JPH09505889A

JPH09505889A - キナーゼ受容体活性化検定法

Info

Publication number: JPH09505889A
Application number: JP7515150A
Authority: JP
Inventors: ゴドウスキー，ポール・ジェイ; マーク，メラニー・アール; サディック，マイケル・ダニエル; ウォン，ウェイ・リー・タン
Original assignee: ジェネンテク，インコーポレイテッド
Priority date: 1993-11-23
Filing date: 1994-11-18
Publication date: 1997-06-10
Anticipated expiration: 2018-09-02
Also published as: CA2175892A1; US6025145A; GR3026430T3; AU1210895A; EP0730740A1; ATE163231T1; DE69408541T2; AU698975B2; CA2175892C; ES2116066T3; US5891650A; JP3442784B2; DE69408541D1; WO1995014930A1; US5914237A; EP0730740B1; DK0730740T3; HK1008440A1

Abstract

(57)【要約】問題のチロシンキナーゼ受容体の活性化（すなわち自己リン酸化）を測定する検定法が開示されている。(a) 細胞が第１固相に付着するよう、第１固相を実質的に均一な細胞集団で被覆する。細胞は外来のチロシンキナーゼ受容体を有するか、または受容体若しくは「受容体構築物」をコードするＤＮＡで形質転換されており、ＤＮＡが発現して受容体または受容体構築物が細胞の細胞膜に存在する。(b) リガンドを付着している細胞を有する固相に次に加え、チロシンキナーゼ受容体をリガンドに接触させる。(c) リガンドに接触させた後、付着している細胞を溶解し、それによって細胞溶解物を放出させる。(d) チロシンキナーゼ受容体に、または受容体構築物の場合にはフラグポリペプチドに特異的に結合する捕獲剤で第２固相を被覆する。(e) 工程(c)で得られた細胞溶解物を、付着している捕獲剤を含むウエルに加え、受容体または受容体構築物をウエルに捕獲する。(f) 洗浄工程を行い、非結合細胞溶解物を除去し、捕獲された受容体または受容体構築物を残す。(g) 捕獲された受容体または受容体構築物を、チロシンキナーゼ受容体中のリン酸化された残基を同定する、標識された抗ホスホチロシン抗体に接触させる。(h) 捕獲された受容体または受容体構築物への抗ホスホチロシン抗体の結合を測定する。

Description

【発明の詳細な説明】キナーゼ受容体活性化検定法発明の背景発明の分野本発明はキナーゼ受容体活性化（ＫＩＲＡ）検定法に関する。特には本発明は、キナーゼ受容体活性化、酵素結合免疫吸着検定法（ＫＩＲＡＥＬＩＳＡ）を用いる、受容体プロテインチロシンキナーゼ（ｒＰＴＫ）のキナーゼドメインの自己リン酸化を測定する検定法に関する。関連技術の記述動物における信号伝達の一つの機構はタンパク質リン酸化を含む。タンパク質リン酸化は、リン酸基をリン酸ドナーから基質タンパク質中のアクセプターアミノ酸へ転移させる酵素であるプロテインキナーゼの作用を含む。プロテインホスファターゼは刺激が除かれた場合、信号を逆にする手段を提供する。プロテインキナーゼは多重基質であり、プロテインキナーゼの分類はアクセプターアミノ酸特異性に基づいている。２つの最もよくキャラクタライズされたプロテインキナーゼは、プロテインセリン／トレオニンキナーゼと呼ばれる、アクセプターとしてタンパク質のアルコール基を有するプロテインキナーゼ、およびプロテインチロシンキナーゼと呼ばれる、アクセプターとしてタンパク質のフェノール基を有するプロテインキナーゼである(Ｈunter、Ｍethods in Ｅnzymol ogy ２００：３〜９[１９９１])。最もよく知られたタイプの信号伝達性プロテインキナーゼは、成長因子受容体プロテインチロシンキナーゼ（ｒＰＴＫ）である。ｒＰＴＫは通常、大きい、グリゴシル化された細胞外リガンド結合ドメイン（ＥＣＤ）、およびチロシンキナーゼ触媒ドメインを有する細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を含んでなる。単一の疎水性の膜貫通（ＴＭ）ドメインがＥＣＤとＩＣＤを結合する。ｒＰＴＫの例にはインスリン受容体、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｒ）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−Ｒ）、およびＨＥＲ２受容体を含む。例えばＵllrichおよびＳchlessinger、Ｃell ６１：２０３〜２１２（１９９０）およびFantl等、Ａnn．Ｒev．Ｂiochem. ６２：４５３〜４８１（１９９３）を参照。ｒＰＴＫは外来のタンパク質基質および固有のチロシン残基をその触媒チロシンキナーゼドメインによりリン酸化できる。固有のチロシン残基は、通常ｒＰＴＫのＩＣＤにある（図１参照）。ｒＰＴＫの細胞内キナーゼドメインの活性化は、リガンド結合によるＥＣＤのコンホメーション変化から生ずる受容体オリゴメリ化により媒介される。ＵllrichおよびＳclessinger （上書）を参照。セリン−トレオニンキナーゼも文献に開示されている。公知のプロテインセリン−トレオニンキナーゼの大部分は細胞質タンパク質であり、セリン−トレオニンキナーゼドメインを有する哺乳動物の膜貫通受容体のファミリーが最近見出された。この受容体ファミリーの膜はＴＧＦ−βおよびアクチビンを結合すると記載されている。セリン−トレオニンキナーゼの総説については、Ｓale，Ｇ.、Ｂ iochem．Ｓoc．Ｔransactions ２０：６６４〜６７０(１９９２)；ten Ｄijke 等、Ｐrog．in Ｇrowth Ｆactor Ｒes. ５：５５〜７２(１９９４)；およびＭathews，Ｌ.、Ｅndoc．Ｒev. １５(３)：３１０〜３２５（１９９４）を参照。チロシンキナーゼ活性を測定する様々な検定法が開発されている。これらの検定法のいくつかは、チロシンキナーゼ酵素が合成基質ポリペプチドをリン酸化する能力を測定する。例えばキナーゼがＡＴＰのγ−リン酸の適当なアクセプター基質への転移を触媒する能力を測定することにより、成長因子媒介チロシンキナーゼの活性を測定する検定法が開発された。例えばＰike，Ｌ.、Ｍethods of Ｅnzymology 、１４６：３５３〜３６２（１９８７）およびＨunter、Ｊournal of Ｂiological Ｃhemistry ２５７(９)：４８４３〜４８４８（１９８２）を参照。この検定法では［γ−³²Ｐ］ＡＴＰを用いるとリン酸化基質（合成のチロシン含有ペプチドである）の放射性標識が可能になる。他のものはプロテインキナーゼ検定法を記載し、その検定法では、ＥＧＦ受容体(Ｄanato等、Ｃell Ｇrowth Ｄiffer. ３：２５９〜２６８［１９９２］参照)、インスリン受容体 (Ｋasuga等、Ｊournal of Ｂiological Ｃhemistry ２５７（１７）：９８９１〜９８８４［１９９２］およびＫasuga等、Ｍethods in Ｅnzymology、１０９：６０９〜６２１［１９８５］参照)、および肝臓成長ホルモン受容体（Ｗa ng等、Ｊournal of Ｂiological Ｃhemistry ２６７(２４)：１７３９０〜１７３９６［１９９２］参照）等のチロシンキナーゼ受容体への³²Ｐの導入を測定する。抗ホスホチロシン抗体の発見はチロシン残基のリン酸化を測定する非放射性の、別の手段を提供した。例えばＷhiteおよびＢacker（Ｍethods in Ｅnzymolo gy ２０１：６５〜６７[１９９１]）は、ホスホチロシンに選択的に結合し、ｒＰＴＫを研究するのに有用であると考えられるポリクローナル抗体について述べている。抗ホスホチロシンモノクローナル抗体がＭadden等（Ａnal．Ｂiochem ．１９９：２１０〜２１５[１９９１]）中に引用された検定法の一つで用いられ、その検定法はインスリン受容体へのホスファターゼ活性を測定する。抗ホスホチロシン抗体はＣleaveland等により、プロテインチロシンキナーゼＥＬＩＳＡ検定法でも用いられている。Cleaveland等、Ａnalytical Ｂiochemistry １９０：２４９〜２５３（１９９０）参照。Ｃleaveland等の方法は、精製した高活性オンコジーンチロシンキナーゼ、v−srcおよびv−fpsを用い、これらのチロシンキナーゼの、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート上にコートした合成ポリマー基質をリン酸化する能力を測定する。ポリマー基質のsrc−誘導リン酸化により作られたホスホチロシンを、抗ホスホチロシン抗体により次に定量化し、抗体の存在はリポーター酵素、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）に結合した第２のラビット抗マウス抗体を用いて検出する。類似のＥＬＩＳＡ検定法はＬazaro等により開発され、該検定法をプロテインチロシンキナーゼの検出に用いる。Ｌazaro等、Ａnalytical Ｂiochemistry 192: 257〜261(1991)を参照。Ｃleaveland等の検定法と同様に、この検定法もプロテインチロシンキナーゼの、ミクロＥＬＩＳＡウエルに結合した合成基質をリン酸化する能力を測定する。ｒＰＴＫの特異的な活性化を評価する直接的な方法は、受容体自己リン酸化の分析による。ＨunterおよびＣooper、Ａnn．Ｒev．Ｂiochem. ５４：８９７〜９３０（１９８５）およびＵllrichおよびSchlessinger、Ｃell ６１：２０３〜２１２（１９９０）を参照。この直接的アプローチを用いて、ＫnutsonおよびＢ uckは、in situおよびインビトロ条件下にインスリン受容体の自己リン酸化を測定する検定法を開示する(Ａrchieves of Ｂiochemistry and Ｂiophysics ２８５(２)：１９７〜２0４[１９９１])。そのＩn situ検定法において胚性マウス３Ｔ３−Ｃ２線維芽細胞（内因性のインスリン受容体を有する）の単層培養物を大きい細胞培養皿中でインスリンとインキュベートする。インキュベーション後、そのインスリン受容体を膜から抽出する。インスリン受容体の抽出を行うために、その細胞単層をプロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液中にかき出し、次にその細胞をホモジナイザーで破壊する。その細胞ホモジネートを次に６０分遠心分離に付し、生成するペレットを界面活性剤を含む緩衝液中に抽出する。更なる遠心分離工程の後に、上清（インスリン受容体を含む）を抗インスリン受容体抗体とインキュベートする。次にその受容体抗体複合体をプロテインＡ−アガロースとインキュベートし、占有されていないプロテインＡ部位を通常のラビット１g Ｇでブロックする。アガロースビーズを次に遠心分離し、上清をアスピレートし、ペレットを放射能標識抗ホスホチロシン抗体を含む緩衝液に再懸濁する。結合したヨウ素化抗ホスホチロシン抗体の量が測定される。Ｋleinとその協力者は、インスリン受容体のインスリン活性化を測定する検定法を議論する(Ｋlein等、Ｄiabetes ４２：８８３〜８９０[１９９３])。この検定法では、インスリン受容体を有する単核血液細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ等を含む）のヘテロジニアスな集団のアリコートを遠心管中でインスリンと接触させる。その細胞をモーター駆動ホモジナイザーを用いて界面活性剤中で次に溶解し(lysed)、溶解産物を真空遠心分離を用いて２〜４倍濃縮する。時にはインスリン受容体をコムギ胚芽凝集素アガロースを用いて部分的に精製する。遠心後生成する上清を次に抗インスリン受容体を被覆したミクロタイタープレートに移す。ミクロタイタープレートに捕獲される受容体のパーセントを最適化するために、インスリン（８.７nＭ）、並びにキナーゼおよびホスファターゼ阻害剤が受容体固定化中存在する。インスリン受容体の活性化を、³²Ｐ標識ＡＴＰを用いる基質ポリＧlu，Tyrのリン酸基転位により次に測定する。上清を次に吸収紙上にスポットし、その吸収紙を冷ＴＣＡで洗浄して、結合していない³²Ｐ −ＡＴＰを除去する。洗浄した吸収紙上に残存する³²Ｐ−標識ポリ−Ｇlu，Ｔy をシンチレーションカウンティングにより次にカウントする。Ｈagino等も患者におけるインスリン受容体の研究に興味を持った(Ｈagino等、Ｄiabetes ４３：２７４〜２８０[１９８４])。検定法ンにおける第１工程として、Ｈagino等は、細胞型に関して特にホモジニアスでない一次細胞懸濁液を刺激する。特にヘパリン化血液（１mlを媒地で２回洗浄し、牛血清アルブミンＢＳＡを含む媒地１mlに再懸濁）を、様々な濃度のインスリンに接触させる。自己リン酸化反応を中止し、細胞を３０分遠心分離し、上清を捨て、このようにして得た赤血球ゴーストを緩衝液に再懸濁し、再度遠心分離する。これによって得たペレットを５００μlに調節し、界面活性剤中に溶解する。溶解した物質を次に遠心分離し、得られた上清をサンドイッチＥＬＩＳＡ（抗インスリン受容体抗体を用いてインスリン受容体を捕獲する）に付し、インスリン受容体自己リン酸化の程度を測定する。Ｋing等（Ｌife Ｓciences ５３：１４６５〜１４７２[１９９３]）は、ヒトの無傷の表皮Ａ４３１細胞における表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）受容体関連チロシンキナーゼの阻害剤を調べるための比色検定法を記述する。幾人かの他の人は、受容体自己リン酸化を測定するウエスタンブロット分析において酵素に結合した形の抗ホスホチロシン抗体を用いた。簡単に言えば、ウエスタンブロッティングは一般にポリアクリルアミドゲル上で活性化ｒＰＴＫを電気泳動することを含む。ｒＰＴＫを次にニトロセルロースに移し、検出を可能にするよう標識した抗ホスホチロシン抗体でイムノブロットする。例えば、Ｗang,Ｍolecular and Ｃellular Ｂiology ５(１２)：３６４０〜３６４３(１９８５)；Ｇlenney等、Ｊournal of Ｉmmunological Ｍethods １０９：２７７〜２８５(１９８８)；Ｋamps、Ｍethods in Ｅnzymology ２０１：１０１〜１１０(１９９１)；Ｋozma等、Ｍethods in Ｅnzymology ２０１：２８〜４３ (１９９１)；Ｈolmes等、Ｓcience ２５６：１２０５〜１０（１９９２）；およびＣorfas等、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ９０：１６２４〜１６２８（１９９３）を参照。しかしウエスタンブロットの場合、正確な定量は非常に煩雑である。さらにこの技術は時間を要す傾向があり、一般に高サンプル処理ができない。受容体プロテインチロシンキナーゼ（ｒＰＴＫ）自己リン酸化を測定する感度の良い、信頼できる検定法を提供するのが本発明の目的である。その検定法はキナーゼ活性化を定性的および定量的に測定し、およびある選択されたｒＰＴＫの可能なアゴニストおよびアンタゴニストの同定および特性づけを容易にするのに望ましく有用である。リガンド−受容体相互作用をいずれかの選択したｒＰＴＫについて研究することを可能にする検定法を提供するのが本発明の更なる目的である。この検定法は高処理量能力、すなわち、多数のサンプルを比較的短時間で（例えば１日で）信頼可能に評価する能力を有しなければならない。その検定法は理想的には放射性材料を使用せず、自動化もすることができる。所望の特徴を有する受容体特異的な捕獲剤が利用できるかどうかとは関係なく、問題のｒＰＴＫを研究することを可能にする一般的な検定法を提供することは、本発明の少なくとも一態様において、本発明の更なる目的である。更に、in s ituでのチロシンキナーゼ受容体の活性を実質的に表す検定法を提供するのは本発明の目的である。受容体とリガンド間の相互作用の変化が膜に結合していない受容体の結果として生ずる可能性を減少させる限りにおいてこれは望ましい。更に受容体がマルチマー的複合体であるなら、この検定法は正しく組立てられた受容体を研究するのを可能にする。セリン−トレオニンキナーゼリン酸化、細胞内キナーゼのリン酸化およびホスフォターゼ活性を測定する方法を提供するのが更なる目的である。これらおよび他の目的は、全体として本明細書を考慮することにより当業者に明白であろう。発明の要約従って本発明は、問題のチロシンキナーゼ受容体の活性化（すなわち自己リン酸化）を測定する検定法を提供する。その検定法は２つの主な段階に分けられる。各段階は一般に別のアッセイプレートで行なう。検定法の第１段階は受容体を活性化することを含み、検定法のキナーゼ受容体活性化（ＫＩＲＡ）段階と呼ぶ。検定法の第２段階は受容体活性化を測定することを含む。便利にはこれは、酵素結合免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて行われ、受容体活性化を測定する。検定法のＫＩＲＡ段階は、真核細胞の細胞膜に位置するチロシンキナーゼ受容体を活性化することを含み、受容体の細胞外ドメインは細胞の外部環境に面し、膜貫通ドメインは細胞膜中に位置し、キナーゼドメインは細胞内に位置する。この段階の全体の検定法は下の(a)〜(c)を含む。 (a) 第１の固相（例えば第１のアッセイプレートのウエル）を、細胞（通常は哺乳動物の細胞系）の実質的にホモジニアスな集団(population)で被覆し、細胞を固相に付着させる。しばしば細胞は付着性であり、したがって第１の固相に自然に付着する。本発明の一態様では、細胞は上に議論したように細胞膜に提示された内因性のチロシンキナーゼ受容体を有する。別の態様では、細胞は、チロシンキナーゼ受容体または以下で更に定義する「受容体構築物」をコードするＤＮＡで形質転換され、該ＤＮＡは受容体または受容体構築物が細胞膜中で適当に位置するように細胞により発現される。受容体構築物は、キナーゼ受容体とフラグ（flag）ペプチドの融合を含んでなる。フラグペプチドは検定法のＥＬＩＳＡ部分において捕獲剤、しばしば捕獲抗体により認識される。本明細書に開示する受容体構築物の使用は特に有益である。何故なら必要とされる特性を有する受容体特異的な捕獲剤が利用できるか否かにかかわらず、いかなるチロシンキナーゼ受容体の自己リン酸化をも測定できる「一般的な」検定法をそれは提供するからである。しばしばチロシンキナーゼ受容体は、ある選択されたチロシンキナーゼのＥＣＤおよび他のよく特性づけされたチロシンキナーゼ（例えばＲse受容体）の触媒的なＩＣＤ（および多分膜貫通ドメイン）を含んでなる融合タンパク質である。 (b) 分析物を付着細胞を有するウエルに次に加え、チロシンキナーゼを分析物にさらす（すなわち接触させる）。この検定法は問題のチロシンキナーゼ受容体についてのアゴニストおよびアンタゴニストリガンドの同定を可能にする。アゴニストリガンドによる受容体の結合および／または活性化をブロックするアンタゴニストリガンドの存在を検出するために、付着細胞を先ず考えられるアンタゴニストリガンドに接触させ、次にアゴニストリガンド（またはアゴニストとアンタゴニスト混合物）に接触させ、受容体結合および活性化の競合的阻害を測定できる。また該検定法はアゴニストリガンドに結合しそれによってｒＰＴＫに結合し、活性化するアンタゴニストの能力を減少させ、失くすアンタゴニストを同定できる。そのようなアンタゴニストを検出するためにｒＰＴＫに対する考えられるアンタゴニストおよびアゴニストを一緒にインキュベートし、次に付着細胞をこのリガンド混合物に接触させる。 (c) 分折物と接触させた後、付着細胞を細胞溶解緩衝液（その中に溶解用界面活性剤を含む）および穏やかな撹拌を用いて溶解させ、それによって、検定法のＥＬＩＳＡ部分に細胞溶解産物の濃縮または清澄化なしに直接付すことのできる細胞溶解産物を放出させる。かくしてこの検定法は、ＥＬＩＳＡ前に細胞溶解産物を濃縮することが驚くべきことに不必要である点において、ＫnutsonおよびＢ uck（上書）、Ｋlein等（上書）およびＨagino等（上書）により記載された検定法に比べ顕著な改良を提供する。さらに他の検定法とは異なり本検定法においては、細胞は、細胞をホモジナイズし、遠心分離し、または清澄化する必要なしに、細胞溶解緩衝剤中での穏やかな撹拌を用いて溶解できる。このように調製された細胞溶解物は検定法のＥＬＩＳＡ段階に付す準備ができる。検定法のＥＬＩＳＡ段階の前に第１アッセイプレートは凍結温度（すなわち約−２０°〜７０℃）で相当な時間（少なくとも６月）貯蔵できることが驚くべきことに発見された。これは、検定法のＫＩＲＡおよびＥＬＩＳＡ段階を別の日に行い得る点において重要な発見である。検定法のＥＬＩＳＡ部分は工程(d)〜(h)を含んでなり、以下に記載する。 (d) 第１工程として、第２の固相（通常ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートのウエル）を、チロシンキナーゼ受容体に、または受容体構築物の場合にはフラグポリペプチドに特異的に結合する捕獲剤（しばしば捕獲抗体）で被覆する。第２固相の被覆は捕獲剤が第２固相に付着するよう行われる。捕獲剤は通常モノクローナル抗体であるが、実施例に記載するようにポリクローナル抗体も用いてよい。 (e) 検定法の上述のＫＩＲＡ段階の工程(c)で得られた細胞溶解物を、付着している捕獲剤にさらし、または接触させ、受容体または受容体構築物は第２固相に付着する（または捕獲される）。Ｋlein等の検定法とは異なり、第２固相への受容体または受容体構築物の適当な固定化を達成するために、受容体に対するリガンドおよびキナーゼ阻害剤が存在することを本方法は要しない。 (f) 結合していない細胞溶解物を除去するため洗浄工程を次に行い、捕獲された受容体または受容体構築物を残す。 (g) 付着し、または捕獲された受容体または受容体構築物を、チロシンキナーゼ受容体中のリン酸化されたチロシン残基を同定する抗ホスホチロシン抗体に次にさらしまたは接触させる。好ましい態様では抗ホスホチロシン抗体を、非放射性の発色試薬の色変化を触媒する酵素にコンジュゲート（直接または間接に）する。したがって受容体のリン酸化を、試薬のその後の色の変化により測定し得る。酵素を抗ホスホチロシン抗体に直接結合することができ、またはコンジュゲート用分子（例えばビオチン）を抗ホスホチロシン抗体にコンジュゲートし、酵素を、抗ホスホチロシン抗体に、コンジュゲート用分子を介してその後結合できる。 (h) 最後に、捕獲された受容体または受容体構築物への抗ホスホチロシン抗体の結合を、例えば発色試薬の色変化により測定する。本発明は、ＫＩＲＡＥＬＩＳＡ検定法における使用に特に有用なＲse.フラグ試薬にも関する。Ｒse.フラグ試薬は、フラグポリペプチド（通常、本明細書に記載するgＤフラグ）の、Ｒse ｒＰＴＫの細胞内ドメインのカルボキシ末端への融合を含むポリペプチドである。一般に、Ｒseの膜貫通ドメインおよび問題の他のｒＰＴＫの細胞外ドメインも、融合ポリペプチド試薬中に存在する。この試薬をコードする核酸およびそれによって形質転換された細胞も特許請求する。他の要旨では、本発明は、上に開示したＫＩＲＡＥＬＩＳＡに用いることのできるキットに関し、本明細書に記載する第２固相に通常結合する抗フラグポリペプチド捕獲剤（例えば捕獲抗体）を含んでなる。従ってキットはウエルに付着する抗フラグポリペプチド捕獲抗体を有するＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを通常提供する。場合によりキットはしばしば標識された抗ホスホチロシン抗体をも提供し、または抗ホスホチロシン抗体を標識する試薬をキットと共に供給する。時には本明細書に記載する受容体構築物で形質転換した細胞の均一な集団をもキットと共に提供する。キットはＫＩＲＡＥＬＩＳＡを行うための説明書も適当に含む。図面の簡単な記述図１Ａ−１Ｃは、Ｒse.gＤ（図１Ａ）、受容体ＥＣＤ／Ｒse.gＤキメラ(図１Ｂ)、および受容体ＥＣＤ／Ｒse.gＤキメラで形質転換されたＣＨＯ細胞（図１Ｃ）の模式的な表示である。図２Ａおよび２Ｂは、Ｒse.gＤのアミノ酸配列（配列番号１）およびヌクレオチド配列（配列番号２）の配列を示す。シグナル配列の残基は（★）で示し、Ｒ seの膜貫通ドメインをボックスで囲み、ＲseのＥＣＤおよびＩＣＤを記述する。 gＤフラグ配列の残基はアンダーラインをつける。図３は、検定法での使用に適した捕獲剤を選択するための例示的な戦略のフローダイアグラムである。図４は、検定法での使用に適した形質転換細胞を選択するための例示的な戦略のフローダイアグラムであり、細胞は細胞膜に位置するアミノ末端フラグポリペプチドを有する受容体構築物を有する。図５は、検定法での使用に適した形質転換細胞を選択するための例示的な戦略のフローダイアグラムであり、細胞は細胞膜に位置するカルボキシ末端フラグポリペプチドを有する受容体構築物を有する。図６は、実施例１に記載するＨＥＲ２受容体についてのＫＩＲＡＥＬＩＳＡ検定法を説明するフローチャートおよびカートーンである。図７は、実施例１に記載する検定法を用いて得られたp１８５^HER2／ＨＲＧβ １_177-244ＫＩＲＡＥＬＩＳＡ標準曲線を示す。標準曲線を得るために、定量的なアミノ酸分析（q.a.a.a.）により測定した、３０００、１０００、３３３、１１１、３７、１２、４または０ pM ＨＲＧβ１_177-244でＭＣＦ−７細胞（２ ×１０⁵）を刺激した。各キャリブレータ濃度は３回試験した。１０のそのような標準曲線から得られた値を平均し（全ｎ＝３０）、平均ＡＢＳ_450/650±sd対ＨＲＧβ１_177-244濃度として示す。図８は、実施例１のp１８５^HER2／ＨＲＧＫＩＲＡＥＬＩＳＡのヘレグリン特異性を示す。検定法において、ＨＲＧβ１_177-244（■）を用いて３０００、１０００、３３３、１１１、３７、１２、４、若しくは０pＭで、またはＩＧＦ−１(▲)、ＥＧＦ(□)、ＶＥＧＦ（●）若しくはインスリン（◆）を用いて３００００、１００００、３３３３、１１１１、３７０、１２０、４０若しくは０ pＭで、ＭＣＦ−７細胞（２×１０⁵）を刺激した。すべてのリガンド濃度について、n＝３であり、データは平均ＡＢＳ_450/650±sd対リガンド濃度として示した。図９は、実施例２に記載するＲse受容体についてのＫＩＲＡＥＬＩＳＡ検定法を説明するフローチャートおよびカートーンである。図１０は、実施例２に記載する検定法を用いて得られたＲse ＫＩＲＡＥＬＩＳＡ標準曲線を示す。標準曲線を得るために、Ｒse.gＤ構築物で形式転換したＣＨＯ細胞を、１：１００、１：２００、１：４００、１：８００、１：１６００、１：３２００または０希釈した抗Ｒseアゴニスト抗体で刺激した。各キャリブレーター濃度は３回試験した。値は、平均ＡＢＳ_450/650±sd対１／希釈アゴニスト抗体として示す。図１１は、実施例３に記載するtrk受容体（すなわちtrkＡ、trkＢおよびtrkＣ）についてのＫＩＲＡＥＬＩＳＡを説明するフローチャートおよびカルトーンである。図１２Ａ−１２Ｄは、実施例３に記載する検定法に用いるgＤ.trkＡのアミノ酸配列（配列番号３）およびヌクレオチド配列（配列番号４）の配列を示す。シグナル配列の残基を（★）で示し、gＤフラグ配列の残基にはアンダーラインを付し、trkＡの膜貫通ドメインの残基は太線で示し、そのＥＣＤおよびＩＣＤを記述する。図１３Ａ−１３Ｄは、実施例３に記載する検定法で用いるgＤ.trkＢのアミノ酸配列（配列番号５）およびヌクレオチド配列（配列番号６）の配列を示す。シグナル配列の残基を（★）で示し、gＤフラグ配列の残基にはアンダーラインを付し、trkＢの膜貫通ドメインの残基は太線で示し、そのＥＣＤおよびＩＣＤを記述する。図１４Ａ−１４Ｄは、実施例３に記載する検定法で用いるgＤ.trkＣのアミノ酸配列（配列番号７）およびヌクレオチド配列（配列番号８）の配列を示す。シグナル配列の残基は（★）で示し、gＤフラグ配列の残基はアンダーラインを付し、trkＣの膜貫通ドメインの残基は太線で示し、そのＥＣＤおよびＩＣＤを記述する。図１５Ａ−１５Ｃは、実施例３に記載する検定法を用いて得られた、それぞれ trkＡ、ＢおよびＣについての標準曲線を示す。標準曲線を得るために、gＤ.trk 構築物で形質転換したＣＨＯ細胞を、リガンド、すなわち神経成長因子(ＮＧＦ，■)、ノイロトロフィン３(ＮＴ３，●)、またはノイロトロフィン５（ＮＴ５，▲）の３０００、１０００、３３３、１１１、３７、１２、４または０pＭで刺激した。値は平均ＡＢＳ_450/650±sd対リガンド濃度として示す。図１６Ａ−１６Ｌは、実施例２のＲse.gＤの発現に用いるpＳＶＩ１７．ＩＤ．ＬＬ発現ベクターのヌクレオチド配列（配列番号９）を示す。図１７は、実施例４に記載するＭＰＬ／Ｒse.gＤキメラ受容体の模式的な表示である。図１８は、実施例４に記載するＭＰＬ／Ｒse.gＤキメラ受容体についてのＫＩＲＡＥＬＩＳＡを説明するフローチャートおよびカートーンである。好ましい態様の詳細な記述Ｉ．略号および定義「ｒＰＴＫ」は、受容体プロテインチロシンキナーゼを意味する。「ＥＣＤ」、「ＴＭドメイン」および「ＩＣＤ」はそれぞれ、ｒＰＴＫの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインを意味する。本出願において用いる場合「キナーゼ受容体活性化」または「ＫＩＲＡ」は、今特許請求する検定法の第１段階を言い、該検定法では、細胞に結合したｒＰＴＫを、ｒＰＴＫの細胞内ドメインのチロシン残基のリン酸化を誘導し得る（またはし得ない）可能性のあるアゴニスト／アンタゴニストと接触させる。ＫＩＲＡは本明細書で定義する「第１のアッセイプレート」中で一般に行う。「酵素結合免疫吸着剤検定法」または「ＥＬＩＳＡ」とは、今特許請求する検定法の第２段階を言い、ｒＰＴＫのチロシンリン酸化の測定を含む。ＥＬＩＳＡは本明細書に開示する「第２のアッセイプレート」中で通常行う。ＥＬＩＳＡは、それが第２固相（通常はＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートのウエル）へのｒＰＴＫまたは受容体構築物捕獲を含む限りにおいて「サンドイッチＥＬＩＳＡ」である。ＥＬＩＳＡ検定法は、酵素−抗体コンジュゲートの調製を一般に含む。コンジュゲートした酵素は基質を解裂して、分光学的に検出できる着色した反応生成物を生じる。この検定法において個々のマイクロタイターウエル中の着色した溶液の吸収は、ホスホチロシンの量に比例する。ＥＬＩＳＡの総説はＣurre nt Ｐrotocols in Ｍolecular Ｂiology ２巻、１１章（１９９１）中に見出される。「ＥＬＩＳＡ」という語は本検定法の第２段階を記載するのに用いるが、それは本発明の好ましい態様にすぎない。なぜなら、本明細書に開示するように酵素的検出以外の技術が、活性化した受容体への抗ホスホチロシン抗体の結合の測定に利用できるからである。「受容体」、「キナーゼ受容体」、「チロシンキナーゼ」、「チロシンキナーゼ受容体」、「受容体プロテインチロシンキナーゼ」および「ｒＰＴＫ」は本明細書では互換的に用い、少なくとも１つのリン酸を受容するフェノール基を有するタンパク質を言う。そのタンパク質は、それがリガンド結合性のＥＣＤ、ＴＭドメインおよびＩＣＤを有する限りにおいて通常受容体である。ＩＣＤは通常触媒的なキナーゼドメインを含み、１またはそれ以上のリン酸を受容するチロシン残基を有する。例えば図１Ａおよび１Ｂを参照。チロシンキナーゼ受容体の例には、インスリン受容体、インスリン関連受容体、上皮増殖因子受容体(ＥＧＦ− Ｒ)、血小板由来増殖因子受容体ＡおよびＢ(ＰＤＧＦ−Ｒ−ＡおよびＰＤＧＦ− Ｒ−Ｂ)、インスリン様増殖因子１受容体(ＩＧＦ−１−Ｒ)、マクロファージコロニー刺激因子受容体(Ｍ−ＣＳＦ−Ｒ)、ＨＥＲ２／neu／c−erbＢ−２受容体、ＨＥＲ３／c-erbB−３受容体、Xmrk受容体、ＩＲＲ受容体、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体bekおよびflg、c−kit受容体、Ｆlk／kＤＲ受容体、Ｒse受容体、Ｅph、Ｅlk、Ｅck、Ｅek、Ｅrk、Ｃek４／Ｍek４／ＨＥkおよびＣek５受容体、Ａx１受容体、肝細胞増殖因子受容体(ＨＧＦ−Ｒ)、Ｆlt１ＶＥＧＦ受容体、ＳＡＬ−ＳＩ受容体、ＨpＴk５受容体、trkＡ受容体、trkＢ受容体およびtr kＣ受容体を含む。例えば、ＵllrichおよびＳchlessinger、Ｃell ８１：２０３〜２１２(１９９０)；Fantl等、Ａnnu．Ｒev．Ｂiochem. ６２：４５３〜４８１(１９９３)；Ｍark等、Ｊournal of Ｂiological Ｃhemistry、２６９(１４)：１０７２０〜１０７２８(１９９４)；およびＷＯ９３／１５２０１を参照。上述の語は、選択されたチロシンキナーゼの少なくとも細胞外ドメインおよび細胞内ドメイン、および場合により他のチロシンキナーゼの膜貫通ドメインを含んでなるキメラ「受容体」分子を包含する。勿論問題のチロシンキナーゼは膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインを提供し得る。その語は、様々なｒＰＴＫのアミノ酸配列変異体および共有結合誘導体を、それがＫＩＲＡＥＬＩＳＡにおいてチロシンキナーゼリン酸化活性を未だ示すならば、包含する。それ故該変異体は保存的なアミノ酸の変化を一般に有するであろう。チロシンキナーゼの個々のドメインは公知のチロシンキナーゼに対する配列相同性および疎水性プロットに基づいて記述できる。例えば疎水的な膜貫通ドメインは容易に決定でき、ＥＣＤとＩＣＤは通常膜貫通ドメインの、それぞれアミノ末端およびカルボキシル末端である。便利にはＲse受容体の膜貫通ドメインとＩＣＤを問題のチロシンキナーゼのＥＣＤに融合し、それによって上述のように受容体を示す用語に包含されるキメラ受容体を形成できる。好ましい態様ではｒＰＴＫを、ＨＥＲ２受容体(ＵllrichおよびＳchlessinger 、上書)、Ｒse受容体(Ｍark等、上書、配列番号１)、trkＡ受容体(配列番号３)、trkＢ受容体（配列番号５）およびtrkＣ受容体（配列番号７）よりなる群から選択する。「自己リン酸化」とはｒＰＴＫの触媒的なキナーゼドメインの活性化を意味し、それによって少なくとも１つの固有のチロシン残基がリン酸化される。一般に自己リン酸化はアゴニスト分子がキナーゼ受容体の細胞外ドメインに結合した場合に生じるであろう。特定の作用機構に限定されることなく、アゴニスト分子の結合はキナーゼ受容体のオリゴメリ化をもたらし、それが触媒的なキナーゼドメインの活性化を起こすかも知れないと考えられる。「固相」とは、細胞（検定法のＫＩＲＡ段階で）または捕獲剤（検定法のＥＬＩＳＡ段階で）が付着し得る非水系のマトリックスを意味する。通常、固相はアッセイプレートのウエルを含むが本発明はこの態様に限定されない。例えば固相は分離した粒子よりなる非連続的な固相を含み得る。その粒子は多孔性で、多くの異なった材料、例えば多糖類(例えばアガロース)、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、シリコーンおよびガラスから形成し得る。適当な粒状固相の例については米国特許第４,２７５,１４９号を参照。「ウエル」とは水性の試料を置き得る凹んだところ（recess）または保持スペースを意味する。ウエルは「アッセイプレート」に設けられる。本発明は「第１のアッセイプレート」を用い、それは細胞（受容体または受容体構築物を有する）の付着を最適にする材料（例えばポリスチレン）から形成される。一般に、第１アッセイプレートの個々のウエルは体積比に対し大きい表面積を有し、それ故適当な形は平底のウエル（そこに細胞が付着する）である。「第２のアッセイプレート」は捕獲剤の付着を最適にする材料（例えばポリスチレン）から一般に形成される。第２アッセイプレートは第１アッセイプレートと同じ一般的な構成および／または特徴を有する。しかしながら検定法のＫＩＲＡ段階とＥＬＩＳＡ段階に別のプレートを用いる。本発明の好ましい態様では、第１アッセイプレートおよび第２アッセイプレートの両方とも「ミクロタイター」プレートである。本明細書で用いる「ミクロタイター」プレートの語は、約３０〜２００の個々のウエル、通常９６ウエルを有するアッセイプレートを言う。しばしばマイクロタイタープレートの個々のウエルは約２５０μlの最大容量を保持するであろう。便利には第１アッセイプレートは９６ウエルのポリスチレンまたはプラスチックの細胞培養マイクロタイタープレート（Ｂecton Ｄickinson Ｌabware、Ｌincoln Ｐark、ニュージャージによって販売されているもののような）であり、それは自動化可能である。しばしば細胞が懸濁している細胞培養培地を含む水性の試料約５０μl〜３００μl、より好ましくは１００μl〜２００μlを、検定法のＫＩＲＡ段階において第１アッセイプレートの各ウエルに加えるであろう。ウエル当り約１×１０⁴〜３×１０⁵の細胞を接種することが望ましい。より好ましくはウエル当り５×１０⁴〜１ ×１０⁵の細胞を接種する。通常第２アッセイプレートはＮunc Ｍaxisorp、Ｉn ter Ｍed、デンマークにより販売されているもののようなポリスチレンマイクロタイターＥＬＩＳＡプレートを含むであろう。「細胞の均一な集団」の語は、集団中の細胞の少なくとも約８０％、好ましくは９０％が同じ細胞形を有する実質的に均一な細胞集団を言う。それ故細胞系を用いるのが便利である。細胞系は真核生物細胞系、通常は動物の細胞系、望ましくは哺乳動物の細胞系である。その細胞は選択された受容体または受容体構築物を有し、または形質転換されて産生する。例えばキナーゼ受容体がある細胞系に存在することが知られている場合（例えばＭＣＦ−７細胞系におけるＨＥＲ２受容体）、形質転換工程は不要である。逆に、細胞が受容体を作らないか、または細胞膜中に適当な数の受容体を有しない場合には、細胞を受容体をコードする核酸で形質転換することが必要かも知れない。したがって細胞は受容体（または受容体構築物）をコードする核酸で形質転換され、核酸が発現され、その受容体のＥＣＤは細胞の外側の環境に面し、膜貫通ドメインは細胞膜に位置し、キナーゼドメインは細胞内に位置する。検定法が内生のｒＰＴＫの活性化に頼る場合には、十分なレベルのｒＰＴＫが細胞膜に存在し検出が可能であることを条件に、問題のｒＰＴＫを産生することが知られている細胞系を選択する。一般的な案として約１×１０⁴受容体／細胞という最小数が必要である。例えばＨＥＲ２受容体を産生するＭＣＦ−７細胞系（ＡＴＣＣ−ＨＴＢ２２）は検定法に有用であることが示された。５×１０⁴ＨＥＲ２受容体／ＭＣＦ−７細胞が存在する。他の細胞系およびそれらのそれぞれのｒＰＴＫの例は、胚性マウス３Ｔ３−Ｃ２線維芽細胞細胞系およびインスリン受容体、およびＨep３Ｂ（ＡＴＣＣ＃ＨＢ８０６４）細胞系およびＲse受容体を含む。しかしながら細胞系におけるｒＰＴＫ核酸の発現の程度は大きくないのでｒＰＴＫの構成的（constitutive）リン酸化をもたらす。例えば３×１０⁶ＨＥＲ２受容体／細胞を有するＳＫ−ＢＲ−３細胞系（ＡＴＣＣＨＴＢ３０）は本明細書に開示する検定法での使用に適しないことがわかった。それ故、受容体の種類に依存して、約３×１０⁶受容体／細胞以下を有する細胞系を用いるのが有用かも知れない。受容体／細胞の数は例えばＳcatchard分析（Ｓcatchard、Ａnn ．ＮＹＡcad．Ｓci. ５１：６６０〜６７２[１９４９]；Ｇoodwin等、Ｃell ７３：４４７〜４５６[１９９３]）を用いて測定できる。しかし適当な数の受容体／細胞を有する細胞系の選択は本明細書に記載する技術を用いて可能である。細胞を記述するため本明細書で用いる「付着」の語は、第１固相（しばしば第１アッセイプレートのウエル）に自然に付着し、それによってウエルの内表面上に細胞によるかなり均一な被覆を形成する細胞を言う。細胞による均一な被覆は、第１アッセイプレートのウエル中で細胞を約８〜１６時間インキュベートした後に一般に形成される。インキュベーションの後に、非付着細胞および細胞培養培地を第１アッセイプレートからデカントして除く。インキュベーションは細胞の増殖に最適の温度、すなわち約３７℃で通常行う。付着性細胞系の例はＣＨＯ細胞(ＵrlaubおよびＣhasin、Ｐroc．ＮaＨ．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ７７：４２１６[１９８０])、ＭＣＦ−７細胞（ＡＴＣＣＨＢ２２）、２９３細胞(Graham 等、Ｊ．Ｇen．Ｖirol. ３６：５９[１９７７])、Ｓwiss albino ３Ｔ３線維芽細胞細胞系(ＡＴＣＣＮｏ.ＣＣＬ９２)、およびＵ９３７マクロファージ細胞系（ＡＴＣＣＮｏ.ＣＲＬ１５９３）を含む。「フラグポリペプチド」は、「捕獲剤」をそれに対して作ることができるエピトープ（好ましくは直鎖状のエピトープ）を提供するに十分な残基を有するが、ｒＰＴＫの活性を妨害しないほど短い、短いポリペプチドを含んでなる。フラグペプチドは、それに対する捕獲剤が検定法の他の試薬に結合しないほど十分にユニークである。「ユニーク」なフラグポリペプチド配列の選択は、例えばＧenba nkまたはＥＭＢＬにおいて他の公知の配列に対して提案されたフラグポリペプチドの配列を比較することにより行うことができる。適当なフラグポリペプチドは一般に少なくとも６アミノ酸残基、通常は約８〜８０アミノ酸残基（好ましくは約９〜３０アミノ酸残基）を有する。「受容体構築物」とは、キナーゼ受容体と上に定義したフラグポリペプチドの融合を含んでなるポリペプチドを意味する。フラグポリペプチドは、ａ)フラグポリペプチドが受容体へのリガンド結合を妨害しない、ｂ)フラグポリペプチドは受容体の自己リン酸化を妨害しない、およびｃ)フラグポリペプチドは、検定法のＥＬＩＳＡ段階で捕獲剤に結合できるよう適当な立体配置で存在するよう受容体構築物のある位置に設けられる。しばしばポリペプチドフラグは受容体構築物のＮ末端に存在するであろう。例えば、ｇＤ．ｔｒｋ構築物についての実施例３を参照。或いは、フラグポリペプチドは受容体構築物のＣ末端に存在してもよい。例えば、Ｒse.gＤ構築物に言及する実施例２を参照。図１Ａ−１Ｃも参照。本明細書に開示するＲse構築物は特に有用である。何故ならそのＩＣＤ（および場合により膜貫通ドメイン）は問題のキナーゼ受容体のＥＣＤに融合でき、それによってフラグポリペプチドが問題のキナーゼ受容体に関してどこに位置すべきかを決める必要をなくすからである。「Ｒse.gＤ」とは、そのＣＯＯＨ末端に融合した単純疱疹ウイルスのグリコプロテインＤ（gＤ）フラグポリペプチドを有するＲse受容体プロテインチロシンキナーゼである受容体構築物を言う。「Ｒse.フラグ試薬」とは、ＣＯＯＨ末端でフラグポリペプチド（通常gＤフラグポリペプチド）に融合したＲse受容体のＩＣＤを含んでなるポリペプチドを言う。時には、ＲseのＴＭドメインおよび問題のｒＰＴＫのＥＣＤもＲse.gＤ試薬中に存在するであろう。「受容体ＥＣＤ／Ｒse.gＤキメラ」とは、gＤフラグポリペプチドへＣＯＯＨ末端で融合したＲseのＴＭおよびＩＣＤドメインへの問題のｒＰＴＫのＥＣＤの融合を言う。「gＤ.trkＡ」、「gＤ.trkＢ」、および「gＤ.trkＣ」は、アミノ末端に融合したgＤフラグポリペプチドを有する各trk受容体（Ａ〜Ｃ）を言う。「捕獲剤」とは、本明細書で定義した第２固相に結合することができる。ｒＰＴＫまたは受容体構築物に選択的な化合物または薬剤を意味する。したがって捕獲剤は第２アッセイプレートのウエルへ受容体または受容体構築物を捕獲する。通常、捕獲剤は問題の受容体に融合しているフラグポリペプチドに選択的に結合する。捕獲剤の結合は受容体に結合したリガンドの存在または不存在に影響されず、捕獲により受容体活性化を誘導しない。さらに捕獲剤は抗ホスホチロシン抗体によるリン酸化チロシンへの接近を立体的にブロックしない。適当な捕獲剤を選択する手段は本明細書に記載する。一般に捕獲剤は抗体（例えばアフィニティ精製されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）を含んでなるが、「 strep−tag」ポリペプチドに選択的に結合するストレプタビジン等の他の選択性試薬も用い得る(Ｓchmidt等、Ｐrotein Ｅngineering ６(１)：１０９〜１２２[１９９３])。ストレプタビシンは例えばＺymed Ｌaboratories Ｓ，Ｓan Ｆrancisco、カリフォルニアから商業的に購入し得る。或いは捕獲剤はプロテインＡ（免疫グロブリンに特異的に結合する）を含み得る。本発明のこの態様では細胞溶解物中に存在する活性化された受容体または受容体構築物をそれに特異的に結合する抗体とインキュベートし、それによって受容体−抗体複合体を形成する。この複合体を、複合体中に存在する抗体への特異的結合によってプロテインＡにより捕獲できる。プロテインＡは例えばＰharmacia Ｂiotech Ｉnc．Ｐis cataway、ニュージャージーより商業的に購入できる。適当な捕獲剤を選択する戦略は図３に示されており、後により詳細に記載するであろう。最も好ましい態様においては、捕獲剤はフラグポリペプチド（受容体構築物中に存在する）に特異的に結合するモノクローナル抗体である。適当なフラグポリペプチドおよびそれらのそれぞれの捕獲抗体の例には、flu ＨＡフラグおよびその抗体１２ＣＡ５(Ｆield等、Ｍol．Ｃell Ｂiol ８：２１５９〜２１６５[１９８８])；Ｃ−mycフラグおよびそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体(Ｅvan等、Ｍolecular and Ｃellular Biology ５(１２)：３６１０〜３６１６[１９８５])；および単純性疱疹ウィルスクリコプロテインＤ（gＤ）フラグおよびそれに対する５Ｂ６抗体（Ｐaborsky等、Ｐro tein Engineerings ３(６)：５４７〜５５３［１９９０］およびＭark等、Ｊo urnal of Biological Chemistry ２６９(１４)：１０７２０〜１０７２８[ １９９４]）を含む。他のフラグポリペプチドが開示されている。例としてはＦl ag−ペプチド(Ｈopp等、Ｂiotechnology ６：１２０４〜１２１０[１９８８]) 、ＫＴ３エピトープペプチド(Ｍartin等、Ｓcience ２５５：１９２〜１９４[ １９９２])；α−チュブリンエピトープペプチド(Ｓkinner等、Ｊ．Ｂiol．Ｃhe m．２６６：１５１６３−１５１６６[１９７１])；およびＴ７ジーン１０プロテインペプチドＴａｇ（Ｌutz−Ｆreyermuth等、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad.Sci．ＵＳＡ８７：６３９３〜６３９７[１９９０]）を含む。フラグポリペプチドが上記のように選択されると、それに対する捕獲抗体を本明細書に開示する技術を用いて作ることができる。「分析物」の語は、研究されるべき、通常は問題のチロシンキナーゼ受容体を活性化する（または活性化を妨げる）その能力を調査する化合物または組成物を言う。分析物は、体液(血漿または羊水等の)、またはチロシンキナーゼ受容体のリガンドを含むことが知られ、または含むのではないかと考えられている組成物を含み得る。分析物は問題のｒＰＴＫに対するリガンドを有する細胞をも含む。本明細書で用いる「リガンド」とは、問題のチロシンキナーゼのＥＣＤに、または問題のチロシンキナーゼに対する公知のアゴニストに結合できる分子を言う。リガンドは通常チロシンキナーゼに対するアゴニストまたはアンタゴニストであろう。「アゴニスト」とは、ＥＣＤに結合して、チロシンキナーゼの細胞内キナーゼドメインを活性化することのできる分子を意味する。しばしばアゴニストは増殖因子（すなわち、細胞分裂を刺激できるポリペプチド）を含むであろう。例示的な増殖因子は、ヘレグリン（ＨＲＧ）、インスリン、インスリン様増殖因子ＩおよびII(ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−II)、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インターロイキン（例えばＩＬ−８）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポイエチン(ＥＰＯ)、血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)、線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)、トランスホーミング増殖因子アルファおよびベータ(ＴＧＦ−α およびＴＧＦ−β)、肝細胞増殖因子、および神経成長因子（ＮＧＦ）を含む。或いはアゴニストはｒＰＴＫに対する抗体であり得る(例えばＹarden．Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci.，ＵＳＡ８７：２５６９〜２５７３［１９９０］を参照) 。しかしながら、小さい有機分子などの非プロテインアゴニストも本発明に包含される。「アンタゴニスト」とは、アゴニスト作用をブロックする分子を意味する。通常アンタゴニストは、(a)ｒＰＴＫに結合し、それによってアゴニストによるｒＰＴＫの結合および／または活性化をブロックするか(アンタゴニストはｒＰＴＫのＥＣＤに結合し得るが、これは必ずしも事実ではない)、または(b)アゴニストに結合し、アゴニストによるｒＰＴＫの活性化を阻害する。この検定法は両タイプのアンタゴニストの検出を容易にする。アンタゴニストは、受容体に対する外来のアゴニストリガンドの受容体結合ドメインを含むペプチドフラグメントを例えば含み得る。アンタゴニストは、ｒＰＴＫのＥＣＤに対する、またはｒＰＴＫに対する公知アゴニストに対する抗体でもあり得る。しかしながら他の非タンパク質分子もこの語に含まれ得る。「抗体」という語は最も広義に用い、具体的にはモノクローナル抗体、およびポリエピトープ的特異性を有する抗体組成物（すなわちポリクローナル抗体）を包含する。ポリクローナル抗体は好ましくは「アフィニティ精製された」抗体である。「アフィニティ精製された」なる語は、ポリクローナル抗体を選択的に精製するために抗体が抗原（例えばｒＰＴＫ若しくはそのフラグメントまたはフラグポリペプチド）を用いて精製されていることを意味する。アフィニティ精製は、抗原をアフィニティカラム（例えばアガロースカラム）上に固定化し、ポリクローナル抗体をカラムに通すことにより達成され得る。アフィニティ精製された抗体は、例えば、溶出条件を変えることにより、またはカオトロピック剤を添加することにより次に溶離し得る。抗体に関するアフィニティ精製技術の総説については、例えばＣurrent Ｐrotocols in Ｉmmunology Ｃoligen等編、Ｗile y publishers １および２巻を参照。本明細書で用いる「モノクローナル抗体」の語は、実質的にホモジニアスな抗体の集団から得られる抗体を言う。すなわち集団を構成する個々の抗体は、少量存在するかも知れない起こり得る天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であって、単一の抗原部位に対する。更に、異なった決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を典型的には含む従来の（ポリクローナルな）抗体製品とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対する。本明細書でモノクローナル抗体は、それらが所望の生物学的活性を示す限り、由来の種、免疫グロブリンの種類またはサブクラス呼称とは関係なく、定常ドメインを有する選択した抗体の可変（超可変を含む）ドメイン(例えば「人化」抗体)、重鎖を有する軽鎖、他の種からの鎖を有する一つの種の鎖、ヘテロガスなタンパク質との融合、並びに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ')₂およびＦｖ）をスプライシングすることにより製造されたハイブリッドおよび組換え抗体を含む。（例えば米国特許第４,８１６,５６７号およびＭageおよびＬamoyi、Ｍon oclonal Ａntibody Ｐroduction Ｔechniques and Ａpplications 、７９〜９７ページ、Ｍarcel Ｄecker，Ｉnc.、ニューヨーク参照。）従って改質剤「モノクローナル」は実質的にホモジニアスな抗体集団から得られる抗体の特性を示し、いずれかの特定の方法による抗体の製造を必要とすると解釈すべきでない。例えば本発明に従って用いるモノクローナル抗体は、Ｋohle rおよびＭilstein、Ｎature ２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法によって製造してもよく、または組換えＤＮＡ法（米国特許第４,８１６,５６７号）によって製造してもよい。「モノクローナル抗体」は、例えばＣlackson等、Ｎature、３５２：６２４〜６２８（１９９１）およびＭ arks等、Ｊ．Ｍol．Biol.、２２２５８１〜５９７（１９９１）に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーからも単離し得る。「抗ホスホチロシン抗体」の語は、ｒＰＴＫのキナーゼドメインにおけるリン酸化されたチロシン残基に選択的に結合する分子、通常は抗体を言う。その抗体はポリクローナルであり得るが、望ましくはモノクローナル抗体である。抗ホスホチロシンポリクローナル抗体は、ＷhiteおよびＢacker、Ｍethods in Ｅnzy mology ２０１：６５〜６７［１９９１］に開示された技術を用いて製造でき、モノクローナル抗ホスホチロシン抗体は、例えばＵpstate Ｂiologicals，Ｉnc （ＵＢＩ、Ｌake Ｐlacid、ニューヨーク）から商業的に入手し得る。本明細書で用いる「標識」の語は、ある分子（抗ホスホチロシン抗体等の）と直接的または間接的にコンジュゲートした検出可能な化合物または組成物を言う。標識はそれ自体で検出可能であり(例えば放射性ラベルまたは蛍光ラベル)、または、酵素ラベルの場合には、検出可能な基質化合物または組成物の化学的な変化を触媒し得る。好ましい標識は非放射性の発色試薬の色変化を触媒する酵素的な標識である。「洗浄」とは、非結合物質（例えば非付着細胞、非付着捕獲剤、非結合リガンド、受容体、受容体構築物、細胞溶解物または抗ホスホチロシン抗体）が除去されるような方法で固相を水相（通常緩衝液または細胞培養培地）にさらすことを意味する。バックグラウンドノイズを減少させるために、洗浄用溶液に界面活性剤（例えばトリトンＸ）を含ませるのが便利である。通常洗浄後、洗浄用水溶液をアッセイプレートのウエルからデカントする。便利には洗浄は自動洗浄装置を用いて行う。時には数度の洗浄工程（例えば約１〜１０の洗浄工程）が必要であるかもしれない。「ブロック緩衝液」とは、捕獲剤を被覆しない第２固相のさらされた表面に結合できる少なくとも１つのブロッキング剤を含む、水性の、pＨが緩衝された溶液を意味する。ブロッキング化合物は通常、牛血清アルブミン(ＢＳＡ)、ゼラチン、カゼインまたはミルク粉等タンパク質であり、検定法においていずれの試薬（例えば抗ホスホチロシンキナーゼ抗体および検出試薬）とも交差反応しない。ブロック緩衝液は約７〜７.５の間のpＨで一般に提供され、適当な緩衝剤はリン酸塩およびＴＲＩＳを含む。「溶解緩衝液」とは、溶解用界面活性剤、１以上のプロテアーゼ阻害剤および少なくとも１つのホスファターゼ阻害剤（ソジウムオルソバナデート等の）を含んでなる水性の、pＨ緩衝化溶液を意味する。「溶解用界面活性剤」とは、真核細胞の細胞膜を溶解するが、受容体または受容体構築物を変性し、または活性化しない、水混和性の、非イオン性界面活性剤を言う。適当な非イオン性界面活性剤の例は、トリトンＸ１００、トイーン２０、ＣＨＡＰＳおよびノニデトＰ−４０（ＮＰ４０）（Ｃalbiochem、Ｌa Ｊolla、カリホルニアから入手できる）を含む。多くの他の非イオン性界面活性剤が利用できる。適当なプロテアーゼ阻害剤の例は、フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプスタチン、アポチニン、４−(２−アミノエチル)−ベンゼンスルホニルフルオライドヒドロクロライド−ベスタチン、キモスタチンおよびベンズアミジンを含む。保存剤（例えばチミロサル）および溶液の等張性を維持する１以上の化合物（例えば塩化ナトリウム［ＮaＣl］またはシュクロース）および緩衝剤（例えばトリスまたはＰＢＳ）も通常存在する。一般に溶解緩衝液のpＨは約７〜７. ５の範囲にある。通常、第１アッセイプレートへの溶解緩衝剤の添加後に、第１アッセイプレートを「緩やかに撹拌」する。この表現は実質的に低速度で第１アッセイプレートを物理的に振とうする（通常円運動を用いて）行為を言う。緩やかな撹拌は細胞を機械的に破壊する（例えば細胞をホモジナイズし、また遠心分離することによって）ことを含まない。例示的な振とう速度は、例えばＢellco orbital shak erで２００〜５００rpm、好ましくは３００〜４００rpmのオーダーである。ＩＩ．本発明実施の態様１．キナーゼ受容体活性化−ＫＩＲＡ本検定法の第一段階は真核生物の細胞の細胞膜内に存在するキナーゼ受容体のキナーゼドメインの燐酸化を包含する。受容体は内在性受容体であってもよく、受容体をコードする核酸を細胞に形質転換したものでもあってもよい。本発明の一態様では、受容体構築物をコードする核酸を細胞に形質転換する。以下に細胞を受容体または受容体構築物核酸で形質転換する例示的技術を述べる。Ａ．細胞の形質転換本発明は生体内における受容体の活性をさらにより正確に反映すると考えられる範囲において可溶性キナーゼ受容体検定法に関する実質的な改良を提供する。今回、本検定法のＥＬＩＳＡ段階で検出できるチロシンキナーゼ活性を保持しつつ、受容体構築物が細胞膜内に適当に集合するような受容体構築物（キナーゼ受容体およびアミノ末端またはカルボキシル末端フラグペプチドを含む）で真核生物細胞を形質転換できることが発見された。これは目的とするいかなるチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性をも測定するための一般的検定法を提供する。もし、選択したｒＰＴＫに対するここに記載された捕捉剤が入手できるなら、フラグポリペプチドのない受容体単独をコードする核酸で細胞を形質転換することができる。それとは別に、もし、受容体を生産する細胞（たとえば、ＨＥＲ２受容体を生産するＭＣＦ−７細胞のような）が入手できるなら、この検定で使用する細胞を形質転換する必要はない。ｒＰＴＫをコードする核酸または受容体構築物で細胞を形質転換するために、ｒＰＴＫをコードする核酸および、要すれば、フラグポリペプチドを分離する。これはｃＤＮＡまたはｒＰＴＫまたは目的フラグポリペプチドをコードするＤＮＡを含むことが知られたゲノムライブラリーを、ｒＰＴＫまたは目的フラグポリペプチド用の選択した標識プローブ（たとえば、抗体またはオリゴヌクレオチド −プローブ）で、例えばＳａｍｂｒｏｏｋなど、「分子クローニング：実験室指針（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｎｕａｌ）」、（Ｎｅｗ・Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、１９８９年）の第１０〜１２章に記載されているような標準的操作法を使用してスクリーニングすることによって達成できる。それと別に、フラグポリペプチドをコードする核酸はオリゴ合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＣＡ）を使用して合成的に製造できる。ｒＰＴＫまたはフラグポリペプチドをコードする核酸を単離するその他の方法は前記Ｓａｍｂｒｏｏｋなどの第１４章に記載されているようなＰＣＲ法を使用するものである。この核酸はここに記載するＲｓｅ−フラグポリペプチド構築物のＴＭおよびＩＣＤをコードする核酸に融合できるので、目的ｒＰＴＫのＥＣＤのみの単離が必要である。図１Ａ〜１Ｃおよび配列番号１および２参照。しかしながら、もし必要ならば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、前出、７．７９に記載されている通常のプライマー伸長操作を使用して、ｃＤＮＡには逆転写されていなかったｍＲＮＡの前駆体およびプロセッシング中間体を検出できる。この発明の好適な実施法の一つは、好ましくは目的ｒＰＴＫを持つ哺乳類細胞系からの様々な組織からのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、注意深く選択したオリゴヌクレオチド配列を使用するものである。プローブとして選択したオリゴヌクレオチド配列は誤陽性を最小化するのに十分な長さと十分な明白さのものとすべきである。このオリゴヌクレオチドはスクリーニングするライブラリーのＤＮＡにハイブリッド化したら検出できるように標識されなければならない。標識の好適な方法はオリゴヌクレオチドを放射能標識するために、当業界で良く知られているように、³²Ｐ標識ＡＴＰをポリヌクレオチドキナーゼとともに使用するものである。しかしながら、オリゴヌクレオチドを標識するためには、これに限定するものではないが、ビオチン化または酵素標識を含む他の方法も使用しうる。受容体構築物をコードする核酸を提供するためにはｒＰＴＫをコードする核酸を３’−末端でフラグポリペプチドのＮ末端をコードする核酸に融合する。これとは別に、ｒＰＴＫをコードする核酸を５’−末端でフラグポリペプチドのカルボキシル末端をコードする核酸に融合する。こうして、受容体構築物のカルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかにフラグポリペプチドが提供される。適当なフラグポリペプチドの例は前記した。他の適当なフラグポリペプチドの選択はここに記載する技術を使用すれば可能である。Ｒｓｅ．フラグ試薬と目的ｒＰＴＫとの間の融合体を作製するためには、目的ｒＰＴＫのＥＣＤをコードする核酸をその３’−末端でＲｓｅ．フラグ試薬のアミノ末端をコードする核酸に融合する。次に、後続するクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために、ｒＰＴＫまたは受容体構築物をコードする核酸（たとえば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡなど）を複製可能なベクターに挿入する。熟練した実務家は多数のベクターを利用できるがそのベクターは本検定法で使用すべき細胞と適合していなければならない。このベクターはその存在が種々の因子に依存するベクター成分を持つものである。そのような成分は、例えば、シグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子１個またはそれ以上、エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終結配列などを含む。これらベクター成分の選択は後記することとする。ＥＣＤを細胞の外部環境に直面して配置させる細胞膜にｒＰＴＫまたは受容体構築物を輸送しなければならないので、シグナル配列の発現ベクターへの組込が必要である。それ故に、ｒＰＴＫまたは受容体構築物のそのような様式による配置のために適当なシグナル配列が使用される。シグナル配列は一般にベクターの成分であるか、またはベクターに挿入するｒＰＴＫのＤＮＡまたは受容体構築物ＤＮＡの一部分であってもよい。もし、異種性シグナル配列を使用するなら、宿主細胞によって認識され、処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものからである。酵母の分泌には、天然のシグナル配列を、たとえば酵母インベルターゼのリーダー、アルファ因子リーダー（サッカロミセスおよびクリュイベロミセスのα− 因子リーダーを含み、後者は１９９１年４月２３日発行米国特許５０１０１８２号に記載されている）、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンスのグルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日発刊の欧州特許３６２１７９号）、または１９９０年１１月１５日発刊のＷＯ９０／１３６４６号に記載のシグナルなどで置換しうる。たとえば他種動物ｒＰＴＫからのシグナル配列、同一または関連する種の分泌ポリペプチドからのシグナル配列、ならびに、例えばヘルペス・シンプレックスｇＤシグナルのようなウイルスの分泌リーダーのような他種哺乳類シグナル配列が適当であることもありうるけれども、哺乳類細胞では天然シグナル配列（たとえば、生体内で正常には哺乳類細胞を指向する前ｒＰＴＫ配列）をコードするＤＮＡの発現は十分である。前駆体領域のＤＮＡは読み枠内に結合させて、ｒＰＴＫまたは受容体構築物をコードするＤＮＡとする。発現ベクターおよびクローニングベクターの両者は、選択した宿主細胞１種またはそれ以上でベクターの複製が可能な核酸配列を含む。一般に、クローニングベクター内ではこの配列はベクターが宿主染色体ＤＮＡと独立に複製することが可能なものであって、複製起点または自律性複製配列を含む。２μプラスミド起点は酵母に適しており、種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は哺乳類細胞内でのクローニングベクター用に有用である。一般に、複製起点成分は哺乳類発現ベクターには不要である（早期プロモーターを含有するだけの理由で、ＳＶ４０起点が典型的に使用される）。発現ベクターは殆ど「シャトル」ベクター、すなわちそれらは少なくとも１種の生物内で複製できるが、他種の生物に形質転換しても発現できるものである。例えば、あるベクターは大腸菌にクローニングできるが、次に同じベクターを、宿主染色体と独立には複製することはできないが、酵母または哺乳類の細胞に形質転換して発現させる。ＤＮＡを宿主ゲノムに挿入して増幅することもありうる。これは、例えば宿主としてバチルス属の種を使用し、ベクターにバチルス属ゲノムＤＮＡにある配列に相補的なＤＮＡ配列を含めることで、容易に達成できる。このベクターでバチルス属を形質転換するとゲノムおよびｒＰＴＫまたは受容体構築物のＤＮＡの挿入による均質的組換えをもたらす。しかしながら、ｒＰＴＫまたは受容体構築物をコードするゲノムＤＮＡの回収はｒＰＴＫまたは受容体構築物ＤＮＡを切除するために制限酵素消化が必要なので、外因性に複製されたベクターのそれよりもさらに複雑である。発現ベクターおよびクローニングベクターは通常、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有する。この遺伝子は選択的培養培地内で形質転換された宿主細胞が生存または生育するために必要な蛋白質をコードする。選択遺伝子含有ベクターで形質転換されなかった宿主細胞はこの培養培地中では生存しない。典型的な選択遺伝子は、（ａ）たとえば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンなどの抗生物質または他種のトキシンに抵抗性を与える、（ｂ）栄養要求性欠落を補足する、または（ｃ）複合体培地から取込めない決定的栄養素を供給する、蛋白質をコードする。選択方式の一例では、宿主細胞の生長を止める薬品を使用する。異種遺伝子で形質転換に成功したこれらの細胞は薬品耐性を授与する蛋白質をコードするＤＮＡを発現し、選択管理に生き残る。このような選択の有力な例では医薬品、ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎなど、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１巻：３２７頁［１９８２年］）、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０９巻：１４２２頁［１９８０年］）またはヒグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎなど、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５巻：４１０〜４１３頁［１９８５年］）を使用する。前記３例はそれそれ適当な医薬Ｇ４１８またはネオマイシン（ゲネチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはヒグロマイシンに対して耐性を与えるために真核生物制御下の細菌遺伝子を採用するものである。哺乳類細胞のための適当な選択マーカーのその他の例は、たとえばＤＨＦＲまたはチミジンキナーゼのようなｒＰＴＫまたは受容体構築物の核酸を取込む能力のある細胞の認定を可能にする。哺乳類細胞の形質転換体を選択圧力下に置いてマーカー取り込みによる形質転換体のみが独特に適応する。選択圧力は培地中の選択剤濃度が順次変化して、選択遺伝子およびｒＰＴＫまたは受容体構築物をコードするＤＮＡの双方を増幅に導く条件下に形質転換体を培養することによって加える。増幅は生長に必須な蛋白質の生産に要求の大きい遺伝子が組換え細胞の継代的染色体内に共同的に反復するプロセスである。ｒＰＴＫまたは受容体構築物の増加量は増幅されたＤＮＡから合成される。増幅可能な遺伝子の他の例には、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなど、メタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩを含む。例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換した細胞は形質転換体全てをＤＨＦＲの競合的拮抗剤であるメトトレキセート（Ｍｔｘ）を含む培養培地中でまず培養して確認する。野生型のＤＨＦＲを採用する時に適当な宿主細胞はＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎがＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７巻：４２１６頁（１９８０年）に記載したようにして調製し、増殖したＤＨＦＲ活性欠失チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系である。形質転換した細胞を次に濃度を増加しつつメトトレキセートに接触する。これでＤＨＦＲ遺伝子の多重コピーおよび、同時に、たとえばｒＰＴＫまたは受容体構築物をコードするＤＮＡのような、発現ベクターを含む他種のＤＮＡの多重コピーの合成に導く。この増幅技術は、もし、例えばＭｔｘに高度に耐性の突然変異ＤＨＦＲ遺伝子が採用される（ＥＰ１１７０６０）なら、たとえば内因性ＤＨＦＲの存在に関わらず、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ６１・ＣＨＯ−Ｋ１のようなそうでなければ適当な宿主であるいかなる適当な宿主についても使用できる。これとは別に、ｒＰＴＫまたは受容体構築物、野生型ＤＨＦＲ蛋白質およびその他の選択可能なマーカー、たとえばアミノグリコシド−３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）のようなもの、をコードするＤＮＡ配列で形質転換または共−形質転換した宿主細胞（殊に内因性ＤＨＦＲ含有野生型宿主）は、たとえばカナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８などのアミノグリコシド抗生物質のような選択可能なマーカーに対する選択剤を含む培地中での細胞生長により選択できる。米国特許４９６５１９９号参照。酵母で使用するために適当な選択遺伝子の一つは酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂなど、Ｎａｔｕｒｅ、２８２巻：３９頁［１９７９年］；Ｋｉｎｇｓｍａｎなど、Ｇｅｎｅ、７巻、１４１頁［１９７９年］；またはＴｓｃｈｅｍｐｅｒなど、Ｇｅｎｅ、１０巻：１５７頁［１９８０年］）。ｔｒｐ１遺伝子はトリプトファン中での生育能力を欠落する突然変異株酵母、例えばＡＴＣＣ４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８６巻：１２頁［１９７７年］）に対する選択マーカーを提供する。そこで、酵母宿主細胞ゲノム内にｔｒｐ１損傷があると、トリプトファン不在下での生長により形質転換を検出するための効果的な環境が提供される。同様に、Ｌｅｕ２−欠失酵母株（ＡＴＣＣ２０６２２または３８６２６）はこのＬｅｕ２遺伝子を持つ既知プラスミドによって補完できる。これに加えて、１．６μｍ環状プラスミドｐＫＤ１から誘導したベクターをクリュイベロミセス酵母を形質転換するために使用できる。Ｂｉａｎｃｈｉなど、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、１２巻：１８５頁（１９８７年）。さらに最近、Ｋ．ラクチスについてウシ組み換えキモシンの大量生産用発現システムが報告された（Ｖａｎ・ｄｅｎ・Ｂｅｒｇ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８巻：１３５頁［１９９０年］）。クリュイベロミセス工業用株による成熟ヒト組み換え血漿アルブミン分泌のための安定な多重コピー発現ベクターも開示されている。Ｆｌｅｅｒなど、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻：９６８〜９７５頁（１９９１年）。発現およびクローニングベクターは通常宿主生物により認識されるプロモーターを含有し、ｒＰＴＫまたは受容体構築物核酸に作動可能に結合している。プロモーターは構造遺伝子（一般に約１００から１０００ｂｐ以内）の開始コドンの上流（５’）に位置する非翻訳配列であって、それが作動可能に結合する、たとえばｒＰＴＫ核酸配列のような特定核酸配列の転写と翻訳とを制御する。このようなプロモーターは典型的には誘導性と構成的との２種類に分類される。誘導性プロモーターは、たとえば栄養の存在または不在または温度変化など、培養条件の変化に応じて支配下にあるＤＮＡからの転写水準の増加を開始するプロモーターである。今日では可能性ある種々の宿主細胞多数が認識するプロモーターが良く知られている。これらプロモーターは制限酵素消化により起源ＤＮＡからプロモーターを取り出し、ベクターにプロモーター配列を挿入することによってｒＰＴＫまたは受容体構築物をコードするＤＮＡに作動可能に結合している。天然型ｒＰＴＫプロモーター配列および多数の異種プロモーター双方ともｒＰＴＫまたは受容体構築物ＤＮＡの直接的増幅および／または発現を指向して使用しうる。プロモーターは形質転換細胞の細胞膜内に受容体または受容体構築物の適当数の蓄積（すなわち、受容体の自己燐酸化がＥＬＩＳＡで検出されるが構成的燐酸化は起きないように）をもたらすものでもあろう。これを達成するために適当なプロモーターの選択はここに以下に記載するＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡで使用するために細胞を選択するための指針に従えば可能である。殆ど全部の真核生物遺伝子は転写開始部位からおよそ２５から３０塩基上流に存在するＡＴ豊富領域を持っている。遺伝子多数では転写開始部位から７０から８０塩基上流にある別の配列の一つはＣＸＣＡＡＴ領域であるが、ここにＸはいかなるヌクレオチドでもよい。殆どの真核生物遺伝子の３’末端にはＡＡＴＡＡＡ配列があり、これはコード配列の３’末端に末尾ポリＡを付加するためのシグナルであろう。これら配列は全て真核生物発現ベクターに適当に挿入される。酵母宿主での使用のために適当なプロモーター配列の実例には３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５巻：２０７３頁［１９８０年］）または、たとえば、エノラーゼ、グリセルアデルヒド−３−ホスフェート脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルベート脱カルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのような、他の解糖酵素（Ｈｅｓｓなど、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ・Ｒｅｇ．、７巻：１４９頁［１９６８年］；およびＨｏｌｌａｎｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１７巻：４９００頁［１９７８年］）を含む。他の酵母プロモーターは生育条件により制御される転写という別の利点を持つ誘導性プロモーターであって、アルコール脱水素酵素２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝関連分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素および麦芽糖およびガラクトースの利用を担当する酵素のプロモーター領域である。酵母での発現に使用するために適当なベクターおよびプロモーターをＨｉｔｚｅｍａｎなどが欧州特許７３６７５Ａにさらに記載している。酵母のエンハンサーも酵母プロモーターとともに利用するのが有利である。哺乳類宿主細胞でベクターからｒＰＴＫまたは受容体構築物を転写するには、例としては、たとえば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日刊行の英国特許２２１１５０４号）、アデノウイルス（アデノウイルス２のような）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、唾液腺ウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから、たとえばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターなど異種哺乳類プロモーターから、熱ショックプロモーターから、および正常にはｒＰＴＫまたは受容体構築物の配列に関連するプロモーターから、おのおの得られたプロモーターにより制御するが、但し、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合することを条件とするものである。ＳＶ４０ウイルスの早期および後期プロモーターはＳＶ４０ウイルス複製開始点も含むＳＶ４０制限断片として容易に得られる。Ｆｉｅｒｓなど、Ｎａｔｕｒｅ、２７３巻：１１３頁（１９７８年）；ＭｉｌｌｉｇａｎとＢｅｒｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０９巻：１４２２〜１４２７頁（１９８０年）；Ｐａｖｌａｋｉｓなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ、７８巻：７３９８〜７４０２頁（１９８１年）。ヒトサイトメガロウイルスの即時型プロモーターはＨｉｎｄＩＩＩ・Ｅ制限断片として容易に得られる。Ｇｒｅｅｎａｗａｙなど、Ｇｅｎｅ、１８巻：３５５〜３６０頁（１９８２年）。ウシパピローマウイルスをベクターとして使用する哺乳類宿主においてＤＮＡを発現する系は米国特許４４１９４４６号に記載されている。この系の修飾は米国特許４６０１９７８号に記載されている。サル細胞における免疫インターフェロンをコードするｃＤＮＡの発現に関するＧｒａｙなど、Ｎａｔｕｒｅ、２９５巻：５０３〜５０８頁（１９８２年）；ヘルペスシンプレックスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーター制御下にマウス細胞内でのヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関するＲｅｙｅｓなど、Ｎａｔｕｒｅ、２９７巻：５９８〜６０１頁（１９８２年）；マウスおよびウサギ培養細胞内でのヒトインターフェロンβ１遺伝子の発現に関するＣａｎａａｎｉとＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９巻：５１６６〜５１７０頁（１９８２年）；およびラウスザルコマウイルスの長末端反復をプロモーターとして使用するＣＶ−１サル腎臓細胞、ニワトリ胚フィブロブラスト、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、およびマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞内での細菌ＣＡＴ配列の発現に関するＧｏｒｍａｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９巻：６７７７〜６７８１頁（１９８２年）も参照。もし検定のＥＬＩＳＡ段階での検出を促進するために細胞当りｒＰＴＫまたは受容体構築物の数の増加が必要なら、高級真核生物によるｒＰＴＫまたは受容体構築物をコードするＤＮＡの転写を増加させてもよい。これはベクターにエンハンサー配列を挿入することによって達成する。エンハンサーはＤＮＡにあってプロモーターにその転写を増加するように働く通常約１０から３００ｂｐのシス作用エレメントである。エンハンサーは相対的に方向および位置に非依存的であって、転写ユニットの５’（Ｌａｉｍｉｎｅなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８巻：９９３頁［１９８１年］）および３’（Ｌｕｓｋｙなど、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏ．、３巻：１１０８頁［１９８３年］）にあって、イントロン内部（Ｂａｎｅｒｊｉなど、Ｃｅｌｌ、３３巻：７２９頁［１９８３年］）ならびにコード配列自体の内部（Ｏｓｂｏｒｎｅなど、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏ．、４巻：１２９３頁［１９８４年］）に発見されている。哺乳類遺伝子からエンハンサー配列多数が公知になっている（グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリン）。しかしながら、典型的には真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーを使用するのがよい。実例には複製開始点の後期側にあるＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複写開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。真核生物プロモーターの活性化用増強エレメントに関するＹａｎｉｖ、Ｎａｔｕｒｅ、２９７巻：１７〜１８頁（１９８２年）も参照。エンハンサーはベクターのｒＰＴＫまたは受容体構築物をコードする配列の５’位置または３’位置に挿入してもよいが、好ましくはプロモーターから５’の部位に置く。真核生物宿主細胞中に使用する発現ベクターは転写の終結に必要な配列およびｍＲＮＡを安定化させる配列も含むのがよい。このような配列は真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの通常は５’−、希に３’−非翻訳領域から得られる。これら領域はｒＰＴＫまたは受容体構築物をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチド断片を含む。前記成分１個またはそれ以上を含有する適当なベクターの構築には標準的結合技術を使用する。分離したプラスミドまたはＤＮＡ断片を切断し、仕立て、そして必要なプラスミドを発生させるために所望の形に再結合する。構築したプラスミド内の正確な配列を確認するための分析用に、結合混合物を使用して大腸菌Ｋ１２の２９４株（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換し、適当なアンピシリンまたはテトラサイクリン耐性により、成功した形質転換体を選択する。形質転換体からのプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、および／またはＭｅｓｓｉｎｇなど、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄ・Ｒｅｓ．、９巻：３０９頁（１９８１年）の方法またはＭａｘａｍなど、Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６５巻：４９９頁（１９８０年）の方法により配列決定する。組換え脊椎動物細胞培養物内でのｒＰＴＫまたは受容体構築物の合成に適応するために適当な他の方法、ベクターおよび宿主細胞はＧｅｔｈｉｎｇなど、Ｎａｔｕｒｅ、２９３巻：６２０〜６２５頁（１９８１年）；Ｍａｎｔｅｉなど、Ｎａｔｕｒｅ、２８１巻：４０〜４６頁（１９７９年）；Ｌｅｖｉｎｓｏｎなど、欧州特許１１７０６０号、および欧州特許１１７０５８号に記載されている。ｒＰＴＫまたは受容体構築物のＤＮＡの哺乳類細胞培養物での発現のために殊に有用なプラスミドはｐＲＫ５（欧州特許出願３０７２４７号）またはｐＳＶＩ６Ｂ（１９９１年６月１３日発行、ＰＣＴ・ＷＯ９１／０８２９１号）である。低級真核生物宿主細胞の中で形質転換のために適当な真核生物細胞系にはサッカロミセス・セレビシエおよびシゾサッカコミセス・ポンベ（ＢｅａｃｈとＮｕｒｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ、２９０巻：１４０頁［１９８１年］；１９８５年５月２日発行の欧州特許１３９３８３号）；クライベロミセス宿主（米国特許４９４３５２９号；Ｆｌｅｅｒなど、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻：９６８〜９７５頁［１９９１年］）およびＡ．ニデュランス（Ｂａｌｌａｎｃｅなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１１２巻：２８４〜２８９頁［１９８３年］；Ｔｉｌｂｕｒｎなど、Ｇｅｎｅ、２６巻：２０５〜２２１頁［１９８３年］；Ｙｅｌｔｏｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻：１４７０〜１４７４頁［１９８４年］）およびＡ．ニガー（ＫｅｌｌｙとＨｙｎｅｓ、ＥＭＢＯ・Ｊ．、４巻：４７５〜４７９頁［１９８５年］）のようなアスペルギルス宿主を含む。形質転換用の有用な動物宿主細胞系の実例にはＳＶ４０で形質転換したサル腎ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ・ＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児腎系（懸濁培養での生長用にサブクローニングした２９３または２９３系細胞、Ｇｒａｈａｍなど、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、３６巻：５９頁［１９７７年］）；幼若ハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７巻：４２１６頁［１９８０年］）；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３巻：２４３〜２５１頁［１９８０年］）；サル腎細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ・ＣＲＬ１５８７）；ヒト子宮癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ・３Ａ、ＡＴＣＣ・ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ・Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳腺癌（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒなど、Ａｎｎａｌｓ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３巻：４４〜６８頁［１９８２年］）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトヘパトマ系（Ｈｅｐ・Ｇ２）を含む。宿主細胞を前記した本発明の発現またはクローニングベクターで形質転換し、適当ならプロモーターを誘発するために修正した通常の栄養培地中で培養し、形質転換体を選択し、または所期の配列をコードする遺伝子を増幅する。形質転換とはＤＮＡが複製されるように染色体外エレメントとしてまたは染色体成分として生物体にＤＮＡを導入することを意味する。使用する宿主細胞に依存して、その細胞に適当な形質転換は標準的な技術を使用して行う。形質転換の成功は一般にこのベクターの作動指標が宿主細胞に出現した時に認定される。哺乳類細胞にはＧｒａｈａｍとＶａｎ・ｄｅｒ・Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻：４５６〜４５７頁（１９７８年）の燐酸カルシウム沈降法が好適である。哺乳類細胞宿主系の形質転換の概観はＡｘｅｌが１９８３年８月１６日発行の米国特許４３９９２１６号に記載している。酵母への形質転換は典型的にはＶａｎ・Ｓｏｌｉｎｇｅｎなど、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１３０巻：９４６頁（１９７７年）およびＨｓｉａｏなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６巻：３８２９頁（１９７９年）の方法に従って実施する。しかしながら、ＤＮＡを細胞に導入する、たとえば核微量注射法、電気穿孔法、無傷細胞との細菌原形質体融合法、たとえばポリブレン、ポリオルニチンなどのポリカチオン法など、のようなその他の方法を使用してもよい。ｒＰＴＫまたは受容体構築物調製のために使用する哺乳類細胞は種々の培地中で培養しうる。たとえばハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最少必須培地（［ＭＥＭ］Ｓｉｇｍａ社）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ社）、およびダルベッコの修正イーグル培地（［ＤＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ社）のような商業的に入手しうる培地はこの宿主細胞培養に適当である。これに加えてＨａｍとＷａｌｌａｃｅがＭｅｔｈ．Ｅｎｚ．、５８巻：４４頁（１９７９年）に、ＢａｒｎｅｓとＳａｔｏがＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０２巻：２５５頁（１９８０年）に記載したもの、および米国特許４７６７７０４号、４６５７８６６号、４９２７７６２号または４５６０６５５号、ＷＯ８７／００１９５号、ＷＯ９０／０３４３０号、米国再発行特許３０９８５号または米国特許５１２２４６９号に記載がある培地はいずれもこの宿主細胞用の培養培地として使用しうる。これらの文献はいずれも参考のために引用するものである。これら培地はいずれも必要に応じてホルモンおよび／またはその他の増殖因子（たとえばインシュリン、トランスフェリン、または表皮増殖因子のようなもの）、塩（たとえば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、および燐酸塩のようなもの）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳのようなもの）、ヌクレオシド（たとえばアデノシンおよびチミジンのようなもの）、抗生物質（たとえばゲンタマイシン（商品名）薬剤のようなもの）、微量元素（通常最終濃度がマイクロモルの範囲内にある無機化合物として定義されるもの）、およびブドウ糖または同等なエネルギー源を添加してもよい。当業者には公知なはずのその他の必要な添加剤はいずれも適当な濃度で含有させてもよい。温度、ｐＨ、などのような培養条件は発現のためにその宿主細胞について使用されており、当業者には明白となるであろう。哺乳類細胞培養物の生産性を最大化するための原理、実験計画、および実際的な技術は、「哺乳類細胞のバイオテクノロジー：実際的手法（Ｍａｍｍａｌｉａｎ・Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ・Ｐｒａｃｔｉｃａｌ・Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編、ＩＲＬ出版、１９９１年に一般的に記載されている。遺伝子の増幅および／または発現は、例えばｍＲＮＡの転写を定量化する通常のサザンブロッティング、ノーザンブロッティング（Ｔｈｏｍａｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７巻：５２０１〜５２０５頁［１９８０年］）、点染（ＤＮＡ分析）、または切片上ハイブリッド形成によって、適当な標識プローブを使用して、本明細書に記載する配列に基づいて、標本中で直接測定してもよい。最も通常には放射性同位元素、殊に³²Ｐであるが、種々の標識を採用してもよい。しかしながら、たとえばポリヌクレオチドへの導入のためにビオチン修飾したヌクレオチドを使用するような、他の技術も採用しうる。次にビオチンはアビジンまたは抗体の結合部位を与えるが、このアビジンまたは抗体はたとえば放射能核種、螢光団、酵素、またはその他同様なもののような、広範な標識を用いて標識しうる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、ＤＮＡ− ＲＮＡハイブリッド二本鎖、またはＤＮＡ−蛋白質二本鎖、を含む特定の二本鎖を認定できる抗体も採用しうる。また、抗体を二本鎖が表面に結合し、その表面で二本鎖が形成すると、その二本鎖に結合する抗体の存在を、検出できるような標識をして、検定を実施してもよい。これとは別に、遺伝子発現は、たとえば免疫組織化学染色により遺伝子生産物発現の直接的定量のような免疫学的方法によっても測定しうる。Ｂ．検定で使用する細胞の選択前記のように、検定に付すべき細胞は（ａ）内因的受容体を持つ細胞、（ｂ）ｒＰＴＫで形質転換した細胞、または（ｃ）受容体構築物で形質転換した細胞、であることができる。本検定法に使用する細胞の適合性を以下に検討する。外因性ｒＰＴＫを持つ細胞はＰＴＫの既知リガンド（たとえば、作動剤抗体）および対照（たとえば、作動剤抗体用希釈剤）を利用して試験的実施ＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡに付すことができる。ここに使用するようなリガンドの範囲（実施例１、２および３参照）を使用して、検査する細胞に十分な数の受容体が存在するかどうかを決定できる。受容体が構成的に燐酸化されてその細胞系が不適当であるかどうか見出すために、細胞系を陽性および陰性対照（たとえば、陽性対照としてここに記載する細胞培養培地中の既知作動剤リガンド、陰性対照として作動剤リガンドのない培養培地）に接触させるものである、ここに開示するＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡに付すことができる。もしも受容体の燐酸化が陽性対照および陰性対照の双方で検出されれば、これは受容体の構成的燐酸化が起きていることの表示でありうる。しかしながら、細胞培養培地中の血漿成分が受容体を活性化している可能性もある。そこで細胞を血漿不在培地で約２〜１２時間（細胞生存率に依存して）「スターブ」させ、次に陽性対照および陰性対照を使用して検定を反復する。もし対照双方について活性化が検出されれば、その細胞系は不適当であると考えられ、他の細胞系を検査できる。もし、その細胞系が受容体により形質転換されれば（フラグポリペプチドなしに）、図４に描くのに似た方策を使用してその細胞系が本検定法に使用するために適当であるかどうかを発見できる。第一段階として、ｒＰＴＫをコードする核酸の形質転換および発現の成功を決定できる（図４、段階ｂ参照）。細胞の表面にｒＰＴＫのＥＣＤが存在するかどうかを確認するために、受容体のＥＣＤに対する抗体を使用してフローサイトメトリー分析を行うことができる。この抗体はここに検討する抗体を作製するための技術を使用して調製できる。フローサイトメトリー分析は、例えばＣｏｌｉｇｅｎなど編、「免疫学における最新実験計画法（Ｃｕｒｒｅｎｔ・Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ・ｉｎ・Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、Ｗｉｌｅｙ出版、１巻および２巻に記載されている技術を使用して実施できる。概略的には、フローサイトメトリー分析は無傷の細胞（受容体を持つ）をそのＥＣＤに対する抗体とインキュベーションし、続いて洗浄する。抗体に結合した細胞を次にフルオロクロームに接合させた種特異性の抗−抗体・抗体とインキュベーションする。洗浄後、標識細胞を螢光活性化フローサイトメトリーによって分析して、ＥＣＤが細胞表面上に存在するかどうかを検出する。次の段階、すなわち図４、段階（ｃ）では、活性化すべき細胞結合受容体の性能を検査する。これを決定するためには、形質転換した細胞をその受容体に対する既知の作動剤（たとえば、内因性リカンドまたはその受容体の作動剤抗体）と接触する。接触後、細胞を適当な緩衝液中で溶解し（たとえば、燐酸塩緩衝食塩水中のドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム；ＰＢＳ中のＳＤＳ）、例えば、Ｗａｎｇ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・ａｎｄ・Ｃｅｌｌｕｌａｒ・Ｂｉｏｌｏｇｙ、５（１２）巻：３６４０〜３６４３頁（１９８５年）；Ｇｌｅｎｎｅｙなど、Ｊｏｕｒｎａｌ・ｏｆ・Ｉｎｎｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ・Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０９巻：２７７〜２８５頁（１９８８年）；Ｋａｍｐｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０１巻：１０１〜１１０頁（１９９１年）；Ｋｏｚｍａなど、Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０１巻：２８〜４３頁（１９９１年）；Ｈｏｌｍｅｓなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻：１２０５〜１０頁（１９９２年）；またはＣｏｒｆａｓなど、ＰＮＡＳ・ＵＳＡ、９０巻：１６２４〜１６２８頁（１９９３年）に記載のある、抗ホスホチロジン抗体によるウエスタンブロッティングに付す。ウエスタンブロッティング段階でｒＰＴＫを活性化できることが指摘されたとして、ＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡ試験的実施、図４の段階（ｄ）参照、を実行して、形質転換細胞系が本検定法に使用できるかどうかをさらに確認する。本発明の好適な態様においては、ＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡ法は受容体特異的試薬（すなわち、捕捉剤）の入手可能性にかかわらず、いかなる目的ｒＰＴＫも研究できるという範囲で「一般的」検定法である。この態様ではフラグポリペプチドをその受容体のアミノか、カルボキシル末端かのいずれかに持つ受容体構築物を採用する。もしフラグポリペプチドをＮＨ₂−末端に持つなら（たとえば、実施例３に記載する受容体構築物ｇＤ．ｔｒｋ・Ａ、Ｂ、およびＣ参照）、図４に要約した本検定において使用する形質転換細胞系を選択する操作を実施できる。この態様では、細胞を前記フラグポリペプチド−受容体構築物で形質転換する。段階（ａ）参照。段階（ｂ）では、受容体およびフラグポリペプチド（すなわち、受容体構築物）の形質転換成功を確認する。これを検討するために、フラグポリペプチドと受容体のＥＣＤとの双方に対する抗体を使用して二次元フローサイトメトリー分析を実行できる。二次元フローサイトメトリー分析の技術は免疫学における最新実験計画法、前出に開示されている。受容体構築物の形質転換成功が証明されたものとすれば、次に、図４の段階（ｃ）および（ｄ）を実施する。図４の段階（ｃ）から（ｄ）までの説明については、前記記載を参照。Ｃ−末端フラグポリペプチドを持つ受容体構築物で形質転換に成功し、また、この発明の検定法における使用にも適切な細胞を確認するための技術を図５に図示する。細胞形質転換［段階（ａ）］に続いて、受容体の形質転換成功は、例えば目的とする受容体ＥＣＤに対して指向する抗体を使用するフローサイトメトリー分析により決定する。フローサイトメトリー分析は実質的に前記の通りに実行できる。これは図５に略述した操作法の段階（ｂ）を構成する。段階（ｂ）に続き、全受容体構築物（ＣＯＯＨ−末端フラグポリペプチドを含む）の形質転換成功は段階（ｃ）で分析する。これは細胞を溶解し（本明細書に記載の細胞溶解技術を使用して）、膜抽出物を目的受容体に対する抗体で免疫沈降することによって達成できる。この免疫沈降した膜抽出物をフラグポリペプチドに対して特異的な抗体でウエスタンブロッティングに付す。あるいは、抗フラグポリペプチドが捕捉した膜溶解物のｒＰＴＫ特異的ＥＬＩＳＡ分析を実行できる。略述すれば、これはＥＬＩＳＡウェルを適当なフラグ特異的捕捉試薬で被覆することを含む。ウェルをブロックし、洗浄し、次に細胞溶解物をウェル内でインキュベーションする。非結合受容体構築物は洗浄により除去する。ウェルを次に受容体特異的抗体１種またはそれ以上と、直接的にまたは間接的に反応させてＨＲＰＯに結合する。ウェルを洗浄し、ＨＲＰＯを次に染色体基質（たとえば、ＴＭＢ）に接触させる。段階（ｄ）および（ｅ）、すなわち受容体活性化およびＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡ試験的実施、は実質的に前記したものと同様である。一旦、使用可能な細胞が確認されたら、それらを本発明が特許請求する検定法のＫＩＲＡ段階に付する。Ｃ．細胞による第一固相の被覆第一固相（たとえば、第一固相プレートのウェル）を内因性受容体を持つ細胞または前記節に従って形質転換した細胞で被覆する。好ましくは、細胞が自然に第一固相に接着するような接着細胞系を選択する。しかしながら、接着細胞系の使用は必須ではない。例えば、非接着性細胞（たとえば、赤血球）を、例えば、Ｂｅｃｔｏｎ・Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ・Ｌａｂｗａｒｅ社、Ｌｉｎｃｏｌｎ・Ｐａｒｋ、Ｎｅｗ・Ｊｅｒｓｅｙが販売しているような検定プレートの丸底のウェルに添加できる。次に、検定プレートをプレート運搬器に入れて遠心分離し、ウェルの底に接着する細胞ペレットを作製する。細胞培養物の上清液はピペットで除去する。そこで、検定における変動を削減（すなわち丸底ウェルのペレット中の細胞は前記別法を使用する時、上清液とともに排出される）するので、接着細胞の使用は明らかに非接着細胞の使用よりも有利である。第一検定プレートのウェルに添加すべき細胞は組織培養フラスコ内に維持し、細胞密度が全面生長の約７０〜９０％を達成した時に使用してもよい。そこで、一般に、例えば平底ウェル１個につき約１×１０⁴から３×１０⁵個の間（好ましくは、５×１０⁴から１×１０⁵）の細胞をピペットを用いて接種する。予期に反して、前記細胞濃度の添加は、事前に細胞の濃縮または清澄化または細胞溶解の必要なしに、ＥＬＩＳＡ段階でｒＰＴＫを測定するように活性化するのに十分であることが発見された。しばしば、所期の細胞濃度を達成するためマイクロタイタープレートのウェルに接種する前に細胞を培養培地で希釈する。通常、細胞がマイクロタイタープレートのウェルに最適な接着をするためには十分であるが、細胞が劣化し始めるほど長くない時間培養する。そこで、細胞に対して生理学的に最適な温度（通常約３７℃）で約８から１６時間インキュベーションするのが好適である。この細胞を培養するのに適当な培地は前記１Ａ章に記載してある。５％ＣＯ₂中での培養を推奨する。一夜インキュベーション後、ウェルの上清液をデカンテーションし、マイクロタイタープレートを、たとえば紙タオルなど、吸着剤基質で軽く固めて、過剰の上清液をさらに除去するが、スポンジも同様に作用する。そこで、実質的に均質な接着細胞層がマイクロタイタープレートの各ウェル内面に残留する。これら接着細胞を次に分析物（ａｎａｌｙｔｅ）と接触させる。Ｄ．分析物の調製および添加前記の通り、分析物は目的ｒＰＴＫに対する作動剤リガンド（または推測上の作動剤）または拮抗剤（または推測上の拮抗剤）を含みうる。これらリガンドは内因性ポリペプチドであっても、たとえば無機または有機分子のような、合成的分子であってもよい。通常、リガンドはポリペプチドである。この検定法は目的とするチロジンキナーゼ受容体を活性化（または活性化に拮抗）する分子をスクリーニングするために有用である。そこで、この検定法は治療的に有効な分子の開発用に使用できる。リガンドが作動剤である場合、その分子には天然の増殖因子、たとえば、ヘレグリン（ＨＲＧ）、インシュリン、インシュリン様増殖因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、インターロイキン（たとえば、ＩＬ−８）、マクロファージ・コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子アルファおよびベータ（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、ヘパトサイト増殖因子（ＨＧＦ）、フィブロブラスト増殖因子（ＦＧＦ）、および神経生長因子（ＮＧＦ）など、を含有できる。これら増殖因子多数は商業的に入手できる。そうでなければ、この増殖因子はここに記述するペプチド合成または組換え技術により調製できる。合成低分子作動剤は同様にして通常の化学的合成技術を使用して当業者が作製できる。リガンドが生物学的液体中に存在している場合には分析物は当業界で公知の技術を使用して調製できる。たとえば血液や羊水のような体液を直接使用してもよいが、しかしながら、濃縮が必要である。もし検査すべき分析物が特定の組織を含むならば、その細胞を細胞培養液中で生長させ、分泌されたリガンドについて上清液を検査することもできる。しばしば、標準曲線を作成するためにリガンドを水性希釈剤（たとえば細胞培養培地のような）で希釈する。リガンドは、しかしながら、細胞または細胞成分（たとえば、細胞膜など）中に存在していてもよい。殊に、検定を使用して選択した細胞系の細胞膜中でのリガンドの存在を検出できることが発見されている。これは既知のｒＰＴＫに対する新規内因性リガンドの発見のために明らかに有用である。例えば、ピペットを使用して接着細胞を含む各ウェルにリガンド組成物を添加する。検定には対照ウェル（たとえば、リガンド用水性希釈剤を添加したもの）少なくとも１個を含める。接着細胞は通常シグナルを最適化するために十分であるが、内因性ホスファターゼによるｒＰＴＫの脱燐酸化の結果としてそのシグナルが減弱するほど長過ぎない時間、刺激する。適当な刺激時間は約１０から６０分の間、好ましくはその細胞に生理学的に至適な温度（通常約３７℃）では約３０分である。活性化後、ウェルの上清液をデカンテーションし、プレートを次に吸着剤基質で軽く固めることにより、過剰の上清液をさらに除去する。この検定を使用して目的ｒＰＴＫに対する拮抗剤リガンドを検出できる。拮抗剤は一般的に（ａ）ｒＰＴＫと結合して、作動剤によるそのｒＰＴＫへの結合および／または活性化を阻害するもの（拮抗剤はＥＣＤに結合してもよいが、しかし必ずしもそうである必要はない）および（ｂ）作動剤に結合して作動剤によるｒＰＴＫの活性化を阻止するものの２個のカテゴリーに分類される。前記カテゴリー（ａ）の拮抗剤分子を検出するためには、実質的に前記したように推定上のリガンドと細胞を接触させる。拮抗剤との接触に続いて、ウェル上清液をデカンテーションし、ペレットを軽く固める。次に、既知の作動剤（たとえば、内因性増殖因子など）を実質的に前記文節に記述したようにして洗浄した細胞に添加し、続いてウェル上清液をデカンテーションし、プレートを軽く固める。これとは別に、拮抗剤および作動剤の双方を含有する組成物を前記記載のように接着細胞に添加できる。ｒＰＴＫの結合および／または活性化を阻害する推測上の拮抗剤の性能は、これに続いて後述するようにＥＬＩＳＡによって測定できる。前記カテゴリー（ｂ）の拮抗剤分子を検出するには、本検定法のＫＩＲＡ段階の前に、既知の作動剤を推測上の拮抗剤と前インキュベーションする。このインキュベーションは拮抗剤−作動剤複合体の形成を可能にするに十分な時間、例えば３０分間から１２時間まで、実施する。次にこの複合体を、対照として使用する非複合の作動剤および拮抗剤とともに、検定に付す。作動剤（要すれば拮抗剤とともに）リガンドとの接触に続いて、前記のようにして細胞を溶解する。Ｅ．細胞の溶解検定のこの段階では本検定法のＥＬＩＳＡ段階に移るためにｒＰＴＫが活性化されたままで残る（すなわち、チロジン残基が燐酸化されたまま残る）ように、ｒＰＴＫを溶解するように細胞溶解する。そこで、ｒＰＴＫまたは受容体構築物は溶解するが、しかしｒＰＴＫを脱燐酸化または変性させない前記細胞溶解緩衝液を使用して細胞を溶解する。前記のようにマイクロタイタープレートを使用する場合は、各ウェルに細胞溶解緩衝液約７５から２００μＬを添加する。プレートを次にプレート振盪機（たとえば、Ｂｅｌｌｃｏ・Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、ＮＪが販売しているもののようなもの）を使用して約１から２時間、穏やかに振盪し得る。振盪は室温で行い得る。２．酵素免疫吸着測定法−ＥＬＩＳＡ本検定法の第二段階は第二検定プレート中で行われるサンドイッチＥＬＩＳＡを含む。ＥＬＩＳＡ実施のために、捕捉剤を調製する。Ａ．捕捉剤の調製前記のように、捕捉剤はしばしばポリクローナル抗体（通常親和性により精製したポリクローナル抗体）またはモノクローナル抗体を含む。他の捕捉剤は前記定義の条項に考察し、検討した。捕捉剤はキナーゼ受容体に、またはフラグポリペプチド（すなわち、抗原）に、特異的に結合する。抗原に対するポリクローナル抗体（受容体かまたはフラグポリペプチドか）は一般に抗原またはその抗原断片（しばしば、ｒＰＴＫのＥＣＤ）およびアジュバントの多回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により動物体内に作製する。抗原または標的アミノ酸配列を含む断片を二官能性または誘導化剤を使用して免疫すべき種に免疫原性を持つ蛋白質（たとえば、キーホールリンペット血青素）に複合させることは有用である。宿主動物またはそれから得られた抗体生産性培養細胞への免疫原の投与のための経路および計画は一般に抗体の刺激用および生産用に確立された通常技術と同じである。マウスは検査モデルとして頻繁に採用される一方、ヒトを含む哺乳類またはそれから得られた抗体生産細胞はいずれも本発明の工程に従って操作すればヒトを含む哺乳類のハイブリッド細胞系生産のための基礎として役立つことができる。典型的には複合体１ｍｇまたは１μｇ（各々ウサギまたはマウスに対して）とフロイントの完全アジュバント３容とを混合し、その溶液を多重部位皮内注射によって動物を免疫原複合体または誘導物に対して免疫する。１ケ月後、動物に元の量の１／５から１／１０の複合体をフロイント完全アジュバント（または他の適切なアジュバント）中にとかして多部位への皮下注射によってブーストする。７から１４日後、動物を瀉血し、血漿の抗−抗原力価を検定する。力価が定常値になるまで動物をブーストする。好ましくは、同一抗原の複合体であるが、異なる蛋白質および／または異なる交差結合剤に複合した複合体で動物をブーストする。複合体は蛋白質融合体として組換え細胞培養物中に製造することができる。また、たとえば明礬のような凝集剤も免疫反応を強化するために使用される。免疫後、免疫した動物から免疫細胞（典型的には脾臓細胞またはリンパ節組織からのリンパ球）を取出し、たとえば骨髄腫細胞との融合またはエプスタイン− バール（ＥＢ）ウイルス形質転換および所期の抗体を生産するクローンのスクリーニングなど、この細胞を通常の様式で不死化することによってモノクローナル抗体を調製できる。ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎがＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６巻：５１１頁（１９７６年）に記載し、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇなどが「モノクローナル抗体およびＴ細胞−ハイブリドマ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ・Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ・ａｎｄ・Ｔ−Ｃｅｌｌ・Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、５６３〜６８１頁（１９８１年）中でさらに記載した細胞融合技術は特異的抗原多数に対するモノクローナル抗体を高濃度で分泌する融合細胞系を生産するために広範に適用されている。ある種属の細胞を他種属のものと融合することは可能である。しかしながら、免疫抗体生産細胞および骨髄腫の源泉は同種属からであるのが好ましい。融合細胞系は細胞培養培地内で培養を維持できる。本発明の細胞系はヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地内にある連続細胞系からなる組成物の中で選択をし、および／または維持をすることができる。事実、ハイブリドマ細胞系が一度樹立されると、種々の栄養的に適切な培地上で維持できる。その上、融合細胞系は液体窒素上の凍結および貯蔵を含む常法多数によって貯蔵し、保存できる。凍結した細胞系は無限に蘇生し、モノクローナル抗体の合成および分泌を再開する培養ができる。分泌された抗体は、たとえば沈降、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーのような、常法によって組織培養上清液から回収される。ここに記載する抗体は、場合によってはＩｇＧまたはＩｇＭ精製用にこれら免疫グロブリンを貯蔵血清から精製するために使用される、たとえばエタノールまたはポリエチレングリコール沈降操作法など、常法により融合細胞培養物からも回収される。精製した抗体は無菌濾過する。抗体がポリクローナル抗体である場合は、一般に抗体を実質的に特異的に捕捉するように目的抗原から作成した親和性カラムを使用して親和精製する。通常、液体クロマトグラフィーのような他の精製法を親和性クロマトグラフィーの前に行う。他の態様では、抗体または抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙなど、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻：５５２〜５５４頁（１９９０年）に記載されている、適当な抗体または抗体断片を選択するためにフラグポリペプチド、ｒＰＴＫ、またはこれらの断片を使用する技術で作成した抗体ファージライブラリーから分離できる。Ｃｌａｃｋｓｏｎなど、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）およびＭａｒｋｓなど、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）はファージライブラリーを使用する各々マウスおよびヒトの抗体の分離を記載している。これに続く文献はチェイン・シャッフリングによる高親和性（ｎＭの範囲で）ヒト抗体の生産（Ｍａｒｋなど、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１０巻：７７９〜７８３頁［１９９２年］）、ならびに非常に大きいファージライブラリーを構築するための方策の一つとして組合せ感染および生体内組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅなど、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、２１巻：２２６５〜２２６６頁［１９９３年］）を記載している。そこで、これら技術は「モノクローナル」抗体単離のための慣習的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に代わる本発明に包含される有力な選択肢である。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは常法操作（たとえば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用する）を使用して容易に分離され、配列決定される。本発明のハイブリドマ細胞はこのようなＤＮＡの好適な源泉として役立つ。一旦分離したＤＮＡは発現ベクターに入れ、これを次に通常は免疫グロブリン蛋白質を生産しない、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質転換することによって、組換え宿主細胞内でのモノクローナル抗体の合成がなされる。例えば相同的なマウス配列の代わりにヒトの重鎖および軽鎖の定常ドメインのコード配列を置換することによって（Ｍｏｒｒｉｓｏｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１巻：６８５１頁［１９８４年］）、または免疫グロブリンをコードする配列に共有結合的に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列全部または一部を組込むことによって、ＤＮＡを修飾しうる。この様式で、本発明の抗ｒＰＴＫまたは抗フラグポリペプチドモノクローナル抗体に結合特異性を持つ「キメラ」または「融合」抗体を調製する。こうして、組み換えＤＮＡ法によって抗体を製造できる（Ｃａｂｉｌｌｙなど、米国特許４８１６５６７号）。捕捉剤の結合は受容体に結合するリガンドの存在または不在によっては影響を受けず、また、捕捉剤は抗ホスホチロジン抗体による燐酸化チロジンへの接近を立体的に阻害することはない。さらにその上、この捕捉剤は、勿論、目的受容体を活性化しない。これらの性質を持つ抗体をスクリーニングするために、図３に略記した操作法を実施できる。まず、捕捉剤（たとえば、抗体またはストレプトアビジン）を選択したなら、受容体かフラグポリペプチドか（本検定で受容体構築を使用する場合）どちらかへの結合を確認する。これは例えばフローサイトメトリー分析、免疫沈降または抗原被覆ＥＬＩＳＡにより測定できる。フローサイトメトリー分析については前記した。免疫沈降は通常適切な緩衝液（たとえばＰＢＳ）中での非イオン性界面活性剤（たとえば、０．５％トリトンＸ−１００）によって細胞（受容体または受容体構築物を持つ）を溶解し、得られた細胞溶解物を抗受容体または抗フラグポリペプチド捕捉剤の候補とインキュベーションすることを含む。これらの免疫複合体は（ａ）免疫複合体の沈降を促進するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下に抗捕捉剤抗体か、または（ｂ）固定化（たとえば、アガロース結合）Ａ蛋白質またはＧ蛋白質か、のいずれかと沈降させる。この免疫沈降物質を次にポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析する。抗原被覆ＥＬＩＳＡでは、ＥＬＩＳＡのウェルを精製受容体か、精製フラグポリペプチドか、または精製受容体構築物かのいずれかで一夜被覆する。被覆したウェルを次に捕捉剤候補と接触させ、ＨＲＰＯと複合した種特異性抗捕捉剤抗体でスクリーニングする。受容体に対するリガンドの存在下に受容体またはフラグポリベプチドに結合する捕捉剤の性能も確認する。これは受容体または受容体構築物を受容体に対する既知のリガンド（たとえば、内因性増殖因子またはそれに対する抗体作動剤）とともにインキュベーションすることによって分析できる。次にフローサイトメトリー分析、免疫沈降、または抗原被覆ＥＬＩＳＡを実質的に前記したように実行して捕捉剤の結合を検討できる。前記の二段階によって捕捉剤が適切であると決定されると、次にその捕捉剤が細胞溶解前および後のいずれにおいても受容体活性化（すなわち、自己燐酸化）を起こさないことを証明する。そこで、細胞に結合した受容体または受容体構築物を捕捉剤候補または負の対照（たとえば、受容体を活性化しない対照抗体）と接触させる。細胞溶解に続いて受容体または受容体構築物を標識抗ホスホチロジン抗体を使用するウエスタンブロット分析に付すことができる。たとえば、Ｇｌｅｎｎｅｙなど、Ｊｏｕｒｎａｌ・ｏｆ・Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ・Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０９巻：２７７〜２８５頁（１９８８年）；Ｋａｍｐｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０１巻：１０１〜１１０頁（１９９１年）；Ｋｏｚｍａなど、Ｍｅｔｈｏｄｓ・Ｉｎ・Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０１巻：２８〜４３頁（１９９１年）；Ｈｏｌｍｅｓなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻：１２０５〜１０頁（１９９２年）参照。細胞溶解後に捕捉剤が受容体活性化を誘発するかどうか確認するためには、ＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡの試験的実施（前記のように捕捉剤および負の対照の双方について）を行うことができる。最後に、抗ホスホチロジン抗体（たとえば、ビオチン化抗−ホスホチロジン抗体）が捕捉剤候補の存在下に活性化受容体に結合する性能をここに開示するＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡの試験的実施によって確認する。ある捕捉剤が前記選択基準全てに合格したとすれば、それはＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡでの使用に良好な可能性を持っている。適切な捕捉剤が調製されたら、第二固相をそれで被覆する。例えば、約０．１から１０μｇ／ｍＬまでの間の捕捉剤をピペットを使用して第二検定プレートの各ウェルに添加できる。全電荷を増加させ、それ故、第二検定プレートに強く結合させるため、捕捉剤はしばしば高ｐＨ（たとえば、約７．５から９．６までの間）の緩衝液中で使用される。通常、捕捉剤をウェル中で約８から７２時間までの間インキュベーションしてウェル内壁への捕捉剤被覆の十分な生成を可能にする。一般にこのインキュベーションは低温（たとえば、約３から８℃の間）で実施して捕捉剤の分解を削減する。インキュベーション後、プレートのウェルをデカンテーションし、吸着剤基質で軽く固める。次に非特異的結合を阻止する。これを達成するために、ブロック緩衝液をウェルに添加する。例えば、Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社、Ｐｕｒｃｈａｓｅ、Ｎ．Ｙ．が販売しているような、ウシ血漿アルブミン（ＢＳＡ）を含むブロック緩衝液が適当である。各ウェルへのブロック緩衝液約１００から２００μＬの間の添加と、それに続く室温で約１から２時間の間の穏やかな撹拌は非特異的結合の阻止に十分であることが見出された。第二検定プレートへの添加ではなく、前段で得た細胞溶解物に直接ブロック緩衝液を添加することも可能である。これに続いて、捕捉剤被覆プレートを洗浄緩衝液で数回（通常、約３〜８回の間）洗浄する。洗浄緩衝液は、例えばｐＨ７．０から７．５の燐酸緩衝液食塩水（ＰＢＳ）を含有できる。しかしながら、他の洗浄緩衝液も入手可能で、これらも使用できる。好都合には、本検定法のこの洗浄段階および他の洗浄段階には、ＳｃａｎＷａｓｈｅｒ３００型（Ｓｋａｔｒｏｎ・Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）その他のような自動プレート洗浄器を使用できる。Ｂ．チロジンホスホリル化の測定活性化された可溶化ｒＰＴＫ（または受容体構築物）を次に捕捉剤が接着した各ウェルに添加する。一般的計画として、前記１Ｅ節に述べたようにして得た細胞溶解物の約８０％（すなわち、ウェルの元の容積に依存して約６０から１６０ μＬ）を各ウェルに添加できる。各ウェルにｒＰＴＫを捕捉できるために適切な時間、たとえば１時間から３時間まで、の間、細胞溶解物を捕捉剤とインキュベーションする。インキュベーションは室温で実施できる。非結合細胞溶解物を次に洗浄緩衝液での洗浄により除去する。この洗浄段階に続き、前に添加したブロック緩衝液量と等量またはそれ以下の抗ホスホチロジン抗体一定量を各ウェルに添加する。例えば、適当な緩衝液（たとえば細胞溶解緩衝液中に含まれるもののような界面活性剤を含むＰＢＳ）中に抗体約０．３μｇ／ｍＬから０．５μｇ／ｍＬまでの間を含む抗ホスホチロジン抗体製品約５０から２００μＬをウェルに添加する。これに非結合抗ホスホチロジン抗体を除去する洗浄段階を続ける。チロジン燐酸化を次に第二固相に結合する抗ホスホチロジン抗体結合量により定量する。当業者は抗体の存在を検出する方法多数を入手できる。そのいくつかを以下に例示する。一般には抗ホスホチロジン抗体を検出可能な標識で直接的か間接的かいずれかで標識する。一般的に次の類型に分類される多数の標識が入手可能である。（ａ）放射性同位元素、たとえば³⁵Ｓ、¹⁴Ｃ、¹²⁵Ｉ、³Ｈおよび¹³¹Ｉのようなもの。抗体は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ・Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ・ｉｎ・Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、前出、に記載されている技術を使用して放射性同位元素で標識することができ、放射能はシンチレーション計測を使用して測定できる。（ｂ）螢光標識、たとえば希土類元素キレート（ユーロピウムのキレート）またはフルオレッセインおよびその誘導体、ロダミンおよびその誘導体、ダンシル、リッサミン、フィコエリスリンおよびデキサスレッドのようなものを使用できる。これら螢光標識は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ・Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ・ｉｎ・Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、前出、に開示されている技術を用いて抗体に結合できる。螢光は螢光光度計（Ｄｙｎａｔｅｃｈ社）を用いて定量できる。（ｃ）種々な酵素−基質標識を使用でき、米国特許４２７５１４９号はそれらのいくつかを綜説している。これら酵素は一般に種々の技術を使用して測定することのできる発色団基質の化学変化を触媒する。例えば、酵素が基質の変色を触媒するなら、分光学的に測定できる。その他に、酵素が基質の螢光または化学発光を変化するものもある。螢光の変化を定量する技術は前記した。化学発光基質は化学反応によって電子的に励起され、測定できる光を放射する（例えば、Ｄｙｎａｔｅｃｈ社・ＭＬ３０００化学発光光度計を使用）か、またはエネルギーを螢光受容体に与える。酵素標識の例にはルシフェラーゼ（たとえば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許４７３７４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、マレエート脱水素酵素、ウレアーゼ、たとえばセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）のようなペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、配糖体オキシダーゼ（たとえばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−ホスフェート脱水素酵素など）、ヘテロ環オキシダーゼ（たとえばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、その他の同類を含む。酵素を抗体に結合する技術はＭｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｚｙｍ．(Ｊ．ＬａｎｇｏｎｅとＨ．Ｖａｎ．Ｖｕｎａｋｉｓ編)、７３集：１４７〜１６６頁(１９８１年 )、Ａｃａｄｅｍｉｃ・Ｐｒｅｓｓ社、Ｎｅｗ・Ｙｏｒｋ中、Ｏ’ Ｓｕｌｌｉｖａｎなど、「酵素免疫検定で使用する酵素−抗体結合物の製造法（Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｆｏｒ・ｔｈｅ・Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ・ｏｆ．Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ・Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ・ｆｏｒ・ｕｓｅ・ｉｎ・Ｅｎｚｙｍｅ・Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」およびＣｕｒｒｅｎｔ・Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ・ｉｎ・Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、前出、に記載されている。酵素−基質組合せの例には次を含む。例えば：（ｉ）セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）および基質としての過酸化水素。ここでは過酸化水素が色素前駆体（たとえば、オルトフェニレンジアミン［ＯＰＤ］または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン・塩酸塩［ＴＭＢ］など）を酸化する。（ｉｉ）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）とクロモーゲン基質としてのパラ− ニトロフェニル燐酸塩。（ｉｉｉ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）とクロモーゲン基質（たとえば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）またはフルオロゲン基質である４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ。他に多数の酵素−基質組合せが当業者には入手できる。これらの一般的綜説としては米国特許４２７５１４９号および４３１８９８０号を参照。標識を間接的に抗体に結合することもある。当業者はこれを達成するための種々の技術を知っている。例えば、抗体をビオチンと結合し、前記広範囲類型３種の中のいずれかの標識をアビジンと結合するか、その逆とする。ビオチンはアビジンに選択的に結合するので、そこで、標識をこの間接的な様式で抗体に結合できる。ビオチン−アビジン結合技術の綜説についてはＣｕｒｒｅｎｔ・Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ・ｉｎ・Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、前出、を参照。この他に、標識を間接的に抗体に結合するために、抗体を小さなハプテン（たとえば、ジゴキシン）と結合し、前記標識中で異なる型のものの一つを抗ハプテン抗体（たとえば、抗 −ジゴキシン抗体）と結合する。こうして、抗体と標識との間接的な結合を達成できる。本発明の別の態様では抗ホスホチロジン抗体を標識する必要がなく、その存在は標識抗−抗ホスホチロジン抗体（たとえば、ＨＲＰＯに結合した抗−マウス抗ホスホチロジン抗体）を使用して検出できる。好適な態様では、抗−ホスホロチロジン抗体を基質（たとえば、テトラメチルベンズイミジン［ＴＭＢ］、またはオルトフェニレンジアミン［ＯＰＤ］）の変色を触媒する酵素標識により標識する。こうして、放射能物質の使用を避ける。試薬の変色は適切な波長（たとえば、ＴＭＢには４５０ｎｍ、ＯＰＤには４９０ｎｍ、対照波長は６５０ｎｍ）で分光光学的に測定できる。３．細胞内キナーゼ活性ここに記載する検定法は細胞内キナーゼ（たとえば、原形質チロジンキナーゼおよび／または原形質セリン−スレオニンキナーゼ）の燐酸化および／または活性化の測定用にも有用である。これら分子の燐酸化はキナーゼ受容体または「キナーゼ複合体」（細胞膜に存在するキナーゼ受容体１個またはそれ以上を含む）による細胞内キナーゼのトランス燐酸化の結果として起きることができる。細胞内チロジンキナーゼの例は、例えばインシュリン受容体基質Ｉ（ＩＲＳ−Ｉ）、Ｓｈｃ、Ｒａｓ、およびＧＲＢ２を含む。これらチロジンキナーゼの捕捉剤として使用できるヒトＳｈｃ、ヒトＲａｓおよびＧＲＢ２に対する抗体はＵＢＩ社、ＮＹから購入できる。細胞内セリン−トレオニンキナーゼの例にはＭＥＫおよびＭＡＰＫを含む。これらキナーゼの燐酸化を測定するための操作は細胞内キナーゼとフラグポリペプチドとのキメラ（すなわち「キナーゼ構築物」）が形成されることを除いて本質的に前記と同様である。あるいは、この細胞は内因性細胞内キナーゼを持っているか、目的とする細胞内キナーゼをコードする核酸で形質転換される。一般に、真核生物細胞はキナーゼ構築物をコードする核酸で形質転換するのがよい。核酸が発現されると、キナーゼまたはキナーゼ構築物が細胞内（すなわち、原形質内）に存在することになる。キナーゼまたはキナーゼ構築物を含む細胞を前記ＫＩＲＡに付す。作動剤との接触が細胞内キナーゼのトランス燐酸化を起こせば、これを前記ＥＬＩＳＡで定量できる。ＥＬＩＳＡ内の捕捉剤は細胞内キナーゼかフラグポリペプチドかのどちらかと結合する。４．セリン−スレオニンキナーゼ活性この検定はさらに燐酸化および／またはセリン−スレオニンキナーゼの活性化を測定するために有用である。用語「セリン−スレオニンキナーゼ」はホスフェートを受容できるアルコール基少なくとも１個を持つ基質を燐酸化するキナーゼを示す。リガンド結合ＥＣＤ、ＴＭドメインおよびＩＣＤを持つという範囲においては、セリン−スレオニンキナーゼは通常は「受容体」である。ＩＣＤは通常触媒キナーゼドメインを持ち、一般にホスフェートを受容するセリンおよび／またはスレオニン残基１個またはそれ以上を含む。細胞内セリン−スレオニンキナーゼの例にはＭＥＫおよびＭＡＰＫを含む。細胞内セリン−スレオニンキナーゼの燐酸化の測定に関する検討は前記３章を参照のこと。セリン−スレオニンキナーゼ受容体の例はｄａｆ−１、アクチビンＩＩ型受容体（ＡｃｔＲ−ＩＩ）、アクチビンＩＩＢ型受容体（ＡｃｔＲ−ＩＩＢ）、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体（Ｔβ Ｒ−ＩＩ）、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）−１、−２、−３、−４およびＴＧＦ−βＩ型受容体（ＴβＲ−１）／ＡＬＫ−５を含む。ｔｅｎ・Ｄｉｊｋｅなど、前出、参照。セリン−スレオニンキナーゼ検定は燐酸化を抗ホスホセリンおよび／または抗ホスホスレオニン抗体を使用して定量すること以外はチロジンキナーゼについて記載したものと本質的に同一である。抗ホスホセリンおよび抗ホスホスレオニンモノクローナル抗体は、例えばＳｉｇｍａ・Ｉｍｍｕｎｏ・Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、から購入できる。５．ホスファターゼ活性ホスファターゼ活性も同様にここに記載する検定法を使用して測定できる。ホスファターゼ酵素はホスホリル化チロジン、セリンおよび／またはスレオニン残基を脱ホスホリル化（すなわち、これらアミノ酸残基の燐酸エステルから無機燐酸を遊離する）することができる。一般に、ホスファターゼ酵素はチロジン残基かセリン−スレオニン残基かいずれかに特異的であるが、時にはチロジン、セリンおよびスレオニン残基を脱燐酸化できる。時には「内因性」ホスファターゼ活性を測定するが、これは選択した細胞内に天然に存在するホスファターゼ酵素の活性を示す。内因性ホスファターゼ活性を定量するため、ホスファターゼ少なくとも１種を持つ細胞をホスファターゼ阻害剤１種またはそれ以上の存在または不在下に刺激する。蛋白質チロジンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）阻害剤の例にはオルトバナジン酸ナトリウムおよびモリブデン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ・Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む。セリン−スレオニンホスファターゼ阻害剤であるオカダ酸はＩＣＮ・Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社が供給している。一般的な計画では、検定プレートの各ウェルに約１から１０μＭの間のホスファターゼ阻害剤を添加できる。他の点全ては実質的に前記のようにして検定する。そこで、選択した細胞内のキナーゼを脱燐酸化する内因性ホスファターゼの性能を定量することができる。好適な態様では、目的とするホスファターゼ酵素を検討できる。蛋白質チロジンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）の例にはＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰＭＥＧ、ＰＴＰ１ｃ、Ｙｏｐ５１、ＶＨ１、ｃｄｃ２５、ＣＤ４５、ＨＬＡＲ、ＰＴＰ１８、ＨＰＴＰα、およびＤＰＴＰ１０Ｄを含む。ＺｈａｎｇとＤｉｘｏｎ、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍ．、６８巻：１〜３６頁（１９９４年）参照。蛋白質セリン−スレオニンホスファターゼの例にはＰＰ１、ＰＰ２Ａ、ＰＰ２ＢおよびＰＰ２Ｃを含む。ＨｕｎｔｅｒとＳｅｆｔｏｎ編、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ．Ｐｒｅｓｓ社、Ｎｅｗ・Ｙｏｒｋ、２０１集：３８９〜３９８頁（１９９１年）参照。これら蛋白質は商業的に購入でき、またはここに記載する組換え技術を使用して製造できる。ホスファターゼ活性を測定するため、本質的に前記のようにして、次の修正を加えてＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡを実施できる。キナーゼまたはキナーゼ構築物（たとえば受容体構築物）の第二固相への捕捉および洗浄段階（非結合細胞溶解物を除去するため）に続いて、目的ホスファターゼを第二検定プレートの各ウェルに添加し、接着したキナーゼまたはキナーゼ構築物とともにインキュベーションする。例えば、適切な希釈緩衝液中のホスファターゼ（ＨｕｎｔｅｒとＳｅｆｔｏｎ編、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ．Ｐｒｅｓｓ社、Ｎｅｗ・Ｙｏｒｋ、２０１巻：４１６〜４４０［１９９１年］）約５０〜２００μＬを各ウェルに添加できる。一般に、これに続けてキナーゼをホスファターゼに脱燐酸化させるため、室温（または３７℃）で約３０分から２時間の間穏やかに振盪する。洗浄でホスファターゼを除去後、対照（すなわち、ホスファターゼ無添加）と比較したキナーゼの燐酸化度合の減少を前記ＥＬＩＳＡによって定量する。６．キット便宜のため、試薬をキット、すなわち、試薬の包装した組合せ、目的ｒＰＴＫ活性化を阻害または活性化するための分析物の性能を検定する分析物の組合せとして供給できる。キットの各成分は予め決められた比率で供給されよう。そこでキットは本検定用特異的第二固相ならびに別々に包装されているか、または第二固相（たとえば、マイクロタイタープレート）に捕捉されている抗フラグポリペプチド捕捉剤を含む。通常、酵素標識で直接的または間接的に標識された抗ホスホチロジン抗体のような他種の試薬もキットに入れるであろう。検出可能な標識が酵素である場合、キットは基質および酵素が必要とする補助因子（たとえば、検出可能な発色団または螢光団を提供する基質前駆体）も含有するであろう。これに加えて、たとえば、安定化剤、緩衝剤（たとえば、ブロック緩衝液および細胞溶解緩衝液）などのような他の添加剤も含めうる。好都合には、このキットは受容体構築物で形質転換した均質な細胞集団も供給できる。様々な試薬の相対的な量は検定の感度を実質的に最適化する試薬の溶液内濃度を提供するために広範に変動してもよい。殊に、試薬は溶解後に適当な濃度を持つ試薬溶液を提供するであろう添加剤を含み、乾燥粉末、通常は凍結乾燥粉末、として提供されてもよい。キットにはまたＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡを実行するための指示書を入れるのが適当である。７．検定のための使用この出願は信頼性良く高感度にキナーゼ活性化を定量的に検出するために有用な検定法二種を提供する。第一の検定法はここに記載する所望の特性を持つキナーゼ受容体に特異的な捕捉剤抗体が入手できるか製造されている場合に使用できる。第二の検定法はフラグポリペプチドおよびそこに特異的に結合する捕捉剤の使用により測定すべきいずれかのキナーゼ受容体の活性化を可能にする一般的検定法である。これら検定法は選択したキナーゼ受容体のための新規な作動剤／拮抗剤を認定するために有用である。また、この検定法はリガンド−受容体間相互作用を研究（すなわち、機序研究）する手段を提供する。また、選択した細胞系中の内因性受容体の存在をこの検定の使用によって定量できる。これら検定法はさらに生物学的標本中の選択したキナーゼ受容体に対するリガンドの存在を認定し、また、たとえば精製操作後に増殖因子が分離されたかどうかを確認するために有用である。個々の受容体を活性化するこれら増殖因子の性能を測定する検定法を持つことは望ましいことである。本検定法はヒトから採取した生物学的標本中の選択したｒＰＴＫ（たとえばインシュリン受容体）に対するリガンドの存在を検出する臨床的応用も持ち、そこで、リガンド濃度が上昇または下降した患者を認定できる。リガンド濃度の上昇または下降が病理学的症状を起こす場合にはこれは殊に望ましい。従って、選択したリガンド（たとえば、インシュリン）の投与対象候補をこの診断法によって認定できる。ここに開示する検定法を用いて患者に投与する作動剤または拮抗剤のｐＫを検定することも可能である。この検定法はまた生物学的標本中に隠れている受容体の検出を促進する。この検定法はまた内因性ホスファターゼ、好適な態様においては目的ホスファターゼ、のホスファターゼ活性を定量するためにも有用である。これは、例えばホスファターゼ阻害剤のスクリーニングに使用できる。以下は本発明実施の特異的態様の実例である。これら実施例は例示的目的のみで提出されるものであり、いかなる意味でも本発明の範囲を限定することは意図されていない。ここに引用する報告、特許および特許出願は、前記も後記もいずれでも全て、それら全体を参考にするためにここに引用するものである。実施例１ＨＥＲ２受容体のＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡこの実施例に記載する検定法は、ＨＥＲ２受容体とその特異的活性化剤、ヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ：ＨＲＧ）との間の相互作用の結果としての自己燐酸化の程度を測定するために開発した。ｐ１８５^HER2の過剰発現は上皮由来性癌多数の不十分な臨床的成果に関連する。ヘレグリンとその齧歯類同族体ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）は最初に乳癌細胞系ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−４５３中の１８５ｋＤＡ蛋白質の自己燐酸化を促進する性能に基づいて精製した。本発明のこの態様において、チロジンキナーゼ受容体ＤＮＡ（内因性または形質転換のいずれか）を発現する細胞系は接着性で、リガンド不在下に自己燐酸化を促進せず、結合リガンドの存在が原因で非対結合を起こすこともないような、この受容体に特異的に結合することのできる抗体（たとえば、モノクローナルまたは親和性精製ポリクローナル）がある。標準曲線作製と標本多数とをこの検定を使用していくつかの希釈で反復して同時に進行でき、未知標本多数の中のリガンド活性を容易に定量できる。（ｉ）捕捉剤の製造ＨＥＲ２分子の細胞外ドメインで免疫したニュージーランド白色ウサギの免疫血漿からポリクローナル抗−ＨＥＲ２抗体を分離した（Ｆｅｎｄｌｙなど、Ｊｏｕｒｎａｌ・ｏｆ・Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ・Ｒｅｓｐｏｎｓｅ・Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ、９巻：４４９〜４５５頁［１９９０年］）。このｒＨＥＲ２・ＥＣＤ特異性抗体をＡｖｉｄｇｅｌ・Ｆ（Ｂｉｏｐｒｏｂｅ・Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｔｕｓｔｉｎ、ＣＡ）に結合したｒＨＥＲ２・ＥＣＤから構成した親和カラムによるＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ・Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して精製した。得られた精製抗体保存液は０．８２９ｍｇ／ｍＬ燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４で、０．５ｍＬ量づつにして−２０℃で保存した。（ｉｉ）抗ホスホチロジン抗体の製造モノクローナル抗ホスホチロジン、クローン４Ｇ１０、はＵｐｓｔａｔｅ・Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社（ＵＢＩ、Ｌａｋｅ・Ｐｌａｃｉｄ、Ｎ．Ｙ．）から購入し、長鎖ビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド（Ｂｉｏｔｉｎ−Ｘ−ＮＨＳ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ・Ｏｒｇａｎｉｃｓ社、Ｃｌｅｖｅｌａｎd、ＯＨ）を使用してビオチン化した。（ｉｉｉ）リガンド組換えにより、末端を切詰めた残基１７７〜２４４に対応するβ１ヘレグリン（分子量＝７．８８Ｋｄ）（ＨＲＧβ１_177〜244）をＨｏｌｍｅｓなどがＳｃｉｅｎｃｅ、２５６巻：１２０５〜１２１０頁（１９９２年）に記載したように、大腸菌中で生産し、均一になるまで精製し、ｐＨ７．５の５０ｍＭ−トリス／ＨＣｌ中の８９．７μＭ−ストック溶液として４℃で貯蔵した。（ｉｖ）接着細胞人乳腺癌から分離した接着細胞系ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ−ＨＢＴ２２）をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手した。ＭＣＦ−７細胞はＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡ分析で測定可能量の表面ｐ１８５^HER2を生産することが証明されている。この細胞を１５０ｃｍ²組織培養フラスコ中（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に保存し、細胞濃度が全面生長の６０％から７５％の時に使用した。検定のためには、平底マイクロタイタープレート（Ｆａｌｃｏｎ３０７２型、Ｂｅｃｔｏｎ・Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ・Ｌａｂｗａｒｅ社、Ｌｉｎｃｏｌｎ・Ｐａｒｋ、ＮＪ）のウェル毎に２ ×１０⁵細胞を接種し、３７℃で一夜５％ＣＯ₂中で培養した。細胞は通常組成としてのＦ１２／ＤＭＥＭ５０：５０Ｇｉｂｃｏ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ・Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｇｒａｎｄ・Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で生長させた。培地には１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）、２５ｍＭ−ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ社）、および２ｍＭ−Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ社）を添加した。（ｖ）ＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡＭＣＦ−７細胞（２×１０⁵）を培地１００μＬ中で平底９６穴培養プレートの各ウェルに添加、一夜３７℃で５％ＣＯ₂中で培養した。翌朝ウェルの上清液をデカンテーションし、紙タオルでプレートを軽く押し固めた。実験標本または組換えＨＲＧβ１_177〜244標準（３０００、１０００、３３３、１１１、３７、１２、４、および０ｐＭ）を含む培地５０μＬを各ウェルに添加した。細胞を３７℃で３０分間刺激し、ウェル上清液をデカンテーションし、プレートを再度軽く押し固めた。細胞を溶解し、受容体を溶解するために細胞溶解緩衝液１００μ Ｌを各ウェルに添加した。この細胞溶解緩衝液は５０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ社）、０．５％トリトン−Ｘ−１００（Ｇｉｂｃｏ社）、０．０１％チメロサール、３０ＫＩＵアプロチニン（ＩＣＮ・Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、Ａｕｒｏｒａ、ＯＨ）／ｍＬ、１ｍＭ−４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホン酸フッ化物塩酸塩（ＡＥＢＳＦ、ＩＣＮ・Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）、５０ μＭ−リュウペプチン（ＩＣＮ・Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）および２ｍＭ− オルトバナジン酸ナトリウム（Ｎａ₃ＶＯ₄，Ｓｉｇｍａ・Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、から構成した。次にプレートをプレート振盪機（Ｂｅｌｌｃｏ・Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、ＮＪ）上、室温で６０分間穏やかに振盪した。細胞が溶解したら、親和性精製したポリクローナル抗ＨＥＲ２・ＥＣＤ（５０ｍＭ−炭酸緩衝液中１．０μｇ／ｍＬ、ｐＨ９．６、１００μＬ／ウェル）で一夜４℃で被覆したＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ・Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｉｎｔｅｒ・Ｍｅｄ社、デンマーク）をデカンテーションし、紙タオルで押し固め、ブロック緩衝液［０．５％ＢＳＡ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社、Ｐｕｒｃｈａｓｅ、ＮＹ）および０．０１％チメロサール含有ＰＢＳ］１５０μＬ／ウェルで穏やかに振盪しながら室温で６０分間ブロックした。６０分後、抗ＨＥＲ２・ＥＣＤ被覆プレートを自動プレート洗浄器（ＳｃａｎＷａｓｈｅｒ３００、Ｓｋａｔｒｏｎ・Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）を使用して洗浄緩衝液（０．０５％トゥイーン２０および０．０１％チメロサール含有ＰＢＳ）で６回洗浄した。細胞培養マイクロタイターウェルからの溶解ｐ１８５^HER2含有細胞溶解物（８５μＬ／ウェル）を抗ｒＨＥＲ２・ＥＣＤで被覆し、ブロックしたＥＬＩＳＡウェルに移動し、穏やかに振盪しながら室温で２時間インキュベーションした。非結合受容体を洗浄緩衝液で洗浄して除去し、希釈緩衝液（０．５％ＢＳＡ、０．０５％トゥイーン２０、５ｍＭ−ＥＤＴＡ、および０．０１％チメロサール含有ＰＢＳ）で１：２０００、すなわち４００ｐｇ／ｍＬ、に希釈したビオチン化４Ｇ１０（抗ホスホチロジン）１００μＬを各ウェルに添加した。室温で２時間インキュベーションした後、プレートを洗浄し、希釈緩衝液で１：１００００に希釈したＨＲＰＯ結合ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｓ．Ｓａｎ・Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを穏やかに振盪しながら室温で３０分間インキュベーションした。遊離のアビジン結合体を洗い去り、新しく調製した基質溶液（テトラメチルベンジジン［ＴＭＢ］、２成分基質キット、Ｋｉｒｋｅｇａａｄ・ａｎｄ・Ｐｅｒｒｙ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）１００μＬを各ウェルに添加した。反応が１０分間進行した後、１．０Ｍ−Ｈ₃ＰＯ₄を１００μＬ／ウェル添加して発色を止めた。Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ・Ｃｅｎｔｒｉｓ６５０（Ａｐｐｌｅ・Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ社、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、ＣＡ）およびＤｅｌｔａＳｏｆｔソフトウエア（ＢｉｏＭｅｔａｌｌｉｃｓ社、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）の制御下にｖｍａｘプレート読取器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｄｅｖｉｃｅｓ社、Ｐａｌｏ・Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用し、参照波長を６５０ｎｍとする４５０ｎｍの吸光度を読み取った（ＡＢＳ_450/650）。図７に示す標準曲線は、ＭＣＦ−７細胞を３０００、１０００、３３３、１１１、３７、１２、４または０ｐＭのＨＲＧβ１_177〜244で刺激し、ｐＭ−ＨＲＧ β１_177〜244対平均ＡＢＳ_450/650±標準偏差として表示し、ＤｅｌｔａＳｏｆｔプログラムを使用して作成した。標本濃度は吸光度をその標準曲線に内挿して得られ、ｐＭ−ＨＲＧβ１_177〜244活性として表示した。データを四パラメーター非線型最小自乗方程式に適合させた時、相関係数０．９９９８を与えた。図７に示すデータについて、ＨＲＧβ１_177〜244による受容体活性化のＥＣ₅₀は３７３ｐＭであった。ｐ１８５^HER2ＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡの高度な再現性を証明するために、１ケ月にわたり標準曲線を７回作成し、ＥＣ₅₀ 値を平均した。これでＨＲＧβ１_177〜244の平均ＥＣ₅₀値３６０±４０ｐＭ（平均±標準偏差）の値を得た。（ｖｉ）検定内および検定間精度および検定特異性ｐ１８５^HER2ＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡを別々の日に３回行って検定間変動を測定した。各検定では標準曲線を３回作成した。高（１０００ｐＭ）、中（２００ｐＭ）および低（４０ｐＭ）ＨＲＧβ１_177〜244に対応する対照を２４反復で検定した。各被検標本のＡＢＳ_450/650をｐＭ−ＨＲＧβ１_177〜244活性に変換し、各検査濃度での変換値２４個を平均した。データを平均値および変動係数％（％ｃｖ［（検定内標準偏差／検定内算出値平均値）×１００］）で表示した。次の表１Ａ参照。この検定が実際に生物検定とＥＬＩＳＡとの両要素から構成されている事実にも拘らず、ＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡの検定内変動値は容認できる範囲内であった。最高の変動係数（％）は２０％以下であり、中値および低値では１０％以下であった。検定間変動は各検査での所定サンプル濃度について隣接ウェル３個（２４ウェル試験の中で）の最高値の平均により算出した。各検査濃度の平均値３個を平均した。データを平均値と％ｃｖ［（検定間標準偏差／検定間平均値）×１００］とで表示した。前記表１Ｂ参照。このＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡの検定間変動は容認できる範囲内であった。この検定法の特異性を確認するため、ＭＣＦ−７細胞を３０００、１０００、３３３、１１１、３７、１２、４または０ｐＭのＨＲＧβ１_177〜244または３００００、１００００、３３３３、１１１１、３７０、１２０、４０または０ｐＭのインシュリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、またはインシュリンで刺激した。ｐ１８５^HER2ＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡを前記の通りに行った。結果を図８に示す。ｐ１８５^HER2ＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡは明らかにヘレグリンに特異的であった。ＨＲＧβ１_117〜244は正常な受容体刺激および自動燐酸化を誘発した一方で、近縁のＥＧＦは検査した最高濃度（１００ｎＭ）でも極く僅かな刺激しか与えなかった。ＥＧＦ−ＲはＭＣＦ−７細胞中で生産されるので、このシグナルはｐ１８５^HER2のＥＧＦ受容体トランス燐酸化に起因すると思われる。インシュリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、血管表皮増殖因子（ＶＥＧＦ）およびインシュリンはいずれもＭＣＦ−７ｐ１８５^HER2ＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡには検出可能な効果を及ぼさなかった。ＭＣＦ−７細胞は活性なインシュリン受容体を生産するにも関わらず、インシュリンでさえ効果がなかった。この実施例が示す結果は、ＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡはキナーゼ受容体のリガンド活性化、たとえば、ｐ１８５^HER2受容体のヘレグリン活性化、を検定するための有用な方法であることを証明する。チロジン燐酸化で表示される受容体活性化水準は容易に定量化され、所与リガンドのＥＣ₅₀は容易に測定される。この検定が使用される可能性の一つは受容体の作動剤または拮抗剤に関する化合物のスクリーニングであろう。この検定の処理可能量はウエスタンブロット分析のそれを大きく超える。この検定の細胞培養部分は９６ウェルのプレート中で実施されるので、１日の検定で１度に異なる希釈率で多数の標本を反復して検定してもよい。実施例２Ｒｓe受容体のＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡＭａｒｋなどはＪｏｕｒｎａｌ・ｏｆ・Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ・Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６９（１４）巻：１０７２０〜１０７２８頁（１９９４年）にヒトおよびネズミの組織からのＲｓｅ受容体蛋白質チロジンキナーゼの分離を記載している。このＲｓｅ受容体とカルボキシ末端フラグポリペプチド（すなわち、Ｒｓｅ．ｇＤ）とをここに記載するＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡに付した。実験操作を以下に略述する。（ｉ）捕捉剤の調製モノクローナル抗ｇＤ（クローン５Ｂ６）はヘルペス／シンプレックスウイルスのグリコプロテインＤからのペプチドに対して調製した（Ｐａｂｏｒｓｋｙなど、Ｐｒｏｔｅｉｎ・Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３（６）巻：５４７〜５５３頁［１９９０年］）。精製ストック製品を３．０ｍｇ／ｍＬ燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４に調整し、１．０ｍＬ量を−２０℃で貯蔵した。（ｉｉ）抗ホスホチロジン抗体の調整モノクローナル抗ホスホチロジン、クローン４Ｇ１０、はＵｐｓｔａｔｅ・Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社（ＵＢＩ、Ｌａｋｅ・Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）から購入し、長鎖ビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド（Ｂｉｏｔｉｎ−Ｘ−ＮＨＳ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ・Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を使用してビオチン化した。（ｉｉｉ）リガンドＲｓｅ受容体への内因性リカンドは入手できなかったので、この実施例に記載するＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡに用いるリガンドを形成するＲｓｅ受容体への作動剤抗体を調製した。作動剤抗体を作製するためＲｓｅ．ＩｇＧキメラを作製した。略述すれば、Ｒｓｅ・ＥＣＤのコード配列を多段工法によりヒトＩｇＧ−γ１重鎖配列に融合した。ＰＲＣを用いて、Ｒｓｅアミノ酸４２８のコード配列の３’ に独特なＢｓｔＥＩＩ部位を持つ断片を作製した。ＰＣＲ生成物をその構築物中の独特なＢｓｔＥＩＩ部位を通してヒトＩｇＧ−γ₁重鎖ｃＤＮＡに結合した（Ｍａｒｋなど、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２６７巻：２６１６６〜２６１７１頁［１９９２年］）。得られた構築物（ｐＲＫ．ｂｐＴＫ３．ＩｇＧ．融合体と命名）はヒトＩｇＧ−γ₁重鎖をコードする配列に結合したＲｓｅアミノ酸３７５〜４２８のコード配列を含む。Ｒｓｅ・ＥＣＤのの残りの部分（アミノ酸１〜３７４）を次にｐＲＫ．ｂｐＴＫ３．ＩｇＧ．融合体中のＢａｍＨＩ部位を経由する結合で付加してｐＲＫ．Ｒｓｅ．ＩｇＧを得た。Ｒｓｅ．ＩｇＧを発現する安定な細胞集団を作製するために、ＣａｃｈｉａｎｃｅｓなどがＢｉｏ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１５巻：２２５〜２５９頁（１９９３年）に開示したｐＲＫ５誘導物であるＣＭＶ推進発現プラスミドｐＣＩＳ．ＥＢＯＮのエピソームにＲｓｅ．ＩｇＧをコードするｃＤＮＡをサブクローニングした。ヒト胎児腎臓２９３細胞（ＡＴＣＣ、Ｐａｒｋｌａｗｎ・Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、米国から入手）を燐酸カルシウム法により形質転換した。細胞単層をＤＮＡ沈降物存在下にインキュベーションし、グリセリンでショックを与え、２ｍＭ−グルタミン、１０％ウシ胎児血漿、ペニシンリンおよびストレプトマイシンを含有するＦ１２：ＤＭＥＭ（１：１）中で培養した。４８時間後、細胞集団をＧ４１８を含有する培地に再接種して安定な細胞集団を選択した。条件付け媒体を血漿不含培地中でＧ４１８不在下に７２時間培養したＲｓｅ．ＩｇＧ核酸発現細胞から集めた。Ｃｈａｍｏｗ，Ｓ．Ｍ．などがＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９巻：９８８５〜９８９１頁（１９９０年）に記載した操作に次の小規模の修正を加えて使用するプロテインＡカラムでの親和性クロマトグラフィーによりＲｓｅ．ＩｇＧを精製した。Ｒｓｅ．ＩｇＧを発現する細胞から採集した条件付け媒体を０．１Ｍ− クエン酸、ｐＨ６．０に調整し、プロテインＡカラム（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社）に直接負荷した。カラムを０．１Ｍ−クエン酸、ｐＨ６．０で洗浄し、３Ｍ−ＭｇＣｌ₂と１０％グリセリンとで溶離した。画分を集め、ＰＤ−１０カラム上で脱塩し、透析し、ＰＢＳに対して濃縮した。蛋白質濃度はヒトＩｇＧ（Ｆｃ）に対するＥＬＩＳＡにより測定した。この蛋白質の純度はＰＡＧＥゲルのクーマジー染色によって分析した。前記の通り、Ｒｓｅ．ＩｇＧに対するポリクローナル抗体をニュージーランド白ウサギ中に発生させた。Ｒｓｅ．ＩｇＧ４μｇのＰＢＳμＬ溶液をフロインドのアジュバント１００μＬ中に乳濁化した（最初の注射には完全アジバント、全ブーストには不完全アジュバント）。最初の免疫および第一回ブーストでは蛋白質を膝窩のリンパ節に直接注射した（Ｓｉｇｅｌなど、Ｍｅｔｈｏｄｓ・Ｅｎｚｙｍｏｌ．、９３巻：３〜１２頁［１９８３年］）。後続するブーストでは、蛋白質を皮下および筋肉内部位に注射した。蛋白質１．３μｇ／体重ｋｇを３週間毎に注射し、各ブースト後１および２週間目に血液を採取した。作製したポリクローナル抗血漿を次に５０％硫酸アンモニウム中で沈殿させた。得られた精製ポリクローナル抗血漿をここでは「１９Ｂ」と呼称する。Ｒｓｅ受容体の自動燐酸化を誘発する１９Ｂ抗血漿の性能を確認するために、血漿でスターブした３Ｔ３．ｇＤ．Ｒ１１細胞（ＭａｒｋなどがＪｏｕｒｎａｌ・ｏｆ・Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ・Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６９（１４）巻：１０７２０〜１０７２８頁［１９９４］に記載した技術を使用してアミノ末端ｇＤフラグポリペプチド［すなわち、ｇＤ．Ｒｓｅ］を持つＲｓｅ受容体をコードする核酸で形質転換したもの）またはＮＩＨ３Ｔ３細胞を１：２００希釈の免疫前血漿または１９Ｂポリクローナル抗血漿と１０分間接触させた。抗ｇＤモノクローナル抗体５Ｂ６を使用して抽出物からｇＤ．Ｒｓｅ蛋白質を免疫沈降させた。蛋白質を７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで還元条件下に分画し、ニトロセルロースに移した。Ｒｓｅの燐酸化は標識抗ホスホチロジン抗体で検出した。３Ｔ３．ｇＤ．Ｒ１１細胞の１９Ｂ抗血漿処理で１４０ｋＤのｇＤ．Ｒｓｅ蛋白質の燐酸化を刺激した。この増加は免疫前血漿処理細胞には観察されなかった。精製した１９Ｂポリクローナル抗血漿はｐＨ７．５の２．８ｍｇ／ＰＢＳｍＬストック溶液として４℃で保存した。（ｉｖ）Ｒｓｅ．ｇＤ核酸の調製合成二重鎖オリゴヌクレオチドを使用してヒトＲｓｅのＣ末端アミノ酸１０個（８８０〜８９０）に対するコード配列を再構築し、さらに抗体５Ｂ６のエピトープおよび終止コドンを含むアミノ酸２１個を付加した。融合遺伝子の合成部分の最終的配列は次の通りであった：コード鎖：５’-ＴＧＣＡＧＣＡＡＧＧＧＣＴＡＣＴＧＣＣＡＣＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＧＣＡＧＡＴＧＣＴＡＧＣＣＴＣＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＡＴＣＣＡＡＡＴＣＧＡＴＴＣＣＧＣＧＧＣＡＡＡＧＡＴＣＴＴＣＣＧＧＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡＧＣＴ-３’（配列番号１０）。非コード（アンチセンス）鎖：５’-ＡＧＣＴＴＣＴＡＣＡＧＧＡＣＣＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＣＣＧＣＧＧＡＡＴＣＧＡＴＴＴＧＧＡＴＣＡＧＣＣＡＴＣＴＴＧＡＧＧＣＴＡＧＣＡＴＣＴＧＣＧＣＡＧＣＴＣＧＡＧＴＧＴＧＧＣＡＧＴＡＧＣＣＣＴＴＧＣＴＧＣＡ-３’（配列番号１１）。この合成ＤＮＡをヒトＲｓｅのアミノ酸１〜８８０をコードするｃＤＮＡに公知のヒトＲｓｅｃＤＮＡ配列におけるヌクレオチド２６４４から始まるＰｓｔＩ部位（Ｍａｒｋなど、Ｊｏｕｒｎａｌ・ｏｆ・Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ・Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６９（１４）巻：１０７２０〜１０７２８頁［１９９４］）および発現ベクターｐＳＶＩ７．ＩＤ．ＬＬ（図１６、配列番号９参照）のポリリンカー中のＨｉｎｄＩＩＩ部位に結合して、発現プラスミドｐＳＶＩ７．ＩＤ．Ｒｓｅ．ｇＤを作製した。略述すれば、この発現プラスミドには二シストロン性の一次転写体を含み、５’−切断ドナーおよび３’−切断アクセプターイントロンの切断部位、続いてＲｓｅ．ｇＤをコードする配列が結合したＤＨＦＲをコードする配列を含む。全長（非切断）メッセージは第一オープン読み枠としてＤＨＦＲを含むので、ＤＨＦＲ蛋白質が作製されて、安定な形質転換体の選択が可能である。（ｖ）細胞の形質転換ｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（欧州特許３０７２４７号、１９８９年３月１５日発行）にプラスミド骨格中の独特なＮｏｔＩ部位でリネアライズしたｐＳＶ．ＩＤ．Ｒｓｅ．ｇＤ２０μｇを電気穿孔した。このＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出後にエタノール沈降し、１／１０トリスＥＤＴＡ２０μＬ中に再懸濁した。次にＤＮＡ１０μｇをＣＨＯ．ｄｐ１２細胞１０⁷個とともにＰＢＳ１ｍＬ中で氷上で１０分間インキュベーションした後、４００ボルトで３３０μｆで電気穿孔した。細胞を氷に戻し、１０分後に非選択培地に接種した。２４時間後、細胞にヌクレオシド不含培地を加えて安定なＤＨＦＲ+クローンを選択した。（ｖｉ）ＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡで使用する形質転換細胞の選択Ｒｓｅ．ｇＤ核酸を発現する細胞系を認定するために、候補クローンをＲｓｅの細胞外エピトープを認識する前記のようにして作製したポリクローナル抗血漿１９Ｂを使用する螢光活性化細胞選択（ＦＡＣＳ）分析によってスクリーニングした。図５、段階（ｂ）参照。ＦＡＣＳ検定で陽性を示したクローンが全長Ｒｓｅ．ｇＤ核酸を発現することを確認するため、細胞溶解物を調製（Ｌｏｋｋｅｒなど、ＥＭＢＯ・Ｊ．、１１巻：２５０３〜２５１０頁［１９９２年］）し、溶解したＲｓｅ．ｇＤを１９Ｂ抗血漿で免疫沈降した。免疫沈降した蛋白質を還元条件下に７％ＰＡＧＥを使用して分画し、ニトロセルロースにブロットし、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体で検出する抗−ｇＤ・５Ｂ６抗体でプローブした。図５の段階（ｃ）参照。細胞クローン中のＲｓｅ．ｇＤが１９Ｂ作動剤抗体に反応して活性化して自動燐酸化を起こす性能を測定した。略述すれば、前記のＲｓｅ．ｇＤ核酸で形質転換したｄｐ．ＣＨＯ細胞を血漿でスターブし、１：２００希釈の免疫前血漿または１９Ｂ抗血漿と１０分間接触した。ｇＤ・５Ｂ６モノクローナル抗体を使用してＲｓｅ．ｇＤ蛋白質を抽出物から免疫沈降した。蛋白質を７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで還元条件下に分画し、ニトロセルロースに転写した。Ｒｓｅの燐酸化は標識抗ホスホチロジン抗体で検出した。図５、段階（ｄ）参照。（ｖｉｉ）培地細胞はＦ１２／ＤＭＥＭ５０：５０（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ・Ｌｉｆｅ・Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｇｒａｎｄ・Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中に生長させた。この培地には１０％透析濾過したＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ社、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）、２５ｍＭ−ＨＥＰＥＳおよび２ｍＭ−Ｌ−グルタミンを添加した。（ｖｉｉｉ）ＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡＲｓｅ．ｇＤで形質転換したｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（１９８９年３月１５日発行、欧州特許３０７２４７号）を平底９６穴培養プレートのウェルに接種（ウェル当り５×１０⁴個）し、一夜３７℃で５％ＣＯ₂中で培養した。翌朝、ウェルの上清液をデカンテーションし、プレートを紙タオルで軽く押し固めた。各ウェルに実験標本または１：１００、１：２００、１：４００、１：８００、１：１６００、１：３２００または０希釈した抗Ｒｓｅ作動剤ポリクローナル抗体（１９ＢｐＡｂ）を添加した。細胞を３７℃で３０分間刺激し、ウェル上清液をデカンテーションし、プレートを紙タオルで軽く押し固めた。細胞を溶解し、受容体を溶解するために溶解緩衝液１００μＬを各ウェルに添加した。溶解緩衝液は５０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ社）、０．５％トリトン−Ｘ１００（Ｇｉｂｃｏ社）、０．０１％チメロサール、３０ＫＩＵ／ｍＬアプロチニン（ＩＣＮ・Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、Ａｕｒｏｒａ、ＯＨ）、１ｍＭ−４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホン酸フッ化物塩酸塩（ＡＥＢＳＦ、ＩＣＮ・Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）、５０μＭ−ロイペプチン（ＩＣＮ・Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）および２ｍＭ−オルトバナジン酸ナトリウム（Ｎａ₃ＶＯ₄、Ｓｉｇｍａ・Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有する１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、ｐＨ７．５から構成されていた。次にプレートをプレート振盪機（Ｂｅｌｌｃｏ・Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、ＮＪ）で室温で６０分間穏やかに振盪した。細胞が溶解したらば、５Ｂ６モノクローナル抗−ｇＤ抗体（５０ｍＭ−炭酸緩衝液中０．５μｇ／ｍＬ、ｐＨ９．６、１００μＬ／ウェル）で一夜４℃で被覆したＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ・Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｉｎｔｅｒ・Ｍｅｄ社、デンマーク）をデカンテーションし、紙タオルで押し固め、ブロック緩衝液［０．５％ＢＳＡ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社、Ｐｕｒｃｈａｓｅ、ＮＹ）および０．０１％チメロサール含有ＰＢＳ］１５０μＬ／ウェルで穏やかに振盪しながら室温で６０分間ブロックした。６０分後、抗ｇＤ・５Ｂ６被覆プレートを自動プレート洗浄器（ＳｃａｎＷａｓｈｅｒ３００、Ｓｋａｔｒｏｎ・Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）を使用して洗浄緩衝液（０．０５％トゥイーン２０と０．０１％チメロサールとを含有するＰＢＳ）で６回洗浄した。細胞培養マイクロタイターウェルからの溶解Ｒｓｅ．ｇＤ含有細胞溶解物（８５μＬ／ウェル）を抗ｇＤ・５Ｂ６で被覆し、ブロックしたＥＬＩＳＡウェルに移動し、穏やかに振盪しながら室温で２時間インキュベーションした。非結合Ｒｓｅ．ｇＤを洗浄緩衝液で洗浄して除去し、希釈緩衝液（０．５％ＢＳＡ、０．０５％トゥイーン２０、５ｍＭ−ＥＤＴＡ、および０．０１％チメロサール含有ＰＢＳ）で１：２０００、すなわち４００ｐｇ／ｍＬ、に希釈したビオチン化４Ｇ１０（抗ホスホチロジン）１００μＬを各ウェルに添加した。室温で２時間インキュベーションした後に、プレートを洗浄し、希釈緩衝液で１：１００００に希釈したＨＲＰＯ結合ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｓ．Ｓａｎ・Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを穏やかに振盪しつつ室温で３０分間インキュベーションした。遊離のアビジン結合体を洗い去り、新しく調製した基質溶液（テトラメチルベンジジン［ＴＭＢ］、２成分基質キット、Ｋｉｒｋｅｇａａｄ・ａｎｄ・Ｐｅｒｒｙ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）１００μＬを各ウェルに添加した。反応が１０分間進行した後、１．０Ｍ−Ｈ₃ＰＯ₄を１００μＬ／ウェル添加して発色を止めた。Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ・Ｃｅｎｔｒｉｓ６５０（Ａｐｐｌｅ・Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ社、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、ＣＡ）およびＤｅｌｔａＳｏｆｔソフトウエア（ＢｉｏＭｅｔａｌｌｉｃｓ社、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）の制御下にｖｍａｘプレート読取器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｄｅｖｉｃｅｓ社、Ｐａｌｏ・Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して、参照波長を６５０ｎｍとする４５０ｎｍの吸光度を読取った（ＡＢＳ_450/650）。図１０に示す標準曲線は、Ｒｓｅ．ｇＤ形質転換ＣＨＯ細胞を１：１００、１：２００、１：４００、１：８００、１：１６００、１：３２００または０希釈の抗Ｒｓｅ作動剤抗体（１９Ｂ）で刺激し、１／抗Ｒｓｅ作動剤抗体（１９Ｂ）希釈率対平均ＡＢＳ_450/650±標準偏差として表示し、ＤｅｌｔａＳｏｆｔプログラムを使用して作成した。この実施例で示された結果はＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡがカルボキシ末端フラグポリペプチドを持つ受容体構築物、たとえばＲｓｅ．ｇＤ、のリガンド活性化、を検定するために有用な方法であることを証明する。チロジン燐酸化としての受容体活性化水準は容易に定量され、所与のリガンド（たとえば、受容体に対する作動剤抗体）に対するＥＣ₅₀は簡易に測定できる。実施例３ｔｒｋＡ、ＢおよびＣ受容体のＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡノイロトロフィンは神経系の発達と維持に決定的役割を果たす小さな塩基性の蛋白質の一族に属する。最初に確認され、多分最もよく理解されているこの族の構成員は神経生長因子（ＮＧＦ）である。１９９２年１２月８日発行の米国特許５１６９７６２号参照。最近、ＮＧＦに逐次的な関連があって、ＮＧＦに類似の機能を持つが、別種のポリペプチドが確認されている。例えば、今ではノイロトロフィン−２（ＮＴ２）と呼ばれる脳由来神経栄養因子（ＢＮＧＦ）をＬｅｉｂｒｏｃｋなど（Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻：１４９〜１５２頁［１９８９年］）がクローニングし、配列決定した。研究者数グループが最初には神経因子（ＮＦ）と呼ばれ、今ではノイロトロフィン−３と呼ばれる神経栄養因子を確認している（Ｅｒｎｆｏｒｓなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７４巻：３３９頁［１９９０年］；Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７巻：１４４６頁［１９９０年］；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌなど、Ｎｅｕｒｏｎ、４巻：７６７頁［１９９０年］；ＪｏｎｅｓとＲｅｉｃｈａｒｄｔ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７巻：８０６０〜８０６４頁［１９９０年］；Ｋａｉｓｈｏなど、ＦＥＢＳ・Ｌｅｔｔ．、２６６巻：１８７頁［１９９０年］）。最近、ノイロトロフィン−４および−５（ＮＴ４およびＮＴ５）がこの族に追加された（Ｈａｌｌｂｏｏｋなど、Ｎｅｕｒｏｎ、６巻：８４５〜８５８頁［１９９１年］；Ｂｅｒｋｍｅｉｅｒなど、Ｎｅｕｒｏｎ、７巻：８５７〜８６６［１９９１年］；Ｉｐなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻：３０６０〜３０６４頁［１９９２年］）。ノイロトロフィンは他のポリペプチド増殖因子と同様に、細胞表面のｒＰＴＫ（Ｔｒｋ受容体と呼ばれる）との相互作用を通してそれらの標的細胞に影響を与える。ｔｒｋ族の最初の一員であるｔｒｋＡは最初にトロポミオシン配列の触媒ドメインへの転座に起因する腫瘍原性形質転換の結果として確認された。その後の研究から、ｔｒｋＡはＮＧＦに対するシグナル伝達の受容体であることが確認された。続いて、他の関連受容体２個、マウスおよびラットｔｒｋＢ（Ｋｌｅｉｎなど、ＥＭＢＯ・Ｊ．、８巻：３７０１〜３７０９頁［１９８９年］；Ｍｉｄｄｌｅｍａｓなど、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１１巻：１４３〜１５３頁［１９９１年］；１９９１年１１月６日発行の欧州特許４５５４６０号）およびブタ、マウスおよびラットのｔｒｋＣ（Ｌａｍｂａｌｌｅなど、Ｃｅｌｌ、６６巻：９６７〜９７９頁［１９９１年］；１９９３年１月１３日発行の欧州特許５２２５３０号）がｔｒｋ受容体族の構成員であることが確認された。ｔｒｋ受容体の構造は極めて類似しているが、異なるスプライシングによってこの族の複雑さが増加し、既にｔｒｋＡの型２個、ｔｒｋＢの型３個（２個は機能的チロジンキナーゼドメインを持たない）、およびｔｒｋＣの型少なくとも４個（いくつかは機能的チロジンキナーゼドメインを持たないが、２個はチロジンキナーゼドメインに小さな挿入断片を持つ）が知られている。ヒトｔｒｋＡ、ＢおよびＣ受容体の配列は、ここに参考のために引用する、１９９４年３月１８日出願の米国特許出願０８／２１５１３９号に開示されている。次のＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡはアミノ末端フラグポリペプチドを持つｔｒｋＡ，ＢおよびＣ受容体構築物を使用して実施した。（ｉ）捕捉剤の調製実施例２に記載したようなヘルペス・シンプレックスウイルスのグリコプロテインＤからのペプチドに対してモノクローナル抗−ｇＤ（クローン５Ｂ６）を製造した。精製したストック製品は燐酸緩衝液食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４中、３．０ｍｇ／ｍＬに調製し、１．０ｍＬ量づつを−２０℃で貯蔵した。（ｉｉ）抗ホスホチロジン抗体の調製モノクローナル抗ホスホチロジン、クローン４Ｇ１０、はＵｐｓｔａｔｅ・Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社（ＵＢＩ社、Ｌａｋｅ・Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）から購入し、長鎖ビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド（Ｂｉｏｔｉｎ−Ｘ−ＮＨＳ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ・Ｏｒｇａｎｉｃｓ社、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を使用してビオチン化した。（ｉｉｉ）リガンド神経生長因子（ＮＧＦ）、ノイロトロフィン−３（ＮＴ３）、およびノイロトロフィン５（ＮＴ５）は前記報告に記載されたこれら各蛋白質の配列データを用いて組み換え技術により調製した。精製したＮＧＦ、ＮＴ３およびＮＴ５はｐＨ７．５のＰＢＳ中のストック溶液（各１８０μＭ、８．８μＭ、２６．９μＭ）として４℃で貯蔵した。（ｉｖ）ｇＤ．ｔｒｋ核酸の調製ｇＤフラグ（すなわちｇＤ．ｔｒｋ構築物）を持つ種々のｔｒｋ受容体を発現するために、種々のｔｒｋ受容体のアミノ末端に融合するｇＤのシグナルとエピトープ（Ｐａｂｏｒｓｋｙなど、前出参照）とをコードするＤＮＡ構築物を作った。これらはｔｒｋ受容体およびｇＤ配列をｐＲＫ５またはｐＲＫ７（Ｓｕｖａなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３７巻：８９３〜８９６頁［１９８７年］）に標準的な分子生物学技術を使用して挿入することによって図１２−１４に示す構築物を作製した。ｇＤ．ｔｒｋ構築物に加えて、ｇＤタグ付ｔｒｋ．ＩｇＧ融合蛋白質（すなわち、ｇＤ．ｔｒｋ．ＩｇＧ）を発現する構築物を造った。ｔｒｋ細胞外ドメインとＩｇＧ−１・ＦｃドメインとのキメラをヒトＩｇＧ−１のＦｃ領域クローン（Ａｓｈｋｅｎａｚｉなど、Ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎｓ・Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０巻：２１９〜２２７頁［１９９３年］）を作製した。さらに具体的には、ＩｇＧ−１をコードする配列の源泉は、重−軽鎖結合に関与するシステイン残基の後のＩｇＧ−１ヒンジの第一残基であるアスパラギン酸２１６に始まり（アミノ酸１１４を重鎖定常領域の第一残基とする；Ｋａｂａｔなど、「免疫学的に重要な蛋白質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ・ｏｆ・Ｐｒｏｔｅｉｎｓ・ｏｆ・Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ・Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、第４版［１９８７年］）、ＩｇＧ−１のＣＨ２およびＣＨ３・Ｆｃドメインを含み、残基４４１に終わるヒトＩｇＧ−１配列に融合した成熟ヒトＣＤ４蛋白質の残基１〜１８０から構成されるハイブリッドポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を含むＣＤ４−ＩｇＧ−１発現プラスミドｐＲＫＣＤ４２Ｆｃ₁（Ｃａｐｏｎなど、Ｎａｔｕｒｅ、３３４巻：５２５頁［１９８９年］；Ｂｙｒｎなど、Ｎａｔｕｒｅ、３４４巻：６６７頁［１９９０年］）であった。ＣＤ４コードする配列を発現プラスミドｐＲＫＣＤ４₂Ｆｃ₁から除去し、このベクターをｔｒｋ受容体をコードするＤＮＡとＩｇＧ−１のアスパルテート２１６とｔｒｋＡの４０２バリン、ｔｒｋＢのスレオニン４２２、またはｔｒｋＣのスレオニン４１３との間のスプライスで融合させた。ｇＤタグは各ｔｒｋ．ＩｇＧのアミノ末端にｇＤ．ｔｒｋ構築物でと同様な方法で付加した。（ｖ）細胞の形質転換ヒト胎児腎臓２９３細胞（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから入手）をｇＤ．ｔｒｋ．ＩｇＧをコードする核酸で燐酸カルシウム実験計画（Ｇｏｒｍａｎ、「ＤＮＡクローニング：実際的方法（ＤＮＡ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｐｒａｃｔｉｃａｌ・Ａｐｐｒｏａｃｈ）」［Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．編］、１１巻、１４３〜１９０頁、ＩＲＬ・Ｐｒｅｓｓ社、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ）を使用して一過性に形質転換した。１２時間後、形質転換した細胞を血漿不含Ｆ１２／ＤＭＥＭ５０：５０培地（Ｇｉｂｃｏ社）で３回洗浄し、次に血漿不含培地を添加して４８時間採取した。各ｇＤ．ｔｒｋ構築物を安定に発現する細胞系は、ｇＤをタグしたｔｒｋ受容体をコードするするｐＲＫプラスミドおよびＤＨＦＲをコードするプラスミドを再度燐酸カルシウム媒介形質転換法を使用してｄｐ１２．ＣＨＯ細胞に共形質転換することによって作製した。前記培地（ｇＤ．ｔｒｋ．ＩｇＧ含有）はさらに精製することなしにｇＤ．ｔｒｋ．ＩｇＧポリペプチドへのノイロトロフィン結合に及ぼすｇＤフラグポリペプチドの存在の効果を評価するための結合検定に用いた。非タグｔｒｋ．ＩｇＧポリペプチドを対照として並行して実験した。細胞上清液を含むｔｒｋ．ＩｇＧおよびｇＤタグ付ｔｒｋ．ＩｇＧは前記の通りに調製し、適当なヨード化ノイロトロフィンとの競合的置換検定に使用した。ＮＧＦをｔｒｋＡのリガンドとして使用し、ＮＴ５をｔｒｋＢのリガンドとして使用し、ＮＴ３をｔｒｋＣのリガンドとして使用した。得られた結果を次表に要約する。（ｖｉ）ＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡで使用するための形質転換細胞の選択前記実験からノイロトロフィンとそれらの受容体との間の相互作用の親和性にはアミノ末端にあるｇＤフラグポリペプチドの存在に起因する変化が観察できなかったことは明らかである。この結果に基づいて、ＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡで使用するために前記の章に記載した技術を使用してｇＤ．ｔｒｋ構築物で細胞を形質転換した。２日後、ｇＤ．ｔｒｋ構築物で形質転換したｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（１９８９年３月１５日発行、欧州特許３０７２４７号）をＧＨＴ不含培地内での生長によって選択し、２週間後、それらの表面にｇＤフラグポリペプチドを発現する細胞を選択するために、生長した細胞を５Ｂ６モノクローナルを使用するＦＡＣＳ分析で分類した。限界希釈法で接種することによってｇＤ陽性細胞をクローニングし、得られたコロニーを次にＦＡＣＳ分析（抗ｇＤ５Ｂ６モノクローナル抗体を使用する）、ノイロトロフィン結合（前記の通り）、抗ホスホチロジン抗体を使用するウエスタンブロッティングで示されるチロジン燐酸化、抗ｇＤ．５Ｂ６抗体を使用するウエスタンブロッティングによるｇＤ発現、および５Ｂ６抗体を使用する免疫細胞化学で再スクリーニングした。陽性を示したクローンを次に限界希釈法により再クローニングし、後記のＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡに付した。（ｖｉｉ）培地Ｆ１２／ＤＭＥＭ・５０：５０（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ・Ｌｉｆｅ・Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｇｒａｎｄ・Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中に細胞を生育させた。培地には１０％透析濾過ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ社、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）、２５ｍＭ−ＨＥＰＥＳおよび２ｍＭ−Ｌ−グルタミンを添加した。（ｖｉｉｉ）ＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡｇＤ．ｔｒｋで形質転換したｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（１９８９年３月１５日発行、欧州特許３０７２４７号）を平底９６穴培養プレートの各ウェル中の培地１００μＬに接種（ウェル当り５×１０⁴）し、一夜３７℃で５％ＣＯ₂中で培養した。翌朝、ウエルの上清液をデカンテーションし、紙タオルでプレートを軽く押し固めた。実験標本または組み換え精製ＮＧＦ、ＮＴ３、またはＮＴ５標準（３０００、１０００、３３３、１１１、３７、１２、４、および０ｐＭ）を含む培地１００μＬを各ウェルに添加した。細胞を３７℃で３０分間刺激し、ウェル上清液をデカンテーションし、プレートを再度軽く押し固めた。細胞を溶解し、受容体を溶解するため、細胞溶解緩衝液１００μＬを各ウェルに添加した。この細胞溶解緩衝液は５０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ社）、０．５％トリトン−Ｘ −１００（Ｇｉｂｃｏ社）、０．０１％チメロサール、３０ＫＩＵアプロチニン（ＩＣＮ・Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、Ａｕｒｏｒａ、ＯＨ）／ｍＬ、１ｍＭ −４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホン酸フッ化物塩酸塩（ＡＥＢＳＦ、ＩＣＮ・Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）、５０μＭ−ロイペプチン（ＩＣＮ・Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）、および２ｍＭ−オルトバナジン酸ナトリウム（Ｎａ₃ＶＯ₄，Ｓｉｇｍａ・Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、ｐＨ７．５から構成した。次にプレートをプレート振盪機（Ｂｅｌｌｃｏ・Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、ＮＪ）上、室温で６０分間穏やかに振盪した。細胞が溶解したら、５Ｂ６モノクローナル抗ｇＤ抗体（５０ｍＭ−炭酸緩衝液中０．５μｇ／ｍＬ、ｐＨ９．６、１００μＬ／ウェル）で一夜４℃で被覆したＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ・Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｉｎｔｅｒ・Ｍｅｄ社、デンマーク）をデカンテーションし、紙タオルで押し固め、ブロック緩衝液［０．５％ＢＳＡ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社、Ｐｕｒｃｈａｓｅ、ＮＹ）および０．０１％チメロサール含有ＰＢＳ］１５０μＬ／ウェルで穏やかに振盪しながら室温で６０分間ブロックした。６０分後、抗ｇＤ・５Ｂ６被覆プレートを自動プレート洗浄器（ＳｃａｎＷａｓｈｅｒ３００、Ｓｋａｔｒｏｎ・Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）を用いて洗浄緩衝液（０．０５％トゥイーン２０および０．０１％チメロサール含有ＰＢＳ）で６回洗浄した。細胞培養マイクロタイターウェルからの溶解ｇＤ．ｔｒｋ含有細胞溶解物（８５μ Ｌ／ウェル）を抗ｇＤ５Ｂ６で被覆し、ブロックしたＥＬＩＳＡウェルに移し、穏やかに撹拌しながら室温で２時間インキュベーションした。非結合ｇＤ．ｔｒｋを洗浄緩衝液で洗浄して除去し、希釈緩衝液（０．５％ＢＳＡ、０．０５％トゥイーン２０、５ｍＭ−ＥＤＴＡ、および０．０１％チメロサール含有ＰＢＳ）で１：２０００、すなわち４００ｐｇ／ｍＬ、に希釈したビオチン化４Ｇ１０（抗ホスホチロジン）１００μＬを各ウェルに添加した。室温で２時間インキュベーションした後、プレートを洗浄し、希釈緩衝液で１：１００００に希釈したＨＲＰＯ結合ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｓ．Ｓａｎ・Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを穏やかに振盪しながら室温で３０分間インキュベーションした。遊離のアビジン結合体を洗い去り、新しく調製した基質溶液（テトラメチルベンジジン、２成分基質キット、Ｋｉｒｋｅｇａａｄ・ａｎｄ・Ｐｅｒｒｙ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）１００μＬを各ウェルに加えた。反応を１０分間進行させ、１．０Ｍ−Ｈ₃ＰＯ₄を１００μＬ／ウェル添加して発色を止めた。Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ・Ｃｅｎｔｒｉｓ６５０（Ａｐｐｌｅ・Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ社、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、ＣＡ）およびＤｅｌｔａＳｏｆｔソフトウエア（ＢｉｏＭｅｔａｌｌｉｃｓ社、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）の制御下にｖｍａｘプレート読取器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｄｅｖｉｃｅｓ社、Ｐａｌｏ・Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して、参照波長を６５０ｎｍとする４５０ｎｍの吸光度（ＡＢＳ_450/650）を読み取った。図１５Ａ〜１５Ｃに示す標準曲線はｇＤ．ｔｒｋ形質転換ＣＨＯ細胞を３０００、１０００、３３３、１１１、３７、１２、４または０ｐＭのＮＧＦ、ＮＴ３またはＮＴ５で刺激し、ｐＭ−ノイロトロフィン対平均ＡＢＳ_450/650±標準偏差として表示し、ＤｅｌｔａＳｏｆｔプログラムを用いて作成した。標本濃度は吸光度をその標準曲線に内挿して得られ、ｐＭ−ノイロトロフィン活性として表示した。この実施例が提示する結果はＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡがアミノ末端フラグポリペプチド、たとえばｇＤ．ｔｒｋ受容体構築物など、を持つ受容体構築物のリガンド活性化を検定するために有用な方法であることを証明する。チロジン燐酸化として受容体活性化水準は容易に定量化され、所与リガンドのＥＣ₅₀は容易に測定される。実施例４ＭＰＬ／Ｒｓｅキメラ受容体のＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡヒトＭＰＬ受容体はＶｉｇｏｎなど、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ、８９巻：５６４０〜５６４４頁（１９９２年）に開示されている。ＭＰＬ受容体のＥＣＤとカルボキシル末端フラグポリペプチド（すなわち、Ｒｓｅ．ｇＤ、実施例２参照）を持つＲｓｅのＴＭおよびＩＣＤ（Ｍａｒｋなど、前出）とを含むキメラ受容体の一つを本発明に記載するＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡに付した。この実験操作を以下に略記する。図１６および図１７も参照。（ｉ）捕捉剤の製造ヘルペスシンプレックスウイルスのグリコプロテインＤ（Ｐａｂｏｒｓｋｙなど、Ｐｒｏｔｅｉｎ・Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３（６）巻：５４７〜５５３頁［１９９０年］）からのペプチドに対してモノクローナル抗ｇＤ（クローン５Ｂ６）を作製した。精製ストック製品は燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４で３．０ｍｇ／ｍＬに調整し、１．０ｍＬ量を−２０℃で貯蔵した。（ｉｉ）抗ホスホチロジン抗体の調製モノクローナル抗ホスホチロジン、クローン４Ｇ１０、はＵＢＩ社（Ｌａｋｅ・Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）から購入し、長鎖ビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド（Ｂｉｏｔｉｎ−Ｘ−ＮＨＳ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ・Ｏｒｇａｎｉｃｓ社、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を使用してビオチン化した。（ｉｉｉ）リガンドＭＰＬリガンド［ｄｅ・Ｓａｕｖａｇｅなど、Ｎａｔｕｒｅ、３６９巻：５３３〜５３８頁（１９９４年）］を組み換え技術で調製した。この精製ＭＰＬリガンドはストック溶液として４℃で貯蔵した。（ｉｖ）ＭＰＬ／Ｒｓｅ．ｇＤ核酸の調製前記実施例２に記載した通りに製造した発現プラスミドｐＳＶ．ＩＤ．Ｒｓｅ．ｇＤをＲｓｅ．ｇＤの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン（アミノ酸４２９〜９１１）に融合したヒトＭＰＬのＥＣＤコード配列（アミノ酸１〜４９１）を含むプラスミドｐＳＶ．ＩＤ．Ｍ．ｔｍＲｄ６を製造するように修飾した。合成オリゴヌクレオチドを使用してヒトＭＰＬの細胞内ドメイン部分のコード配列をＲｓｅコード配列部分にＭａｒｋなどがＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７巻：２６１６６〜２６１７１頁（１９９２年）に記載したような２段階ＰＣＲクローニング反応で結合した。第一ＰＣＲ反応で使用したプライマーはＭＰＬのｃＤＮＡ鋳型についてＭ１（５’−ＴＣＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴＴＴＡＣＡＧ−配列番号１２）およびＭ２（５’−ＣＡＧＧＴＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＣＧＧＴＣＴＣＧＧＴ−配列番号１３）であり、ＲｓｅのｃＤＮＡ鋳型についてＲ１（５’−ＧＧＧＣＣＡＴＧＡＣＡＣＴＧＴＣＡＡ−配列番号１４）およびＲ２（５’−ＧＡＣＣＧＣＣＡＣＣＧＡＧＡＣＣＧＣＣＴＧＧＴＧＧＧＴＡＣＣＴＧＴＧＧＴＣＣＴＴ −配列番号１５）であった。この融合結合部のＰｖｕＩＩ−ＳｍａＩ部分を使用して全長キメラ受容体を構築した。（ｖ）細胞の形質転換ｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（１９８９年３月１５日発行、欧州特許３０７２４７号）にプラスミド骨格中の独特なＮｏｔＩ部位でリネアライズしておいたｐＳＶ．ＩＤ．Ｍ．ｔｍＲｄ６を電気穿孔した。フェノール／クロロホルムで抽出後に、ＤＮＡをエタノール沈降し、１／１０トリスＥＤＴＡ２０μＬ中に再懸濁した。次にＤＮＡ１０μｇをＰＢＳ１ｍＬ中のＣＨＯ．ｄｐ１２細胞１０⁷個とともに氷上で１０分間インキュベーションした後に、４００ボルトおよび３３０μｆで電気穿孔した。細胞を氷に戻し、１０分後に非選択培地に接種した。２４時間後に、細胞にヌクレオシド不含培地を補給し、安定なＤＨＦＲ+クローンを選択した。（ｖｉ）ＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡで使用する形質転換細胞の選択ＭＰＬ／Ｒｓｅ．ｇＤを発現するクローンをｇＤエピトープのタグを検出する抗体５Ｂ６を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分画後に全細胞溶解物のウエスタンブロットにより認定した。（ｖｉｉ）培地Ｆ１２／ＤＭＥＭ・５０：５０（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ・Ｌｉｆｅ・Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｇｒａｎｄ・Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中に細胞を生育させた。培地には１０％透析濾過ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ社、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）、２５ｍＭ−ＨＥＰＥＳおよび２ｍＭ−Ｌ−グルタミンを添加した。（ｖｉｉｉ）ＫＩＲＡ・ＥＬＩＳＡＭＰＬ／Ｒｓｅ．ｇＤ．形質転換ＣＨＯ細胞（ウェル当り３×１０⁴個）を平底９６穴培養プレートのウェル中の培地１００μＬに添加し、一夜３７℃で５％ＣＯ₂中で培養した。翌朝、ウェルの上清液をデカンテーションし、紙タオルでプレートを軽く押し固めた。次に実験標本か、ＭＰＬリガンド２００、５０、１２．５、３．１２、０．７８、０．１９、０．０４８または０ｎｇ／ｍＬかのいずれかを含む培地５０μＬを各ウェルに添加した。細胞を３７℃で３０分間刺激し、ウェル上清液をデカンテーションし、プレートを再度軽く押し固めた。細胞を溶解し、キメラ受容体を溶解するために、細胞溶解緩衝液１００μＬを各ウェルに添加した。この細胞溶解緩衝液は５０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ社）、０．５％トリトン−Ｘ−１００（Ｇｉｂｃｏ社）、０．０１％チメロサール、３０ＫＩＵアプロチニン（ＩＣＮ・Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、Ａｕｒｏｒａ、ＯＨ）／ｍＬ、１ｍＭ−４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホン酸フッ化物塩酸塩（ＡＥＢＳＦ、ＩＣＮ・Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）、５０μＭ−ロイペプチン（ＩＣＮ・Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）、および２ｍＭ−オルトバナジン酸ナトリウム（Ｎａ₃ＶＯ₄，Ｓｉｇｍａ・Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、から構成した。次にプレートをプレート振盪機（Ｂｅｌｌｃｏ・Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、ＮＪ）上、室温で６０分間穏やかに振盪した。細胞が溶解したら、５Ｂ６モノクローナル抗ｇＤ抗体（５０ｍＭ−炭酸緩衝液中５．０μｇ／ｍＬ、ｐＨ９．６、１００μＬ／ウェル）で一夜４℃で被覆したＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ・Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｉｎｔｅｒ・Ｍｅｄ社、デンマーク）をデカンテーションし、紙タオルで押し固め、ブロック緩衝液［０．５％ＢＳＡ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社、Ｐｕｒｃｈａｓｅ、ＮＹ）および０．０１％チメロサール含有ＰＢＳ］１５０μＬ／ウェルで穏やかに振盪しながら室温で６０分間ブロックした。６０分後、抗ｇＤ５Ｂ６被覆プレートを自動プレート洗浄器（ＳｃａｎＷａｓｈｅｒ３００、Ｓｋａｔｒｏｎ・Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）を使用して洗浄緩衝液（０．０５％トゥイーン２０および０．０１％チメロサール含有ＰＢＳ）で６回洗浄した。細胞培養マイクロタイターウェルからの溶解したＭＰＬ／Ｒｓｅ．ｇＤ含有細胞溶解物（８５μＬ／ウェル）を抗ｇＤ５Ｂ６で被覆し、ブロックしたＥＬＩＳＡウェルに移し、穏やかに撹拌しながら室温で２時間インキュベーションした。非結合ＭＰＬ／Ｒｓｅ．ｇＤ受容体を洗浄緩衝液で洗浄して除去し、希釈緩衝液（０．５％ＢＳＡ、０.０５％トゥイーン２０、５ｍＭ−ＥＤＴＡ、および０．０１％チメロサール含有ＰＢＳ）で１：１８０００、すなわち５６ｎｇ／ｍＬ、に希釈したビオチン化４Ｇ１０（抗ホスホチロジン）１００μＬを各ウェルに添加した。室温で２時間インキュベーションした後、プレートを洗浄し、希釈緩衝液で１：６００００に希釈したＨＲＰＯ結合ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｓ．Ｓａｎ・Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）１００μ Ｌを各ウェルに添加した。プレートを穏やかに振盪しながら室温で３０分間インキュベーションした。遊離のアビジン結合体を洗い去り、新たに調製した基質溶液（テトラメチルベンジジン［ＴＭＢ］、２成分基質キット、Ｋｉｒｋｅｇａａｄ・ａｎｄ・Ｐｅｒｒｙ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）１００μＬを各ウェルに添加した。反応を１０分間進行させ、１．０Ｍ−Ｈ₃ＰＯ₄１００μＬ／ウェルを添加して発色を止めた。Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ・Ｃｅｎｔｒｉｓ６５０（Ａｐｐｌｅ・Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ社、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、ＣＡ）およびＤｅｌｔａＳｏｆｔソフトウエア（ＢｉｏＭｅｔａｌｌｉｃｓ社、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）の制御下にｖｍａｘプレート読取器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｄｅｖｉｃｅｓ社、Ｐａｌｏ・Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して、参照波長を６５０ｎｍとする４５０ｎｍの吸光度（ＡＢＳ_450/650）を読み取った。この結果はＭＰＬリガンドが、濃度依存的におよびリガンド特異的にＭＰＬ／Ｒｓｅ．ｇＤキメラ受容体を活性化することができることを証明した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 Ｙ 33/573 0276−2Ｊ 33/573 Ａ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号０８／２８６，３０５ (32)優先日 1994年８月５日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者マーク，メラニー・アールアメリカ合衆国カリフォルニア94010、バーリンゲイム、ビー・チャラ・ビスタ・アベニュー 958番 (72)発明者サディック，マイケル・ダニエルアメリカ合衆国カリフォルニア94530、エル・セリット、アルベマール・ストリート 610番 (72)発明者ウォン，ウェイ・リー・タンアメリカ合衆国カリフォルニア94022、ロス・アルトス・ヒルズ、アリック・レーン 26333番【要約の続き】酸化された残基を同定する、標識された抗ホスホチロシン抗体に接触させる。(h) 捕獲された受容体または受容体構築物への抗ホスホチロシン抗体の結合を測定する。

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の工程を含んでなるチロシンキナーゼ受容体の自己リン酸化測定方法： (a) 第１固相を真核細胞の均一な集団で被覆して、細胞を第１固相に付着させ（細胞はフラグポリペプチドおよびチロシンキナーゼ受容体を含んでなる受容体構築物を細胞膜に有する）； (b) 付着している細胞を分析物に接触させ； (c) 付着している細胞を溶解し、それによって細胞溶解物を放出させ、 (d) フラグポリペプチドに特異的に結合する捕獲剤で第２固相を被覆して、捕獲剤を第２固相に付着させ； (e) 工程(c)で得られた細胞溶解物に、付着している捕獲剤を接触させて、受容体構築物を第２固相に付着させ； (f) 非結合細胞溶解物を除去するため第２固相を洗浄し； (g) 付着している受容体構築物を、チロシンキナーゼ受容体中のリン酸化したチロシン残基を同定する抗ホスホチロシン抗体に接触させ；そして (h) 付着している受容体構築物への抗ホスホチロシン抗体の結合を測定する。２．工程(a)の前に細胞を受容体構築物をコードする核酸で形質転換する請求項１に記載の方法。３．細胞が哺乳動物細胞系を含んでなる請求項１に記載の方法。４．細胞が付着性である請求項１に記載の方法。５．捕獲剤が捕獲抗体を含んでなる請求項１に記載の方法。６．第１固相が第１アッセイプレートのウエルを含んでなる請求項１に記載の方法。７．第１アッセイプレートがマイクロタイタープレートである請求項６に記載の方法。８．約１×１０⁴〜３×１０⁵の細胞を工程(a)でウエルに加える請求項６に記載の方法。９．第２固相が第２アッセイプレートのウエルを含んでなる請求項１に記載の方法。１０．工程(e)の前に細胞溶解物を濃縮または清澄化しない請求項１に記載の方法。１１．工程(c)が第１アッセイプレートのウエルに溶解緩衝液を加え、第１アッセイプレートを緩やかに撹拌することを含んでなる請求項６に記載の方法。１２．溶解緩衝液が溶解用界面活性剤を含んでなる請求項１１に記載の方法。１３．抗ホスホチロシン抗体が標識されている請求項１に記載の方法。１４．標識が発色試薬にさらされる酵素を含んでなり、発色試薬の色変化を工程 (h)で測定する請求項１３に記載の方法。１５．フラグポリペプチドがチロシンキナーゼ受容体のアミノ末端に融合している請求項１に記載の方法。１６．チロシンキナーゼ受容体がtrkＡ受容体、trkＢ受容体、またはtrkＣ受容体である請求項１５に記載の方法。１７．フラグポリペプチドが、チロシンキナーゼ受容体のカルボキシ末端に融合している請求項１に記載の方法。１８．チロシンキナーゼ受容体がＲse受容体である請求項１７に記載の方法。１９．受容体構築物が問題の受容体の細胞外ドメインとＲse受容体の細胞内ドメインを含んでなる請求項１７に記載の方法。２０．問題の受容体がＭＰＬ受容体である請求項１９に記載の方法。２１．受容体構築物がＲse受容体の膜貫通ドメインを更に含んでなり、フラグポリペプチドがgＤポリペプチドを含んでなる請求項２０に記載の方法。２２．分析物がチロシンキナーゼ受容体に対するアゴニストを含んでなる請求項１に記載の方法。２３．分析物がチロシンキナーゼ受容体に対するアンタゴニストを含んでなる請求項１に記載の方法。２４．アゴニストによるチロシンキナーゼ受容体への結合または活性化をアンタゴニストが競合的に阻害し、工程(b)の後に付着細胞をアゴニストに接触させる工程が続く、請求項２３に記載の方法。２５．分析物が、受容体に対するアンタゴニストおよびアゴニストを含んでなる組成物であり、検定法がアゴニストに結合するアンタゴニストの能力を測定し、それによってアゴニストによるチロシンキナーゼ受容体の活性化を減少させる請求項１に記載の方法。２６．工程(d)の後にブロック緩衝液を第２固相に加える請求項１に記載の方法。２７．以下の工程を含んでなるチロシンキナーゼ受容体の自己リン酸化を測定する方法： (a) 第１アッセイプレートのウエルを付着性細胞の均一な集団で被覆して、細胞をウエルに付着させ（細胞は細胞膜に位置するチロシンキナーゼ受容体を有する）; (b) 付着している細胞を分析物に接触させ； (c) 付着している細胞を溶解して、それによって細胞から細胞溶解物を放出し; (d) チロシンキナーゼ受容体に特異的に結合する捕獲剤で第２アッセイプレートのウエルを被覆して、捕獲剤をウエルに付着させ； (e) 付着している捕獲剤に、工程(c)で得られた細胞溶解物を接触させて、チロシンキナーゼ受容体をウエルに付着させ； (f) 非結合の細胞溶解物を除去するためウエルを洗浄し； (g) 付着しているチロシンキナーゼ受容体を、チロシンキナーゼ受容体中のリン酸化チロシン残基に選択的に結合する抗ホスホチロシン抗体に接触させ； (h) 付着しているチロシンキナーゼ受容体への抗ホスホチロシン抗体の結合を測定する。２８．チロシンキナーゼ受容体がＨＥＲ２受容体を含んでなる請求項２７に記載の方法。２９．Ｒse受容体の細胞内ドメインのカルボキシル末端に融合したフラグポリペプチドを含んでなるポリペプチド。３０．Ｒse受容体の膜貫通ドメインをさらに含んでなる請求項２９に記載のポリペプチド。３１．Ｒse受容体以外の受容体プロテインチロシンキナーゼの細胞外ドメインをさらに含んでなる請求項３０に記載のポリペプチド。３２．フラグポリペプチドがgＤフラグを含んでなる請求項２９に記載のポリペプチド。３３．フラグポリペプチドに特異的に結合する捕獲剤で被覆された固相を含んでなるキット。３４．固相がマイクロタイタープレートのウエルを含んでなる請求項３３に記載のキット。３５．標識された抗ホスホチロシン抗体をさらに含んでなる請求項３３に記載のキット。３６．標識が酵素を含んでなる請求項３５に記載のキット。３７．受容体構築物をコードする核酸で形質転換された細胞をさらに含んでなる請求項３３に記載のキット。３８．以下の工程を含んでなるキナーゼのリン酸化を測定する検定法： (a) 真核細胞の均一な集団で第１固相を被覆して、細胞を第１固相に付着させ（細胞はフラグポリペプチドおよびキナーゼを含んでなるキナーゼ構築物を含んでなり）; (b) 分析物に、付着している細胞を接触させ； (c) 付着している細胞を溶解し、それによって細胞から細胞溶解物を放出させ ; (d) フラグポリペプチドに特異的に結合する捕獲剤で第２固相を被覆して、捕獲剤を第２固相に付着させ； (e) 工程(c)で得られた細胞溶解物に、付着している捕獲剤を接触させて、キナーゼ構築物を第２固相に付着させ； (f) 非結合細胞溶解物を除去するため第２固相を洗浄し； (g) キナーゼ構築物中のリン酸化された残基を同定する抗体に、付着しているキナーゼ構築物を接触させ；そして (h) 付着しているキナーゼ構築物への抗体の結合を測定する。３９．キナーゼが受容体である請求項３８に記載の検定法。４０．キナーゼがセリン−スレオニンキナーゼである請求項３８に記載の検定法。４１．ホスファターゼ活性を測定する請求項３８に記載の検定法。４２．細胞がさらにホスファターゼを含み、検定法が工程(c)の前に真核細胞をホスファターゼ阻害剤に接触させる工程をさらに含んでなる請求項４１に記載の検定法。４３．付着しているキナーゼ構築物をホスファターゼに接触させ、非結合ホスファターゼを除去するため第２固相を次に洗浄する、工程(f)と(g)との間の工程をさらに含んでなる請求項４１に記載の検定法。