CN110982693A - 一种用于检测aqp4抗体的细胞爬片及应用 - Google Patents

一种用于检测aqp4抗体的细胞爬片及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测AQP4抗体的细胞爬片及应用，所述细胞爬片是将HEK293T细胞贴壁生长在盖玻片上，再用含AQP4基因的pCMV‑HA‑AQP4表达质粒转染HEK293T细胞，获得表达AQP4蛋白的HEK293T细胞并固定；同时未转染AQP4蛋白HEK293T细胞固定于盖玻片上；然后将表达AQP4蛋白的HEK293T细胞盖玻片和未转染AQP4蛋白的HEK293T细胞盖玻片间隔固定在同一个载玻片的相同面上，分别作为反应区和对照区，获得所述细胞爬片。本方法可对细胞爬片成品细胞进行大量生产，且随取随用；检测人体内AQP4抗体的检验过程对设备的按要求相对较低，对技术要求低，时间花费少。

Description

一种用于检测AQP4抗体的细胞爬片及应用
(一)技术领域
本发明涉及一种检测人体血清中AQP4抗体的细胞爬片及应用于检测人体血清中AQP4抗体的方法。
(二)背景技术
中枢神经系统脱髓鞘疾病是一类轴索相对完整但脑和脊髓神经的纤维髓鞘脱失的疾病。多发性硬化(MS)和视神经脊髓炎(NMO)是较常见的两种不同的中枢神 经系统脱髓鞘疾病。但是这两类中枢神经系统脱髓鞘疾病因其临床症状复杂多变，诊 断和鉴别区分也相对困难。2004年科研人员首次在NMO患者血清中发现NMO-IgG 能与抗水通道蛋白4(AQP4)产生特异性结合，NMO-IgG被证实为抗AQP4抗体。 逐渐地，医学诊断标准将人体血清中血清的抗AQP4抗体阳性作为NMO区别于MS 的诊断支持条件。
目前，流式细胞分析法检测抗AQP4抗体对NMO诊断的敏感性和特异性相对较 高，是目前主要使用的诊断方法。但该方法有许多明显的缺点：(1)需要临时培养细 胞；(2)设备昂贵，不易普及；(3)对检验员技术要求高；(4)耗时相对较长。因此， 该研究方法很难在临床推广使用。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种检测人体血清中AQP4抗体的细胞爬片及用于检测人体血清中AQP4抗体的方法，同时具备以下特点：(1)细胞爬片保留了AQP4重组蛋白的 活性和构象，使其能与人体血清中AQP4抗体特异结合；(2)爬片成品可大量生产， 且随取随用；(3)检测人体血清中AQP4抗体的检验过程对设备的按要求相对较低； (4)检测人体血清中AQP4抗体的检验过程技术要求低，时间花费少。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种用于检测AQP4抗体的细胞爬片，所述细胞爬片是将HEK293T 细胞贴壁生长在盖玻片上，再用含AQP4基因的pCMV-HA-AQP4表达质粒转染 HEK293T细胞，获得表达AQP4蛋白的HEK293T细胞并固定；同时未转染AQP4蛋 白HEK293T细胞固定于盖玻片上；然后将固定后的表达AQP4蛋白的HEK293T细 胞盖玻片和未转染AQP4蛋白的HEK293T细胞盖玻片间隔固定在同一个载玻片的相 同面上，分别作为反应区和对照区，获得所述细胞爬片。所述AQP4基因核苷酸序列 为SEQ ID NO.1所示。
进一步，所述盖玻片厚度0.13-0.16mm，长50mm，宽24mm(世泰80340-3610)。 所述载玻片厚度1mm，长75mm，宽25mm(世泰80383-0004-01)。
进一步，所述含AQP4基因的pCMV-HA-AQP4表达质粒按如下方法制备：以人 类视神经cDNA为模板，通过PCR体外扩增的方法获得AQP4目的基因片段，并在 目的基因的两端设SalI/NotI双酶切位点；将含有SalI/NotI双酶切位点的目的基因片 段插入含有强组成型启动子CMV的pCMV-HA载体中，得到pCMV-HA-AQP4表达 质粒；pCMV-HA-AQP4表达质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态中，提取 pCMV-HA-AQP4表达质粒。
进一步，所述HEK293T细胞在玻片上贴壁生长方法为：在贴壁试剂原液(优选 购自北京细工ECAK-3)中加入9倍体积的PBS，制得贴壁试剂工作液；在10cm直 径圆形细胞培养皿中加入10ml贴壁试剂工作液，加入2片盖玻片，37℃孵育1小时 后，弃掉贴壁试剂工作液，用PBS清洗盖玻片2次，每次5分钟，使得HEK293T细 胞适合在盖玻片上贴附生长，获得预处理后的盖玻片；按照DMEM培养基：FBS： 双抗＝45：5：0.5(v/v/v)的比例配制完全培养基，其中双抗为Gibco公司15140163； 将HEK293T细胞接种至含完全培养基的10cm直径圆形细胞培养皿，37℃培养至细 胞生长密度达到90％以上，用Trypsin-EDTA(Gibco公司15140163)把细胞从培养 皿上消化下来，收集细胞，用完全培养基重悬细胞，即为细胞悬液；向含有预处理后 盖玻片的培养皿中加细胞悬液，在37℃，5％CO2的培养箱培养过夜，获得贴附于盖玻片上生长的HEK293T细胞；所述细胞悬液中细胞浓度为1×107个/ml。
进一步，所述转染按如下方法进行：
(1)将pCMV-HA-AQP4表达质粒加入opti-mem无血清培养基(Gibco公司 31985-070)制成15μg/500μL的A液；将Lipofectamine 2000转染液(invitrogen公司 11668019)以体积比40μL：500μL加入到opti-mem无血清培养基中，室温静置5min， 制成B液；将A液加入B液中混匀，然后室温静置15分钟，获得转染混合液；
(2)将HEK293T细胞贴壁生长的盖玻片加入opti-mem无血清培养基，再缓慢 滴入转染混合液，十字混匀后，在37℃，5％CO2的培养箱培养，作为转染组，每6h 更换一次培养液，获得表达AQP4蛋白的HEK293T细胞，所述转染混合液与opti-mem 无血清培养基体积比为450μL：10mL；同样条件下，以不滴加转染混合液且HEK293T 细胞贴壁生长的盖玻片加入完全培养基作为阴性对照组。
进一步，所述细胞固定方法为：
将HEK293T细胞贴壁生长的盖玻片，用无菌PBS清洗2次，每次5分钟；加4％ (即40g/L)多聚甲醛(PBS为溶剂)，室温固定30分钟，无菌PBS清洗2次，每次 5分钟；再用0.02％(即0.2g/L)叠氮钠水溶液浸泡盖玻片2次，每次5分钟，最后 风干，获得固定后的盖玻片。
本发明所述细胞爬片的制备方法为：将固定后的表达AQP4蛋白的HEK293T细 胞盖玻片和未表达AQP4蛋白的HEK293T细胞盖玻片分别割成边长4mm的正方形， 再用无影胶把切割完成的表达AQP4蛋白的盖玻片(AQP4(+)HEK293T)和未表达 AQP4蛋白的盖玻片(AQP4(-)HEK293T)间隔(间距1-2mm)贴在同一个载玻片的 相同面上，分别作为反应区(即图1中B区)和对照区(即图1中A区)，细胞爬片 制备完成。
本发明还提供一种所述细胞爬片在检测AQP4抗体中的应用，所述应用是采用免疫荧光法染色检测人体血清或脑脊液中的AQP4阳性抗体，具体步骤为：
(1)取出细胞爬片，室温放置10分钟；将细胞爬片放入暗盒中，向反应区和对 照区分别滴加PBST缓冲液(约200ul，确保盖玻片都被覆盖)，室温静置5分钟；
(2)封闭：吸去PBST，向反应区和对照区分别加入5％BSA封闭液(索莱宝 SW3015，约200μL)，室温封闭30分钟；
(3)样品孵育：吸去封闭液，向反应区和对照区分别加入待测样品稀释液(即PBST：样品＝9：1(v/v)，约200μL)，室温孵育1小时；所述待测样品为人体血清或 脑脊液；
(4)清洗：吸去待测样品稀释液，用PBST清洗细胞爬片3次，每次5分钟(注： 摇床上洗涤，摇速约60次/分钟)；
(5)孵育：向反应区和对照区分别加入200μL PBST稀释的FITC标记的抗AQP4 抗体的二抗，室温孵育30分钟(注：从此步骤起，请避光操作)；
(6)清洗：吸去反应区和对照区中的二抗，PBST清洗细胞爬片3次，每次5 分钟(注：摇床上洗涤，摇速约60次/分钟)；
(7)封片：分别向反应区和对照区加入DAPI封片剂(Abcam公司ab104139， 约70μL)，盖上盖玻片，避免产生气泡，采用免疫荧光法检测荧光强度；
(8)结果判读如下：
阳性判读：对照区与反应区的绿色荧光强度比较，TEST统计学检验，反应区绿 色荧光亮度显著高于对照区，即证明待测样品中含有AQP4抗体；
阴性判读：对照区与反应区的绿色荧光强度比较，TEST统计学检验，反应区亮 度与对照区无显著性差异，即证明待测样品中不含AQP4抗体。
相对于现有技术方法，本发明的有益效果为：
本发明先通过PCR方法从人类视神经cDNA中大量扩增出AQP4全长目的基因， 插入pCMV-HA载体中，得到pCMV-HA-AQP4表达质粒，后转染到贴附于盖玻片的 HEK293T细胞中，最终得到贴有AQP4(+)HEK293T盖玻片和未转染的 AQP4(-)HEK293T盖玻片的细胞爬片。本发明所制得的检测人体血清中AQP4抗体的 细胞爬片保留了AQP4重组蛋白的活性和构象，使其能与AQP4抗体特异结合；本方 法可对细胞爬片成品细胞进行大量生产，且随取随用；检测人体血清中AQP4抗体的 检验过程对设备的按要求相对较低，对技术要求低，时间花费少。
(四)附图说明
图1为本发明制备的检测人体血清中AQP4抗体的细胞爬片成品的示意图，其中 A区域为对照区；B区域为反应区。
图2为本发明制备的检测人体血清中AQP4抗体的细胞爬片成品检测NMO患者 和非NMO患者血清中AQP4抗体的结果，其中a为AQP4(-)HEK293T检测人类血清 中AQP4抗体阴性结果，b为AQP4(+)HEK293T检测人类血清中AQP4抗体阳性结果。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、AQP4抗体细胞爬片的制备
1、质粒构建：
1.1以人类视神经cDNA(Gene ID:361)为模板，引物为:
AQP4F：ACGCGTCGACGTCGGTTGTGGAGAACTTAGAGAGC
AQP4R:TAAAGCGGCCGCAAATACCCTTGCCACGGCCACCCT，通过PCR体 外扩增的方法获得AQP4目的基因片段(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示)，并在目 的基因的两端加设SalI/NotI双酶切位点；
1.2将含有SalI/NotI双酶切位点的目的基因片段插入含有强组成型启动子CMV的pCMV-HA载体(购自takara 635690)中，插入位点为SalI/NotI，得到pCMV-HA-AQP4表达质粒，通过酶切测序鉴定，最终确定pCMV-HA-AQP4表达质 粒。
1.3 pCMV-HA-AQP4表达质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态中，用无内毒素的大 提试剂盒(购自Qiagen公司12362)进行大提，得到5mg pCMV-HA-AQP4表达质粒。
2、细胞培养：
2.1在贴壁试剂原液(北京细工ECAK-3)中加入9倍体积的PBS，制得贴壁试 剂工作液。每个10cm直径圆形细胞培养皿加入10ml贴壁试剂工作液，加入2片普 通的盖玻片(厚度0.13-0.16mm，长50mm，宽24mm，世泰80340-3610)，37℃孵育 1小时后，弃掉贴壁试剂工作液，用PBS清洗盖玻片2次，每次5分钟，使得HEK293T 细胞适合在盖玻片上贴附生长；
2.2按照DMEM培养基：FBS：双抗＝45：5：0.5(v/v/v)的比例配制完全培养 基，其中双抗为(Gibco公司15140163)。将HEK293T细胞接种至含完全培养基的 10cm直径圆形细胞培养皿，37℃培养至细胞生长密度达到90％以上，然后用 Trypsin-EDTA(Gibco公司15140163)把细胞从培养皿上消化下来，收集细胞1×107个，用1ml完全培养基重悬细胞，即为1×107个/ml细胞悬液。向每个步骤2.1处理后 的含有盖玻片的培养皿中加细胞悬液500ul，在37℃，5％CO2的培养箱培养过夜，使 得细胞贴附于玻片上生长。
3、细胞转染：
3.1配制A液和B液：A液为500ul opti-mem无血清培养基(Gibco公司31985-070)中加入步骤1.3获得的15ug的pCMV-HA-AQP4表达质粒。B液为500ul opti-mem无 血清培养基中加入40ul的Lipofectamine 2000转染液(Invitrogen公司11668019)，室 温静置5min。
3.2将A液加入B液中混匀，然后室温静置15分钟，转染混合液配制完成。
3.3弃掉步骤2.2培养过夜后培养皿中原有完全培养基，加入10ml opti-mem无血清培养基，再缓慢滴入转染混合液450ul，十字混匀后，在37℃，5％CO2的培养箱培 养，作为转染组。同样条件下，以不滴加转染混合液且不更换培养基的步骤2.2培养 过夜后培养皿为阴性对照组。
3.4步骤3.3转染后每6小时观察转染组和阴性对照组细胞形态，弃掉转染组培养皿中opti-mem无血清培养基，换液为10ml完全培养基培养；阴性对照组也弃掉完全 培养基并更换新的完全培养基。
4、细胞固定：
4.1步骤3.4转染30小时后取出所有盖玻片，其中转染组记为玻片 AQP4(+)HEK293T，阴性对照组记为玻片AQP4(-)HEK293T，无菌PBS清洗2次，每 次5分钟；
4.2加4％多聚甲醛，室温固定30分钟，无菌PBS清洗2次，每次5分钟；
4.3再用0.02％叠氮钠浸泡盖玻片2次，每次5分钟，最后风干；
4.4用玻璃刀将步骤4.3盖玻片切割成边长4mm的正方形，再用无影胶把切割完 成的盖玻片AQP4(+)HEK293T和盖玻片AQP4(-)HEK293T贴在载玻片相同面上作为 反应区(即图1中B区)和对照区(即图1中A区)，如图1所示，细胞爬片制备完 成。
5、染色验证：免疫荧光法染色检测人体血清或脑脊液中的AQP4阳性抗体，证 明细胞爬片制备成功，其中样品为常规采集人体血清，经医院临床检验验证分别为 AQP4抗体阳性、AQP4抗体阴性，具体步骤为：
5.1取出步骤4.4制备的细胞爬片，室温放置10分钟；
5.2将细胞爬片放入暗盒中，向反应区和对照区分别滴加PBST缓冲液(约200ul，确保玻片都被覆盖)，室温静置5分钟；
5.3封闭：吸去PBST，向反应区和对照区分别加入5％BSA封闭液(约200ul)， 室温封闭30分钟；
5.4样品孵育：吸去封闭液，向反应区和对照区分别加入血清稀释液(Abcamab46182，AQP4抗体：PBST＝1:100，v/v，约200ul左右)，室温孵育1小时；
5.5清洗：吸去样品稀释液，用PBST清细胞爬片3次，每次5分钟。(注：摇床 上洗涤，摇速约60次/分钟)；
5.6孵育：向反应区和对照区分别加入200ul PBST稀释的FITC标记的抗AQP4 抗体的二抗，室温孵育30分钟。(注：从此步骤起，请避光操作)；
5.7清洗：吸去反应区和对照区中的二抗，清洗玻片3次，每次5分钟。(注：摇 床上洗涤，摇速约60次/分钟)；
5.8封片：向反应区和对照区分别加入DAPI封片剂(Abcam公司ab104139，约70ul)，盖上盖玻片，避免产生气泡，镜下读取绿色荧光结果。
6、结果判读如下：
阳性判读(图2中b)：A区与B区的绿色荧光强度比较，TEST统计学检验，B 区亮度显著高于A区，即证明人体血清中AQP4抗体的细胞爬片成品制作成功；
阴性判读(图2中a)：A区与B区的绿色荧光强度比较，TEST统计学检验，B 区亮度与A区无显著性差异，即证明人体血清中AQP4抗体的细胞爬片成品制作不成 功。
注：DAPI封片剂可使细胞核染上蓝色荧光，有助于排除非特异性绿色荧光。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是对本发明实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变换，均属于本发明的保护范围内。
序列表
<110> 天津天海新域生物科技有限公司、浙江达美生物技术有限公司
<120> 一种用于检测AQP4抗体的细胞爬片及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1091
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
ttgtggagaa cttagagagc tctctggcta actagagaac ccactgctta ctggcttatc 60
gaaattaata cgactcacta tagggagacc caagctggct agcgtttaaa cgggccctct 120
agactcgagc gccaccatgg tggctttcaa aggggtctgg actcaagctt tctggaaagc 180
agtcacagcg gaatttctgg ccatgcttat ttttgttctc ctcagcctgg gatccaccat 240
caactggggt ggaacagaaa agcctttacc ggtcgacatg gttctcatct ccctttgctt 300
tggactcagc attgcaacca tggtgcagtg ctttggccat atcagcggtg gccacatcaa 360
ccctgcagtg actgtggcca tggtgtgcac caggaagatc agcatcgcca agtctgtctt 420
ctacatcgca gcccagtgcc tgggggccat cattggagca ggaatcctct atctggtcac 480
acctcccagt gtggtgggag gcctgggagt caccatggtt catggaaatc ttaccgctgg 540
tcatggtctc ctggttgagt tgataatcac atttcaattg gtgtttacta tctttgccag 600
ctgtgattcc aaacggactg atgtcactgg ctcaatagct ttagcaattg gattttctgt 660
tgcaattgga catttatttg caatcaatta tactggtgcc agcatgaatc ccgcccgatc 720
ctttggacct gcagttatca tgggaaattg ggaaaaccat tggatatatt gggttgggcc 780
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agtggtgcat gtgattgacg ttgaccgggg agaggaaaaa aagggaaaga ccaatctgga 1020
aaggattgtc ttcagtagtg gatccgagct cggacccagc ttaggggctc cagggtggcc 1080
gtggcaaggg t 1091

Claims (10)

1.一种用于检测AQP4抗体的细胞爬片，其特征在于所述细胞爬片是将HEK293T细胞贴壁生长在盖玻片上，再用含AQP4基因的pCMV-HA-AQP4表达质粒转染HEK293T细胞，获得表达AQP4蛋白的HEK293T细胞并固定；同时未转染AQP4蛋白HEK293T细胞固定于盖玻片上；然后将表达AQP4蛋白的HEK293T细胞盖玻片和未转染AQP4蛋白的HEK293T细胞盖玻片间隔固定在同一个载玻片的相同面上，分别作为反应区和对照区，获得所述细胞爬片。
2.如权利要求1所述用于检测AQP4抗体的细胞爬片，其特征在于所述AQP4基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述用于检测AQP4抗体的细胞爬片，其特征在于所述盖玻片厚度0.13-0.16mm，长50mm，宽24mm；所述载玻片厚度1mm，长75mm，宽25mm。
4.如权利要求1所述用于检测AQP4抗体的细胞爬片，其特征在于所述含AQP4基因的pCMV-HA-AQP4表达质粒按如下方法制备：以人类视神经cDNA为模板，通过PCR体外扩增的方法获得AQP4目的基因片段，并在目的基因的两端设SalI/NotI双酶切位点；将含有SalI/NotI双酶切位点的目的基因片段插入含有强组成型启动子CMV的pCMV-HA载体中，得到pCMV-HA-AQP4表达质粒；pCMV-HA-AQP4表达质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态中，提取pCMV-HA-AQP4表达质粒。
5.如权利要求1所述用于检测AQP4抗体的细胞爬片，其特征在于所述HEK293T细胞在盖玻片上贴壁生长方法为：在贴壁试剂原液中加入9倍体积的PBS，制得贴壁试剂工作液；在培养皿中加入贴壁试剂工作液，加入盖玻片，37℃孵育1小时后，弃掉贴壁试剂工作液，用PBS清洗盖玻片2次，每次5分钟，获得预处理后的盖玻片；按照DMEM培养基：FBS：双抗＝45：5：0.5的体积比配制完全培养基；将HEK293T细胞接种至含完全培养基的细胞培养皿，37℃培养至细胞生长密度达到90％以上，用Trypsin-EDTA把细胞从培养皿上消化下来，收集细胞，用完全培养基重悬细胞，即为细胞悬液；向含有预处理后盖玻片的培养皿中加细胞悬液，在37℃，5％CO2的培养箱培养过夜，获得贴附于盖玻片上生长的HEK293T细胞。
6.如权利要求1所述用于检测AQP4抗体的细胞爬片，其特征在于所述转染按如下方法进行：
(1)将pCMV-HA-AQP4表达质粒加入opti-mem无血清培养基制成15μg/500μL的A液；将Lipofectamine 2000转染液以体积比40μL：500μL加入到opti-mem无血清培养基中，室温静置5min，制成B液；将A液加入B液中混匀，然后室温静置15分钟，获得转染混合液；
(2)将HEK293T细胞贴壁生长的盖玻片加入opti-mem无血清培养基，再缓慢滴入转染混合液，十字混匀后，在37℃，5％CO2的培养箱培养，作为转染组，每6h更换一次培养液，获得表达AQP4蛋白的HEK293T细胞，所述转染混合液与opti-mem无血清培养基体积比为450μL：10mL；同样条件下，以不滴加转染混合液且HEK293T细胞贴壁生长的盖玻片加入完全培养基培养作为阴性对照组。
7.如权利要求1所述用于检测AQP4抗体的细胞爬片，其特征在于所述细胞固定方法为：
将HEK293T细胞贴壁生长的盖玻片，用无菌PBS清洗2次，每次5分钟；加0.4％多聚甲醛，室温固定30分钟，无菌PBS清洗2次，每次5分钟；再用0.02％叠氮钠浸泡盖玻片2次，每次5分钟，最后风干，获得固定HEK293T细胞后的盖玻片。
8.如权利要求1所述用于检测AQP4抗体的细胞爬片，其特征在于所述细胞爬片的制备方法为：将表达AQP4蛋白的HEK293T细胞盖玻片和未表达AQP4蛋白的HEK293T细胞盖玻片分别用无影胶贴在同一个载玻片的相同面上，分别作为反应区和对照区，细胞爬片制备完成。
9.一种权利要求1所述细胞爬片在检测AQP4抗体中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述应用步骤为：
(1)取出细胞爬片，室温放置10分钟；将细胞爬片放入暗盒中，向反应区和对照区分别滴加PBST缓冲液200ul，室温静置5分钟；
(2)封闭：吸去PBST，向反应区和对照区分别加入5％BSA封闭液200μL，室温封闭30分钟；
(3)样品孵育：吸去封闭液，向反应区和对照区分别加入待测样品稀释液200μL，室温孵育1小时；所述待测样品为人体血清或脑脊液；所述样品稀释液是指体积比9：1的PBST与样品混合液；
(4)清洗：吸去待测样品稀释液，在60次/分钟下用PBST清洗细胞爬片3次，每次5分钟；
(5)孵育：避光下，向反应区和对照区分别加入200μL PBST稀释的FITC标记的抗AQP4抗体的二抗，室温孵育30分钟；
(6)清洗：避光下，吸去反应区和对照区中的二抗，在60次/分钟下PBST清洗细胞爬片3次，每次5分钟；
(7)封片：避光下，分别向反应区和对照区加入DAPI封片剂70μL，盖上盖玻片，避免产生气泡，采用免疫荧光法检测荧光强度；
(8)结果判读如下：
阳性判读：反应区绿色荧光亮度显著高于对照区，即证明待测样品中含有AQP4抗体；
阴性判读：反应区亮度与对照区无显著性差异，即证明待测样品中不含AQP4抗体。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113740522A (zh) * 2021-09-01 2021-12-03 陕西脉元生物科技有限公司 一种抗原修复液及采用其制备的细胞爬片、以及细胞爬片的制备方法和应用
CN113740531A (zh) * 2021-09-01 2021-12-03 陕西脉元生物科技有限公司 一类降低荧光非特异性显色的细胞及基于其的检测产品和检测自身抗体的应用
CN115232795A (zh) * 2021-07-22 2022-10-25 北京和合医学诊断技术股份有限公司 稳定表达aqp4-m23蛋白的细胞株及其构建方法、应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105784572A (zh) * 2016-03-01 2016-07-20 广东医学院附属医院 一种基于流式细胞术定量检测外周血白细胞自噬的试剂盒
CN106318974A (zh) * 2016-08-29 2017-01-11 南方医科大学南方医院 细胞固定工艺及通过该工艺制备aqp4抗体检测试剂盒
CN107299111A (zh) * 2017-06-21 2017-10-27 中国人民解放军总医院 检测MOG‑IgG的CBA试剂盒用的细胞爬片组件制备、CBA检测试剂盒及其应用
CN110376044A (zh) * 2019-08-29 2019-10-25 北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司 一种神经球免疫荧光染色的方法
WO2020097395A1 (en) * 2018-11-08 2020-05-14 The Regents Of The University Of California Systems and methods for targeting cancer cells

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105784572A (zh) * 2016-03-01 2016-07-20 广东医学院附属医院 一种基于流式细胞术定量检测外周血白细胞自噬的试剂盒
CN106318974A (zh) * 2016-08-29 2017-01-11 南方医科大学南方医院 细胞固定工艺及通过该工艺制备aqp4抗体检测试剂盒
CN107299111A (zh) * 2017-06-21 2017-10-27 中国人民解放军总医院 检测MOG‑IgG的CBA试剂盒用的细胞爬片组件制备、CBA检测试剂盒及其应用
WO2020097395A1 (en) * 2018-11-08 2020-05-14 The Regents Of The University Of California Systems and methods for targeting cancer cells
CN110376044A (zh) * 2019-08-29 2019-10-25 北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司 一种神经球免疫荧光染色的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张丹枫等: "三疣梭子蟹PtToll-1受体的原核表达及组织、细胞分布研究", 《水生生物学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115232795A (zh) * 2021-07-22 2022-10-25 北京和合医学诊断技术股份有限公司 稳定表达aqp4-m23蛋白的细胞株及其构建方法、应用
CN115232795B (zh) * 2021-07-22 2023-09-19 北京和合医学诊断技术股份有限公司 稳定表达aqp4-m23蛋白的细胞株及其构建方法、应用
CN113740522A (zh) * 2021-09-01 2021-12-03 陕西脉元生物科技有限公司 一种抗原修复液及采用其制备的细胞爬片、以及细胞爬片的制备方法和应用
CN113740531A (zh) * 2021-09-01 2021-12-03 陕西脉元生物科技有限公司 一类降低荧光非特异性显色的细胞及基于其的检测产品和检测自身抗体的应用

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