CN114957444B - 一种nmdar的nr1亚基缺失突变体、突变体细胞及构建方法和应用 - Google Patents

一种nmdar的nr1亚基缺失突变体、突变体细胞及构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种NMDAR的NR1亚基缺失突变体、突变体细胞及构建方法和应用，涉及自身抗体检测技术领域。本发明对NR1亚基的特定位点进行缺失，并由缺失了NMDARNR1亚基部分氨基酸的突变体与NMDARNR2亚基共转，从而建立了在不需要拮抗剂的情况下稳定表达NR1和NR2亚基的细胞检测系统，以检测待检样本中NMDAR自身抗体。本发明得到的所述突变体细胞可与抗NMDAR脑炎患者中的自身抗体结合，一方面建立了不需要添加拮抗剂、可稳定表达识别NMDAR自身抗体的检测体系；另一方面得到了“球状”背景低的识别NMDAR自身抗体的检测体系。

Description

一种NMDAR的NR1亚基缺失突变体、突变体细胞及构建方法和 应用
技术领域
本发明属于自身抗体检测技术领域，具体涉及一种NMDAR的NR1亚基缺失突变体、突变体细胞及构建方法和应用。
背景技术
NMDAR是配体门控的阳离子通道，在突触的传递和可塑性中起着至关重要的作用。NMDAR是由GluN1和GluN2(A-D)亚基组成的异构体，分别结合甘氨酸和谷氨酸。GluN1和其中一种GluN2结合形成具有不同药理特性的受体。GluN1单亚基不能在中枢神经系统组织中形成功能受体，需要与其他亚基结合才能在神经元细胞表面表达。
2008年，Dalmau等人提出了抗NMDAR脑炎的概念，这是一种由 NMDAR自身抗体介导的严重的、潜在致命的自身免疫性疾病。由于副肿瘤性抗NMDAR脑炎在肿瘤切除和免疫治疗后有更好的预后，因此有必要建立快速检测系统，以检测针对NMDAR抗原表位的自身抗体。一般认为，NMDA 受体是由两个NR1亚单位和两个NR2亚单位构成的异四聚体。因此，建立识别NMDAR自身抗体的检测体系，就需要建立稳定表达每个NMDA受体亚基的细胞。然而，培养基中的谷氨酸和甘氨酸激活的NMDAR Ca2+内流对非神经元是有毒的，当NMDAR的NR1和NR2亚基同时在非神经元细胞中过表达时，会产生细胞毒性，造成靶细胞死亡。已有学者探究出可同时过表达NMDARNR1和NR2亚基的方法，Tanaka等人通过在培养基中添加拮抗剂MK-801以保护过表达NR1和NR2亚基的HEK293细胞(Tanaka K, Kitagawa Y,Hori K,etal.Evaluation of the concordance between GluN1-GluN2 heteromer live-cell-based assay and GluN1 monomer biochip kit assay on anti-NMDAR autoantibodydetection[J].Journal of Immunological Methods, 2021,499:113150.)；Thouin等人通过在培养基中添加拮抗剂500μM ketamine以保护过表达NR1和NR2亚基的HEK293细胞(Thouin A,Gastaldi M, Woodhall M,et al.Comparison of N-methyl-D-aspartatereceptor antibody assays using live or fixed substrates[J].Journal ofNeurology,2021,268(5):1818-1826)。虽然拮抗剂的加入会改善靶细胞的死亡情况，但是拮抗剂过多会造成细胞毒性，降低过表达蛋白的表达量；过少则达不到改善细胞死亡的效果，荧光染色时“球状”信号偏多，对结果的正常判断造成干扰。
自2012年Gleichman等人发现抗NMDAR患者中的自身抗体主要识别 GluN1的N368/G369区域后，过表达NMDAR单亚基GluN1的HEK293细胞被用来检测患者样本中NMDAR自身抗体，但仍有不少学者持续比较不同方法检出情况与临床信息的一致性。欧蒙的一项研究结果是商业化的单亚基检测系统虽然特异度为99％，但其在血清和脑脊液中的检测灵敏度分别是 86％和92％，其高特异度是以降低检测的灵敏度为代价的，相对于GluN1单亚基的检测系统，NR1和NR2亚基检测系统的检出率略高。因此，有必要建立一套简单、稳定、灵敏度高的过表达NMDARNR1和NR2双亚基系统以辅助当前NMDAR脑炎患者样本中自身抗体的检测。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种NMDAR的NR1亚基缺失突变体、突变体细胞及构建方法和应用，尤其是提供了一种简单、不需要拮抗剂、“球状”背景信号少且灵敏度较高的检测系统以检测样本中NMDAR自身抗体。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种NMDAR的NR1亚基缺失突变体，所述NR1亚基缺失突变体缺失NR1亚基的627-630位氨基酸或581-624位氨基酸。
本发明还提供了上述NR1亚基缺失突变体的构建方法，包括以下步骤：
以包含SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的质粒为模板，利用引物对进行 PCR扩增，得所述NR1亚基缺失突变体；
其中，针对627-630位氨基酸缺失设计的引物包括627-630-F和 627-630-R，627-630-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，627-630-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
针对581-624位氨基酸缺失设计的引物包括581-624-F和581-624-R， 581-624-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，581-624-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选的，所述模板包括将SEQ ID NO.1所示核苷酸序列插入pCDNA3.1 的NheI和NotI酶切位点之间。
优选的，所述PCR扩增的体系以50μL计，包括模板50ng、引物F 2μL、引物R 2μL、Fast Pfu DNA Polymerase 1μL、5×Fast Pfu buffer 10μL、2.5mM dNTP 4μL、DMSO 1μL和余量的Nuclease-free Water。
优选的，所述PCR扩增的程序，包括：98℃预变性2min；98℃变性15s， 59℃退火15s，72℃延伸4min，33个循环；72℃再延伸5～10min。
本发明还提供了一种结合NMDAR自身抗体的NMDAR突变体细胞，所述NMDAR突变体细胞包括上述NR1亚基缺失突变体和NR2亚基。
本发明还提供了上述NMDAR突变体细胞的构建方法，包括以下步骤：将所述NR1亚基缺失突变体和NR2亚基共转细胞，得所述NMDAR突变体细胞。
优选的，所述NR1亚基缺失突变体和NR2亚基的质量比为(0.2～5)： 1。
本发明还提供了上述NR1亚基缺失突变体或上述NMDAR突变体细胞在制备检测NMDAR脑炎患者自身抗体的试剂中的应用。
本发明还提供了一种检测NMDAR脑炎患者自身抗体的系统，包括利用上述NR1亚基缺失突变体或上述NMDAR突变体细胞制备得到的细胞爬片和血清免疫荧光染色试剂。
有益效果：本发明提供了一种NMDAR的NR1亚基缺失突变体，对NR1 亚基的特定位点进行缺失，并由缺失了NMDAR NR1亚基部分氨基酸的突变体与NMDARNR2亚基共转，从而建立了在不需要拮抗剂的情况下稳定表达NR1和NR2亚基的细胞检测系统，以检测待检样本中NMDAR自身抗体。本发明得到的所述突变体细胞可与抗NMDAR脑炎患者中的自身抗体结合，一方面建立了不需要添加拮抗剂、可稳定表达识别NMDAR自身抗体的检测体系；另一方面得到了“球状”背景低的识别NMDAR自身抗体的检测体系。
附图说明
图1为实施例2的NMDAR自身抗体阳性血清染色结果图，图中a： NR1△581-624与NR2a共转阳性血清染色结果，b：NR1△627-630与NR2a 共转阳性血清染色结果，c：NR1△581-624与NR2b共转阳性血清染色结果， d：NR1△627-630与NR2b共转阳性血清染色结果；
图2为实施例2的阴性血清染色结果，图中a：NR1△581-624与NR2a 共转阴性血清染色结果，b：NR1△627-630与NR2a共转阴性血清染色结果， c：NR1△581-624与NR2b共转阴性血清染色结果d：NR1△627-630与NR2b 共转阴性血清染色结果；
图3为对比例2中野生型NMDARNR1亚基分别与NR2a和NR2b共转后，加入不同含量拮抗剂(ifenprodil)培养后阳性血清的染色结果，图中a-c：野生型NMDARNR1亚基与NR2a共转后，加入0μM、10μM、100μM ifenprodil 后阳性血清的染色结果；d-f：野生型NMDARNR1亚基与NR2b共转后，加入0μM、10μM、100μM ifenprodil后阳性血清的染色结果；
图4为对比例2中野生型NMDARNR1亚基分别与NR2a和NR2b共转后，加入不同含量拮抗剂(ifenprodil)培养后阴性血清的染色结果，图中a-c：野生型NMDAR NR1亚基与NR2a共转后，加入0μM、10μM、100μM ifenprodil后阴性血清的染色结果；d-f：野生型NMDARNR1亚基与NR2b共转后，加入0μM、10μM、100μM ifenprodil后阴性血清的染色结果；
图5为对比例3中NMDAR自身抗体阳性血清染色结果，图中a-c分别表示：NR1△410-559、NR1△625-626以及NR1△837-838与NR2a的共转染色结果；d-f分别表示：NR1△410-559、NR1△625-626以及NR1△837-838 与NR2b的共转染色结果；
图6为对比例3中NMDAR自身抗体阴性血清染色结果，图中a-c分别表示：NR1△410-559、NR1△625-626以及NR1△837-838与NR2a的共转染色结果；d-f分别表示：NR1△410-559、NR1△625-626以及NR1△837-838 与NR2b的共转染色结果。
具体实施方式
本发明提供了一种NMDAR的NR1亚基缺失突变体，所述NR1亚基缺失突变体缺失NR1亚基的627-630位氨基酸或581-624位氨基酸。
在本发明中，所述NMDAR的NR1亚基的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列优选如SEQ ID NO.12所示。在缺失627-630位氨基酸或581-624位氨基酸后，将其过表达至293T细胞中，表达后的NR1亚基缺失突变体可识别患者样本中的自身抗体；或NR1亚基缺失突变体(缺失 627-630位氨基酸或581-624位氨基酸)与NR2亚基(NR2a或NR2b)共转至293T细胞中，共转后的缺失突变体可识别患者样本中的自身抗体；所述 NMDAR的NR1亚基缺失突变体与NR2亚基(NR2a或NR2b)共转至293T 细胞中，过表达细胞可在DMEM完全培养基中正常生长，未出现死亡情况。原因可能是NR1亚基缺失突变体与NR2亚基(NR2a或NR2b)共表达后未形成与野生型相同的受体通道，即便培养基中含有谷氨酸和甘氨酸，也不能促进NMDAR受体通道开放，因此不会导致大量Ca2+内流，进而不会导致细胞死亡。
本发明还提供了上述NR1亚基缺失突变体的构建方法，包括以下步骤：
以包含SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的质粒为模板，利用引物对进行 PCR扩增，得所述NR1亚基缺失突变体；
其中，针对627-630位氨基酸缺失设计的引物包括627-630-F和 627-630-R，627-630-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，627-630-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
针对581-624位氨基酸缺失设计的引物包括581-624-F和581-624-R， 581-624-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，581-624-R的核苷酸序列如 SEQ ID NO.5所示。
本发明所述模板优选包括将SEQ ID NO.1所示核苷酸序列插入质粒中作为模板，如在实施例中，将SEQ ID NO.1所示的序列插入pCDNA3.1的 NheI和NotI酶切位点之间，作为模板，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
本发明优选利用PCR扩增的方法得到对应的NR1亚基缺失突变体，且两个NR1亚基缺失突变体的PCR扩增体系和程序均相同。本发明所述PCR 扩增的体系以50μL计，优选包括模板50ng、引物F(0.2μM)2μL、引物R(0.2μM)2μL、Fast Pfu DNA Polymerase(2.5units)1μL、5×Fast Pfu buffer 10μL、2.5mM dNTP 4μL、DMSO 1μL和余量的Nuclease-free Water。本发明所述PCR扩增的体系，优选包括：98℃预变性2min；98℃变性15s，59℃退火15s，72℃延伸4min，33个循环；72℃再延伸5～10min。
本发明在构建NR1亚基缺失突变体所应用的引物信息如表1所示。
表1 NR1亚基缺失突变体构建引物
在本发明实施例中，优选还包括对得到的PCR产物分别使用DMT酶于 37℃处理1h，去除模板质粒，然后将处理后的PCR产物转化至感受态细胞 (DMT Chemically CompetentCell)中；将转化产物涂平板，于37℃培养箱中过夜培养；次日，挑取单克隆至卡那抗性的LB液体培养基，37℃摇床过夜培养，提质粒送金维智测序，并将测序正确的质粒大提保存。
本发明还提供了一种结合NMDAR自身抗体的NMDAR突变体细胞，所述NMDAR突变体细胞包括上述NR1亚基缺失突变体和NR2亚基。
本发明对所述突变体细胞的制备方法并没有特殊限定，可以通过瞬时转染或稳定转染获得，整个制备过程无需添加抑制剂，制备过程简单。本发明所述突变体细胞可以在不加抑制剂的DMEM完全培养基中生长而不出现死亡的情况。本发明所述突变体细胞应用于样本检测时，具有较低的非特异性信号，“球状”信号较少。
本发明所述突变体细胞优选以现有真核生物的细胞系为基础细胞，实施例中以293T细胞为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。本发明所述突变体细胞可在不需要拮抗剂的情况下稳定表达NR1和 NR2亚基，可作为细胞检测系统检测待检样本中NMDAR自身抗体。
本发明还提供了上述NMDAR突变体细胞的构建方法，包括以下步骤：将所述NR1亚基缺失突变体和NR2亚基共转细胞，得所述NMDAR突变体细胞。
本发明所述NR1亚基缺失突变体和NR2亚基两种亚基的质粒总量优选为3～24μg，共转时细胞生长在直径10cm的皿中，细胞密度为30～40％，且所述的两种亚基的质粒总量可根据培养皿的规格进行等比例调整，如在本发明中，所述所述NR1亚基缺失突变体和NR2亚基(NR2a的登录号： NM_000833.4、NR2b的登录号：NM_000834.4)的质量比优选为(0.2～5)： 1，更优选为1：1。本发明所述构建方法，优选包括以下步骤：将上述NMDAR NR1亚基缺失突变体和NMDAR NR2亚基以1:1的比例混合，使用PEI转染试剂将混合质粒转入HEK293细胞中，进行洗涤、固定，得到可结合NMDAR 自身抗体的细胞爬片。本发明得到的所述NMDAR突变体细胞或细胞爬片，可应用于识别NMDAR自身抗体，检测的“球状”信号少，背景低，可作为检测系统。
本发明还提供了上述NR1亚基缺失突变体或上述NMDAR突变体细胞在制备检测NMDAR脑炎患者自身抗体的试剂中的应用。
在本发明实施例中，优选对上述细胞爬片固定和烘干后，依次进行一抗孵育和二抗孵育，洗涤后在显微镜下观察，从而完成对NMDAR脑炎患者自身抗体的检测。本发明对所述固定和烘干的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。本发明所述一抗孵育，优选包括将NMDAR脑炎患者的血清使用PBST按照1:10的体积比稀释后进行孵育，孵育时间40min。本发明在所述一抗孵育后，优选还包括利用PBST洗涤3次，而后再进行二抗孵育。本发明所述二抗孵育优选包括使用荧光基团标记的抗人IgG进行孵育，实施例中优选利用FITC标记的抗人IgG进行孵育(JACKSON二抗，使用 PBST按照1:200稀释后使用)，孵育时间40min。本发明在所述二抗孵育后进行洗涤，所述洗涤优选包括使用PBST洗涤3次。本发明实施例证实，缺失了NR1亚基的581-624位氨基酸或缺失了NR1亚基627-630位氨基酸的突变体与NR2亚基(NR2a/2b)共转后细胞几乎铺满了细胞爬片，可检测出阳性血清中的NMDAR自身抗体，同时在阴性样本上表现出较好的背景，“球状”信号少，获得了信号好，背景低的NMDAR自身抗体检测系统。
本发明还提供了一种检测NMDAR脑炎患者自身抗体的系统，包括利用上述NR1亚基缺失突变体或上述NMDAR突变体细胞制备得到的细胞爬片和血清免疫荧光染色试剂。
本发明所述系统优选与上述相同，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的一种NMDAR的NR1亚基缺失突变体、突变体细胞及构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
NMDARNR1亚基缺失突变体的构建
1、通过人工合成的方法，将NMDAR的1α亚基DNA序列(SEQ ID NO.1) 合成至pCDNA3.1上，作为模板，插入酶切位点为NheI和NotI。
2、委托生物公司合成表1所示引物。
3、分别使用表1的引物进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
PCR扩增体系为：模板50ng、引物F(0.2μM)2μL、引物R(0.2μM) 2μL、Fast Pfu DNAPolymerase(2.5units)1μL、5×Fast Pfu buffer 10μL、2.5mM dNTP 4μL、DMSO 1μL，最后用Nuclease-free Water将体系补足50μL；
PCR扩增的程序包括：98℃预变性2min；98℃变性15s，59℃退火15s， 72℃延伸4min，变性到延伸33个循环；72℃再延伸5～10min。
4、分别将步骤3得到的PCR产物使用DMT酶于37℃处理1h，去除模板质粒，然后将处理后的PCR产物转化至感受态细胞(DMT Chemically Competent Cell)中；将转化产物涂平板，于37℃培养箱中过夜培养；次日，挑取单克隆至卡那抗性的LB液体培养基，37℃摇床过夜培养，提质粒送金维智测序。测序正确的质粒大提保存。
实施例2
制备各缺失突变体的细胞爬片及血清免疫荧光染色
1、293T细胞培养：DMEM高糖培养基与FBS按9:1比例配制成10％FBS-DMEM高糖培养基，待细胞铺满时按1:5～1:6传代至含有载玻片的 10cm2培养皿，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中过夜培养；
2、PEI转染：将实施例1提取的2种NR1亚基缺失突变体质粒分别与两种NR2(NR2a的登录号：NM_000833.4、NR2b的登录号：NM_000834.4； NR2a和NR2b的核酸序列相似度为61.17％，氨基酸序列的相似度为52.06％) 亚基的质粒按照1:1混合后，转染时每种质粒各1.5μg，使用PEI转染试剂分别转染至步骤(1)培养获得的细胞，转染完4小时候更换为完全培养基，继续培养36～48h进行固定；
3、爬片的固定及烘干：用PBS将细胞爬片冲洗2次，然后置于预冷的丙酮中，固定5～10min，取出于42℃烘干，得到了四种缺失突变体细胞的爬片。
4、用PBS洗涤步骤3制备得到的各爬片；
5、一抗孵育：将NMDAR脑炎患者的血清使用PBST按照1:10的比例稀释后进行孵育，孵育时间40min；
6、洗涤：使用PBST洗涤3次；
7、二抗孵育：使用FITC标记的抗人IgG进行孵育(JACKSON二抗，使用PBST按照1:200稀释后使用)，孵育时间40min；
8、洗涤：使用PBST洗涤3次；
9、显微镜下观察结果，并记录各突变体与自身抗体的结合情况。
实施例3
实施例3与实施例2的不同之处在于实施例3使用如下质粒单独转染：野生型NR1(核酸序列见SEQ ID NO.1)、NR2a(NR2a的登录号： NM_000833.4)、NR2b(NR2b的登录号：NM_000834.4)进行转染，转染质粒量各为1.5μg，制得过表达野生型NR1、过表达NR2a、过表达NR2b的细胞爬片；使用如下质粒进行共转：野生型NR1和NR2a共转、野生型NR1 和NR2b共转。同时选取实施例2制备得到的NR1△627-630和NR2a、 NR1△581-624和NR2a、NR1△627-630和NR2b、NR1△581-624和NR2b 爬片对疑似NMDAR脑炎患者的血清进行筛选，比较各种细胞爬片的检出情况。
对比例1
1、通过人工合成的方法，将NMDAR的1α亚基DNA序列(SEQ ID NO.1) 合成至pCDNA3.1上，插入酶切位点为NheI和NotI。
2、根据突变位点设计表2所示的引物。
表2对比例设计缺失引物
3、分别使用表2的引物进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
构建突变体NR1△410-559，NR1△625-626时，以NMDAR 1α亚基的 DNA序列为模板，进行PCR扩增；
构建突变体NR1△837-838时，以缺失了864-937位氨基酸的NMDAR 1α亚基的DNA序列为模板，进行PCR扩增。
PCR扩增体系为：模板50ng、引物F(0.2μM)2μL、引物R(0.2μM) 2μL、Fast Pfu DNAPolymerase(2.5units)1μL、5×Fast Pfu buffer 10μL、2.5mM dNTP 4μL、DMSO 1μL，最后用Nuclease-free Water将体系补足50μL；
PCR扩增的程序包括：98℃预变性2min；98℃变性15s，59℃退火15s， 72℃延伸4min，变性到延伸33个循环；72℃再延伸5～10min。
4、将步骤3得到的PCR产物进一步处理，分别用DMT酶于37℃处理 1h，去除模板质粒，进行胶回收。将胶回收的产物使用T4 Polynucleotide Kinase进行处理(按照NEB说明书进行操作)，处理后的产物加入T4连接酶室温连接2小时，然后将连接产物转化至感受态细胞(DMT Chemically Competent Cell)中；将转化产物涂平板，于37℃培养箱中过夜培养；次日，挑取单克隆至卡那抗性的LB液体培养基，37℃摇床过夜培养，提质粒送金维智测序。测序正确的质粒大提保存。
对比例2
对比例2与实施例2的不同之处在于对比例2的步骤2使用野生型 NMDARNR1质粒分别与NR2a(NR2a的登录号：NM_000833.4)或NR2b (NR2b的登录号：NM_000834.4)共转，转染完4小时候更换为含有不同含量拮抗剂(ifenprodil)完全培养基，继续培养36～48h进行固定，制得细胞爬片进行与实施例2相同的免疫荧光染色。
对比例3
对比例3与实施例2的不同之处在于对比例2分别使用如下质粒： NR1△410-559、NR1△625-626以及NR1△837-838分别与NR2a(NR2a的登录号：NM_000833.4)或NR2b(NR2b的登录号：NM_000834.4)共转，制得细胞爬片进行与实施例2相同的免疫荧光染色。
结果显示，实施例2NMDAR自身抗体阳性血清染色结果如图1所示，阴性血清染色结果如图2所示，缺失了NR1亚基的581-624位氨基酸或缺失了NR1亚基627-630位氨基酸的突变体与NR2亚基(NR2a/2b)共转后细胞几乎铺满了细胞爬片，可检测出阳性血清中的NMDAR自身抗体，同时在阴性样本上表现出较好的背景，“球状”信号少；与对比例3相比，实施例1获得了信号好，背景低的NMDAR自身抗体检测系统。
实施例3的结果是野生型NR1抗体的检出率为7.99％；NR2a抗体的检出率较低(在854例样品中，未检测出NR2a抗体的阳性，但是在更早之前的检测当中筛出了1例NR2a抗体的阳性，可能是某一段时间检测人群的差异导致或需要扩大样本基数)；NR2b抗体的检出率为0.93％；野生型NR1 和NR2a共转、NR1△627-630和NR2a共转、NR1△581-624和NR2a共转后的细胞爬片可检出NR2a的阳性(截止目前为止，尚未检测到NR1抗体和 NR2a抗体的双阳性)；野生型NR1和NR2b共转、NR1△627-630和NR2b 共转、NR1△581-624和NR2b共转后的细胞爬片既能检出NR1抗体阳性的样本，又能检出NR2b抗体阳性的样本，还能筛出NR1和NR2b双阳的样本 (在854例样品中，NR1抗体和NR2b抗体双阳性检出率为0.7％)。另外，本发明还发现NMDAR NR1的两个缺失突变体NR1△627-630、NR1△581-624分别和NR2a、NR2b共转后，其阳性信号明显高于野生型NR1 和NR2a、NR2b共转后的阳性信号。
对比例2的试验结果如图3和图4所示，野生型NMDAR NR1亚基分别与NR2a和NR2b共转后，加入不同含量拮抗剂(ifenprodil)培养后阳性血清的染色结果如图3所示，阴性染色结果如图4所示，野生型NMDAR NR1 亚基分别与NR2a和NR2b共转后，细胞会出现死亡现象，即细胞未铺满细胞爬片(图3中a和d、图4中a和d)；当加入10μM ifenprodil后，细胞死亡现象明显改善(图3中b和e、图4中b和e)且在图3中e的阳性信号数目明显多于图3中b；当加入100μM ifenprodil后，细胞死亡现象明显加重(图3中c和f、图4中c和f)。因此，适量抑制剂的加入会降低NMDAR NR1亚基和NR2亚基共转后对细胞造成的毒性，但是在阴性样本上，表现出了较为明显的“球状”背景。
对比例3的NMDAR自身抗体阳性血清染色结果如图5所示，NMDAR 自身抗体阴性血清染色结果如图6所示。NR1△410-559、NR1△625-626以及 NR1△837-838与NR2a/2b亚基共转后，只有NR1△625-626共转后的突变体细胞可以检出阳性信号，但阴性血清上“球状”信号较多，其余两种突变体细胞未见明显阳性信号；NR1△837-838共转后的突变体细胞死亡较多； NR1△410-559共转后的突变体细胞死亡数量略少于，但阴性血清上“球状”信号较多。三组突变体不适用于NMDAR自身抗体的检测。
综上可知，本发明提供了一种简单、不需要拮抗剂、“球状”背景信号少且灵敏度较高的检测系统以检测样本中NMDAR自身抗体。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 陕西脉元生物科技有限公司
<120> 一种NMDAR的NR1亚基缺失突变体、突变体细胞及构建方法和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2817
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagcacca tgcgcctgct gacgctcgcc ctgctgttct cctgctccgt cgcccgtgcc 60
gcgtgcgacc ccaagatcgt caacattggc gcggtgctga gcacgcggaa gcacgagcag 120
atgttccgcg aggccgtgaa ccaggccaac aagcggcacg gctcctggaa gattcagctc 180
aatgccacct ccgtcacgca caagcccaac gccatccaga tggctctgtc ggtgtgcgag 240
gacctcatct ccagccaggt ctacgccatc ctagttagcc atccacctac ccccaacgac 300
cacttcactc ccacccctgt ctcctacaca gccggcttct accgcatacc cgtgctgggg 360
ctgaccaccc gcatgtccat ctactcggac aagagcatcc acctgagctt cctgcgcacc 420
gtgccgccct actcccacca gtccagcgtg tggtttgaga tgatgcgtgt ctacagctgg 480
aaccacatca tcctgctggt cagcgacgac cacgagggcc gggcggctca gaaacgcctg 540
gagacgctgc tggaggagcg tgagtccaag gcagagaagg tgctgcagtt tgacccaggg 600
accaagaacg tgacggccct gctgatggag gcgaaagagc tggaggcccg ggtcatcatc 660
ctttctgcca gcgaggacga tgctgccact gtataccgcg cagccgcgat gctgaacatg 720
acgggctccg ggtacgtgtg gctggtcggc gagcgcgaga tctcggggaa cgccctgcgc 780
tacgccccag acggcatcct cgggctgcag ctcatcaacg gcaagaacga gtcggcccac 840
atcagcgacg ccgtgggcgt ggtggcccag gccgtgcacg agctcctcga gaaggagaac 900
atcaccgacc cgccgcgggg ctgcgtgggc aacaccaaca tctggaagac cgggccgctc 960
ttcaagagag tgctgatgtc ttccaagtat gcggatgggg tgactggtcg cgtggagttc 1020
aatgaggatg gggaccggaa gttcgccaac tacagcatca tgaacctgca gaaccgcaag 1080
ctggtgcaag tgggcatcta caatggcacc cacgtcatcc ctaatgacag gaagatcatc 1140
tggccaggcg gagagacaga gaagcctcga gggtaccaga tgtccaccag actgaagatt 1200
gtgacgatcc accaggagcc cttcgtgtac gtcaagccca cgctgagtga tgggacatgc 1260
aaggaggagt tcacagtcaa cggcgaccca gtcaagaagg tgatctgcac cgggcccaac 1320
gacacgtcgc cgggcagccc ccgccacacg gtgcctcagt gttgctacgg cttttgcatc 1380
gacctgctca tcaagctggc acggaccatg aacttcacct acgaggtgca cctggtggca 1440
gatggcaagt tcggcacaca ggagcgggtg aacaacagca acaagaagga gtggaatggg 1500
atgatgggcg agctgctcag cgggcaggca gacatgatcg tggcgccgct aaccataaac 1560
aacgagcgcg cgcagtacat cgagttttcc aagcccttca agtaccaggg cctgactatt 1620
ctggtcaaga aggagattcc ccggagcacg ctggactcgt tcatgcagcc gttccagagc 1680
acactgtggc tgctggtggg gctgtcggtg cacgtggtgg ccgtgatgct gtacctgctg 1740
gaccgcttca gccccttcgg ccggttcaag gtgaacagcg aggaggagga ggaggacgca 1800
ctgaccctgt cctcggccat gtggttctcc tggggcgtcc tgctcaactc cggcatcggg 1860
gaaggcgccc ccagaagctt ctcagcgcgc atcctgggca tggtgtgggc cggctttgcc 1920
atgatcatcg tggcctccta caccgccaac ctggcggcct tcctggtgct ggaccggccg 1980
gaggagcgca tcacgggcat caacgaccct cggctgagga acccctcgga caagtttatc 2040
tacgccacgg tgaagcagag ctccgtggat atctacttcc ggcgccaggt ggagctgagc 2100
accatgtacc ggcatatgga gaagcacaac tacgagagtg cggcggaggc catccaggcc 2160
gtgagagaca acaagctgca tgccttcatc tgggactcgg cggtgctgga gttcgaggcc 2220
tcgcagaagt gcgacctggt gacgactgga gagctgtttt tccgctcggg cttcggcata 2280
ggcatgcgca aagacagccc ctggaagcag aacgtctccc tgtccatcct caagtcccac 2340
gagaatggct tcatggaaga cctggacaag acgtgggttc ggtatcagga atgtgactcg 2400
cgcagcaacg cccctgcgac ccttactttt gagaacatgg ccggggtctt catgctggta 2460
gctgggggca tcgtggccgg gatcttcctg attttcatcg agattgccta caagcggcac 2520
aaggatgctc gccggaagca gatgcagctg gcctttgccg ccgttaacgt gtggcggaag 2580
aacctgcagg atagaaagag tggtagagca gagcctgacc ctaaaaagaa agccacattt 2640
agggctatca cctccaccct ggcttccagc ttcaagaggc gtaggtcctc caaagacacg 2700
agcaccgggg gtggacgcgg cgctttgcaa aaccaaaaag acacagtgct gccgcgacgc 2760
gctattgaga gggaggaggg ccagctgcag ctgtgttccc gtcataggga gagctga 2817
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcatcgggga aggcgccccc agaagcatcc tgggcatggt gtgggc 46
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctgggggcg ccttccccga tgc 23
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtacctgctg agaagcttct cagcgcgcat cctgg 35
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaagcttctc agcaggtaca gcatcacggc cacc 34
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agcacactgt ggctgctggt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cacgaagggc tcctggtgga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttctcagcgc gcatcctggg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gggggcgcct tccccgatgc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cggcacaagg atgctcgccg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggcaatctcg atgaaaatca 20
<210> 12
<211> 938
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Met Ser Thr Met Arg Leu Leu Thr Leu Ala Leu Leu Phe Ser Cys Ser
1 5 10 15
Val Ala Arg Ala Ala Cys Asp Pro Lys Ile Val Asn Ile Gly Ala Val
20 25 30
Leu Ser Thr Arg Lys His Glu Gln Met Phe Arg Glu Ala Val Asn Gln
35 40 45
Ala Asn Lys Arg His Gly Ser Trp Lys Ile Gln Leu Asn Ala Thr Ser
50 55 60
Val Thr His Lys Pro Asn Ala Ile Gln Met Ala Leu Ser Val Cys Glu
65 70 75 80
Asp Leu Ile Ser Ser Gln Val Tyr Ala Ile Leu Val Ser His Pro Pro
85 90 95
Thr Pro Asn Asp His Phe Thr Pro Thr Pro Val Ser Tyr Thr Ala Gly
100 105 110
Phe Tyr Arg Ile Pro Val Leu Gly Leu Thr Thr Arg Met Ser Ile Tyr
115 120 125
Ser Asp Lys Ser Ile His Leu Ser Phe Leu Arg Thr Val Pro Pro Tyr
130 135 140
Ser His Gln Ser Ser Val Trp Phe Glu Met Met Arg Val Tyr Ser Trp
145 150 155 160
Asn His Ile Ile Leu Leu Val Ser Asp Asp His Glu Gly Arg Ala Ala
165 170 175
Gln Lys Arg Leu Glu Thr Leu Leu Glu Glu Arg Glu Ser Lys Ala Glu
180 185 190
Lys Val Leu Gln Phe Asp Pro Gly Thr Lys Asn Val Thr Ala Leu Leu
195 200 205
Met Glu Ala Lys Glu Leu Glu Ala Arg Val Ile Ile Leu Ser Ala Ser
210 215 220
Glu Asp Asp Ala Ala Thr Val Tyr Arg Ala Ala Ala Met Leu Asn Met
225 230 235 240
Thr Gly Ser Gly Tyr Val Trp Leu Val Gly Glu Arg Glu Ile Ser Gly
245 250 255
Asn Ala Leu Arg Tyr Ala Pro Asp Gly Ile Leu Gly Leu Gln Leu Ile
260 265 270
Asn Gly Lys Asn Glu Ser Ala His Ile Ser Asp Ala Val Gly Val Val
275 280 285
Ala Gln Ala Val His Glu Leu Leu Glu Lys Glu Asn Ile Thr Asp Pro
290 295 300
Pro Arg Gly Cys Val Gly Asn Thr Asn Ile Trp Lys Thr Gly Pro Leu
305 310 315 320
Phe Lys Arg Val Leu Met Ser Ser Lys Tyr Ala Asp Gly Val Thr Gly
325 330 335
Arg Val Glu Phe Asn Glu Asp Gly Asp Arg Lys Phe Ala Asn Tyr Ser
340 345 350
Ile Met Asn Leu Gln Asn Arg Lys Leu Val Gln Val Gly Ile Tyr Asn
355 360 365
Gly Thr His Val Ile Pro Asn Asp Arg Lys Ile Ile Trp Pro Gly Gly
370 375 380
Glu Thr Glu Lys Pro Arg Gly Tyr Gln Met Ser Thr Arg Leu Lys Ile
385 390 395 400
Val Thr Ile His Gln Glu Pro Phe Val Tyr Val Lys Pro Thr Leu Ser
405 410 415
Asp Gly Thr Cys Lys Glu Glu Phe Thr Val Asn Gly Asp Pro Val Lys
420 425 430
Lys Val Ile Cys Thr Gly Pro Asn Asp Thr Ser Pro Gly Ser Pro Arg
435 440 445
His Thr Val Pro Gln Cys Cys Tyr Gly Phe Cys Ile Asp Leu Leu Ile
450 455 460
Lys Leu Ala Arg Thr Met Asn Phe Thr Tyr Glu Val His Leu Val Ala
465 470 475 480
Asp Gly Lys Phe Gly Thr Gln Glu Arg Val Asn Asn Ser Asn Lys Lys
485 490 495
Glu Trp Asn Gly Met Met Gly Glu Leu Leu Ser Gly Gln Ala Asp Met
500 505 510
Ile Val Ala Pro Leu Thr Ile Asn Asn Glu Arg Ala Gln Tyr Ile Glu
515 520 525
Phe Ser Lys Pro Phe Lys Tyr Gln Gly Leu Thr Ile Leu Val Lys Lys
530 535 540
Glu Ile Pro Arg Ser Thr Leu Asp Ser Phe Met Gln Pro Phe Gln Ser
545 550 555 560
Thr Leu Trp Leu Leu Val Gly Leu Ser Val His Val Val Ala Val Met
565 570 575
Leu Tyr Leu Leu Asp Arg Phe Ser Pro Phe Gly Arg Phe Lys Val Asn
580 585 590
Ser Glu Glu Glu Glu Glu Asp Ala Leu Thr Leu Ser Ser Ala Met Trp
595 600 605
Phe Ser Trp Gly Val Leu Leu Asn Ser Gly Ile Gly Glu Gly Ala Pro
610 615 620
Arg Ser Phe Ser Ala Arg Ile Leu Gly Met Val Trp Ala Gly Phe Ala
625 630 635 640
Met Ile Ile Val Ala Ser Tyr Thr Ala Asn Leu Ala Ala Phe Leu Val
645 650 655
Leu Asp Arg Pro Glu Glu Arg Ile Thr Gly Ile Asn Asp Pro Arg Leu
660 665 670
Arg Asn Pro Ser Asp Lys Phe Ile Tyr Ala Thr Val Lys Gln Ser Ser
675 680 685
Val Asp Ile Tyr Phe Arg Arg Gln Val Glu Leu Ser Thr Met Tyr Arg
690 695 700
His Met Glu Lys His Asn Tyr Glu Ser Ala Ala Glu Ala Ile Gln Ala
705 710 715 720
Val Arg Asp Asn Lys Leu His Ala Phe Ile Trp Asp Ser Ala Val Leu
725 730 735
Glu Phe Glu Ala Ser Gln Lys Cys Asp Leu Val Thr Thr Gly Glu Leu
740 745 750
Phe Phe Arg Ser Gly Phe Gly Ile Gly Met Arg Lys Asp Ser Pro Trp
755 760 765
Lys Gln Asn Val Ser Leu Ser Ile Leu Lys Ser His Glu Asn Gly Phe
770 775 780
Met Glu Asp Leu Asp Lys Thr Trp Val Arg Tyr Gln Glu Cys Asp Ser
785 790 795 800
Arg Ser Asn Ala Pro Ala Thr Leu Thr Phe Glu Asn Met Ala Gly Val
805 810 815
Phe Met Leu Val Ala Gly Gly Ile Val Ala Gly Ile Phe Leu Ile Phe
820 825 830
Ile Glu Ile Ala Tyr Lys Arg His Lys Asp Ala Arg Arg Lys Gln Met
835 840 845
Gln Leu Ala Phe Ala Ala Val Asn Val Trp Arg Lys Asn Leu Gln Asp
850 855 860
Arg Lys Ser Gly Arg Ala Glu Pro Asp Pro Lys Lys Lys Ala Thr Phe
865 870 875 880
Arg Ala Ile Thr Ser Thr Leu Ala Ser Ser Phe Lys Arg Arg Arg Ser
885 890 895
Ser Lys Asp Thr Ser Thr Gly Gly Gly Arg Gly Ala Leu Gln Asn Gln
900 905 910
Lys Asp Thr Val Leu Pro Arg Arg Ala Ile Glu Arg Glu Glu Gly Gln
915 920 925
Leu Gln Leu Cys Ser Arg His Arg Glu Ser
930 935

Claims (10)

1.一种NMDAR的NR1亚基缺失突变体，其特征在于，所述NR1亚基缺失突变体缺失NR1亚基的627-630位氨基酸或581-624位氨基酸；
所述NMDAR的NR1亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
2.权利要求1所述NR1亚基缺失突变体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
以包含SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的质粒为模板，利用引物对进行PCR扩增，得所述NR1亚基缺失突变体；
其中，针对627-630位氨基酸缺失设计的引物包括627-630-F和627-630-R，627-630-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，627-630-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
针对581-624位氨基酸缺失设计的引物包括581-624-F和581-624-R，581-624-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，581-624-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，所述模板包括将SEQ ID NO.1所示核苷酸序列插入pCDNA3.1的NheI和NotI酶切位点之间。
4.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系以50μL计，包括模板50ng、引物F 2μL、引物R 2μL、Fast Pfu DNA Polymerase 1μL、5×Fast Pfu buffer 10μL、2.5mM dNTP 4μL、DMSO 1μL和余量的Nuclease-free Water。
5.根据权利要求2或4所述构建方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序，包括：98℃预变性2min；98℃变性15s，59℃退火15s，72℃延伸4min，33个循环；72℃再延伸5~10min。
6.一种结合NMDAR自身抗体的NMDAR突变体细胞，其特征在于，所述NMDAR突变体细胞包括权利要求1所述NR1亚基缺失突变体和NR2亚基。
7.权利要求6所述NMDAR突变体细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述NR1亚基缺失突变体和NR2亚基共转细胞，得所述NMDAR突变体细胞。
8.根据权利要求7所述构建方法，其特征在于，所述NR1亚基缺失突变体和NR2亚基的质量比为（0.2~5）：1。
9.权利要求1所述NR1亚基缺失突变体或权利要求6所述NMDAR突变体细胞在制备检测NMDAR脑炎患者抗NMDAR自身抗体的试剂中的应用。
10.一种检测NMDAR脑炎患者自身抗体的系统，其特征在于，包括利用权利要求1所述NR1亚基缺失突变体或权利要求6所述NMDAR突变体细胞制备得到的细胞爬片和血清免疫荧光染色试剂。
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