JPH08501942A

JPH08501942A - ヒトカルシトニンレセプター

Info

Publication number: JPH08501942A
Application number: JP6509102A
Authority: JP
Inventors: イー．ムーア，エマ; オー．シェパード，ポール; イー．クエストナー，ロルフ
Original assignee: ザイモジェネティクス，インコーポレイティド
Priority date: 1992-09-30
Filing date: 1993-09-17
Publication date: 1996-03-05
Also published as: EP0663006A1; US5683884A; CA2145866C; US5674981A; US5674689A; CA2145866A1; WO1994008006A1; US5622839A

Abstract

(57)【要約】ヒトカルシトニンレセプターが組換え手段によりクローン化され、配列決定され、そして発現された。そのレセプター及びそれに対する対抗がヒトカルシトニンレセプターのアゴニスト及びアンタゴニストを同定するためにスクリーニングシステムに使用され、それにより異常な骨吸収を処置し、そして妨げるための手段、及び診断方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトカルシトニンレセプター発明の背景骨は動的組織であり、そしてホメオスタシスは新しい骨の形成と前に形成した骨との間の平衡を必要とする。カルシトニン、すなわち、甲状腺および胸腺により分泌されるペプチドのホルモンは骨のホメオスタシスを維持するとき重要な役割を演ずる。カルシトニンは破骨細胞、すなわち、骨の吸収を仲介する骨の組織中の細胞に結合する。カルシトニンは破骨細胞を固定化し、こうして骨の吸収を阻止し、その結果骨により血清の中に解放されるカルシウムの量を減少する。骨の吸収の阻止はオステオポローシスの処置としてカルシトニンを使用してすることによって利用されてきている。カルシトニンレセプターはＧタンパク質連結レセプターの構成員であると信じられる。レセプターの活性化が２つの独立の細胞内の経路、すなわち、環状AMP および三リン酸イノシトールの経路を刺激することが証明された（Chabreら、Mo l．Endocrin．6 (4)：551-556，1992）。副甲状腺ホルモン、ブタカルシトニン、セクレチンおよびグルカゴンのレセプターのクローニングは、Ｇタンパク質連結レセプターの新しい族が存在する可能性を確立した。これらのレセプターは、ベータアドレナリン作動性レセプター、セロトニンレセプターおよびグルタメートレセプターを包含する従来知られているＧタンパク質連結レセプターに対する相同性をほとんどを示す。現在において、サケカルシトニンはオステオポローシスの処置のためのヒトカルシトニンより好ましい。サケカルシトニンのための世界中の市場は毎年５×10⁸ ドルを越える。サケカルシトニンは、骨の吸収の阻止において、ヒト型のカルシトニンよりかなりいっそう有効であることが示された。サケカルシトニンがオステオポローシスの処置においてヒトカルシトニンより効力がある理由についていくつかの仮説が存在する。これらの仮説は次のものを包含する：１）サケカルシトニンは分解に対していっそう耐性である、２）サケカルシトニンはより低い代謝クリアランス速度(MCR)を有する、および３）サケカルシトニンはわずかに異なるコンフォメーションを有し、骨レセプター部位に対してより高い親和性を生ずるすることができる。ヒトにおけるオステオポローシスの処置のためのサケカルシトニンに関連する利点にかかわらず、また、欠点が存在する。平均のコストは200ドル／月を越えることがあり、そして処置は５年またはそれ以上の間の予防的投与を包含する。他の問題は、米国において、カルシトニンは注入により投与しなくてはならない。さらに、ある患者は非ヒトカルシトニンに対する抗体を発生する。したがって、骨の吸収の効力のあるインヒビターであり、高価ではなく、投与がいっそう便利でありそして非免疫原性であるサケまたはヒトのカルシトニンの新しい類似体が必要である。カルシトニン類似体として使用する可能な化合物の発見および試験は、高い処理量のスクリーニングシステムを必要とする。このようなシステムは好ましくは細胞の標的、例えば、高いレベルの適当なカルシトニンレセプターを含有する培養細胞系を使用して、推定上の類似体を同定しそしてそれに対する応答を測定する。非常に驚くべきことには、本発明はカルシトニン類似体を同定するためのスクリーニングシステムにおいて使用するヒトカルシトニンレセプターを提供し、そして他の関係する要求を満足する。発明の要約本発明は、ヒトカルシトニンレセプター、組み換えヒトカルシトニンレセプター、およびそれらのポリペプチド断片の単離された、実質的に純粋な調製物を提供する。ある種の態様の範囲内で、レセプターは脊椎動物細胞中でＧタンパク質に連結され、カルシトニンに結合し、これによりアデニレートシクラーゼを活性化し、そしてリン酸イノシトール代謝を刺激することができる。他の態様の範囲内で、レセプターは切断された形である。このような組換えレセプターが単離され精製された形態で提供されると、本発明は、また、レセプターに対するモノクローナル抗体、カルシトニン結合ドメイン、および他の断片を提供する。他の面において、本発明は、組換え手段により、好ましくは培養真核細胞中で、ヒトカルシトニンレセプターまたはそれらのポリペプチドまたは断片を生産する能力を提供する。発現されたレセプターまたは断片は天然レセプターの生物学的活性をもつことができず、そして発現のために使用した細胞中でＧタンパク質に結合するこどができるか、あるいはできない。したがって、ヒトカルシトニンレセプターおよびそれらの断片をコードする、単離され精製された形態ポリヌクレオチドを記載し、ここでポリヌクレオチドはDNA、例えば、cDNAまたはRNAの形態であることができる。これらの配列に基づいて、プローブを使用してヒトカルシトニンレセプター遺伝子をハイブリダイゼーションしそして同定することができる。プローブは全長のcDNAであるか、あるいは14〜25ヌクレオチド程度に小さい、いっそうしばしば約40〜約50またはそれ以上のヌクレオチドであることができる。関係する態様において、本発明は、転写プロモーター、ヒトカルシトニンレセプターまたは断片をエンコードするDNA配列、および転写ターミネーターからなり、各々がレセプターの発現のために作用可能に連鎮されているDNA構成体に関する。発現のために、この構成体は少なくとも１つのシグナル配列を含有することもできる。構成体は、宿主細胞、好ましくは哺乳動物細胞およびより好ましくは実質的な量の内因性カルシトニンレセプターを発現しない細胞を形質転換またはトランスフェクションするために使用される。適当なリガンド、例えば、カルシトニンにより結合されたとき、レセプターはヒト細胞中でＧタンパク質への連結を介してアデニレートシクラーゼを活性化することができる。さらに、大規模生産のために、発現されたレセプターは、また、例えば、アフィニティー精製により、細胞から単離することができる。ヒトカルシトニンレセプターを発現する細胞を使用して、真核細胞のカルシトニンレセプター仲介代謝を変更することができる化合物を同定することができる。化合物をレセプターへの結合について、および／または宿主細胞中でレセプター仲介代謝の変化の実行についてスクリーニングすることができる。レセプターの作用物質および／または拮抗物質を、また、細胞不含系中で、精製されたレセプターまたはそれらの結合性断片を使用してリガンド−レセプターの相互作用についてスクリーニングずることができるか、あるいは代謝の変化を評価する能力をまた提供する再構成された系、例えば、ミセルを使用してスクリーニングすることができる。本発明に従い同定された化合物は、骨の吸収に関係する疾患、例えば、オステオポローシス、パジェット病などの処置および予防において有用な薬物の引き続く開発またはスクリーニングのための誘発化合物として働くことができる。図面の簡単な説明第１図は、推定上のトランスメンブレンドメインを副見出しした、ヒトカルシトニンレセプターのアミノ酸配列（配列番号：１）を図解する。第２図は、ベクターZEM1698である。第３図は、ヒトカルシトニンレセプターを発現するようにトランスフェクションされたBHK細胞系についてのルシフェラーゼ誘発アッセイの結果を図解し、ここで細胞をヒトカルシトニン（HcT）、サケカルシトニン（ScT）またはヒトCGRP （CGRP）で処理した。第４図は、ヒトカルシトニンレセプターを発現するようにトランスフェクションされたBHK細胞系についてのルシフェラーゼ誘発アッセイの結果を図解し、ここで細胞をヒトカルシトニン（HcT）、サケカルシトニン（ScT）またはヒトCGRP （CGRP）で処理した。特定の態様の説明本発明は、単離されたヒトカルシトニンレセプター分子、組み換えヒトカルシトニンレセプターおよび前記レセプターをエンコードする単離されたポリヌクレオチド配列を提供することによって、ヒトカルシトニンレセプター−リガンドの相互作用の作用物質および拮抗物質を同定する手段を提供する。用語「ヒトカルシトニンレセプター」は、第１図のアミノ酸配列の中に記載されるカルシトニンと有意な構造的および機能的相同性を共有する任意のタンパク質を意味する。組換え的に調製されたヒトカルシトニンレセプターの領域が同様な機能を有するタンパク質を生ずるような方法で欠失または置換されたとき、このようなレセプターは生ずることがある。実質的に相同性の配列、対立遺伝子変異型、および天然突然変異体；誘発された点、欠失、および挿入の突然変異体および交互に発現された変異型がまた含められる。ここにおいて使用するとき、実質的に相同性は、配列番号：１に示すヒトcDNA配列の配列と少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、そしてより好ましくは95％またはそれ以上同一である配列を意味する。カルシトニンレセプターの本質的に機能的な面は、原形質膜の中に挿入したとき、それがヒトカルシトニンに結合することができること、およびその結合に応答して細胞の応答を開始することができることである。カルシトニンレセプターの変異型は切断された形であり、ヒトカルシトニンに結合するが、細胞の応答を開始しないレセプターを生ずることができる。このようなレセプターの変異型の本質的な要件は、カルシトニンに結合できるリガンド結合性ドメインを含有することである。カルシトニンレセプターの変異型は、DNA配列中で第１トランスメンブレン領域の直後に位置する挿入を有する変異型を包含する。理論に拘束されたくないが、これらの変異型のあるものはカルシトニンレセプターの可溶性の形態として機能することができる。他の主としてトランスメンブレンレセプターの可溶性の形態は従来発見されてきている。例えば、黄体化ホルモンレセプター、すなわち、７つのトランスメンブレンＧタンパク質連結レセプターの族の１構成員は、レセプターの細胞外側ドメインのみからなる切断された形の形態のリガンドに結合することが示された（Tsai-Morrisら、J．Biol．Chem．265（32）：19385-19388， 1990）。あるレセプターの切断された形の形態はリガンドに結合し、そして膜結合レセプターを発現する標的細胞との相互作用に利用可能なホルモンの濃度に影響を与えることができることが仮定されたされた。第１のトランスメンブレン領域の後に挿入を有する他のレセプターの変異型は膜の中に定着されたままでありるが、細胞内のシグナル形質導入特性に影響を与えると信じられる。挿入はレセプターの切断された形の変異型を生ずるが、レセプターが膜に結合したままである場合、レセプター− リガンド複合体の細胞内のシグナリング特性は本質的に排除される。シグナル形質導入能力をもたないレセプターは、可溶性レセプターに類似する機能、すなわち、細胞内のシグナリング経路における応答を開始しないでシグナル形質導入性レセプターに結合するホルモンの濃度を変更ずる機能をはたし、これにより細胞へのリガンドの作用を制限するであろう。変異型のレセプターが切断されたレセプターを生じない場合において、挿入は細胞質ループ、Ｇタンパク質連結レセプターおよびＧタンバク質の相互作用と相関関係をもつ領域を変更することができる（Iismaaら、Curr．Opinion cell Bio l．４：195：202，1992）。レセプターへのＧタンパク質の連結の変化はcAMP、三リン酸イノシトールまたはカルシウムの細胞内レベルを変更することによって第２メッセンジャー経路に影響を与え、そして究極的に骨のホメオスタシスに影響を与える。特定の組織は異なる形質導入特性をもつレセプターのサブタイプを発現することが発見された。例えば、代謝栄養の（mtabotrophic）グルタメートレセプターは、第２メッセンジャーレベルに対して異なる作用を有するレセプターの少なくとも５つの異なるサブタイプを包含する（Schoeppら、TIPS 14：13-2 0，1993）。代謝栄養のグルタメ−トレセプターのサブタイプは、心臓、涙腺、腸、気管および海馬を包含する種々の異なる組織から単離されてきている（Bonn er，TIPS，Suppl．11-15，1989）。変異型レセプターのサブタイプが優先的に発現されることができる他の場合は、細胞外の環境の変化に対する応答である。変異型レセプターの発現はリガンドに対する細胞の応答の変化を生ずる。例えば、カルシトニンで長期間の処置を受けた多数の患者は、薬物の作用に対して耐性となる。これらの場合のほぼ50％において、耐性は抗体の形成を伴わず（The Calcitonins：Physiology and Pharmacology，Azria編、Karger，Basel ，Su.，1989）そしてこのような耐性は明瞭に理解されないが、カルシトニンの増加したレベルへの長期間の暴露は別のレセプターのサブタイプの発現を誘発し、こうしてカルシトニンに対する細胞の応答性を変化することができると仮定されてきた。本発明のカルシトニンレセプターおよび変異型は、種々の条件下にカルシトニンに対する細胞の応答を研究しかつカルシトニン応答性細胞の経路を調節する化合物を同定するための、価値ある道具を提供する。ヒトカルシトニンレセプターの「リガンド」は、米国特許第4，859，609号（ここに引用によって加える）に一般に記載されているように、ヒトカルシトニンレセプター、ヒトカルシトニンレセプターの類似体、またはキメラのヒトカルシトニンレセプターのリガンド結合性ドメインにより結合ずることができる化合物を意味する。リガンドは化学的に合成するか、あるいは天然に見出されるもの、例えば、ヒトまたはサケのカルシトニンであることができる。リガンドは作用物質および拮抗物質に分類することができる。作用物質はレセプターへのその結合が細胞内の応答経路を誘発ずる分子である。拮抗物質はレセプターへのその結合が細胞内の応答経路をブロックする分子である。「単離された」ヒトカルシトニンレセプターは、その自然の環境、例えば、破骨細胞、腎細胞、リンパ球など以外の中に存在するヒトカルシトニンレセプター、例えば、以後定義するように実質的に純粋なヒトカルシトニンレセプターを指示することを意味する。より一般に、単離されたは細胞または他の系の非相同の成分としてヒトカルシトニンレセプターを含むことを意味する。例えば、ヒトカルシトニンレセプターは、ヒトカルシトニンレセプターをコードするDNA構成体でトランスフェクションされた細胞で発現し、細胞から分離し、そして他の選択したレセプターを含有するミセルに添加ずることができる。下に記載する他の例において、ルシフェラーゼをコードする遺伝子で共トランスフェクションされた細胞によりヒトカルシトニンレセプターを発現する。こうして、これに関して、単離されたヒトカルシトニンレセプターの環境は、その自然の状態で存在ずるとき、とくにそれが外因性成分として系の中に存在するときの環境ではない。本発明は、ヒトカルシトニンレセプターのタンパク質を発現することができる、クローニングされたヒトカルシトニンレセプターのコード配列を提供する。ヒトカルシトニンレセプターをコードする相補的DNAは、例えば、そのレセプターを発現することが知られている破骨細胞、乳癌細胞、例えば、下に記載するT-47 Dから得られたmRNAからcDNAライブラリーを構成することによって、得ることができる。このライブラリーを標識化相補的オリゴヌクレオチドのプローブでスクリーニングすることができる。あるいは、このライブラリーを転写しそして生ずるmRNAを適当な真核細胞を注入し、そして、ヒトカルシトニンレセプターを発現するトランスフェクションされた細胞を、機能的アッセイにより、検出することによって、ライブラリーをスクリーニングすることができる。本発明は、ヒトカルシトニンレセプターをコードするcDNAを首尾よく単離することに関する。こにおいて提供されるヒトカルシトニンレセプターおよびこその cDNAクローンを使用して、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を普通の手段、例えば、ジデオキシ配列決定により決定することができる。一般、Sambrookら、Mole cular Cloning：A Laboratory Manual，第２版、Cold Spring Harbor Lab orator y Press、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989（ここに引用によって加える）参照。ここにおいて提供される配列に基づいて、ヒトカルシトニンレセプターをコードするゲノムまたはcDNA配列はよく知られた方法に従いヒト細胞源から調製されたライブラリーから得ることができる。例えば、ヒトカルシトニンレセプターからのオリゴヌクレオチドのプローブ、例えば、全長のcDNA あるいは少なくとも約14ヌクレオチド〜25またはそれ以上のヌクレオチド；しばしば40〜50程度に多いヌクレオチドの長さのより短いプローブを使用して、他のヒトカルシトニンレセプターのサブタイプをエンコードするDNA配列を得ることができる。部分的クローンが得られる場合、エンドヌクレアーゼの切断、結合およびループアウト突然変異誘発のような技術を使用して、それらを適切なリーディングフレームの中に接合して全長のクローンを生成することが必要である。ヒトカルシトニンレセプターをコードするDNA配列を適当な発現ベクターの中に挿入し、引き続いてこれを使用して真核細胞をトランスフェクションする。本発明の実施に使用する発現ベクターは、クローニングされたDNAの転写を指令することができるプロモーターおよび転写ターミネーターからなるであろう。原形質膜への輸送のために本発明のタンパク質を指令するために、少なくとも１つのシグナル配列を問題のDNA配列に作用可能に連鎮する。シグナル配列はヒトカルシトニンレセプターのコード配列から、この分野において記載される他のシグナル配列から誘発することができるか、あるいはあらたに合成することができる。本発明の実施において使用する宿主細胞は、哺乳動物、鳥類、植物、昆虫および菌類の細胞を包含ずるが、好ましくは哺乳動物細胞である。酵母の種（例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）種、とくにサッカロミセス・セレビシアエ（S．cerevisiae）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）種）または線状菌類（例えば、アスペルギルス（Asper gillus ）種、ニュウーロスポラ（Neurospora）種）を包含する菌類の細胞を本発明のの範囲内の宿主細胞として使用することができる。本発明における使用に適当な酵母のベクターは、YRp7（Struhlら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 76：103 5-1039，1978），YEp13（Broachら、Gene ８：121-133，1979），POTベクター（ Kawasakiら、米国特許第4，931，373号、これをここに引用によって加える）、p JDB249およびpJDB219（Beggs，Nature 275：104-108，1978）およびそれらの誘導体を包含する。このようなベクターは、一般に、選択可能なマーカーであり、このマーカーは形質転換体の選択を可能とする表現型のアッセイが存在する優性表現型を示す、ある数の遺伝子の１つであることができる。好ましい選択可能なマーカーは、補体宿主細胞の栄養要求が抗生物質耐性を提供するか、あるいは細胞の特定の炭素源の利用を可能とするものであり、そしてLEU2（Broachら、前掲）、URA3（Botsteinら、Gene ８：17，1979），HIS3（Struhlら、前掲）またはP OT1 （Kawasakiら、前掲）を包含する。他の適当な選択可能なマーカーはCAT遺伝子であり、これは酵母細胞にクロランフェニコール耐性を付与する。酵母細胞中て本発明のレセプターを発現するとき使用できる追加のベクター、プロモーターおよびターミネーターはこの分野において知られており、そして、例えば、Emr（Meth．Enzymol．185：231-279，1990）（これを引用によってここに加える）に概観されている。本発明のレセプターはアスペルギルス（Aspergil lus ）種（McKnightおよびUpshall、米国特許第4，935，349号に記載されている、これをここに引用によって加える）中で発現することができる。有用なプロモーターは、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans ）のグリコール分解遣伝子から誘発されたもの、例えば、ADH3プロモーター（McKnightら、EMBO J．4：2093-2099，1985）およびtpiＡプロモーターを包含する。適当なターミネーターの例はADH3ターミネーター（McKnightら、前掲）である。菌類を形質転換する技術は文献においてよく知られており、そして、例えば、Beggs（前掲）、Hinnenら（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 75：1929-19 33，1978）、Yeltonら（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81：1740-1747，1984）、およびRussell（Nature 301：167-169，1983）（それらの各々をここに引用によって加える）に記載されている。種々の高等真核細胞はヒトカルシトニンレセプターの発現のための宿主細胞として働くことがでぎる。培養哺乳動物細胞、例えば、BHK，N1E-115（Liles ら、J．Biol．Chem．261：5307-5313，1986），PC 12およびCOS-1（ATCC CRL 1650 ）は好ましい。好ましいBHK細胞系はtk^-ts13 BHK細胞系（WaechterおよびBaser ga，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 79：1106-1110，1982）およびBHK 570細胞系（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Co llection）米国マリイランド州ロックビレ、パークローンDr．に受け入れ番号CR L 10314で受託された）である。tk^-BHK細胞系はATCC CRL 1632として入手可能である。内因性カルシトニンレセプターをもたない宿主細胞を使用するすることが好ましい゜本発明の実施において使用する哺乳動物の発現べクターは、クローニングされた遺伝子またはcDNAの転写を指令することができるプロモーターを包含するであろう。好ましいプロモーターは、ウイルスのプロモーターおよび細胞のプロモーターを包含する。ウイルスのプロモーターは、直ちに初期のサイトメガロウイルスのプロモーター（Boshartら、Cell 41：521-530，1985）およびSV40プロモーター（Subramani ら、Mol．Cell．Biol．１：854-864，1981）を包含する。細胞のプロモーターは、マウスのメタロチオネイン−１のプロモーター（Palmiter ら、米国特許第4，579，821号）、マウスのＶ_k プロモーター（Bergamら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 81：7041-7045，1983；Grantら、Nucleic Acids Res． 15：5496，1987）およびマウスのＶ_Hプロモーター（Lohら、Cell 33：85-93，19 83）を包含する。とくに好ましいプロモーターはアデノウイルス２からの主要な後期のプロモーター（KaufmanおよびSharp，Mol．Cell．Biol．２：1304-13199 ，1982）である。このような発現ベクターは、また、プロモーターから下流および問題のペプチドまたはタンパク質をコードするDNA配列から上流に位置する１組のRNAスプライス部位を含有する。好ましいRNAスプライス部位はアデノウイルスおよび／または免疫グロブリン遺伝子から得ることができる゜また、問題のコード配列の下流に位置するポリアデニル化シグナルが発現ベクターの中に含有される。ポリアデニル化シグナルは、SV40からの初期または後期のポリアデニル化シグナル（KaufmanおよびSharp、前掲）、アデノウイルス５ EIB領域およびヒト成長ホルモン遺伝子のターミネーターからのポリアデニル化シグナル（DeNotoら、Nucleic Acids Res．９：3719-3730，1981）を包含する。発現ベクターは、プロモーターとRNAスプライス部位との間に位置する非コードウイルスリーダー配列、例えば、アデノウイルス２の３部分のリーダーを包含することができる。好ましいベクターは、また、エンハンサー配列、例えば、SV40 のエンハンサーおよびマウスのμエンハンサー（Gillies，Cell 33：717-728，1 983）を包含する。発現ベクターは、また、アデノウイルスのVA RNAをコードする配列を包含することができる。クローニングされたDNA配列は、例えば、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション（Wiglerら、Cell 14：725，1978；Corsaro およびPearson，Somatic C ell Genetics 7：603，1981；Graham およびVan der Eb，Virology 52：456，1 973）により培養哺乳動物細胞の中に導入することができる。クローニングされたDNA配列を哺乳動物細胞の中に導入する他の技術、例えば、エレクトロポレイション（Neumannら、EMBO J．1：841-845，1982）を使用することもできる。クローニングされたDNAを組込んだ細胞を同定するために、選択可能なマーカーを一般に細胞の中に問題の遺伝子またはcDNAと一緒に導入する。培養哺乳動物細胞中の使用するために好ましい選択可能なマーカーは、薬物耐性を付与する遺伝子、例えば、ネオマイシン、ヒグロマイシン、およびメトトレキセートを包含する。選択可能なマーカーは増幅可能な選択可能なマーカーであることができる。好ましい増幅可能な選択可能なマーカーはDHFR遺伝子である。選択可能なマーカーはThilly（Mammalian Cell Technology，Butterworth Publishers，マサチュセッツ州ストーンハム（これをここに引用によって加える）により概観されている。選択可能なマーカーの選択は当業者のレベルの範囲内である。選択可能なマーカーは細胞の中の別々のプラスミド上に問題の遺伝子と同時に導入することができるか、あるいは同一プラスミド上に導入することができる。同一プラスミド上である場合、選択可能なマーカーおよび問題の遺伝子は異なるプロモーターまたは同一プロモーターのコントロール下にあることができ、後者の配置はジストロニック（dicistronic）メッセージを生成する。この種類の構成体はこの分野において知られている（例えば、LevinsonおよびSimonsen、米国特許第4，713，339号）。また、「キャリヤーDNA」として知られている追加のDN Aを細胞の中に導入する混合物に添加することは有利であることがある。トランスフェクションされた哺乳動物細胞をある期間、典型的には１〜２日間成長させて、問題の１または２以上のDNA配列の発現を開始する。次いで薬物の選択を適用して、安定に選択可能なマーカーを発現している細胞の成長について選択する。増幅可能な選択可能なマーカーでトランスフェクションされた細胞について、薬物の濃度を段階的に増加してクローニングされた配列のコピー数の増加について選択し、これにより発現のレベルを増加する。組み換えヒトカルシトニンレセプターをコードする発現ベクターを植物、鳥類および昆虫の細胞の中に導入するために適当なプロモーター、ターミネーターおよび方法はこの分野において知られている。昆虫細胞の中で非相同DNA配列を発現するベクターとして、例えば、バキュロウイルスを使用することはAtkinsonら（Pestic．Sci．28：215-224，1990）により概観されている。植物細胞の中で遺伝子を発現するためのベクターとしてアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agroba cterium rhizogenes ）を使用することは、Sinkarら（J．Biosci．（Baglaore）1 1：47-58，1987）により概観されている゜次いで、本発明のDNA構成体を含有する宿主細胞を培養して組み換えヒトカルシトニンレセプターを生産する。細胞は許容される方法に従い哺乳動物細胞または他の宿主細胞の成長のために要求される栄養を含有する培地の中で培養する。種々の適当な方法はこの分野において知られており、そして一般に炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラルおよび成長因子を包含する。成長培地は一般にDNA構成体を含有ずる細胞について、例えば、DNA構成体上の選択可能なマーカーにより補足されているか、あるいはDNA構成体で共トランスフェクションされている必須栄養の中で薬物の選択または欠如により選択される。本発明による生産されるヒトカルシトニンレセプターは、当業者に一般に入手可能な技術を使用する精製のプロトコールを使用して、組換え発現系または他の源から精製することができる。大量のヒトカルシトニンレセプターを得るために最も便利な源は、組換えレセプターを発現する細胞である。精製は昔通の化学的精製手段、例えば、なかでも液体クロマトグラフィー、レクチンアフィニティクロマトグラフィー、勾配遠心、およびゲル電気泳動により達成することができる。タンパク質精製の方法はこの分野において知られており（参照、一般に、Scopes，R.，Protein Purification，Springer-Verlag、ニューヨーク（1982）（これをここに引用によって加える）そしてここに記載するヒトカルシトニンレセプターおよびとくに組換え的に生産されるヒトカルシトニンレセプターの精製に適用することができる。好ましい態様において、ヒトカルシトニンレセプターに対して向けられた抗体を使用するイムノアフィニティークロマトグラフィーを用いる。精製の他の方法において、ヒトカルシトニンレセプターまたはその一部分をエンコードする組換え遺伝子をアミノ末端において、ちょうどシグナルペプチドの背後で、例えば、米国特許第4，703，004号および米国特許第4，782，137号（これらを引用によってここに加える）に記載されているように、小さい親水性ペプチドをコードする配列により修飾することができる。ベプチドに対する特定の抗体はヒトカルシトニンレセプターの急速な精製を促進し、次いで短いペプチドをエンテロキリナーゼで除去することができる。こうして、前述したように、本発明は、その自然の細胞の環境から単離され、他のＧタンパク質連結カルシトニンレセプターを実質的に含有しない、組み換えヒトカルシトニンレセプターを提供する。また、精製されたヒトカルシトニンレセプターが提供される。とくに製剤学的に使用のために、少なくとも約50％の均質度の実質的に純粋なカルシトニンレセプターは好ましく、少なくども約70〜80％はより好ましく、95〜99％またはそれ以上は最も好ましい。いったん望むように部分的に、あるいは均質に精製されると、アッセイ法などにおいて、組み換えヒトカルシトニンレセプターを使用して作用物質の化合物についてスクリーニングし、モノクローナル抗体を発生させることができる。他の面において、本発明は、天然に見出される切形レセプター変異型を包含する、組み換えヒトカルシトニンレセプターのポリペプチドおよび断片に関する。ヒトカルシトニンレセプターのポリペプチドおよび断片を組換え発現系から単離することができるか、あるいはMerrifield，Fed．Proc．21：412（1962），Merr ifield，J．Am．Chem．Sco．85：2149（1963）、またはBaranyおよびMerrifield ，The Peptides，vol．2，pp．1-284（1979）Academic Press、ニューヨーク（それらの各々を引用によってここに加える）の固相法によるか、あるいは自動化ペプチド分析装置の使用によりここにおいて提供された配列から合成することができる。「ポリペプチド」は、全体のタンパク質を包含する。少なくとも約６アミノ酸、典型的には20〜30またはそれ以上、100〜200アミノ酸またはそれ以上の配列を意味する。例えば、リガンドに結合するヒトカルシトニンレセプターのタンパク質の１または２以上の部分は、種々の方法により、例えば、組換え技術により種々のレセプターポリペプチドの断片を発現させるか、あるいは精製された組換えレセプターをプロテアーゼまたは化学物質で処理してそれを断片化しそしてどの断片がリガンドのブロット中で標識化カルシトニンに結合できるかを決定することによって同定することができる。証拠はリガンド結合性ドメインがレセプターの約150のＮ−末端残基内に含有されることを示す。次いで、ポリペプチドを合成し、そして抗原として使用して、リガンド−ヒトカルシトニンレセプターの相互作用などを阻止することができる。他の面において、本発明は、ヒトカルシトニンレセプター−リガンドの相互作用を調節し、こうしてヒトカルシトニンレセプターにまたはその天然のリガンド、カルシトニンに直接または間接的に連結することができる疾患を、治療的および／または予防的に、処置する手段を提供する。本発明のレセプターを有するおかげで、ヒトカルシトニンとそのレセプターとの相互作用を剌激し、まねるか、あるいは阻止する作用物質または拮抗物質を同定することができる。作用物質または拮抗物質を使用して、レセプターを発現する細胞の代謝または反応性をコントロールし、これにより問題の疾患、例えば、オステオポローシスを軽減するか、あるいはある場合において予防する手段を提供する。こうして、本発明は、カルシトニン−ヒトカルシトニンレセプターの相互作用により仲介される事象の作用物質または拮抗物質を同定するスクリーニング法を提供する。このようなスクリーニングアッセイは、リガンド／レセプター／Ｇタンパク質の相互作用のどの面が標的とするかにある程度依存する、広範な種類のフォーマットを使用することができる。例えば、このようなアッセイはレセプターに結合し、これによりレセプターとリガンドとの相互作用をブロックまたは阻止する化合物を同定するように設計することができる。さらに詳しくは、リガンドの代わりに使用そ、したがってヒトカルシトニンレセプター仲介細胞内経路を剌激することができる化合物を同定するように、他のアッセイを設計することができる。なお池のアッセイを使用して、Ｇタンパク質に対するヒトカルシトニンレセプターの連合を阻止または促進し、これによりヒトカルシトニンレセプターのリガンドに対する細胞の応答を仲介する化合物を同定することができる。１つの機能的スクリーニングアッセイにおいて、哺乳動物細胞内で発現されたヒトカルジトニンレセプターをイノシトールに機能的に連結させる。このアッセイにおいて、相対的レセプターの占有を第２メッセンジャーの代謝のリガンド誘発の剌激または阻止の程度と比較することによって、化合物をレセプターの作用物質または拮抗物質としてのそれらの相対的親和性についてスクリーニングする。例えば、ホスホリパーゼＣの活性化はイノシトールモノホスフェートの代謝の増加に導く。イノシトールモノホスフェートの代謝を測定する手段は一般にSube rsおよびNathanson，J．Mol．Cell．Cardiol．20：131-140（1988）（引用によってここに加える）に記載されている。スクリーニング法を使用して、レセプターに特異的に結合しそして、例えば、アデニルシクラーゼのＧタンパク質仲介活性化を刺激するレセプターの能力に影響を実質的に与える（剌激または阻止する）それ以上の薬物のスクリーニングにおいて使用するための試薬、例えば、カルシトニンの類似体または誘導化合物を同定することができる。本発明の膜結合カルシトニンレセプターは、また、カルシトニンレセプターとして機能するように思われる。組換えカルシトニンレセプターを発現するベビーハムスターの腎細胞は急速なかつ持続した〔Ca²⁺］_iの増加を経て細胞外カルシウムのミリモル増加に対して応答することが発見されたが、３つのカルシトニンレセプター陰性のベビーハムスターの腎細胞系（それらの２つのカルシトニンレセプターに関する組換えレセプターを発現する）は細胞外カルシウムの変化に対する感受性を示さなかった。したがって、本発明のカルシトニンレセプターは、細胞の代謝への細胞外カルシウムの作用を変調し、まねるか、あるいは阻止する化合物を同定するための有用な道具である。実験の証拠が示すように、細胞外カルシウムは副甲状腺ホルモン分泌性の主細胞およびカルシトニン分泌性甲状腺Ｃ−細胞を調節し、これらの細胞は血清カルシウムの変化に応答してそれらのそれぞれのホルモンを分泌する（Zaidi，Biosci．Rep．10：493-506，1 990）。また、証拠が示すように、破骨細胞は細胞外カルシウムのミリモル増加を感知しそして破骨細胞〔Ca²⁺〕_i濃度の増加を経て骨の吸収を阻止する細胞表面のレセプターを発現する（Zaidi、前掲；Alamら、Biosci．Rep．12：369-380 ，1992；MacIntyreら、Handbook of Experimental Pharmacology，Baker編、83 ：411-439，Springer-Verlag、ベルリン、1988；Malgaroliら、J．Biol．Chem． 264：14342-14347，1989；Zaidiら、Biochem.Biophys．Res．Comm．164：807，1 990）。可溶性レセプターとして機能する切断されたカルシトニンレセプター変異型を種々のスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。例えば、可溶性レセプターを使用して、固体の支持体、例えば、ラテックス、ポリスチレンのビーズ（Interfacial Dynamics Corp.、オレゴン州ポートランド）、磁性粒子（Ad vanced Magnetics、マサチュセッツ州ケンブリッジ）およびナイロン球（Hendry ら、J．Immunological Meth．35：285-296，1980）。例えば、樹脂ビーズのプールを各々が単一のアミノ酸をもつ別々の反応器の中に分布させ、そしてアミノ酸をビーズに連結させ、次いでビーズを再プールすることによって合成される大きいペプチドのライブラリーをスクリーニングすることができる。このサイクルを多数回反復してペプチド鎖を延長する。各ビーズは単一のペプチド鎖の種を含有する。アクセプターの分子（例えば、可溶性レセプター）をリポーター酵素（例えば、フルオレセイン）に連結し、そしてペプチド鎖連結ビーズと反応させる。レセプターに結合するビーズをリポーター酵素の活性化により同定しそしてプールから分姉する。リポーターを適当な溶媒中で洗浄して除去し、ペプチド鎖連結ビーズをミクロシークエンサーの中に入れ、そしてアミノ酸配列を分析する（La mら、Nature 354：82-84，1991）。他のアプローチにおいて、可溶性形態のレセプターを固体の支持体に取り付け、そしてリガンドをレセプターの上に通過させて、結合しかつ複合体を形成する化合物についてスクリーニングする。このスクリーニング法は、固相酵素結合イムノアッセイにおいて使用するために、抗原または抗体を固体の支持体、例えば、ナイロンビーズに固定化することに類似する（Hendryら、前掲）。このような方法はこの分野においてよく知られている。また、WO91/19818号およびWO91/05058号（これらを引用によってここに加える）に記載されているように、切形カルシトニンレセプター変異型を使用してペプチドのライブラリーをスクリーニングすることができる。ヒトカルシトニンレセプターに結合するモノクローナル抗体が、また、本発明により提供される。非ヒト、例えば、ネズミのモノクローナル抗体の生産はよく知られており（参照、例えば、Harlowら、Antibodies A Laboratory Mannual，C old Spring Harbor Press，pp．139-240，1989（引用によってここに加える）そして、例えば、精製された組み換えヒトカルシトニンレセプター分子リードアウト前記レセプター分子の所望の部分、例えば、リガンドの結合またはＧタンパク質およびアデニレートシクラーゼ活性化に寄与する１または２以上のドメインを含有する調製物で動物を免疫化することによって達成することができる。ヒトレセプターまたは結合性ドメインのポリペプチドに対するヒトモノクローナル抗体を発生することは困難であることがあるので、非ヒトモノクローナル抗体の抗原結合性領域、例えば、Ｆ（ ab'）₂または超可変性領域またはネズミモノクローナル抗体をヒトの一定領域（ Fc）またはフレームワーク領域に組換えDNA技術により転移して、実質的にヒトの分子を生成することが望ましいことがある。このような方法は一般に既知でありそして、例えば、米国特許第4，816，397号および米国特許第4，946，778号、および欧州特許公開第173，494号および欧州特許公開第239，400号（これらをここに引用によって加える）に記載されている。あるいは、ヒトレセプターのタンパク質に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその一部分をコードするDNA配列は、WO90/14430号（引用によってここに加える）の中に概説されている一般的プロトコールに従いヒトＢ細胞からのDNAライブラリーをスクリーニングし、次いで所望の特異性の抗体（または結合性抗原）をコードする配列をクローニングおよび増幅することによって単離することができる。他の態様において、本発明はレセプターを発現する細胞を使用する生体外で実施されるスクリーニングアッセイを提供する。例えば、レセプターまたは選択したその一部分をコードするDNAを確立された細胞系、例えば、哺乳動物細胞系、例えば、BHKまたはCHOの中に、ここに記載する方法を使用してトランスフェクションすることができる。次いでレセプターを培養細胞により発現させ、そして選択した因子を細胞への所望の作用について、別々に、あるいは適当なリガンド、例えば、カルシトニンと組み合わせてスクリーニングする。なお他の面において、本発明により提供されるスクリーニングアッセイはトランスジェニック哺乳動物に関し、このような哺乳動物の胚芽細胞および体細胞は、ヒトカルシトニンレセプターのタンパク質あるいは、例えば、リガンド、GTP結合性タンパク質などに結合するレセプターの選択した部分をエンコードするヌクレオチド配列を含有する。例えば、ヒトカルシトニンレセプターをコードする配列を非ヒト哺乳動物の胚の中に導入することができるいくつかの手段が存在し、それらのいくつかは、例えば、米国特許第4，736， 866号、Jaenisch，Science 240-1468-1474（1988）およびWestphalら、Annu．Re v．Cell Biol ．５：181-196（1989）（これらをここに引用によって加える）に記載されている。次いで動物細胞はレセプターを発現し、こうして選択した作用物質または拮抗物質を試験またはスクリーニングするための便利なモデルとして使用することができる。他の面において、本発明は診断法および組成物に関する。ヒトカルシトニンレセプターをコードするヌクレオチド配列、組換えレセプターのタンパク質およびそれに対するモノクローナル抗体を有することによって、種々の診断アッセイが提供される。例えば、ヒトカルシトニンレセプターに対してモノクローナル抗体を使用して、個々のまたは問題の培養物の選択した細胞または組織中のレセプターの存在および／または濃度を決定することができる。これらのアッセイは、疾患、例えば、オステオポローシス、パジェット病、および他の骨の吸収の障害の診断および／または処置において使用することができる。多数の種類のイムノアッセイおよびオリゴヌクレオチドのプローブのアッセイは利用可能であり、そしてこの分野において知られている。ヒトカルシトニンレセプターのDNAまたはRNAは、サザンまたはドットブロットに類似する標識化ヒトカルシトニンを使用して、細胞の中で直接検出することができる。また、ポリメラーゼ連鎖反応（Saiki ら、Science 239：487，1988、および米国特許第4，683，195号および米国特許第4，683，202号、引用によ、ってここに加える）を使用してDNA配列を増幅することができ、これらを引き続いてアガロースゲル上のそれらの特徴的なサイズ、ヒトカルシトニンレセプターのDNAまたはオリゴヌクレオチドのプローブを使用するこれらのゲルのサザンブロット、あるいは同様なプローブを使用するドットブロットにより検出される。プローブは約14ヌクレオチド〜約25またはそれ以上のヌクレオチド、好ましくは40〜60ヌクレオチドからなり、そしてある場合においてヒトカルシトニンレセプターの実質的な部分またはさらに全体のcD NAを使用することができる。プローブは検出可能なシグナル、例えば、酵素、ビオチン、ラジオヌクレオチド、蛍光体、化学発光体、常磁性粒子などで直接または間接的に標識化される。次の実施例により例示するが、これらの実施例は制限的ではない゜実施例Ｉヒトカルシトニンレセプターのクローニングこの実施例はヒトカルシトニンレセプターのcDNAをクローニングする方法を記載する。Ｉ．cDNAの合成およびcDNAライブラリーの調製 T-47D乳癌細胞（HBL 133）をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（ATCC）から入手し、そしてRPMI培地（ RPMI 1640（Sigma、ミゾリー州セントルイス）；0.29mg／mlのＬ−グルタミン（ Hazelton、カンサス州レネクサ）；1mMのピルビン酸ナトリウム（Irvin、カリフォルニア州サンタアナ）；0.6μ１／mlのインスリン（GIBCO-BRL、マリイランド州ガイサーバーグ）および１μＭのヒドロコルチゾン（Sigma）を含有する150 mmのペトリ皿の中でコンフルエンシーに培養した。細胞をペトリ皿からこすり取ることによって取り出し、そして全体のRNAを細胞からグアニジンイソチオシアネート（Chirg winら、Biochemistry 18：52-94，1979）およびCsCl遠心を使用して調製した。オリゴ（dT）セルロースクロマトグラフィー（AvivおよびLeder，Proc．Natl．A cad．Sci．USA 69 ：1408-1412，1972）を使用してポリ（Ａ）＋RNAを単離した。 RNAをポリ（Ａ）＋RNAについて２回選択した。第１鎖cDNAを前述のポリ（Ａ）＋RNAから合成した。反応は次の試薬を使用して準備した：5.0μｌの2.0μｇ／μｌのポリ（Ａ）＋RNA，7.0μｌのジエチルピロカーボネート（DEPC）で処理した水、2.0μｌの10mMのTrisおよび１mMのEDTA （TE）pH7.4、および2.0μｌの1.0μｇ／μｌのプライマーとして作用するオリゴヌクレオチドZC2938（配列番号：15）。反応混合物を65℃に３分間加熱し、そして氷上で冷却した。冷却後、反応混合物をＡおよびＢと表示する別々の管の中に分割した。次の試薬をＡおよびＢ混合物に添加した：4.0μｌの５×AT緩衝液（GIBCO-BRL、マリイランド州ガイサーバーグ）、1.0μ１の200mMのジチオスレイトール、1.0μｌの10mMの各dATP，dGTP，dTTPおよび５−メチル−dCTPを含有ずるデオキシヌクレオチド三リン酸（Pharmacia LKB Biotechnology、ニュージャージイ州ピスカタェイ）。反応混合物Ａは1.0μｌの添加した放射線標識化デオキシヌクレオチド三リン酸α−dATP（10μCi／μｌ）を有した。反応混合物Ｂに、1.0μｌのDEPC処理した水を添加した。５μｌの200ｕ／μｌのSuperscript^R 逆転写酵素（GIBCO-BRL、マリイランド州ガイサーバーグ）を両者の反応混合物ＡおよびＢに添加し、そして両者を45℃において30分間インキュベーションした。 80.0μｌのTE pH7.4の添加により反応を停止した。２μｌを反応混合物Ａから取り出して、TCA沈殿を使用して収量を定量した。追加の2.0μｌをアルカリ性ゲル分析のために取って置いた。2.0μｇのカキグリコーゲン、30.0μｌの８ＭのNH₄Ac₂および300.0μｌの100％エタノールの添加により、残りの反応混合物ＡおよびＢを沈澱させた。ペレット化後、反応物を50.0 μｌの無菌の蒸留水の中に再懸濁させた。第２鎖の合成の第１鎖のプライミングを促進する条件下に第１鎖の合成反応からのRNA-DNAハイブリッド上で第２鎖の合成を実施して、DNAヘアピンを形成した。次の試薬を50μｇの第１鎖cDNAに添加することによって、100.0μｌの反応混合物を調製した：20.0μｌの５×ポリメラーゼＩ緩衝液（100mMのTris、pH7.4， 500mMのKCｌ，25mMのMgCl₂，50mMの（NH₄）₂SO₄）、4.0μｌの100mMのジチオスレイトール、1.0μｌの10mMの各デオキシヌクレオチド三リン酸を含有する溶液、3.0μｌの５mMのβ−NAD，0.6μｌの７ｕ／μｌの大腸菌（E．coli）DNAリガーゼ（NEB、マサチュセッツ州ベベリイ）、3.1μｌの８ｕ／μｌの大腸菌（E．c oli）DNAポリメラーゼ（Amersham、イリノイ州アーリントンハイツ）、１μｌのｕ／μｌのRNアーゼＨ（GIBCO-BRLマリイランド州ガイサーバーグ）。反応混合物を室温においてアセンブリングし、そして１６℃において２時間インキュベーションした。２アリコートの2.0μｌの各々をTCA沈澱およびアルカリ性ゲル分析のために取り出した。２μｇのカキグリコーゲンを残りの反応混合物に添加し、次いで5.0μｌの0.5 ＭのEDTAおよび200μｌのTE pH7.4を添加した。反応物をフェノール−クロロホルム抽出し、そして酢酸アンモニウム沈澱させた。反応混合物ＡおよびＢの各々を36.0μｌの無菌の蒸留水の中に再懸濁させた。ヘアピン構造の一本鎮DNAをヤエナリヌクレアーゼ反応混合物で切断し、ここでこの反応混合物は6.0μｌの10×S1緩衝液（300 mMのNaAc pH4.6，３ＭのNaCl，10mMのZnS0₄）、6.0μｌの10mMのジチオスレイトール、1.0μｌの5 0％のグリセロール、6.0μｌのヤエナリヌクレアーゼ（NEB、マサチュセッツ州ベベリイ）を含有した。反応を30℃において30分間インキュベーションし、そしてTE pH7.4で100.0μｌに希釈することによって停止させた。２μｌのアルカリ性ゲル分析のために取り出した。追加の50.0μｌの２ＭのTris pH7.4および50.0 μｌのTE pH7.4を添加した。混合物を２回フェノール−クロロホルム抽出し、そして１回クロロホルム抽出した。反応混合物を60.0μｌの８ＭのNH₄Acおよび260 .0μｌのイソプロパノールで沈澱させ、そしてペレットを80％エタノール中で洗浄した。ヤエナリヌクレアーゼ消化後、DNAをT4DNAポリメラーゼ処理でブラントとした。cDNAを24.0μｌの無菌の蒸留水の中に再懸濁させた；これに10×T4DNAポリメラーゼ緩衝液（330 mMのTrisアセテートpH7.9，670mMのリン酸カリウム、100 mM の酢酸マグネシウムおよび１mg／mlのゼラチン）、4.0μｌの各１mMのデオキシヌクレオチド三リン酸、4.0μｌの50mMのジチオスレイトールおよび4.0μｌの14 ｕ／μｌのT4DNAポリメラーゼを添加し、そして15℃において60分間インキュベーションした。200.0μｌのＴＥの添加により反応を停止した後、反応をフェノール／クロロホルム抽出した。酢酸アンモニウムおよびイソプロパノールを使用してcDNAを沈澱させた。プラスミドZem228は、マウスメタロチオネイン−１プロモーターとSV40転写ターミネーターとの間のクローニングされたDNAの挿入のための独特BamHI部位、およびSV40初期プロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子、およびSV40ターミネーターを含有する発現ユニットを含有するpUC18に基づく発現ベクターである。プラスミドZem228をEcoRIを使用する部分的に消化により２つのEcoRI部位を欠失し、dNTPの存在下にDNAポリメラーゼＩ（クレノー断片）でブラントとし、そして再結合により修飾した。生ずるプラスミドをBamHIで消化し、次いで線状化プラスミドをBamHI−EcoRIアダプターで結合して、独特EcoRIクローニング部位を生成した。生ずるプラスミドをZ em228Rを表示した。Zem228RをSstＩで線状化し、付着末端をdNTPの存在下にT4DN Aポリメラーゼでブラントとし、そして線状化平滑末端の断片を再結合することによって、SV40プロモーターとマウスメタロチオネイン−１プロモーターとの間のSstＩ部位を破壊した。SstＩ部位が破壊されたプラスミドをZem228Raと表示した。 Zem228Raの中へのcDNA断片の方向的挿入を促進するために、５’EcoRＩ付着末端、内部のSstＩ部位、おひびEcoRＩ付着末端との結合のときEcoRＩ部位を再生しない３’EcoRＩ付着末端を含有するアダプターを合成した。プラスミドZem228 RaをEcoRＩによる消化により線状化し、そして線状化プラスミドを仔ウシアルカリ性ホスファターゼで処理して再環化を防止した。線状化プラスミドをキナーゼ化オリゴヌクレオチドZC3168およびZC3169（それぞれ、配列番号：13および14）で結合した。挿入されたアダブターを含有するプラスミドをZem228Cと表示した。 Zem228CベクターのEcoRＩ＋Sstｌ切断を達成する能力を改良するために、EcoR Ｉ付着末端との結合のときEcoRＩ部位を再生しないEcoRＩ付着末端がフランキングする内部のEcoRＩ部位を含有するオリゴヌクレオチドのアダプターを合成した。オリゴヌクレオチドZC1773およびZC1774（それぞれ、配列番号：５および６）をキナーゼ処理しそしてアニーリングしてアダプターを形成した。プラスミド Zem228CをEcoRＩで消化して線状化し、そして線状化ベクターおよびキナーゼ処理したアダプターを結合した。アダプターを含有するプラスミドを確証しそして配列決定した。配列分析により、プラスミドは新しいEcoRＩ部位と下流のSstＩ部位との間に30bpのDNAインサートを含有することが明らかにされた。cDNA配列の挿入の前のベクターのEcoRＩ＋SstＩ切断は追加のDNA配列を除去するので、挿入されたDNAは除去されなかった。このプラスミドをZem1698と表示した（また、 Zem228CCと呼んだ）。ベクターZem1698の中へのcDNAのクローニングを促進するために、EcoRＩアダプター（Invitrogen、カリフォルニア州サンディエゴ）をcDNAに結合した。cDNA を24.0μｌの無菌の蒸留水中に再懸濁させ、そして4.0μｌの10×リガーゼ緩衝液（500 mMのTris-HCl，pH7.8および50mMのMgCl₂）、2.0μｌの10mMのdATP，2.0 μｌの200mMのジチオスレイトール、4.0μｌの１μｇ／μｌのアダプターDNAおよび4.0μｇ／μｌの１Weiss Ｕ／μｌのT4リガーゼ（Boehringer Mannheim、アイダホウ州インジアナポリス）をDNA溶液に添加した。結合反応を室温において一夜インキュベーションした。リガーゼを65℃において10分間インキュベーションすることによって加熱不活性化した。cDNAをSstＩで20単位のSstＩとの200μ ｌの反応においてSstＩ８時間消化し、そしてイソプロパノール沈澱させた。 cDNAを大きさで分別しそしてリンカーを除去するために、cDNAをセファローズ（Sepharose）2B-CLカラムを使用するクロマトグラフィーにかけ、カラム緩衝液として10mMのTris-HCl，pH7.4、および0.1mMのEDTAを使用した。空隙体積中のDN Aを集め、そしてエタノール沈澱させた。cDNAの最終収量は1.9μｇであった。クローニングベクタ−Zem1698をアルカリ性ホスファターゼで処理して、ベクターの再環化を防止した。cDNAは前述したように半リン酸化EcoRＩリンカーのアダプターを含み、そして次の反応を使用してリン酸化してZem1698 ベクターの中へのクローニングを可能とした。25μｌの80ng／μｌを１μｌの20 0 mMのジチオスレイトール、５μｌの10mMのアデノシン三リン酸、５μｌの10× T4キナーゼ緩衝液（700 mMのTris-HCl，pH7.6，１ＭのKCl，100MのMgCl₂）および５μｌの１０Ｕ／μｌのT4ポリヌクレオチドキナーゼ（GIBCO-BRLマリイランド州ガイサーバーグ）と混合した。反応混合物を37℃において45分間インキュベーションし、次いで65℃において10分間インキュベーションした。TEを150最終体積に添加し、そして反応混合物を１回フェノール−クロロホルム抽出し、そして１回クロロホルム抽出した。cDNAおよび酢酸ナトリウムおよびエタノールで沈澱させた。cDNAを80ng／μｌの最終濃度に再懸濁させた。試験の結合において、10ngのcDNAおよび40ngのベクターはcDNAライブラリーの発現のために最適であることが証明された。結合反応を８μｌのEcoRＩおよびSs tＩで消化したベクターZem1698および２μｌの80ng／μｌのcDNAの使用により規模を大きくし、そして次の成分を含有する80μｌの反応体積で反応させた：１μ ｌの10×リガーゼ（500 mMのTris-HCl，pH7.8，100mMのMgCl₂，250μｇ／mlのBS A）、0.5μｌの10mMのジチオスレイトールおよび１μｌの１μｇ／mlのムラサキイガイのグリコーゲン。反応を室温において12時間インキュベーションし、その後、40μｌの水、４μｌの２ＭのTrispH8.0および４μｌの0.5 MのEDTAを添加した。反応をフェノール／クロロホルム抽出し、そして酢酸アンモニウムおよびエタノールで沈澱させた。ペレットを70％エタノール中のすすぎ、そして20μｌの水中に再懸濁させた。１μｌのcDNAを使用してエレクトロマックス（Electromax^R）大腸菌(E.coli）細胞（GIBCO-BRLマリイランド州ガイサーバーグ）を形質転換し、ここで25μＦ，2.3 KV，400オームにセットしたパルス・コントローラー（Pulse Controller^R）を装備したジーン・パルサー（Gene Pulser^R）（Biorad、カリフォルニア州リッチモンド）および2mmのギャップのクベットを使用した。エレクトロポレイション後、細胞を１mlのLBブロス中に再懸濁させ、そして１：10，１：100および１：1000希釈で100μｇ／mlのアンピシリンを含むLBプレート上にプレートした。プレートを37℃において一夜インキュベーションし、そして力価を決定した。残りのcDNAを８μｌに濃縮し、そして２μｌのcDNA／25μｌの細胞を使用して４回の独立のエレクトロポレイション反応を前述したように実施した。４つのエレクトロポレイション反応物を最終体積8.2 mlのLBブロス中の単一の混合物の中にプールし、そしてローラードラム中で37℃において30分間インキュベージョンした。接種物を前述したように40の15cmのLBおよびアンピシリンプレート上にプレートした（200 ul／プレート）。プレートの力価決定は各プレートがほぼ208,000コロニーを有すること決定した。プレートをこすって細胞を除去し、そしてプラスミドDNAを単離した。II．PCR増幅によるカルシトニンレセプタ−cDNAの単離ブタカルシトニンレセプター、ラットセクレチンレセプターおよびフクロネズミ副甲状腺ホルモンレセプターの多重整列に基づく高い保存および低いディジェネラシーの領域に相当する縮重オリゴヌクレオチド（ZC4698およびZC4699；それぞれ、配列番号：11および13）を使用する、カルシトニンレセプター配列を増幅するための鋳型どして、T-47Dヒト乳癌二本鎮cDNAを使用した。50μｌの反応物を構成し、この反応物は80ngの鋳型cDNA；100 pmolの各オリゴヌクレオチドZC4698（配列番号：11）およびZC4699（配列番号：12）；５μ１の10× PCR緩衝液（Promega Corp．、ウイスコンシン州マディソン）；５μｌの各2.5 m Mのデオキシヌクレオチド三リン酸；0.25μｌのTaqポリメラーゼ（Promega）および29.75μｌの水を含有した。ポリメラーゼ連鎖反応を94℃において90秒間、4 0℃において90秒間および72℃において120秒間２サイクル；94℃において45秒間、50℃において45秒間、72℃において120秒間38サイクルで実施し、次いで72℃ において７分間インキュベーションした。反応混合物を1.2％のアガロースゲルの電気泳動にかけ、そしてほぼ600塩基対のDNA断片を単離し、フェノールー−クロロホルム抽出し、そして15μｌの水中に再懸濁させた。600 bpの断片をポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。反応混合物は１μｌの600 bpの鋳型、100 pmolの各オリゴヌクレオチド（ZC4698、配列番号：11およびZC4699、配列番号：12）、５μｌの10×PCR緩衝液〔Promega）、５μｌの各2.5 mMのデオキシヌクレオチド三リン酸および0.6μｌのポリメラーゼ（Promega）を含有した。反応を次のようにして実施した：２サイクル、90℃ において90秒間、45℃において45秒間、72℃において120秒間２サイクル；94℃ において45秒間、45℃において45秒間、72℃において120秒間30サイクル、そして72℃における７分間インキュベーションで停止した。反応混合物を４℃に冷却し、そして１％の低融点のアガロースゲルの電気泳動にかけた。600 bpの断片を切り出し、そして精製した。 600 bpの断片をプライム２ベクター中にクローニングした。オリゴヌクレオチドZC4418およびZC4419（それぞれ、配列番号：９および配列番号：10）をブラスミドベクターｐブルースクリプト（pBluescript）Ｉ（Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ）のpstＩ制限部位中に挿入することによって、プライム２ベクターを構成した。これはもとのPstＩ部位を破壊し、そしてオリゴヌクレオチドのインサートの中央に新しいpstＩ部位をつくった。プライム２ベクターをPstＩで完全に消化して３’オーバーハングを生成した。粘着末端をベクターおよびインサートのために別々の反応において発生させ、各反応は0.5μｌのプライム２ベクターまたは４μｌの600 bpのインサートのDNA断片、２μｌの10×バクテリオファージT4DNA ポリメラーゼ緩衝液（Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989、これをここに引用によって加える）、２μｌの各１ mMのdGTPまたはdCTP，２μｌのT4DNAポリメラーゼを含有した。プライム２ベクターおよび600 bpのDNA断片の結合反応は、１μｌのプライム２ベクター、10μｌの600 bpのDNA断片、３μｌの10×結合緩衝液（Boehringer Mannheim）、３μｌのリガーゼ（NEB、マサチュセッツ州ベッドフォード）および30μｌの水を含んだ。室温において一夜インキュベーションした後、反応混合物をフェノール−クロロホルム抽出した。いったんエタノール沈澱すると、DNA を25μｌの水中に再懸濁させた。生ずるプラスミド（600/プライム２と表示ずる）を使用して、エレクトロポレイションにより大腸菌（E.coli）株DH10B ELECTROMAX細胞（GIBCO BRL）を形質転換した。１つの形質転換体（600／プライム２＃１と表示する）を選択しそしてプラスミドDNAを単離した。配列の分析により、インサートはブタカルシトニンレセプターに関係するポリペプチドをエンコードするすることが示された。III．乳癌cDNAからの全長のヒトカルシトニンレセプターのクローニング実施例Ｉに記載するJT47dライブラリーをスクリーニングすることによって、全長のヒトカルシトニンレセプターcDNAを得た。LB＋70μｇ／mlのアンピシリンを2×10⁵コロニー形成単位（cfu）の密度で含有する39の150 mmのペトリ皿上に、JT47dライブラリーをプレートした。十分なLBブロスを各プレートに添加して、コロニーの懸濁液をつくった。細胞懸濁液を1〜39と表示し、そして15％のグリセロールを添加したLB中に入れ、そして−80℃において凍結した。細胞懸濁液１〜４を含有するバイアルを氷上で融解した。１μｌの各懸濁液を10mlのLBブロス中に希釈し、そして各プレートを137mm，1.2μｍのBIOTRANSナイロンフィルター（ICN、カリフォルニア州アービン）でカバーすることによって調製したLB＋アンピシリンを含有する150 mmのプレート当たり1，10または100μｌでプレートした。プレートを25℃において12時間インキュベーションし、次いでコロニーがほぼ0.5 mmの大きさになるまで、37℃において５時間インキュベーションした。新鮮なナイロンフィルターをマスターフィルター上にプレスし、層3mmのワットマン（Whatman）紙と２枚のガラス板との問に層を配置し、そして上部の板に圧力を加えることによって、マスターフィルターの複製コピーを作った。フィルターを配向について１８ゲージの針を使用して検索した。スクリーニングコピーを 150 mmのLB＋170μｇ／mlのクロランフェニコールプレート上に配置し、そして3 7℃において３日間インキュベーションした。マスターフィルターを150 mmのLB ＋70μｇ／mlのクロランフェニコールプレート上に配置し、そして37℃において数時間インキュベーションした。マスターフィルターを除去し、そして４℃において貯蔵した。ほぼ400,000コロニーをスクリーニングした。まずEcoRＩおよびBamHＩで消化することによって、プローブとして使用するためにプラスミド600/プライム２＃１を調製した。それぞれ、2.5％のアガロースゲルおよび１％の低融点を使用して、DNA断片を２回ゲル精製した。ほぼ600 bp のバンドを単離した。αdCTPおよびストラタジーン（Stratagene）プライム−It キット（Stratagene）を製造業者の仕様書に従い使用して、ほぼ30ngの600 bpの DNA断片を放射線標識化した。 50％のホルムアミド、５mlの100×デンハルト溶液（Sambrook、前掲）、５ml の10％SDS，30mlの20×SSC（Sambrook、前掲）および水の80mlの溶液中でcDNAフィルターをプレハイブリダイゼーションして100 mlの最終休積にした。37℃において一夜インキュベーションした後、8.6ｇのデキストラン硫酸および1.8mlの沸騰した10mg/mlのサケ精子DNAを含む新しいハイブリダイゼーション溶液を添加した。600/プライム２＃１プローブを沸騰させて変性しそして8.6×10⁷cpmの標識化プローブをフィルターおよびハイブリダイゼーション溶液に添加した。フィルターを37℃において一夜ハイブリダイゼーションした。１つのクローンをプローブに対してハイブリダイゼーションし、そしてマスターフィルターからレスキューした。陽性シグナルに相当するフィルターの区画を除去し、２mlのLBブロス中に入れ、そして渦形成した。培養物を新しいフィルター上でいくつかの系統的希釈で再プレートし、そして前述したようにプロセシングした。標識化プローブ600/プライム２＃１を使用して新しいフィルターをスクリーニングし、そしてクローンはプローブにハイブリダイゼーションしたことが評価された。このクローンをpHollexと表示し、そしてアメリカン・タイブ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）米国マリイランド州ロックビレに大腸菌（ E．coli）XLIの青色の形質転換体として受け入れ番号69067で受託された。配列の分析および制限分析において、cDNAは3.3kbのインサートを有した。コーディング配列を1422bpであり、1.9kbの３’非翻訳配列をもっていた。Hollexは474酢酸アンモニウムのタンパク質をエンコードし、そしてブタカルシトニンレセプターと70.3％のアミノ酸の同一性を有した。IV．卵巣のcDNAからの切形ヒトカルシトニンレセプターの同定ヒト卵巣第１鎖cDNAをクロンテク（Clontech）（カリフォルニア州パロアルト）から入手しそして、ヒトカルシトニンレセプターの領域（配列番号：１として示されている）に相当するオリゴヌクレオチド（ZC5471およびZC5468；それぞれ、配列番号：16および17）を使用する、ポリメラーゼ連鎮反応によるカルシトニンレセプター配列の増幅のための鋳型として使用した。１ngの鋳型DNA，５μｌ（100 pmol）の各オリゴヌクレオチドZC5468およびZC5471（それぞれ、配列番号：17および16）、５μｌの各2.5mMのデオキシヌクレオチド三リン酸、５μｌの1 0×VENT_R緩衝液（100 mMのKCl，200mMのTris-HCl，pH8.8，100mMの（NH₄）₂SO₄ ，20mMのMgSO₄および１％トリトンX-100（ポリエチレングリコール４−イソオクチルフェニルエーテル）（New England Bjolabs）、0.5μｌのVENT_R熱安定性DNA ポリメラーゼ（New England Biolabs）および29.5μｌの水を含有する50μｌの反応を構成した。ポリメラーゼ連鎖反応を94℃において90秒間、58℃において90 秒間および72℃において２分間２サイクル；94℃において45秒間、58℃において 45秒間、72℃において２分間38サイクルで実施し；次いで72℃において７分間インキュベーションし、そして４℃において一夜貯蔵した。反応混合物を２％のアガロースゲルの電気泳動にかけ、そしてほぼ600塩基対のDNA断片を単離した。DNAを含有ずるアガロースを粉砕して水溶液を形成した。オリゴヌクレオチドZC5471およびZC5468（それぞれ、配列番号：16 および17）に対して内部に位置する配列に対してハイブリダイゼーションするように設計されたオリゴヌクレオチド（ZC5469およびZC5474、それぞれ、配列番号：18および19）を使用するポリメラーゼ連鎖反応のための鋳型として、生ずるDN A断片を使用した。１μｌの鋳型ＤＮＡ，５μｌ（100 pmol）の各オリゴヌクレオチドZC5469およびZC5474（それぞれ、配列番号：18および19）、５μｌの各2. 5 mMのデオキシヌクレオチド三リン酸、５μｌの10×VENT_R緩衝液（New England Biolabs）、0.5μｌのVENT_Rポリメラーゼ（New England Biolabs）および29.5 μｌの水を含有する50μｌの反応を構成した。ポリメラーゼ連鎖反応を94℃において90秒間、58℃において90秒間および72℃において２分間２サイクル；94℃において45秒間、58℃において45秒間、72℃において２分間28サイクルで実施し；次いで72℃において７分間１サイクルを実施し、そして４℃において一夜貯蔵した。反応混合物を１％アガロースゲルの電気泳動にかけ、そしてほぼ400塩基対のD NA断片が見られた。ポリメラーゼ連鎖反応の増幅35μｌのアリコートを１％低融点アガロースゲルの電気泳動にかけ、そして400塩基対の断片を切り出し、そして等しい体積の１×TBE中に懸濁した。断片をフェノール−クロロホルム抽出し、そして10μｌの水中に再懸濁させた。ポリメラーゼ連鎖反応は平滑末端のDNA断片を発生した。平滑末端のSmaＩの制限消化したpUC19ベクターを使用して、３μｌのDNA，２μｌのpUC19，３μｌの1 0×リガーゼ緩衝液、３μｌのリガーゼおよび19μｌの水を含有する結合反応を構成した。１μｌのアリコートを使用して、ELECTROMAX DH10B大腸菌（E．coli ）細胞（GI BCO-BRLマリイランド州ガイサーバーグ）をエレクトロポレイションし、ここで2 5μＦ，2.3 KC、400オームにセットしたパルス・コントローラー（Pulse Contro ller^R）を装備したジーン・パルサー（Gene Pulser^R）（Bio-Rad、カリフォルニア州リッチモンド）および2mmのギャップをもつクベットを使用した。エレクトロポレイション後、細胞を１mlのLBブロス中に再懸濁させ、そして10μｌ，100 μｌおよび890μｌの希釈で100μｇ／mlのアンピシリンを含むLBプレート上にプレートした。プレートを37℃において一夜インキュベーションした。被覆しそして各ペトリ皿から２×1.2〜１Ｍのフィルター（ICN、カリフォルニア州アービン）を注意して取り出すことによって、複製フィルターを調製した。フィルターを配向について18ゲージの針を使用して検索し、そして８０℃において１時間ベーキングした。乾燥後、50％ホルムアミド、５mlの10％SDS，５mlの100×デンハルト溶液（USA Biochem．Corp、オハイオ州クレブランド）、30mlの20×SSC（Samb rook、前掲）、50mlの0.2mg／mlのサケ精子DNAおよび水を含有する50mlのプレハイブリダイゼーション溶液中に、フィルターを入れて最終体積を100 mlとした。フィルターを37℃において配置して一夜インキュベーションした。 αdCTPおよびストラタジーン（Stratagene）プライム−Itキット（Stratagene ）を製造業者の仕様書に従い使用してDNAを標識化することによって、400塩基対の断片内のヒトカルシトニンレセプターの一部分にハイブリダイゼーションする、オリゴヌクレオチドZC5162（配列番号：21）をプローブとして使用するために調製した。プレハイブリダイゼーション溶液を除去し、そして10⁶cpm/mlのプローブZC516 2（配列番号：21）を含有する50mlの新しいハイブリダイゼーション溶液をフィルターに添加した。フィルターを37℃において一夜ハイブリダイゼーションした。プローブは４つのクローンにハイブリダイゼーションし、すべてのクローンは890μｌのプレーティングからのフィルター上に位置した。４つのコロニーのうちの３つを単離し、そして5mlの２×YT ブロス（16gのBacto Typtone（DIFCO、ミシガン州デトロイト）、10gの酵母エキス（DIFCO）、10gのNaClおよび１リットルとする水）（100μｇ／mlのアンピシリンを含有した）の中に接種した。培養物を37℃において一夜成長させ、そしてプラスミドDNAを単離した。プラスミドDNAをEcoRＩおよびHindIIIで消化し、そしてアガロースゲルの電気泳動にかけて正しい大きさのインサートを評価した。すべての３つのクローンは400塩基対の大きさのインサートを有した。100μｇ／ mlのアンビシリンを含有するLBプレートからストリーキングで取り出して純粋なコロニーを単離し、そしてプラスミドDNAの単離および制限消化を前述したように反復した。DNAを2.5％アガロースゲル上で分析し、そして400塩基対のインサートを評価した。 cDNA断片の配列分析において、フレーム、シフトを生じたヌクレオチド52で開始する35塩基対のインサート（配列番号：１参照）を除外して、配列はHollexと表示するクローンと同定であることが示された。卵巣カルシトニンレセプターcD NAクローンのヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸配列は、配列番号：24および配列番号：25に示されている。Ｖ．全長のヒトカルシトニンレセプター胎盤cDNAの同定ヒト胎盤第１鎖cDNAをクロンテク（Clontech）（No．7116-1）から入手しそして、前述したように、ヒトカルシトニンレセプターの領域に相当するオリゴヌクレオチド（ZC5471およびZC5468；それぞれ、配列番号：16および17）を使用する、ポリメラーゼ連鎮反応によるカルシトニンレセブター配列の増幅のための鋳型として使用した。１μｇの鋳型cDNA，５μｌ（100 pmol）の各オリゴヌクレオチドZC5471およびZC5469（それぞれ、配列番号：16および17）、５μｌの各2.5 mMのdNTP、５μｌの10×VENT_R 緩衝液（New England Biolabs）、0.5μｌのVENT_Rポリメラーゼ（New England B iolabs）および29.5μｌの水を含有する50μｌの反応を構成した。ポリメラーゼ連鎖反応を94℃において90秒間、60℃において90秒間および72℃において２分間２サイクル；94℃において45秒間、60℃において45秒間および72℃において２分間38サイクルで実施し；次いで72℃において７分間１サイクルを実施し、そして４℃において一夜貯蔵した。10μｌのポリメラーゼ連鎮反応生成物をゲル電気泳動により分析した。反応生成物はほぼ600塩基対であった。反応混合物を１％アガロースゲルの電気泳動にかけ、そしてDNA断片を含有するアガロースをゲルの残部から切り出すことによって、ほぼ600塩基対のDNA断片を単離した。アガロースを粉砕して水溶液を形成し、そしてポリメラーゼ連鎖反応のために鋳型として使用した。１μｌの鋳型cDNA，５μｌ（100 pmol）の各オリゴヌクレオチドZC5471およびZC5468（それぞれ、配列番号：16および17）、５ μｌの各2.5mMのdNTP，５μｌの10×VENT_R緩衝液（New England Biolabs）、0.5 μｌのVENT_Rポリメラーゼ（New England Biolabs）および29.5μｌの水を含有する50μｌの反応において、鋳型DNAを増幅した。ポリメラーゼ連鎖反応を94℃において90秒間、60℃において90秒間および72℃において２分間２サイクル；94℃ において45秒間、60℃において45秒間および72℃において２分間３８サイクルで実施し；次いで72℃において７分間１サイクルを実施し、そして４℃において一夜貯蔵した。反応混合物を２％アガロースゲルの電気泳動にかけ、そして500 〜800塩基対の範囲の４つのDNAバンドが見られた。４つのバンドの各々を切り出し、1.5％アガロースゲルを使用して精製し、フェノール−クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈澱させ、そして各DNAペレットを５μｌの水中に再懸濁させた。４つのDNA断片の各々をリン酸化して、次の成分を含有する反応混合物中の平滑末端の脱リン酸化ベクターpNEB193（New England Biolabsから入手したpUC19 誘導体）の中へのクローニングを促進した：４μｌのほぼ10ng／μｌのDNA断片；５μｌの0.01Ｍのｃ−32p ATP；５μｌの10×ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（700 mMのTris-HCl，pH7.8，100mMのMgCl₂および50mMのジチオスレイトール（New England Biolabs））、５μｌのポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs）および33.5μｌの水。反応混合物を37℃において１時間インキュベーションし、次いで65℃において45分間インキュベーションした。４つのリン酸化 DNA断片をリン酸化反応混合物１μｌの250 mMのジチオスレイトール、１μｌのほぼ30ng／μｌのSmaＩ線状化pNEB193および2.5μｌのT4DNAリガーゼ（New Engl and Biolabs）への添加によりpNEB193と結合した。インキュベーション後、５μ ｌの10×結合緩衝液（New England Biolabs）、40μｌの水および５μｌのT4DNA リガーゼを添加し、そして反応混合物を室温においてインキュベーションした。結合したDNAをフェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈澱により精製し、そしてDNAを20μｌの水中に再懸濁させた。プラスミドDNAをSmaＩで消化し、フェノール抽出し、そして５μｌの水中に再懸濁させた。線状化DNAを前述したように使用してELECTROMAX DH10B大腸菌（E．coli）細胞をエレクトロポレイションした。細胞混合物を使用して１mlのLBブロス中に再懸濁させ、そして100 μｇ／mlのアンピシリン、60μｌの50mg／mlのXgalおよび20μｌの100 mMのIPTG を含有する LBプレートを接種した。プレートを37℃において一夜インキュベーションし、そして４つの異なるDNA断片の各々からの７つの白色コロニーを培養のために選択した。 28の選択したコロニーを5mlの２×YTブロス中に個々に接種し、そして37℃において卵巣成長させた。プラスミドDNAを単離し、そしてEcoRＩおよびHind III 制限酵素で消化した。１μｌの各制限消化を2.5％アガロースゲル上で実施した。DNAをニトロセルロースに移し、そしてを本質的にSouthern（J．Mol．Biol．9 8：503，1975；Sambrookら、前掲）により記載されているようにヒトカルシトニンレセプターの全体のコーティング配列を含むpHollexからの3.3 kbのBamHＩ断片でブロットをプロービングした。マルチプライム（Multiprime）DNA標識化キット（Amersham、イリノイ州アーリントンハイツ）を製造業者の仕様書に従い使用し、pHollex断片を標識化した。 28クローンのうちの６つのヒトカルシトニンレセプターにハイブリダイゼーションし、そして配列分析のために選択した。この分析において、pla 14と表示する１つのクローンは９塩基対のインサートを有するが、純粋な培養物であるように思われないことがを明らかにされた。100μｇ／mlのアンピシリンを含有するL Bプレート上に混合培養物をストリーキングすることによって、クローンpla 14 を精製した。６つのコロニーを単離し、そして配列分析にかけた。これらのコロニーをpla 14.1〜14.6と表示した。これらのクローンの２つ、pla 14.4および14 .6の各々は９塩基対のインサートを有した。クローンpla 14.6をプラスミドDNA 源として使用し、そして次のプラスミドDNAの単離物をEcoRＩおよびNsiＩで消化した。DNAを2.5％アガロースゲル上の電気泳動させ、そして150塩基対の断片を単離し、そしてフェノールー−クロロホルム抽出およびエタノール沈澱により精製した。DNAを31μｌの水中に再懸濁させた。胎盤カルシトニンレセプターのクローンのヌクレオチド配列および推定されたアミノ酸配列を配列番号：26および配列番号：27に示す。実施例II 哺乳動物細胞中のヒトカルシトニンレセプターの発現この実施例は、カルシトニンを結合し、アデニレートシクラーゼ活性を活性化し、そして細胞内カルシウムを増加することができる方法で、機能的ヒトカルシトニンレセプターを細胞により発現することを記載する。Ａ．ルシフェラーゼ細胞系中のトランスフェクション pKZ10、すなわち、２つの環状AMP応答要素を含有するプロモーター、ルシフェラーゼcDNAおよびhGHターミネーターからなる発現ユニットで安定にトランスフェクションされたBHK570細胞系中で、ヒトカルシトニンレセプターcDNA pHollex を発現した。この細胞系はそのレセプターに結合するカルシトニンレセプターに応答するルシフェラーゼ活性、アデニレートシクラーゼ活性および細胞内カルシウムの濃度の測定を可能とする。プラスミドZK6中のエンケファリン環状AMP応答要素（CRE）をZem233から得た。Zem233をプラスミドZem67およびZem106から誘導した。プラスミドZem106を前駆体Zem93から構成した。Zem93を構成するために、MT-1プロモーターからなるKp nＩ−BamHＩ断片をMThGHlll（Palmiterら、Science 222：809-814，1983）から単離し、そしてpUC18の中に挿入した。次いでプラスミドZem93をSstIで消化し、そして再結合してプラスミドZem106を発生させ、ここでMT-1プロモーターに対して５’の配列のほぼ600 bpは排除された。まずZem106をEcoRＩおよびSstＩで消化してベクターを含有する断片を単離することによって、エンケファリンCREをZem106の中に挿入した。オリコヌクレオチドZC982およびZC983（それぞれ、配列番号：３および４）を、アニーリングしたとき、５’EcoRＩおよび３’SstＩ部位によりフランキングされたヌクレオチド−71〜−133からのプロエンケファリンCRE（Comら、Nature 323：353-356，19 86）をエンコードするように設計した。オリゴヌクレオチドZC982およびZC983（それぞれ、配列番号：３および４）をキナーゼ処理し、アニーリングしそして線状化Zem106と結合してプラスミドZem224を得た。まずpIC19R（Marshら、Gene 32：481-486，1984）をSmaＩおよびHind IIIで消化することによって、プラスミドZem67を得た。次いで地図位置270（Pvu II）から位置5171（Hind III）までのSV40のori領域を線状化pIC19Rに結合して、プラスミドZem67を生成した。プラスミドpSV2-neo（ATCCから受け入れ番号37149から入手可能）からのHind III−BamHＩネオマイシン耐性遺伝子−SV40ターミネーター断片をHind III−Bgl II消化Zem67の中に挿入して、Zem220を得た。プラスミド220からのSV40プロモーター−ネオマイシン耐性遺伝子−SV40ターミネーター発現ユニットを、EcoRＩ断片として単離した。プラスミドZem224はEc oRＩで消化し、そして仔ウシアルカリ性ホスファターゼで処理して再環化を防止した。ネオマイシン発現ユニットおよび線状化Zem224を結合した。CREに対して近位のSV40プロモーターを含有するプラスミドをZem233と表示した。プラスミドZem233を修飾して追加のCRE配列、TATAボックス、およびプロエンケファリンCRE配列に対して直ぐ３’のlacＺコーティングおよびポリ（Ａ）配列の部分を挿入し、こうして生ずる発現ユニットがZe m233中に存在するネオマイシン耐性発現ユニットに関して反対の向きであるようにした。プラスミドZem233をSstＩおよびBamHＩで消化して線状化した。アニーリングしたとき、５’SstＩ付着末端および３’EcoRＩ付着末端をもつ糖タンパク質CRE（Delegeaneら、Mol．Cell．Biol．7：3994-4002，1987）を生ずる二本鎮がエンコードするように、オリゴヌクレオチドZC3509およびZC3510（それぞれ、配列番号：７および８）を設計した。オリゴヌクレオチドを標準の方法に従いアニーリングした。チミジンキリーゼ遺伝子のヌクレオチド−79〜＋18の範囲の EcoRＩ−PstＩ断片として、チロシンキナーゼTATAボックスを得た（McKnight Ce ll 31 ：355-366，1982）。pUC18ベクター中にクローニングされたlacＺコーティング領域およびマウスプロトアミンターミネーターを含有する、プラスミドpLac F（Jaques Peschon，Immunex Corp、ワシントン州シアトルから入手した）からP stＩ−BamHＩ断片としで、lacＺ遺伝子の３’配列およびその関連するポリ（Ａ）配列を得た。SstＩ−BamHＩ線状化Zem233，SstＩ−EcoRＩ ZC3509/ZC3510アダプター、EcoRＩ−PstＩ TATAbz断片およびPstＩ−BamHＩ lacＺ配列を結合した。Zem233のネオマイシン耐性遺伝子の発現ユニットに関して正しい向きで発現ユニットを含有するプラスミドをKZ5と表示した。ルシフェラーゼ遺伝子およびヒト成長ホルモン（hGH）ターミネーター配列を使用して、KZ5中に存在するlacＺコーティングおよびポリ（Ａ）配列を置換した。ルシフェラーゼ遺伝子は最初にプラスミドａ−168luc（Delegeaneら、Mol．Ce ll．Biol． 7：3994-4002，1987およびdeWetら、Mol．Cell．Biol．7：725-737， 1987）から1.5 kbのXhol-Xbal断片として得た。Zem219b（大腸菌（E．col ｉ）形質転換体としてATCCに受け入れ番号6879で受託された）からXbal-SalＩ断片としてhGHターミネーターを得た。ルシフェラーゼ遺伝子およびhGHターミネーター配列を便宜上XhoＩ−SalＩ線状化pICI19H（Marshら、前掲）中にサブクローニングした。生ずるプラスミドKZ8をXhoＩおよびSalＩで消化して、ルシフェラーゼ−hGHターミネーター配列を単離した。プラスミドKZ5をSalＩで消化してベクター含有断片を単離し、そして仔ウシアルカリ性ホスファターゼで処理して再環化を防止した。XhoＩ−SalＩルシフェラーゼ−hGHターミネーター断片をSalＩ消化KZ5と結合した。プロモーターに関して適切な向きでルシフェラーゼ−ハロゲンターミネーターを含有するプラスミドをKZ6と表示した。プラスミドKZ6をHind IIIで消化して、SV40プロモーター、CRE ユニット、ルシフェラーゼ遺伝子、ヒト成長ホルモン遺伝子およびポリ（Ａ）配列を含有する DNA断片を除去した。Zem219b（ATCC受け入れ番号68979）をHind IIIで消化して、DHFR遺伝子およびpUC18配列を単離した。KZ6およびZem219b DNA断片をゲル精製し、それぞれ、3.0 kbの断片および5.0 kbの断片として単離し、そして結合した。CRE応答性ルシフェラーゼ遺伝子およびDHFR選択可能なマーカーを含有する生ずるプラスミドをプラスミドKZ10と表示した。本質的にGrahamおよびVan de Eb（Virol．52：456，1973、これをここに引用によって加える）により記載されているリン酸カルシウム沈澱法を使用して、BH K570細胞（ATCCから受け入れ番号CRL10314として入手可能）の中に、プラスミド KZ10トランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を成長培地（ 10％胎児仔ウシ血清および2.0 mmのＬ−グルタミンを含有するダルベッコ変性イーグル培地（DMEM））中で成長させた。非選択成長培地中で数日後、成長培地をメトトレキセート（HTX）選択培地（250 nMのMTXを含有する成長培地）と置換した。次いで細胞をコンフルエンシーに成長させた後、それらをトリプシン処理し、そして制限希釈で96ウェルのプレートのウェル中にプレートした。細胞をメトトレキセート選択培地中で１〜２週間成長させた。単一のコロニーを含有するウェルからのクローンを、後述するルシフェラーゼアッセイにおいてフォルスコリンに対して応答する能力についてアッセイした。フォルスコリンは細胞のcAMPレベルを増加し、こうして関連するcAMP依存性生物学的応答経路をレセプター独立的方法で増加する。フォルスコリンに対して応答することができるクローンをBHK/KZ10-20-48と表示した。Ｂ．卵巣カルシトニンレセプターcDNAの発現オリゴヌクレオチドのプライマーZC5468およびZC5471（それぞれ配列番号：17 および16）を卵巣カルシトニンレセプターcDNAの増幅のために使用し、そして３ ’EcoRＩ制限部位および５’NsiＩ制限部位を含有した。これらの制限部位を使用してボリメラーゼ連鎖反応発生クローンから卵巣cDNAを除去し、そしてpHolle xの対応する領域の中にDNA断片を挿入して、卵巣cDNA挿入をもつカルシトニンレセプターを含有する新しいプラスミドを生成した。卵巣クローンの２つの（６および７と表示した）をプールし、そしてEcoRＩおよびNsiＩで消化した。cDNA断片を切り出し、次いで分析し、そして2.5％アガロースゲルを使用して単離し、そして180塩基対であることが発見された。卵巣cDNA塩基対の断片のクローニングを促進するために、pNEB193（New England Biolabs）をEcoRＩおよびSmaＩで消化しそしてDNAポリメラーゼのクレノー断片を使用してプラスミドを平滑末端とすることによって、クローンpHollexのBgl II/BclＩ部分（1.5 kb）をクローニングベクターpNEB193の中に結合した。pNEB193 DNAをBamHＩで消化し、そしてpHollexのBgl II/BclＩ（BamHＩ適合性）断片と結合した。生ずるプラスミドpHollex／NEB193は、カルシトニンレセプターcDNAを取り囲む３’EcoRＩ制限部位および５’NsiＩ制限部位を有する。25μｇのプラスミドをEcoRＩおよびNsiＩで消化し、そして0.8％アガロースゲルを使用ずるゲル精製により4.5 kbの断片を単離した。生ずる断片を60μｌの水中に再懸濁させた。１μｌのほぼ50ng／μｌのpHollex；１μｌのほぼ10ng／μ ｌの卵巣カルシトニンレセプターcDNA；３μｌの10×結合緩衝液；３μｌのT4リガーゼ（New England Biolabs）および22μｌの水を含有する反応混合物中で、卵巣cDNAおよびpHollex線状化プラスミドを結合した。生ずるDNAペレットを５μ ｌの水中に再懸濁させ、そして１μｌの線状化DNAを使用して前述したようにELE CTROMAX DH10B大腸菌（E．coli）細胞をエレクトロポレイションした。細胞を10 00mg／mlのアンピシリンを含有するLBプレート上にプレートし、そして18コロニーを単離した。培養物をこれらのコロニーから成長させ、そしてプラスミドDNA を単離した。クローンをOvex １〜18と表示し、そして各クローンはゲル分析により1.5kbのインサートを含有することが示された。Ovex １および２の配列分析は、ポリメラーゼ連鎮反応の増幅により発生したもとの断片と同一のカルシトニンcDNAにおいて３５塩基対のインサートを明らかにした。 Ovex １および２を哺乳動物の発現ベクターZem228Rの中にサブクローニングした。ベクターZem228Rは実施例Ｉ．Ｉに記載するZem1698の前駆体である。プラスミドZem228RをEcoRＩで消化してベクターを線状化し、そして10×ニック翻訳緩衝液（0.5ＭのTris-HCl，pH7.5，0.1ＭのMgS0₄，１mMのジチオスレイトール、 500μｇ／mlのウシ血清アルブミン）、2.5 mMの各dNTP，５μｌのDNAポリメラーゼのクレノー断片（GIBCO-BRL）、10μｌほぼ20ng／μｌのプラスミドZem 228Rおよび50μｌの水を含有する反応混合物中で平滑末端とした。反応混合物を室温において１時間インキュベーションし、フェノールークロロホルム抽出し、そしてエタノール沈澱させた。DNAペレットを85μｌの水中に再懸濁させ、仔ウシアルカリ性ホスファターゼで処理し、そしてゲル精製した。OvexクローンをAs cＩおよびHind IIIで消化して、インサートからpNEB193断片を除去した。生ずる断片を1.5 kbとして同定され、そしてゲル精製した。1.5 kbのDNA断片を次の成分を含有する反応混合物中で平滑末端とした：10×ニック翻訳緩衝液；５μｌの DNAポリメラーゼのクレノー断片（GIBCO-BRL）、５μｌの2.5 mMのdNTPおよび60 μｌの水。反応混合物を室温において30分間インキュベーションし、そしてフェノール−クロロホルム抽出した。DNAをエタノール沈澱させ、そして10μｌの水中に再懸濁させた。平滑末端の線状化ベクターZem228Rおよび平滑末端のOvex cDNA断片を次の成分を含有する反応混合物中で結合した：１μｌのほぼ20ng／μｌの仔ウシアルカリ性ホスファターゼ処理Zem228R；３μｌの10×結合緩衝液（New England Biolabs ）；３μｌのリガーゼ（New England Biolabs）；５μｌのAscＩ／Hind III平滑末端Ovex断片および22μｌの水。結合混合物をフェノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈澱させ、そして５gmlの水中に再懸濁させた。１μｌの結合混合物を使用して、前述したように、ELECTROMAX DH10B大腸菌（E．coli）細胞をエレクトロポレイションした。結合−細胞混合物を１ｍｌのLBブロス中に再懸濁させ、そして100μｌ混合物を使用して100 ng／mlのアンピシリンを含有するLBプレートを接種した。 18のOvex／Zem228Rコロニーを単離し、そして４mlの50μｇ／ml のカナマイシンを含有する２×YTブロスの中に接種した。培養物を37℃においで一夜成長させた。18培養物のうちの８は成長し、そしてこれらのをプラスミドDN A源として使用した。プラスミドDNAをBamHＩで消化し、そしてゲル分析した。８クローンの各々は正しい大きさ（1.5 kb）のインサートを有した。プラスミドDNADNAをSalＩで消化しそしてゲル分析を使用することによって、O vex／Zem228Rの向きを決定した。pOvex／Zem228R4およびてpOvex／Zem228R5と表示するクローンは、正しい制限部位を有することが発見された。卵巣サブタイプヒトカルシトニンレセプターcDNA0vex／Zem228Rを、実施例II Ａに記載するように、細胞系BHK／KZ10-20-48中の発現させた。Ｃ．胎盤カルシトニンレセプターcDNAの発現ベクターpHollex／NEB193をNsiＩおよびEcoRＩで消化して、卵巣35塩基対のインサートに相当する領域を除去した。4.5 kbのDNA断片を単離しそして精製した。１μｌの50ng／μｌのEcoRＩ／NsiＩ pHollex／NEB193，30ng（１μｌ）の15 0塩基対のpla 14.6EcoRＩ／NsiＩ DNA断片、３μｌの10×リガーゼ緩衝液（500 mMのTris-HCl，pH7.8，100mMのMgC1₂，100mMのジチオスレイトール、10mMのATP および250μｇ／mlのBSA（New England Biolabs））；３μｌのリガーゼ（New E ngland Biolabs）および２２μｌの水を含有する混合物で結合反応混合物を調製した。この混合物を室温において３時間インキュベーションし、次いでフェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈澱を実施した。DNAを５μｌの水中に再懸濁させそして、前述したように、ELECTROMAX DH10B大腸菌（E．coli）細胞をエレクトロポレイションするために使用した。plaex１〜４と表示する４つのコロニーを単離しそして培養し、そしてプラスミドDNAを調製した。 DNAをニトロセルロースに移しそして前述したようにプロービングすることによって、インサートの大きさを確証した。９塩基対の胎盤のクローンのインサート（ZC5993；配列番号：20）をスパンするように設計したオリゴヌクレオチドからプローブを作った。５μｌの3.9 pmol／μｌのZC5993（配列番号：20）、10μ ｌの10×ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（New England Biolabs）、５μｌのポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs）、１μｌの150μCi／μｌの³² ＰガンマーATP（Amersham）および79μｌの水を含有する混合物中で、プローブを37℃において30分間インキュベーションすることによって放射線標識化した。マルチプライム（Multiprime）DNA標識化キット（Amersham）とともに準備された仕様書に従い、スペルミン／サケ血清DNAで沈澱することによって、組み込まれなかった放射線標識を除去した。ニトロセルロースのブロットを高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件において65℃において0.1×SSC／0. 5％SDS（Sambrookら、前掲）中でインキュベーションして、プラスミドpHollex を含有するが、胎盤インサートを含まないクローンにプローブがハイブリダイゼーションするのを排除した。すべて４つのplaexクローンはインサートを含有することが発見された。 plaex 3と表示する１つのクローンを哺乳動物の発現ベクターZem228Rの中にサブクローニングした。Zem228RをEcoRＩで消化ししてベクターを線状化しそして、前述したように、平滑末端とした。plaex 3プラスミドDNAをAscＩおよびHind IIIで消化して、pNEB193に相当するベクターの部分をプラスミドから除去した。生ずるDNA断片は1.5 kbと同定しそしてゲル精製した。前述したように、DN A断片を平滑末端とした。１μｌのほぼ20ng／μｌのリン酸化Zem228R，３μｌの10×結合緩衝液（New E ngland Biolabs）、３μｌのリガーゼ（New EnglandBiolabs）、５μｌの50ng／ μｌのAscＩ／Hind III平滑末端化plaexDNA断片および22μｌの水を含有する反応混合物中で、、平滑末端の線状化ベクターZem228Rおよび平滑末端のplaex DNA 断片を結合した。前述したように、結合および引き続くELECTROMAX DH10B大腸菌（E．coli）細胞のエレクトロボレイションを実施した。細胞混合物を１ｍｌのL Bブロス中に再懸濁させ、そして懸濁液の100μｌおよび900μｌのアリコートを使用して、50μｇ／mlのカナマイシンを含有するLBブロスを接種した。 137 mmの1.2μＭのナイロン膜（ICN）を使用しでplaex ３コロニーからフィルターを作った。フィルターを乾燥し、そして62.5mlの20×SSPE（175.3ｇのNaCl ，27.6NaH₂P0₄・Ｈ₂O，7.4ｇのEDTA，NaOHを添加してpH7.4としそして水を添加して１リットルとした）、25mlの50×デンハルト溶液；12.5mlの10％SDS（Sambr ookら、前掲）および144 mlの水を含有し、0.2 mg／mlの沸騰したサケ精子DNAを添加したハイブリダイゼーション溶液の中に入れた。この混合物を65℃において数時間インキュベーションした。鋳型としてpHollex／NEB193およびオリゴヌクレオチドZC5470およびZC5465（それぞれ、配列番号：22および23）からポリメラーゼ連鎖反応を使用してDNA配列を増幅することによって、プローブを作った。１ngの鋳型DNA，５μｌ（100 pmol）の各オリゴヌクレオチドZC5470およびZC546 5（それぞれ、配列番号：22および23）、５μｌの各2.5 mMのデオキシヌクレオチド三リン酸、５μｌの10×VENT_R緩衝液（New England Biolabs）、0.5μｌのV ENT_Rポリメラーゼ（New England Biolabs）および29.5μｌの水を含有する50μ ｌの反応混合物を構成した。ポリメラーゼ連鎖反応を94℃において90秒間、58℃において90秒間および72℃ において２分間２サイクル；94℃において45秒間、58℃において48秒間および72 ℃において２分間38サイクルで実施し；次いで72℃において７分間１サイクルで実施し、そして４℃において一夜貯蔵した。第２ポリメラーゼ連鎖反応を上の反応の生成物を鋳型として使用して実施した。反応混合物は１ngの鋳型DNA，10μｌ（200 pmol）の各オリゴヌクレオチドZC5 470およびZC5465（それぞれ、配列番号：22および23）、10μｌの各2.5 mMのデオキシヌクレオチド三リン酸、４μｌの10×VENT_R（EXO-）緩衝液（New England Biolabs）、29．５μｌの水およびワックスのビーズ（AMPLIWAX PCR GEM 100； Perkin Elmer、コネチカット州ノーウェーク）を含有した。反応混合物を80℃に加熱しそして製造業者の仕様書に従い反応を実施した。インキュベーション後、６μｌの10×VENT_R緩衝液（New EnglandBiolabs）、４μｌのVENT_R（EXO-）（Ne w England Biolabs）および50μｌの水を混合物に添加した。10の別々の反応混合物を調製した。ポリメラーゼ連鎖反応を94℃において45秒間、58℃において45 秒間、および72℃において２分間10サイクルで実施し；次いで72℃において７分間１サイクルで実施した。反応混合物をプールし、そしてセントリコン（Centri con）100（Amicon、マサチュセッツ州デンバー）中で製造業者の仕様書に従い遠心により精製した。27μｌの7.5Ｍの酢酸アンモニウム、55μｌのDNA上澄み液、 18μｌの水および100μｌの２−プロパノールを含有する反応混合物中で酢酸アンモニウム−２−プロパノール沈澱により、保持物（retentate）を精製した。反応混合物をエッペンドルフ・マイクロセントリフーグ（Eppendorf microcentr ifuge）中で14,000rpmで10分間遠心した。ペレットを187μｌの水中にほぼ50ng ／μｌの濃度に再懸濁させた。 10⁶cpm/mlのプローブを含有する100 mlのハイブリダイゼーション溶液にフィルターを添加した。インキュベーション後、フィルターを５回0.1×SSCおよび0. 5％SDS中で65℃において30分間／洗浄で洗浄した。６つの陽性コロニーが同定され、これらを単離し、そして100μｇ／mlのアンピシリンを添加した５ｍｌの２ ×YTブロスを接種した。プラスミドDNAを細胞から単離し、そしてBamHＩを使用ずる制限消化により分析した。すべての６つのクローンは1.5 kbの期待したインサートの大きさを有することが発見され、そしてクローンをplaex １，２，４と表示した。プラスミドDNAをNsiＩで消化することによってインサートの向きを決定し、そしてクローンのすべては転写のために正しい向きを有することが発見された。胎盤サブタイプヒトカルシトニンレセプターcDNA plaex１は、実施例IIＡに記載するように細胞系BHK/KZ10-20-48中で安定に発現された。Ｄ．全細胞中のルシフェラーゼおよびアデニレートシクラーゼ活性前述したように、pHollexまたはZem1698を使用して細胞系BHK／KZ10-20-48（Z em1698形質転換体を陰性の対照として使用した）をトランスフェクションした。前述したように、500μｇ／mlのG418−ネオマイシンおよび250 nMのメトトレキセートの両者を含有する成長培地中で、トランスフェクション体を選択した。トランスフェクション体を、三重反復実験において、選択した作用物質に対するCRE-ルシフェラーゼの応答の誘発についてアッセイした。２つのクローン、Ho llex１およびHollex２、、およびベクターZem1698（陰性の対照）を試験した。各ウェルが100μｌの選択培地中の2×10⁴細胞を含有するのように、ミクロライト（Microlite）平の底の組織培養プレート（Baxter Scientific Products、イリノイ州シカゴ）を構成し、そして細胞を一夜成長させた。次の成分を含有する２× 最終アッセイ濃度で５％血清を含むDMEM培地中で作用物質を調製した：10^-13〜1 0^-6Ｍのヒトカルシトニン（hCT）、サケカルシトニン（sCT）、ヒトカルシトニン遺伝子関係ペプチド（hCGRP）または20μＭのフォルスコリン（CalBiochem、カリフォルニア州サンディエゴ）。三重反復実験の試料のウェルにおいて、ウェルから古い培地を除去しそして10 0μｌの新鮮な成長培地および100μｌの各２×溶液を添加することによって、誘発を開始した。10％胎児仔ウシ血清を含有する100μｌのDMEMを添加した三重反復実験のウェルにおいて、未誘発レベルを決定した。プレートを37℃，５％ CO₂ において４時間インキュベーションして、ルシフェラーゼを誘発させた。誘発後、培地を除去し、そしてウェルを200μｌ／ウェルのPBSで１回洗浄した。洗浄後、20μｌのストック細胞培養溶解試薬（Luciferase Assay System，Pro mega Corp.、ウイスコンシン州マデイソン）の１：５希釈物（無菌の水中の）を各ウェルに添加し、そしてプレートを室温において15分間インキュベーションした。プレートをラブシステムス・ルミノスカン（Labsystems Luminoskan）マイクロタイター・ルミノメーター（Labsystems Inc．、イリノイ州モートングレイブ）に移し、これに40μｌのルシフェラーゼアッセイ基質（Luciferase Assay S ystem，Promega）を添加し、反応混合物を３秒間混合し、そしてルシフェラーゼシグナルを２秒間／ウェルで組込んだ。各作用物質についてのルシフェラーゼの誘発倍数を次のようにして計算した： Hollex１およびHollex２は、ヒトおよびサケのカルシトニンについてルシフェラーゼの５〜10倍の誘発を示した。対照ベクターのZem1698は述べた作用物質のいずれに対しても有意な応答を示さなかった。カルシトニンおよびフォルスコリンに対してトランスフェクション体のクローンHollex１およびHollex２のcAMP応答を、また、ラジオイムノアッセイによりcA MP〔 ¹²⁵Ｉ〕シンチレーション近位アッセイ系（Amersham）を製造業者の指示に従い使用してアッセイした。簡単に述べると、１×10⁵細胞／ウェルまたは３×1 0⁵細胞／ウェルを24ウェルの培養皿のウェルの中にプレートし，、そして選択培地中で２日間（１×10⁵細胞／ウェル）または一夜（３×10⁵細胞／ウェル）成長させた。カルシトニンおよびフォルスコリンをDMEM，10％胎児仔ウシ血清、10μ ＭのIBMX中で、それぞれ、0.0001〜1000nMおよび25μＭにおいて調製した。成長培地を200μｌ／ウェルの作用物質（カルジトニンまたはフォルスコリン）で置換した。細胞を作用物質とともに37℃において５％CO₂中で10分間インキュベーションした。インキュベーション後、800μｌの沸騰水を各ウェルに添加した。15分後、上澄み液を集め、そしてアセテート緩衝液（cAMP〔 ¹²⁵Ｉ〕シンチレーション近位アッセイ系（Amersham））中で１：５または１：40に希釈した。試料を製造業者が提供するプロトコールに従いトリエチルアミンおよび無水酢酸を使用してアセチル化した。各アセチル化試料の100μｌのアリコートを75μｌの¹²⁵Ｉ−cAMP，75μｌの抗スクシニルcAMP抗血清および75μｌのロバ抗ウサギIgG連結SPAビーズ（すべてのアッセイ溶液はcAMP）〔¹²⁵Ｉ〕シンチレーション近位アッセイ系（Amersham）中で提供された）とダイナテク（Dynatech）MICROLITE2プレートのウェル中で組み合わせた。トレーヲ密閉し、そして回転プラットフォーム震盪器で200 rpmにおいて連続的に震盪しながら一夜インキュベーションした。試料をパッカード・トップ・カウント・マイクロプレート・シンチレーション・カウター（Pakard T op Count Microplate Scintillation Counter）（Pakard Instrument Col.、コネチカット州メリデン）中でカウントした。２〜128 fmolのアセチル化cAMPの標準曲線をまた作成した。また、合計の¹²⁵Ｉ−cAMP結合および非特異的結合を決定した。飽和サケカルシトニン濃度（10〜100 nM）、およびHollex１について0.07nMおよびHollex２について0.04nMのED50においてサケカルシトニンを使用して、Holl ex１はcAMPレベルの12倍の誘発を示し、Hollex２はcAMPレベルの５倍の誘発を示した。Ｅ．Hollex１およびHollex２を使用する結合および競争アッセイクローンHollex１およびHollex２を、競争アッセイを使用してカルシトニンに結合するレセプター仲介能力について試験した。T47D細胞を陽性の対照として使用し、そしてZem1698でトランスフェクションしたBHK細胞を陰性の対照として使用した。細胞を24ウェルの細胞培養皿中で１×10⁵細胞／ウェルの密度にプレートし、そして37℃および５％CO₂において成長培地（前の実施例に記載した）中で48時間成長させた。細胞を結合培地（500 mlのRPMI1640（Sigma、ミゾリー州セントルイス）、１mg／mlのバシトラシン（Sigma）、および１mg／mlのBSA（Boehring er Mannheim）中ですすいで血清を除去した。放射線標識化¹²⁵Ｉ作用物質を含有する300μｌの結合培地および非標識化競合物の系統的希釈物（表１）を適当なウェルに添加した。細胞を室温において1.5時間インキュベーションし、次いでP BSで３回すすいで未組み込みの放射能を除去した。500μｌの0.25Ｎ NaOHを各ウェルに添加して細胞を可溶化した。試料を各ウェルから集め、そしてCPMをガンマカウンターでカウントした。 BIOSOFT （Cambridge、英国）からのKinetic，EBDA，Ligan，Loweryプログラムを製造業者の仕様書に従い使用して、データをエンターしそして計算した。追加の実験の結果を表２に要約する。上の結果が明瞭に示すように、ヒトカルシトニンレセプターのクローンはヒトカルシトニンおよびサケカルシトニンの両者に結合し、サケのペプチドに比較してヒトカルシトニンについての親和性はより大きい。Ｆ．plaexを使用する結合および競争アッセイ競争アッセイを使用して、plaex１を発現するトランスフェクション体のプールをカルシトニンに対するレセプター仲介結合について試験した。Hollex１を陽性の対照として使用し、そしてZem228RでトランスフェクションしたBHK細胞を陰性の対照として使用した。細胞を24ウェルの細胞培養皿中で１×10⁵細胞／ウェルの密度にプレートし、そして37℃および５％CO₂において成長培地（前の実施例に記載した）中で48時間成長させた。細胞を実施例IIＥに記載したように結合培地中ですすいだ。300 μｌの熱結合培地は10nMのhCTおよび５μCi／μｌの¹²⁵Ｉ hCTを含有した。非標識化hCTを１μＭの最終濃度に添加することによって寒冷競合を達成し、適当なウェルに添加した。細胞を室温において1.5時間インキュベーションした。組み込まれなかった放射能をPBSを使用する３回の洗浄により除去した。500μｌの１Ｎ NaOHを各ウェルに添加して細胞を可溶化した。各試料をガンマカウンターでカウントした。データを表３に表す。表３細胞系熱（cpm）熱／寒冷（cpm） plaex １ 80,000 38,000 Hollex１ 96,000 23,000 BHK/Zem228R 147 105 上の結果が明瞭に示すように、ヒト胎盤サブタイプカルシトニンレセプターを発現するBHKトランスフェクション体はヒトカルシトニンに結合する。Ｇ．三リン酸イノシトールのアッセイ pHollexからのカルシトニンレセプターを発現するBHK 570細胞またはモック−トランスフェクションされたBHK 570細胞を、24ウェルの組織培養皿の中に約200,0 00細胞／ウェルでプレートした。24時間後、10％胎児仔ウシ血清および4.0μCi ／μｌのmyo-（２−³Ｈ）イノシトール（比活性＝20Ci／mmol；Amersham）を含有する0.5mlのダルベッコ変性イーグル培地（DMEM，JRH Bioscience、カンサス州レネクサ）中でインキュベーションすることによって、各ウェル中の細胞を標識化した。24時間インキュベーションの終わりにおいて、10mMのLiClを含有する 20mMのHepes，pH7.0（Sigma ChemicalCo.）で緩衝化した１mlの前もって加温したDMEMで細胞を洗浄した。洗浄培地を吸引により除去し、そして900μｌの新鮮な緩衝化培地と置換した。細胞を37℃において５〜15分間インキュベーションした。インキュベーション後、適当な濃度の各作用物質または拮抗物質を三重反復実験のウェルに添加し、そして細胞を37℃において30分間インキュベーションした。細胞を氷上に配置することによって、反応を停止させた。培地の吸引後、細胞を次いで１mlの冷いDMEMおよび１mlの氷冷10％過塩素酸の添加により溶解した。 10分後、細胞リゼイトを500μｌ10mMのEDTA，pH7.0を含有する管に移した。試料を900μｌの60mMのHepeS緩衝液中の1.5 MのKOHの添加により中和し、そしてpH7 〜7.5に到達するまでKOH-Hepes溶液を滴々添加した。中和した試料を−20℃おいて一夜凍結した。凍結試料を融解し、そして沈澱を試料の中から外に沈降させた。５mlの各メタノールおよび１ＭのKHCO₃で順次に洗浄し、次いで15mlの水で洗浄したAMPREPミニカラムに上澄み液を適用した。試料を適用した後、貫流を集めた。カラムを１mlの水で４回洗浄し、そして各洗浄後に１mlの試料を集めた。リン酸イノシトールはカラムから４回の連続する１mlの0.25ＭのKHCO₃の適用により溶離され、各適用後に１mlの試料を集めた。10mlのOPTIFLUOR（Pakard Instru ment Co.、コネチカット州メンデン）を各試料に添加し、そして試料をカウントした。リン酸イノシトール経路の剌激は、標識化リン酸イノシトールのレベルの増加により示された。Hollex１におけるヒトカルシトニンについてのED₅₀は６nM であり、そしてサケカルシトニンについて9.5 nMであった。Hollex２は応答を示さなかった。Ｈ．カルシウム分析カルシトニンに対するHollex１の細胞内カルシウムの応答を、本質的にGrynki ewiczら（J．Biol．Chem．260：3440-3450，1985、引用によってここに加える）により記載されているようにアッセイした。トランスフェクション体を２ウェルのカバーガラスのチャンバー（NUNC）の中に５×10⁴ 細胞／チャンバーで接種した。細胞をG418およびメトトレキセートの選択培地中で通常の条件下に１〜３日間成長させた。培地を吸引により除去し、そしてチャンバーを１mlの画像形成（Imaging）緩衝液（140 mMのNaCl、10mMのHEPES，5. 6mMののグルコース、５mMのKCl，１mMのCaCl₂）で２回すすいだ。最後のすすぎ後、0.5 mlのFura-2AM溶液（50mgのfura-2AM（Molecular Probes ，Inc.、オレゴン州エウゲン）、50mlのDMSO、５mlの画像形成緩衝液）、細胞を暗所で室温において30分間インキュベーションした。インキュベーション後、Fu ra-2AM溶液を除去し、そして細胞を１mlの画像形成緩衝液で３回すすいだ。最後のすすぎ後、0.5 mlの緩衝液を各チャンバーの中に残した。細胞を暗所で室温において30〜120分間保持した。水銀アーク灯および10×および40×ニコン・フロウアー（Nikon Flour）ドライ対物レンズを装備したニコン・ダイアフォト（Nik on Diaphot）倒立蛍光検微鏡で、画像形成を実施した。サン・マイクロシステムス（Sun Microsystems）（カリフォルニア州マウンテンビュー）SPARC IIワークステーションンおよびイノビション（Inovision）（Research Triangle Park、ノースカロライナ州）RATIOTOOLソフトウェアを使用して、実験をコントロヘルしそして分析した。340 nmおよび380 nmのバンドパスフィルターを含有する自動化フィルターホイールを通してこのソフトウェアにより、別の励起波長をコントロールした。放射画像を二色性ミラー（380 nmのカットオフ）によりジェネシス（Genesis）II画像インテンシファイアーを装備したDage-MTI 72 CCDカメラに向け、そしてディジタル的に記録した。Hollex１細胞の30〜70％はカルシトニンに対するカルシウムの応答を有したことがデータにより示された。より少ないHollex２細胞は応答を示した（１〜５％）。プラスミドpHOLLEXは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（A merican Type Culture Collection）米国マリイランド州ロックビレ12301に受け入れ番号69067で1992年９月１日に、大腸菌（E．coli）XL−１ブルー形質転換体として受託された。実施例III クローニングされたカルシトニンレセプターを発現するBHK細胞を評価して、細胞外カルシウムに対してそれらの応答を決定した。高い純度の塩類（Aldrich 、ウイスコンシン州ミルウォーキー）および無菌の水（Bacter、イリノイ州マクグローパーク）を使用して調製した緩衝液（140 mMのNaCl，５mMのKCl，0.5mMの MgCl₂，0.5mMのCaCl_２（いくつかの実験において濃度を変化させた）、10mMのグルコース、10mMのHEPES，pH7.4）で細胞を数回洗浄した。細胞にfura-2AM（Mole cular Probes Inc．）（10μｇ／ml）を本質的に前述したように30分間負荷し、次いでさらに３回洗浄した。スライドを室温において倒立検微鏡（EPIPHTO，Nik on）に取り付け、そして細胞の場（典型的には20〜30細胞）を40×ニコン（Niko n）フルオル対物レンズで探した。340および380 nmの励起波長におけるfura-2放射の比を５秒毎に記録した。コンピューターのワークステーション（Sun Micros ystems）で比の画像形成のために設計したソフトウェアシステム（Inovision）を使用して、個々の細胞を分析した。カルシウム分析装置でカルシウムの標準に対して比較することによって、緩衝液中の塩化カルシウムの濃度を決定した。すべての実験は３〜８回再現した。式：カルシウム（nm）＝2240〔R-0.3〕／（20- R）〕を使用して計器を校正した後、fura-2比340 nm／380 nm値（Ｒ）を〔Ca²⁺〕_i濃度に変換した。基底〔Ca²⁺〕_i濃度は典型的には80〜150 nmであった。20nmのサケカルシトニンに暴露し、次いで25mMの塩化カルシウムに暴露した個々の細胞のピークfura-2比340／380をいくつかの実験について平均し、そして〔Ca²⁺〕_i濃度に変換した。標準誤差を99％のレベルで2.58（ｎ＞30）のＺスコアを使用して計算した。約700,000カルシトニンレセプター／細胞を発現する切断された形のBHK細胞系は、10〜20nmのサケまたはヒトのカルシトニンで最大の一時的〔Ca²⁺〕_i増加を示した。カルシトニンで前処理したか、あるいはしてない同一の細胞への25mMの細胞外塩化カルシウムの適用（紫外線への細胞の合計の暴露を減少するために５分の暗い期間後）は、急速なかつ持続した［Ca²⁺〕_i増加を生成した。後者の応答の大きさはカルシトニンにより誘発されたものに匹敵し、そしてカルシトニンの前処理により有意に変化しなかった（ｐ＜0.01）。25mMの細胞外塩化カルシウムに対する応答は約20分で増大した基底レベルに戻った。２分間の25mMの細胞外カルシウムの添加および引き続く細胞緩衝液による連続的洗浄は、〔Ca²⁺〕_iの急速なかつ一時的増加を生じた。CaCl₂の代わりに73mMのKClの添加は作用をもたなかった。 100,000および150,000レセブター／細胞のヒトカルシトニンレセプターのレベルを発現するトランスフェクションされたBHK細胞系を、また、アッセイした。両者の細胞系はカルシトニンおよび細胞外カルシウムに対して応答し、〔Ca²⁺〕_i を増加した。これらの細胞は、カルシトニン前処理による細胞外カルシウムに対する応答の顕著な増強を示した。対照のBHK細胞系は細胞外カルシウムに対する応答を示さなかった。カルシトニンおよび細胞外カルシウムの両者に対して応答する単細胞のピーク〔Ca²⁺〕_iを、カルシトニンレセプターを発現する各細胞系について平均した（±ｐ＜0.01におけるS．E．）。平均のピーク応答は所定の細胞系により発現される平均のレセプターの数／細胞に比例した。細胞外カルシウムに対する投与量の応答を700,000レセプター／細胞を発現する細胞系において特徴づけた。有意な応答は基底（1.3mM）を越えた２mM程度に少ない細胞外カルシウムの増加で観測され、そして最大の応答をほぼ14mMにおいて起こった。最大の半分の応答についての有効濃度は、細胞外カルシウム濃度／応答面積の明らかに線状の二重逆数プロットから各曲線の下で決定して８〜10mM であった。細胞外カルシウムのこれらの投与量−応答濃度は、単離された破骨細胞中の〔Ca²⁺〕_iの増大を誘発すると報告されたものに類似する。上の結果から明らかなように、本発明はクローニングされたヒトカルシトニンレセプターおよびクローニングされたレセプターを発現する細胞を提供する。クローニングされた配列を含有するベクターおよびそれらを発現する細胞は、なかでも、オステオポローシスおよび異常な骨の吸収により特徴づけられる他の疾患の処置および予防において有用な作用物質をスクリーニングおよび同定する方法において使用を見出す。さらに、本発明は、大規模の発現系から便利に、ヒトカルシトニンレセプターを製造する経済的方法を提供する。この明細書中で述べたすべての刊行物および特許出願は、本発明が関係する技術水準を示す。すべての刊行物、特許および特許出願は、各刊行物、特許および特許出願が特別にかつ個々に示されているのと同程度に引用によってここに加える。本発明を理解の明瞭さを目的として例示および実施例により多少詳細に説明したが、本発明の範囲内である種の変化および変更を行うことができることは明らかであろう。配列の列挙（１）一般情報：（ｉ）出願者：Moore，Emma E Sheppard，Paul O Kuestner，Rolf E （ii）発明の名称：ヒトカルシトニンレセプター（iii）配列の数：27 （iv）通信住所：（Ａ）住所：TOWNSEND AND TOWNSEND KHOURIE and CREW （Ｂ）通り：One Market Plaza，Steuart St．Tower， Twentieth Floor （Ｃ）市：San Francisco （Ｄ）州：CA （Ｅ）国：USA （Ｆ）郵便番号：94105-1492 （ｖ）コンピューター読取りフォーム：（Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：IBM PC compatible （Ｃ）操作システム：PC-DOS／MS-DOS （Ｄ）ソフトウェアー：PatentIn Release #1.0，Version #1.25 （vi）現出願データ：（Ａ）出願番号：US （Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（vii）従来の出願データ：（Ａ）出願番号：US 07／954,804 （Ｂ）出願日：30-SEP-1992 （viii）アトニー／エージエントの情報：（Ａ）名称：Parmelee，Steven W （Ｂ）登録番号：31,990 （Ｃ）参照／バケット番号：13952-15-1 （ix）電信情報：（Ａ）電話：206-467-9600 （Ｂ）テレファックス：415-543-5043 （２）配列番号１についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：3012個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：pHOLLEX （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／キー：CDS （Ｂ）位置：52..1476 （xi）配列：配列番号１：（２）配列番号２についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：474個のアミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（xi）配列：配列番号２：（２）配列番号３についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：71個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：ZC982 （xi）配列：配列番号３：（２）配列番号４についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：63個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：ZC983 （xi）配列：配列番号４：（２）配列番号５についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：33個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：ZC1773 （xi）配列：配列番号５：（２）配列番号６についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：33個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：ZC1774 （xi）配列：配列番号６：（２）配列番号７についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：38個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：ZC3507 （xi）配列：配列番号７：（２）配列番号８についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：46個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：ZC3510 （xi）配列：配列番号８：（２）配列番号９についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：42個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：ZC4418 （xi）配列：配列番号９：（２）配列番号10についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：42個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：ZC4419 （xi）配列：配列番号10：（２）配列番号11についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：26個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：ZC4698 （xi）配列：配列番号11：（２）配列番号12についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：26個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：ZC4699 （xi）配列：配列番号12：（２）配列番号13についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：11個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：ZC3168 （xi）配列：配列番号13：（２）配列番号14についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：11個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：ZC3169 （xi）配列：配列番号14：（２）配列番号15についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：44個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：ZC2938 （xi）配列：配列番号15：（２）配列番号16についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：21個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：ZC5471 （xi）配列：配列番号16：（２）配列番号17についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：22個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：ZC5468 （xi）配列：配列番号17：（２）配列番号18についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：22個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：ZC5469 （xi）配列：配列番号18：（２）配列番号19についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：22個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：ZC5474 （xi）配列：配列番号19：（２）配列番号20についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：35個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：ZC5993 （xi）配列：配列番号20：（２）配列番号21についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：53個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：ZC5162 （xi）配列：配列番号21：（２）配列番号22についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：21個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：ZC5470 （xi）配列：配列番号22：（２）配列番号23についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：21個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：ZC5465 （xi）配列：配列番号23：（２）配列番号24についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：3416個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：pOvex （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／キー：CDS （Ｂ）位置：52..594 （xi）配列：配列番号24：（２）配列番号25についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：180個のアミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（xi）配列：配列番号25：（２）配列番号26についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：3390個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：plaex （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／キー：CDS （Ｂ）位置：52..1485 （xi）配列：配列番号26：（２）配列番号27についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：477個のアミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（xi）配列：配列番号27：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者シェパード，ポールオー. アメリカ合衆国，ワシントン 98052，レッドモンド，ノースイーストセカンドストリート 20727 (72)発明者クエストナー，ロルフイー. アメリカ合衆国，ワシントン 98011，ボセル，ノースイーストワンハンドレッドセブンティエイトスストリート 9027

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトカルシトニンレセプターまたはそのポリペプチド断片をコードする単離されたポリヌクレオチド分子。２．ゲノムDNA配列またはｃDNA配列である、請求の範囲第１項記載のポリヌクレオチド。３．実質的に配列番号：１、配列番号：24、または配列番号：26のコード配列である、請求の範囲第１項記載のポリヌクレオチド。４．第１図のヒトカルシトニンレセプター（それぞれ、配列番号：１、配列番号：24、または配列番号：26）をコードする、請求の範囲第３項記載のポリヌクレオチド。５．次の作用可能に連鎖された要素：転写プロモーター；ヒトカルシトニンレセプターまたはそのポリペプチド断片をコードするDNA配列；および転写ターミネーター；からなるDNA構成体。６．DNA配列が第１図のヒトカルシトニンレセプター配列（配列番号：１、配列番号：24、または配列番号：26）をコードする、請求の範囲第５項記載のDNA 構成体。７．ヒトカルシトニンレセプターをコードするDNA配列が実質的に配列番号：１、配列番号：24、または配列番号：26のコード配列である、請求の範囲第５項記載のDNA構成体。８．次の作用可能に連鎖された要素：転写プロモーター；ヒト・カルシトニンレセプターまたはその断片をコードするDNA配列；および転写ターミネーター；からなるDNA構成体で形質転換またはトランスフェクションされた培養真核細胞。９．哺乳動物細胞である、請求の範囲第８項記載の真核細胞。 10．内因性ヒトカルシトニンレセプターを発現しない、請求の範囲第９項記載の真核細胞。 11．ヒトカルシトニンレセプターをコードするDNA配列が実質的に配列番号：１、配列番号：24、または配列番号：26のコード配列である、請求の範囲第８項記載の真核細胞。 12．DNA配列が第１図のヒトカルシトニンレセプター（配列番号：１、配列番号：24、または配列番号：26）をコード配列する、請求の範囲第８項記載の真核細胞。 13．作用可能に連鎖された転写プロモーター、ヒトカルシトニンレセプターをコードするDNA配列、および転写ターミネーターからなるDNA構成体で形質転換またはトランスフェクションされた真核細胞を、前記DNA配列が発現される条件下に、成長させることからなる、ヒトカルシトニンレセプターのポリペプチドを生産する方法。 14．ヒトカルシトニンレセプターを細胞から単離する工程をさらに含む、請求の範囲第13項記載の方法。 15．細胞が培養哺乳動物細胞である、請求の範囲第13項記載の方法。 16．カルシトニンレセプターをアフィニティー精製により単離する、請求の範囲第13項記載の方法。 17．請求の範囲第13項記載の方法に従い生産されたヒトカルシトニンレセプターのポリペプチド。 18．ヒトカルシトニンレセプターに特異的に結合するモノクローナル抗体。 19．精製されたヒトカルシトニンレセプターのポリペプチド。 20．第１図に従う配列（配列番号：１）を有する、請求の範囲第19項記載の精製されたヒトカルシトニンレセプターのポリペプチド。 21．474アミノ酸の長さを有する、請求の範囲第19項記載の精製されたヒトカルシトニンレセプターのポリペプチド。 22．配列番号：24に従う配列を有する、請求の範囲第19項記載の精製されたヒトカルシトニンレセプターのポリペプチド。 23．配列番号：26に従う配列を有する、請求の範囲第19項記載の精製されたヒトカルシトニンレセプターのポリペプチド。 24．180アミノ酸の長さを有する、請求の範囲第19項記載の精製されたヒトカルシトニンレセプターのポリペプチド。 25．477アミノ酸の長さを有する、請求の範囲第19項記載の精製されたヒトカルシトニンレセプターのポリペプチド。 26．化合物を組換えヒトカルシトニンレセプターのポリペプチドを発現する真核細胞とインキュベーションし、前記細胞の代謝をモニターし、そして前記細胞中のレセプター仲介代謝の前記化合物の作用を決定する、細胞中のヒトカルシトニンレセプター仲介代謝を変更する化合物を同定する方法。 27．化合物を細胞とヒトまたはサケのカルシトニンの存在下にインキュベーションする、請求の範囲第26項記載の方法。 28．真核細胞中でモニターした代謝がリン酸イノシトールの代謝である、請求の範囲第26項記載の方法。 29．下記工程：リガンドをヒトカルシトニンレセプターのリガンド結合ドメインに対して前記レセプターへの結合を可能とするために十分な時間の間暴露し、ここで前記リガンド結合ドメインは固体の支持体に固定されており、結合したリガンドおよびレセプターの複合体を分離し、そして結合したリガンドおよびレセプターの複合体を検出する、からなるヒトカルシトニンレセプターのリガンドを同定する方法。 30．前記リガンドが検出のために標識化されている、請求の範囲第29項記載の方法。