JPH09117285A - リガンド、そのアンタゴニストまたはアゴニストの効率的な測定のためのハイブリッドリセプターをコードする核酸 - Google Patents

リガンド、そのアンタゴニストまたはアゴニストの効率的な測定のためのハイブリッドリセプターをコードする核酸

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JPH09117285A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 リガンドのアゴニストまたはアンタゴニスト
としての結合特性についての効率的な測定のためのハイ
ブリッドリセプターをコードする核酸の提供。 【解決手段】 (a)リセプターのリガンド結合領域をコ
ードしている配列を有する核酸と、(b)該リガンド結合
領域に対しヘテロローガスなリポーターポリペプチドを
コードしている配列を有する核酸とを結合させる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、通常インビボにお
いてリセプター(受容体)と相互作用するリガンドの機能
をまねるようにしてあるいは該機能に拮抗するようにし
て、該リセプターと結合する能力について、候補薬物を
スクリーニングする方法に関するものである。また、本
発明はリガンドの機能的な分析法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】発明の構成および目的 リセプターは細胞表面に存在し、シグナル伝達機能を有
するタンパク質性の巨大分子と定義される。細胞膜の外
表面には多くのリセプターが存在する。
【０００３】これらの細胞表面リセプターは細胞外領域
と細胞質(内)領域とを有しており、細胞外領域と他の細
胞の物質とは特異的に結合することができ、この細胞外
領域による物質への結合作用の結果、細胞質領域と他の
細胞分子とが相互作用する。リセプターによって結合さ
れる物質はリガンドと呼称されるが、この言葉は、その
相手であるリセプターとの関連においてのみ、明確に定
義されるものである。「リガンド」という用語は、その物
質が、リセプターがリガンドの存在に関する情報を標的
分子に伝えるような方法で、該リセプターと結合し、開
裂し、あるいはリセプターと相互作用するということを
除けば、特定の分子量、他の構造上の特徴または構成上
の特徴を暗示するものではない。言い換えると、リセプ
ターと結合し得る物質の全てがリガンドであるとは限ら
ないが、リガンドは全てリセプターと結合し得る。リセ
プターには、免疫グロブリンの様な物質は含まれない。
【０００４】リセプターは、一般に、構造上３領域に分
けられる。リセプターを細胞表面にうめ込むのに関与し
ていると考えられる約２０〜２５残基からなる疎水性の
高い領域は、そのアミノ末端およびカルボキシ末端で、
それぞれ細胞外環境および細胞質領域(細胞内環境)へ伸
びている領域と、その境を接している。この細胞外領域
にはリガンド結合領域が含まれている。細胞質領域には
細胞質に変化を起こさせる領域が含まれている。一般
に、細胞質領域には、リガンドの結合により引き起こさ
れるリセプターの凝集または立体配座の変化により活性
化される酵素機能が含まれている。
【０００５】リセプターは、様々な言葉で表わされる活
性化またはシグナル導入(トランスダクション)のプロセ
スを通して機能すると考えられる。リガンドは、細胞質
内におけるリセプター分子の立体配座を変化させるよう
な方法で細胞外のリガンド結合領域と結合する。この立
体配座の変化(活性化と呼ばれる)により、リセプターの
細胞質成分に対する作用が変化する。リセプターの活性
化によってもたらされる変化には、リセプターの酵素的
作用の変化または発生が含まれる。
【０００６】近年、製薬業界においては、疾病または傷
害におけるリセプターの役割に関する研究に重点が置か
れ、リセプターと結合し得る、一般に低分子量の物質で
ある薬物の製造に向けて研究がなされてきた。初期のス
クリーニングで同定された薬物は、生体内または体外移
植組織中で所望の活性について試験される。結局、従来
の方法では大規模なスクリーニングは不可能であった。
即ち、標的であるリセプターを含有する組織標本または
単離細胞(例えば心動脈組織)の取得には多額を要し、こ
れらは限られた量しか存在せず、また、これらを機能的
に生存可能な状態に維持することが困難である。その
上、組織標本に対して候補薬物を確実に、かつ再現性よ
く投与することはしばしば困難である。組織培養中で一
次外移植組織(エクスプラント)を用いるスクリーニング
アッセイは、組織標本を用いて行なわれるアッセイ(分
析)よりも大規模に行なわれ得る。しかしながら、生理
学的な作用を分析することはより困難であり、その様な
分析は、培養培地や培養条件等、多くの干渉源による干
渉を受ける。最後に、天然物質から単離したリセプター
を用いる分析法には、リセプターが自然に変化し得るこ
と、および適当な天然の供給源が常に手に入るとは限ら
ないという不都合がある。本発明は、リガンドの結合の
みならず、リガンドのアゴニストまたは拮抗物質として
の結合特性を決定するための、大規模な実施が可能であ
り、再現容易で簡便な分析システムを提供することを目
的とするものである。
【０００７】同様に、有意義な臨床診断は、しばしば不
活性形のリガンド(例えばリガンドの活性を変化させた
り、消滅させるような、試験対象の有する酵素作用また
は他の作用の下におかれたリガンド)の干渉を受けるこ
となく、生物学的に活性なリガンドを分析することに依
存している。被検試料中のリガンドの測定には、イムノ
アッセイが広範囲に用いられている。しかしながら、活
性形のリガンドと不活性形のリガンドとを識別し得る抗
体の同定は、往々にして極めて困難である。リセプター
は、アナライト結合物質としてまれに抗体の代わりに用
いられていた。しかしながら、リセプターと結合する物
質の全てが、必ずしもリセプターの活性を誘発する、即
ち、生物学的に活性であるとは限らない。本発明は、臨
床的な被検試料中に含まれているリガンドであって、そ
のもののリセプターのシグナル導入を誘発し、あるいは
阻害する作用を有するリガンドの同定法を提供するもの
である。
【０００８】少くともいくらかの、インビトロで測定可
能なリガンド相互作用依存性の既知の活性を有する多数
のリセプターが同定されている。例えば、ＥＧＦが表皮
成長因子受容体に結合することで、リセプターのホスホ
トランスフェラーゼ領域が刺激され、その細胞内の細胞
質領域に存在している幾つかの標的アミノ酸残基がりん
酸化される(自己りん酸化、オートホスホリレーション
と称される過程)。また、リセプターは、そのホスホト
ランスフェラーゼ活性部位が位置している領域に結合す
る、抗体または特異的な細胞質内の基質ポリペプチド類
をりん酸化することも知られている。不運にも、他のリ
セプターは、それらが高い親和性をもってリガンドと結
合することが分かっているにもかかわらず、既知のリガ
ンド依存性酵素活性を有しないか、あるいはそれらの活
性が余りにも低く、リガンド依存性の活性化の定量分析
が困難となっている。治療目的にとっては、その様な未
解明のリセプターとリガンドとの相互作用に拮抗した
り、それを促進することが望ましいが、関連組織が存在
しない条件下、また幾つかの場合には、無傷の生物体の
不在下では、ある候補薬物とリセプターとの結合が、単
なる機能の中和の状態であるか否かを決定する方法も、
候補薬物がアゴニストまたは拮抗体のいずれかとして結
合していることを決定する方法も得られていない。従っ
て本発明は、あるリガンドのリセプターが既知のシグナ
ル導入特性を示さない場合に、候補薬物を、リガンドに
対するアゴニストまたは拮抗体活性に関してスクリーニ
ングする方法を提供することを目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】要約 これらの本発明の目的は、ヘテロローガス(異種)なリポ
ーターポリペプチドであって、リセプターのリガンド結
合領域にリガンドあるいはリガンドのアゴニストまたは
アンタゴニスト(拮抗体)が結合した場合に、コンホメー
ション(立体配座)または機能面で分析可能な変化を生じ
得るリポーターポリペプチドと、該リセプターのリガン
ド結合領域とが融合してなる新規なリセプターハイブリ
ッドを用いることにより達成された。
【００１０】ある疾病または傷が、特定のリセプターに
作用するリガンドに起因するものである場合、その危険
にさらされているリセプターに対するリガンドの作用に
拮抗し得る物質、即ち、リガンド拮抗体(アンタゴニス
ト)をみつけることが目的となろう。他方、リガンド活
性の不足によって特徴づけられる臨床症状のモデル治療
は、不充分なリガンドまたはリガンド欠損を増強または
補う薬物、即ち、リガンドアゴニストで構成されること
になる。
【００１１】本発明のハイブリッドリセプターは、リセ
プターに対して活性なアゴニスト薬物をみつけるための
スクリーニング法に有用である。ハイブリッドリセプタ
ーと候補薬物とをインキュベートし、ヘテロローガスな
リポーターポリペプチドによるシグナルの生成を分析す
る。一般に、しかし必然的ではないが、リポーターポリ
ペプチドによって生成されるシグナルは、リポーターポ
リペプチドの酵素機能の活性化または刺激作用として測
定される。候補薬物のアゴニスト活性の定量を欲しない
ならば、既知量のリガンドを有するスタンダードを含有
させる必要はない。実際、インビボでリセプターの活性
を調整するリガンドは全く不明であることもある。本発
明の分析系の１つの利点は、アゴニスト薬物を同定する
のに、リセプターに対するリガンドも、リセプターのイ
ンビボにおけるシグナル導入機構もわかっていることを
要しないという点にある。
【００１２】本発明のハイブリッドリセプターは、アゴ
ニスト薬物をスクリーニングすると同様の方法で、被検
試料中の生物学的なリガンドの量を測定するのに用いる
ことができる。この用途は、既知のリガンドの測定を目
的としているので、既知量のリガンドを用いて標準曲線
を調製し、被検試料における結果と比較する。
【００１３】拮抗(アンタゴニスト)薬物候補の選択も、
ハイブリッドリセプターを既知のリセプターアゴニスト
とインキュベートすることを除き、アゴニストの同定に
用いた方法と同様の分析法によって行われる。アゴニス
ト(薬物または正常な生体内リガンド)を、リセプターと
候補薬物との接触の前、あるいは、好ましくは同時に、
リセプターと共にインキュベートする。拮抗体(アンタ
ゴニスト)活性は、リポーターポリペプチドの変化に基
づき測定されるアゴニスト活性またはリガンド活性の変
位の関数である。
【００１４】本発明のハイブリッドリセプターは、リガ
ンド−リセプター相互作用を分析するための、普遍的で
ポータブル(持ち運び可能)な分析系を得ることを可能な
らしめた点で、特に有益である。本発明においては、ポ
ータブルなリポーターポリペプチドとして第１リセプタ
ーの細胞質内領域を選択しようとするものである。この
領域を他のリセプターの細胞質内領域で置換して本発明
のハイブリッドリセプターを調製する。第１リセプター
に有用な分析系(例、自己りん酸化分析)はその第１リセ
プターの細胞質領域を含む他の全てのハイブリッドリセ
プターに用いることができる。
【００１５】図面の簡単な記述 図１および図２は、インシュリンリセプターと表皮性成
長因子のリセプターとのハイブリッドを発現させるのに
用いられるプラスミドの構成を示す図である。種々のリ
セプター突然変異体をコードしている領域は陰影を付し
た棒で示されている (cＤＮＡ)。ＳＶ４０初期プロモー
ター配列は太く黒い矢印で示されており、ポリＡ付加部
位には印が施されている。プラスミドの組立てに用いた
ジヒドロ葉酸還元酵素(ＤＨＦＲ)暗号配列[シモンセン
(Ｓimonsen)およびレビンソン(Ｌevinson)、１９８３、
「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミイ・オブ・サイエンスィズ(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓ
ci．)ＵＳＡ」 ８０:２４６５−２４９９]と制限部位と
が示されている。両cＤＮＡの発現は、シミアン(Ｓimia
n)ウィルス(ＳＶ)４０の初期領域のプロモーター配列、
およびＢ型肝炎ウィルスの表面抗原をコードしている
３'非翻訳配列[クローレィら(Ｃrowley)、１９８３、
「モレキュラー・セルラー・バイオロジィ[Ｍol．Ｃel
l．Ｂiol．]３:４４−４５]によってコントロールされ
る。複製起源とアンピシリン耐性遺伝子とを含有してい
る大腸菌プラスミドpＭＬ[哺乳類細胞内で用いるのに適
したpＢＲ３２２誘導体;ラスキイ(Ｌusky)およびボツチ
ャン(Ｂotchan)１９８１、「ネイチャー(Ｎature)」２９
３:７９]の配列を、大腸菌内でプラスミドを複製させる
ために存在させた。
【００１６】図２はインシュリン・リセプター(ＨＩ
Ｒ)、ＥＧＦリセプター(ＨＥＲ)およびそれらから調製
されたハイブリッドリセプターであるＩＥＲおよびＩα
ＥＲを比較した模式図である。ヒトＥＧＦリセプター
(ＨＥＲ)、ヒトインシュリンリセプター(ＨＩＲ)、イン
シュリンリセプターとＥＧＦリセプターのキメラ(ＩＥ
Ｒ)、およびインシュリン−α−サブユニットリセプタ
ーとＥＧＦリセプターのキメラ(ＩαＥＲ)を平行に並
べ、ＨＩＲα配列(α)の暗号領域を点描を施したボック
ス、ＨＩＲβ配列のそれを斜線で陰影をつけたボック
ス、そして、ＨＥＲ配列のそれを空白ボックスで示し
た。暗号領域はトランスメンブラン領域と一列に並んで
いる(等尺で描かれていない)。タンパク質のシグナル配
列の暗号セグメントは(Ｓ)で表示されており、前駆体開
裂部位は縦線で示されている。ヘテロローガスなリセプ
ターのcＤＮＡの連結部はジグザグラインで示されてお
り、この連結に用いられた合成オリゴヌクレオチドは黒
色の棒で示されている。組立てに関連したＤＮＡ制限エ
ンドヌクレアーゼ開裂部位はcＤＮＡ配列の上方に示さ
れている。
【００１７】図３は、対照である発現ベクターでトラン
スフェクトされたＣＯＳ−７細胞と比較して、図１のc
ＤＮＡ組立て物でトランスフェクトされたＣＯＳ−７細
胞では、125Ｉインシュリンと結合したＣＯＳ−７細胞
が多いことを示す図である。
【００１８】図４および図５は、実施例に示す如く、様
々な形質転換細胞および対照細胞から得られた自己りん
酸化産物の界面活性剤処理によるリゼイトの適当な抗体
による免疫沈降物をＳＤＳ ＰＡＧＥ還元ゲル電気泳動
にかけて得た泳動パターンを示す図である。(＋)および
(−)ゲルはインシュリンまたは(Ａ４３１の場合には）
ＥＧＦ−処置リセプターを表わす。側部の数字はマーカ
ー分子量である。図４のａは対照であるｍｏｃｋ−形質
転換細胞と組換え形質転換細胞の抗−ＨＥＲ−免疫沈降
自己りん酸化産物を示す。この図は、組換え体内でイン
シュリン−ＥＧＦハイブリッドリセプター組立て物が発
現したことを示している。
【００１９】図４のｂは、インシュリンリセプターの全
細胞外領域を含有するハイブリッドの自己りん酸化がイ
ンシュリンによって活性化されることを示している。図
５のｃは、インシュリンにより活性化されたＩＥＲリセ
プターの自己りん酸化の動力学を示す図である。この図
から、自己りん酸化は、りん酸化の反応時間に依存して
いることが分る。
【００２０】図５のｄはインシュリンによる活性化の後
におけるＩＥＲリセプターのＳＤＳ−ＰＡＧＥの移動度
の変化を示す図である。
【００２１】図６は表皮性成長因子の細胞外領域と、リ
ポーター分子として作用するerbＢ腫瘍因子のフラグメ
ントとを含有するハイブリッドリセプターである、ＨＥ
Ｒ−erbＢの構造を示す図である。
【００２２】図７は、リガンド(ＥＧＦ)の存在下(＋)ま
たは非存在下(−)における腫瘍因子−リセプターのハイ
ブリッド組立物の自己りん酸化を示すゲル電気泳動を表
わす図である。
【００２３】詳しい記述 本明細書に記載した方法の中心はハイブリッドリセプタ
ーである。これは、基本的に、リガンド結合領域とリポ
ーターポリペプチドとから成る。リガンド結合領域はリ
セプターの細胞外領域に位置している。リガンドの結合
に関与している正確なアミノ酸配列を同定することは、
しばしば困難である。実際、リガンドの結合に関連する
幾つかの領域があり、特に、リガンドがポリペプチドで
ある場合にはそうである。従って、リセプターの細胞外
領域の全てがハイブリッドを形成していることが好まし
い。このことはまた、リガンド結合領域を確実に、正し
い立体配座に保つことにも役立つ。
【００２４】適当なリガンド結合領域は、幾つかの方法
の内どれかを用いて選択する。まず、そのハイブリッド
リセプターの使用目的が、被検試料中の既知のリガンド
の分析、あるいは、その様なリガンドのアゴニストまた
は拮抗体のスクリーニリグにあるときは、そのリガンド
に対する既知のリセプターから、リガンド結合部位を選
択する。リガンドが既知であって、そのリセプターが既
知でない場合には、リガンドの細胞表面リセプターを同
定する必要がある。このことは、１)リガンドが結合す
るか、あるいは機能的に相互作用することが分かってい
る組織細胞を得、２)その細胞から既知の方法で膜タン
パク質製品(標本)を得、３)この製品をリガンドとイン
キュベートし、４)インキュベーション混合物からリガ
ンド−リセプター−コンプレックスを分離し[例えば、
リガンドを、臭化シアンで活性化したセファロースに予
め不溶化しておく]、５)リセプターをリガンドから分離
し、６)リセプター部分のアミノ酸配列を得、７)決定し
たアミノ酸配列をコードしている核酸プローブを調製し
(約４０bp以上の長い１本のプローブ、あるいは、短い
プローブのプールのいずれか)、８)リセプターが得られ
た生物または細胞から、cＤＮＡまたはゲノムＤＮＡフ
ァージライブラリィー、あるいはプラスミド(ベクター)
ライブラリィーを調製し、９)プローブとライブラリィ
ーとをハイブリダイズしてリセプターをコードしている
ＤＮＡを含有しているプラスミドまたはファージを同定
し、１０)アミノ末端からトランスメンブラン(膜透過)
配列までの領域を同定するのに必要な程度のヌクレオチ
ド配列と推定のアミノ酸配列とを決定する。リセプター
の細胞外領域全部をコードしているＤＮＡを含んでいる
単一のベクターが無い場合には、様々なベクターを共通
の部位で制限酵素消化し、適当なフラグメントを単離し
て自体既知の方法で再結合(リライゲーション)すること
により所望のＤＮＡを組立てる。既知のリガンドに対す
るリセプターを同定するための他の方法は当業者にとっ
て既知であるか、将来、利用可能となり得る。
【００２５】推定のリセプターは同定されたかもしれな
いが、インビボにおけるそのリガンドはなお不明であ
る。例えば、脳下垂体や副腎の如き腺から得られる内分
泌組織の研究によって、構造上、他の既知のリセプター
と似ている膜結合タンパク質(即ち、大きい(通常５００
残基以上)細胞外領域、疎水性のトランスメンブラン配
列およびカルボキシ末端である細胞質領域とを有するで
あろう)が同定されるかもしれない。同様に、悪性腫瘍
細胞のリセプター検索は、形質転換された表現型と関連
しているかもしれない、高濃度に存在している特異なリ
セプター類を同定するのにも有用であろう。その様なリ
セプターの細胞外領域も、本発明にとって有用である。
【００２６】リセプターとそのリガンドは同定された
が、細胞質領域は既知の機能を有しないかもしれない。
例えば、アデニル酸シクラーゼやグアニル酸シクラーゼ
を活性化することも、ホスホトランスフェラーゼ活性を
有することも、リガンドを輸送することも分かっていな
いかもしれない。天然のリセプターにおいては、リガン
ド−リセプター相互反応により、検出可能なシグナルは
全く、あるいは僅かしか産生されないにもかかわらず、
ハイブリッド構築においてはリポーターポリペプチドか
ら検出可能なシグナルが供給されるので、その様なリセ
プターのリガンド領域は有用である。この様に、ある種
のリセプターの場合には、リセプターと結合した候補薬
物が非特異的に結合しているか、あるいはそれがアゴニ
ストまたは拮抗体として作用するか否かを決定すること
も、生物学的に活性な、固有のリガンドを分析すること
も、リポーターポリペプチドなしではできない。
【００２７】リポーターポリペプチドはリガンド結合部
位にとってヘテロローガスなポリペプチドであって、そ
れは、リガンドが結合領域に結合した際にその性質を変
化させるものであれば何でも良い。一般に、この性質の
変化は、リポーターポリペプチドの酵素活性または免疫
学的な同一性の変化により検出し得る。通常、リポータ
ーポリペプチドはヘテロローガスなリセプター、あるい
はリセプター類似体の細胞質領域であり、例えば、リガ
ンドとの結合に際して免疫学的または酵素学的な同一性
に変化を来すことが分っている腫瘍遺伝子産物である。
インシュリンリセプターや表皮性成長因子リセプター等
のリセプター由来の細胞質性ホスホトランスフェラーゼ
を用いることが好ましい。しかしながら、β−アドレナ
リン作動性リセプター、アセチルコリンリセプター、お
よびアドレナリンリセプター等の他のリセプターも、ア
デニル酸シクラーゼやグアニル酸シクラーゼの活性化ま
たは阻害を介して中間体形質導入分子として作用するＧ
タンパク質と称されるタンパク質と結合することが分っ
ている。その様なタンパク質は単離され、特性化されて
いる。リポーターポリペプチドとして、その様なリセプ
ターのＧタンパク質結合領域を用いることも本発明の範
囲に含まれる。ヘテロローガスなリセプターやリセプタ
ー同族体の細胞質領域全てを使用する必要はなく、所望
の機能を示す部分のみを使用すればよく、また、他のリ
セプターの無傷で修飾されていない配列を用いる必要も
ない。例えば、リガンド結合領域が得られたリセプター
の細胞質内領域のアミノ酸配列における変異体や誘導体
も許容される。
【００２８】本発明は、機能についての特定の理論に制
限されるものではないが、リポーターポリペプチドの性
質の変化は、リガンドによるリポーターポリペプチドに
対する立体障害(例えば、リガンドが立体障害によりリ
ポーター領域上の活性部位を吸収)によって起こされる
ものではないと考えられる。本発明で用いる方法はリセ
プターのシグナル導入機構(シグナル・トランスデュー
シング・メカニズム)を統制することによりリガンド結
合領域の変化が分子中の立体配座における変化によって
リセプター分子からリガンド領域に伝えられ、その変化
がリポーターの細胞質領域の機能または性質に影響を及
ぼすものである。この導入機構は、リポーターポリペプ
チドがリガンド結合領域にとってヘテロローガスなもの
である場合にも有効であることが分った。
【００２９】所望により、ハイブリッドリセプターは、
リガンド結合領域とリポーターポリペプチドとの間に融
合されているトランスメンブラン配列を含んでいてもよ
い。典型的なトランスメンブラン領域は、約２０〜２５
残基を含有し、約１.５から３.５にヒドロパシィピーク
を示すものである。それらは疎水性の側鎖を有する残
基、例えばロイシン、イソロイシン、フェニルアラニ
ン、バリンおよびメチオニン等を高い割合で含有してい
る。適切なトランスメンブラン配列は細胞外のリガンド
結合領域を供給するリセプターから得られるが、トラン
スメンブラン配列は全合成されるか、あるいは膜内在性
タンパク質または非関連リセプターから得ることができ
る。最後の例には、ヘテロローガスなリセプターの細胞
質内領域であるリポーターポリペプチドに通常伴ってい
るトランスメンブラン領域も含まれる。
【００３０】ハイブリッドリセプター成分は、ヒト、動
物、植物、昆虫、さらに原虫、ウィルスおよび真菌を含
む微生物、並びにその他の適当な種を起源とする。リガ
ンド結合領域の供給源となる種は、関心を持たれている
リガンドと結合し得るリガンド結合領域の存在につい
て、あるいは、標的となっている生理活性の存在につい
て選択される。リポーターポリペプチドまたはトランス
メンブラン領域を、リガンド結合領域と同一種から得る
必要はない。
【００３１】ハイブリッドリセプターは一般に、今日、
技術分野で利用可能なインビトロの方法で実用的に合成
するには、あまりにも大きく複雑なので組換え細胞培養
法で合成することが好ましい。
【００３２】ハイブリッドリセプターを合成するための
組換え法は、ハイブリッドリセプターをコードしている
核酸を含有する複製可能なベクターの組立てから始ま
る。一般に、ベクターは適合し得る宿主細胞と共同して
２つの機能を果たす。１つの機能はハイブリッドリセプ
ターをコードしている核酸のクローニングを促進するこ
と、つまり、使用可能な量の核酸を生産することにあ
る。もう一つの機能はハイブリッドリセプターの発現を
指令することにある。これらの機能の一方または両方
が、ベクター−宿主系によってなされる。ベクターは、
選択された宿主細胞と同様、それがなすべき機能に応じ
て異なる成分を含有することとなる。
【００３３】各ベクターはハイブリッドリセプターをコ
ードする核酸を含有している。通常、これはそのアミノ
末端に分泌シグナルが結合している成熟した形のハイブ
リッドリセプターをコードしているＤＮＡであろう。こ
の分泌シグナルは、リガンド結合領域の得られたリセプ
ターの分泌を指令する通常のシグナルプレ配列であるこ
とが好ましい。しかしながら、他のリセプターに由来す
るシグナルや、同一種または近縁種の分泌ポリペプチド
から得られるシグナルも適当なシグナルとなり得る。
【００３４】分泌されたハイブリッドは、それがトラン
スメンブラン領域を含んでいれば、組換え宿主の膜内に
位置する。その様な領域がハイブリッド中に存在しない
ときには、ハイブリッドは培養培地に分泌される。通
常、ハイブリッドは、構造を可能な限り忠実に保持する
ために、トランスメンブラン領域を含有していることが
好ましい。しかしながら、ハイブリッドリセプターを、
他の細胞膜タンパク質を含まないように精製しなければ
ならない膜−結合性リセプターの場合よりも、トランス
メンブラン領域を欠失したリセプターの精製の方が複雑
でない。さらに、細胞−結合性リセプターの場合、増殖
期に細胞膜に多量の蓄積が起きると、宿主に望ましくな
い生物学的な影響を与えるかもしれない。これらの潜在
的な可能性は、ハイブリッドリセプターをコードしてい
るアミノ酸を誘導可能なプロモーターのコントロール下
におくことによって克服される。
【００３５】クローニングベクター中では、通常、ハイ
ブリッドリセプターをコードしている核酸は、選択され
た宿主内で、宿主の染色体と独立してベクターを複製さ
せる核酸配列と一緒に存在している。通常、この配列
は、複製起源または自律的複製配列である。その様な配
列は、種々の細菌、酵母およびより高等な真核細胞につ
いてよく知られている。よく知られたプラスミドpＢＲ
３２２の複製起源は大腸菌に、２μプラスミドの複製起
源は酵母に、そして種々のウィルス(ＳＶ４０ウィル
ス、ポリオーマウィルス、アデノウィルスまたはウシ乳
頭腫ウィルス)の複製起源は哺乳類細胞に適合する。余
り望ましくないが、ＤＮＡは、宿主のゲノムに挿入され
ることでクローンされる。このことは、例えば、バシラ
スのゲノムＤＮＡと相補的なベクターＤＮＡに挿入する
ことにより、バシラス種では容易に行い得る。このベク
ターでバシラスがトランスフェクションされると、ゲノ
ムとのホモローガスな組換えが起き、ハイブリッドリセ
プターＤＮＡが挿入される。しかしながら、ハイブリッ
ドリセプターをコードしているゲノムＤＮＡの回収は、
ハイブリッドリセプターＤＮＡをクローニングビヒクル
のゲノムから回収するために制限酵素による消化を行う
必要があるので、外的に複製されたウィルスＤＮＡまた
はプラスミドＤＮＡの回収よりも複雑である。
【００３６】発現およびクローニングベクターは選択遺
伝子(選択可能なマーカーとも称される)を含有していな
ければならない。これは、ベクターで形質転換された宿
主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードし
ている遺伝子である。この遺伝子が存在することによ
り、挿入体を発現する宿主のみが確実に増殖することに
なる。代表的な選択遺伝子は、(a)抗生物質あるいは他
の毒素(例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレ
キセートまたはテトラサイクリン)に対する耐性を付与
する、または(b)栄養要求性の欠失を補償するタンパク
質をコードしている遺伝子か、あるいは(c)複合培地か
ら得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコー
ドしている遺伝子(例えば、バシルスにとっての、Ｄ−
アラニン・ラセマーゼをコードしている遺伝子)であ
る。
【００３７】酵母内で用いるのに適した選択遺伝子は酵
母プラスミドＹＲp７中に存在するtrp１遺伝子である
[スティンチコムら(Ｓtinchcomb)、１９７９ “ネイチ
ャー(Ｎature)" ２８２:３９; キングスマンら(Ｋingsm
an)、１９７９ “ジーン(Ｇene)" ７:１４１; またはチ
エンパーら(Ｔschemper)、１９８０ “ジーン" １０:１
５７]。trp１遺伝子はトリプトファン中で増殖する能力
を欠く酵母の突然変異株(例、ＡＴＣＣ Ｎo.４４０７
６またはＰＥＰ４−１[ジョーンズ(Ｊones)、１９７７
“ジェネティックス(Ｇenetics)" ８５:１２])に選択マ
ーカーを与える。酵母宿主細胞ゲノムにtrp１損傷があ
ると、トリプトファンの非存在下で形質転換体を増殖さ
せることで形質転換を検出するのに有効な環境が得られ
る。同様に、Ｌeu２欠損酵母株(ＡＴＣＣ２０,６２２ま
たは３８,６２６)はＬeu２遺伝子を有する既知のプラス
ミドで補償される。
【００３８】哺乳類細胞にとって適当な選択マーカー
は、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)、チミジンキ
ナーゼまたはネオマイシン耐性を付与するタンパク質で
ある。その様なマーカーにより、ハイブリッドリセプタ
ー核酸を取り入れるのに適した細胞を同定することが可
能となる。哺乳類細胞形質転換体を、マーカーを取り込
んだ形質転換体のみが特異的に生存に適応し得る選択圧
の下におく。選択圧は、培地中の選択物質の濃度が逐字
増加されている、連続的な細胞培養中で培養することに
より、選択遺伝子をコードしているＤＮＡとハイブリッ
ドリセプターをコードしているＤＮＡの両者を増幅させ
ることにより与えられる。増幅されたＤＮＡにより、ハ
イブリッドリセプターの合成量が増加される。
【００３９】例えば、ＤＨＦＲ形質転換細胞は、ヒポキ
サンチン、グリシンおよびチミジンを欠く培養培地中で
選択される。この場合、適当な宿主細胞はウーラウブ
(Ｕrlaub)およびチャッシン(Ｃhasin)１９８０、“プロ
シーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・
オブ・サイエンスィズ(プロナス)(Ｐroc．Ｎat'l．Ａca
d．Ｓci．)ＵＳＡ"７７:４２１６記載の如くにして調製
し、増殖された、ＤＨＦＲ活性を欠くチャイニーズハム
スターの卵巣(ＣＨＯ)セルラインである。
【００４０】メトトレキセート(ＭＴＸ)耐性の高い突然
変異ＤＨＦＲが特に有用なＤＨＦＲである(ＥＰ１１７,
０６０Ａ)。この選択物質は、内因性のＤＨＦＲが存在
していても、それ以外において適切な宿主であれば用い
ることができる。内因性のＤＨＦＲを完全に不活化する
には、単に、充分量のＭＴＸが培地中に含有されていれ
ばよく、そうすれば、ＭＴＸ選択は、突然変異ＤＨＦＲ
のＤＮＡの増幅によってのみ行われる。ＭＴＸを吸着す
ることのできる真核細胞の大多数はメトトレキセート感
受性のように思われる。その様な有用なセルラインの１
つに、ある種のＣＨＯライン、即ちＣＨＯ−Ｋ１(ＡＴ
ＣＣ Ｎo．ＣＣＬ６１)がある。
【００４１】ハイブリッドリセプターを脊椎動物の組換
え細胞培養中で合成するのに適応させ得る他の方法、ベ
クターおよび宿主細胞は、ゲッシングら(Ｍ．Ｊ．Ｇeth
ing)、“ネイチャー"２９３:６２０〜６２５(１９８
１)、マンテイら(Ｎ．Ｍantei)、“ネイチャー"２８１:
４０〜４６およびレビンソンら(Ａ．Ｌevison)、ＥＰ１
１７０６,０５８Ａによって記載されている。
【００４２】発現ベクターは、クローニングベクターと
異なり、ハイブリッドリセプターをコードしているＤＮ
Ａが強く転写されるよう、宿主生物によって認識され
る、プロモーターおよび／または他の配列を含有してい
なければならない。これは、一般に、意図する宿主のプ
ロモーターとホモローガスな配列である。高等な真核細
胞の場合、プロモーターからの転写をより増大する上
で、エンハンサー配列が有用である。プロモーターと異
り、エンハンサー配列は、ハイブリッドリセプターをコ
ードしている核酸の５'側に位置している必要はない。
原核生物に一般的に用いられるプロモーターには、β−
ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系[チャン
ら(Ｃhang)、１９７８“ネイチャー"２７５:６１５;ゲ
ツデルら(Ｇoeddel)、１９７９“ネイチャー"２８１:５
４４]、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)
プロモーター系[ゲツデル１９８０“ヌクレイツク・ア
シッズ・リサーチ(Ｎucleic Ａcids Ｒes．)"８:４０
５７およびＥＰＯ出願公開Ｎo．３６,７７６]、並びにt
acプロモーター[ドゥ・ボアら(Ｈ．de Ｂoer)、１９８
３“プロナス ＵＳＡ"８０:２１−２５]の如きハイブ
リッドプロモーターが含まれる。しかしながら、他の既
知の微生物のプロモーターも適する。それらのヌクレオ
チド配列は公開されているので、当業者は、必要な制限
部位を与えるリンカーやアダプターを用いて、それらを
プラスミドベクター中のハイブリッドリセプターをコー
ドしているＤＮＡと機能的(操作可能)にライゲート(結
合)させることができる[シーベンリストら(Ｓiebenlis
t)１９８０“セル(Ｃell)"２０:２６９]。原核生物系で
用いるためのプロモーターには、ハイブリッドリセプタ
ーをコードしているＤＮＡと機能的に結合しているシャ
インダルガルノ配列も含まれるであろう。
【００４３】酵母用ベクターの好適なプロモーティング
配列には、以下のものに対するプロモーターが含まれ
る:メタロチオナイン(metallothionein)、３−ホスホグ
リセレート・キナーゼ[ヒツツマン(Ｈitzeman)ら、１９
８０“ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ィ"２５５:２０７３]またはエノラーゼ、グリセルアル
デヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、ヘキソ
キナーゼ、ピルベート・デカルボキシラーゼ、ホスホフ
ルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェート・イソ
メラーゼ、３−ホスホグリセレート・ムターゼ、ピルベ
ート・キナーゼ、トリオセホスフェート・イソメラー
ゼ、ホスホグルコース・イソメラーゼ、グルコキナーゼ
等の他の解糖酵素類[ヘス(Ｈess)ら、１９６８、“ジャ
ーナル・オブ・アドバンスイズ・イン・エンザイム・レ
グ(Ｊ．Ａdv．Ｅnzyme Ｒeg．)"７:１４９;およびホラ
ンド(Ｈolland)ら、１９７８、“バイオケミストリィ"
１７:４９００]。
【００４４】その他、増殖条件によって転写がコントロ
ールされるという利点をも有するプロモーターとして、
アルコール・デヒドロゲナーゼ２、イソチトクローム
Ｃ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する減成酵素、
前記メタロチオナイン、グリセルアルデヒド−３−ホス
フェート・デヒドロゲナーゼ、並びにマルトースおよび
ラクトースの利用に与る酵素類等に関するプロモーター
領域が含まれる。更に、酵母内で発現させる上で好適な
ベクターおよびプロモーターはＲ．ヒツツマン(Ｒ．Ｈi
tzman)らにより、ＥＰＯ公開番号第７３,６５７号の中
に記述されている。
【００４５】哺乳類宿主細胞内でのベクターからの転写
は、ウシ乳頭腫ウィルス、ワクシニアウィルス、ポリオ
ーマウィルス、アデノウィルス２、レトロウィルス、Ｂ
型肝炎ウィルスおよび大多数の好ましいシミアンウィル
ス４０(ＳＶ４０)から得られ、ハイブリッドリセプター
の核酸と機能的に結合しているプロモーターおよび／ま
たはエンハンサーによってコントロールされる。ＳＶ４
０ウィルスの早期および後期プロモーターはＳＶ４０ウ
ィルスの複製起源を含有しているＳＶ４０制限フラグメ
ントと同様、都合良く得られる[ファイヤーズら(Ｆier
s)、１９７８“ネイチャー"２７３:１１３]。本発明に
おいては、宿主細胞またはその近縁種から得られたプロ
モーターやエンハンサーも有用であることは当然であ
る。
【００４６】核酸は、それが他の核酸配列と機能的な関
連性に置かれている場合、機能的に結合していることに
なる。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤ
ＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタン
パク質として発現されるならば、ポリペプチドのＤＮＡ
と機能的に結合しており、プロモーターまたはエンハン
サーは、それが暗号配列の転写を左右するなら該配列と
機能的に結合しており、あるいは、リボゾーム結合部位
は、それが暗号配列の翻訳を促進するよう位置せしめる
ならば該配列と機能的に結合していることになる。一般
に、機能的に結合しているという言葉は、結合されてい
るＤＮＡ配列が近接しており、さらに、分泌リーダー配
列の場合には、近接し、リーディングフレーム内にある
ことを意味する。
【００４７】真核性宿主細胞(酵母、菌類、昆虫、植
物、動物またはヒト)内で用いる発現ベクターは転写の
終止およびmＲＮＡの安定化に必要な配列をも含有して
いるであろう。その様な配列は、一般に、真核性の、ま
たはウィルスのcＤＮＡの３'非翻訳領域から得られる。
これらの領域は、ハイブリッドリセプターをコードして
いるmＲＮＡの非翻訳部分に含まれるポリアデニル化セ
グメントとして転写される領域を含有している。この
３'非翻訳領域には転写終止部位も含まれている。
【００４８】本発明におけるベクターのクローニングま
たは発現にとって好適な宿主細胞は、原核細胞、酵母細
胞およびより高等な真核細胞である。原核細胞には、大
腸菌やバシラスの如き、グラム陰性またはグラム陽性菌
が含まれる。好ましいクローニング宿主は大腸菌２９４
(ＡＴＣＣ３１,４４６)であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ
１７７６(ＡＴＣＣ３１,５３７)、大腸菌Ｗ３１１０(Ａ
ＴＣＣ２７,３２５)、シュードモナス種、あるいはセラ
シア・マーセサンス(Ｓerratia Ｍarcesans)も適す
る。
【００４９】原核生物に加えて糸状菌や酵母の如き真核
微生物もハイブリッドリセプターをコードしているベク
ターの宿主として適する。下等な真核性宿主微生物の
内、サッカロミケス・セレビシエ(Ｓaccharomyces cer
visiae)または通常のパン酵母が最も普通に用いられ
る。しかしながら、他の多くの属、種または株も一般に
入手可能であり、本発明に用い得る。
【００５０】機能的なハイブリッドリセプターの発現に
とって好適な宿主細胞は多核細胞生物から導かれた細胞
の培養物である。多くの場合、ハイブリッドリセプター
は下等な微生物には適合し得ない領域、即ち、適切なジ
スルフィド結合を形成する上で複雑なプロセシングを必
要とし、しばしば、サブユニット・プロセッシングが要
求される疎水性の領域、を含有している。しかも、この
リセプターのグリコシル化は天然のリセプターの場合と
同様に行われることが望ましい。これらの機能は全て高
等な真核細胞により、最もよく達成される。原則とし
て、脊椎動物または無脊椎動物の細胞培養物のいずれで
もよく、あらゆる高等な真核細胞の培養物が有用である
が、ヒト等の哺乳類の細胞が好ましい。培養中でのその
様な細胞の増殖は自体既知である[組織培養(Ｔissuecul
ture)、アカデミック・プレス、クルス(Ｋruse)および
パターソン(Ｐatterson)編(１９７３)参照]。有用な哺
乳類宿主のセルラインには例えば、ＶＥＲＯ細胞、Ｈel
la細胞、チャイニーズハムスターの卵巣細胞セルライ
ン、ＷＩ３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７およびＭＤＣＫの各
セルラインが含まれる。
【００５１】本発明のハイブリッドリセプターは、原則
として、該リセプターを被検試料、コントロールおよび
(所望により)スタンダード(標品)と一緒にインキュベー
トした後、リポーターポリペプチドにおける変化を測定
することからなる方法により、薬物のスクリーニング、
あるいは生物活性なリガンドのアツセイに用いられる。
リガンドの結合がリポーターポリペプチドの立体配座を
変化させることは、本発明者らが見い出したことである
故、この様な変化を幾つかの方法のどれかを用いて検出
することも本発明の範囲内に含まれる。一般に、リポー
ターポリペプチドのタンパク質結合または酸素活性の変
化を測定する。一つの方法では、活性化された立体配座
に対する抗体を惹起させ、リセプターをリガンドまたは
候補薬物と一緒にインキュベートしてから、ハイブリッ
ドリセプターに対する抗体の結合を測定する。このアツ
セイは従来のタンパク質抗原についてのイムノアツセイ
と同様の方法で行われる。抗体はホスホチロシン含有タ
ンパク質と結合し得ることが自体既知である[ウオン(Ｗ
ang)、１９８５“モル・アンド・セル・バイオロ(Ｍo
l．and Ｃell．Ｂiol．)"５(１２):３６４０〜３６４
３;ロスら(Ｒoss)、１９８１、“ネイチャー"２９４:６
５４;およびパンら(Ｐang)、１９８５、“アーク・バイ
オケム・バイオフィス(Ａrch．Ｂiochem．Ｂiophys．)"
２４２(１):１７６]。これらの抗体は本発明の方法に有
用であるが、従来技術における抗体と異なり、ハイブリ
ッドリセプターの場合には、リポーターポリペプチドに
とって特異的であり、他のリセプターやりん酸化された
タンパク質とは交差反応せず、リガンドのリセプター結
合領域への結合影響を測定することに関しては、まさに
利用度の高い抗ホスホチロシン抗体が選ばれる。しか
し、この方法は、結合しなかった標識抗体をリポーター
と結合した抗体から除去するために相分離が必要である
という不都合を有する。しかしながら、この方法では、
ハイブリッドリセプターを共有結合的に修飾しなくとも
よい。
【００５２】リポーターポリペプチドに対する特異抗体
の結合を利用するアツセイと同様の方法は、正常な相互
作用によってリポーターと結合する非−免疫的な結合タ
ンパク質のリポーターへの結合を測定する方法である。
典型的な結合タンパク質は、ある種の、リガンドで活性
化されたリセプターに伴なっているＧタンパク質であ
る。この場合のリポーターポリペプチドはβ−アドレナ
リン性リセプター等のリセプターの細胞質内領域であ
る。Ｇタンパク質の結合は、標識したＧタンパク質の置
換により、あるいは、活性化されたＧタンパク質へのＧ
ＴＰまたはＡＴＰの結合の測定等、抗体結合のアツセイ
と同様にして分析される。
【００５３】もしもリポーターポリペプチドがヘテロロ
ーガスなリセプターの酵素学的に活性な細胞質内領域で
ある場合には、その活性のアツセイが検出方法として好
ましい。今日、その様な活性には、タンパク質のホスホ
リルキナーゼ活性や一次チロシンキナーゼ活性が含まれ
るが、いくつかの例では、セリンキナーゼ活性やスレオ
ニンキナーゼ活性も含まれる。キナーゼ活性は、従来の
キナーゼ活性の測定法の内、いずれかの方法によって測
定される。キナーゼ活性の測定法として、本発明におい
て好ましい従来方法は、32Ｐを用いた自己りん酸化を介
する、リポーターポリペプチドへの放射性りんの挿入を
測定する方法である。同じ種類の活性を有するリセプタ
ーのハイブリッドを形成することが好ましい。
【００５４】しかしながら、酵素学的な活性やポリペプ
チドの相互作用以外の手段でリポーターポリペプチドの
変化を測定することも本発明の範囲に含まれる。その様
な方法の１つは、リガンドとの結合に際して性質が変化
する有機部分をリセプターに結合させることを含む。例
えば、リポーターポリペプチドを安定なフリーラジカル
や化学発光性の基、あるいはフルオレスセイン・イソチ
オシアナートの如き蛍光性の分子でラベルする。これら
のラベルはいずれも診断的免疫化学の分野では良く知ら
れており、それらをタンパク質と共有結合的に結合させ
るための常法も良く知られている。これらの方法はリポ
ーターポリペプチドを他のタンパク質と同様の方法でラ
ベルするのに有用である。リガンド結合領域に対するリ
ガンドまたは候補薬物の結合に際するリセプターポリペ
プチドの立体配座の変化はラベルの変化に基づいて検出
される。例えば、リポーターポリペプチドの立体配座に
対するリガンドの活性化に基づく変化によって安定なフ
リーラジカル・ラベルの回転モーメントが増加または減
少するであろう。同様に、リポーターポリペプチドの蛍
光性ラベルまたは化学発光性ラベルは、リポーターポリ
ペプチドにリガンドまたは活性な候補が結合すると分子
内のエネルギーの移動に関与しているポリペプチド種が
再配向(リオリエンテーション)されるために変化するで
あろう。これは、ラベル分子の強度、分極または波長の
変化によって検出され、一般に、ラベルの蛍光または化
学発光の増強または消失によって検出される。ラベルし
たリポーターを用いる方法の利点は、リガンドまたは候
補薬物の分析をもっぱら水溶液中で行うことができ、相
分離の必要がないことにある。このことにより、オート
アナライザー等の連続フロー機器を用い、自動的なスク
リーニング法が可能となる。その様な方法は、ハイブリ
ッドリセプター同様、固有のリセプターにも有用であ
る。
【００５５】実施例の記載を簡単にするため、頻繁に用
いられる方法を短い熟語に略して示す。“プラスミド"
は小文字のpを先頭にし、そして／または大文字および
／または数字を続けることによって表わされる。本発明
の出発物質であるプラスミドは市販されているか、また
は非制限的な施設から一般に入手可能であり、あるいは
この様にして入手し得るプラスミドから、公知の方法に
従って組立てることができる。更に、その他の同等なプ
ラスミドも当業者には知られており、通常の技術者にと
って自明であろう。
【００５６】ＤＮＡの“消化"または“開裂"とは、ＤＮ
Ａを、該ＤＮＡのある位置に対してのみ作用する酵素で
触媒的に開裂することを指す。その様な酵素を制限酵素
と称し、該酵素にとって特異的な部位を制限部位(サイ
ト)と称する。本発明において用いる様々な制限酵素は
市販されており、その反応条件、コファクター、および
その他必要なものは、酵素の供給業者の指示に従って使
用した。制限酵素類は、各制限酵素が最初に得られた微
生物を表示する大文字、次いで他の文字、更に、通常、
数字からなる略号で表わされる。特定の酵素について適
当な緩衝液および基質の量は、製造業者によって明示さ
れている。通常、インキュベーション時間は３７℃で１
〜数時間とするが、供給者の指示に従ってかえてもよ
い。インキュベーションした後、フェノールおよびクロ
ロホルムでタンパク質を抽出して除き、水性フラクショ
ンからエタノール沈殿によって消化された核酸を回収す
る。時たま、制限酵素による消化の後、５'末端のホス
フェートを細菌性アルカリホスファターゼで加水分解す
ることがある。これは、ＤＮＡフラグメントの２つの制
限的開裂末端が“閉環(サーキュライディング)"した
り、閉じたループを形成することにより、該制限部位に
他のＤＮＡフラグメントが挿入されにくくなるのを防止
するためである。明示しない限り、プラスミドの消化に
は、５'末端の脱りん反応は伴なわないものとする。脱
りんの方法および試薬は常法に従う[Ｔ.マニアテイス
(Ｔ.Ｍaniatis)ら、１９８２、モレキュラー・クローニ
ング(Ｍolecular Ｃloning)pp.１３３−１３４]。
【００５７】“充填(フィリング)"または“平滑末端化
(ブランティング)"とは、制限酵素で開裂した核酸の粘
着末端の一本鎖末端を二本鎖に変換する工程を指す。こ
のことにより、粘着末端が消滅して平滑末端が形成され
る。この工程は、１個またはほんの少数の他の制限酵素
によって作られた末端とのみ結合し得る制限的な切断末
端を、あらゆる、平滑に切断する制限エンドヌクレアー
ゼで形成された末端末端または他の充填後の粘着末端に
適合し得る末端に変える上で多方面に利用可能な手段で
ある。一般に、平滑末端化は、目的とするＤＮＡ２〜１
５μｇを、ＤＮＡポリメラーゼIのクレノウフラグメン
ト８単位と４種類のデオキシヌクレオチドトリホスフェ
ート各２５０μＭの存在下、１０mＭＭgＣｌ2、１mＭジ
チオトレイトール、５０mＭＮaＣｌ、１０mＭトリス(p
Ｈ７.５)バツファーの混液中、３７℃でインキュベート
することにより行われる。通常、３０分後にフェノール
およびクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿に付すこ
とによりインキュベーションを終了する。
【００５８】制限消化物からの特定のＤＮＡフラグメン
トの“回収"または“単離"とは、この消化物をポリアク
リルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動にかけて
分離し、フラグメントの移動度を分子量既知のマーカー
ＤＮＡフラグメントのそれと比較して所望のフラグメン
トを同定し、所望のフラグメントを含むゲルの部分を取
り除き、該ゲルからＤＮＡを分離することを意味する。
この方法は一般的に知られている。例、Ｒ.ローン(Ｒ.
Ｌawn)ら、１９８１、“ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ"９:６１０３−６１１４およびＤ.ゲツデル(Ｄ.Ｇo
eddel)ら、１９８０“ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ"８:４０５７参照。
【００５９】“形質転換"とは、ＤＮＡを生物内に導入
することを意味し、その結果ＤＮＡが染色体外成分とし
て、あるいは染色体内に組込まれて複製されることを意
味する。特に明示しない限り、本発明における大腸菌の
形質転換法にはマンデル(Ｍandel)らのＣaＣｌ2法(１９
７０、“ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
イ"５３:１５４)を採用する。
【００６０】“ライゲーション(結合)"とは、２個の２
本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形
成する工程を言う(Ｔ.マニアテイスら、前掲p１４６)。
特に明示しない限り、ライゲーションは既知の緩衝液と
条件を使用し、ライゲートすべきＤＮＡフラグメント１
μｇ当たりＴ４ＤＮＡリガーゼ(“リガーゼ")１０単位
を用いて行う。
【００６１】形質転換体からＤＮＡを“調製する"と
は、プラスミドＤＮＡを微生物培養物中から単離するこ
とを意味する。明示しない限り、マニアテイスらのアル
カリ性／ＳＤＳ法(同上p.９０)を採用する。
【００６２】“オリゴヌクレオチド"とは、短かい一本
鎖または二本鎖ポリデオキシヌクレオチドであって、既
知の方法によって化学的に合成され、次いでポリアクリ
ルアミドゲル上で精製されたものである。
【００６３】以下の実施例は本発明を実施する上で、現
在知られている最良の方法を例示するものにすぎず、本
発明がこれらに限定されることはない。本明細書中で引
用した文献は全て参照例として示されている。
【００６４】
【実施例】実施例 １ インシュリンリセプター(ＩＲ)発現プラス
ミドの組立て 全ＨＩＲ暗号配列を含有するλＨＩＲ−Ｐ１２から得た
ゲル精製ＳalIフラグメント(５.２kb)を、pＵＣ１２を
ＳalIで消化し、このベクターに精製ＳalIフラグメント
をライゲートすることによりpＵＣ１２[ニューイングラ
ンド・バイオラボス(Ｎaw Ｅngland Ｂiolabs)]のポリ
リンカー領域にサブクローンした。コロニーを増殖さ
せ、pＵＣ１２ＸbaI部位の隣にＨＩＲ暗号配列の５'末
端が所望の方向性で含有されているクローンをスクリー
ニングした。このベクターをＸbaIおよびＤraIで消化し
(ＤraIはＨＩＲの３'非翻訳領域に含まれている)、ＨＩ
Ｒ−含有フラグメントを単離した。このフラグメントを
哺乳類の発現ベクター(pＣＶＳＶＥＨＢＶＥ４００、欧
州公開Ｎo.１１７,０６０)であって、ＢamＨIで先に消
化しておいたベクターに挿入した。ＢamＨI粘着末端を
充填した後、プラスミドをＸbaIで消化した。従って、
ＸbaI−ＤraIへの挿入は、ＨＩＲmＲＮＡが必然的に発
現する方向にのみ可能であった。得られたインシュリン
リセプター発現プラスミドをpＣＶＳＶ−ＨＩＲcと命名
した。
【００６５】実施例 ２ インシュリン−ＥＧＦハイブ
リッドリセプターを発現させるためのベクターの組立て 以下のフラグメントを、４成分(ファクター)ライゲーシ
ョンでライゲートさせた。(a)ＩＲ発現プラスミドpＣＶ
ＳＶＥ−ＨＩＲc由来の９３１bpＢamＨI−ＡatII制限フ
ラグメント、(b)組換えファージλＨＥＲ−Ａ６４[ウー
リッチら(Ｕllrich)１９８４、“ネイチャー"３０９:４
１８〜４２５]に含有されているヒトＥＧＦリセプター
配列の１１５０bpＡpaI−ＳstI制限フラグメント、(c)
５'−ＣＣＣＧＴＣＡＡＡＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＧ
ＡＴＧＧＴＧＧＧＧＧＣＣ−３'および５'−ＣＣＣＡＣ
ＣＡＴＣＣＣＡＧＴＧＧＣＧＡＴＡＴＴＴＧＡＣＧＧＧ
ＡＣＧＴ−３'を含有する合成オリゴヌクレオチドリン
カー、および(d)ＳstIおよびＢamＨIで開裂されたpＵＣ
１２。この様にして、インシュリンリセプターの細胞外
領域をコードしている配列をＥＧＦリセプターのトラン
スメンブラン領域および細胞質領域をコードしている配
列と結合させ、発現プラスミド内に位置せしめた。ハイ
ブリッドをコードしているＤＮＡを含有するプラスミド
pＵＣ１２／ＨＩＲ−ＨＥＲＩnt.を形質転換された大腸
菌２９４のアンピシリン耐性コロニーから回収した。こ
のプラスミドをＢamＨIおよびＡpaIで消化し、ＩＥＲ連
結部(ジャンクション)を含有する９６５bpフラグメント
(フラグメント１)を回収した。pＣＶＳＶ−ＨＩＲcをＰ
vuIおよびＢamＨIで消化し、残りのＩＲ暗号配列と哺乳
類発現ベクターの一部を含有する３１１７bpフラグメン
ト(フラグメント２)を回収した。λＨＥＲ−Ａ６４をＡ
paI−ＢglIIで消化して８１０bpフラグメント(フラグメ
ント３)、ＢglII−ＸmnIで消化して１kbフラグメント
(フラグメント４)をそれぞれ回収した。フラグメント３
および４はヒトＥＧＦリセプターのトランスメンブラン
および細胞質領域をコードしている。pＣＶＳＶＥＨＢ
ＶＥ４００をＢamＨIで消化し、制限部位を末端の充填
に付し、このＤＮＡを引き続きＰvuIで消化した。記載
の哺乳類発現ベクターの一部をコードしている４kbＢam
ＨI−ＰvuIフラグメント(フラグメント５)を回収した。
フラグメント１、２、３、４および５の混合物をライゲ
ートし、大腸菌２９４ＤＮＡの形質転換に用いた。制限
分析によりアンピシリン耐性コロニーをスクリーニング
した。ＨＩＲ−ＨＥＲ連結部とオーバラップする２４１
bpのＰstIフラグメントをＭ１３Ｔyl３１にクローン
し、配列決定を行って予測される連結部を立証した。
【００６６】トランスメンブラン領域を含有しないハイ
ブリッドリセプターの発現ベクターを、ＡpaIＥＧＦリ
セプター下流のトランスメンブラン領域がＭ１３突然変
異誘発によって欠失されており、欠失されたＥＲフラグ
メントにフレーム内で、ＡpaIアダプターがライゲート
されていることを除き、pＣＶＳＶ−ＨＩＲcを用いて同
様の方法で組立てた。
【００６７】インシュリンリセプターα鎖とＥＧＦリセ
プターのトランスメンブランおよび細胞質領域とのハイ
ブリッドであって、ＨＩＲ−β鎖配列を全く含まないハ
イブリッドリセプターＩαＥＲをコードしているベクタ
ーをＩＥＲプラスミドのオリゴヌクレオチドで指令され
る欠失突然変異により調製した。結合したインシュリン
リセプターおよびＥＧＦリセプターの配列をＭ１３mp１
０ベクターのＢamＨI部位に導入した。Ｍ１３mp１０の
ＨindIII部位の隣りに所望の方向性でＩＲ配列を含有し
ている分子を同定し、アデルマン(Ａdelman)ら[“ＤＮ
Ａ"２:１８３〜１９３(１９８３)]のプロトコールに基
づき、オリゴヌクレオチド５'−ＣＣＣＣＡＧＧＣＣＡ
ＴＣＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＧＡ−３'を用いた欠失
突然変異誘発を行うために、一本鎖の鋳型を調製した。
りん酸化したプライマー５０ｍｇを一本鎖Ｍ１３鋳型２
μｇとハイブリダイズさせた。突然変異した第２の鎖を
完成させ、この二本鎖分子を大腸菌ＪＭ１０１に導入し
た。得られたプラークを、ハイブリダイゼーションのプ
ローブとしてプライマーを用い、高いストリンジェンシ
ィの下、ベントン(Ｂenton)およびデービス(Ｄavis)の
“サイエンス"１９６:１８０〜１８２(１９７７)記載の
方法に従い、スクリーニングした。二本鎖ＤＮＡを調製
し、突然変異した領域を含有する１.２kbＢstＥII制限
フラグメントを用いてＩＥＲ発現プラスミドのそれぞれ
のＤＮＡフラグメントと置換し、pIαＥＲを得た。
【００６８】実施例 ３ インシュリンおよびＥＧＦの
ハイブリッドリセプターの発現 ＣＯＳ−７サル腎細胞[グルツマン(Ｇluzman)１９８
１、“セル"２３:１７５〜１８２]を１０％ウシ胎児血
清と抗生物質とを含んだ、ＤＭＥＭ培地とＦ１２培地の
５０:５０混合物中で培養した。全細胞培養培地[ギブコ
(Ｇibco)]は、２mＭ Ｌ−グルタミンと２０mＭＨＥＰ
ＥＳpＨ７.４を含有していた。
【００６９】実施例２で得たpＩＥＲまたはpＩαＥＲを
グラハム(Ｇraham)およびファン・デル・エブ(Ｖan der
Ｅb)、１９７３“ヴィロロジィ(Ｖirology)"５２:４５
６〜４６７のプロトコールに基づき、りん酸カルシウム
による共沈法によってＣＯＳ−７細胞に導入した。準
(サブ)全面成長した細胞を８ｃｍの培養皿あたり、１０
μｇのプラスミドでトランスフェクトした。プラスミド
ＤＮＡを１mＭトリスpＨ７.５、０.１mＭＥＤＴＡ、お
よび２５０mＭＣaＣｌ2０.５５ｍｌに溶かした後、５０
mＭＨＥＰＥＳpＨ７.１２、２８０mＭＮaＣｌおよび１.
５mＭＮa2ＨＰＯ4０.５ｍｌをゆっくり加えた。４５分
間の間に沈殿が徐々に形成され、それを、細胞培養培地
に加えた。トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞を、
抗生物質、２mＭＬ−グルタミン、２０mＭＨＥＰＥＳお
よび１０(v／v)％ウシ胎児血清(pＨ７.４)を含んだＤＭ
ＥＭ培地とＦ−１２培地の５０:５０混合物中、３７℃
で５３時間培養した。
【００７０】pＩＥＲまたはpＩαＥＲで形質転換された
ＣＯＳ−７細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２.２ｃｍのウ
エルあたり、０.２％ウシ血清アルブミン(シグマ)、バ
シトラシン(０.５ｍｇ／ｍｌ、シグマ)および125Ｉイン
シュリン(０.５μＣi／ウエル)、９３μＣi／μｇを含
んだ血清不含細胞培養培地１ｍｌ中、２１℃で２時間イ
ンキュベートした。細胞を、４℃において、ＰＢＳで３
回洗浄し、３７℃において、０.１％ＳＤＳ、０.１ＭＮ
aＯＨ０.５ｍｌ中で３０分間溶解させた。ガンマ・カウ
ンター中で放射活性を測定した。形質転換体へのインシ
ュリンの結合が、対照におけるそれよりも増加している
ことを、図３に示した。
【００７１】ヒト上皮性腫瘍細胞Ａ４３１（ＥＧＦリセ
プターの対照リセプター供給源)を１ｌあたり４.５mＭ
グルコース、１０％ウシ胎児血清および抗生物質を含ん
だＤＭＥＭ中で培養した。
【００７２】実施例４ 正常なリセプターおよびハイブ
リッドリセプターにおけるホルモン刺激下での自己りん
酸化 pＩＥＲまたはpＩαＥＲで形質転換した、並びにmock形
質転換に付されたＣＯＳ−７細胞を８ｃｍの培養皿中で
５３時間増殖させて得た単層あるいはＡ４３１細胞をＰ
ＢＳで２回洗浄し、クリスら(Ｋris)、１９８５“セル"
４０:６１９〜６２５の記載の如くにして可溶化した。
１５０mＭＮaＣｌ、１.５mＭＭgＣｌ2、１mＭＥＧＴ
Ａ、１０％グリセロール、１％トリトンＸ−１００、１
％アプロチニン(シグマ)および４μｇ／ｍｌフェニルメ
チルスルホニル・フルオライド(ＰＭＳＦ)(シグマ)並び
に０.５ｍｇ／ｍｌバシトラシン(シグマ)を含有する５
０mＭＨＥＰＥＳバツファー(pＨ７.５)１ｍｌを、この
単層に４℃において５分間加えた。培養皿から、可溶化
されたタンパク質を含有しているバツファーを取り、４
℃において５分間、１０,０００ｇで遠心した。トラン
スメンブラン領域を欠失したハイブリッドリセプターで
形質転換した細胞の培養上清を４℃において５分間、１
０,０００ｇで遠心した。細胞溶解液または培養上清０.
２ｍｌを２００nＭインシュリン(シグマ)または１μＭ
ＥＧＦと１時間インキュベートした。
【００７３】インシュリンリセプターと結合し得るマウ
スのモノクローナル抗体[ＣII２５.３、ガングリィら
(Ｇanguly)１９８５“細胞制御における今日の話題(Ｃu
rrentＴopics in Ｃellular Ｒegulation)"２７:８３−
９４]をプロティンＡ−セファロースに吸着させて固定
化した。しかしながら、どの様なポリクローナルまたは
モノクローナル抗−インシュリンリセプター抗体を用い
ても良いことは、理解できるであろう。抗体１μｌを、
界面活性剤不含の溶解バツファー中、膨潤させ、予め洗
浄しておいたプロティンＡ−セファロース(１:１)のス
ラリーと３０分間混合し、抗−ＩＲ抗体を吸着させた。
【００７４】固定化抗−ＩＲ抗体のスラリー５０μｌを
ＥＧＦまたはインシュリンで処理した細胞リゼイト、あ
るいは細胞培養上清に加え、４℃で１５分間インキュベ
ートした。生成した免疫沈降物をＨＮＴＧバツファー
(２０mＭＨＥＰＥＳ、pＨ７.５:１５０mＭＮaＣｌ、１
０％グリセロールおよび０.１％トリトンＸ−１００)
０.９ｍｌで４回洗浄した。容量３０μｌの沈殿を５mＭ
ＭnＣｌ2に調節し、１５μＣiのγ−32Ｐ−ＡＴＰ(５,
０００Ｃi／mmol)を４℃において０.５〜１０分間で加
えた。ＡＴＰの終濃度は、０.１pＭＡＴＰ(ＥＧＦ、Ｉ
ＥＲまたはＩαＥＲ形質転換体またはそれらの対照に関
して)、あるいは１００μＭＡＴＰ(ＨＩＲ形質転換体ま
たはその対照に関して)であった。３倍濃度のＳＤＳ試
料バツファー２０μｌを加えることにより自己りん酸化
反応を終了させた。図４のａ及び図５のｄにおいては５
分後、図４のｂにおいては１分後、そして図５のｃにお
いては指示した時間の後に、５分間煮沸することによっ
て自己りん酸化を終了させた。試料を遠心し、２０μｌ
づつ、５％／７％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分
析した[ラエムリ(Ｌaemmli)、１９７０“ネイチャー"２
７７:６８０〜６８５]。
【００７５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元ゲル上で得られた泳
動パターンはチロシンキナーゼ配列を含有するポリペプ
チドに対する35Ｓ−Ｍet標識法の結果と一致した。図４
のｂ(ＨＩＲ＋)から、内因性ＣＯＳ−７コントロールの
場合よりも、ヒトインシュリンリセプターβサブユニッ
トの場合の方が、インシュリン刺激自己りん酸化が高い
ことが分る。この場合、インシュリンリセプターキナー
ゼにとって必要なＡＴＰの濃度(１００μＭ)に起因し
て、観察されるシグナルは弱いが、インシュリンの誘導
効果は強い。これに対し、Ａ４３１細胞ＥＧＦ対照リセ
プター(Ａ４３１)で認められるように、ＥＧＦリセプタ
ーキナーゼの活性およびＥＧＦ刺激の測定にはピコモル
濃度しか必要としない。キメラリセプター分子ＩＥＲが
特徴的に低濃度のＡＴＰを必要とすることは、そこに、
ＥＧＦリセプターキナーゼが存在していることを示すも
のである。リガンド誘導でキナーゼのＶmaxが増加さ
れ、最大誘導(４倍)は４℃において、３０秒間の反応の
後に認められた(図５のｃ)。この観察結果は野生型のＥ
ＧＦリセプターの動力学的特性とよく関連しており[ス
タロスら(Ｓtaros)１９８５、「細胞制御の分子的側面
(Ｍolecular Ａspects ofＣellular Ｒegulation)」４
巻、「トランスメンブランのシグナリングにおける分子
機構(Ｍolecular Ｍechanisms of Ｔransmembrane Ｓig
nalling)」]、このことは、インシュリン結合領域によっ
てコントロールされた場合でも、ＥＧＦリセプターキナ
ーゼは、その本来の特徴を維持することを示すものであ
る。
【００７６】驚くべきことに、インシュリンで刺激され
た、あるいは刺激されていないＩＥリセプターハイブリ
ッドの１３０kdりんタンパク質サブユニットは微妙な、
しかし再現性のある、サイズの相違を示す(図５のｄ)。
この観察結果からリガンド誘導酵素活性は、チロシン残
基のりん酸化をもたらすが、基本的なレベルでの修飾を
伴なわず、以後に続くリセプターの細胞質内領域の立体
配座上の変化によってＳＤＳゲル内での泳動特性が変化
し得るという可能性が示される。無傷のＥＧＦリセプタ
ー内でも同様の変化が起こり得るが、１７０kdグリコプ
ロティンという大きいモノマーサイズを有するので検出
されていない。電気泳動における変化は、Ｃa2＋／カル
モジュリン依存性タンパク質キナーゼ[クレットら(Ｋur
et)、１９８５“ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリィ"２６０:６４２７〜６４３３]、タイプIIc
ＡＭＰ−依存性タンパク質キナーゼ[ヘミングスら(Ｈem
mings)、１９８１“ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・
バイオケミストリィ(Ｅur.Ｊ.Ｂiochem.)"１１９:４４
３〜４５１]等の他の自己りん酸化タンパク質について
も報告されている。
【００７７】開裂されていないキメラプロリセプターＩ
ＥＲはインシュリン刺激による自己りん酸化を示すので
(図４のｂおよび図５のｃ、ＩＥＲ＋ゲルの頂上のバン
ド)、インシュリンの結合とシグナルの導入に必要な４
級構造が、インシュリンリセプターのタンパク分解的プ
ロセッシングの前に形成されているに相違なく、このこ
とは先行文献とも一致する[ブラツクシェアーら(Ｂlack
shear)、１９８３、“ＦＥＢＳ"１５８:２４３〜２４
６;リース−ジョーンズら(Ｒees−Ｊones)１９８３“バ
イオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・
コミュニケーションズ(Ｂiochem.Ｂiophys.Ｒes.Ｃom
m.)１１６:４１７〜４２２]。インシュリンリセプター
のβサブユニットとプロリセプター開裂部位が欠失され
た細胞外部分を有するキメラ組立て物ＩαＥＲを用いた
実験(図４のｂ、ＩαＥＲ比較図、＋と−)によると、得
られた１８０kdの一本鎖糖タンパク質は、見かけ上イン
シュリンに対する結合能力を有するにもかかわらず、細
胞質内キナーゼ領域に対するインシュリンの活性化能は
失われていることが分った。
【００７８】上記の如く、インシュリンはピコモル濃度
以下のＡＴＰの存在下、インシュリンリセプターのホス
ホトランスフェラーゼが不活性であるような条件の下
で、ＥＧＦリセプターの自己りん酸化活性の程度を制御
する。インシュリンリセプターをαサブユニットとβサ
ブユニット並びにβサブユニットのアミノ末端にプロセ
ッシングするためのシグナルを含めて、インシュリンリ
セプターの完全な細胞外部分を含有するハイブリッドＩ
ＥＲに関してのみ、ホルモンによるコントロールが認め
られた。リセプターのプロセッシングは、本発明の発現
系で行われるようである。βサブユニットの全ての部分
をも欠き、その結果、開裂シグナルを欠くキメラＩαＥ
Ｒの場合にはホルモンの影響を認めなかった。この様な
ＩＥＲとＩαＥＲとの構造上の相違が、シグナル導入に
おける決定的なキメラリセプターの構造に強く影響して
いると考えられる。
【００７９】実施例 ５ リセプター−腫瘍遺伝子ハイ
ブリッド(ＨＥＲ−erbＢ)をコードしているベクターの
組立て Ｖ−erbＢ腫瘍遺伝子産物の細胞内領域とＥＧＦリセプ
ターの細胞外およびトランスメンブラン領域とを融合さ
せたハイブリッドリセプター(ＨＥＲ−erbＢ、図６)を
組立てた。
【００８０】このハイブリッドリセプターは、ＳＶ４０
の初期プロモーターのコントロール下、プラスミドから
発現される。このプラスミドはメトトレキセート(ＭＴ
Ｘ)耐性のための突然変異体ＤＨＦＲ遺伝子をも含有し
ている。ネオマイシン耐性遺伝子をコードしているプラ
スミドで同時形質転換して選択を行い、ＭＴＸ−含有培
養培地中で選択することによりＤＮＡを増幅させた。
【００８１】λＨＥＲ−Ａ６４(ウールリッヒら)をＳac
IおよびＮarIで消化し、ＥＧＦリセプターの全細胞外領
域とトランスメンブラン領域とをコードしている制限フ
ラグメントを回収した。ＡＥＶ−erbＢ(Ｈ)[ヤマモトら
(Ｙamamoto,Ｔ.)１９８３“セル"３５:７１〜７８]の全
細胞内領域をコードしている１.７kbＡhaII−ＳtuI制限
フラグメントをＥＧＦフラグメントと一緒に、ＳacIと
ＳmaIで切り開いたpＵＣ１２プラスミドにライゲートし
た。この組換えプラスミドを大腸菌ＨＢ１０１内で増幅
させ、全キメラリセプターをコードしている領域を３.
７kbＳacI−ＸmnI制限フラグメント(両部位は、それぞ
れＥＧＦリセプターおよびv−erbＢ配列の非翻訳領域に
位置していた)中に取り出した。
【００８２】p３４２Ｅ[クロウレィら(Ｃrowley)、１９
８３、“モル・セル・バイオロ(Ｍol.Ｃell.Ｂiol.)"
３:４４〜５５]をＥcoＲIで消化し、開裂されたプラス
ミドを回収した。配列:
【化１】 を有するアダプターを開裂したプラスミドとライゲート
し、ライゲーション混合物で大腸菌２９４をトランスフ
ェクトし、アダプター挿入体を含有するプラスミドpＣ
ＶＳＶＥ−ＨＢＳをアンピシリン耐性コロニーから回収
した。
【００８３】pＣＶＳＶＥ−ＨＢＳをＳacIで部分消化
し、線状のベクターフラグメント(I)を回収した。線状
プラスミドをＨpaIで消化し、ベクターフラグメントを
回収した。
【００８４】pＣＶＳＶＥ−ＨＢＳベクターフラグメン
トとハイブリッドリセプターをコードしているＳacI−
ＸmnIフラグメントとライゲートし、形質転換された大
腸菌ＨＢ１０１コロニーから発現ベクターpＣＶＳＶ−
ＨＥＲ−erbＢを回収した。
【００８５】実施例 ６ リセプター−腫瘍遺伝子ハイ
ブリッドの発現 発現ベクターpＣＶＳＶＥ−ＨＥＲ−erbＢを、ネオマイ
シン耐性を付与し得る発現プラスミドと一緒に、グラハ
ムとフアン・デァ・エブ(１９７３)のプロトコールに基
づくりん酸カルシウム共沈法により、正常なラット１線
維芽細胞に同時トランスフェクトした。準全面成長した
細胞を、８ｃｍの培養皿あたり１０μｇのプラスミドＤ
ＮＡを用いてトランスフェクトした。ＤＮＡを１mＭト
リスpＨ７.５、０.１mＭ ＥＤＴＡ、２５０mＭ ＣaＣｌ
2 ０.５５ｍｌに溶かし、５０mＭＨＥＰＥＳ pＨ７.１
２、２８０mＭ ＮaＣｌ、１.５mＭ Ｎa2ＨＰＯ4 ０.５
ｍｌをゆっくり加えた。４０分以内に徐々に沈殿が析出
し、これを細胞培養培地１０ｍｌに加えた。トランスフ
ェクションから５時間後、細胞をＰＢＳ中２０％グリセ
ロール３ｍｌ内で１分間インキュベートすることにより
グリセリンショック処置に付した。グリセリンを洗い流
した後、元の培地中で細胞をさらに培養した。
【００８６】選択マーカーとしてＳＶ４０初期プロモー
ターのコントロール下にあるネオマイシン耐性遺伝子を
用いた。トランスフェクションの２日後、選択開始に際
し、４００μｇ／ｍｌのゲネティシン(Ｇeneticin)(シ
グマＧ５０１３)を補充した培地を用いた。次いで、ネ
オマイシン耐性細胞を、７％の透析したウシ胎児血清を
含有し、メトトレキセート(シグマＡ６７７０)を濃度２
００nＭ、次いで１０００nＭに補充した培地で増殖させ
た。その結果、ネオマイシン耐性セルラインにおけるc
ＤＮＡ発現の、段階的な増幅がみられた。
【００８７】形質転換体内でのハイブリッドの発現は、
最初、界面活性剤によるリゼイトをヒトＥＧＦリセプタ
ーに特異的なマウスのモノクローナル抗体Ｒ１で免疫沈
降させた後、35Ｓ−メチオニンで代謝的にラベルされた
タンパク質を分析することにより監視された。安定に発
現されるセルラインは35Ｓ−メチオニンで代謝的にラベ
ルされている。プロティンＡ−セファロースに吸着させ
たＲ１抗体により、上記の如く調製された界面活性剤に
よるリゼイトから特異的なタンパク質を免疫沈降させ、
ＳＤＳ還元ポリアクリルアミドゲル上で分析した。マウ
スのＲ１モノクローナル抗体[ウオーターフィールドら
(Ｗaterfield)、１９８２、“ジャーナル・オブ・セル
ラー・バイオケミストリィ(Ｊ.Ｃell.Ｂiochem.)"２０:
１４９〜１６１]は、内因性のラットI細胞のＥＧＦリセ
プターを認識しない。ＨＥＲ−erbＢタンパク質は、メ
トトレキセートによる増幅の前または後に、免疫沈降法
により容易に検出された。予想通り、ＨＥＲ−erbＢタ
ンパク質はＡ４３１細胞内で発現される野生型のＥＧＦ
リセプターよりも小さかった。Ａ４３１内で極めて高い
レベルにＥＧＦリセプターが発現された場合と比較する
と、増幅されたＲatI細胞は、３倍少ないＨＥＲ−erbＢ
を発現するにすぎない。
【００８８】ハイブリッドＨＥＲ−erbＢタンパク質は、
125I−ＥＧＦが種々の濃度において形質転換体細胞と結
合したことから、特異的なＥＧＦ結合を示した。この結
合は飽和され得るものであり、１０倍過剰の非標識ＥＧ
Ｆの存在下では完全に置換され得る。全面成長したラッ
トI培養への125Ｉ−標識ＥＧＦの結合量は個々の細胞培
養中で発現されたＥＧＦリセプターまたはキメラリセプ
ターの量に正確に対応していた。この様に、組立てられ
たタンパク質は完全な機能を持ったＥＧＦ結合部位を含
有しており、細胞表面に忠実に移行されていた。
【００８９】実施例 ７ ＥＧＦの刺激下でのインビト
ロにおける自己りん酸化 ＨＥＲ−erbＢがインビトロでの自己りん酸化活性を有
するか否かを試験するために、細胞リゼイトを上記の如
くに免疫沈降させ、32Ｐ−γ−ＡＴＰと一緒にインキュ
ベートし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動とオートラ
ジオグラフィーによって分析した。８ｃｍの培養皿中で
増殖させた、形質転換された細胞の単一層をＰＢＳで２
回洗浄し、クリスら(Ｋris)“セル"４０:６１９〜６２
５(１９８５)の記載に従って可溶化した。この単一層に
５０mＭ ＨＥＰＥＳ pＨ７.５、１５０mＭ ＮaＣｌ、
１.５mＭ ＭgＣｌ2、１mＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロ
ール、１％トリトンＸ−１００、１％アプロチニンおよ
び４μｇ／ｍｌフェニルメチルスルホニルフルオライド
(ＰＭＳＦ)１ｍｌを４℃で５分間、加えた。可溶化され
た細胞を４℃で５分間、１０,０００ｇで遠心し、上清
を−７０℃で保持するか、さらにプロセッシングした。
【００９０】自己りん酸化のＥＧＦ刺激は、免疫沈降に
先立って０.４ｍｌ中、ＴＸ−１００の濃度を０.５％に
希釈しておいた界面活性剤による細胞リゼイトと５μｇ
／ｍｌＥＧＦとを４℃で１５分間インキュベートするこ
とにより誘導した。３０分間プロテインＡ−セファロー
スに予め結合させておいたＲ１抗体を加え(１μｌ抗体
／５０μｌスラリー、１:１)、４℃で１５分間インキュ
ベーションを続けた。免疫沈殿物をＨＮＴＧバツファー
(２０mＭ ＨＥＰＥＳ、pＨ７.５、１５０mＭＮaＣｌ、
１０％グリセロール、および０.１％トリトンＸ−１０
０)０.９ｍｌ中で５回洗浄した。容量３０μｌの洗浄し
た免疫沈殿物を５mＭ ＭnＣｌ2に調節し、γ−32Ｐ−Ａ
ＴＰ１５μＣiを４℃で０.５分間加えた。３倍濃度のＳ
ＤＳ試料バツファー２０μｌを加えて自己りん酸化を終
了させた。試料を５分間煮沸し、遠心し、２０μｌづ
つ、５％／７％ポリアクリルアミド還元ゲルで分析した
(ラエムリ、１９７０)。減圧下、７０℃でゲルを固定
し、乾燥させた。対照として、正常なＲatI線維芽細胞
を用いた。サイズマーカーはキロダルトンで示されてい
る。野生型のＥＧＦリセプター同様、ＨＥＲ−erbＢハ
イブリッドにより、免疫沈降物中に有意な量の32Ｐが取
り込まれた。りん酸化の程度はＥＧＦの添加(＋で表さ
れている)によって増大し;３０秒間の測定では、ＥＧＦ
の存在下においてりん酸化の速度は３倍高いことが分っ
た。v−erbＢタンパク質はそれ自身、極めて低い自己り
ん酸化活性を有するにすぎない[ラックスら(Ｌax)、１
９８５、“ＥＭＢＯジャーナル"４:３１７９〜３１８
２]。ハイブリッドの自己りん酸化活性は低いが、ＥＧ
Ｆ結合領域の再構築により、リガンドによって自己りん
酸化活性が誘導され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、インシュリンリセプター(ＨＩＲ)と
表皮性成長因子リセプター(ＨＥＲ)とのハイブリッドリ
セプターの模式図である。
【図２】 図２は、ＨＩＲ、ＨＥＲおよびこれらのハイ
ブリッドリセプターを比較して示した模式図である。
【図３】 図３は図１のcＤＮＡ組立て物でトランスフ
ェクトされたＣＯＳ−７細胞における125Ｉインシュリ
ンの結合程度を示すグラフである。
【図４】 図４は、種々に形質転換された細胞の免疫沈
降−自己りん酸化産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元ゲル電気
泳動の結果を示す写真の模写図である。
【図５】 図５は、種々に形質転換された細胞の免疫沈
降−自己りん酸化産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元ゲル電気
泳動の結果を示す写真の模写図である。
【図６】 図６はハイブリッドリセプターＨＥＲ−erb
Ｂの模式図である。
【図７】 図７はリガンドの存在(＋)したおよび非存在
下(−)におけるＨＥＲ−erbＢのゲル電気泳動の結果を
示す写真の模写図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/566 // Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ヘイモ・リーデル アメリカ合衆国カリフォルニア94131、サ ン・フランシスコ、ウォーレン・ドライ ブ・ナンバー301、480番 (72)発明者 アクセル・ウールリッヒ アメリカ合衆国カリフォルニア94117、サ ン・フランシスコ、アッパー・テラス433 番

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】(a)リセプターのリガンド結合領域と、(b)
    該リガンド結合領域に対しヘテロローガスなリポーター
    ポリペプチドとを含有するハイブリッドリセプターをコ
    ードしている核酸。
  2. 【請求項２】(a)リセプターのリガンド結合領域と、(b)
    該リガンド結合領域に対しヘテロローガスなリポーター
    ポリペプチドとを含有するハイブリッドリセプターをコ
    ードしている核酸を含有する複製可能なベクター。
  3. 【請求項３】(a)リセプターのリガンド結合領域と、(b)
    該リガンド結合領域に対しヘテロローガスなリポーター
    ポリペプチドとを含有するハイブリッドリセプターをコ
    ードしている核酸を含有する複製可能なベクターを含有
    する宿主細胞。
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