JPH09117285A - リガンド、そのアンタゴニストまたはアゴニストの効率的な測定のためのハイブリッドリセプターをコードする核酸 - Google Patents
リガンド、そのアンタゴニストまたはアゴニストの効率的な測定のためのハイブリッドリセプターをコードする核酸Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 リガンドのアゴニストまたはアンタゴニスト
としての結合特性についての効率的な測定のためのハイ
ブリッドリセプターをコードする核酸の提供。 【解決手段】 (a)リセプターのリガンド結合領域をコ
ードしている配列を有する核酸と、(b)該リガンド結合
領域に対しヘテロローガスなリポーターポリペプチドを
コードしている配列を有する核酸とを結合させる。
としての結合特性についての効率的な測定のためのハイ
ブリッドリセプターをコードする核酸の提供。 【解決手段】 (a)リセプターのリガンド結合領域をコ
ードしている配列を有する核酸と、(b)該リガンド結合
領域に対しヘテロローガスなリポーターポリペプチドを
コードしている配列を有する核酸とを結合させる。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、通常インビボにお
いてリセプター(受容体)と相互作用するリガンドの機能
をまねるようにしてあるいは該機能に拮抗するようにし
て、該リセプターと結合する能力について、候補薬物を
スクリーニングする方法に関するものである。また、本
発明はリガンドの機能的な分析法に関するものである。
いてリセプター(受容体)と相互作用するリガンドの機能
をまねるようにしてあるいは該機能に拮抗するようにし
て、該リセプターと結合する能力について、候補薬物を
スクリーニングする方法に関するものである。また、本
発明はリガンドの機能的な分析法に関するものである。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】発明の構成および目的 リセプターは細胞表面に存在し、シグナル伝達機能を有
するタンパク質性の巨大分子と定義される。細胞膜の外
表面には多くのリセプターが存在する。
するタンパク質性の巨大分子と定義される。細胞膜の外
表面には多くのリセプターが存在する。
【0003】これらの細胞表面リセプターは細胞外領域
と細胞質(内)領域とを有しており、細胞外領域と他の細
胞の物質とは特異的に結合することができ、この細胞外
領域による物質への結合作用の結果、細胞質領域と他の
細胞分子とが相互作用する。リセプターによって結合さ
れる物質はリガンドと呼称されるが、この言葉は、その
相手であるリセプターとの関連においてのみ、明確に定
義されるものである。「リガンド」という用語は、その物
質が、リセプターがリガンドの存在に関する情報を標的
分子に伝えるような方法で、該リセプターと結合し、開
裂し、あるいはリセプターと相互作用するということを
除けば、特定の分子量、他の構造上の特徴または構成上
の特徴を暗示するものではない。言い換えると、リセプ
ターと結合し得る物質の全てがリガンドであるとは限ら
ないが、リガンドは全てリセプターと結合し得る。リセ
プターには、免疫グロブリンの様な物質は含まれない。
と細胞質(内)領域とを有しており、細胞外領域と他の細
胞の物質とは特異的に結合することができ、この細胞外
領域による物質への結合作用の結果、細胞質領域と他の
細胞分子とが相互作用する。リセプターによって結合さ
れる物質はリガンドと呼称されるが、この言葉は、その
相手であるリセプターとの関連においてのみ、明確に定
義されるものである。「リガンド」という用語は、その物
質が、リセプターがリガンドの存在に関する情報を標的
分子に伝えるような方法で、該リセプターと結合し、開
裂し、あるいはリセプターと相互作用するということを
除けば、特定の分子量、他の構造上の特徴または構成上
の特徴を暗示するものではない。言い換えると、リセプ
ターと結合し得る物質の全てがリガンドであるとは限ら
ないが、リガンドは全てリセプターと結合し得る。リセ
プターには、免疫グロブリンの様な物質は含まれない。
【0004】リセプターは、一般に、構造上3領域に分
けられる。リセプターを細胞表面にうめ込むのに関与し
ていると考えられる約20〜25残基からなる疎水性の
高い領域は、そのアミノ末端およびカルボキシ末端で、
それぞれ細胞外環境および細胞質領域(細胞内環境)へ伸
びている領域と、その境を接している。この細胞外領域
にはリガンド結合領域が含まれている。細胞質領域には
細胞質に変化を起こさせる領域が含まれている。一般
に、細胞質領域には、リガンドの結合により引き起こさ
れるリセプターの凝集または立体配座の変化により活性
化される酵素機能が含まれている。
けられる。リセプターを細胞表面にうめ込むのに関与し
ていると考えられる約20〜25残基からなる疎水性の
高い領域は、そのアミノ末端およびカルボキシ末端で、
それぞれ細胞外環境および細胞質領域(細胞内環境)へ伸
びている領域と、その境を接している。この細胞外領域
にはリガンド結合領域が含まれている。細胞質領域には
細胞質に変化を起こさせる領域が含まれている。一般
に、細胞質領域には、リガンドの結合により引き起こさ
れるリセプターの凝集または立体配座の変化により活性
化される酵素機能が含まれている。
【0005】リセプターは、様々な言葉で表わされる活
性化またはシグナル導入(トランスダクション)のプロセ
スを通して機能すると考えられる。リガンドは、細胞質
内におけるリセプター分子の立体配座を変化させるよう
な方法で細胞外のリガンド結合領域と結合する。この立
体配座の変化(活性化と呼ばれる)により、リセプターの
細胞質成分に対する作用が変化する。リセプターの活性
化によってもたらされる変化には、リセプターの酵素的
作用の変化または発生が含まれる。
性化またはシグナル導入(トランスダクション)のプロセ
スを通して機能すると考えられる。リガンドは、細胞質
内におけるリセプター分子の立体配座を変化させるよう
な方法で細胞外のリガンド結合領域と結合する。この立
体配座の変化(活性化と呼ばれる)により、リセプターの
細胞質成分に対する作用が変化する。リセプターの活性
化によってもたらされる変化には、リセプターの酵素的
作用の変化または発生が含まれる。
【0006】近年、製薬業界においては、疾病または傷
害におけるリセプターの役割に関する研究に重点が置か
れ、リセプターと結合し得る、一般に低分子量の物質で
ある薬物の製造に向けて研究がなされてきた。初期のス
クリーニングで同定された薬物は、生体内または体外移
植組織中で所望の活性について試験される。結局、従来
の方法では大規模なスクリーニングは不可能であった。
即ち、標的であるリセプターを含有する組織標本または
単離細胞(例えば心動脈組織)の取得には多額を要し、こ
れらは限られた量しか存在せず、また、これらを機能的
に生存可能な状態に維持することが困難である。その
上、組織標本に対して候補薬物を確実に、かつ再現性よ
く投与することはしばしば困難である。組織培養中で一
次外移植組織(エクスプラント)を用いるスクリーニング
アッセイは、組織標本を用いて行なわれるアッセイ(分
析)よりも大規模に行なわれ得る。しかしながら、生理
学的な作用を分析することはより困難であり、その様な
分析は、培養培地や培養条件等、多くの干渉源による干
渉を受ける。最後に、天然物質から単離したリセプター
を用いる分析法には、リセプターが自然に変化し得るこ
と、および適当な天然の供給源が常に手に入るとは限ら
ないという不都合がある。本発明は、リガンドの結合の
みならず、リガンドのアゴニストまたは拮抗物質として
の結合特性を決定するための、大規模な実施が可能であ
り、再現容易で簡便な分析システムを提供することを目
的とするものである。
害におけるリセプターの役割に関する研究に重点が置か
れ、リセプターと結合し得る、一般に低分子量の物質で
ある薬物の製造に向けて研究がなされてきた。初期のス
クリーニングで同定された薬物は、生体内または体外移
植組織中で所望の活性について試験される。結局、従来
の方法では大規模なスクリーニングは不可能であった。
即ち、標的であるリセプターを含有する組織標本または
単離細胞(例えば心動脈組織)の取得には多額を要し、こ
れらは限られた量しか存在せず、また、これらを機能的
に生存可能な状態に維持することが困難である。その
上、組織標本に対して候補薬物を確実に、かつ再現性よ
く投与することはしばしば困難である。組織培養中で一
次外移植組織(エクスプラント)を用いるスクリーニング
アッセイは、組織標本を用いて行なわれるアッセイ(分
析)よりも大規模に行なわれ得る。しかしながら、生理
学的な作用を分析することはより困難であり、その様な
分析は、培養培地や培養条件等、多くの干渉源による干
渉を受ける。最後に、天然物質から単離したリセプター
を用いる分析法には、リセプターが自然に変化し得るこ
と、および適当な天然の供給源が常に手に入るとは限ら
ないという不都合がある。本発明は、リガンドの結合の
みならず、リガンドのアゴニストまたは拮抗物質として
の結合特性を決定するための、大規模な実施が可能であ
り、再現容易で簡便な分析システムを提供することを目
的とするものである。
【0007】同様に、有意義な臨床診断は、しばしば不
活性形のリガンド(例えばリガンドの活性を変化させた
り、消滅させるような、試験対象の有する酵素作用また
は他の作用の下におかれたリガンド)の干渉を受けるこ
となく、生物学的に活性なリガンドを分析することに依
存している。被検試料中のリガンドの測定には、イムノ
アッセイが広範囲に用いられている。しかしながら、活
性形のリガンドと不活性形のリガンドとを識別し得る抗
体の同定は、往々にして極めて困難である。リセプター
は、アナライト結合物質としてまれに抗体の代わりに用
いられていた。しかしながら、リセプターと結合する物
質の全てが、必ずしもリセプターの活性を誘発する、即
ち、生物学的に活性であるとは限らない。本発明は、臨
床的な被検試料中に含まれているリガンドであって、そ
のもののリセプターのシグナル導入を誘発し、あるいは
阻害する作用を有するリガンドの同定法を提供するもの
である。
活性形のリガンド(例えばリガンドの活性を変化させた
り、消滅させるような、試験対象の有する酵素作用また
は他の作用の下におかれたリガンド)の干渉を受けるこ
となく、生物学的に活性なリガンドを分析することに依
存している。被検試料中のリガンドの測定には、イムノ
アッセイが広範囲に用いられている。しかしながら、活
性形のリガンドと不活性形のリガンドとを識別し得る抗
体の同定は、往々にして極めて困難である。リセプター
は、アナライト結合物質としてまれに抗体の代わりに用
いられていた。しかしながら、リセプターと結合する物
質の全てが、必ずしもリセプターの活性を誘発する、即
ち、生物学的に活性であるとは限らない。本発明は、臨
床的な被検試料中に含まれているリガンドであって、そ
のもののリセプターのシグナル導入を誘発し、あるいは
阻害する作用を有するリガンドの同定法を提供するもの
である。
【0008】少くともいくらかの、インビトロで測定可
能なリガンド相互作用依存性の既知の活性を有する多数
のリセプターが同定されている。例えば、EGFが表皮
成長因子受容体に結合することで、リセプターのホスホ
トランスフェラーゼ領域が刺激され、その細胞内の細胞
質領域に存在している幾つかの標的アミノ酸残基がりん
酸化される(自己りん酸化、オートホスホリレーション
と称される過程)。また、リセプターは、そのホスホト
ランスフェラーゼ活性部位が位置している領域に結合す
る、抗体または特異的な細胞質内の基質ポリペプチド類
をりん酸化することも知られている。不運にも、他のリ
セプターは、それらが高い親和性をもってリガンドと結
合することが分かっているにもかかわらず、既知のリガ
ンド依存性酵素活性を有しないか、あるいはそれらの活
性が余りにも低く、リガンド依存性の活性化の定量分析
が困難となっている。治療目的にとっては、その様な未
解明のリセプターとリガンドとの相互作用に拮抗した
り、それを促進することが望ましいが、関連組織が存在
しない条件下、また幾つかの場合には、無傷の生物体の
不在下では、ある候補薬物とリセプターとの結合が、単
なる機能の中和の状態であるか否かを決定する方法も、
候補薬物がアゴニストまたは拮抗体のいずれかとして結
合していることを決定する方法も得られていない。従っ
て本発明は、あるリガンドのリセプターが既知のシグナ
ル導入特性を示さない場合に、候補薬物を、リガンドに
対するアゴニストまたは拮抗体活性に関してスクリーニ
ングする方法を提供することを目的とするものである。
能なリガンド相互作用依存性の既知の活性を有する多数
のリセプターが同定されている。例えば、EGFが表皮
成長因子受容体に結合することで、リセプターのホスホ
トランスフェラーゼ領域が刺激され、その細胞内の細胞
質領域に存在している幾つかの標的アミノ酸残基がりん
酸化される(自己りん酸化、オートホスホリレーション
と称される過程)。また、リセプターは、そのホスホト
ランスフェラーゼ活性部位が位置している領域に結合す
る、抗体または特異的な細胞質内の基質ポリペプチド類
をりん酸化することも知られている。不運にも、他のリ
セプターは、それらが高い親和性をもってリガンドと結
合することが分かっているにもかかわらず、既知のリガ
ンド依存性酵素活性を有しないか、あるいはそれらの活
性が余りにも低く、リガンド依存性の活性化の定量分析
が困難となっている。治療目的にとっては、その様な未
解明のリセプターとリガンドとの相互作用に拮抗した
り、それを促進することが望ましいが、関連組織が存在
しない条件下、また幾つかの場合には、無傷の生物体の
不在下では、ある候補薬物とリセプターとの結合が、単
なる機能の中和の状態であるか否かを決定する方法も、
候補薬物がアゴニストまたは拮抗体のいずれかとして結
合していることを決定する方法も得られていない。従っ
て本発明は、あるリガンドのリセプターが既知のシグナ
ル導入特性を示さない場合に、候補薬物を、リガンドに
対するアゴニストまたは拮抗体活性に関してスクリーニ
ングする方法を提供することを目的とするものである。
【0009】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】要約 これらの本発明の目的は、ヘテロローガス(異種)なリポ
ーターポリペプチドであって、リセプターのリガンド結
合領域にリガンドあるいはリガンドのアゴニストまたは
アンタゴニスト(拮抗体)が結合した場合に、コンホメー
ション(立体配座)または機能面で分析可能な変化を生じ
得るリポーターポリペプチドと、該リセプターのリガン
ド結合領域とが融合してなる新規なリセプターハイブリ
ッドを用いることにより達成された。
ーターポリペプチドであって、リセプターのリガンド結
合領域にリガンドあるいはリガンドのアゴニストまたは
アンタゴニスト(拮抗体)が結合した場合に、コンホメー
ション(立体配座)または機能面で分析可能な変化を生じ
得るリポーターポリペプチドと、該リセプターのリガン
ド結合領域とが融合してなる新規なリセプターハイブリ
ッドを用いることにより達成された。
【0010】ある疾病または傷が、特定のリセプターに
作用するリガンドに起因するものである場合、その危険
にさらされているリセプターに対するリガンドの作用に
拮抗し得る物質、即ち、リガンド拮抗体(アンタゴニス
ト)をみつけることが目的となろう。他方、リガンド活
性の不足によって特徴づけられる臨床症状のモデル治療
は、不充分なリガンドまたはリガンド欠損を増強または
補う薬物、即ち、リガンドアゴニストで構成されること
になる。
作用するリガンドに起因するものである場合、その危険
にさらされているリセプターに対するリガンドの作用に
拮抗し得る物質、即ち、リガンド拮抗体(アンタゴニス
ト)をみつけることが目的となろう。他方、リガンド活
性の不足によって特徴づけられる臨床症状のモデル治療
は、不充分なリガンドまたはリガンド欠損を増強または
補う薬物、即ち、リガンドアゴニストで構成されること
になる。
【0011】本発明のハイブリッドリセプターは、リセ
プターに対して活性なアゴニスト薬物をみつけるための
スクリーニング法に有用である。ハイブリッドリセプタ
ーと候補薬物とをインキュベートし、ヘテロローガスな
リポーターポリペプチドによるシグナルの生成を分析す
る。一般に、しかし必然的ではないが、リポーターポリ
ペプチドによって生成されるシグナルは、リポーターポ
リペプチドの酵素機能の活性化または刺激作用として測
定される。候補薬物のアゴニスト活性の定量を欲しない
ならば、既知量のリガンドを有するスタンダードを含有
させる必要はない。実際、インビボでリセプターの活性
を調整するリガンドは全く不明であることもある。本発
明の分析系の1つの利点は、アゴニスト薬物を同定する
のに、リセプターに対するリガンドも、リセプターのイ
ンビボにおけるシグナル導入機構もわかっていることを
要しないという点にある。
プターに対して活性なアゴニスト薬物をみつけるための
スクリーニング法に有用である。ハイブリッドリセプタ
ーと候補薬物とをインキュベートし、ヘテロローガスな
リポーターポリペプチドによるシグナルの生成を分析す
る。一般に、しかし必然的ではないが、リポーターポリ
ペプチドによって生成されるシグナルは、リポーターポ
リペプチドの酵素機能の活性化または刺激作用として測
定される。候補薬物のアゴニスト活性の定量を欲しない
ならば、既知量のリガンドを有するスタンダードを含有
させる必要はない。実際、インビボでリセプターの活性
を調整するリガンドは全く不明であることもある。本発
明の分析系の1つの利点は、アゴニスト薬物を同定する
のに、リセプターに対するリガンドも、リセプターのイ
ンビボにおけるシグナル導入機構もわかっていることを
要しないという点にある。
【0012】本発明のハイブリッドリセプターは、アゴ
ニスト薬物をスクリーニングすると同様の方法で、被検
試料中の生物学的なリガンドの量を測定するのに用いる
ことができる。この用途は、既知のリガンドの測定を目
的としているので、既知量のリガンドを用いて標準曲線
を調製し、被検試料における結果と比較する。
ニスト薬物をスクリーニングすると同様の方法で、被検
試料中の生物学的なリガンドの量を測定するのに用いる
ことができる。この用途は、既知のリガンドの測定を目
的としているので、既知量のリガンドを用いて標準曲線
を調製し、被検試料における結果と比較する。
【0013】拮抗(アンタゴニスト)薬物候補の選択も、
ハイブリッドリセプターを既知のリセプターアゴニスト
とインキュベートすることを除き、アゴニストの同定に
用いた方法と同様の分析法によって行われる。アゴニス
ト(薬物または正常な生体内リガンド)を、リセプターと
候補薬物との接触の前、あるいは、好ましくは同時に、
リセプターと共にインキュベートする。拮抗体(アンタ
ゴニスト)活性は、リポーターポリペプチドの変化に基
づき測定されるアゴニスト活性またはリガンド活性の変
位の関数である。
ハイブリッドリセプターを既知のリセプターアゴニスト
とインキュベートすることを除き、アゴニストの同定に
用いた方法と同様の分析法によって行われる。アゴニス
ト(薬物または正常な生体内リガンド)を、リセプターと
候補薬物との接触の前、あるいは、好ましくは同時に、
リセプターと共にインキュベートする。拮抗体(アンタ
ゴニスト)活性は、リポーターポリペプチドの変化に基
づき測定されるアゴニスト活性またはリガンド活性の変
位の関数である。
【0014】本発明のハイブリッドリセプターは、リガ
ンド−リセプター相互作用を分析するための、普遍的で
ポータブル(持ち運び可能)な分析系を得ることを可能な
らしめた点で、特に有益である。本発明においては、ポ
ータブルなリポーターポリペプチドとして第1リセプタ
ーの細胞質内領域を選択しようとするものである。この
領域を他のリセプターの細胞質内領域で置換して本発明
のハイブリッドリセプターを調製する。第1リセプター
に有用な分析系(例、自己りん酸化分析)はその第1リセ
プターの細胞質領域を含む他の全てのハイブリッドリセ
プターに用いることができる。
ンド−リセプター相互作用を分析するための、普遍的で
ポータブル(持ち運び可能)な分析系を得ることを可能な
らしめた点で、特に有益である。本発明においては、ポ
ータブルなリポーターポリペプチドとして第1リセプタ
ーの細胞質内領域を選択しようとするものである。この
領域を他のリセプターの細胞質内領域で置換して本発明
のハイブリッドリセプターを調製する。第1リセプター
に有用な分析系(例、自己りん酸化分析)はその第1リセ
プターの細胞質領域を含む他の全てのハイブリッドリセ
プターに用いることができる。
【0015】図面の簡単な記述 図1および図2は、インシュリンリセプターと表皮性成
長因子のリセプターとのハイブリッドを発現させるのに
用いられるプラスミドの構成を示す図である。種々のリ
セプター突然変異体をコードしている領域は陰影を付し
た棒で示されている (cDNA)。SV40初期プロモー
ター配列は太く黒い矢印で示されており、ポリA付加部
位には印が施されている。プラスミドの組立てに用いた
ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)暗号配列[シモンセン
(Simonsen)およびレビンソン(Levinson)、1983、
「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミイ・オブ・サイエンスィズ(Proc.Natl.Acad.S
ci.)USA」 80:2465−2499]と制限部位と
が示されている。両cDNAの発現は、シミアン(Simia
n)ウィルス(SV)40の初期領域のプロモーター配列、
およびB型肝炎ウィルスの表面抗原をコードしている
3'非翻訳配列[クローレィら(Crowley)、1983、
「モレキュラー・セルラー・バイオロジィ[Mol.Cel
l.Biol.]3:44−45]によってコントロールされ
る。複製起源とアンピシリン耐性遺伝子とを含有してい
る大腸菌プラスミドpML[哺乳類細胞内で用いるのに適
したpBR322誘導体;ラスキイ(Lusky)およびボツチ
ャン(Botchan)1981、「ネイチャー(Nature)」29
3:79]の配列を、大腸菌内でプラスミドを複製させる
ために存在させた。
長因子のリセプターとのハイブリッドを発現させるのに
用いられるプラスミドの構成を示す図である。種々のリ
セプター突然変異体をコードしている領域は陰影を付し
た棒で示されている (cDNA)。SV40初期プロモー
ター配列は太く黒い矢印で示されており、ポリA付加部
位には印が施されている。プラスミドの組立てに用いた
ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)暗号配列[シモンセン
(Simonsen)およびレビンソン(Levinson)、1983、
「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミイ・オブ・サイエンスィズ(Proc.Natl.Acad.S
ci.)USA」 80:2465−2499]と制限部位と
が示されている。両cDNAの発現は、シミアン(Simia
n)ウィルス(SV)40の初期領域のプロモーター配列、
およびB型肝炎ウィルスの表面抗原をコードしている
3'非翻訳配列[クローレィら(Crowley)、1983、
「モレキュラー・セルラー・バイオロジィ[Mol.Cel
l.Biol.]3:44−45]によってコントロールされ
る。複製起源とアンピシリン耐性遺伝子とを含有してい
る大腸菌プラスミドpML[哺乳類細胞内で用いるのに適
したpBR322誘導体;ラスキイ(Lusky)およびボツチ
ャン(Botchan)1981、「ネイチャー(Nature)」29
3:79]の配列を、大腸菌内でプラスミドを複製させる
ために存在させた。
【0016】図2はインシュリン・リセプター(HI
R)、EGFリセプター(HER)およびそれらから調製
されたハイブリッドリセプターであるIERおよびIα
ERを比較した模式図である。ヒトEGFリセプター
(HER)、ヒトインシュリンリセプター(HIR)、イン
シュリンリセプターとEGFリセプターのキメラ(IE
R)、およびインシュリン−α−サブユニットリセプタ
ーとEGFリセプターのキメラ(IαER)を平行に並
べ、HIRα配列(α)の暗号領域を点描を施したボック
ス、HIRβ配列のそれを斜線で陰影をつけたボック
ス、そして、HER配列のそれを空白ボックスで示し
た。暗号領域はトランスメンブラン領域と一列に並んで
いる(等尺で描かれていない)。タンパク質のシグナル配
列の暗号セグメントは(S)で表示されており、前駆体開
裂部位は縦線で示されている。ヘテロローガスなリセプ
ターのcDNAの連結部はジグザグラインで示されてお
り、この連結に用いられた合成オリゴヌクレオチドは黒
色の棒で示されている。組立てに関連したDNA制限エ
ンドヌクレアーゼ開裂部位はcDNA配列の上方に示さ
れている。
R)、EGFリセプター(HER)およびそれらから調製
されたハイブリッドリセプターであるIERおよびIα
ERを比較した模式図である。ヒトEGFリセプター
(HER)、ヒトインシュリンリセプター(HIR)、イン
シュリンリセプターとEGFリセプターのキメラ(IE
R)、およびインシュリン−α−サブユニットリセプタ
ーとEGFリセプターのキメラ(IαER)を平行に並
べ、HIRα配列(α)の暗号領域を点描を施したボック
ス、HIRβ配列のそれを斜線で陰影をつけたボック
ス、そして、HER配列のそれを空白ボックスで示し
た。暗号領域はトランスメンブラン領域と一列に並んで
いる(等尺で描かれていない)。タンパク質のシグナル配
列の暗号セグメントは(S)で表示されており、前駆体開
裂部位は縦線で示されている。ヘテロローガスなリセプ
ターのcDNAの連結部はジグザグラインで示されてお
り、この連結に用いられた合成オリゴヌクレオチドは黒
色の棒で示されている。組立てに関連したDNA制限エ
ンドヌクレアーゼ開裂部位はcDNA配列の上方に示さ
れている。
【0017】図3は、対照である発現ベクターでトラン
スフェクトされたCOS−7細胞と比較して、図1のc
DNA組立て物でトランスフェクトされたCOS−7細
胞では、125Iインシュリンと結合したCOS−7細胞
が多いことを示す図である。
スフェクトされたCOS−7細胞と比較して、図1のc
DNA組立て物でトランスフェクトされたCOS−7細
胞では、125Iインシュリンと結合したCOS−7細胞
が多いことを示す図である。
【0018】図4および図5は、実施例に示す如く、様
々な形質転換細胞および対照細胞から得られた自己りん
酸化産物の界面活性剤処理によるリゼイトの適当な抗体
による免疫沈降物をSDS PAGE還元ゲル電気泳動
にかけて得た泳動パターンを示す図である。(+)および
(−)ゲルはインシュリンまたは(A431の場合には)
EGF−処置リセプターを表わす。側部の数字はマーカ
ー分子量である。図4のaは対照であるmock−形質
転換細胞と組換え形質転換細胞の抗−HER−免疫沈降
自己りん酸化産物を示す。この図は、組換え体内でイン
シュリン−EGFハイブリッドリセプター組立て物が発
現したことを示している。
々な形質転換細胞および対照細胞から得られた自己りん
酸化産物の界面活性剤処理によるリゼイトの適当な抗体
による免疫沈降物をSDS PAGE還元ゲル電気泳動
にかけて得た泳動パターンを示す図である。(+)および
(−)ゲルはインシュリンまたは(A431の場合には)
EGF−処置リセプターを表わす。側部の数字はマーカ
ー分子量である。図4のaは対照であるmock−形質
転換細胞と組換え形質転換細胞の抗−HER−免疫沈降
自己りん酸化産物を示す。この図は、組換え体内でイン
シュリン−EGFハイブリッドリセプター組立て物が発
現したことを示している。
【0019】図4のbは、インシュリンリセプターの全
細胞外領域を含有するハイブリッドの自己りん酸化がイ
ンシュリンによって活性化されることを示している。図
5のcは、インシュリンにより活性化されたIERリセ
プターの自己りん酸化の動力学を示す図である。この図
から、自己りん酸化は、りん酸化の反応時間に依存して
いることが分る。
細胞外領域を含有するハイブリッドの自己りん酸化がイ
ンシュリンによって活性化されることを示している。図
5のcは、インシュリンにより活性化されたIERリセ
プターの自己りん酸化の動力学を示す図である。この図
から、自己りん酸化は、りん酸化の反応時間に依存して
いることが分る。
【0020】図5のdはインシュリンによる活性化の後
におけるIERリセプターのSDS−PAGEの移動度
の変化を示す図である。
におけるIERリセプターのSDS−PAGEの移動度
の変化を示す図である。
【0021】図6は表皮性成長因子の細胞外領域と、リ
ポーター分子として作用するerbB腫瘍因子のフラグメ
ントとを含有するハイブリッドリセプターである、HE
R−erbBの構造を示す図である。
ポーター分子として作用するerbB腫瘍因子のフラグメ
ントとを含有するハイブリッドリセプターである、HE
R−erbBの構造を示す図である。
【0022】図7は、リガンド(EGF)の存在下(+)ま
たは非存在下(−)における腫瘍因子−リセプターのハイ
ブリッド組立物の自己りん酸化を示すゲル電気泳動を表
わす図である。
たは非存在下(−)における腫瘍因子−リセプターのハイ
ブリッド組立物の自己りん酸化を示すゲル電気泳動を表
わす図である。
【0023】詳しい記述 本明細書に記載した方法の中心はハイブリッドリセプタ
ーである。これは、基本的に、リガンド結合領域とリポ
ーターポリペプチドとから成る。リガンド結合領域はリ
セプターの細胞外領域に位置している。リガンドの結合
に関与している正確なアミノ酸配列を同定することは、
しばしば困難である。実際、リガンドの結合に関連する
幾つかの領域があり、特に、リガンドがポリペプチドで
ある場合にはそうである。従って、リセプターの細胞外
領域の全てがハイブリッドを形成していることが好まし
い。このことはまた、リガンド結合領域を確実に、正し
い立体配座に保つことにも役立つ。
ーである。これは、基本的に、リガンド結合領域とリポ
ーターポリペプチドとから成る。リガンド結合領域はリ
セプターの細胞外領域に位置している。リガンドの結合
に関与している正確なアミノ酸配列を同定することは、
しばしば困難である。実際、リガンドの結合に関連する
幾つかの領域があり、特に、リガンドがポリペプチドで
ある場合にはそうである。従って、リセプターの細胞外
領域の全てがハイブリッドを形成していることが好まし
い。このことはまた、リガンド結合領域を確実に、正し
い立体配座に保つことにも役立つ。
【0024】適当なリガンド結合領域は、幾つかの方法
の内どれかを用いて選択する。まず、そのハイブリッド
リセプターの使用目的が、被検試料中の既知のリガンド
の分析、あるいは、その様なリガンドのアゴニストまた
は拮抗体のスクリーニリグにあるときは、そのリガンド
に対する既知のリセプターから、リガンド結合部位を選
択する。リガンドが既知であって、そのリセプターが既
知でない場合には、リガンドの細胞表面リセプターを同
定する必要がある。このことは、1)リガンドが結合す
るか、あるいは機能的に相互作用することが分かってい
る組織細胞を得、2)その細胞から既知の方法で膜タン
パク質製品(標本)を得、3)この製品をリガンドとイン
キュベートし、4)インキュベーション混合物からリガ
ンド−リセプター−コンプレックスを分離し[例えば、
リガンドを、臭化シアンで活性化したセファロースに予
め不溶化しておく]、5)リセプターをリガンドから分離
し、6)リセプター部分のアミノ酸配列を得、7)決定し
たアミノ酸配列をコードしている核酸プローブを調製し
(約40bp以上の長い1本のプローブ、あるいは、短い
プローブのプールのいずれか)、8)リセプターが得られ
た生物または細胞から、cDNAまたはゲノムDNAフ
ァージライブラリィー、あるいはプラスミド(ベクター)
ライブラリィーを調製し、9)プローブとライブラリィ
ーとをハイブリダイズしてリセプターをコードしている
DNAを含有しているプラスミドまたはファージを同定
し、10)アミノ末端からトランスメンブラン(膜透過)
配列までの領域を同定するのに必要な程度のヌクレオチ
ド配列と推定のアミノ酸配列とを決定する。リセプター
の細胞外領域全部をコードしているDNAを含んでいる
単一のベクターが無い場合には、様々なベクターを共通
の部位で制限酵素消化し、適当なフラグメントを単離し
て自体既知の方法で再結合(リライゲーション)すること
により所望のDNAを組立てる。既知のリガンドに対す
るリセプターを同定するための他の方法は当業者にとっ
て既知であるか、将来、利用可能となり得る。
の内どれかを用いて選択する。まず、そのハイブリッド
リセプターの使用目的が、被検試料中の既知のリガンド
の分析、あるいは、その様なリガンドのアゴニストまた
は拮抗体のスクリーニリグにあるときは、そのリガンド
に対する既知のリセプターから、リガンド結合部位を選
択する。リガンドが既知であって、そのリセプターが既
知でない場合には、リガンドの細胞表面リセプターを同
定する必要がある。このことは、1)リガンドが結合す
るか、あるいは機能的に相互作用することが分かってい
る組織細胞を得、2)その細胞から既知の方法で膜タン
パク質製品(標本)を得、3)この製品をリガンドとイン
キュベートし、4)インキュベーション混合物からリガ
ンド−リセプター−コンプレックスを分離し[例えば、
リガンドを、臭化シアンで活性化したセファロースに予
め不溶化しておく]、5)リセプターをリガンドから分離
し、6)リセプター部分のアミノ酸配列を得、7)決定し
たアミノ酸配列をコードしている核酸プローブを調製し
(約40bp以上の長い1本のプローブ、あるいは、短い
プローブのプールのいずれか)、8)リセプターが得られ
た生物または細胞から、cDNAまたはゲノムDNAフ
ァージライブラリィー、あるいはプラスミド(ベクター)
ライブラリィーを調製し、9)プローブとライブラリィ
ーとをハイブリダイズしてリセプターをコードしている
DNAを含有しているプラスミドまたはファージを同定
し、10)アミノ末端からトランスメンブラン(膜透過)
配列までの領域を同定するのに必要な程度のヌクレオチ
ド配列と推定のアミノ酸配列とを決定する。リセプター
の細胞外領域全部をコードしているDNAを含んでいる
単一のベクターが無い場合には、様々なベクターを共通
の部位で制限酵素消化し、適当なフラグメントを単離し
て自体既知の方法で再結合(リライゲーション)すること
により所望のDNAを組立てる。既知のリガンドに対す
るリセプターを同定するための他の方法は当業者にとっ
て既知であるか、将来、利用可能となり得る。
【0025】推定のリセプターは同定されたかもしれな
いが、インビボにおけるそのリガンドはなお不明であ
る。例えば、脳下垂体や副腎の如き腺から得られる内分
泌組織の研究によって、構造上、他の既知のリセプター
と似ている膜結合タンパク質(即ち、大きい(通常500
残基以上)細胞外領域、疎水性のトランスメンブラン配
列およびカルボキシ末端である細胞質領域とを有するで
あろう)が同定されるかもしれない。同様に、悪性腫瘍
細胞のリセプター検索は、形質転換された表現型と関連
しているかもしれない、高濃度に存在している特異なリ
セプター類を同定するのにも有用であろう。その様なリ
セプターの細胞外領域も、本発明にとって有用である。
いが、インビボにおけるそのリガンドはなお不明であ
る。例えば、脳下垂体や副腎の如き腺から得られる内分
泌組織の研究によって、構造上、他の既知のリセプター
と似ている膜結合タンパク質(即ち、大きい(通常500
残基以上)細胞外領域、疎水性のトランスメンブラン配
列およびカルボキシ末端である細胞質領域とを有するで
あろう)が同定されるかもしれない。同様に、悪性腫瘍
細胞のリセプター検索は、形質転換された表現型と関連
しているかもしれない、高濃度に存在している特異なリ
セプター類を同定するのにも有用であろう。その様なリ
セプターの細胞外領域も、本発明にとって有用である。
【0026】リセプターとそのリガンドは同定された
が、細胞質領域は既知の機能を有しないかもしれない。
例えば、アデニル酸シクラーゼやグアニル酸シクラーゼ
を活性化することも、ホスホトランスフェラーゼ活性を
有することも、リガンドを輸送することも分かっていな
いかもしれない。天然のリセプターにおいては、リガン
ド−リセプター相互反応により、検出可能なシグナルは
全く、あるいは僅かしか産生されないにもかかわらず、
ハイブリッド構築においてはリポーターポリペプチドか
ら検出可能なシグナルが供給されるので、その様なリセ
プターのリガンド領域は有用である。この様に、ある種
のリセプターの場合には、リセプターと結合した候補薬
物が非特異的に結合しているか、あるいはそれがアゴニ
ストまたは拮抗体として作用するか否かを決定すること
も、生物学的に活性な、固有のリガンドを分析すること
も、リポーターポリペプチドなしではできない。
が、細胞質領域は既知の機能を有しないかもしれない。
例えば、アデニル酸シクラーゼやグアニル酸シクラーゼ
を活性化することも、ホスホトランスフェラーゼ活性を
有することも、リガンドを輸送することも分かっていな
いかもしれない。天然のリセプターにおいては、リガン
ド−リセプター相互反応により、検出可能なシグナルは
全く、あるいは僅かしか産生されないにもかかわらず、
ハイブリッド構築においてはリポーターポリペプチドか
ら検出可能なシグナルが供給されるので、その様なリセ
プターのリガンド領域は有用である。この様に、ある種
のリセプターの場合には、リセプターと結合した候補薬
物が非特異的に結合しているか、あるいはそれがアゴニ
ストまたは拮抗体として作用するか否かを決定すること
も、生物学的に活性な、固有のリガンドを分析すること
も、リポーターポリペプチドなしではできない。
【0027】リポーターポリペプチドはリガンド結合部
位にとってヘテロローガスなポリペプチドであって、そ
れは、リガンドが結合領域に結合した際にその性質を変
化させるものであれば何でも良い。一般に、この性質の
変化は、リポーターポリペプチドの酵素活性または免疫
学的な同一性の変化により検出し得る。通常、リポータ
ーポリペプチドはヘテロローガスなリセプター、あるい
はリセプター類似体の細胞質領域であり、例えば、リガ
ンドとの結合に際して免疫学的または酵素学的な同一性
に変化を来すことが分っている腫瘍遺伝子産物である。
インシュリンリセプターや表皮性成長因子リセプター等
のリセプター由来の細胞質性ホスホトランスフェラーゼ
を用いることが好ましい。しかしながら、β−アドレナ
リン作動性リセプター、アセチルコリンリセプター、お
よびアドレナリンリセプター等の他のリセプターも、ア
デニル酸シクラーゼやグアニル酸シクラーゼの活性化ま
たは阻害を介して中間体形質導入分子として作用するG
タンパク質と称されるタンパク質と結合することが分っ
ている。その様なタンパク質は単離され、特性化されて
いる。リポーターポリペプチドとして、その様なリセプ
ターのGタンパク質結合領域を用いることも本発明の範
囲に含まれる。ヘテロローガスなリセプターやリセプタ
ー同族体の細胞質領域全てを使用する必要はなく、所望
の機能を示す部分のみを使用すればよく、また、他のリ
セプターの無傷で修飾されていない配列を用いる必要も
ない。例えば、リガンド結合領域が得られたリセプター
の細胞質内領域のアミノ酸配列における変異体や誘導体
も許容される。
位にとってヘテロローガスなポリペプチドであって、そ
れは、リガンドが結合領域に結合した際にその性質を変
化させるものであれば何でも良い。一般に、この性質の
変化は、リポーターポリペプチドの酵素活性または免疫
学的な同一性の変化により検出し得る。通常、リポータ
ーポリペプチドはヘテロローガスなリセプター、あるい
はリセプター類似体の細胞質領域であり、例えば、リガ
ンドとの結合に際して免疫学的または酵素学的な同一性
に変化を来すことが分っている腫瘍遺伝子産物である。
インシュリンリセプターや表皮性成長因子リセプター等
のリセプター由来の細胞質性ホスホトランスフェラーゼ
を用いることが好ましい。しかしながら、β−アドレナ
リン作動性リセプター、アセチルコリンリセプター、お
よびアドレナリンリセプター等の他のリセプターも、ア
デニル酸シクラーゼやグアニル酸シクラーゼの活性化ま
たは阻害を介して中間体形質導入分子として作用するG
タンパク質と称されるタンパク質と結合することが分っ
ている。その様なタンパク質は単離され、特性化されて
いる。リポーターポリペプチドとして、その様なリセプ
ターのGタンパク質結合領域を用いることも本発明の範
囲に含まれる。ヘテロローガスなリセプターやリセプタ
ー同族体の細胞質領域全てを使用する必要はなく、所望
の機能を示す部分のみを使用すればよく、また、他のリ
セプターの無傷で修飾されていない配列を用いる必要も
ない。例えば、リガンド結合領域が得られたリセプター
の細胞質内領域のアミノ酸配列における変異体や誘導体
も許容される。
【0028】本発明は、機能についての特定の理論に制
限されるものではないが、リポーターポリペプチドの性
質の変化は、リガンドによるリポーターポリペプチドに
対する立体障害(例えば、リガンドが立体障害によりリ
ポーター領域上の活性部位を吸収)によって起こされる
ものではないと考えられる。本発明で用いる方法はリセ
プターのシグナル導入機構(シグナル・トランスデュー
シング・メカニズム)を統制することによりリガンド結
合領域の変化が分子中の立体配座における変化によって
リセプター分子からリガンド領域に伝えられ、その変化
がリポーターの細胞質領域の機能または性質に影響を及
ぼすものである。この導入機構は、リポーターポリペプ
チドがリガンド結合領域にとってヘテロローガスなもの
である場合にも有効であることが分った。
限されるものではないが、リポーターポリペプチドの性
質の変化は、リガンドによるリポーターポリペプチドに
対する立体障害(例えば、リガンドが立体障害によりリ
ポーター領域上の活性部位を吸収)によって起こされる
ものではないと考えられる。本発明で用いる方法はリセ
プターのシグナル導入機構(シグナル・トランスデュー
シング・メカニズム)を統制することによりリガンド結
合領域の変化が分子中の立体配座における変化によって
リセプター分子からリガンド領域に伝えられ、その変化
がリポーターの細胞質領域の機能または性質に影響を及
ぼすものである。この導入機構は、リポーターポリペプ
チドがリガンド結合領域にとってヘテロローガスなもの
である場合にも有効であることが分った。
【0029】所望により、ハイブリッドリセプターは、
リガンド結合領域とリポーターポリペプチドとの間に融
合されているトランスメンブラン配列を含んでいてもよ
い。典型的なトランスメンブラン領域は、約20〜25
残基を含有し、約1.5から3.5にヒドロパシィピーク
を示すものである。それらは疎水性の側鎖を有する残
基、例えばロイシン、イソロイシン、フェニルアラニ
ン、バリンおよびメチオニン等を高い割合で含有してい
る。適切なトランスメンブラン配列は細胞外のリガンド
結合領域を供給するリセプターから得られるが、トラン
スメンブラン配列は全合成されるか、あるいは膜内在性
タンパク質または非関連リセプターから得ることができ
る。最後の例には、ヘテロローガスなリセプターの細胞
質内領域であるリポーターポリペプチドに通常伴ってい
るトランスメンブラン領域も含まれる。
リガンド結合領域とリポーターポリペプチドとの間に融
合されているトランスメンブラン配列を含んでいてもよ
い。典型的なトランスメンブラン領域は、約20〜25
残基を含有し、約1.5から3.5にヒドロパシィピーク
を示すものである。それらは疎水性の側鎖を有する残
基、例えばロイシン、イソロイシン、フェニルアラニ
ン、バリンおよびメチオニン等を高い割合で含有してい
る。適切なトランスメンブラン配列は細胞外のリガンド
結合領域を供給するリセプターから得られるが、トラン
スメンブラン配列は全合成されるか、あるいは膜内在性
タンパク質または非関連リセプターから得ることができ
る。最後の例には、ヘテロローガスなリセプターの細胞
質内領域であるリポーターポリペプチドに通常伴ってい
るトランスメンブラン領域も含まれる。
【0030】ハイブリッドリセプター成分は、ヒト、動
物、植物、昆虫、さらに原虫、ウィルスおよび真菌を含
む微生物、並びにその他の適当な種を起源とする。リガ
ンド結合領域の供給源となる種は、関心を持たれている
リガンドと結合し得るリガンド結合領域の存在につい
て、あるいは、標的となっている生理活性の存在につい
て選択される。リポーターポリペプチドまたはトランス
メンブラン領域を、リガンド結合領域と同一種から得る
必要はない。
物、植物、昆虫、さらに原虫、ウィルスおよび真菌を含
む微生物、並びにその他の適当な種を起源とする。リガ
ンド結合領域の供給源となる種は、関心を持たれている
リガンドと結合し得るリガンド結合領域の存在につい
て、あるいは、標的となっている生理活性の存在につい
て選択される。リポーターポリペプチドまたはトランス
メンブラン領域を、リガンド結合領域と同一種から得る
必要はない。
【0031】ハイブリッドリセプターは一般に、今日、
技術分野で利用可能なインビトロの方法で実用的に合成
するには、あまりにも大きく複雑なので組換え細胞培養
法で合成することが好ましい。
技術分野で利用可能なインビトロの方法で実用的に合成
するには、あまりにも大きく複雑なので組換え細胞培養
法で合成することが好ましい。
【0032】ハイブリッドリセプターを合成するための
組換え法は、ハイブリッドリセプターをコードしている
核酸を含有する複製可能なベクターの組立てから始ま
る。一般に、ベクターは適合し得る宿主細胞と共同して
2つの機能を果たす。1つの機能はハイブリッドリセプ
ターをコードしている核酸のクローニングを促進するこ
と、つまり、使用可能な量の核酸を生産することにあ
る。もう一つの機能はハイブリッドリセプターの発現を
指令することにある。これらの機能の一方または両方
が、ベクター−宿主系によってなされる。ベクターは、
選択された宿主細胞と同様、それがなすべき機能に応じ
て異なる成分を含有することとなる。
組換え法は、ハイブリッドリセプターをコードしている
核酸を含有する複製可能なベクターの組立てから始ま
る。一般に、ベクターは適合し得る宿主細胞と共同して
2つの機能を果たす。1つの機能はハイブリッドリセプ
ターをコードしている核酸のクローニングを促進するこ
と、つまり、使用可能な量の核酸を生産することにあ
る。もう一つの機能はハイブリッドリセプターの発現を
指令することにある。これらの機能の一方または両方
が、ベクター−宿主系によってなされる。ベクターは、
選択された宿主細胞と同様、それがなすべき機能に応じ
て異なる成分を含有することとなる。
【0033】各ベクターはハイブリッドリセプターをコ
ードする核酸を含有している。通常、これはそのアミノ
末端に分泌シグナルが結合している成熟した形のハイブ
リッドリセプターをコードしているDNAであろう。こ
の分泌シグナルは、リガンド結合領域の得られたリセプ
ターの分泌を指令する通常のシグナルプレ配列であるこ
とが好ましい。しかしながら、他のリセプターに由来す
るシグナルや、同一種または近縁種の分泌ポリペプチド
から得られるシグナルも適当なシグナルとなり得る。
ードする核酸を含有している。通常、これはそのアミノ
末端に分泌シグナルが結合している成熟した形のハイブ
リッドリセプターをコードしているDNAであろう。こ
の分泌シグナルは、リガンド結合領域の得られたリセプ
ターの分泌を指令する通常のシグナルプレ配列であるこ
とが好ましい。しかしながら、他のリセプターに由来す
るシグナルや、同一種または近縁種の分泌ポリペプチド
から得られるシグナルも適当なシグナルとなり得る。
【0034】分泌されたハイブリッドは、それがトラン
スメンブラン領域を含んでいれば、組換え宿主の膜内に
位置する。その様な領域がハイブリッド中に存在しない
ときには、ハイブリッドは培養培地に分泌される。通
常、ハイブリッドは、構造を可能な限り忠実に保持する
ために、トランスメンブラン領域を含有していることが
好ましい。しかしながら、ハイブリッドリセプターを、
他の細胞膜タンパク質を含まないように精製しなければ
ならない膜−結合性リセプターの場合よりも、トランス
メンブラン領域を欠失したリセプターの精製の方が複雑
でない。さらに、細胞−結合性リセプターの場合、増殖
期に細胞膜に多量の蓄積が起きると、宿主に望ましくな
い生物学的な影響を与えるかもしれない。これらの潜在
的な可能性は、ハイブリッドリセプターをコードしてい
るアミノ酸を誘導可能なプロモーターのコントロール下
におくことによって克服される。
スメンブラン領域を含んでいれば、組換え宿主の膜内に
位置する。その様な領域がハイブリッド中に存在しない
ときには、ハイブリッドは培養培地に分泌される。通
常、ハイブリッドは、構造を可能な限り忠実に保持する
ために、トランスメンブラン領域を含有していることが
好ましい。しかしながら、ハイブリッドリセプターを、
他の細胞膜タンパク質を含まないように精製しなければ
ならない膜−結合性リセプターの場合よりも、トランス
メンブラン領域を欠失したリセプターの精製の方が複雑
でない。さらに、細胞−結合性リセプターの場合、増殖
期に細胞膜に多量の蓄積が起きると、宿主に望ましくな
い生物学的な影響を与えるかもしれない。これらの潜在
的な可能性は、ハイブリッドリセプターをコードしてい
るアミノ酸を誘導可能なプロモーターのコントロール下
におくことによって克服される。
【0035】クローニングベクター中では、通常、ハイ
ブリッドリセプターをコードしている核酸は、選択され
た宿主内で、宿主の染色体と独立してベクターを複製さ
せる核酸配列と一緒に存在している。通常、この配列
は、複製起源または自律的複製配列である。その様な配
列は、種々の細菌、酵母およびより高等な真核細胞につ
いてよく知られている。よく知られたプラスミドpBR
322の複製起源は大腸菌に、2μプラスミドの複製起
源は酵母に、そして種々のウィルス(SV40ウィル
ス、ポリオーマウィルス、アデノウィルスまたはウシ乳
頭腫ウィルス)の複製起源は哺乳類細胞に適合する。余
り望ましくないが、DNAは、宿主のゲノムに挿入され
ることでクローンされる。このことは、例えば、バシラ
スのゲノムDNAと相補的なベクターDNAに挿入する
ことにより、バシラス種では容易に行い得る。このベク
ターでバシラスがトランスフェクションされると、ゲノ
ムとのホモローガスな組換えが起き、ハイブリッドリセ
プターDNAが挿入される。しかしながら、ハイブリッ
ドリセプターをコードしているゲノムDNAの回収は、
ハイブリッドリセプターDNAをクローニングビヒクル
のゲノムから回収するために制限酵素による消化を行う
必要があるので、外的に複製されたウィルスDNAまた
はプラスミドDNAの回収よりも複雑である。
ブリッドリセプターをコードしている核酸は、選択され
た宿主内で、宿主の染色体と独立してベクターを複製さ
せる核酸配列と一緒に存在している。通常、この配列
は、複製起源または自律的複製配列である。その様な配
列は、種々の細菌、酵母およびより高等な真核細胞につ
いてよく知られている。よく知られたプラスミドpBR
322の複製起源は大腸菌に、2μプラスミドの複製起
源は酵母に、そして種々のウィルス(SV40ウィル
ス、ポリオーマウィルス、アデノウィルスまたはウシ乳
頭腫ウィルス)の複製起源は哺乳類細胞に適合する。余
り望ましくないが、DNAは、宿主のゲノムに挿入され
ることでクローンされる。このことは、例えば、バシラ
スのゲノムDNAと相補的なベクターDNAに挿入する
ことにより、バシラス種では容易に行い得る。このベク
ターでバシラスがトランスフェクションされると、ゲノ
ムとのホモローガスな組換えが起き、ハイブリッドリセ
プターDNAが挿入される。しかしながら、ハイブリッ
ドリセプターをコードしているゲノムDNAの回収は、
ハイブリッドリセプターDNAをクローニングビヒクル
のゲノムから回収するために制限酵素による消化を行う
必要があるので、外的に複製されたウィルスDNAまた
はプラスミドDNAの回収よりも複雑である。
【0036】発現およびクローニングベクターは選択遺
伝子(選択可能なマーカーとも称される)を含有していな
ければならない。これは、ベクターで形質転換された宿
主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードし
ている遺伝子である。この遺伝子が存在することによ
り、挿入体を発現する宿主のみが確実に増殖することに
なる。代表的な選択遺伝子は、(a)抗生物質あるいは他
の毒素(例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレ
キセートまたはテトラサイクリン)に対する耐性を付与
する、または(b)栄養要求性の欠失を補償するタンパク
質をコードしている遺伝子か、あるいは(c)複合培地か
ら得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコー
ドしている遺伝子(例えば、バシルスにとっての、D−
アラニン・ラセマーゼをコードしている遺伝子)であ
る。
伝子(選択可能なマーカーとも称される)を含有していな
ければならない。これは、ベクターで形質転換された宿
主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードし
ている遺伝子である。この遺伝子が存在することによ
り、挿入体を発現する宿主のみが確実に増殖することに
なる。代表的な選択遺伝子は、(a)抗生物質あるいは他
の毒素(例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレ
キセートまたはテトラサイクリン)に対する耐性を付与
する、または(b)栄養要求性の欠失を補償するタンパク
質をコードしている遺伝子か、あるいは(c)複合培地か
ら得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコー
ドしている遺伝子(例えば、バシルスにとっての、D−
アラニン・ラセマーゼをコードしている遺伝子)であ
る。
【0037】酵母内で用いるのに適した選択遺伝子は酵
母プラスミドYRp7中に存在するtrp1遺伝子である
[スティンチコムら(Stinchcomb)、1979 “ネイチ
ャー(Nature)" 282:39; キングスマンら(Kingsm
an)、1979 “ジーン(Gene)" 7:141; またはチ
エンパーら(Tschemper)、1980 “ジーン" 10:1
57]。trp1遺伝子はトリプトファン中で増殖する能力
を欠く酵母の突然変異株(例、ATCC No.4407
6またはPEP4−1[ジョーンズ(Jones)、1977
“ジェネティックス(Genetics)" 85:12])に選択マ
ーカーを与える。酵母宿主細胞ゲノムにtrp1損傷があ
ると、トリプトファンの非存在下で形質転換体を増殖さ
せることで形質転換を検出するのに有効な環境が得られ
る。同様に、Leu2欠損酵母株(ATCC20,622ま
たは38,626)はLeu2遺伝子を有する既知のプラス
ミドで補償される。
母プラスミドYRp7中に存在するtrp1遺伝子である
[スティンチコムら(Stinchcomb)、1979 “ネイチ
ャー(Nature)" 282:39; キングスマンら(Kingsm
an)、1979 “ジーン(Gene)" 7:141; またはチ
エンパーら(Tschemper)、1980 “ジーン" 10:1
57]。trp1遺伝子はトリプトファン中で増殖する能力
を欠く酵母の突然変異株(例、ATCC No.4407
6またはPEP4−1[ジョーンズ(Jones)、1977
“ジェネティックス(Genetics)" 85:12])に選択マ
ーカーを与える。酵母宿主細胞ゲノムにtrp1損傷があ
ると、トリプトファンの非存在下で形質転換体を増殖さ
せることで形質転換を検出するのに有効な環境が得られ
る。同様に、Leu2欠損酵母株(ATCC20,622ま
たは38,626)はLeu2遺伝子を有する既知のプラス
ミドで補償される。
【0038】哺乳類細胞にとって適当な選択マーカー
は、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)、チミジンキ
ナーゼまたはネオマイシン耐性を付与するタンパク質で
ある。その様なマーカーにより、ハイブリッドリセプタ
ー核酸を取り入れるのに適した細胞を同定することが可
能となる。哺乳類細胞形質転換体を、マーカーを取り込
んだ形質転換体のみが特異的に生存に適応し得る選択圧
の下におく。選択圧は、培地中の選択物質の濃度が逐字
増加されている、連続的な細胞培養中で培養することに
より、選択遺伝子をコードしているDNAとハイブリッ
ドリセプターをコードしているDNAの両者を増幅させ
ることにより与えられる。増幅されたDNAにより、ハ
イブリッドリセプターの合成量が増加される。
は、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)、チミジンキ
ナーゼまたはネオマイシン耐性を付与するタンパク質で
ある。その様なマーカーにより、ハイブリッドリセプタ
ー核酸を取り入れるのに適した細胞を同定することが可
能となる。哺乳類細胞形質転換体を、マーカーを取り込
んだ形質転換体のみが特異的に生存に適応し得る選択圧
の下におく。選択圧は、培地中の選択物質の濃度が逐字
増加されている、連続的な細胞培養中で培養することに
より、選択遺伝子をコードしているDNAとハイブリッ
ドリセプターをコードしているDNAの両者を増幅させ
ることにより与えられる。増幅されたDNAにより、ハ
イブリッドリセプターの合成量が増加される。
【0039】例えば、DHFR形質転換細胞は、ヒポキ
サンチン、グリシンおよびチミジンを欠く培養培地中で
選択される。この場合、適当な宿主細胞はウーラウブ
(Urlaub)およびチャッシン(Chasin)1980、“プロ
シーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・
オブ・サイエンスィズ(プロナス)(Proc.Nat'l.Aca
d.Sci.)USA"77:4216記載の如くにして調製
し、増殖された、DHFR活性を欠くチャイニーズハム
スターの卵巣(CHO)セルラインである。
サンチン、グリシンおよびチミジンを欠く培養培地中で
選択される。この場合、適当な宿主細胞はウーラウブ
(Urlaub)およびチャッシン(Chasin)1980、“プロ
シーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・
オブ・サイエンスィズ(プロナス)(Proc.Nat'l.Aca
d.Sci.)USA"77:4216記載の如くにして調製
し、増殖された、DHFR活性を欠くチャイニーズハム
スターの卵巣(CHO)セルラインである。
【0040】メトトレキセート(MTX)耐性の高い突然
変異DHFRが特に有用なDHFRである(EP117,
060A)。この選択物質は、内因性のDHFRが存在
していても、それ以外において適切な宿主であれば用い
ることができる。内因性のDHFRを完全に不活化する
には、単に、充分量のMTXが培地中に含有されていれ
ばよく、そうすれば、MTX選択は、突然変異DHFR
のDNAの増幅によってのみ行われる。MTXを吸着す
ることのできる真核細胞の大多数はメトトレキセート感
受性のように思われる。その様な有用なセルラインの1
つに、ある種のCHOライン、即ちCHO−K1(AT
CC No.CCL61)がある。
変異DHFRが特に有用なDHFRである(EP117,
060A)。この選択物質は、内因性のDHFRが存在
していても、それ以外において適切な宿主であれば用い
ることができる。内因性のDHFRを完全に不活化する
には、単に、充分量のMTXが培地中に含有されていれ
ばよく、そうすれば、MTX選択は、突然変異DHFR
のDNAの増幅によってのみ行われる。MTXを吸着す
ることのできる真核細胞の大多数はメトトレキセート感
受性のように思われる。その様な有用なセルラインの1
つに、ある種のCHOライン、即ちCHO−K1(AT
CC No.CCL61)がある。
【0041】ハイブリッドリセプターを脊椎動物の組換
え細胞培養中で合成するのに適応させ得る他の方法、ベ
クターおよび宿主細胞は、ゲッシングら(M.J.Geth
ing)、“ネイチャー"293:620〜625(198
1)、マンテイら(N.Mantei)、“ネイチャー"281:
40〜46およびレビンソンら(A.Levison)、EP1
1706,058Aによって記載されている。
え細胞培養中で合成するのに適応させ得る他の方法、ベ
クターおよび宿主細胞は、ゲッシングら(M.J.Geth
ing)、“ネイチャー"293:620〜625(198
1)、マンテイら(N.Mantei)、“ネイチャー"281:
40〜46およびレビンソンら(A.Levison)、EP1
1706,058Aによって記載されている。
【0042】発現ベクターは、クローニングベクターと
異なり、ハイブリッドリセプターをコードしているDN
Aが強く転写されるよう、宿主生物によって認識され
る、プロモーターおよび/または他の配列を含有してい
なければならない。これは、一般に、意図する宿主のプ
ロモーターとホモローガスな配列である。高等な真核細
胞の場合、プロモーターからの転写をより増大する上
で、エンハンサー配列が有用である。プロモーターと異
り、エンハンサー配列は、ハイブリッドリセプターをコ
ードしている核酸の5'側に位置している必要はない。
原核生物に一般的に用いられるプロモーターには、β−
ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系[チャン
ら(Chang)、1978“ネイチャー"275:615;ゲ
ツデルら(Goeddel)、1979“ネイチャー"281:5
44]、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)
プロモーター系[ゲツデル1980“ヌクレイツク・ア
シッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)"8:40
57およびEPO出願公開No.36,776]、並びにt
acプロモーター[ドゥ・ボアら(H.de Boer)、198
3“プロナス USA"80:21−25]の如きハイブ
リッドプロモーターが含まれる。しかしながら、他の既
知の微生物のプロモーターも適する。それらのヌクレオ
チド配列は公開されているので、当業者は、必要な制限
部位を与えるリンカーやアダプターを用いて、それらを
プラスミドベクター中のハイブリッドリセプターをコー
ドしているDNAと機能的(操作可能)にライゲート(結
合)させることができる[シーベンリストら(Siebenlis
t)1980“セル(Cell)"20:269]。原核生物系で
用いるためのプロモーターには、ハイブリッドリセプタ
ーをコードしているDNAと機能的に結合しているシャ
インダルガルノ配列も含まれるであろう。
異なり、ハイブリッドリセプターをコードしているDN
Aが強く転写されるよう、宿主生物によって認識され
る、プロモーターおよび/または他の配列を含有してい
なければならない。これは、一般に、意図する宿主のプ
ロモーターとホモローガスな配列である。高等な真核細
胞の場合、プロモーターからの転写をより増大する上
で、エンハンサー配列が有用である。プロモーターと異
り、エンハンサー配列は、ハイブリッドリセプターをコ
ードしている核酸の5'側に位置している必要はない。
原核生物に一般的に用いられるプロモーターには、β−
ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系[チャン
ら(Chang)、1978“ネイチャー"275:615;ゲ
ツデルら(Goeddel)、1979“ネイチャー"281:5
44]、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)
プロモーター系[ゲツデル1980“ヌクレイツク・ア
シッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)"8:40
57およびEPO出願公開No.36,776]、並びにt
acプロモーター[ドゥ・ボアら(H.de Boer)、198
3“プロナス USA"80:21−25]の如きハイブ
リッドプロモーターが含まれる。しかしながら、他の既
知の微生物のプロモーターも適する。それらのヌクレオ
チド配列は公開されているので、当業者は、必要な制限
部位を与えるリンカーやアダプターを用いて、それらを
プラスミドベクター中のハイブリッドリセプターをコー
ドしているDNAと機能的(操作可能)にライゲート(結
合)させることができる[シーベンリストら(Siebenlis
t)1980“セル(Cell)"20:269]。原核生物系で
用いるためのプロモーターには、ハイブリッドリセプタ
ーをコードしているDNAと機能的に結合しているシャ
インダルガルノ配列も含まれるであろう。
【0043】酵母用ベクターの好適なプロモーティング
配列には、以下のものに対するプロモーターが含まれ
る:メタロチオナイン(metallothionein)、3−ホスホグ
リセレート・キナーゼ[ヒツツマン(Hitzeman)ら、19
80“ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ィ"255:2073]またはエノラーゼ、グリセルアル
デヒド−3−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、ヘキソ
キナーゼ、ピルベート・デカルボキシラーゼ、ホスホフ
ルクトキナーゼ、グルコース−6−ホスフェート・イソ
メラーゼ、3−ホスホグリセレート・ムターゼ、ピルベ
ート・キナーゼ、トリオセホスフェート・イソメラー
ゼ、ホスホグルコース・イソメラーゼ、グルコキナーゼ
等の他の解糖酵素類[ヘス(Hess)ら、1968、“ジャ
ーナル・オブ・アドバンスイズ・イン・エンザイム・レ
グ(J.Adv.Enzyme Reg.)"7:149;およびホラ
ンド(Holland)ら、1978、“バイオケミストリィ"
17:4900]。
配列には、以下のものに対するプロモーターが含まれ
る:メタロチオナイン(metallothionein)、3−ホスホグ
リセレート・キナーゼ[ヒツツマン(Hitzeman)ら、19
80“ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ィ"255:2073]またはエノラーゼ、グリセルアル
デヒド−3−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、ヘキソ
キナーゼ、ピルベート・デカルボキシラーゼ、ホスホフ
ルクトキナーゼ、グルコース−6−ホスフェート・イソ
メラーゼ、3−ホスホグリセレート・ムターゼ、ピルベ
ート・キナーゼ、トリオセホスフェート・イソメラー
ゼ、ホスホグルコース・イソメラーゼ、グルコキナーゼ
等の他の解糖酵素類[ヘス(Hess)ら、1968、“ジャ
ーナル・オブ・アドバンスイズ・イン・エンザイム・レ
グ(J.Adv.Enzyme Reg.)"7:149;およびホラ
ンド(Holland)ら、1978、“バイオケミストリィ"
17:4900]。
【0044】その他、増殖条件によって転写がコントロ
ールされるという利点をも有するプロモーターとして、
アルコール・デヒドロゲナーゼ2、イソチトクローム
C、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する減成酵素、
前記メタロチオナイン、グリセルアルデヒド−3−ホス
フェート・デヒドロゲナーゼ、並びにマルトースおよび
ラクトースの利用に与る酵素類等に関するプロモーター
領域が含まれる。更に、酵母内で発現させる上で好適な
ベクターおよびプロモーターはR.ヒツツマン(R.Hi
tzman)らにより、EPO公開番号第73,657号の中
に記述されている。
ールされるという利点をも有するプロモーターとして、
アルコール・デヒドロゲナーゼ2、イソチトクローム
C、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する減成酵素、
前記メタロチオナイン、グリセルアルデヒド−3−ホス
フェート・デヒドロゲナーゼ、並びにマルトースおよび
ラクトースの利用に与る酵素類等に関するプロモーター
領域が含まれる。更に、酵母内で発現させる上で好適な
ベクターおよびプロモーターはR.ヒツツマン(R.Hi
tzman)らにより、EPO公開番号第73,657号の中
に記述されている。
【0045】哺乳類宿主細胞内でのベクターからの転写
は、ウシ乳頭腫ウィルス、ワクシニアウィルス、ポリオ
ーマウィルス、アデノウィルス2、レトロウィルス、B
型肝炎ウィルスおよび大多数の好ましいシミアンウィル
ス40(SV40)から得られ、ハイブリッドリセプター
の核酸と機能的に結合しているプロモーターおよび/ま
たはエンハンサーによってコントロールされる。SV4
0ウィルスの早期および後期プロモーターはSV40ウ
ィルスの複製起源を含有しているSV40制限フラグメ
ントと同様、都合良く得られる[ファイヤーズら(Fier
s)、1978“ネイチャー"273:113]。本発明に
おいては、宿主細胞またはその近縁種から得られたプロ
モーターやエンハンサーも有用であることは当然であ
る。
は、ウシ乳頭腫ウィルス、ワクシニアウィルス、ポリオ
ーマウィルス、アデノウィルス2、レトロウィルス、B
型肝炎ウィルスおよび大多数の好ましいシミアンウィル
ス40(SV40)から得られ、ハイブリッドリセプター
の核酸と機能的に結合しているプロモーターおよび/ま
たはエンハンサーによってコントロールされる。SV4
0ウィルスの早期および後期プロモーターはSV40ウ
ィルスの複製起源を含有しているSV40制限フラグメ
ントと同様、都合良く得られる[ファイヤーズら(Fier
s)、1978“ネイチャー"273:113]。本発明に
おいては、宿主細胞またはその近縁種から得られたプロ
モーターやエンハンサーも有用であることは当然であ
る。
【0046】核酸は、それが他の核酸配列と機能的な関
連性に置かれている場合、機能的に結合していることに
なる。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのD
NAは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタン
パク質として発現されるならば、ポリペプチドのDNA
と機能的に結合しており、プロモーターまたはエンハン
サーは、それが暗号配列の転写を左右するなら該配列と
機能的に結合しており、あるいは、リボゾーム結合部位
は、それが暗号配列の翻訳を促進するよう位置せしめる
ならば該配列と機能的に結合していることになる。一般
に、機能的に結合しているという言葉は、結合されてい
るDNA配列が近接しており、さらに、分泌リーダー配
列の場合には、近接し、リーディングフレーム内にある
ことを意味する。
連性に置かれている場合、機能的に結合していることに
なる。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのD
NAは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタン
パク質として発現されるならば、ポリペプチドのDNA
と機能的に結合しており、プロモーターまたはエンハン
サーは、それが暗号配列の転写を左右するなら該配列と
機能的に結合しており、あるいは、リボゾーム結合部位
は、それが暗号配列の翻訳を促進するよう位置せしめる
ならば該配列と機能的に結合していることになる。一般
に、機能的に結合しているという言葉は、結合されてい
るDNA配列が近接しており、さらに、分泌リーダー配
列の場合には、近接し、リーディングフレーム内にある
ことを意味する。
【0047】真核性宿主細胞(酵母、菌類、昆虫、植
物、動物またはヒト)内で用いる発現ベクターは転写の
終止およびmRNAの安定化に必要な配列をも含有して
いるであろう。その様な配列は、一般に、真核性の、ま
たはウィルスのcDNAの3'非翻訳領域から得られる。
これらの領域は、ハイブリッドリセプターをコードして
いるmRNAの非翻訳部分に含まれるポリアデニル化セ
グメントとして転写される領域を含有している。この
3'非翻訳領域には転写終止部位も含まれている。
物、動物またはヒト)内で用いる発現ベクターは転写の
終止およびmRNAの安定化に必要な配列をも含有して
いるであろう。その様な配列は、一般に、真核性の、ま
たはウィルスのcDNAの3'非翻訳領域から得られる。
これらの領域は、ハイブリッドリセプターをコードして
いるmRNAの非翻訳部分に含まれるポリアデニル化セ
グメントとして転写される領域を含有している。この
3'非翻訳領域には転写終止部位も含まれている。
【0048】本発明におけるベクターのクローニングま
たは発現にとって好適な宿主細胞は、原核細胞、酵母細
胞およびより高等な真核細胞である。原核細胞には、大
腸菌やバシラスの如き、グラム陰性またはグラム陽性菌
が含まれる。好ましいクローニング宿主は大腸菌294
(ATCC31,446)であるが、大腸菌B、大腸菌X
1776(ATCC31,537)、大腸菌W3110(A
TCC27,325)、シュードモナス種、あるいはセラ
シア・マーセサンス(Serratia Marcesans)も適す
る。
たは発現にとって好適な宿主細胞は、原核細胞、酵母細
胞およびより高等な真核細胞である。原核細胞には、大
腸菌やバシラスの如き、グラム陰性またはグラム陽性菌
が含まれる。好ましいクローニング宿主は大腸菌294
(ATCC31,446)であるが、大腸菌B、大腸菌X
1776(ATCC31,537)、大腸菌W3110(A
TCC27,325)、シュードモナス種、あるいはセラ
シア・マーセサンス(Serratia Marcesans)も適す
る。
【0049】原核生物に加えて糸状菌や酵母の如き真核
微生物もハイブリッドリセプターをコードしているベク
ターの宿主として適する。下等な真核性宿主微生物の
内、サッカロミケス・セレビシエ(Saccharomyces cer
visiae)または通常のパン酵母が最も普通に用いられ
る。しかしながら、他の多くの属、種または株も一般に
入手可能であり、本発明に用い得る。
微生物もハイブリッドリセプターをコードしているベク
ターの宿主として適する。下等な真核性宿主微生物の
内、サッカロミケス・セレビシエ(Saccharomyces cer
visiae)または通常のパン酵母が最も普通に用いられ
る。しかしながら、他の多くの属、種または株も一般に
入手可能であり、本発明に用い得る。
【0050】機能的なハイブリッドリセプターの発現に
とって好適な宿主細胞は多核細胞生物から導かれた細胞
の培養物である。多くの場合、ハイブリッドリセプター
は下等な微生物には適合し得ない領域、即ち、適切なジ
スルフィド結合を形成する上で複雑なプロセシングを必
要とし、しばしば、サブユニット・プロセッシングが要
求される疎水性の領域、を含有している。しかも、この
リセプターのグリコシル化は天然のリセプターの場合と
同様に行われることが望ましい。これらの機能は全て高
等な真核細胞により、最もよく達成される。原則とし
て、脊椎動物または無脊椎動物の細胞培養物のいずれで
もよく、あらゆる高等な真核細胞の培養物が有用である
が、ヒト等の哺乳類の細胞が好ましい。培養中でのその
様な細胞の増殖は自体既知である[組織培養(Tissuecul
ture)、アカデミック・プレス、クルス(Kruse)および
パターソン(Patterson)編(1973)参照]。有用な哺
乳類宿主のセルラインには例えば、VERO細胞、Hel
la細胞、チャイニーズハムスターの卵巣細胞セルライ
ン、WI38、BHK、COS−7およびMDCKの各
セルラインが含まれる。
とって好適な宿主細胞は多核細胞生物から導かれた細胞
の培養物である。多くの場合、ハイブリッドリセプター
は下等な微生物には適合し得ない領域、即ち、適切なジ
スルフィド結合を形成する上で複雑なプロセシングを必
要とし、しばしば、サブユニット・プロセッシングが要
求される疎水性の領域、を含有している。しかも、この
リセプターのグリコシル化は天然のリセプターの場合と
同様に行われることが望ましい。これらの機能は全て高
等な真核細胞により、最もよく達成される。原則とし
て、脊椎動物または無脊椎動物の細胞培養物のいずれで
もよく、あらゆる高等な真核細胞の培養物が有用である
が、ヒト等の哺乳類の細胞が好ましい。培養中でのその
様な細胞の増殖は自体既知である[組織培養(Tissuecul
ture)、アカデミック・プレス、クルス(Kruse)および
パターソン(Patterson)編(1973)参照]。有用な哺
乳類宿主のセルラインには例えば、VERO細胞、Hel
la細胞、チャイニーズハムスターの卵巣細胞セルライ
ン、WI38、BHK、COS−7およびMDCKの各
セルラインが含まれる。
【0051】本発明のハイブリッドリセプターは、原則
として、該リセプターを被検試料、コントロールおよび
(所望により)スタンダード(標品)と一緒にインキュベー
トした後、リポーターポリペプチドにおける変化を測定
することからなる方法により、薬物のスクリーニング、
あるいは生物活性なリガンドのアツセイに用いられる。
リガンドの結合がリポーターポリペプチドの立体配座を
変化させることは、本発明者らが見い出したことである
故、この様な変化を幾つかの方法のどれかを用いて検出
することも本発明の範囲内に含まれる。一般に、リポー
ターポリペプチドのタンパク質結合または酸素活性の変
化を測定する。一つの方法では、活性化された立体配座
に対する抗体を惹起させ、リセプターをリガンドまたは
候補薬物と一緒にインキュベートしてから、ハイブリッ
ドリセプターに対する抗体の結合を測定する。このアツ
セイは従来のタンパク質抗原についてのイムノアツセイ
と同様の方法で行われる。抗体はホスホチロシン含有タ
ンパク質と結合し得ることが自体既知である[ウオン(W
ang)、1985“モル・アンド・セル・バイオロ(Mo
l.and Cell.Biol.)"5(12):3640〜364
3;ロスら(Ross)、1981、“ネイチャー"294:6
54;およびパンら(Pang)、1985、“アーク・バイ
オケム・バイオフィス(Arch.Biochem.Biophys.)"
242(1):176]。これらの抗体は本発明の方法に有
用であるが、従来技術における抗体と異なり、ハイブリ
ッドリセプターの場合には、リポーターポリペプチドに
とって特異的であり、他のリセプターやりん酸化された
タンパク質とは交差反応せず、リガンドのリセプター結
合領域への結合影響を測定することに関しては、まさに
利用度の高い抗ホスホチロシン抗体が選ばれる。しか
し、この方法は、結合しなかった標識抗体をリポーター
と結合した抗体から除去するために相分離が必要である
という不都合を有する。しかしながら、この方法では、
ハイブリッドリセプターを共有結合的に修飾しなくとも
よい。
として、該リセプターを被検試料、コントロールおよび
(所望により)スタンダード(標品)と一緒にインキュベー
トした後、リポーターポリペプチドにおける変化を測定
することからなる方法により、薬物のスクリーニング、
あるいは生物活性なリガンドのアツセイに用いられる。
リガンドの結合がリポーターポリペプチドの立体配座を
変化させることは、本発明者らが見い出したことである
故、この様な変化を幾つかの方法のどれかを用いて検出
することも本発明の範囲内に含まれる。一般に、リポー
ターポリペプチドのタンパク質結合または酸素活性の変
化を測定する。一つの方法では、活性化された立体配座
に対する抗体を惹起させ、リセプターをリガンドまたは
候補薬物と一緒にインキュベートしてから、ハイブリッ
ドリセプターに対する抗体の結合を測定する。このアツ
セイは従来のタンパク質抗原についてのイムノアツセイ
と同様の方法で行われる。抗体はホスホチロシン含有タ
ンパク質と結合し得ることが自体既知である[ウオン(W
ang)、1985“モル・アンド・セル・バイオロ(Mo
l.and Cell.Biol.)"5(12):3640〜364
3;ロスら(Ross)、1981、“ネイチャー"294:6
54;およびパンら(Pang)、1985、“アーク・バイ
オケム・バイオフィス(Arch.Biochem.Biophys.)"
242(1):176]。これらの抗体は本発明の方法に有
用であるが、従来技術における抗体と異なり、ハイブリ
ッドリセプターの場合には、リポーターポリペプチドに
とって特異的であり、他のリセプターやりん酸化された
タンパク質とは交差反応せず、リガンドのリセプター結
合領域への結合影響を測定することに関しては、まさに
利用度の高い抗ホスホチロシン抗体が選ばれる。しか
し、この方法は、結合しなかった標識抗体をリポーター
と結合した抗体から除去するために相分離が必要である
という不都合を有する。しかしながら、この方法では、
ハイブリッドリセプターを共有結合的に修飾しなくとも
よい。
【0052】リポーターポリペプチドに対する特異抗体
の結合を利用するアツセイと同様の方法は、正常な相互
作用によってリポーターと結合する非−免疫的な結合タ
ンパク質のリポーターへの結合を測定する方法である。
典型的な結合タンパク質は、ある種の、リガンドで活性
化されたリセプターに伴なっているGタンパク質であ
る。この場合のリポーターポリペプチドはβ−アドレナ
リン性リセプター等のリセプターの細胞質内領域であ
る。Gタンパク質の結合は、標識したGタンパク質の置
換により、あるいは、活性化されたGタンパク質へのG
TPまたはATPの結合の測定等、抗体結合のアツセイ
と同様にして分析される。
の結合を利用するアツセイと同様の方法は、正常な相互
作用によってリポーターと結合する非−免疫的な結合タ
ンパク質のリポーターへの結合を測定する方法である。
典型的な結合タンパク質は、ある種の、リガンドで活性
化されたリセプターに伴なっているGタンパク質であ
る。この場合のリポーターポリペプチドはβ−アドレナ
リン性リセプター等のリセプターの細胞質内領域であ
る。Gタンパク質の結合は、標識したGタンパク質の置
換により、あるいは、活性化されたGタンパク質へのG
TPまたはATPの結合の測定等、抗体結合のアツセイ
と同様にして分析される。
【0053】もしもリポーターポリペプチドがヘテロロ
ーガスなリセプターの酵素学的に活性な細胞質内領域で
ある場合には、その活性のアツセイが検出方法として好
ましい。今日、その様な活性には、タンパク質のホスホ
リルキナーゼ活性や一次チロシンキナーゼ活性が含まれ
るが、いくつかの例では、セリンキナーゼ活性やスレオ
ニンキナーゼ活性も含まれる。キナーゼ活性は、従来の
キナーゼ活性の測定法の内、いずれかの方法によって測
定される。キナーゼ活性の測定法として、本発明におい
て好ましい従来方法は、32Pを用いた自己りん酸化を介
する、リポーターポリペプチドへの放射性りんの挿入を
測定する方法である。同じ種類の活性を有するリセプタ
ーのハイブリッドを形成することが好ましい。
ーガスなリセプターの酵素学的に活性な細胞質内領域で
ある場合には、その活性のアツセイが検出方法として好
ましい。今日、その様な活性には、タンパク質のホスホ
リルキナーゼ活性や一次チロシンキナーゼ活性が含まれ
るが、いくつかの例では、セリンキナーゼ活性やスレオ
ニンキナーゼ活性も含まれる。キナーゼ活性は、従来の
キナーゼ活性の測定法の内、いずれかの方法によって測
定される。キナーゼ活性の測定法として、本発明におい
て好ましい従来方法は、32Pを用いた自己りん酸化を介
する、リポーターポリペプチドへの放射性りんの挿入を
測定する方法である。同じ種類の活性を有するリセプタ
ーのハイブリッドを形成することが好ましい。
【0054】しかしながら、酵素学的な活性やポリペプ
チドの相互作用以外の手段でリポーターポリペプチドの
変化を測定することも本発明の範囲に含まれる。その様
な方法の1つは、リガンドとの結合に際して性質が変化
する有機部分をリセプターに結合させることを含む。例
えば、リポーターポリペプチドを安定なフリーラジカル
や化学発光性の基、あるいはフルオレスセイン・イソチ
オシアナートの如き蛍光性の分子でラベルする。これら
のラベルはいずれも診断的免疫化学の分野では良く知ら
れており、それらをタンパク質と共有結合的に結合させ
るための常法も良く知られている。これらの方法はリポ
ーターポリペプチドを他のタンパク質と同様の方法でラ
ベルするのに有用である。リガンド結合領域に対するリ
ガンドまたは候補薬物の結合に際するリセプターポリペ
プチドの立体配座の変化はラベルの変化に基づいて検出
される。例えば、リポーターポリペプチドの立体配座に
対するリガンドの活性化に基づく変化によって安定なフ
リーラジカル・ラベルの回転モーメントが増加または減
少するであろう。同様に、リポーターポリペプチドの蛍
光性ラベルまたは化学発光性ラベルは、リポーターポリ
ペプチドにリガンドまたは活性な候補が結合すると分子
内のエネルギーの移動に関与しているポリペプチド種が
再配向(リオリエンテーション)されるために変化するで
あろう。これは、ラベル分子の強度、分極または波長の
変化によって検出され、一般に、ラベルの蛍光または化
学発光の増強または消失によって検出される。ラベルし
たリポーターを用いる方法の利点は、リガンドまたは候
補薬物の分析をもっぱら水溶液中で行うことができ、相
分離の必要がないことにある。このことにより、オート
アナライザー等の連続フロー機器を用い、自動的なスク
リーニング法が可能となる。その様な方法は、ハイブリ
ッドリセプター同様、固有のリセプターにも有用であ
る。
チドの相互作用以外の手段でリポーターポリペプチドの
変化を測定することも本発明の範囲に含まれる。その様
な方法の1つは、リガンドとの結合に際して性質が変化
する有機部分をリセプターに結合させることを含む。例
えば、リポーターポリペプチドを安定なフリーラジカル
や化学発光性の基、あるいはフルオレスセイン・イソチ
オシアナートの如き蛍光性の分子でラベルする。これら
のラベルはいずれも診断的免疫化学の分野では良く知ら
れており、それらをタンパク質と共有結合的に結合させ
るための常法も良く知られている。これらの方法はリポ
ーターポリペプチドを他のタンパク質と同様の方法でラ
ベルするのに有用である。リガンド結合領域に対するリ
ガンドまたは候補薬物の結合に際するリセプターポリペ
プチドの立体配座の変化はラベルの変化に基づいて検出
される。例えば、リポーターポリペプチドの立体配座に
対するリガンドの活性化に基づく変化によって安定なフ
リーラジカル・ラベルの回転モーメントが増加または減
少するであろう。同様に、リポーターポリペプチドの蛍
光性ラベルまたは化学発光性ラベルは、リポーターポリ
ペプチドにリガンドまたは活性な候補が結合すると分子
内のエネルギーの移動に関与しているポリペプチド種が
再配向(リオリエンテーション)されるために変化するで
あろう。これは、ラベル分子の強度、分極または波長の
変化によって検出され、一般に、ラベルの蛍光または化
学発光の増強または消失によって検出される。ラベルし
たリポーターを用いる方法の利点は、リガンドまたは候
補薬物の分析をもっぱら水溶液中で行うことができ、相
分離の必要がないことにある。このことにより、オート
アナライザー等の連続フロー機器を用い、自動的なスク
リーニング法が可能となる。その様な方法は、ハイブリ
ッドリセプター同様、固有のリセプターにも有用であ
る。
【0055】実施例の記載を簡単にするため、頻繁に用
いられる方法を短い熟語に略して示す。“プラスミド"
は小文字のpを先頭にし、そして/または大文字および
/または数字を続けることによって表わされる。本発明
の出発物質であるプラスミドは市販されているか、また
は非制限的な施設から一般に入手可能であり、あるいは
この様にして入手し得るプラスミドから、公知の方法に
従って組立てることができる。更に、その他の同等なプ
ラスミドも当業者には知られており、通常の技術者にと
って自明であろう。
いられる方法を短い熟語に略して示す。“プラスミド"
は小文字のpを先頭にし、そして/または大文字および
/または数字を続けることによって表わされる。本発明
の出発物質であるプラスミドは市販されているか、また
は非制限的な施設から一般に入手可能であり、あるいは
この様にして入手し得るプラスミドから、公知の方法に
従って組立てることができる。更に、その他の同等なプ
ラスミドも当業者には知られており、通常の技術者にと
って自明であろう。
【0056】DNAの“消化"または“開裂"とは、DN
Aを、該DNAのある位置に対してのみ作用する酵素で
触媒的に開裂することを指す。その様な酵素を制限酵素
と称し、該酵素にとって特異的な部位を制限部位(サイ
ト)と称する。本発明において用いる様々な制限酵素は
市販されており、その反応条件、コファクター、および
その他必要なものは、酵素の供給業者の指示に従って使
用した。制限酵素類は、各制限酵素が最初に得られた微
生物を表示する大文字、次いで他の文字、更に、通常、
数字からなる略号で表わされる。特定の酵素について適
当な緩衝液および基質の量は、製造業者によって明示さ
れている。通常、インキュベーション時間は37℃で1
〜数時間とするが、供給者の指示に従ってかえてもよ
い。インキュベーションした後、フェノールおよびクロ
ロホルムでタンパク質を抽出して除き、水性フラクショ
ンからエタノール沈殿によって消化された核酸を回収す
る。時たま、制限酵素による消化の後、5'末端のホス
フェートを細菌性アルカリホスファターゼで加水分解す
ることがある。これは、DNAフラグメントの2つの制
限的開裂末端が“閉環(サーキュライディング)"した
り、閉じたループを形成することにより、該制限部位に
他のDNAフラグメントが挿入されにくくなるのを防止
するためである。明示しない限り、プラスミドの消化に
は、5'末端の脱りん反応は伴なわないものとする。脱
りんの方法および試薬は常法に従う[T.マニアテイス
(T.Maniatis)ら、1982、モレキュラー・クローニ
ング(Molecular Cloning)pp.133−134]。
Aを、該DNAのある位置に対してのみ作用する酵素で
触媒的に開裂することを指す。その様な酵素を制限酵素
と称し、該酵素にとって特異的な部位を制限部位(サイ
ト)と称する。本発明において用いる様々な制限酵素は
市販されており、その反応条件、コファクター、および
その他必要なものは、酵素の供給業者の指示に従って使
用した。制限酵素類は、各制限酵素が最初に得られた微
生物を表示する大文字、次いで他の文字、更に、通常、
数字からなる略号で表わされる。特定の酵素について適
当な緩衝液および基質の量は、製造業者によって明示さ
れている。通常、インキュベーション時間は37℃で1
〜数時間とするが、供給者の指示に従ってかえてもよ
い。インキュベーションした後、フェノールおよびクロ
ロホルムでタンパク質を抽出して除き、水性フラクショ
ンからエタノール沈殿によって消化された核酸を回収す
る。時たま、制限酵素による消化の後、5'末端のホス
フェートを細菌性アルカリホスファターゼで加水分解す
ることがある。これは、DNAフラグメントの2つの制
限的開裂末端が“閉環(サーキュライディング)"した
り、閉じたループを形成することにより、該制限部位に
他のDNAフラグメントが挿入されにくくなるのを防止
するためである。明示しない限り、プラスミドの消化に
は、5'末端の脱りん反応は伴なわないものとする。脱
りんの方法および試薬は常法に従う[T.マニアテイス
(T.Maniatis)ら、1982、モレキュラー・クローニ
ング(Molecular Cloning)pp.133−134]。
【0057】“充填(フィリング)"または“平滑末端化
(ブランティング)"とは、制限酵素で開裂した核酸の粘
着末端の一本鎖末端を二本鎖に変換する工程を指す。こ
のことにより、粘着末端が消滅して平滑末端が形成され
る。この工程は、1個またはほんの少数の他の制限酵素
によって作られた末端とのみ結合し得る制限的な切断末
端を、あらゆる、平滑に切断する制限エンドヌクレアー
ゼで形成された末端末端または他の充填後の粘着末端に
適合し得る末端に変える上で多方面に利用可能な手段で
ある。一般に、平滑末端化は、目的とするDNA2〜1
5μgを、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメン
ト8単位と4種類のデオキシヌクレオチドトリホスフェ
ート各250μMの存在下、10mMMgCl2、1mMジ
チオトレイトール、50mMNaCl、10mMトリス(p
H7.5)バツファーの混液中、37℃でインキュベート
することにより行われる。通常、30分後にフェノール
およびクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿に付すこ
とによりインキュベーションを終了する。
(ブランティング)"とは、制限酵素で開裂した核酸の粘
着末端の一本鎖末端を二本鎖に変換する工程を指す。こ
のことにより、粘着末端が消滅して平滑末端が形成され
る。この工程は、1個またはほんの少数の他の制限酵素
によって作られた末端とのみ結合し得る制限的な切断末
端を、あらゆる、平滑に切断する制限エンドヌクレアー
ゼで形成された末端末端または他の充填後の粘着末端に
適合し得る末端に変える上で多方面に利用可能な手段で
ある。一般に、平滑末端化は、目的とするDNA2〜1
5μgを、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメン
ト8単位と4種類のデオキシヌクレオチドトリホスフェ
ート各250μMの存在下、10mMMgCl2、1mMジ
チオトレイトール、50mMNaCl、10mMトリス(p
H7.5)バツファーの混液中、37℃でインキュベート
することにより行われる。通常、30分後にフェノール
およびクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿に付すこ
とによりインキュベーションを終了する。
【0058】制限消化物からの特定のDNAフラグメン
トの“回収"または“単離"とは、この消化物をポリアク
リルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動にかけて
分離し、フラグメントの移動度を分子量既知のマーカー
DNAフラグメントのそれと比較して所望のフラグメン
トを同定し、所望のフラグメントを含むゲルの部分を取
り除き、該ゲルからDNAを分離することを意味する。
この方法は一般的に知られている。例、R.ローン(R.
Lawn)ら、1981、“ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ"9:6103−6114およびD.ゲツデル(D.Go
eddel)ら、1980“ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ"8:4057参照。
トの“回収"または“単離"とは、この消化物をポリアク
リルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動にかけて
分離し、フラグメントの移動度を分子量既知のマーカー
DNAフラグメントのそれと比較して所望のフラグメン
トを同定し、所望のフラグメントを含むゲルの部分を取
り除き、該ゲルからDNAを分離することを意味する。
この方法は一般的に知られている。例、R.ローン(R.
Lawn)ら、1981、“ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ"9:6103−6114およびD.ゲツデル(D.Go
eddel)ら、1980“ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ"8:4057参照。
【0059】“形質転換"とは、DNAを生物内に導入
することを意味し、その結果DNAが染色体外成分とし
て、あるいは染色体内に組込まれて複製されることを意
味する。特に明示しない限り、本発明における大腸菌の
形質転換法にはマンデル(Mandel)らのCaCl2法(19
70、“ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
イ"53:154)を採用する。
することを意味し、その結果DNAが染色体外成分とし
て、あるいは染色体内に組込まれて複製されることを意
味する。特に明示しない限り、本発明における大腸菌の
形質転換法にはマンデル(Mandel)らのCaCl2法(19
70、“ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
イ"53:154)を採用する。
【0060】“ライゲーション(結合)"とは、2個の2
本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形
成する工程を言う(T.マニアテイスら、前掲p146)。
特に明示しない限り、ライゲーションは既知の緩衝液と
条件を使用し、ライゲートすべきDNAフラグメント1
μg当たりT4DNAリガーゼ(“リガーゼ")10単位
を用いて行う。
本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形
成する工程を言う(T.マニアテイスら、前掲p146)。
特に明示しない限り、ライゲーションは既知の緩衝液と
条件を使用し、ライゲートすべきDNAフラグメント1
μg当たりT4DNAリガーゼ(“リガーゼ")10単位
を用いて行う。
【0061】形質転換体からDNAを“調製する"と
は、プラスミドDNAを微生物培養物中から単離するこ
とを意味する。明示しない限り、マニアテイスらのアル
カリ性/SDS法(同上p.90)を採用する。
は、プラスミドDNAを微生物培養物中から単離するこ
とを意味する。明示しない限り、マニアテイスらのアル
カリ性/SDS法(同上p.90)を採用する。
【0062】“オリゴヌクレオチド"とは、短かい一本
鎖または二本鎖ポリデオキシヌクレオチドであって、既
知の方法によって化学的に合成され、次いでポリアクリ
ルアミドゲル上で精製されたものである。
鎖または二本鎖ポリデオキシヌクレオチドであって、既
知の方法によって化学的に合成され、次いでポリアクリ
ルアミドゲル上で精製されたものである。
【0063】以下の実施例は本発明を実施する上で、現
在知られている最良の方法を例示するものにすぎず、本
発明がこれらに限定されることはない。本明細書中で引
用した文献は全て参照例として示されている。
在知られている最良の方法を例示するものにすぎず、本
発明がこれらに限定されることはない。本明細書中で引
用した文献は全て参照例として示されている。
【0064】
【実施例】実施例 1 インシュリンリセプター(IR)発現プラス
ミドの組立て 全HIR暗号配列を含有するλHIR−P12から得た
ゲル精製SalIフラグメント(5.2kb)を、pUC12を
SalIで消化し、このベクターに精製SalIフラグメント
をライゲートすることによりpUC12[ニューイングラ
ンド・バイオラボス(Naw England Biolabs)]のポリ
リンカー領域にサブクローンした。コロニーを増殖さ
せ、pUC12XbaI部位の隣にHIR暗号配列の5'末
端が所望の方向性で含有されているクローンをスクリー
ニングした。このベクターをXbaIおよびDraIで消化し
(DraIはHIRの3'非翻訳領域に含まれている)、HI
R−含有フラグメントを単離した。このフラグメントを
哺乳類の発現ベクター(pCVSVEHBVE400、欧
州公開No.117,060)であって、BamHIで先に消
化しておいたベクターに挿入した。BamHI粘着末端を
充填した後、プラスミドをXbaIで消化した。従って、
XbaI−DraIへの挿入は、HIRmRNAが必然的に発
現する方向にのみ可能であった。得られたインシュリン
リセプター発現プラスミドをpCVSV−HIRcと命名
した。
ミドの組立て 全HIR暗号配列を含有するλHIR−P12から得た
ゲル精製SalIフラグメント(5.2kb)を、pUC12を
SalIで消化し、このベクターに精製SalIフラグメント
をライゲートすることによりpUC12[ニューイングラ
ンド・バイオラボス(Naw England Biolabs)]のポリ
リンカー領域にサブクローンした。コロニーを増殖さ
せ、pUC12XbaI部位の隣にHIR暗号配列の5'末
端が所望の方向性で含有されているクローンをスクリー
ニングした。このベクターをXbaIおよびDraIで消化し
(DraIはHIRの3'非翻訳領域に含まれている)、HI
R−含有フラグメントを単離した。このフラグメントを
哺乳類の発現ベクター(pCVSVEHBVE400、欧
州公開No.117,060)であって、BamHIで先に消
化しておいたベクターに挿入した。BamHI粘着末端を
充填した後、プラスミドをXbaIで消化した。従って、
XbaI−DraIへの挿入は、HIRmRNAが必然的に発
現する方向にのみ可能であった。得られたインシュリン
リセプター発現プラスミドをpCVSV−HIRcと命名
した。
【0065】実施例 2 インシュリン−EGFハイブ
リッドリセプターを発現させるためのベクターの組立て 以下のフラグメントを、4成分(ファクター)ライゲーシ
ョンでライゲートさせた。(a)IR発現プラスミドpCV
SVE−HIRc由来の931bpBamHI−AatII制限フ
ラグメント、(b)組換えファージλHER−A64[ウー
リッチら(Ullrich)1984、“ネイチャー"309:4
18〜425]に含有されているヒトEGFリセプター
配列の1150bpApaI−SstI制限フラグメント、(c)
5'−CCCGTCAAATATCGCCACTGGG
ATGGTGGGGGCC−3'および5'−CCCAC
CATCCCAGTGGCGATATTTGACGGG
ACGT−3'を含有する合成オリゴヌクレオチドリン
カー、および(d)SstIおよびBamHIで開裂されたpUC
12。この様にして、インシュリンリセプターの細胞外
領域をコードしている配列をEGFリセプターのトラン
スメンブラン領域および細胞質領域をコードしている配
列と結合させ、発現プラスミド内に位置せしめた。ハイ
ブリッドをコードしているDNAを含有するプラスミド
pUC12/HIR−HERInt.を形質転換された大腸
菌294のアンピシリン耐性コロニーから回収した。こ
のプラスミドをBamHIおよびApaIで消化し、IER連
結部(ジャンクション)を含有する965bpフラグメント
(フラグメント1)を回収した。pCVSV−HIRcをP
vuIおよびBamHIで消化し、残りのIR暗号配列と哺乳
類発現ベクターの一部を含有する3117bpフラグメン
ト(フラグメント2)を回収した。λHER−A64をA
paI−BglIIで消化して810bpフラグメント(フラグメ
ント3)、BglII−XmnIで消化して1kbフラグメント
(フラグメント4)をそれぞれ回収した。フラグメント3
および4はヒトEGFリセプターのトランスメンブラン
および細胞質領域をコードしている。pCVSVEHB
VE400をBamHIで消化し、制限部位を末端の充填
に付し、このDNAを引き続きPvuIで消化した。記載
の哺乳類発現ベクターの一部をコードしている4kbBam
HI−PvuIフラグメント(フラグメント5)を回収した。
フラグメント1、2、3、4および5の混合物をライゲ
ートし、大腸菌294DNAの形質転換に用いた。制限
分析によりアンピシリン耐性コロニーをスクリーニング
した。HIR−HER連結部とオーバラップする241
bpのPstIフラグメントをM13Tyl31にクローン
し、配列決定を行って予測される連結部を立証した。
リッドリセプターを発現させるためのベクターの組立て 以下のフラグメントを、4成分(ファクター)ライゲーシ
ョンでライゲートさせた。(a)IR発現プラスミドpCV
SVE−HIRc由来の931bpBamHI−AatII制限フ
ラグメント、(b)組換えファージλHER−A64[ウー
リッチら(Ullrich)1984、“ネイチャー"309:4
18〜425]に含有されているヒトEGFリセプター
配列の1150bpApaI−SstI制限フラグメント、(c)
5'−CCCGTCAAATATCGCCACTGGG
ATGGTGGGGGCC−3'および5'−CCCAC
CATCCCAGTGGCGATATTTGACGGG
ACGT−3'を含有する合成オリゴヌクレオチドリン
カー、および(d)SstIおよびBamHIで開裂されたpUC
12。この様にして、インシュリンリセプターの細胞外
領域をコードしている配列をEGFリセプターのトラン
スメンブラン領域および細胞質領域をコードしている配
列と結合させ、発現プラスミド内に位置せしめた。ハイ
ブリッドをコードしているDNAを含有するプラスミド
pUC12/HIR−HERInt.を形質転換された大腸
菌294のアンピシリン耐性コロニーから回収した。こ
のプラスミドをBamHIおよびApaIで消化し、IER連
結部(ジャンクション)を含有する965bpフラグメント
(フラグメント1)を回収した。pCVSV−HIRcをP
vuIおよびBamHIで消化し、残りのIR暗号配列と哺乳
類発現ベクターの一部を含有する3117bpフラグメン
ト(フラグメント2)を回収した。λHER−A64をA
paI−BglIIで消化して810bpフラグメント(フラグメ
ント3)、BglII−XmnIで消化して1kbフラグメント
(フラグメント4)をそれぞれ回収した。フラグメント3
および4はヒトEGFリセプターのトランスメンブラン
および細胞質領域をコードしている。pCVSVEHB
VE400をBamHIで消化し、制限部位を末端の充填
に付し、このDNAを引き続きPvuIで消化した。記載
の哺乳類発現ベクターの一部をコードしている4kbBam
HI−PvuIフラグメント(フラグメント5)を回収した。
フラグメント1、2、3、4および5の混合物をライゲ
ートし、大腸菌294DNAの形質転換に用いた。制限
分析によりアンピシリン耐性コロニーをスクリーニング
した。HIR−HER連結部とオーバラップする241
bpのPstIフラグメントをM13Tyl31にクローン
し、配列決定を行って予測される連結部を立証した。
【0066】トランスメンブラン領域を含有しないハイ
ブリッドリセプターの発現ベクターを、ApaIEGFリ
セプター下流のトランスメンブラン領域がM13突然変
異誘発によって欠失されており、欠失されたERフラグ
メントにフレーム内で、ApaIアダプターがライゲート
されていることを除き、pCVSV−HIRcを用いて同
様の方法で組立てた。
ブリッドリセプターの発現ベクターを、ApaIEGFリ
セプター下流のトランスメンブラン領域がM13突然変
異誘発によって欠失されており、欠失されたERフラグ
メントにフレーム内で、ApaIアダプターがライゲート
されていることを除き、pCVSV−HIRcを用いて同
様の方法で組立てた。
【0067】インシュリンリセプターα鎖とEGFリセ
プターのトランスメンブランおよび細胞質領域とのハイ
ブリッドであって、HIR−β鎖配列を全く含まないハ
イブリッドリセプターIαERをコードしているベクタ
ーをIERプラスミドのオリゴヌクレオチドで指令され
る欠失突然変異により調製した。結合したインシュリン
リセプターおよびEGFリセプターの配列をM13mp1
0ベクターのBamHI部位に導入した。M13mp10の
HindIII部位の隣りに所望の方向性でIR配列を含有し
ている分子を同定し、アデルマン(Adelman)ら[“DN
A"2:183〜193(1983)]のプロトコールに基
づき、オリゴヌクレオチド5'−CCCCAGGCCA
TCTATCGCCACTGGGA−3'を用いた欠失
突然変異誘発を行うために、一本鎖の鋳型を調製した。
りん酸化したプライマー50mgを一本鎖M13鋳型2
μgとハイブリダイズさせた。突然変異した第2の鎖を
完成させ、この二本鎖分子を大腸菌JM101に導入し
た。得られたプラークを、ハイブリダイゼーションのプ
ローブとしてプライマーを用い、高いストリンジェンシ
ィの下、ベントン(Benton)およびデービス(Davis)の
“サイエンス"196:180〜182(1977)記載の
方法に従い、スクリーニングした。二本鎖DNAを調製
し、突然変異した領域を含有する1.2kbBstEII制限
フラグメントを用いてIER発現プラスミドのそれぞれ
のDNAフラグメントと置換し、pIαERを得た。
プターのトランスメンブランおよび細胞質領域とのハイ
ブリッドであって、HIR−β鎖配列を全く含まないハ
イブリッドリセプターIαERをコードしているベクタ
ーをIERプラスミドのオリゴヌクレオチドで指令され
る欠失突然変異により調製した。結合したインシュリン
リセプターおよびEGFリセプターの配列をM13mp1
0ベクターのBamHI部位に導入した。M13mp10の
HindIII部位の隣りに所望の方向性でIR配列を含有し
ている分子を同定し、アデルマン(Adelman)ら[“DN
A"2:183〜193(1983)]のプロトコールに基
づき、オリゴヌクレオチド5'−CCCCAGGCCA
TCTATCGCCACTGGGA−3'を用いた欠失
突然変異誘発を行うために、一本鎖の鋳型を調製した。
りん酸化したプライマー50mgを一本鎖M13鋳型2
μgとハイブリダイズさせた。突然変異した第2の鎖を
完成させ、この二本鎖分子を大腸菌JM101に導入し
た。得られたプラークを、ハイブリダイゼーションのプ
ローブとしてプライマーを用い、高いストリンジェンシ
ィの下、ベントン(Benton)およびデービス(Davis)の
“サイエンス"196:180〜182(1977)記載の
方法に従い、スクリーニングした。二本鎖DNAを調製
し、突然変異した領域を含有する1.2kbBstEII制限
フラグメントを用いてIER発現プラスミドのそれぞれ
のDNAフラグメントと置換し、pIαERを得た。
【0068】実施例 3 インシュリンおよびEGFの
ハイブリッドリセプターの発現 COS−7サル腎細胞[グルツマン(Gluzman)198
1、“セル"23:175〜182]を10%ウシ胎児血
清と抗生物質とを含んだ、DMEM培地とF12培地の
50:50混合物中で培養した。全細胞培養培地[ギブコ
(Gibco)]は、2mM L−グルタミンと20mMHEP
ESpH7.4を含有していた。
ハイブリッドリセプターの発現 COS−7サル腎細胞[グルツマン(Gluzman)198
1、“セル"23:175〜182]を10%ウシ胎児血
清と抗生物質とを含んだ、DMEM培地とF12培地の
50:50混合物中で培養した。全細胞培養培地[ギブコ
(Gibco)]は、2mM L−グルタミンと20mMHEP
ESpH7.4を含有していた。
【0069】実施例2で得たpIERまたはpIαERを
グラハム(Graham)およびファン・デル・エブ(Van der
Eb)、1973“ヴィロロジィ(Virology)"52:45
6〜467のプロトコールに基づき、りん酸カルシウム
による共沈法によってCOS−7細胞に導入した。準
(サブ)全面成長した細胞を8cmの培養皿あたり、10
μgのプラスミドでトランスフェクトした。プラスミド
DNAを1mMトリスpH7.5、0.1mMEDTA、お
よび250mMCaCl20.55mlに溶かした後、50
mMHEPESpH7.12、280mMNaClおよび1.
5mMNa2HPO40.5mlをゆっくり加えた。45分
間の間に沈殿が徐々に形成され、それを、細胞培養培地
に加えた。トランスフェクトされたCOS−7細胞を、
抗生物質、2mML−グルタミン、20mMHEPESお
よび10(v/v)%ウシ胎児血清(pH7.4)を含んだDM
EM培地とF−12培地の50:50混合物中、37℃
で53時間培養した。
グラハム(Graham)およびファン・デル・エブ(Van der
Eb)、1973“ヴィロロジィ(Virology)"52:45
6〜467のプロトコールに基づき、りん酸カルシウム
による共沈法によってCOS−7細胞に導入した。準
(サブ)全面成長した細胞を8cmの培養皿あたり、10
μgのプラスミドでトランスフェクトした。プラスミド
DNAを1mMトリスpH7.5、0.1mMEDTA、お
よび250mMCaCl20.55mlに溶かした後、50
mMHEPESpH7.12、280mMNaClおよび1.
5mMNa2HPO40.5mlをゆっくり加えた。45分
間の間に沈殿が徐々に形成され、それを、細胞培養培地
に加えた。トランスフェクトされたCOS−7細胞を、
抗生物質、2mML−グルタミン、20mMHEPESお
よび10(v/v)%ウシ胎児血清(pH7.4)を含んだDM
EM培地とF−12培地の50:50混合物中、37℃
で53時間培養した。
【0070】pIERまたはpIαERで形質転換された
COS−7細胞をPBSで2回洗浄し、2.2cmのウ
エルあたり、0.2%ウシ血清アルブミン(シグマ)、バ
シトラシン(0.5mg/ml、シグマ)および125Iイン
シュリン(0.5μCi/ウエル)、93μCi/μgを含
んだ血清不含細胞培養培地1ml中、21℃で2時間イ
ンキュベートした。細胞を、4℃において、PBSで3
回洗浄し、37℃において、0.1%SDS、0.1MN
aOH0.5ml中で30分間溶解させた。ガンマ・カウ
ンター中で放射活性を測定した。形質転換体へのインシ
ュリンの結合が、対照におけるそれよりも増加している
ことを、図3に示した。
COS−7細胞をPBSで2回洗浄し、2.2cmのウ
エルあたり、0.2%ウシ血清アルブミン(シグマ)、バ
シトラシン(0.5mg/ml、シグマ)および125Iイン
シュリン(0.5μCi/ウエル)、93μCi/μgを含
んだ血清不含細胞培養培地1ml中、21℃で2時間イ
ンキュベートした。細胞を、4℃において、PBSで3
回洗浄し、37℃において、0.1%SDS、0.1MN
aOH0.5ml中で30分間溶解させた。ガンマ・カウ
ンター中で放射活性を測定した。形質転換体へのインシ
ュリンの結合が、対照におけるそれよりも増加している
ことを、図3に示した。
【0071】ヒト上皮性腫瘍細胞A431(EGFリセ
プターの対照リセプター供給源)を1lあたり4.5mM
グルコース、10%ウシ胎児血清および抗生物質を含ん
だDMEM中で培養した。
プターの対照リセプター供給源)を1lあたり4.5mM
グルコース、10%ウシ胎児血清および抗生物質を含ん
だDMEM中で培養した。
【0072】実施例4 正常なリセプターおよびハイブ
リッドリセプターにおけるホルモン刺激下での自己りん
酸化 pIERまたはpIαERで形質転換した、並びにmock形
質転換に付されたCOS−7細胞を8cmの培養皿中で
53時間増殖させて得た単層あるいはA431細胞をP
BSで2回洗浄し、クリスら(Kris)、1985“セル"
40:619〜625の記載の如くにして可溶化した。
150mMNaCl、1.5mMMgCl2、1mMEGT
A、10%グリセロール、1%トリトンX−100、1
%アプロチニン(シグマ)および4μg/mlフェニルメ
チルスルホニル・フルオライド(PMSF)(シグマ)並び
に0.5mg/mlバシトラシン(シグマ)を含有する5
0mMHEPESバツファー(pH7.5)1mlを、この
単層に4℃において5分間加えた。培養皿から、可溶化
されたタンパク質を含有しているバツファーを取り、4
℃において5分間、10,000gで遠心した。トラン
スメンブラン領域を欠失したハイブリッドリセプターで
形質転換した細胞の培養上清を4℃において5分間、1
0,000gで遠心した。細胞溶解液または培養上清0.
2mlを200nMインシュリン(シグマ)または1μM
EGFと1時間インキュベートした。
リッドリセプターにおけるホルモン刺激下での自己りん
酸化 pIERまたはpIαERで形質転換した、並びにmock形
質転換に付されたCOS−7細胞を8cmの培養皿中で
53時間増殖させて得た単層あるいはA431細胞をP
BSで2回洗浄し、クリスら(Kris)、1985“セル"
40:619〜625の記載の如くにして可溶化した。
150mMNaCl、1.5mMMgCl2、1mMEGT
A、10%グリセロール、1%トリトンX−100、1
%アプロチニン(シグマ)および4μg/mlフェニルメ
チルスルホニル・フルオライド(PMSF)(シグマ)並び
に0.5mg/mlバシトラシン(シグマ)を含有する5
0mMHEPESバツファー(pH7.5)1mlを、この
単層に4℃において5分間加えた。培養皿から、可溶化
されたタンパク質を含有しているバツファーを取り、4
℃において5分間、10,000gで遠心した。トラン
スメンブラン領域を欠失したハイブリッドリセプターで
形質転換した細胞の培養上清を4℃において5分間、1
0,000gで遠心した。細胞溶解液または培養上清0.
2mlを200nMインシュリン(シグマ)または1μM
EGFと1時間インキュベートした。
【0073】インシュリンリセプターと結合し得るマウ
スのモノクローナル抗体[CII25.3、ガングリィら
(Ganguly)1985“細胞制御における今日の話題(Cu
rrentTopics in Cellular Regulation)"27:83−
94]をプロティンA−セファロースに吸着させて固定
化した。しかしながら、どの様なポリクローナルまたは
モノクローナル抗−インシュリンリセプター抗体を用い
ても良いことは、理解できるであろう。抗体1μlを、
界面活性剤不含の溶解バツファー中、膨潤させ、予め洗
浄しておいたプロティンA−セファロース(1:1)のス
ラリーと30分間混合し、抗−IR抗体を吸着させた。
スのモノクローナル抗体[CII25.3、ガングリィら
(Ganguly)1985“細胞制御における今日の話題(Cu
rrentTopics in Cellular Regulation)"27:83−
94]をプロティンA−セファロースに吸着させて固定
化した。しかしながら、どの様なポリクローナルまたは
モノクローナル抗−インシュリンリセプター抗体を用い
ても良いことは、理解できるであろう。抗体1μlを、
界面活性剤不含の溶解バツファー中、膨潤させ、予め洗
浄しておいたプロティンA−セファロース(1:1)のス
ラリーと30分間混合し、抗−IR抗体を吸着させた。
【0074】固定化抗−IR抗体のスラリー50μlを
EGFまたはインシュリンで処理した細胞リゼイト、あ
るいは細胞培養上清に加え、4℃で15分間インキュベ
ートした。生成した免疫沈降物をHNTGバツファー
(20mMHEPES、pH7.5:150mMNaCl、1
0%グリセロールおよび0.1%トリトンX−100)
0.9mlで4回洗浄した。容量30μlの沈殿を5mM
MnCl2に調節し、15μCiのγ−32P−ATP(5,
000Ci/mmol)を4℃において0.5〜10分間で加
えた。ATPの終濃度は、0.1pMATP(EGF、I
ERまたはIαER形質転換体またはそれらの対照に関
して)、あるいは100μMATP(HIR形質転換体ま
たはその対照に関して)であった。3倍濃度のSDS試
料バツファー20μlを加えることにより自己りん酸化
反応を終了させた。図4のa及び図5のdにおいては5
分後、図4のbにおいては1分後、そして図5のcにお
いては指示した時間の後に、5分間煮沸することによっ
て自己りん酸化を終了させた。試料を遠心し、20μl
づつ、5%/7%SDSポリアクリルアミドゲル上で分
析した[ラエムリ(Laemmli)、1970“ネイチャー"2
77:680〜685]。
EGFまたはインシュリンで処理した細胞リゼイト、あ
るいは細胞培養上清に加え、4℃で15分間インキュベ
ートした。生成した免疫沈降物をHNTGバツファー
(20mMHEPES、pH7.5:150mMNaCl、1
0%グリセロールおよび0.1%トリトンX−100)
0.9mlで4回洗浄した。容量30μlの沈殿を5mM
MnCl2に調節し、15μCiのγ−32P−ATP(5,
000Ci/mmol)を4℃において0.5〜10分間で加
えた。ATPの終濃度は、0.1pMATP(EGF、I
ERまたはIαER形質転換体またはそれらの対照に関
して)、あるいは100μMATP(HIR形質転換体ま
たはその対照に関して)であった。3倍濃度のSDS試
料バツファー20μlを加えることにより自己りん酸化
反応を終了させた。図4のa及び図5のdにおいては5
分後、図4のbにおいては1分後、そして図5のcにお
いては指示した時間の後に、5分間煮沸することによっ
て自己りん酸化を終了させた。試料を遠心し、20μl
づつ、5%/7%SDSポリアクリルアミドゲル上で分
析した[ラエムリ(Laemmli)、1970“ネイチャー"2
77:680〜685]。
【0075】SDS−PAGE還元ゲル上で得られた泳
動パターンはチロシンキナーゼ配列を含有するポリペプ
チドに対する35S−Met標識法の結果と一致した。図4
のb(HIR+)から、内因性COS−7コントロールの
場合よりも、ヒトインシュリンリセプターβサブユニッ
トの場合の方が、インシュリン刺激自己りん酸化が高い
ことが分る。この場合、インシュリンリセプターキナー
ゼにとって必要なATPの濃度(100μM)に起因し
て、観察されるシグナルは弱いが、インシュリンの誘導
効果は強い。これに対し、A431細胞EGF対照リセ
プター(A431)で認められるように、EGFリセプタ
ーキナーゼの活性およびEGF刺激の測定にはピコモル
濃度しか必要としない。キメラリセプター分子IERが
特徴的に低濃度のATPを必要とすることは、そこに、
EGFリセプターキナーゼが存在していることを示すも
のである。リガンド誘導でキナーゼのVmaxが増加さ
れ、最大誘導(4倍)は4℃において、30秒間の反応の
後に認められた(図5のc)。この観察結果は野生型のE
GFリセプターの動力学的特性とよく関連しており[ス
タロスら(Staros)1985、「細胞制御の分子的側面
(Molecular Aspects ofCellular Regulation)」4
巻、「トランスメンブランのシグナリングにおける分子
機構(Molecular Mechanisms of Transmembrane Sig
nalling)」]、このことは、インシュリン結合領域によっ
てコントロールされた場合でも、EGFリセプターキナ
ーゼは、その本来の特徴を維持することを示すものであ
る。
動パターンはチロシンキナーゼ配列を含有するポリペプ
チドに対する35S−Met標識法の結果と一致した。図4
のb(HIR+)から、内因性COS−7コントロールの
場合よりも、ヒトインシュリンリセプターβサブユニッ
トの場合の方が、インシュリン刺激自己りん酸化が高い
ことが分る。この場合、インシュリンリセプターキナー
ゼにとって必要なATPの濃度(100μM)に起因し
て、観察されるシグナルは弱いが、インシュリンの誘導
効果は強い。これに対し、A431細胞EGF対照リセ
プター(A431)で認められるように、EGFリセプタ
ーキナーゼの活性およびEGF刺激の測定にはピコモル
濃度しか必要としない。キメラリセプター分子IERが
特徴的に低濃度のATPを必要とすることは、そこに、
EGFリセプターキナーゼが存在していることを示すも
のである。リガンド誘導でキナーゼのVmaxが増加さ
れ、最大誘導(4倍)は4℃において、30秒間の反応の
後に認められた(図5のc)。この観察結果は野生型のE
GFリセプターの動力学的特性とよく関連しており[ス
タロスら(Staros)1985、「細胞制御の分子的側面
(Molecular Aspects ofCellular Regulation)」4
巻、「トランスメンブランのシグナリングにおける分子
機構(Molecular Mechanisms of Transmembrane Sig
nalling)」]、このことは、インシュリン結合領域によっ
てコントロールされた場合でも、EGFリセプターキナ
ーゼは、その本来の特徴を維持することを示すものであ
る。
【0076】驚くべきことに、インシュリンで刺激され
た、あるいは刺激されていないIEリセプターハイブリ
ッドの130kdりんタンパク質サブユニットは微妙な、
しかし再現性のある、サイズの相違を示す(図5のd)。
この観察結果からリガンド誘導酵素活性は、チロシン残
基のりん酸化をもたらすが、基本的なレベルでの修飾を
伴なわず、以後に続くリセプターの細胞質内領域の立体
配座上の変化によってSDSゲル内での泳動特性が変化
し得るという可能性が示される。無傷のEGFリセプタ
ー内でも同様の変化が起こり得るが、170kdグリコプ
ロティンという大きいモノマーサイズを有するので検出
されていない。電気泳動における変化は、Ca2+/カル
モジュリン依存性タンパク質キナーゼ[クレットら(Kur
et)、1985“ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリィ"260:6427〜6433]、タイプIIc
AMP−依存性タンパク質キナーゼ[ヘミングスら(Hem
mings)、1981“ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・
バイオケミストリィ(Eur.J.Biochem.)"119:44
3〜451]等の他の自己りん酸化タンパク質について
も報告されている。
た、あるいは刺激されていないIEリセプターハイブリ
ッドの130kdりんタンパク質サブユニットは微妙な、
しかし再現性のある、サイズの相違を示す(図5のd)。
この観察結果からリガンド誘導酵素活性は、チロシン残
基のりん酸化をもたらすが、基本的なレベルでの修飾を
伴なわず、以後に続くリセプターの細胞質内領域の立体
配座上の変化によってSDSゲル内での泳動特性が変化
し得るという可能性が示される。無傷のEGFリセプタ
ー内でも同様の変化が起こり得るが、170kdグリコプ
ロティンという大きいモノマーサイズを有するので検出
されていない。電気泳動における変化は、Ca2+/カル
モジュリン依存性タンパク質キナーゼ[クレットら(Kur
et)、1985“ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリィ"260:6427〜6433]、タイプIIc
AMP−依存性タンパク質キナーゼ[ヘミングスら(Hem
mings)、1981“ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・
バイオケミストリィ(Eur.J.Biochem.)"119:44
3〜451]等の他の自己りん酸化タンパク質について
も報告されている。
【0077】開裂されていないキメラプロリセプターI
ERはインシュリン刺激による自己りん酸化を示すので
(図4のbおよび図5のc、IER+ゲルの頂上のバン
ド)、インシュリンの結合とシグナルの導入に必要な4
級構造が、インシュリンリセプターのタンパク分解的プ
ロセッシングの前に形成されているに相違なく、このこ
とは先行文献とも一致する[ブラツクシェアーら(Black
shear)、1983、“FEBS"158:243〜24
6;リース−ジョーンズら(Rees−Jones)1983“バ
イオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・
コミュニケーションズ(Biochem.Biophys.Res.Com
m.)116:417〜422]。インシュリンリセプター
のβサブユニットとプロリセプター開裂部位が欠失され
た細胞外部分を有するキメラ組立て物IαERを用いた
実験(図4のb、IαER比較図、+と−)によると、得
られた180kdの一本鎖糖タンパク質は、見かけ上イン
シュリンに対する結合能力を有するにもかかわらず、細
胞質内キナーゼ領域に対するインシュリンの活性化能は
失われていることが分った。
ERはインシュリン刺激による自己りん酸化を示すので
(図4のbおよび図5のc、IER+ゲルの頂上のバン
ド)、インシュリンの結合とシグナルの導入に必要な4
級構造が、インシュリンリセプターのタンパク分解的プ
ロセッシングの前に形成されているに相違なく、このこ
とは先行文献とも一致する[ブラツクシェアーら(Black
shear)、1983、“FEBS"158:243〜24
6;リース−ジョーンズら(Rees−Jones)1983“バ
イオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・
コミュニケーションズ(Biochem.Biophys.Res.Com
m.)116:417〜422]。インシュリンリセプター
のβサブユニットとプロリセプター開裂部位が欠失され
た細胞外部分を有するキメラ組立て物IαERを用いた
実験(図4のb、IαER比較図、+と−)によると、得
られた180kdの一本鎖糖タンパク質は、見かけ上イン
シュリンに対する結合能力を有するにもかかわらず、細
胞質内キナーゼ領域に対するインシュリンの活性化能は
失われていることが分った。
【0078】上記の如く、インシュリンはピコモル濃度
以下のATPの存在下、インシュリンリセプターのホス
ホトランスフェラーゼが不活性であるような条件の下
で、EGFリセプターの自己りん酸化活性の程度を制御
する。インシュリンリセプターをαサブユニットとβサ
ブユニット並びにβサブユニットのアミノ末端にプロセ
ッシングするためのシグナルを含めて、インシュリンリ
セプターの完全な細胞外部分を含有するハイブリッドI
ERに関してのみ、ホルモンによるコントロールが認め
られた。リセプターのプロセッシングは、本発明の発現
系で行われるようである。βサブユニットの全ての部分
をも欠き、その結果、開裂シグナルを欠くキメラIαE
Rの場合にはホルモンの影響を認めなかった。この様な
IERとIαERとの構造上の相違が、シグナル導入に
おける決定的なキメラリセプターの構造に強く影響して
いると考えられる。
以下のATPの存在下、インシュリンリセプターのホス
ホトランスフェラーゼが不活性であるような条件の下
で、EGFリセプターの自己りん酸化活性の程度を制御
する。インシュリンリセプターをαサブユニットとβサ
ブユニット並びにβサブユニットのアミノ末端にプロセ
ッシングするためのシグナルを含めて、インシュリンリ
セプターの完全な細胞外部分を含有するハイブリッドI
ERに関してのみ、ホルモンによるコントロールが認め
られた。リセプターのプロセッシングは、本発明の発現
系で行われるようである。βサブユニットの全ての部分
をも欠き、その結果、開裂シグナルを欠くキメラIαE
Rの場合にはホルモンの影響を認めなかった。この様な
IERとIαERとの構造上の相違が、シグナル導入に
おける決定的なキメラリセプターの構造に強く影響して
いると考えられる。
【0079】実施例 5 リセプター−腫瘍遺伝子ハイ
ブリッド(HER−erbB)をコードしているベクターの
組立て V−erbB腫瘍遺伝子産物の細胞内領域とEGFリセプ
ターの細胞外およびトランスメンブラン領域とを融合さ
せたハイブリッドリセプター(HER−erbB、図6)を
組立てた。
ブリッド(HER−erbB)をコードしているベクターの
組立て V−erbB腫瘍遺伝子産物の細胞内領域とEGFリセプ
ターの細胞外およびトランスメンブラン領域とを融合さ
せたハイブリッドリセプター(HER−erbB、図6)を
組立てた。
【0080】このハイブリッドリセプターは、SV40
の初期プロモーターのコントロール下、プラスミドから
発現される。このプラスミドはメトトレキセート(MT
X)耐性のための突然変異体DHFR遺伝子をも含有し
ている。ネオマイシン耐性遺伝子をコードしているプラ
スミドで同時形質転換して選択を行い、MTX−含有培
養培地中で選択することによりDNAを増幅させた。
の初期プロモーターのコントロール下、プラスミドから
発現される。このプラスミドはメトトレキセート(MT
X)耐性のための突然変異体DHFR遺伝子をも含有し
ている。ネオマイシン耐性遺伝子をコードしているプラ
スミドで同時形質転換して選択を行い、MTX−含有培
養培地中で選択することによりDNAを増幅させた。
【0081】λHER−A64(ウールリッヒら)をSac
IおよびNarIで消化し、EGFリセプターの全細胞外領
域とトランスメンブラン領域とをコードしている制限フ
ラグメントを回収した。AEV−erbB(H)[ヤマモトら
(Yamamoto,T.)1983“セル"35:71〜78]の全
細胞内領域をコードしている1.7kbAhaII−StuI制限
フラグメントをEGFフラグメントと一緒に、SacIと
SmaIで切り開いたpUC12プラスミドにライゲートし
た。この組換えプラスミドを大腸菌HB101内で増幅
させ、全キメラリセプターをコードしている領域を3.
7kbSacI−XmnI制限フラグメント(両部位は、それぞ
れEGFリセプターおよびv−erbB配列の非翻訳領域に
位置していた)中に取り出した。
IおよびNarIで消化し、EGFリセプターの全細胞外領
域とトランスメンブラン領域とをコードしている制限フ
ラグメントを回収した。AEV−erbB(H)[ヤマモトら
(Yamamoto,T.)1983“セル"35:71〜78]の全
細胞内領域をコードしている1.7kbAhaII−StuI制限
フラグメントをEGFフラグメントと一緒に、SacIと
SmaIで切り開いたpUC12プラスミドにライゲートし
た。この組換えプラスミドを大腸菌HB101内で増幅
させ、全キメラリセプターをコードしている領域を3.
7kbSacI−XmnI制限フラグメント(両部位は、それぞ
れEGFリセプターおよびv−erbB配列の非翻訳領域に
位置していた)中に取り出した。
【0082】p342E[クロウレィら(Crowley)、19
83、“モル・セル・バイオロ(Mol.Cell.Biol.)"
3:44〜55]をEcoRIで消化し、開裂されたプラス
ミドを回収した。配列:
83、“モル・セル・バイオロ(Mol.Cell.Biol.)"
3:44〜55]をEcoRIで消化し、開裂されたプラス
ミドを回収した。配列:
【化1】 を有するアダプターを開裂したプラスミドとライゲート
し、ライゲーション混合物で大腸菌294をトランスフ
ェクトし、アダプター挿入体を含有するプラスミドpC
VSVE−HBSをアンピシリン耐性コロニーから回収
した。
し、ライゲーション混合物で大腸菌294をトランスフ
ェクトし、アダプター挿入体を含有するプラスミドpC
VSVE−HBSをアンピシリン耐性コロニーから回収
した。
【0083】pCVSVE−HBSをSacIで部分消化
し、線状のベクターフラグメント(I)を回収した。線状
プラスミドをHpaIで消化し、ベクターフラグメントを
回収した。
し、線状のベクターフラグメント(I)を回収した。線状
プラスミドをHpaIで消化し、ベクターフラグメントを
回収した。
【0084】pCVSVE−HBSベクターフラグメン
トとハイブリッドリセプターをコードしているSacI−
XmnIフラグメントとライゲートし、形質転換された大
腸菌HB101コロニーから発現ベクターpCVSV−
HER−erbBを回収した。
トとハイブリッドリセプターをコードしているSacI−
XmnIフラグメントとライゲートし、形質転換された大
腸菌HB101コロニーから発現ベクターpCVSV−
HER−erbBを回収した。
【0085】実施例 6 リセプター−腫瘍遺伝子ハイ
ブリッドの発現 発現ベクターpCVSVE−HER−erbBを、ネオマイ
シン耐性を付与し得る発現プラスミドと一緒に、グラハ
ムとフアン・デァ・エブ(1973)のプロトコールに基
づくりん酸カルシウム共沈法により、正常なラット1線
維芽細胞に同時トランスフェクトした。準全面成長した
細胞を、8cmの培養皿あたり10μgのプラスミドD
NAを用いてトランスフェクトした。DNAを1mMト
リスpH7.5、0.1mM EDTA、250mM CaCl
2 0.55mlに溶かし、50mMHEPES pH7.1
2、280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4 0.5
mlをゆっくり加えた。40分以内に徐々に沈殿が析出
し、これを細胞培養培地10mlに加えた。トランスフ
ェクションから5時間後、細胞をPBS中20%グリセ
ロール3ml内で1分間インキュベートすることにより
グリセリンショック処置に付した。グリセリンを洗い流
した後、元の培地中で細胞をさらに培養した。
ブリッドの発現 発現ベクターpCVSVE−HER−erbBを、ネオマイ
シン耐性を付与し得る発現プラスミドと一緒に、グラハ
ムとフアン・デァ・エブ(1973)のプロトコールに基
づくりん酸カルシウム共沈法により、正常なラット1線
維芽細胞に同時トランスフェクトした。準全面成長した
細胞を、8cmの培養皿あたり10μgのプラスミドD
NAを用いてトランスフェクトした。DNAを1mMト
リスpH7.5、0.1mM EDTA、250mM CaCl
2 0.55mlに溶かし、50mMHEPES pH7.1
2、280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4 0.5
mlをゆっくり加えた。40分以内に徐々に沈殿が析出
し、これを細胞培養培地10mlに加えた。トランスフ
ェクションから5時間後、細胞をPBS中20%グリセ
ロール3ml内で1分間インキュベートすることにより
グリセリンショック処置に付した。グリセリンを洗い流
した後、元の培地中で細胞をさらに培養した。
【0086】選択マーカーとしてSV40初期プロモー
ターのコントロール下にあるネオマイシン耐性遺伝子を
用いた。トランスフェクションの2日後、選択開始に際
し、400μg/mlのゲネティシン(Geneticin)(シ
グマG5013)を補充した培地を用いた。次いで、ネ
オマイシン耐性細胞を、7%の透析したウシ胎児血清を
含有し、メトトレキセート(シグマA6770)を濃度2
00nM、次いで1000nMに補充した培地で増殖させ
た。その結果、ネオマイシン耐性セルラインにおけるc
DNA発現の、段階的な増幅がみられた。
ターのコントロール下にあるネオマイシン耐性遺伝子を
用いた。トランスフェクションの2日後、選択開始に際
し、400μg/mlのゲネティシン(Geneticin)(シ
グマG5013)を補充した培地を用いた。次いで、ネ
オマイシン耐性細胞を、7%の透析したウシ胎児血清を
含有し、メトトレキセート(シグマA6770)を濃度2
00nM、次いで1000nMに補充した培地で増殖させ
た。その結果、ネオマイシン耐性セルラインにおけるc
DNA発現の、段階的な増幅がみられた。
【0087】形質転換体内でのハイブリッドの発現は、
最初、界面活性剤によるリゼイトをヒトEGFリセプタ
ーに特異的なマウスのモノクローナル抗体R1で免疫沈
降させた後、35S−メチオニンで代謝的にラベルされた
タンパク質を分析することにより監視された。安定に発
現されるセルラインは35S−メチオニンで代謝的にラベ
ルされている。プロティンA−セファロースに吸着させ
たR1抗体により、上記の如く調製された界面活性剤に
よるリゼイトから特異的なタンパク質を免疫沈降させ、
SDS還元ポリアクリルアミドゲル上で分析した。マウ
スのR1モノクローナル抗体[ウオーターフィールドら
(Waterfield)、1982、“ジャーナル・オブ・セル
ラー・バイオケミストリィ(J.Cell.Biochem.)"20:
149〜161]は、内因性のラットI細胞のEGFリセ
プターを認識しない。HER−erbBタンパク質は、メ
トトレキセートによる増幅の前または後に、免疫沈降法
により容易に検出された。予想通り、HER−erbBタ
ンパク質はA431細胞内で発現される野生型のEGF
リセプターよりも小さかった。A431内で極めて高い
レベルにEGFリセプターが発現された場合と比較する
と、増幅されたRatI細胞は、3倍少ないHER−erbB
を発現するにすぎない。
最初、界面活性剤によるリゼイトをヒトEGFリセプタ
ーに特異的なマウスのモノクローナル抗体R1で免疫沈
降させた後、35S−メチオニンで代謝的にラベルされた
タンパク質を分析することにより監視された。安定に発
現されるセルラインは35S−メチオニンで代謝的にラベ
ルされている。プロティンA−セファロースに吸着させ
たR1抗体により、上記の如く調製された界面活性剤に
よるリゼイトから特異的なタンパク質を免疫沈降させ、
SDS還元ポリアクリルアミドゲル上で分析した。マウ
スのR1モノクローナル抗体[ウオーターフィールドら
(Waterfield)、1982、“ジャーナル・オブ・セル
ラー・バイオケミストリィ(J.Cell.Biochem.)"20:
149〜161]は、内因性のラットI細胞のEGFリセ
プターを認識しない。HER−erbBタンパク質は、メ
トトレキセートによる増幅の前または後に、免疫沈降法
により容易に検出された。予想通り、HER−erbBタ
ンパク質はA431細胞内で発現される野生型のEGF
リセプターよりも小さかった。A431内で極めて高い
レベルにEGFリセプターが発現された場合と比較する
と、増幅されたRatI細胞は、3倍少ないHER−erbB
を発現するにすぎない。
【0088】ハイブリッドHER−erbBタンパク質は、
125I−EGFが種々の濃度において形質転換体細胞と結
合したことから、特異的なEGF結合を示した。この結
合は飽和され得るものであり、10倍過剰の非標識EG
Fの存在下では完全に置換され得る。全面成長したラッ
トI培養への125I−標識EGFの結合量は個々の細胞培
養中で発現されたEGFリセプターまたはキメラリセプ
ターの量に正確に対応していた。この様に、組立てられ
たタンパク質は完全な機能を持ったEGF結合部位を含
有しており、細胞表面に忠実に移行されていた。
125I−EGFが種々の濃度において形質転換体細胞と結
合したことから、特異的なEGF結合を示した。この結
合は飽和され得るものであり、10倍過剰の非標識EG
Fの存在下では完全に置換され得る。全面成長したラッ
トI培養への125I−標識EGFの結合量は個々の細胞培
養中で発現されたEGFリセプターまたはキメラリセプ
ターの量に正確に対応していた。この様に、組立てられ
たタンパク質は完全な機能を持ったEGF結合部位を含
有しており、細胞表面に忠実に移行されていた。
【0089】実施例 7 EGFの刺激下でのインビト
ロにおける自己りん酸化 HER−erbBがインビトロでの自己りん酸化活性を有
するか否かを試験するために、細胞リゼイトを上記の如
くに免疫沈降させ、32P−γ−ATPと一緒にインキュ
ベートし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動とオートラ
ジオグラフィーによって分析した。8cmの培養皿中で
増殖させた、形質転換された細胞の単一層をPBSで2
回洗浄し、クリスら(Kris)“セル"40:619〜62
5(1985)の記載に従って可溶化した。この単一層に
50mM HEPES pH7.5、150mM NaCl、
1.5mM MgCl2、1mM EDTA、10%グリセロ
ール、1%トリトンX−100、1%アプロチニンおよ
び4μg/mlフェニルメチルスルホニルフルオライド
(PMSF)1mlを4℃で5分間、加えた。可溶化され
た細胞を4℃で5分間、10,000gで遠心し、上清
を−70℃で保持するか、さらにプロセッシングした。
ロにおける自己りん酸化 HER−erbBがインビトロでの自己りん酸化活性を有
するか否かを試験するために、細胞リゼイトを上記の如
くに免疫沈降させ、32P−γ−ATPと一緒にインキュ
ベートし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動とオートラ
ジオグラフィーによって分析した。8cmの培養皿中で
増殖させた、形質転換された細胞の単一層をPBSで2
回洗浄し、クリスら(Kris)“セル"40:619〜62
5(1985)の記載に従って可溶化した。この単一層に
50mM HEPES pH7.5、150mM NaCl、
1.5mM MgCl2、1mM EDTA、10%グリセロ
ール、1%トリトンX−100、1%アプロチニンおよ
び4μg/mlフェニルメチルスルホニルフルオライド
(PMSF)1mlを4℃で5分間、加えた。可溶化され
た細胞を4℃で5分間、10,000gで遠心し、上清
を−70℃で保持するか、さらにプロセッシングした。
【0090】自己りん酸化のEGF刺激は、免疫沈降に
先立って0.4ml中、TX−100の濃度を0.5%に
希釈しておいた界面活性剤による細胞リゼイトと5μg
/mlEGFとを4℃で15分間インキュベートするこ
とにより誘導した。30分間プロテインA−セファロー
スに予め結合させておいたR1抗体を加え(1μl抗体
/50μlスラリー、1:1)、4℃で15分間インキュ
ベーションを続けた。免疫沈殿物をHNTGバツファー
(20mM HEPES、pH7.5、150mMNaCl、
10%グリセロール、および0.1%トリトンX−10
0)0.9ml中で5回洗浄した。容量30μlの洗浄し
た免疫沈殿物を5mM MnCl2に調節し、γ−32P−A
TP15μCiを4℃で0.5分間加えた。3倍濃度のS
DS試料バツファー20μlを加えて自己りん酸化を終
了させた。試料を5分間煮沸し、遠心し、20μlづ
つ、5%/7%ポリアクリルアミド還元ゲルで分析した
(ラエムリ、1970)。減圧下、70℃でゲルを固定
し、乾燥させた。対照として、正常なRatI線維芽細胞
を用いた。サイズマーカーはキロダルトンで示されてい
る。野生型のEGFリセプター同様、HER−erbBハ
イブリッドにより、免疫沈降物中に有意な量の32Pが取
り込まれた。りん酸化の程度はEGFの添加(+で表さ
れている)によって増大し;30秒間の測定では、EGF
の存在下においてりん酸化の速度は3倍高いことが分っ
た。v−erbBタンパク質はそれ自身、極めて低い自己り
ん酸化活性を有するにすぎない[ラックスら(Lax)、1
985、“EMBOジャーナル"4:3179〜318
2]。ハイブリッドの自己りん酸化活性は低いが、EG
F結合領域の再構築により、リガンドによって自己りん
酸化活性が誘導され得る。
先立って0.4ml中、TX−100の濃度を0.5%に
希釈しておいた界面活性剤による細胞リゼイトと5μg
/mlEGFとを4℃で15分間インキュベートするこ
とにより誘導した。30分間プロテインA−セファロー
スに予め結合させておいたR1抗体を加え(1μl抗体
/50μlスラリー、1:1)、4℃で15分間インキュ
ベーションを続けた。免疫沈殿物をHNTGバツファー
(20mM HEPES、pH7.5、150mMNaCl、
10%グリセロール、および0.1%トリトンX−10
0)0.9ml中で5回洗浄した。容量30μlの洗浄し
た免疫沈殿物を5mM MnCl2に調節し、γ−32P−A
TP15μCiを4℃で0.5分間加えた。3倍濃度のS
DS試料バツファー20μlを加えて自己りん酸化を終
了させた。試料を5分間煮沸し、遠心し、20μlづ
つ、5%/7%ポリアクリルアミド還元ゲルで分析した
(ラエムリ、1970)。減圧下、70℃でゲルを固定
し、乾燥させた。対照として、正常なRatI線維芽細胞
を用いた。サイズマーカーはキロダルトンで示されてい
る。野生型のEGFリセプター同様、HER−erbBハ
イブリッドにより、免疫沈降物中に有意な量の32Pが取
り込まれた。りん酸化の程度はEGFの添加(+で表さ
れている)によって増大し;30秒間の測定では、EGF
の存在下においてりん酸化の速度は3倍高いことが分っ
た。v−erbBタンパク質はそれ自身、極めて低い自己り
ん酸化活性を有するにすぎない[ラックスら(Lax)、1
985、“EMBOジャーナル"4:3179〜318
2]。ハイブリッドの自己りん酸化活性は低いが、EG
F結合領域の再構築により、リガンドによって自己りん
酸化活性が誘導され得る。
【図1】 図1は、インシュリンリセプター(HIR)と
表皮性成長因子リセプター(HER)とのハイブリッドリ
セプターの模式図である。
表皮性成長因子リセプター(HER)とのハイブリッドリ
セプターの模式図である。
【図2】 図2は、HIR、HERおよびこれらのハイ
ブリッドリセプターを比較して示した模式図である。
ブリッドリセプターを比較して示した模式図である。
【図3】 図3は図1のcDNA組立て物でトランスフ
ェクトされたCOS−7細胞における125Iインシュリ
ンの結合程度を示すグラフである。
ェクトされたCOS−7細胞における125Iインシュリ
ンの結合程度を示すグラフである。
【図4】 図4は、種々に形質転換された細胞の免疫沈
降−自己りん酸化産物のSDS−PAGE還元ゲル電気
泳動の結果を示す写真の模写図である。
降−自己りん酸化産物のSDS−PAGE還元ゲル電気
泳動の結果を示す写真の模写図である。
【図5】 図5は、種々に形質転換された細胞の免疫沈
降−自己りん酸化産物のSDS−PAGE還元ゲル電気
泳動の結果を示す写真の模写図である。
降−自己りん酸化産物のSDS−PAGE還元ゲル電気
泳動の結果を示す写真の模写図である。
【図6】 図6はハイブリッドリセプターHER−erb
Bの模式図である。
Bの模式図である。
【図7】 図7はリガンドの存在(+)したおよび非存在
下(−)におけるHER−erbBのゲル電気泳動の結果を
示す写真の模写図である。
下(−)におけるHER−erbBのゲル電気泳動の結果を
示す写真の模写図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12P 21/02 G01N 33/566 // G01N 33/566 C12N 5/00 B (C12N 5/10 C12R 1:91) (C12P 21/02 C12R 1:91) (C12P 21/02 C12R 1:19) (72)発明者 ヘイモ・リーデル アメリカ合衆国カリフォルニア94131、サ ン・フランシスコ、ウォーレン・ドライ ブ・ナンバー301、480番 (72)発明者 アクセル・ウールリッヒ アメリカ合衆国カリフォルニア94117、サ ン・フランシスコ、アッパー・テラス433 番
Claims (3)
- 【請求項1】(a)リセプターのリガンド結合領域と、(b)
該リガンド結合領域に対しヘテロローガスなリポーター
ポリペプチドとを含有するハイブリッドリセプターをコ
ードしている核酸。 - 【請求項2】(a)リセプターのリガンド結合領域と、(b)
該リガンド結合領域に対しヘテロローガスなリポーター
ポリペプチドとを含有するハイブリッドリセプターをコ
ードしている核酸を含有する複製可能なベクター。 - 【請求項3】(a)リセプターのリガンド結合領域と、(b)
該リガンド結合領域に対しヘテロローガスなリポーター
ポリペプチドとを含有するハイブリッドリセプターをコ
ードしている核酸を含有する複製可能なベクターを含有
する宿主細胞。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/857,899 US4859609A (en) | 1986-04-30 | 1986-04-30 | Novel receptors for efficient determination of ligands and their antagonists or agonists |
US857899 | 1992-03-26 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62107893A Division JP2592063B2 (ja) | 1986-04-30 | 1987-04-30 | リガンド、そのアンタゴニストまたはアゴニストの効率的な測定のためのハイブリツドリセプター |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH09117285A true JPH09117285A (ja) | 1997-05-06 |
JP2795833B2 JP2795833B2 (ja) | 1998-09-10 |
Family
ID=25326982
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62107893A Expired - Lifetime JP2592063B2 (ja) | 1986-04-30 | 1987-04-30 | リガンド、そのアンタゴニストまたはアゴニストの効率的な測定のためのハイブリツドリセプター |
JP8108961A Expired - Lifetime JP2795833B2 (ja) | 1986-04-30 | 1996-04-30 | リガンド、そのアンタゴニストまたはアゴニストの効率的な測定のためのハイブリッドリセプターをコードする核酸 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62107893A Expired - Lifetime JP2592063B2 (ja) | 1986-04-30 | 1987-04-30 | リガンド、そのアンタゴニストまたはアゴニストの効率的な測定のためのハイブリツドリセプター |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4859609A (ja) |
EP (1) | EP0244221B1 (ja) |
JP (2) | JP2592063B2 (ja) |
AT (1) | ATE139784T1 (ja) |
CA (1) | CA1328419C (ja) |
DE (1) | DE3751846T2 (ja) |
ES (1) | ES2090007T3 (ja) |
GR (1) | GR3021017T3 (ja) |
HK (1) | HK1008022A1 (ja) |
Families Citing this family (147)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6861511B1 (en) | 1986-06-04 | 2005-03-01 | Bayer Corporation | Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans |
US5071773A (en) * | 1986-10-24 | 1991-12-10 | The Salk Institute For Biological Studies | Hormone receptor-related bioassays |
US6806359B1 (en) | 1986-10-24 | 2004-10-19 | The Salk Institute For Biological Studies | Hormone receptor compositions and methods |
US6994988B1 (en) | 1987-02-12 | 2006-02-07 | Genetech, Inc. | Methods and deoxyribonucleic acid for the preparation of tissue factor protein |
US7084251B1 (en) | 1987-02-12 | 2006-08-01 | Genentech, Inc. | Methods and Deoxyribonucleic acid for the preparation of tissue factor protein |
US5336603A (en) * | 1987-10-02 | 1994-08-09 | Genentech, Inc. | CD4 adheson variants |
US6710169B2 (en) | 1987-10-02 | 2004-03-23 | Genentech, Inc. | Adheson variants |
US5571692A (en) * | 1987-12-02 | 1996-11-05 | The Salk Institute For Biological Studies | Retinoic acid receptor α, vectors and cells comprising the same DNA encoding |
US4981784A (en) * | 1987-12-02 | 1991-01-01 | The Salk Institute For Biological Studies | Retinoic acid receptor method |
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