CN113740531A - 一类降低荧光非特异性显色的细胞及基于其的检测产品和检测自身抗体的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类降低荧光非特异性显色的细胞及基于其的检测产品和检测自身抗体的应用，属于抗体检测技术领域。本发明通过多次进行单克隆细胞的分离，得到可以稳定表达各类抗原的低非特异性(无“丝状”信号)背景的细胞株，在过表达抗原的细胞中未检测到非特异性的“丝状”信号。本发明通过在细胞固定后加入一常规缓冲液Tris‑HCl后，阳性信号得到明显的增强，说明非特异性的“丝状”背景与所使用的细胞、过表达细胞的固定方法有很大的关系。

Description

一类降低荧光非特异性显色的细胞及基于其的检测产品和检 测自身抗体的应用

技术领域

本发明属于抗体检测技术领域，涉及一类降低荧光非特异性显色的细胞及其制备方法、基于其的检测产品及检测自身抗体的应用。

背景技术

自身免疫性疾病是由于免疫功能紊乱，机体产生针对自身抗原的病理性免疫应答反应而引起器官或系统损伤的一类疾病。根据临床表现和病变累及的范围，自身免疫性疾病可以分为系统性和器官特异性，前者以系统性红斑狼疮(SLE)、系统性硬化症(SSc)、类风湿性关节炎(RA)、抗磷脂综合征(APS)等为代表，后者包括自身免疫性肝炎(AIH)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)等。《自身抗体检测在自身免疫性疾病中的临床应用专家建议》中提到，对临床怀疑有自身免疫性疾病的患者建议进行自身抗体的检测。由于自身抗体在自身免疫性疾病的诊断及患者病情评估中有重要意义，因此，选择具有灵敏度高和特异性高的检测方法就显得尤为重要。

目前，自身抗体常用的检测方法包括间接免疫荧光法、免疫印迹法、酶联免疫吸附法、免疫散射比浊法、化学发光免疫测定法、免疫胶体金法、乳胶凝集法、放射免疫法、免疫斑点法等。免疫荧光法作为一种常用的方法现已在多种自身抗体的检测中得到了广泛的应用。1941年，Coons等人首次采用荧光素进行抗体标记获得成功，这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术(fluorescent antibody technique)。免疫荧光法因其自身的优势已成为自身抗体诊断的标准技术，其特点是特异性强，阳性与阴性样品的信号强度对比明显，通过显微镜观测能够精准的判断组织或细胞内荧光分布。因此，得到了广大科研工作者及医生的青睐。

虽然免疫荧光法在自身抗体的检测过程中得到了广泛的应用，但与其他方法相比，

以细胞为基础的免疫荧光法试剂盒在进行待检样本的检测时，需要对爬片上的细胞进行固定及干燥，目前，基本上是通过不同浓度的甲醛、多聚甲醛、丙酮、乙醇等有机试剂进行固定，然而，部分有机试剂的使用会对荧光信号产生封闭的作用，从而使得制备好的细胞爬片荧光信号减弱，保质期时间严重缩短，影响细胞爬片的长期使用。

现有技术的缺陷和不足：

1、在免疫荧光法中，自身抗原的位置决定了其相应抗体的典型的荧光模式，所有与典型模式不相关区域的染色被认为是非特异性染色。现阶段，免疫荧光法的非特异性染色问题尚未完全解决，从而导致结果判定的客观性不足，造成一定程度的假阳性；

2、在实验过程中，细胞爬片在经过固定干燥后部分抗原的信号会受到一定程度的损失，进而导致阳性信号强度会低于实际强度；

3、干燥后的细胞爬片在储存的过程中，易出现信号的减弱甚至消失的情况。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一类降低荧光非特异性显色的细胞及基于其的检测产品和检测自身抗体的应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开的一类降低荧光非特异性显色的细胞，该细胞为一类能够稳定表达抗原的、无丝状信号背景的单克隆细胞。

优选地，所述单克隆细胞包括来源于HEK293细胞、CHO细胞和Hela细胞的单克隆细胞。

优选地，所述单克隆细胞通过倍比稀释法或流式细胞分离法制得，通过类似方法分离也可获得无“类似于细胞核的圆片状”、无“类似于胞质的梭形”以及某些规则或无规则形状的无非特异性背景或非特异性背景低的细胞株。

进一步优选地，所述的单克隆细胞的分离方法如下：

步骤1.1：解冻细胞

取出含有冷冻细胞的冻存管，于37℃水浴中，轻轻旋转，使细胞快速解冻，用70％乙醇擦拭冻存管后，将其放入生物安全柜中进行后续操作；

步骤1.2：培养

取出冻存管中的细胞，加入含有10％血清的DMEM完全培养基的离心管中，于800～1000rpm离心3～5min，将上清倒掉；加入含有10％血清的DMEM完全培养基，充分混匀，加至细胞培养皿中，放入细胞培养箱中进行培养；

步骤1.3：消化

待细胞密度至90％的时候，用PBS洗涤一次，加入1％的胰酶消化，待细胞间隙明显时用含10％血清的DMEM完全培养基终止消化，将消化后的细胞吸至离心管中，于800～1000rpm离心3～5min，将上清倒掉，加入含有10％血清的DMEM完全培养基，用移液器轻轻吹打混匀；

步骤1.4：倍比稀释

从4ml细胞中取出100ul细胞，按照10倍的梯度进行倍比稀释，共稀释10⁵倍，总体积100ml，将稀10⁵倍的细胞加入5个96孔板中，每孔100ul，放入细胞培养箱中进行培养，待其贴壁后，显微镜下观察，记录只有单克隆的孔，之后每天进行观察，上下午各一次；

步骤1.5：传代培养

待细胞生长至5天的时候，挑取100株生长状态好的细胞进行传代，同一个孔中的细胞进行消化后取一部分加入含有爬片的孔中，另一部分继续传代进行培养。

本发明还公开了采用上述的降低荧光非特异性显色的细胞制成的检测产品，所述检测产品包括但不限于细胞爬片、线性印记膜条或斑点印记膜片、ELISA试剂盒、化学发光检测试剂盒等。

当检测产品为细胞爬片时，制备方法如下：

1)分离筛选无“丝状”信号背景的单克隆细胞；

2)将单克隆细胞扩大培养，待生长至合适的密度后，进行转染；

3)对转染好质粒的细胞使用固定液进行固定，制得细胞爬片。

优选地，步骤1)中，所述的单克隆细胞，不仅包括来源于HEK293细胞的单克隆细胞，还包括来源于CHO细胞、Hela细胞等常用的细胞株；

所述的无“丝状”背景的单克隆细胞株，可通过倍比稀释法、流式细胞仪获得；且通过类似方法分离也可获得无“类似于细胞核的圆片状”、无“类似于胞质的梭形”以及某些规则或无规则形状的无非特异性背景或非特异性背景低的细胞株。

优选地，步骤2)中，具体包括：

2.1：将步骤1所得的单克隆细胞培养扩大，同时进行细胞的冻存和后续传代；

2.2：重组质粒的转染及过表达细胞的获得：单克隆细胞生长至合适的密度后，使用转染试剂PEI进行转染；

进一步优选地，转染所用质粒为重组真核表达载体；更进一步地，转染的质粒为17T2A-MOG、17T2A-AMPA1、17T2A-NMDAR；这些转染质粒仅列出本发明所使用的少数载体，还包括连接有其他抗原基因的其他表达载体；所述的转染方法还包括lipofectamin2000、lipofectamin3000、电转或其他转染方法；

进一步优选地，所述的过表达细胞不仅包括瞬时转染获得的细胞，还包括通过稳定转染获得的稳转细胞系；

优选地，步骤3)包括：

3.1：固定：使用固定液对已经转染好质粒的细胞进行固定；

所述的固定液为丙酮、甲醛、多聚甲醛、甲醇、乙醇等固定剂，部分固定剂如甲醛、多聚甲醛会封闭住“丝状”背景。

3.2：免疫荧光染色：爬片

使用固定液进行固定后，用待检样本进行染色；

还可以包括步骤4)的处理操作，具体如下：

细胞爬片稳定性的验证：将已经转染好的细胞进行洗涤、固定，洗涤、终止，干燥，于4℃或-20℃冻存；

所述的终止为使用Tris-HCl(在一个比较宽广的pH范围内)洗涤或通过其他方式包括淋洗、浸泡等让已经固定好的细胞与该缓冲液接触，作用时间可根实验进行合理的调整；

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过多次进行单克隆细胞的分离，得到可以稳定表达各类抗原的低非特异性(无“丝状”信号)背景的细胞株，在过表达抗原的细胞中未检测到非特异性的“丝状”信号，本申请提供了一种低背景的无“丝状”信号的细胞。

进一步的研究，本发明通过在细胞固定后加入一常规缓冲液Tris-HCl后，阳性信号得到明显的增强，说明非特异性的“丝状”背景与所使用的细胞、过表达细胞的固定方法有很大的关系。

更进一步的结果发现，在爬片的处理环节Tris-HCl缓冲液的使用可有效延长细胞爬片的保质期，在较长一段时间内，同一样品的阳性信号不会发生减弱。

附图说明

图1为实施例1中部分孔中细胞的荧光染色图片，图中A1为分离前的293细胞，其余孔中细胞均有不同强度的“丝状”信号；

图2为实施例2展示的每种抗原的一个阳性图片及一个阴性“丝状血”图片；

图3为对比例展示的未采用本发明的细胞转染不同抗原的结果图；

图4为细胞爬片的处理过程中是否进行Tris-HCl终止处理的实验结果对比图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

在大量血清学筛选实验的基础上，本发明发现了部分可与HEK293细胞自身蛋白产生免疫学反应的血清，该类血清与通过甲醛、丙酮等固定剂固定后的未转染任何质粒的细胞爬片发生免疫学反应，通过显微镜观察，该荧光信号与某一类待检自身抗体的阳性样本的荧光信号相近，从而导致结果判定者在遇到这一类血清时造成误判。

实施例1

步骤1：通过倍比稀释法得到无“丝状”信号的单克隆细胞F6

1.1从液氮罐中取出一支含有冷冻细胞(购自于ATCC公司的HEK293细胞)的冻存管，立即将其放入37℃水浴中，轻轻旋转，使细胞快速解冻，用70％乙醇擦拭冻存管后，将其放入生物安全柜中进行后续操作；

1.2用移液器将冻存管中的细胞取出，加入含有4ml 10％血清的DMEM完全培养基的15ml离心管中，于800～1000rpm离心3～5min，将上清倒掉；

1.3加入10～15ml含有10％血清的DMEM完全培养基，用移液器轻轻吹打混匀，加至10cm的细胞培养皿中，放入细胞培养箱中进行培养；

1.4待细胞密度至90％的时候，用PBS洗涤一次，加入1ml 1％的胰酶消化，待细胞间隙明显时用含10％血清的DMEM完全培养基终止消化，将消化后的细胞吸至15ml离心管中，于800～1000rpm离心3～5min，将上清倒掉，加入4ml含有10％血清的DMEM完全培养基，用移液器轻轻吹打混匀；

1.5从4ml细胞中取出100ul细胞，按照10倍的梯度进行倍比稀释，共稀释10⁵倍，总体积100ml，将稀10⁵倍的细胞加入5个96孔板中，每孔100ul，放入细胞培养箱中进行培养，待其贴壁后，显微镜下观察，记录只有单克隆的孔，之后每天进行观察，上下午各一次；

1.6待细胞生长至5天的时候，挑取100株生长状态好的细胞进行传代，同一个孔中的细胞进行消化后取一部分加入含有爬片的孔中，另一部分继续传代进行培养。

步骤2、单克隆细胞爬片的固定

2.1将上述100孔中的细胞爬片使用丙酮进行固定，使用有背景的血清样品进行染色；

2.2显微镜下观察结果：将无背景信号的单克隆细胞挑选出来，根据其相应的编号找出步骤1.6传代的细胞进行扩大培养。

实验结果：

1、单克隆细胞的分离：按照1.1-1.6的实验步骤，共得到100株生长状态好的细胞；

2、单克隆细胞爬片的染色：

将每个单克隆细胞孔中的爬片使用丙酮进行固定，固定后用有“丝状”背景的血清进行染色，共得到1株无“丝状”背景的细胞，将其命名为F6细胞。图1仅列出部分孔中细胞的荧光染色图片，其中A1为分离前的293细胞，B5、C4、C5、C6、G4、E5、F4细胞均有不同强度的“丝状”信号，其中，B5和C4有少量的细胞有丝状信号；C5、G4、F4的细胞几乎全有丝状信号，C5和G4的信号强，F4的信号弱；C6部分细胞有丝状信号，部分细胞的信号类似于某些过表达抗原阳性样本的信号；E5全部细胞均有着色；F6细胞背景干净，无非特异性信号。

实施例2

为了验证实施例1所获得的细胞是否能正确表达外源蛋白，是否具有良好的遗传稳定性，本实施例选取一株无“丝状”信号的单克隆细胞即F6进行扩增，转染，得到表达MOG、AMPA1和NMDAR的细胞，并验证过表达细胞的阳性信号及在“丝状”血上的背景。

1、重组载体的构建

通过PCR或人工合成的方法，将MOG、AMPA1、NMDAR基因通过分子克隆方法分别连至17-T2A上，分别将其命名为：17T2A-MOG、17T2A-AMPA1、17T2A-NMDAR，构建好的重组载体经测序正确后大提备用；

2、细胞转染

(1)F6细胞培养：DMEM高糖培养基与FBS按9:1比例配制成10％FBS-DMEM高糖培养基，待F6细胞铺满时按1:5～1:6传代，置37℃，5％CO₂的细胞培养箱中过夜培养；

(2)将步骤1构建好的3种质粒按照PEI转染方法进行转染，转染4～6小时更换新鲜培养液，48小时后固定染色终止生长。

3、固定

使用丙酮或0.5％甲醛固定已经转染好的细胞，固定后的爬片经PBS洗涤后进行染色，观察结果。

4、免疫荧光法染色

使用MOG、AMPA1和NMDAR的阳性血及“丝状血”，对已经固定好的过表达细胞进行染色。

5、实验结果

结果参见图2，图2中结果仅展示每种抗原的一个阳性图片及一个阴性“丝状血”图片；图2中的命名解释：以丙酮-F6-AMPA1为例，丙酮：固定方法；F6：使用的细胞；AMPA1该细胞转染的外源基因。

由图2可以看出，经过分离的F6细胞在“丝状”血清上具有好的背景，而阳性信号与未分离的HEK293细胞一致(对比例1)。因此，本申请得到了可以稳定表达外源基因且具有低背景的细胞株。

实施例3

对分离出的F6单克隆细胞进行传代转染，使用甲醛固定过表达某一抗原的细胞，37℃保存3天后发现阳性信号出现明显的下降，1周时间后阳性信号几乎全消失。针对该问题，本申请进行了研究，阳性信号得到了增强。

1、F6细胞进行培养

选取本申请得到的F6细胞进行培养，当细胞生长至密度约90％以上时按照1:5或1:6的比例进行传代，置37℃，5％CO₂的细胞培养箱中过夜培养；

2、重组质粒的转染

使用PEI或其他常规的转染方法进行转染：选取17T2A-MOG质粒进行转染，转染48h后的细胞使用0.5％甲醛进行固定；

3、细胞爬片的处理

(1)洗涤：将生长48h的细胞用PBS洗涤2次，

(2)固定：加入0.5％甲醛固定4min；

(3)洗涤：甲醛固定后的爬片用PBS洗涤1次

(4)终止：使用Tris-HCl，pH8.0终止爬片4min；

(6)烘干：使用37℃烘箱干燥烘干。

4、结果

使用终止液Tris-HCl，pH8.0对细胞爬片进行终止后，阳新信号得到增强(见图4中的对比例2)

实施例4

将实施例3得到的细胞爬片分别保存于37℃、4℃或-20℃，观察阳性信号和阴性信号的变化情况，结果是使用Tris-HCl终止后，爬片的保质期延长，而阴性背景保持较好。具体数据信息如下表1所示：

表1

对比例1

本对比例与实施例2的区别在于步骤2细胞转染中使用的细胞为未经本发明方法分离的HEK293T细胞。参见图3，结果显示，未经分离筛选的293细胞，转染了不同的抗原之后，在“丝状血”上均出现了“丝状”信号。

对比例2

本对比例与实施例3的区别在于步骤3细胞爬片的处理过程中无“使用Tris-HCl终止”这一步，未经终止的爬片阳性信号比终止后的略弱，实验结果见图4。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (10)

1.一类降低荧光非特异性显色的细胞，其特征在于，该细胞为一类能够稳定表达抗原的、无丝状信号背景的单克隆细胞。

2.根据权利要求1所述的降低荧光非特异性显色的细胞，其特征在于，所述单克隆细胞包括来源于HEK293细胞、CHO细胞和Hela细胞的单克隆细胞。

3.根据权利要求1所述的降低荧光非特异性显色的细胞，其特征在于，所述单克隆细胞通过倍比稀释法或流式细胞分离法制得。

4.采用权利要求1～3中任意一项所述的降低荧光非特异性显色的细胞制成的检测产品，其特征在于，所述检测产品至少包括以下一种：

细胞爬片、线性印记膜条或斑点印记膜片、ELISA试剂盒、化学发光检测试剂盒。

5.如权利要求4所述的检测产品，其特征在于，所述检测产品为细胞爬片，制作方法包括如下步骤：

1)分离筛选无丝状信号背景的单克隆细胞；

2)将单克隆细胞扩大培养，待生长至合适的密度后，进行转染；

3)对转染好质粒的细胞使用固定液进行固定，制得细胞爬片。

6.如权利要求4所述的检测产品，其特征在于，步骤1)中，通过倍比稀释法获得无“丝状”信号的单克隆细胞。

7.如权利要求4所述的检测产品，其特征在于，步骤2)中，转染所用质粒为重组真核表达载体；转染采用PEI试剂转染法、lipofectamin2000/3000转染法或电转染法。

8.如权利要求4所述的检测产品，其特征在于，步骤3)中，对转染好质粒的细胞爬片采用固定液进行固定，所述固定液为丙酮、甲醛、多聚甲醛、甲醇或乙醇。

9.如权利要求4所述的检测产品，其特征在于，所使用的固定液为甲醛或多聚甲醛时，通过在制备得到的细胞爬片中加入pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液能够增强阳性信号。

10.权利要求4～8中任意一项所述的检测产品在制备检测自身抗体免疫性试剂盒中的应用，其特征在于，在过表达抗原的细胞中未检测到非特异性的“丝状”信号。

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