ShcA蛋白的表达量40μg/mL。

生物载片制备：

把盖玻片在酸缸中浸泡1天，用自来水将其表面的硫酸冲干净，再用双蒸水冲洗三遍，行120℃30min高压灭菌，然后把玻片浸泡于纯乙醇中，于四度冰箱储存。实验时在超净台内取出储存的玻片，使之过火后放入六孔板中，待细胞生长至铺满培养瓶80％左右时，把培养皿中培养液弃去，用PBS洗涤细胞三次，弃去洗涤液，再加入胰酶3ml，轻轻晃动培养皿，使胰蛋白酶液均匀覆盖皿底；置于33℃培养箱中消化1min左右，直到在倒置显微镜下细胞回缩变圆，立即用3ml完全培养液终止。用移液器反复吹打皿底上的细胞。将含细胞的培养液移至离心管中，进行1200r/min离心5min，弃去上清；然后加入完全培养液5ml，均匀传代至六孔培养板中，每孔加入完全培养液2ml，并置于33℃、 5％CO₂培养箱中进行培养。将表达ShcA转染细胞及未转染细胞接种在生物载片中。

图1为本发明测定人血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的免疫荧光试剂盒检测流程图。图2为本发明用于测定人血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的免疫荧光试剂盒的阳性对照品及阴性对照品荧光反应图。图2(a)ShcA转染细胞+阳性对照品，图2(b)未转染细胞+阳性对照品，图2(c)ShcA转染细胞+阴性对照品，图2(d)未转染细胞+阴性对照品。

实施例2：

实施例1试剂盒的应用：根据肾病综合征的诊断标准，((1)尿蛋白大于 3.5g/d；(2)血浆白蛋白低于30g/L；(3)水肿；(4)高脂血症。)并排除肾穿刺活检术禁忌，有明确肾脏活检病理诊断的患者，使用15例肾病综合征并获得肾脏活检病理诊断的血清样本，15例健康成人的血清样本，用实施例1方法制备的血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的免疫荧光试剂盒进行半定量测定，结果如下表所示。

表1 ShcA抗体检测结果

本发明通过将血清样本稀释不同的梯度，实现半定量检测人血清中ShcA 抗体，操作简单方便。能够用于上述疾病的诊断检测，也可用于现场快速诊断检测，特异性高。

进一步使用105例病人样本，52例正常人的小临床样本的检测实验中，出现0例假阳性，2例假阴性，即，假阳性率为0(特异性为100％)，假阴性率为1.9％(敏感性为98.1％)。

提本发明制备了一种操作简单、精确度高、耗时短，能批量快速测定足细胞损伤导致蛋白尿的患者中血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的试剂盒。

实施例3(对照例)：

本实施例与实施例1的区别在于，仅转染p46shc，检测特异性和敏感性较差，无法实现准确检测。

实施例4(对照例)：

本实施例与实施例1的区别在于，改变细胞转染参数为：

细胞转染密度：2×10⁷个/mL，

转染PEI 25kd(sigma公司25kDa)浓度：8μg/mL，

转染质粒浓度：4μg/mL，

转染PEI：质粒：3：1。

其余条件与实施例1相同。

发现转然后蛋白ShcA的表达量很低，因而造成检测特异性和敏感性均很差，无法实现准确检测。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种测定人血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的细胞免疫荧光试剂盒在制备检测狼疮肾炎试剂盒中的应用，其特征在于：所述试剂盒包括，盒体、设在盒体内的生物载玻片、盖玻片和设在盒体内的试剂；

所述生物载玻片上包被有磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA转染细胞；所述盒体内的试剂包括荧光抗体试剂、阳性对照品、阴性对照品、血清样本稀释液、浓缩洗涤液、封片剂，所述荧光抗体试剂，为异硫氰酸荧光素FITC标记的羊抗人IgG，所述阳性对照品，为人源抗ShcA抗体阳性血清；所述阴性对照品，为人源ShcA抗体阴性血清；

所述测定人血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的细胞免疫荧光试剂盒的制备方法包括：为将所述磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA的三种异构体p46shc、p52shc和p66shc同时转染HEK293细胞后接种于生物载玻片上，所述转染，其转染参数为：转染细胞密度：1×10⁷个/mL，转染用PEI浓度4μg/mL，转染质粒浓度：8μg/mL，转染PEI：质粒：2：1，细胞转染时间：4h，抑制细胞生长素VPA浓度：3 .8mmol/L，表达培养细胞密度：2×10⁶个/mL，表达时长：4d，ShcA蛋白的表达量在40μg/mL。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述血清样本稀释液，为pH＝7.2的0.05mol/L磷酸盐缓冲液。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述浓缩洗涤液，为含有体积分数为0.1％吐温-20的pH＝7.2、浓度为 0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述封片剂为甘油：PBS的体积比为1：1作为封片剂。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述盖玻片的尺寸为62mm×23mm。