JP2000354494A - ダイオキシンレセプター遺伝子およびその利用 - Google Patents
ダイオキシンレセプター遺伝子およびその利用Info
- Publication number
- JP2000354494A JP2000354494A JP2000042475A JP2000042475A JP2000354494A JP 2000354494 A JP2000354494 A JP 2000354494A JP 2000042475 A JP2000042475 A JP 2000042475A JP 2000042475 A JP2000042475 A JP 2000042475A JP 2000354494 A JP2000354494 A JP 2000354494A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- dioxin
- leu
- dioxin receptor
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】ダイオキシン様物質の測定法に利用することの
できるダイオキシンレセプター遺伝子を提供すること。 【解決手段】下記(a)または(b)の蛋白質をコードする遺
伝子。 (a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるダイオ
キシンレセプター。 (b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において1もし
くは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加された
アミノ酸配列であって、配列番号1で示されるアミノ酸
配列に対して95%以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸
配列を有するダイオキシンレセプター。
できるダイオキシンレセプター遺伝子を提供すること。 【解決手段】下記(a)または(b)の蛋白質をコードする遺
伝子。 (a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるダイオ
キシンレセプター。 (b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において1もし
くは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加された
アミノ酸配列であって、配列番号1で示されるアミノ酸
配列に対して95%以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸
配列を有するダイオキシンレセプター。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、ダイオキシンレセ
プター遺伝子およびその利用に関する。
プター遺伝子およびその利用に関する。
【0002】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】一般
に、ポリ塩化ジベンゾ-p-ジオキシン(PCDD)およびポ
リ塩化ジベンゾフラン(PCDF)がダイオキシン類と総称さ
れ、これらにコプラナポリ塩化ビフェニル(PCB)を加え
た3種の化合物群がダイオキシン様物質と総称されてい
る。これらのダイオキシン様物質にはいずれも置換塩素
の数や位置によって数多くの構造異性体及び同族体が存
在するが、その一部は極めて微量でも生体内において生
殖異常、免疫異常、発癌などを惹起することから、住環
境や食品等の安全性評価の一環として、毒性を示すダイ
オキシン様物質を測定する試みがなされている。ダイオ
キシン様物質は、細胞内でダイオキシンレセプター(別
名:アリルハイドロカーボンレセプター(AhR)とも呼ば
れる。)(Mol.Pharmacol.,39,13-19(1991);Proc.Natl.
Acad.Sci.USA.,89,8185-8189(1992))に結合することに
よってその毒性を惹起する(Ann.Rev.Pharmacol.Toxico
l.,22,517-554(1982))。2,3,7,8-TCDD等のダイオキシ
ン様物質がダイオキシンレセプターに結合すると、該レ
セプターは活性化されて核内に移行した後、Arnt(Scie
nce,252,954-958(1991))と呼ばれる核タンパク質とヘ
テロ二量体を形成し、該二量体が染色体上のダイオキシ
ン応答配列[Dioxin responsive element(DRE);Xenobiot
ic responsive element(XRE)と呼ばれることもある。J.
Biol.Chem.,263,17221-17224(1988)]に結合することに
より、該配列の下流にある遺伝子の転写を活性化する。
そこで、該ダイオキシン応答配列の下流にダイオキシン
レセプター活性化能の指標となるレポーター遺伝子を結
合させ、これをダイオキシンレセプターを発現する細胞
に導入し、該細胞に被験物を接触させ培養した際の該レ
ポーター遺伝子の発現量を指標にすることにより、被験
物のダイオキシンレセプター活性化能を測定する方法が
提案されている(Fund.Appl.Toxicol.,30,194-203(199
6))。このような方法を用いて、種々の被験物のダイオ
キシンレセプター活性化能を測定することにより、ダイ
オキシン様の毒性を惹起し得る化学物質の検出が可能と
なることから、かかるダイオキシン様物質の測定法に利
用することのできるダイオキシンレセプター遺伝子の単
離が切望されている。
に、ポリ塩化ジベンゾ-p-ジオキシン(PCDD)およびポ
リ塩化ジベンゾフラン(PCDF)がダイオキシン類と総称さ
れ、これらにコプラナポリ塩化ビフェニル(PCB)を加え
た3種の化合物群がダイオキシン様物質と総称されてい
る。これらのダイオキシン様物質にはいずれも置換塩素
の数や位置によって数多くの構造異性体及び同族体が存
在するが、その一部は極めて微量でも生体内において生
殖異常、免疫異常、発癌などを惹起することから、住環
境や食品等の安全性評価の一環として、毒性を示すダイ
オキシン様物質を測定する試みがなされている。ダイオ
キシン様物質は、細胞内でダイオキシンレセプター(別
名:アリルハイドロカーボンレセプター(AhR)とも呼ば
れる。)(Mol.Pharmacol.,39,13-19(1991);Proc.Natl.
Acad.Sci.USA.,89,8185-8189(1992))に結合することに
よってその毒性を惹起する(Ann.Rev.Pharmacol.Toxico
l.,22,517-554(1982))。2,3,7,8-TCDD等のダイオキシ
ン様物質がダイオキシンレセプターに結合すると、該レ
セプターは活性化されて核内に移行した後、Arnt(Scie
nce,252,954-958(1991))と呼ばれる核タンパク質とヘ
テロ二量体を形成し、該二量体が染色体上のダイオキシ
ン応答配列[Dioxin responsive element(DRE);Xenobiot
ic responsive element(XRE)と呼ばれることもある。J.
Biol.Chem.,263,17221-17224(1988)]に結合することに
より、該配列の下流にある遺伝子の転写を活性化する。
そこで、該ダイオキシン応答配列の下流にダイオキシン
レセプター活性化能の指標となるレポーター遺伝子を結
合させ、これをダイオキシンレセプターを発現する細胞
に導入し、該細胞に被験物を接触させ培養した際の該レ
ポーター遺伝子の発現量を指標にすることにより、被験
物のダイオキシンレセプター活性化能を測定する方法が
提案されている(Fund.Appl.Toxicol.,30,194-203(199
6))。このような方法を用いて、種々の被験物のダイオ
キシンレセプター活性化能を測定することにより、ダイ
オキシン様の毒性を惹起し得る化学物質の検出が可能と
なることから、かかるダイオキシン様物質の測定法に利
用することのできるダイオキシンレセプター遺伝子の単
離が切望されている。
【0003】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる状
況の下、鋭意検討した結果、新たなダイオキシンレセプ
ター遺伝子を単離することに成功し、本発明に至った。
すなわち、本発明は、 1) 下記(a)または(b)の蛋白質をコードする遺伝子
(以下、本発明遺伝子と記す。)、 (a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるダイオ
キシンレセプター。 (b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において1もし
くは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加された
アミノ酸配列であって、配列番号1で示されるアミノ酸
配列に対して95%以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸
配列を有するダイオキシンレセプター。 2)配列番号2で示される塩基配列のうちの塩基番号4
0〜2577で表される塩基配列を有するダイオキシン
レセプター遺伝子、 3)本発明遺伝子を含有するベクター(以下、本発明ベ
クターと記す。) 4)宿主細胞内で複製可能なベクターに本発明遺伝子を
組込むことを特徴とするベクターの製造方法、 5)本発明遺伝子が宿主細胞に導入されてなる形質転換
体(以下、本発明形質転換体と記す。)、 6)本発明遺伝子を宿主細胞に導入することを特徴とす
る形質転換体の製造方法、 7)本発明形質転換体を培養してダイオキシンレセプタ
ーを産生させることを特徴とするダイオキシンレセプタ
ーの製造方法、 8)配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するダイオ
キシンレセプター、 9)配列番号1で示されるアミノ酸配列において1もし
くは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加された
アミノ酸配列であって、配列番号1で示されるアミノ酸
配列に対して95%以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸
配列を有するダイオキシンレセプター、 10)ダイオキシン応答配列を含む転写制御領域の下流
に連結されたレポーター遺伝子と本発明遺伝子とが宿主
細胞に導入されてなる形質転換体と、被験物とを接触さ
せ、該形質転換体における前記レポーター遺伝子の発現
量を測定する工程を含むことを特徴とする被験物のダイ
オキシンレセプター活性調節能の評価方法、 11)本発明のダイオキシンレセプターと被験物とを接
触させ保温する工程を含むことを特徴とするレセプター
バインディングアッセイを提供するものである。
況の下、鋭意検討した結果、新たなダイオキシンレセプ
ター遺伝子を単離することに成功し、本発明に至った。
すなわち、本発明は、 1) 下記(a)または(b)の蛋白質をコードする遺伝子
(以下、本発明遺伝子と記す。)、 (a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるダイオ
キシンレセプター。 (b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において1もし
くは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加された
アミノ酸配列であって、配列番号1で示されるアミノ酸
配列に対して95%以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸
配列を有するダイオキシンレセプター。 2)配列番号2で示される塩基配列のうちの塩基番号4
0〜2577で表される塩基配列を有するダイオキシン
レセプター遺伝子、 3)本発明遺伝子を含有するベクター(以下、本発明ベ
クターと記す。) 4)宿主細胞内で複製可能なベクターに本発明遺伝子を
組込むことを特徴とするベクターの製造方法、 5)本発明遺伝子が宿主細胞に導入されてなる形質転換
体(以下、本発明形質転換体と記す。)、 6)本発明遺伝子を宿主細胞に導入することを特徴とす
る形質転換体の製造方法、 7)本発明形質転換体を培養してダイオキシンレセプタ
ーを産生させることを特徴とするダイオキシンレセプタ
ーの製造方法、 8)配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するダイオ
キシンレセプター、 9)配列番号1で示されるアミノ酸配列において1もし
くは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加された
アミノ酸配列であって、配列番号1で示されるアミノ酸
配列に対して95%以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸
配列を有するダイオキシンレセプター、 10)ダイオキシン応答配列を含む転写制御領域の下流
に連結されたレポーター遺伝子と本発明遺伝子とが宿主
細胞に導入されてなる形質転換体と、被験物とを接触さ
せ、該形質転換体における前記レポーター遺伝子の発現
量を測定する工程を含むことを特徴とする被験物のダイ
オキシンレセプター活性調節能の評価方法、 11)本発明のダイオキシンレセプターと被験物とを接
触させ保温する工程を含むことを特徴とするレセプター
バインディングアッセイを提供するものである。
【0004】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明遺伝子としては、例えば、配列番号1で示
されるアミノ酸配列を有するダイオキシンレセプターを
コードする遺伝子、配列番号1で示されるアミノ酸配列
において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もし
くは付加されたアミノ酸配列であって、配列番号1で示
されるアミノ酸配列に対して95%以上のアミノ酸同一性
を示すアミノ酸配列を有するダイオキシンレセプターを
コードする遺伝子をあげることができる。より具体的な
本発明遺伝子の例としては、配列番号2で示される塩基
配列のうちの塩基番号40〜2577で表される塩基配
列を有するダイオキシンレセプター遺伝子をあげること
ができる。ここで、「配列番号1に示されるアミノ酸配
列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、も
しくは付加されたアミノ酸配列であって、配列番号1で
示されるアミノ酸配列に対して95%以上のアミノ酸同一
性を示すアミノ酸配列を有するダイオキシンレセプタ
ー」とは、配列番号1で示されるアミノ酸配列を有する
ダイオキシンレセプターと実質的に同等のレセプター機
能を有する蛋白質である。レセプター機能は、例えば、
後述のレポーターアッセイやレセプターバインディング
アッセイ等に基づき評価することができる。また、「数
個」とは、2〜約40個、好ましくは、2〜約20個、
更に好ましくは2〜約10個程度である。上記のようなア
ミノ酸の欠失、置換、付加には、人為的に導入され得る
アミノ酸変異に加えて、動物の系統、個体、器官、組織
等の違いに基づくアミノ酸配列の差異などの天然に生ず
る多型変異も含まれる。このような蛋白質をコードする
遺伝子としては、例えば、部位特異的変異導入法や突然
変異処理等によって、天然の遺伝子に変異を導入するこ
とにより作出された遺伝子であってもよいし、天然の遺
伝子であってもよい。
する。本発明遺伝子としては、例えば、配列番号1で示
されるアミノ酸配列を有するダイオキシンレセプターを
コードする遺伝子、配列番号1で示されるアミノ酸配列
において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もし
くは付加されたアミノ酸配列であって、配列番号1で示
されるアミノ酸配列に対して95%以上のアミノ酸同一性
を示すアミノ酸配列を有するダイオキシンレセプターを
コードする遺伝子をあげることができる。より具体的な
本発明遺伝子の例としては、配列番号2で示される塩基
配列のうちの塩基番号40〜2577で表される塩基配
列を有するダイオキシンレセプター遺伝子をあげること
ができる。ここで、「配列番号1に示されるアミノ酸配
列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、も
しくは付加されたアミノ酸配列であって、配列番号1で
示されるアミノ酸配列に対して95%以上のアミノ酸同一
性を示すアミノ酸配列を有するダイオキシンレセプタ
ー」とは、配列番号1で示されるアミノ酸配列を有する
ダイオキシンレセプターと実質的に同等のレセプター機
能を有する蛋白質である。レセプター機能は、例えば、
後述のレポーターアッセイやレセプターバインディング
アッセイ等に基づき評価することができる。また、「数
個」とは、2〜約40個、好ましくは、2〜約20個、
更に好ましくは2〜約10個程度である。上記のようなア
ミノ酸の欠失、置換、付加には、人為的に導入され得る
アミノ酸変異に加えて、動物の系統、個体、器官、組織
等の違いに基づくアミノ酸配列の差異などの天然に生ず
る多型変異も含まれる。このような蛋白質をコードする
遺伝子としては、例えば、部位特異的変異導入法や突然
変異処理等によって、天然の遺伝子に変異を導入するこ
とにより作出された遺伝子であってもよいし、天然の遺
伝子であってもよい。
【0005】本発明遺伝子は、例えば、モルモット等の
動物の組織から、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis
著;モレキュラー クローニング第2版(Molecular Clo
ning 2nd edition)、コールドスプリング ハーバー ラ
ボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)発行、
1989年等に記載の遺伝子工学的方法に準じて取得す
ることができる。具体的には、まず、モルモット等の動
物の組織由来のRNAを調製する。例えば、肝臓や皮膚
等のモルモット組織を塩酸グアニジンやグアニジンチオ
シアネート等の強力な蛋白質変性剤を含む溶液中で粉砕
し、さらに該粉砕物にフェノール、クロロホルム等を加
えることにより蛋白質を変性させる。変性蛋白質を遠心
分離等により除去した後、回収された上清画分から塩酸
グアニジン/フェノール法、SDS−フェノール法、グ
アニジンチオシアネート/CsCl法等の方法により全
RNAを抽出する。なお、これらの方法に基づいた市販
のキットとしては、例えばISOGEN(ニッポンジーン製)
がある。得られた全RNAを鋳型としてオリゴdTプラ
イマーをRNAのポリA配列にアニールさせ、逆転写酵
素により一本鎖cDNAを合成し、該一本鎖cDNAを
鋳型とし、かつ大腸菌RNaseHを用いてRNA鎖に
ニックとギャップを入れることにより得られるRNAを
プライマーとして大腸菌のDNAポリメラーゼIを用い
て二本鎖のcDNAを合成する。更に該cDNAの両末
端をT4 DNAポリメラーゼにより平滑化する。得ら
れた二本鎖cDNAはフェノール、クロロホルム抽出、
エタノール沈殿等の通常の方法により精製、回収する。
なお、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、
例えばcDNA合成システムプラス(アマシャム社製)
やTimeSaver cDNA合成キット(アマシャムファルマシア
製)等があげられる。次に、得られた二本鎖cDNAを
例えば、プラスミドpUC118やファージλgt10などのベク
ターにリガーゼを用いて挿入することによりcDNAラ
イブラリーを作製する。このようなcDNAライブラリ
ーから、例えば、配列番号2で示される塩基配列の部分
塩基配列を有するDNAをプローブとして用いるハイブ
リダイゼーション法や、配列番号2で示される塩基配列
の部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして用いるポリメラーゼチェイン反応(以下、PC
Rと記す。)により、本発明遺伝子を取得することがで
きる。PCRに用いるプライマーとしては、例えば、約
20bpから約40bp程度の長さでかつGまたはC塩基の割合が
約40%から約60%程度の塩基配列を、配列番号2で示され
る塩基配列の5’非翻訳領域および3’非翻訳領域から
それぞれ選択し、該塩基配列に基づいてオリゴヌクレオ
チドを設計し合成するとよい。具体的には、例えばフォ
ワードプライマーとしては配列番号3で示される塩基配
列からなるオリゴヌクレオチドをあげることができ、リ
バースプライマーとしては配列番号4で示される塩基配
列からなるオリゴヌクレオチドをあげることができる。
このようにして得られる本発明遺伝子は、例えば、J.Sa
mbrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著;モレキュラー クロ
ーニング第2版(Molecular Cloning 2nd edition)、
コールドスプリング ハーバー ラボラトリー(Cold Spr
ing Harbor Laboratory)発行、1989年等に記載の
遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングする
ことができる。具体的には例えば、TAクローニングキッ
ト(Invitrogen社)やpBluescriptII(Stratagene社)
などの市販のプラスミドベクターを用いてクローニング
することができる。尚、本発明遺伝子は、配列番号2で
示される塩基配列に基づいて、例えばホスファイト・ト
リエステル法(Hunkapiller,M.et al., Nature, 310, 1
05, 1984)等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を
行うことにより調製することもできる。本発明遺伝子の
塩基配列は、Maxam Gilbert法 (例えば、Maxam,A.M &
W.Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 560, 1977
等に記載される)やSanger法(例えばSanger,F. & A.R.C
oulson, J.Mol.Biol., 94, 441, 1975、Sanger,F, & Ni
cklen and A.R.Coulson., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 7
4, 5463, 1977等に記載される)により確認することが
できる。
動物の組織から、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis
著;モレキュラー クローニング第2版(Molecular Clo
ning 2nd edition)、コールドスプリング ハーバー ラ
ボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)発行、
1989年等に記載の遺伝子工学的方法に準じて取得す
ることができる。具体的には、まず、モルモット等の動
物の組織由来のRNAを調製する。例えば、肝臓や皮膚
等のモルモット組織を塩酸グアニジンやグアニジンチオ
シアネート等の強力な蛋白質変性剤を含む溶液中で粉砕
し、さらに該粉砕物にフェノール、クロロホルム等を加
えることにより蛋白質を変性させる。変性蛋白質を遠心
分離等により除去した後、回収された上清画分から塩酸
グアニジン/フェノール法、SDS−フェノール法、グ
アニジンチオシアネート/CsCl法等の方法により全
RNAを抽出する。なお、これらの方法に基づいた市販
のキットとしては、例えばISOGEN(ニッポンジーン製)
がある。得られた全RNAを鋳型としてオリゴdTプラ
イマーをRNAのポリA配列にアニールさせ、逆転写酵
素により一本鎖cDNAを合成し、該一本鎖cDNAを
鋳型とし、かつ大腸菌RNaseHを用いてRNA鎖に
ニックとギャップを入れることにより得られるRNAを
プライマーとして大腸菌のDNAポリメラーゼIを用い
て二本鎖のcDNAを合成する。更に該cDNAの両末
端をT4 DNAポリメラーゼにより平滑化する。得ら
れた二本鎖cDNAはフェノール、クロロホルム抽出、
エタノール沈殿等の通常の方法により精製、回収する。
なお、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、
例えばcDNA合成システムプラス(アマシャム社製)
やTimeSaver cDNA合成キット(アマシャムファルマシア
製)等があげられる。次に、得られた二本鎖cDNAを
例えば、プラスミドpUC118やファージλgt10などのベク
ターにリガーゼを用いて挿入することによりcDNAラ
イブラリーを作製する。このようなcDNAライブラリ
ーから、例えば、配列番号2で示される塩基配列の部分
塩基配列を有するDNAをプローブとして用いるハイブ
リダイゼーション法や、配列番号2で示される塩基配列
の部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして用いるポリメラーゼチェイン反応(以下、PC
Rと記す。)により、本発明遺伝子を取得することがで
きる。PCRに用いるプライマーとしては、例えば、約
20bpから約40bp程度の長さでかつGまたはC塩基の割合が
約40%から約60%程度の塩基配列を、配列番号2で示され
る塩基配列の5’非翻訳領域および3’非翻訳領域から
それぞれ選択し、該塩基配列に基づいてオリゴヌクレオ
チドを設計し合成するとよい。具体的には、例えばフォ
ワードプライマーとしては配列番号3で示される塩基配
列からなるオリゴヌクレオチドをあげることができ、リ
バースプライマーとしては配列番号4で示される塩基配
列からなるオリゴヌクレオチドをあげることができる。
このようにして得られる本発明遺伝子は、例えば、J.Sa
mbrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著;モレキュラー クロ
ーニング第2版(Molecular Cloning 2nd edition)、
コールドスプリング ハーバー ラボラトリー(Cold Spr
ing Harbor Laboratory)発行、1989年等に記載の
遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングする
ことができる。具体的には例えば、TAクローニングキッ
ト(Invitrogen社)やpBluescriptII(Stratagene社)
などの市販のプラスミドベクターを用いてクローニング
することができる。尚、本発明遺伝子は、配列番号2で
示される塩基配列に基づいて、例えばホスファイト・ト
リエステル法(Hunkapiller,M.et al., Nature, 310, 1
05, 1984)等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を
行うことにより調製することもできる。本発明遺伝子の
塩基配列は、Maxam Gilbert法 (例えば、Maxam,A.M &
W.Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 560, 1977
等に記載される)やSanger法(例えばSanger,F. & A.R.C
oulson, J.Mol.Biol., 94, 441, 1975、Sanger,F, & Ni
cklen and A.R.Coulson., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 7
4, 5463, 1977等に記載される)により確認することが
できる。
【0006】本発明遺伝子を、該遺伝子が導入される宿
主細胞において利用可能なベクター(以下、基本ベクタ
ーと記す。)、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情
報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主細胞
からの単離、精製が可能であり、検出可能なマーカーを
もつベクター等に、通常の遺伝子工学的手法に準じて組
み込むことにより本発明ベクターを構築することができ
る。本発明ベクターの構築に用いることができる基本ベ
クターとしては、具体的には微生物である大腸菌を宿主
細胞とする場合、例えばプラスミドpUC119(宝酒造
(株)製)や、ファージミドpBluescriptII(ストラタジ
ーン社製)等をあげることができる。出芽酵母を宿主細
胞とする場合は、プラスミドpACT2(Clontech社製)など
をあげることができる。また、哺乳類動物細胞を宿主細
胞とする場合はpRC/RSVもしくはpRC/CMV(いずれもInvit
rogen社製)等のプラスミド、ウシパピローマウイルスプ
ラスミドpBPV(アマシャムファルマシア社製)もしくはEB
ウイルスプラスミドpCEP4(Invitrogen社製)等のウイル
ス由来の自律複製起点を含むベクター、ワクシニアウイ
ルス等のウイルスベクターなどをあげることができ、昆
虫類動物細胞(以下、昆虫細胞と記す。)を宿主細胞と
する場合には、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスをあ
げることができる。自律複製起点を含むベクター、例え
ば、上記の酵母用プラスミドpACT2や、ウシパピローマ
ウイルスプラスミドpBPV、EBウイルスプラスミドpCEP4
などを用いて本発明ベクターを構築すると、該ベクター
は宿主細胞に導入された際にエピソームとして細胞内に
保持される。バキュロウイルスやワクシニアウイルス等
のウイルスに本発明遺伝子を組み込むには、使用しよう
とするウイルスのゲノムと相同な塩基配列を含有するト
ランスファーベクターを用いることができる。このよう
なトランスファーベクターの具体的例としては、Pharmi
ngen社から市販されているpVL1392,pVL1393(Smith,G.
E.,Summers M.D.et al.:Mol.Cell.Biol.,3,2156-2165(1
983))、pSFB5(Funahashi,S.et al.:J.Virol.,65,5584-5
588(1991))などのプラスミドをあげることができる。本
発明遺伝子を前記のようなトランスファーベクターに挿
入し、該トランスファーベクターとウイルスのゲノムと
を同時に宿主細胞に導入すると、トランスファーベクタ
ーとウイルスのゲノムとの間で相同組換えが起こり、本
発明遺伝子がくみこまれたウイルスのゲノムを得ること
ができる。ウイルスのゲノムとしては、Baculovirus,Ad
enovirus,Vacciniavirusなどのゲノムを用いることがで
きる。より具体的には、例えばバキュロウイルスに本発
明遺伝子を組み込む場合、トランスファーベクターpVL1
393,pVL1392等のマルチクローニング部位に本発明遺伝
子を挿入した後、本発明遺伝子が挿入されたトランスフ
ァーベクターのDNAとBaculovirus genome DNA(Bacul
ogold;Pharmingen社製)とを昆虫細胞Sf21株(ATCCから
入手可能)に燐酸カルシウム法等により導入し、得られ
た細胞を培養する。培養液から遠心分離等により、本発
明遺伝子が挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイ
ルス粒子を回収し、これをフェノール等で除蛋白処理す
ることにより、本発明遺伝子を含有するウイルスのゲノ
ムを得ることができる。さらに、該ウイルスのゲノム
を、昆虫細胞Sf21株などのウイルス粒子形成能を有する
宿主細胞に燐酸カルシウム法等により導入し、得られる
細胞を培養することにより、本発明遺伝子を含有するウ
イルス粒子を増やすことができる。一方、マウス白血病
レトロウイルスなどの比較的小さなゲノムへは、トラン
スファーベクターを利用せずに、本発明遺伝子を直接組
み込むこともできる。例えばウイルスベクターDC
(X)(Eli Gilboa et al.,BioTechniques,4,504-512
(1986))のクローニング部位に本発明遺伝子を組み込
む。得られた本発明遺伝子の組込まれたウイルスベクタ
ーを、例えばAmpli-GPE(J.Virol.,66,3755(1992))な
どのパッケージング細胞に導入することにより、本発明
遺伝子の挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイル
ス粒子を得ることができる。
主細胞において利用可能なベクター(以下、基本ベクタ
ーと記す。)、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情
報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主細胞
からの単離、精製が可能であり、検出可能なマーカーを
もつベクター等に、通常の遺伝子工学的手法に準じて組
み込むことにより本発明ベクターを構築することができ
る。本発明ベクターの構築に用いることができる基本ベ
クターとしては、具体的には微生物である大腸菌を宿主
細胞とする場合、例えばプラスミドpUC119(宝酒造
(株)製)や、ファージミドpBluescriptII(ストラタジ
ーン社製)等をあげることができる。出芽酵母を宿主細
胞とする場合は、プラスミドpACT2(Clontech社製)など
をあげることができる。また、哺乳類動物細胞を宿主細
胞とする場合はpRC/RSVもしくはpRC/CMV(いずれもInvit
rogen社製)等のプラスミド、ウシパピローマウイルスプ
ラスミドpBPV(アマシャムファルマシア社製)もしくはEB
ウイルスプラスミドpCEP4(Invitrogen社製)等のウイル
ス由来の自律複製起点を含むベクター、ワクシニアウイ
ルス等のウイルスベクターなどをあげることができ、昆
虫類動物細胞(以下、昆虫細胞と記す。)を宿主細胞と
する場合には、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスをあ
げることができる。自律複製起点を含むベクター、例え
ば、上記の酵母用プラスミドpACT2や、ウシパピローマ
ウイルスプラスミドpBPV、EBウイルスプラスミドpCEP4
などを用いて本発明ベクターを構築すると、該ベクター
は宿主細胞に導入された際にエピソームとして細胞内に
保持される。バキュロウイルスやワクシニアウイルス等
のウイルスに本発明遺伝子を組み込むには、使用しよう
とするウイルスのゲノムと相同な塩基配列を含有するト
ランスファーベクターを用いることができる。このよう
なトランスファーベクターの具体的例としては、Pharmi
ngen社から市販されているpVL1392,pVL1393(Smith,G.
E.,Summers M.D.et al.:Mol.Cell.Biol.,3,2156-2165(1
983))、pSFB5(Funahashi,S.et al.:J.Virol.,65,5584-5
588(1991))などのプラスミドをあげることができる。本
発明遺伝子を前記のようなトランスファーベクターに挿
入し、該トランスファーベクターとウイルスのゲノムと
を同時に宿主細胞に導入すると、トランスファーベクタ
ーとウイルスのゲノムとの間で相同組換えが起こり、本
発明遺伝子がくみこまれたウイルスのゲノムを得ること
ができる。ウイルスのゲノムとしては、Baculovirus,Ad
enovirus,Vacciniavirusなどのゲノムを用いることがで
きる。より具体的には、例えばバキュロウイルスに本発
明遺伝子を組み込む場合、トランスファーベクターpVL1
393,pVL1392等のマルチクローニング部位に本発明遺伝
子を挿入した後、本発明遺伝子が挿入されたトランスフ
ァーベクターのDNAとBaculovirus genome DNA(Bacul
ogold;Pharmingen社製)とを昆虫細胞Sf21株(ATCCから
入手可能)に燐酸カルシウム法等により導入し、得られ
た細胞を培養する。培養液から遠心分離等により、本発
明遺伝子が挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイ
ルス粒子を回収し、これをフェノール等で除蛋白処理す
ることにより、本発明遺伝子を含有するウイルスのゲノ
ムを得ることができる。さらに、該ウイルスのゲノム
を、昆虫細胞Sf21株などのウイルス粒子形成能を有する
宿主細胞に燐酸カルシウム法等により導入し、得られる
細胞を培養することにより、本発明遺伝子を含有するウ
イルス粒子を増やすことができる。一方、マウス白血病
レトロウイルスなどの比較的小さなゲノムへは、トラン
スファーベクターを利用せずに、本発明遺伝子を直接組
み込むこともできる。例えばウイルスベクターDC
(X)(Eli Gilboa et al.,BioTechniques,4,504-512
(1986))のクローニング部位に本発明遺伝子を組み込
む。得られた本発明遺伝子の組込まれたウイルスベクタ
ーを、例えばAmpli-GPE(J.Virol.,66,3755(1992))な
どのパッケージング細胞に導入することにより、本発明
遺伝子の挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイル
ス粒子を得ることができる。
【0007】本発明遺伝子の上流に、宿主細胞で機能可
能なプロモーターを機能可能な形で結合させ、これを上
述のような基本ベクターに組み込むことにより、本発明
遺伝子を宿主細胞で発現させることの可能な本発明ベク
ターを構築することができる。ここで、「機能可能な形
で結合させる」とは、本発明遺伝子が導入される宿主細
胞においてプロモーターの制御下に本発明遺伝子が発現
されるように、該プロモーターと本発明遺伝子とを結合
させることを意味する。宿主細胞で機能可能なプロモー
ターとしては、導入される宿主細胞内でプロモーター活
性を示すDNAをあげることができる。例えば、宿主細
胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペロ
ンのプロモーター(lacP)、トリプトファンオペロンの
プロモーター(trpP)、アルギニンオペロンのプロモータ
ー(argP)、ガラクトースオペロンのプロモーター(gal
P)、tacプロモーター、T7プロモーター、T3プロモータ
ー、λファージのプロモーター(λ-pL、λ-pR)等をあげ
ることができ、宿主細胞が動物細胞や分裂酵母である場
合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモータ
ー、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、シミア
ンウイルス(SV40)の初期または後期プロモーター、マウ
ス乳頭腫ウイルス(MMTV)プロモーター等をあげることが
できる。宿主細胞が出芽酵母である場合にはADH1プロモ
ーターなどをあげることができる。また、宿主細胞にお
いて機能可能なプロモーターをあらかじめ保有するベク
ターを使用する場合には、ベクター保有のプロモーター
と本発明遺伝子とが機能可能な形で結合するように、該
プロモーターの下流に本発明遺伝子を挿入すればよい。
例えば、前述のプラスミドpRC/RSV,pRC/CMV等は、動物
細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニング部
位が設けられており、該クローニング部位に本発明遺伝
子を挿入し動物細胞へ導入することにより、本発明遺伝
子を発現させることができる。これらのプラスミドには
あらかじめSV40の自律複製起点(ori)が組み込まれて
いるため、oriを欠失したSV40ゲノムで形質転換された
培養細胞、例えばCOS細胞等に該プラスミドを導入する
と、細胞内でプラスミドのコピー数が非常に増大し、結
果として該プラスミドに組み込まれた本発明遺伝子を大
量発現させることもできる。また前述の酵母用プラスミ
ドpACT2はADH1プロモーターを有しており、該プラスミ
ドまたはその誘導体のADH1プロモーターの下流に本発明
遺伝子を挿入すれば、本発明遺伝子を例えばCG1945(Clo
ntech社製)等の出芽酵母内で大量発現させることが可能
な本発明ベクターが構築できる。
能なプロモーターを機能可能な形で結合させ、これを上
述のような基本ベクターに組み込むことにより、本発明
遺伝子を宿主細胞で発現させることの可能な本発明ベク
ターを構築することができる。ここで、「機能可能な形
で結合させる」とは、本発明遺伝子が導入される宿主細
胞においてプロモーターの制御下に本発明遺伝子が発現
されるように、該プロモーターと本発明遺伝子とを結合
させることを意味する。宿主細胞で機能可能なプロモー
ターとしては、導入される宿主細胞内でプロモーター活
性を示すDNAをあげることができる。例えば、宿主細
胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペロ
ンのプロモーター(lacP)、トリプトファンオペロンの
プロモーター(trpP)、アルギニンオペロンのプロモータ
ー(argP)、ガラクトースオペロンのプロモーター(gal
P)、tacプロモーター、T7プロモーター、T3プロモータ
ー、λファージのプロモーター(λ-pL、λ-pR)等をあげ
ることができ、宿主細胞が動物細胞や分裂酵母である場
合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモータ
ー、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、シミア
ンウイルス(SV40)の初期または後期プロモーター、マウ
ス乳頭腫ウイルス(MMTV)プロモーター等をあげることが
できる。宿主細胞が出芽酵母である場合にはADH1プロモ
ーターなどをあげることができる。また、宿主細胞にお
いて機能可能なプロモーターをあらかじめ保有するベク
ターを使用する場合には、ベクター保有のプロモーター
と本発明遺伝子とが機能可能な形で結合するように、該
プロモーターの下流に本発明遺伝子を挿入すればよい。
例えば、前述のプラスミドpRC/RSV,pRC/CMV等は、動物
細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニング部
位が設けられており、該クローニング部位に本発明遺伝
子を挿入し動物細胞へ導入することにより、本発明遺伝
子を発現させることができる。これらのプラスミドには
あらかじめSV40の自律複製起点(ori)が組み込まれて
いるため、oriを欠失したSV40ゲノムで形質転換された
培養細胞、例えばCOS細胞等に該プラスミドを導入する
と、細胞内でプラスミドのコピー数が非常に増大し、結
果として該プラスミドに組み込まれた本発明遺伝子を大
量発現させることもできる。また前述の酵母用プラスミ
ドpACT2はADH1プロモーターを有しており、該プラスミ
ドまたはその誘導体のADH1プロモーターの下流に本発明
遺伝子を挿入すれば、本発明遺伝子を例えばCG1945(Clo
ntech社製)等の出芽酵母内で大量発現させることが可能
な本発明ベクターが構築できる。
【0008】構築された本発明ベクターを宿主細胞に導
入することにより、本発明形質転換体を取得することが
できる。本発明ベクターを宿主細胞へ導入する方法とし
ては、宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用すること
ができる。例えば、微生物である大腸菌を宿主細胞とす
る場合は、「モレキュラー・クローニング」(J.Sambrook
ら、コールド・スプリング・ハーバー、1989年)等
に記載される塩化カルシウム法やエレクトロポレーショ
ン法等の通常の方法を用いることができる。また、哺乳
類動物細胞または昆虫細胞を宿主細胞とする場合は、例
えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレ
クトロポレーション法、またはリポフェクション法等の
一般的な遺伝子導入法により前記細胞に導入することが
できる。酵母を宿主細胞とする場合は、例えばリチウム
法を基にしたYeast transformation kit(Clontech社製)
などを用いて導入することができる。尚、ウイルスをベ
クターに用いる場合には、上述のような一般的な遺伝子
導入法によりウイルスのゲノムを宿主細胞に導入できる
ほか、本発明遺伝子の挿入されたウイルスのゲノムを含
有するウイルス粒子を、宿主細胞へ感染させることによ
っても、該ウイルスのゲノムを宿主細胞に導入すること
ができる。
入することにより、本発明形質転換体を取得することが
できる。本発明ベクターを宿主細胞へ導入する方法とし
ては、宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用すること
ができる。例えば、微生物である大腸菌を宿主細胞とす
る場合は、「モレキュラー・クローニング」(J.Sambrook
ら、コールド・スプリング・ハーバー、1989年)等
に記載される塩化カルシウム法やエレクトロポレーショ
ン法等の通常の方法を用いることができる。また、哺乳
類動物細胞または昆虫細胞を宿主細胞とする場合は、例
えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレ
クトロポレーション法、またはリポフェクション法等の
一般的な遺伝子導入法により前記細胞に導入することが
できる。酵母を宿主細胞とする場合は、例えばリチウム
法を基にしたYeast transformation kit(Clontech社製)
などを用いて導入することができる。尚、ウイルスをベ
クターに用いる場合には、上述のような一般的な遺伝子
導入法によりウイルスのゲノムを宿主細胞に導入できる
ほか、本発明遺伝子の挿入されたウイルスのゲノムを含
有するウイルス粒子を、宿主細胞へ感染させることによ
っても、該ウイルスのゲノムを宿主細胞に導入すること
ができる。
【0009】本発明形質転換体を選抜するには、例え
ば、本発明ベクターと同時にマーカー遺伝子を宿主細胞
へ導入し、マーカー遺伝子の性質に応じた方法で細胞を
培養すればよい。例えば、マーカー遺伝子が、宿主細胞
に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する
遺伝子である場合には、該薬剤を添加した培地を用い
て、本発明ベクターが導入された宿主細胞を培養すれば
良い。薬剤耐性付与遺伝子と選抜薬剤の組み合わせとし
ては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイ
シンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子
とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジン
S耐性付与遺伝子とブラストサイジンSとの組み合わせ
などをあげることができる。また、マーカー遺伝子が宿
主細胞の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、
該栄養素を含まない最少培地を用いて、本発明ベクター
が導入された細胞を培養すればよい。また、本発明遺伝
子を宿主細胞で発現させることの可能な本発明ベクター
を導入した場合には、ダイオキシン結合活性に基づく検
出方法を用いることもできる。本発明遺伝子が宿主細胞
の染色体に導入されてなる本発明形質転換体を取得する
には、例えば、本発明ベクターとマーカー遺伝子を有す
るベクターとを制限酵素等で消化することにより直鎖状
にした後、これらを前述の方法で宿主細胞へ導入して該
細胞を通常数週間培養し、導入されたマーカー遺伝子の
発現を指標にして目的とする形質転換体を選抜すればよ
い。また、例えば、上記のような選抜薬剤に対する耐性
付与遺伝子をマーカー遺伝子として有する本発明ベクタ
ーを前述の方法で宿主細胞に導入し、該細胞を選抜薬剤
が添加された培地で数週間以上該細胞を継代培養して、
コロニー状に生き残った選抜薬剤耐性クローンを純化培
養することにより、本発明遺伝子が宿主細胞の染色体に
導入されてなる本発明形質転換体を選抜することもでき
る。該形質転換体は、凍結保存が可能であり必要に応じ
て起眠して使用することができるので、実験毎の形質転
換体作製の手間を省くことができ、また、あらかじめ性
質や取扱い条件の確認された形質転換体を用いて試験を
実施することが可能となる。
ば、本発明ベクターと同時にマーカー遺伝子を宿主細胞
へ導入し、マーカー遺伝子の性質に応じた方法で細胞を
培養すればよい。例えば、マーカー遺伝子が、宿主細胞
に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する
遺伝子である場合には、該薬剤を添加した培地を用い
て、本発明ベクターが導入された宿主細胞を培養すれば
良い。薬剤耐性付与遺伝子と選抜薬剤の組み合わせとし
ては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイ
シンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子
とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジン
S耐性付与遺伝子とブラストサイジンSとの組み合わせ
などをあげることができる。また、マーカー遺伝子が宿
主細胞の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、
該栄養素を含まない最少培地を用いて、本発明ベクター
が導入された細胞を培養すればよい。また、本発明遺伝
子を宿主細胞で発現させることの可能な本発明ベクター
を導入した場合には、ダイオキシン結合活性に基づく検
出方法を用いることもできる。本発明遺伝子が宿主細胞
の染色体に導入されてなる本発明形質転換体を取得する
には、例えば、本発明ベクターとマーカー遺伝子を有す
るベクターとを制限酵素等で消化することにより直鎖状
にした後、これらを前述の方法で宿主細胞へ導入して該
細胞を通常数週間培養し、導入されたマーカー遺伝子の
発現を指標にして目的とする形質転換体を選抜すればよ
い。また、例えば、上記のような選抜薬剤に対する耐性
付与遺伝子をマーカー遺伝子として有する本発明ベクタ
ーを前述の方法で宿主細胞に導入し、該細胞を選抜薬剤
が添加された培地で数週間以上該細胞を継代培養して、
コロニー状に生き残った選抜薬剤耐性クローンを純化培
養することにより、本発明遺伝子が宿主細胞の染色体に
導入されてなる本発明形質転換体を選抜することもでき
る。該形質転換体は、凍結保存が可能であり必要に応じ
て起眠して使用することができるので、実験毎の形質転
換体作製の手間を省くことができ、また、あらかじめ性
質や取扱い条件の確認された形質転換体を用いて試験を
実施することが可能となる。
【0010】上述のようにして得られた本発明形質転換
体を培養することにより本発明遺伝子にコードされるダ
イオキシンレセプターを産生させることができる。例え
ば、本発明形質転換体が微生物である場合、該形質転換
体は、一般微生物における通常の培養に使用される炭素
源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地
を用いて培養することができる。培養は、一般微生物に
おける通常の方法に準じて行い、固体培養、液体培養
(旋回式培養、往復式振とう培養、ジャーファーメンタ
ー(Jar Fermenter)培養、タンク培養等)などが可能
である。培養温度および培地のpHは、微生物が生育可能
な範囲から適宜選ぶことができ、例えば、約15℃〜約
40℃の培養温度にて、pH約6.0〜約8.0の培地で
培養するのが一般的である。培養時間は、種々の培養条
件によって異なるが、通常約1日間〜約5日間である。
温度シフト型やIPTG誘導型等の誘導型の発現ベクターを
用いた場合には誘導時間は1日以内が望ましく、通常数
時間である。また、上記形質転換体が哺乳類や昆虫類等
の動物細胞である場合、該形質転換体は一般の培養細胞
における通常の培養に使用される培地を用いて培養する
ことができる。選抜薬剤を利用して当該形質転換体を作
製した場合は、該選抜薬剤の存在下に培養するのが望ま
しい。哺乳類動物細胞の場合、例えば終濃度が10%とな
るようFBSを添加したDMEM培地(ニッスイ社製等)で3
7℃、5%CO2存在下等で数日ごとに新しい培養液に交
換しながら培養すればよい。細胞がコンフルエントにな
るまで増殖したら、例えば0.25w/v%程度となるよ
うトリプシンが添加されたPBS溶液を加えて個々の細胞
に分散させ、数倍に希釈して新しいシャーレに播種し継
代を続ける。昆虫細胞の場合も同様に、例えばGrace's
medium +10v/v%FBS+2w/v%Yeastlate等の昆虫細胞用培
養液を用いて培養温度25℃から35℃で培養すればよ
い。この際、Sf21細胞などのシャーレからはがれやすい
細胞の場合は、トリプシン液を用いずピペッテイングに
より分散させ継代を行なうことができる。また、バキュ
ロウイルス等のウイルスベクターを含む形質転換体の場
合は、培養時間は細胞質効果が現れて細胞が死滅する
前、例えばウイルス感染後72時間までとするのが好ま
しい。本発明形質転換体により産生されたダイオキシン
レセプターの回収は、適宜、通常の単離、精製の方法を
組み合わせて行えば良く、例えば、培養終了後、形質転
換体の細胞を遠心分離等で集め、集められた該細胞を通
常のバッファー、例えば20mM HEPES pH7,1mM EDTA,1mM
DTT,0.5mM PMSFからなるバッファーに懸濁した後、ポリ
トロン、超音波処理、ダウンスホモジナイザー等で破砕
し、破砕液を数万xgで数十分から1時間程度超遠心分
離し、上清画分を回収することにより、ダイオキシンレ
セプターを含む画分を得ることができる。さらに、前記
上清画分をイオン交換,疎水,ゲルろ過、アフィニティ
等の各種クロマトグラフィーに供することにより、より
精製されたダイオキシンレセプターを回収することもで
きる。この際、ダイオキシン応答配列すなわちダイオキ
シンレセプターが結合する配列を含む約15bpから約
200bp程度の長さのオリゴヌクレオチドをプローブ
としたDNA結合アッセイなどにより、本発明のダイオキ
シンレセプターを含む画分を見分けることもできる。こ
のようにして製造される本発明のダイオキシンレセプタ
ーは、例えば、被験物のダイオキシンレセプターに対す
る結合能・結合量を評価するためのレセプターバインデ
ィングアッセイ等に用いることができる。
体を培養することにより本発明遺伝子にコードされるダ
イオキシンレセプターを産生させることができる。例え
ば、本発明形質転換体が微生物である場合、該形質転換
体は、一般微生物における通常の培養に使用される炭素
源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地
を用いて培養することができる。培養は、一般微生物に
おける通常の方法に準じて行い、固体培養、液体培養
(旋回式培養、往復式振とう培養、ジャーファーメンタ
ー(Jar Fermenter)培養、タンク培養等)などが可能
である。培養温度および培地のpHは、微生物が生育可能
な範囲から適宜選ぶことができ、例えば、約15℃〜約
40℃の培養温度にて、pH約6.0〜約8.0の培地で
培養するのが一般的である。培養時間は、種々の培養条
件によって異なるが、通常約1日間〜約5日間である。
温度シフト型やIPTG誘導型等の誘導型の発現ベクターを
用いた場合には誘導時間は1日以内が望ましく、通常数
時間である。また、上記形質転換体が哺乳類や昆虫類等
の動物細胞である場合、該形質転換体は一般の培養細胞
における通常の培養に使用される培地を用いて培養する
ことができる。選抜薬剤を利用して当該形質転換体を作
製した場合は、該選抜薬剤の存在下に培養するのが望ま
しい。哺乳類動物細胞の場合、例えば終濃度が10%とな
るようFBSを添加したDMEM培地(ニッスイ社製等)で3
7℃、5%CO2存在下等で数日ごとに新しい培養液に交
換しながら培養すればよい。細胞がコンフルエントにな
るまで増殖したら、例えば0.25w/v%程度となるよ
うトリプシンが添加されたPBS溶液を加えて個々の細胞
に分散させ、数倍に希釈して新しいシャーレに播種し継
代を続ける。昆虫細胞の場合も同様に、例えばGrace's
medium +10v/v%FBS+2w/v%Yeastlate等の昆虫細胞用培
養液を用いて培養温度25℃から35℃で培養すればよ
い。この際、Sf21細胞などのシャーレからはがれやすい
細胞の場合は、トリプシン液を用いずピペッテイングに
より分散させ継代を行なうことができる。また、バキュ
ロウイルス等のウイルスベクターを含む形質転換体の場
合は、培養時間は細胞質効果が現れて細胞が死滅する
前、例えばウイルス感染後72時間までとするのが好ま
しい。本発明形質転換体により産生されたダイオキシン
レセプターの回収は、適宜、通常の単離、精製の方法を
組み合わせて行えば良く、例えば、培養終了後、形質転
換体の細胞を遠心分離等で集め、集められた該細胞を通
常のバッファー、例えば20mM HEPES pH7,1mM EDTA,1mM
DTT,0.5mM PMSFからなるバッファーに懸濁した後、ポリ
トロン、超音波処理、ダウンスホモジナイザー等で破砕
し、破砕液を数万xgで数十分から1時間程度超遠心分
離し、上清画分を回収することにより、ダイオキシンレ
セプターを含む画分を得ることができる。さらに、前記
上清画分をイオン交換,疎水,ゲルろ過、アフィニティ
等の各種クロマトグラフィーに供することにより、より
精製されたダイオキシンレセプターを回収することもで
きる。この際、ダイオキシン応答配列すなわちダイオキ
シンレセプターが結合する配列を含む約15bpから約
200bp程度の長さのオリゴヌクレオチドをプローブ
としたDNA結合アッセイなどにより、本発明のダイオキ
シンレセプターを含む画分を見分けることもできる。こ
のようにして製造される本発明のダイオキシンレセプタ
ーは、例えば、被験物のダイオキシンレセプターに対す
る結合能・結合量を評価するためのレセプターバインデ
ィングアッセイ等に用いることができる。
【0011】本発明遺伝子は、例えば、被験物のダイオ
キシンレセプター活性調節能を評価するためのレポータ
ーアッセイに利用することができる。ダイオキシンレセ
プター活性調節能としては、ダイオキシンレセプターに
対するアゴニスト活性、アンタゴニスト活性等があげら
れる。本発明遺伝子を用いたレポーターアッセイにおい
て用いられる「ダイオキシン応答配列を含む転写制御領
域の下流に連結されたレポーター遺伝子」としては、具
体的には、例えばヒトCYP1A1遺伝子の転写制御領
域等のダイオキシン応答配列を含む転写制御領域の下流
にレポーター遺伝子を結合させたキメラ遺伝子、または
ダイオキシン応答配列の下流に転写開始に必要な塩基配
列とレポーター遺伝子を連結させたキメラ遺伝子などを
あげることができ、宿主細胞内でのダイオキシンレセプ
ターの転写調節能をモニターするために用いることがで
きる。このようなキメラ遺伝子作製に用いられるレポー
ター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、分泌型ア
ルカリフォスファターゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺
伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ遺伝子、成長ホルモン遺伝子などを利用することがで
き、宿主細胞における安定性が比較的高いレポーター蛋
白質をコードする遺伝子が好ましい。まず、ダイオキシ
ン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポ
ーター遺伝子と本発明遺伝子とを、例えばダイオキシン
レセプター非内在性宿主細胞、具体的には例えばHeLa細
胞等に導入し、これらの遺伝子を保有する形質転換体を
作製する。ここで、本発明遺伝子は、例えば上述のよう
に、宿主細胞で機能可能なプロモーターと機能可能な形
で結合され基本ベクターに組み込まれた形で宿主細胞へ
導入するとよい。ダイオキシン応答配列を含む転写制御
領域の下流に連結されたレポーター遺伝子も、ベクター
に組み込んで導入するとよい。また例えば、ダイオキシ
ン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポ
ーター遺伝子が組み込まれたベクターと、宿主細胞で機
能可能なプロモーターと機能可能な形で結合された本発
明遺伝子を保有するベクターとを、マーカー遺伝子を有
するベクターとともに宿主細胞に導入し、マーカー遺伝
子の発現を指標にして選抜することにより、ダイオキシ
ン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポ
ーター遺伝子、および宿主細胞で機能可能なプロモータ
ーと機能可能な形で結合された本発明遺伝子が、宿主細
胞の染色体に導入されてなる形質転換体を取得すること
ができる。該形質転換体は凍結保存が可能であり必要に
応じて起眠して使用することができるので、これを一旦
取得して保存すると、アッセイのたびにこれらの遺伝子
を宿主細胞に導入して新たな形質転換体を取得する必要
がなく、また、形質転換体の性能も一定に保つことがで
きることから、例えば自動化されたロボットによる大規
模スクリーニングを実施する際にも有用である。上述の
ように作製された形質転換体を、例えば1日間から数日
間培養する間に、被験物を培地中に加えて前記形質転換
体と接触させ、該形質転換体における前記レポーター遺
伝子の発現量を測定する。該形質転換体が産生するダイ
オキシンレセプターが被験物中のダイオキシン様物質の
結合により活性化された場合は、レポーター遺伝子の転
写が促進され、レポーター遺伝子にコードされた蛋白質
が形質転換体の細胞内などに蓄積されるかもしくは培地
中に分泌される。この蛋白質の量を測定することによ
り、該形質転換体の細胞あたりのレポーター遺伝子の発
現量を測定する。具体的には、例えば、レポーター遺伝
子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いた場合、細胞粗抽
出物にルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを加え
ると発光し、発光量はルシフェラーゼ量に比例する。従
って、この発光量をルミノメーターなどの測定装置で測
定することにより、ルシフェラーゼの量、ひいては、ル
シフェラーゼ遺伝子の発現量を知ることができる。同様
にして、形質転換体に被験物を接触させない条件下にお
けるレポーター遺伝子の発現量を測定し、該発現量と、
被験物を接触させた条件下における発現量とを比較する
ことにより、被験物中のダイオキシン様物質のダイオキ
シンレセプターに対するアゴニスト活性、すなわち、該
レセプターの活性化能を評価することができる。また、
例えば、上記の形質転換体にTCDD等の既知のダイオキシ
ンを接触させた条件下、および、該ダイオキシンと被験
物とを同時に接触させた条件下にそれぞれ上記と同様の
方法でレポーター遺伝子の発現量を測定する。形質転換
体にダイオキシンを接触させた条件下におけるレポータ
ー遺伝子の発現量と比較して、ダイオキシンと被験物質
とを接触させた条件下におけるレポーター遺伝子の発現
量が低ければ、この被験物質はダイオキシンレセプター
に対するアンタゴニスト活性、すなわち、該レセプター
の抗活性化能を有すると評価することができる。
キシンレセプター活性調節能を評価するためのレポータ
ーアッセイに利用することができる。ダイオキシンレセ
プター活性調節能としては、ダイオキシンレセプターに
対するアゴニスト活性、アンタゴニスト活性等があげら
れる。本発明遺伝子を用いたレポーターアッセイにおい
て用いられる「ダイオキシン応答配列を含む転写制御領
域の下流に連結されたレポーター遺伝子」としては、具
体的には、例えばヒトCYP1A1遺伝子の転写制御領
域等のダイオキシン応答配列を含む転写制御領域の下流
にレポーター遺伝子を結合させたキメラ遺伝子、または
ダイオキシン応答配列の下流に転写開始に必要な塩基配
列とレポーター遺伝子を連結させたキメラ遺伝子などを
あげることができ、宿主細胞内でのダイオキシンレセプ
ターの転写調節能をモニターするために用いることがで
きる。このようなキメラ遺伝子作製に用いられるレポー
ター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、分泌型ア
ルカリフォスファターゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺
伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ遺伝子、成長ホルモン遺伝子などを利用することがで
き、宿主細胞における安定性が比較的高いレポーター蛋
白質をコードする遺伝子が好ましい。まず、ダイオキシ
ン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポ
ーター遺伝子と本発明遺伝子とを、例えばダイオキシン
レセプター非内在性宿主細胞、具体的には例えばHeLa細
胞等に導入し、これらの遺伝子を保有する形質転換体を
作製する。ここで、本発明遺伝子は、例えば上述のよう
に、宿主細胞で機能可能なプロモーターと機能可能な形
で結合され基本ベクターに組み込まれた形で宿主細胞へ
導入するとよい。ダイオキシン応答配列を含む転写制御
領域の下流に連結されたレポーター遺伝子も、ベクター
に組み込んで導入するとよい。また例えば、ダイオキシ
ン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポ
ーター遺伝子が組み込まれたベクターと、宿主細胞で機
能可能なプロモーターと機能可能な形で結合された本発
明遺伝子を保有するベクターとを、マーカー遺伝子を有
するベクターとともに宿主細胞に導入し、マーカー遺伝
子の発現を指標にして選抜することにより、ダイオキシ
ン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポ
ーター遺伝子、および宿主細胞で機能可能なプロモータ
ーと機能可能な形で結合された本発明遺伝子が、宿主細
胞の染色体に導入されてなる形質転換体を取得すること
ができる。該形質転換体は凍結保存が可能であり必要に
応じて起眠して使用することができるので、これを一旦
取得して保存すると、アッセイのたびにこれらの遺伝子
を宿主細胞に導入して新たな形質転換体を取得する必要
がなく、また、形質転換体の性能も一定に保つことがで
きることから、例えば自動化されたロボットによる大規
模スクリーニングを実施する際にも有用である。上述の
ように作製された形質転換体を、例えば1日間から数日
間培養する間に、被験物を培地中に加えて前記形質転換
体と接触させ、該形質転換体における前記レポーター遺
伝子の発現量を測定する。該形質転換体が産生するダイ
オキシンレセプターが被験物中のダイオキシン様物質の
結合により活性化された場合は、レポーター遺伝子の転
写が促進され、レポーター遺伝子にコードされた蛋白質
が形質転換体の細胞内などに蓄積されるかもしくは培地
中に分泌される。この蛋白質の量を測定することによ
り、該形質転換体の細胞あたりのレポーター遺伝子の発
現量を測定する。具体的には、例えば、レポーター遺伝
子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いた場合、細胞粗抽
出物にルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを加え
ると発光し、発光量はルシフェラーゼ量に比例する。従
って、この発光量をルミノメーターなどの測定装置で測
定することにより、ルシフェラーゼの量、ひいては、ル
シフェラーゼ遺伝子の発現量を知ることができる。同様
にして、形質転換体に被験物を接触させない条件下にお
けるレポーター遺伝子の発現量を測定し、該発現量と、
被験物を接触させた条件下における発現量とを比較する
ことにより、被験物中のダイオキシン様物質のダイオキ
シンレセプターに対するアゴニスト活性、すなわち、該
レセプターの活性化能を評価することができる。また、
例えば、上記の形質転換体にTCDD等の既知のダイオキシ
ンを接触させた条件下、および、該ダイオキシンと被験
物とを同時に接触させた条件下にそれぞれ上記と同様の
方法でレポーター遺伝子の発現量を測定する。形質転換
体にダイオキシンを接触させた条件下におけるレポータ
ー遺伝子の発現量と比較して、ダイオキシンと被験物質
とを接触させた条件下におけるレポーター遺伝子の発現
量が低ければ、この被験物質はダイオキシンレセプター
に対するアンタゴニスト活性、すなわち、該レセプター
の抗活性化能を有すると評価することができる。
【0012】本発明のダイオキシンレセプターを用いた
レセプターバインディングアッセイは、該ダイオキシン
レセプターに作用する化学物質の結合能の測定や定量の
ほか結合特異性、結合力の分析などが可能な試験方法で
ある。例えば、上述のようにして本発明形質転換体から
回収された本発明のダイオキシンレセプターに、標識さ
れたレセプターリガンド(以下、標識リガンドと記
す。)が結合しているところへ、被験物を共存させる
と、被験物と標識リガンドとの競合から、両者のレセプ
ターへの親和性に応じて、標識リガンドがレセプターか
ら遊離し、レセプターに結合した標識リガンドの量が減
少し、よってレセプターに結合した標識量が減少する。
従って、遊離型の標識リガンドの標識量または結合型の
標識リガンドの標識量をモニターすることにより、被験
物のレセプターへの結合能が間接的にわかる。標識リガ
ンドとしては、例えば、トリチウム標識された2,3,7,8-
TCDD等を用いることができる。標識リガンドの結合型/
遊離型の分離はヒドロキシアパタイト法やグリセロール
密度勾配超遠心法などで行うことができる。反応系は大
きく3群にわけられる。一つの系は、ダイオキシンレセ
プターに標識リガンドが結合しているところへ溶媒のみ
が添加される群であり、被験物の濃度がゼロの系に相当
し、この系から得られる結合型の標識リガンドの標識量
は、標識リガンドのダイオキシンレセプターに対する総
結合量を示す。もう一つの系は、ダイオキシンレセプタ
ーに標識リガンドが結合しているところへ、例えば、標
識されていない2,3,7,8-TCDDが、レセプターを十分飽和
し標識リガンドが結合できなくなるだけの濃度(例えば
10μM)となるよう添加された系であり、この系から
得られる結合型の標識リガンドの標識量は、標識リガン
ドのダイオキシンレセプターに対する非特異的な結合量
と判断される。したがって、ダイオキシンレセプターへ
の標識リガンドの特異的結合量は、総結合量からこの非
特異的結合量を引いた値となる。3番目の系は、ダイオ
キシンレセプターに標識リガンドが結合しているところ
へ、被験物が、例えば最終濃度10μM(この濃度は目
的により任意に変更する。)となるよう添加された系で
ある。被験物がダイオキシンレセプターへの結合能を有
する場合は、この系から得られる結合型の標識リガンド
の標識量は、上記のようにして求めた被験物濃度がゼロ
の時のダイオキシンレセプターへの標識リガンドの特異
的結合量より小さくなる。このようにしてレセプターバ
インディングアッセイを行うことにより、本発明のダイ
オキシンレセプターに対する被験物の結合能を調べるこ
とができ、被験物中にダイオキシンレセプターに親和性
を示す物質が存在するかどうかを調べることもできる。
さらに、本発明のダイオキシンレセプターに対する被験
物の結合能をより詳細に評価するには、例えば前記の3
番目の系における被験物の添加濃度を変えて同様にアッ
セイを行い結合型の標識リガンドの標識量を測定する。
該測定値に基づき、各アッセイにおける結合型と遊離型
のリガンド量を算出して、例えばスキャッチャード解析
を行うことにより、被験物と本発明のダイオキシンレセ
プターとの結合親和性、結合特異性、結合容量等を評価
することができる。本発明のレポーターアッセイやレセ
プターバインディングアッセイは、化学物質の安全性評
価や、環境中のダイオキシン様物質検出等に利用でき
る。
レセプターバインディングアッセイは、該ダイオキシン
レセプターに作用する化学物質の結合能の測定や定量の
ほか結合特異性、結合力の分析などが可能な試験方法で
ある。例えば、上述のようにして本発明形質転換体から
回収された本発明のダイオキシンレセプターに、標識さ
れたレセプターリガンド(以下、標識リガンドと記
す。)が結合しているところへ、被験物を共存させる
と、被験物と標識リガンドとの競合から、両者のレセプ
ターへの親和性に応じて、標識リガンドがレセプターか
ら遊離し、レセプターに結合した標識リガンドの量が減
少し、よってレセプターに結合した標識量が減少する。
従って、遊離型の標識リガンドの標識量または結合型の
標識リガンドの標識量をモニターすることにより、被験
物のレセプターへの結合能が間接的にわかる。標識リガ
ンドとしては、例えば、トリチウム標識された2,3,7,8-
TCDD等を用いることができる。標識リガンドの結合型/
遊離型の分離はヒドロキシアパタイト法やグリセロール
密度勾配超遠心法などで行うことができる。反応系は大
きく3群にわけられる。一つの系は、ダイオキシンレセ
プターに標識リガンドが結合しているところへ溶媒のみ
が添加される群であり、被験物の濃度がゼロの系に相当
し、この系から得られる結合型の標識リガンドの標識量
は、標識リガンドのダイオキシンレセプターに対する総
結合量を示す。もう一つの系は、ダイオキシンレセプタ
ーに標識リガンドが結合しているところへ、例えば、標
識されていない2,3,7,8-TCDDが、レセプターを十分飽和
し標識リガンドが結合できなくなるだけの濃度(例えば
10μM)となるよう添加された系であり、この系から
得られる結合型の標識リガンドの標識量は、標識リガン
ドのダイオキシンレセプターに対する非特異的な結合量
と判断される。したがって、ダイオキシンレセプターへ
の標識リガンドの特異的結合量は、総結合量からこの非
特異的結合量を引いた値となる。3番目の系は、ダイオ
キシンレセプターに標識リガンドが結合しているところ
へ、被験物が、例えば最終濃度10μM(この濃度は目
的により任意に変更する。)となるよう添加された系で
ある。被験物がダイオキシンレセプターへの結合能を有
する場合は、この系から得られる結合型の標識リガンド
の標識量は、上記のようにして求めた被験物濃度がゼロ
の時のダイオキシンレセプターへの標識リガンドの特異
的結合量より小さくなる。このようにしてレセプターバ
インディングアッセイを行うことにより、本発明のダイ
オキシンレセプターに対する被験物の結合能を調べるこ
とができ、被験物中にダイオキシンレセプターに親和性
を示す物質が存在するかどうかを調べることもできる。
さらに、本発明のダイオキシンレセプターに対する被験
物の結合能をより詳細に評価するには、例えば前記の3
番目の系における被験物の添加濃度を変えて同様にアッ
セイを行い結合型の標識リガンドの標識量を測定する。
該測定値に基づき、各アッセイにおける結合型と遊離型
のリガンド量を算出して、例えばスキャッチャード解析
を行うことにより、被験物と本発明のダイオキシンレセ
プターとの結合親和性、結合特異性、結合容量等を評価
することができる。本発明のレポーターアッセイやレセ
プターバインディングアッセイは、化学物質の安全性評
価や、環境中のダイオキシン様物質検出等に利用でき
る。
【0013】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれら実施例によって限定されるもの
ではない。
するが、本発明はこれら実施例によって限定されるもの
ではない。
【0014】実施例1(本発明遺伝子の取得I) まずJ.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著;モレキュラ
ー クローニング第2版(Molecular Cloning 2nd editi
on)、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー(Co
ld Spring Harbor Laboratory)発行、1989年 7.1
9項の記載に準じて、グアニジンチオシアネート-CsCl密
度勾配超遠心法にて、モルモット(Hartley系 メス、日
本チャールス゛リハ゛ー社から購入)肝臓からtotal RNA を抽出分
離した。次に、このtotalRNAから、Oligotex-dT30 supe
r mRNA purification kit(宝酒造製)を用いてmRNAを分
離した。この際の操作はキット添付の説明書の記載に従
った。このmRNA 1μgを用いて、TimeSaver cDNA 合成
キット(アマシャムファルマシア製)及び該キットに含
まれるランダムプライマーを用いて、両末端にEcoRIア
ダプターが結合された二本鎖cDNAからなるライブラリー
を作製した。この際の操作はキット添付の説明書の記載
に従った。次いで、このようにして作製された二本鎖cD
NAライブラリーの全量と、EcoRIで消化された後アルカ
リフォスファターゼ処理されたλgt10(ストラタジーン
社製)1μgとを混合し、これにT4リガーゼを反応さ
せた後、該反応液中のDNAを、GigapackIIIgoldパッ
ケージングエクストラクト(ストラタジーン社製)を用
いて該試薬の添付説明書の記載に従いλファージ粒子へ
パッケージングした。このようにして得られたファージ
粒子の1x106個分について、真壁和裕著、バイオ実験イ
ラストレイテッド第4巻、秀潤社発行、p125-163に記載
の方法に従って、プラークハイブリダイゼーション法に
よるスクリーニングを行った。プローブとしては、ヒト
ダイオキシンレセプターcDNA(GenBank Accession No.L1
9872)のリガンド結合領域に相当する526bpの長さ
のPvuII-PvuII断片を、RediprimeIIキット(アマシャム
ファルマシア製)を用いて32Pで標識したものを用い
た。ハイブリダイゼーションの条件としては、ハイブリ
ダイゼーション液の組成が6XSSPE(0.9M NaCl, 0.052M
NaH2PO4, 7.5mM EDTA),0.5% SDS,5xDenhart,0.1mg/ml
サケ精子DNAであり、保温温度は55℃、保温時間は1
6時間で、使用したプローブのDNA量は0.5μg、ハ
イブリダイゼーション液の放射能濃度は該液150ml当り1
4x108cpmであった。また、ハイブリダイゼーション後の
フィルター洗浄の条件は、洗浄液の組成が1xSSC(15mM
塩化ナトリウム、1.5mM クエン酸ナトリウム),0.5%SDS
であり、保温温度は62℃で、40分間の保温を2回行
った。洗浄後のフィルターをフィルムに2晩感光させて
オートラジオグラフィーを行った。その結果、複数の陽
性シグナルが検出された。次に、陽性シグナルを与えた
プラークからファージDNAを採取してこれを鋳型と
し、λgt10インサートスクリーニング用Long PCRプライ
マー(クロンテック社製)を用いて、PCRsystem9700(ア
プライド・バイオシステムズ社製)にてPCRを行った。反
応液中のプライマー量はおのおの10pmolとし、LA-Taqポ
リメラーゼ(宝酒造社製)および該酵素に添付のバッフ
ァーを用いて、95℃1分間次いで68℃3分間の保温
を1サイクルとしてこれを35サイクル行った。このよ
うにしてそれぞれのファージに挿入されたDNAを増幅
させ、約3kbpの挿入DNAを保持するクローンを選
択した。この挿入DNAをオートシークエンサーABI社
製model377によるダイターミネーターシークエンス
キットFS(ABI社製)を用いたダイレクトーシークエン
スに供した。その結果、該DNAは配列番号2で示され
る塩基配列を有し、配列番号1で示されるアミノ酸配列
をコードしていることが判明した。
ー クローニング第2版(Molecular Cloning 2nd editi
on)、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー(Co
ld Spring Harbor Laboratory)発行、1989年 7.1
9項の記載に準じて、グアニジンチオシアネート-CsCl密
度勾配超遠心法にて、モルモット(Hartley系 メス、日
本チャールス゛リハ゛ー社から購入)肝臓からtotal RNA を抽出分
離した。次に、このtotalRNAから、Oligotex-dT30 supe
r mRNA purification kit(宝酒造製)を用いてmRNAを分
離した。この際の操作はキット添付の説明書の記載に従
った。このmRNA 1μgを用いて、TimeSaver cDNA 合成
キット(アマシャムファルマシア製)及び該キットに含
まれるランダムプライマーを用いて、両末端にEcoRIア
ダプターが結合された二本鎖cDNAからなるライブラリー
を作製した。この際の操作はキット添付の説明書の記載
に従った。次いで、このようにして作製された二本鎖cD
NAライブラリーの全量と、EcoRIで消化された後アルカ
リフォスファターゼ処理されたλgt10(ストラタジーン
社製)1μgとを混合し、これにT4リガーゼを反応さ
せた後、該反応液中のDNAを、GigapackIIIgoldパッ
ケージングエクストラクト(ストラタジーン社製)を用
いて該試薬の添付説明書の記載に従いλファージ粒子へ
パッケージングした。このようにして得られたファージ
粒子の1x106個分について、真壁和裕著、バイオ実験イ
ラストレイテッド第4巻、秀潤社発行、p125-163に記載
の方法に従って、プラークハイブリダイゼーション法に
よるスクリーニングを行った。プローブとしては、ヒト
ダイオキシンレセプターcDNA(GenBank Accession No.L1
9872)のリガンド結合領域に相当する526bpの長さ
のPvuII-PvuII断片を、RediprimeIIキット(アマシャム
ファルマシア製)を用いて32Pで標識したものを用い
た。ハイブリダイゼーションの条件としては、ハイブリ
ダイゼーション液の組成が6XSSPE(0.9M NaCl, 0.052M
NaH2PO4, 7.5mM EDTA),0.5% SDS,5xDenhart,0.1mg/ml
サケ精子DNAであり、保温温度は55℃、保温時間は1
6時間で、使用したプローブのDNA量は0.5μg、ハ
イブリダイゼーション液の放射能濃度は該液150ml当り1
4x108cpmであった。また、ハイブリダイゼーション後の
フィルター洗浄の条件は、洗浄液の組成が1xSSC(15mM
塩化ナトリウム、1.5mM クエン酸ナトリウム),0.5%SDS
であり、保温温度は62℃で、40分間の保温を2回行
った。洗浄後のフィルターをフィルムに2晩感光させて
オートラジオグラフィーを行った。その結果、複数の陽
性シグナルが検出された。次に、陽性シグナルを与えた
プラークからファージDNAを採取してこれを鋳型と
し、λgt10インサートスクリーニング用Long PCRプライ
マー(クロンテック社製)を用いて、PCRsystem9700(ア
プライド・バイオシステムズ社製)にてPCRを行った。反
応液中のプライマー量はおのおの10pmolとし、LA-Taqポ
リメラーゼ(宝酒造社製)および該酵素に添付のバッフ
ァーを用いて、95℃1分間次いで68℃3分間の保温
を1サイクルとしてこれを35サイクル行った。このよ
うにしてそれぞれのファージに挿入されたDNAを増幅
させ、約3kbpの挿入DNAを保持するクローンを選
択した。この挿入DNAをオートシークエンサーABI社
製model377によるダイターミネーターシークエンス
キットFS(ABI社製)を用いたダイレクトーシークエン
スに供した。その結果、該DNAは配列番号2で示され
る塩基配列を有し、配列番号1で示されるアミノ酸配列
をコードしていることが判明した。
【0015】実施例2(本発明遺伝子の取得II) モルモット(Hartley系 メス、日本チャールス゛リハ゛ー社から購
入)肝臓から、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著;
モレキュラー クローニング第2版(MolecularCloning
2nd edition)、コールドスプリング ハーバー ラボラ
トリー(Cold Spring Harbor Laboratory)発行、19
89年 7.19項の記載に準じてグアニジンチオシアネー
ト-CsCl密度勾配超遠心法にて分離されたtotal RNA 1μ
gについて、1μgのオリゴdTプライマー(アマシャム
ファルマシア社製)およびSuperscriptII(GIBCO社製)
を用いて逆転写反応を行い、一本鎖cDNAからなるライブ
ラリーを調製した。PCRにて本発明遺伝子を取得する
ために、配列番号3で示される塩基配列からなるオリゴ
ヌクレオチドおよび配列番号4で示される塩基配列から
なるオリゴヌクレオチドをDNA合成機(アプライド・
バイオシステムズ・モデル394)を用いて合成した。
これらのプライマーを用いて、上記の一本鎖cDNAライブ
ラリーを鋳型として、PCRsystem9700(アプライド・バイ
オシステムズ社製)にてPCRを行った。反応液中のプライ
マー量はおのおの10pmol、鋳型DNA量は10ngとし、LA
-Taqポリメラーゼ(宝酒造社製)および該酵素に添付の
バッファーを使用し、95℃1分間次いで68℃3分間
の保温を1サイクルとしてこれを35サイクル行った。
この反応液全量を、低融点アガロース(アガロースL;
ニッポンジーン社製)を用いたアガロースゲル電気泳動
に供したところ、2.6kbpの移動度を示すバンドが検出
された。このバンド部分のゲルからDNAを回収し、オ
ートシークエンサーABI社製model377にてダイターミ
ネーターシークエンスキットFS(アプライド・バイオシ
ステムズ社製)を用いたダイレクトーシークエンスに供
した。その結果、該DNAは、配列番号2で示される塩
基配列の塩基番号40〜2580で表される塩基配列を
有することがわかった。
入)肝臓から、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著;
モレキュラー クローニング第2版(MolecularCloning
2nd edition)、コールドスプリング ハーバー ラボラ
トリー(Cold Spring Harbor Laboratory)発行、19
89年 7.19項の記載に準じてグアニジンチオシアネー
ト-CsCl密度勾配超遠心法にて分離されたtotal RNA 1μ
gについて、1μgのオリゴdTプライマー(アマシャム
ファルマシア社製)およびSuperscriptII(GIBCO社製)
を用いて逆転写反応を行い、一本鎖cDNAからなるライブ
ラリーを調製した。PCRにて本発明遺伝子を取得する
ために、配列番号3で示される塩基配列からなるオリゴ
ヌクレオチドおよび配列番号4で示される塩基配列から
なるオリゴヌクレオチドをDNA合成機(アプライド・
バイオシステムズ・モデル394)を用いて合成した。
これらのプライマーを用いて、上記の一本鎖cDNAライブ
ラリーを鋳型として、PCRsystem9700(アプライド・バイ
オシステムズ社製)にてPCRを行った。反応液中のプライ
マー量はおのおの10pmol、鋳型DNA量は10ngとし、LA
-Taqポリメラーゼ(宝酒造社製)および該酵素に添付の
バッファーを使用し、95℃1分間次いで68℃3分間
の保温を1サイクルとしてこれを35サイクル行った。
この反応液全量を、低融点アガロース(アガロースL;
ニッポンジーン社製)を用いたアガロースゲル電気泳動
に供したところ、2.6kbpの移動度を示すバンドが検出
された。このバンド部分のゲルからDNAを回収し、オ
ートシークエンサーABI社製model377にてダイターミ
ネーターシークエンスキットFS(アプライド・バイオシ
ステムズ社製)を用いたダイレクトーシークエンスに供
した。その結果、該DNAは、配列番号2で示される塩
基配列の塩基番号40〜2580で表される塩基配列を
有することがわかった。
【0016】実施例3(本発明ベクターの構築) RSVプロモーターを有するプラスミドpRC/RSV(Invitrog
en社)2μgを、制限酵素Not IおよびXba Iそれぞれ10
Uで、37℃にて1.5時間消化し、ブランティングキ
ット(宝酒造社製)にて平滑末端化処理を行った後、ア
ルカリフォスファターゼ(BAP)5Uを65℃にて1
時間反応させた。これを低融点アガロース(アガロース
L;ニッポンジーン社製)を用いたゲル電気泳動に供
し、約6kbpの長さを示すバンド部分からDNAを回収しこ
れをベクターDNAとした。一方、実施例2で取得され
た本発明遺伝子を含むDNAを、T4キナーゼと反応さ
せて末端をリン酸化した後、ブランティングキット(宝
酒造社製)にて平滑末端化処理した。得られたDNAを
低融点アガロース電気泳動法に供した後ゲルから回収
し、その約1μgを上記のように調製されたベクターD
NA100ngと混合し、5uのT4 ligaseを添加して16℃
にて3時間保温した。その反応液中のDNAを、大腸菌
DH5α株コンピテントセル(TOYOBO製)に添付説明書に
記載の方法に従って導入し、アンピシリン耐性を示すコ
ロニーからプラスミドDNAをアルカリ法で調製した。次
に、このいくつかのクローンから得られたプラスミドDN
Aの塩基配列を、配列番号5で示される塩基配列からな
るオリゴヌクレオチド(ダイオキシンレセプター遺伝子
のコーディング領域の塩基配列に基づき設計されたフォ
ワード方向プライマー)および配列番号6で示される塩
基配列からなるオリゴヌクレオチド(ダイオキシンレセ
プター遺伝子のコーディング領域の塩基配列に基づき設
計されたリバース方向プライマー)をそれぞれ用いて決
定し、本発明遺伝子が、RSVプロモーターの下流にダイ
オキシンレセプターを産生しうるように組み込まれたプ
ラスミドを選択した。さらに、このようにして選択され
たプラスミドの塩基配列を、配列番号7〜17のいずれ
かで示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして用いて決定し、配列番号2で示される塩
基配列と100%一致する塩基配列を有するプラスミド
を1個選択した。また、バキュロウイルストランスファ
ーベクターpVL1392またはpVL1393(Pharmingen社)各々2
μgを、制限酵素Not IおよびXba Iそれぞれ10Uで、3
7℃にて1.5時間消化し、ブランティングキット(宝
酒造製)にて平滑末端化処理を行った後、アルカリフォ
スファターゼ(BAP)5Uを65℃1時間反応させ
る。これを低融点アガロース(アガロースL;ニッポン
ジーン社製)を用いたゲル電気泳動に供し、バンド部分
からDNAを回収し、これらをベクターDNAとする。一
方、実施例1または2で取得された本発明遺伝子を含む
DNAを、T4キナーゼと反応させて末端をリン酸化し
た後、ブランティングキット(宝酒造製)にて平滑末端
化処理する。得られたDNAを低融点アガロース電気泳
動法に供した後ゲルから回収し、その約1μgを上記の
ように調製したベクターDNA100ngと混合し、5uのT4
ligaseを添加して16℃にて3時間保温する。この反
応液中のDNAを大腸菌 DH5α株コンピテントセル(TO
YOBO製)に添付説明書に記載の方法に従って導入し、ア
ンピシリン耐性を示すコロニーからプラスミドDNAをア
ルカリ法で調製する。
en社)2μgを、制限酵素Not IおよびXba Iそれぞれ10
Uで、37℃にて1.5時間消化し、ブランティングキ
ット(宝酒造社製)にて平滑末端化処理を行った後、ア
ルカリフォスファターゼ(BAP)5Uを65℃にて1
時間反応させた。これを低融点アガロース(アガロース
L;ニッポンジーン社製)を用いたゲル電気泳動に供
し、約6kbpの長さを示すバンド部分からDNAを回収しこ
れをベクターDNAとした。一方、実施例2で取得され
た本発明遺伝子を含むDNAを、T4キナーゼと反応さ
せて末端をリン酸化した後、ブランティングキット(宝
酒造社製)にて平滑末端化処理した。得られたDNAを
低融点アガロース電気泳動法に供した後ゲルから回収
し、その約1μgを上記のように調製されたベクターD
NA100ngと混合し、5uのT4 ligaseを添加して16℃
にて3時間保温した。その反応液中のDNAを、大腸菌
DH5α株コンピテントセル(TOYOBO製)に添付説明書に
記載の方法に従って導入し、アンピシリン耐性を示すコ
ロニーからプラスミドDNAをアルカリ法で調製した。次
に、このいくつかのクローンから得られたプラスミドDN
Aの塩基配列を、配列番号5で示される塩基配列からな
るオリゴヌクレオチド(ダイオキシンレセプター遺伝子
のコーディング領域の塩基配列に基づき設計されたフォ
ワード方向プライマー)および配列番号6で示される塩
基配列からなるオリゴヌクレオチド(ダイオキシンレセ
プター遺伝子のコーディング領域の塩基配列に基づき設
計されたリバース方向プライマー)をそれぞれ用いて決
定し、本発明遺伝子が、RSVプロモーターの下流にダイ
オキシンレセプターを産生しうるように組み込まれたプ
ラスミドを選択した。さらに、このようにして選択され
たプラスミドの塩基配列を、配列番号7〜17のいずれ
かで示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして用いて決定し、配列番号2で示される塩
基配列と100%一致する塩基配列を有するプラスミド
を1個選択した。また、バキュロウイルストランスファ
ーベクターpVL1392またはpVL1393(Pharmingen社)各々2
μgを、制限酵素Not IおよびXba Iそれぞれ10Uで、3
7℃にて1.5時間消化し、ブランティングキット(宝
酒造製)にて平滑末端化処理を行った後、アルカリフォ
スファターゼ(BAP)5Uを65℃1時間反応させ
る。これを低融点アガロース(アガロースL;ニッポン
ジーン社製)を用いたゲル電気泳動に供し、バンド部分
からDNAを回収し、これらをベクターDNAとする。一
方、実施例1または2で取得された本発明遺伝子を含む
DNAを、T4キナーゼと反応させて末端をリン酸化し
た後、ブランティングキット(宝酒造製)にて平滑末端
化処理する。得られたDNAを低融点アガロース電気泳
動法に供した後ゲルから回収し、その約1μgを上記の
ように調製したベクターDNA100ngと混合し、5uのT4
ligaseを添加して16℃にて3時間保温する。この反
応液中のDNAを大腸菌 DH5α株コンピテントセル(TO
YOBO製)に添付説明書に記載の方法に従って導入し、ア
ンピシリン耐性を示すコロニーからプラスミドDNAをア
ルカリ法で調製する。
【0017】実施例4(本発明遺伝子を含有するウイル
スベクターおよびウイルス粒子の作製) 1x106個のSf21細胞(ATCCから入手)を75c
m2のT型フラスコ(ファルコン社製)中で、10%FBSお
よび2%Yeastlateを含むGrace's medium(以下、FBS含有
Grace培地と記す。)を用いて27℃にて一晩培養す
る。一方、実施例3のようにして作製される本発明遺伝
子がpVL1392に組込まれたトランスファーベクターのDNA
10μgと、直鎖状に調製されたウイルスゲノムのDNA
Baculo gold(Pharmingen社製)20ngとをGrace's medi
um 100μlに添加し、滅菌水で2倍に希釈したリポフェ
クチン(GIBCO社製)10μlを加え、室温にて30分
間放置する。一晩培養された前記のSf21細胞の培養上清
を除き、血清を含まないGrace's medium少量で細胞を洗
った後、同培地5mlを細胞に添加し、これに前記のリ
ポフェクチン−DNA混合液を全量加え、27℃にて3時
間保温する。次いで、FBS含有Grace培地で細胞を洗った
後、FBS含有Grace培地20mlを細胞に添加し、5日間
27℃にて培養する。5日目に培養上清を回収して50
ml容の遠心チューブに採り、5000xgで15分間遠心分
離することにより細胞の破片を沈殿させ、遠心上清を回
収する。この上清全量を100,000xgで24時間遠心分離
し、ウイルス粒子をペレットとして得る。このペレット
を100μlのTEに懸濁し、当量のTE飽和フェノールを
加え、穏やかに室温にて24時間混合する。これを10,0
00xg、10分間遠心分離した後、水層を回収し、これに
当量のクロロホルムを加え10分間穏やかに混合し、再
度10,000xg、10分間の遠心分離を行う。水層を回収
し、該水層に終濃度0.2Mとなる量のNaClと2.5倍
量のエタノールを加え、本発明遺伝子を含有するウイル
スベクターのDNAを沈殿として回収する。
スベクターおよびウイルス粒子の作製) 1x106個のSf21細胞(ATCCから入手)を75c
m2のT型フラスコ(ファルコン社製)中で、10%FBSお
よび2%Yeastlateを含むGrace's medium(以下、FBS含有
Grace培地と記す。)を用いて27℃にて一晩培養す
る。一方、実施例3のようにして作製される本発明遺伝
子がpVL1392に組込まれたトランスファーベクターのDNA
10μgと、直鎖状に調製されたウイルスゲノムのDNA
Baculo gold(Pharmingen社製)20ngとをGrace's medi
um 100μlに添加し、滅菌水で2倍に希釈したリポフェ
クチン(GIBCO社製)10μlを加え、室温にて30分
間放置する。一晩培養された前記のSf21細胞の培養上清
を除き、血清を含まないGrace's medium少量で細胞を洗
った後、同培地5mlを細胞に添加し、これに前記のリ
ポフェクチン−DNA混合液を全量加え、27℃にて3時
間保温する。次いで、FBS含有Grace培地で細胞を洗った
後、FBS含有Grace培地20mlを細胞に添加し、5日間
27℃にて培養する。5日目に培養上清を回収して50
ml容の遠心チューブに採り、5000xgで15分間遠心分
離することにより細胞の破片を沈殿させ、遠心上清を回
収する。この上清全量を100,000xgで24時間遠心分離
し、ウイルス粒子をペレットとして得る。このペレット
を100μlのTEに懸濁し、当量のTE飽和フェノールを
加え、穏やかに室温にて24時間混合する。これを10,0
00xg、10分間遠心分離した後、水層を回収し、これに
当量のクロロホルムを加え10分間穏やかに混合し、再
度10,000xg、10分間の遠心分離を行う。水層を回収
し、該水層に終濃度0.2Mとなる量のNaClと2.5倍
量のエタノールを加え、本発明遺伝子を含有するウイル
スベクターのDNAを沈殿として回収する。
【0018】実施例5(本発明遺伝子を含有するウイル
スベクターがSf21細胞へ導入されてなる形質転換体の作
製と本発明のダイオキシンレセプターの製造) Sf21細胞(ATCCから入手)を75cm2のT型フラ
スコ(ファルコン社製)に1x106個ずつ計10枚播
種し、27℃にてFBS含有GRACE培地で培養する。この細
胞に、実施例4のように調製される組換えウイルス粒子
を含む培養上清を10μl/フラスコの割合で加え、そ
のまま4日間培養する。この培養上清を採取し、前記と
同様に75cm2のT型フラスコ(ファルコン社製)1
0枚に培養したSf21細胞へ、該培養上清をフラスコ一枚
あたり1mlずつ加え、60時間培養する。60時間
後、細胞をピペッテイングにより懸濁してフラスコから
回収し、得られた細胞懸濁液を5,000xgで15分間
遠心分離し細胞をペレットとする。この細胞のペレット
を20mM HEPES pH7,1mM EDTA,1mM DTT,0.5mM PMSFバッフ
ァーに懸濁した後、得られる細胞懸濁液をダウンス型ガ
ラスホモジナイザーで上下に30回ホモジナイズし細胞
を破砕する。この破砕液を30,000xgで1時間超遠心分
離して上清画分を回収することにより、本発明のダイオ
キシンレセプターを含む画分を得る。
スベクターがSf21細胞へ導入されてなる形質転換体の作
製と本発明のダイオキシンレセプターの製造) Sf21細胞(ATCCから入手)を75cm2のT型フラ
スコ(ファルコン社製)に1x106個ずつ計10枚播
種し、27℃にてFBS含有GRACE培地で培養する。この細
胞に、実施例4のように調製される組換えウイルス粒子
を含む培養上清を10μl/フラスコの割合で加え、そ
のまま4日間培養する。この培養上清を採取し、前記と
同様に75cm2のT型フラスコ(ファルコン社製)1
0枚に培養したSf21細胞へ、該培養上清をフラスコ一枚
あたり1mlずつ加え、60時間培養する。60時間
後、細胞をピペッテイングにより懸濁してフラスコから
回収し、得られた細胞懸濁液を5,000xgで15分間
遠心分離し細胞をペレットとする。この細胞のペレット
を20mM HEPES pH7,1mM EDTA,1mM DTT,0.5mM PMSFバッフ
ァーに懸濁した後、得られる細胞懸濁液をダウンス型ガ
ラスホモジナイザーで上下に30回ホモジナイズし細胞
を破砕する。この破砕液を30,000xgで1時間超遠心分
離して上清画分を回収することにより、本発明のダイオ
キシンレセプターを含む画分を得る。
【0019】実施例6(本発明遺伝子が染色体に導入さ
れたレポーターアッセイ用形質転換体の作製) Isogen試薬(ニッポンジーン社製)を用いて該試薬に添
付のプロトコールに記載の方法で、ヒト由来のHepG2細
胞からゲノムDNAを調製した。得られたゲノムDNAを
鋳型として、配列番号18で示される塩基配列からなる
オリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)および配
列番号19で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チド(リバースプライマー)を用いてPCRを行なうこと
により、ヒトCYP1A1遺伝子上流のTATAboxから7
50bp上流〜1370bp上流の領域の塩基配列(J.
Biochem.,110.232-236(1991))を有し、ダイオキシン応
答配列を含むDNAを増幅した。増幅されたDNAを回
収し、その末端をBlunting kit(宝酒造社製)を用いて
平滑化した(以下、該DNAをXRE DNAと記す。)。
マウスメタロチオネインI遺伝子のTATA box近傍の塩基
配列とリーダー配列(Genbank Accession No.J00605)
に由来する塩基配列からなる2本のオリゴヌクレオチ
ド;5'-GATCTCGACTATAAAGAGGGCAGGCTGTCCTCTAAGCGTCAC
CACGACTTCA-3'(配列番号20)、および、5'-AGCTTGAA
GTCGTGGTGACGCTTAGAGGACAGCCTGCCCTCTTTATAGTCGA-3'
(配列番号21)をアニーリングさせて2本鎖DNAと
し、これにT4ポリヌクレオチドカイネースを作用させ
てその両末端をリン酸化した(以下、該DNAをTATA
DNAと記す。)。一方、ホタルルシフェラーゼ遺伝子
を含むプラスミドpGL3(プロメガ社製)を制限酵素Bgl
IIおよびHind IIIで消化した後、これにBacterial alka
line phosphatase(BAP)を加えて65℃で1時間保温し
た。次いで、該保温液を低融点アガロース(AgaroseL;
ニッポンジーン社製)を用いた電気泳動に供し、pGL3由
来のルシフェラーゼ遺伝子を含むBgl II−Hind III断片
の長さに相当する泳動度を示すバンド部分のゲルからD
NAを回収した。回収されたDNA約100ngと、前記のT
ATA DNA1μgとを混合し、T4リガーゼで結合させる
ことによりプラスミドpGL3−TATAを作製した。次に、pG
L3-TATAを制限酵素Sma Iで消化した後、BAPを加えて6
5℃で1時間保温した。該保温液を低融点アガロースゲ
ル電気泳動に供し、バンド部分のゲルからDNAを回収
した。該DNA約100ngと、上記 XRE DNA約1μ
gとを混合してT4リガーゼを反応させた後、該反応液中
のDNAをDH5αコンピテントセル(TOYOBO
製)へ導入した。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコ
ロニー数個からそれぞれの保有するプラスミドのDNA
を調製し、これらを制限酵素Kpn IおよびXho Iで消化し
て該消化液をアガロースゲル電気泳動で分析した。XRE
DNAに相当する約600bpのDNAがpGL3−TATAの
Sma I部位に1コピー導入された構造を有するプラスミ
ドを選択し、これをプラスミドpGL3−TATA-1A1と名づけ
た。次いで、プラスミドpUCSV-BSD(フナコシ社から購
入)をBamHIで消化し、ブラストサイジンSデアミナー
ゼ遺伝子発現カセットをコードするDNAを調製した。
該DNAと、前記プラスミドpGL3−TATA-1A1をBamHIで
消化しBAP処理して得られたDNAとを混合して、T4リ
ガーゼを反応させた後、該反応液を大腸菌 DH5αコ
ンピテントセル(TOYOBO製)に導入した。得られ
たアンピシリン耐性の大腸菌クローンからプラスミドD
NAを調製し、それぞれを制限酵素Bam HIで消化して該
消化液をアガロースゲル電気泳動で分析した。ブラスト
サイジンSデアミナーゼ遺伝子発現カセットがプラスミ
ドpGL3−TATA-1A1のBam HI切断部位に挿入された構造を
有するプラスミドを選択し、プラスミドpGL3-TATA-1A1-
BSDと名づけた。次に、プラスミドpGL3-TATA-1A1-BSDの
DNAを制限酵素SalIで消化し、また、本発明遺伝子が
pRC/RSVに組込まれた本発明ベクターのDNAをPvuIで
消化した。一方、HeLa細胞を、10%FBSを含む
DMEM培地(日水製薬社製)を用いて37℃にて5%
CO2存在下に、直径約10cmのシャーレ(ファルコ
ン社製)を用いて培養した。約5x105の細胞を培養
し、翌日、該細胞にリポフェクチン(GIBCO社製)
を用いたリポフェクション法で、上記2種の直鎖化され
たプラスミドのDNAを同時に導入した。リポフェクシ
ョン法の条件はリポフェクチンに添付されたマニュアル
の記載に従って、処理時間5時間、直鎖化されたプラス
ミドDNAの総量7μg(各々3.5μg)/シャー
レ、リポフェクチン量は20μl/シャーレとした。リ
ポフェクション後、10%FBSを含むDMEM培地中でそのまま
3日間培養した。次に、細胞をトリプシン処理でシャー
レから剥がし、約1/10量ずつ新しい10枚のシャー
レに播種し、そのまま次の日まで培養した。次に、G4
18(SIGMA社製)を最終濃度400μg/mlとなる
ように、および、ブラストサイジンSを最終濃度8μg
/mlとなるように培養液に添加し、培養を継続した。
一週間後、培地を、G418およびブラストサイジンS
を前記と同じ濃度となるよう添加した新しい培地に交換
し、更に培養を継続した。一週間後、同じ操作を再度行
った。さらに一週間後、倒立型顕微鏡でシャーレを観察
し、直径数mmのコロニー30個をそれぞれ、あらかじ
め培地を分注しておいた96穴ビュープレート(ベルト
ールド製)の各ウェルに移し、さらに培養を続けた。細
胞を、コンフルエントになる前にトリプシン処理により
剥がして回収し、それぞれ3等分して3枚の新しい96
穴ビュープレートに播種した。1枚はそのまま継代と培
養を続け、残り2枚の内の一方には最終濃度50nMとな
るよう3−メチルコランスレンを加え、もう一方には何
も加えないまま、それぞれを2日間培養した。2日後、
それぞれの培養上清を除き、200μl/wellのPBS(-)
で細胞を2回リンスした後、5倍に希釈した細胞溶解剤
PGC50(ニッポンジーン社製)を20μlずつ加え
て室温に30分間放置し細胞を溶解させた。このプレー
トを、酵素基質自動インジェクター付きルミノメーター
LB96p(ベルトールド社製)にそれぞれセットし、
50μlの基質液PGL100(ニッポンジーン社製)
を自動分注しながら、ルシフェラーゼ活性を測定した。
3−メチルコランスレンが添加された系の方が、3−メ
チルコランスレンが添加されていない系に比べ、2倍以
上高いルシフェラーゼ活性を示す形質転換体を選抜し
た。
れたレポーターアッセイ用形質転換体の作製) Isogen試薬(ニッポンジーン社製)を用いて該試薬に添
付のプロトコールに記載の方法で、ヒト由来のHepG2細
胞からゲノムDNAを調製した。得られたゲノムDNAを
鋳型として、配列番号18で示される塩基配列からなる
オリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)および配
列番号19で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チド(リバースプライマー)を用いてPCRを行なうこと
により、ヒトCYP1A1遺伝子上流のTATAboxから7
50bp上流〜1370bp上流の領域の塩基配列(J.
Biochem.,110.232-236(1991))を有し、ダイオキシン応
答配列を含むDNAを増幅した。増幅されたDNAを回
収し、その末端をBlunting kit(宝酒造社製)を用いて
平滑化した(以下、該DNAをXRE DNAと記す。)。
マウスメタロチオネインI遺伝子のTATA box近傍の塩基
配列とリーダー配列(Genbank Accession No.J00605)
に由来する塩基配列からなる2本のオリゴヌクレオチ
ド;5'-GATCTCGACTATAAAGAGGGCAGGCTGTCCTCTAAGCGTCAC
CACGACTTCA-3'(配列番号20)、および、5'-AGCTTGAA
GTCGTGGTGACGCTTAGAGGACAGCCTGCCCTCTTTATAGTCGA-3'
(配列番号21)をアニーリングさせて2本鎖DNAと
し、これにT4ポリヌクレオチドカイネースを作用させ
てその両末端をリン酸化した(以下、該DNAをTATA
DNAと記す。)。一方、ホタルルシフェラーゼ遺伝子
を含むプラスミドpGL3(プロメガ社製)を制限酵素Bgl
IIおよびHind IIIで消化した後、これにBacterial alka
line phosphatase(BAP)を加えて65℃で1時間保温し
た。次いで、該保温液を低融点アガロース(AgaroseL;
ニッポンジーン社製)を用いた電気泳動に供し、pGL3由
来のルシフェラーゼ遺伝子を含むBgl II−Hind III断片
の長さに相当する泳動度を示すバンド部分のゲルからD
NAを回収した。回収されたDNA約100ngと、前記のT
ATA DNA1μgとを混合し、T4リガーゼで結合させる
ことによりプラスミドpGL3−TATAを作製した。次に、pG
L3-TATAを制限酵素Sma Iで消化した後、BAPを加えて6
5℃で1時間保温した。該保温液を低融点アガロースゲ
ル電気泳動に供し、バンド部分のゲルからDNAを回収
した。該DNA約100ngと、上記 XRE DNA約1μ
gとを混合してT4リガーゼを反応させた後、該反応液中
のDNAをDH5αコンピテントセル(TOYOBO
製)へ導入した。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコ
ロニー数個からそれぞれの保有するプラスミドのDNA
を調製し、これらを制限酵素Kpn IおよびXho Iで消化し
て該消化液をアガロースゲル電気泳動で分析した。XRE
DNAに相当する約600bpのDNAがpGL3−TATAの
Sma I部位に1コピー導入された構造を有するプラスミ
ドを選択し、これをプラスミドpGL3−TATA-1A1と名づけ
た。次いで、プラスミドpUCSV-BSD(フナコシ社から購
入)をBamHIで消化し、ブラストサイジンSデアミナー
ゼ遺伝子発現カセットをコードするDNAを調製した。
該DNAと、前記プラスミドpGL3−TATA-1A1をBamHIで
消化しBAP処理して得られたDNAとを混合して、T4リ
ガーゼを反応させた後、該反応液を大腸菌 DH5αコ
ンピテントセル(TOYOBO製)に導入した。得られ
たアンピシリン耐性の大腸菌クローンからプラスミドD
NAを調製し、それぞれを制限酵素Bam HIで消化して該
消化液をアガロースゲル電気泳動で分析した。ブラスト
サイジンSデアミナーゼ遺伝子発現カセットがプラスミ
ドpGL3−TATA-1A1のBam HI切断部位に挿入された構造を
有するプラスミドを選択し、プラスミドpGL3-TATA-1A1-
BSDと名づけた。次に、プラスミドpGL3-TATA-1A1-BSDの
DNAを制限酵素SalIで消化し、また、本発明遺伝子が
pRC/RSVに組込まれた本発明ベクターのDNAをPvuIで
消化した。一方、HeLa細胞を、10%FBSを含む
DMEM培地(日水製薬社製)を用いて37℃にて5%
CO2存在下に、直径約10cmのシャーレ(ファルコ
ン社製)を用いて培養した。約5x105の細胞を培養
し、翌日、該細胞にリポフェクチン(GIBCO社製)
を用いたリポフェクション法で、上記2種の直鎖化され
たプラスミドのDNAを同時に導入した。リポフェクシ
ョン法の条件はリポフェクチンに添付されたマニュアル
の記載に従って、処理時間5時間、直鎖化されたプラス
ミドDNAの総量7μg(各々3.5μg)/シャー
レ、リポフェクチン量は20μl/シャーレとした。リ
ポフェクション後、10%FBSを含むDMEM培地中でそのまま
3日間培養した。次に、細胞をトリプシン処理でシャー
レから剥がし、約1/10量ずつ新しい10枚のシャー
レに播種し、そのまま次の日まで培養した。次に、G4
18(SIGMA社製)を最終濃度400μg/mlとなる
ように、および、ブラストサイジンSを最終濃度8μg
/mlとなるように培養液に添加し、培養を継続した。
一週間後、培地を、G418およびブラストサイジンS
を前記と同じ濃度となるよう添加した新しい培地に交換
し、更に培養を継続した。一週間後、同じ操作を再度行
った。さらに一週間後、倒立型顕微鏡でシャーレを観察
し、直径数mmのコロニー30個をそれぞれ、あらかじ
め培地を分注しておいた96穴ビュープレート(ベルト
ールド製)の各ウェルに移し、さらに培養を続けた。細
胞を、コンフルエントになる前にトリプシン処理により
剥がして回収し、それぞれ3等分して3枚の新しい96
穴ビュープレートに播種した。1枚はそのまま継代と培
養を続け、残り2枚の内の一方には最終濃度50nMとな
るよう3−メチルコランスレンを加え、もう一方には何
も加えないまま、それぞれを2日間培養した。2日後、
それぞれの培養上清を除き、200μl/wellのPBS(-)
で細胞を2回リンスした後、5倍に希釈した細胞溶解剤
PGC50(ニッポンジーン社製)を20μlずつ加え
て室温に30分間放置し細胞を溶解させた。このプレー
トを、酵素基質自動インジェクター付きルミノメーター
LB96p(ベルトールド社製)にそれぞれセットし、
50μlの基質液PGL100(ニッポンジーン社製)
を自動分注しながら、ルシフェラーゼ活性を測定した。
3−メチルコランスレンが添加された系の方が、3−メ
チルコランスレンが添加されていない系に比べ、2倍以
上高いルシフェラーゼ活性を示す形質転換体を選抜し
た。
【0020】実施例7(本発明遺伝子が染色体に導入さ
れた形質転換体を用いるレポーターアッセイ) 実施例6に記載のようにして作製されたHeLa細胞の形質
転換体を96穴ビュープレート(ベルトールド社から購
入)に約1.5x104細胞/wellずつ播種し、10%のチャコー
ルデキストラン処理済みFBS、400μg/mlのG418およ
び8μg/mlのブラストサイジンSを含むE-MEM培地(以
下、FBSおよび抗生物質含有E-MEM培地と記す。)で、5
% CO2条件下37℃にて1日間培養を行った。2,3,7,
8-TCDD(第一化学薬品)のDMSO(和光純薬社製)溶液を
2,3,7,8-TCDDの最終濃度が0.15pM〜150nMとなるよう添
加した、FBSおよび抗生物質含有E-MEM培地、ならびに前
記の2,3,7,8-TCDDのDMSO溶液の代わりにそれと同量のDM
SOを添加した、FBSおよび抗生物質含有E-MEM培地を調製
し、これらの培地をそれぞれ前記の細胞の培養上清と交
換した。該細胞をCO2インキュベーター中で培養し、2
4時間後に培養上清を除き、ウェルに接着している細胞
を剥がさないように100μl/ウェルのPBS(−)でウェルを
2回リンスし、5倍に希釈した細胞溶解剤PGC50
(ニッポンジーン社製)を15μl/wellずつ加えて、
時々軽くゆすりながら室温にて30分間放置して細胞を
溶解させた。このように調製された細胞溶解物が入った
ビュープレートを基質自動インジェクター付きのルミノ
メーターLB96p(ベルトールド社製)にセットし、50
μl/wellずつ酵素基質液PGL100(ニッポンジー
ン社製)を添加しながら直ちに発光量を1秒間測定し
た。なお、試験は6連の繰り返し試験数で行い測定値の
平均値を求めた。その結果、ダイオキシンレセプターの
リガンドとして知られている2,3,7,8-TCDDの濃度に依存
して転写活性の上昇が検出された(図1)。このような
本発明遺伝子が染色体に導入された形質転換体を用いた
レポーターアッセイによって、ダイオキシンレセプター
活性化能を有する物質を含む被験物を見出すことができ
る。
れた形質転換体を用いるレポーターアッセイ) 実施例6に記載のようにして作製されたHeLa細胞の形質
転換体を96穴ビュープレート(ベルトールド社から購
入)に約1.5x104細胞/wellずつ播種し、10%のチャコー
ルデキストラン処理済みFBS、400μg/mlのG418およ
び8μg/mlのブラストサイジンSを含むE-MEM培地(以
下、FBSおよび抗生物質含有E-MEM培地と記す。)で、5
% CO2条件下37℃にて1日間培養を行った。2,3,7,
8-TCDD(第一化学薬品)のDMSO(和光純薬社製)溶液を
2,3,7,8-TCDDの最終濃度が0.15pM〜150nMとなるよう添
加した、FBSおよび抗生物質含有E-MEM培地、ならびに前
記の2,3,7,8-TCDDのDMSO溶液の代わりにそれと同量のDM
SOを添加した、FBSおよび抗生物質含有E-MEM培地を調製
し、これらの培地をそれぞれ前記の細胞の培養上清と交
換した。該細胞をCO2インキュベーター中で培養し、2
4時間後に培養上清を除き、ウェルに接着している細胞
を剥がさないように100μl/ウェルのPBS(−)でウェルを
2回リンスし、5倍に希釈した細胞溶解剤PGC50
(ニッポンジーン社製)を15μl/wellずつ加えて、
時々軽くゆすりながら室温にて30分間放置して細胞を
溶解させた。このように調製された細胞溶解物が入った
ビュープレートを基質自動インジェクター付きのルミノ
メーターLB96p(ベルトールド社製)にセットし、50
μl/wellずつ酵素基質液PGL100(ニッポンジー
ン社製)を添加しながら直ちに発光量を1秒間測定し
た。なお、試験は6連の繰り返し試験数で行い測定値の
平均値を求めた。その結果、ダイオキシンレセプターの
リガンドとして知られている2,3,7,8-TCDDの濃度に依存
して転写活性の上昇が検出された(図1)。このような
本発明遺伝子が染色体に導入された形質転換体を用いた
レポーターアッセイによって、ダイオキシンレセプター
活性化能を有する物質を含む被験物を見出すことができ
る。
【0021】実施例8(レセプターバインディングアッ
セイ) 結合反応バッファーは、最終組成が20mM HEPES-KOH pH
7.9, 10mMモリブデン酸ナトリウム, 1mM DTT, 0.5mM ED
TA, 0.5mM PMSF(いずれも和光純薬製)となるように調
製する。反応液は総容量を100μlとし、本発明のダ
イオキシンレセプターを含む細胞抽出物を10μg蛋白
質相当量添加し、トリチウム標識された2,3,7,8-TCDDを
1pMから10nM程度になるよう添加する。非特異的結合を
調べるための試験区には標識されていない2,3,7,8-TCDD
を最終濃度10μMになるようにさらに加える。結合反応
は、以下のように行う。上記の反応液を氷上で15時間
保温した後、チャコールデキストラン液[組成:10mM Tr
is-HCl、0.2%の酸洗活性炭(ナカライテスク社製Norit
A)、0.005%ファルマシアDextran T70]を100μl加
え、10分間氷上に放置する。この反応液を低速遠心機
で1,000xgで10分間遠心分離して活性炭を沈殿させ、上
清を100μl分取し、その放射能量を液体シンチレー
ションカウンターで測定する。この測定値を基に、該上
清中の標識2,3,7,8-TCDD量、すなわち、レセプターに結
合した標識2,3,7,8-TCDD量(結合型標識リガンド量)を
求める。標識2,3,7,8-TCDDのみが添加された試験区の結
合型標識リガンド量は、標識2,3,7,8-TCDDのレセプター
に対する全結合量に相当する。一方、標識2,3,7,8-TCDD
に加え標識されていない2,3,7,8-TCDDが添加された試験
区の結合型標識リガンド量は、標識2,3,7,8-TCDDのレセ
プターに対する非特異的結合量に相当する。各種濃度の
標識2,3,7,8-TCDDが添加された反応液それぞれについ
て、全結合量から非特異的結合量を差し引いて、その反
応液における標識リガンドのレセプターに対する特異的
結合量を求める。次いで、Y軸に(特異的結合標識リガ
ンド濃度/遊離標識リガンド濃度)、X軸に特異的結合標
識リガンド濃度をプロットし、スキャッチャード解析す
ることにより、本発明のダイオキシンレセプターの2,3,
7,8-TCDDに対するKd値を求める。ダイオキシンレセプタ
ーに対する被験物の親和性を測定するには、上記と同様
にして1nM程度のトリチウム標識2,3,7,8-TCDDが入って
いるバインデイングアッセイ結合反応液へ被験物を終濃
度が1%程度となるよう添加する。なお被験物が添加さ
れない反応液には、被験物と同量の溶媒を系に加える。
被験物添加によりレセプターに対する標識2,3,7,8-TCDD
の結合量が低下する場合は、その被験物にはダイオキシ
ンレセプターに結合する物質が含まれると判断される。
セイ) 結合反応バッファーは、最終組成が20mM HEPES-KOH pH
7.9, 10mMモリブデン酸ナトリウム, 1mM DTT, 0.5mM ED
TA, 0.5mM PMSF(いずれも和光純薬製)となるように調
製する。反応液は総容量を100μlとし、本発明のダ
イオキシンレセプターを含む細胞抽出物を10μg蛋白
質相当量添加し、トリチウム標識された2,3,7,8-TCDDを
1pMから10nM程度になるよう添加する。非特異的結合を
調べるための試験区には標識されていない2,3,7,8-TCDD
を最終濃度10μMになるようにさらに加える。結合反応
は、以下のように行う。上記の反応液を氷上で15時間
保温した後、チャコールデキストラン液[組成:10mM Tr
is-HCl、0.2%の酸洗活性炭(ナカライテスク社製Norit
A)、0.005%ファルマシアDextran T70]を100μl加
え、10分間氷上に放置する。この反応液を低速遠心機
で1,000xgで10分間遠心分離して活性炭を沈殿させ、上
清を100μl分取し、その放射能量を液体シンチレー
ションカウンターで測定する。この測定値を基に、該上
清中の標識2,3,7,8-TCDD量、すなわち、レセプターに結
合した標識2,3,7,8-TCDD量(結合型標識リガンド量)を
求める。標識2,3,7,8-TCDDのみが添加された試験区の結
合型標識リガンド量は、標識2,3,7,8-TCDDのレセプター
に対する全結合量に相当する。一方、標識2,3,7,8-TCDD
に加え標識されていない2,3,7,8-TCDDが添加された試験
区の結合型標識リガンド量は、標識2,3,7,8-TCDDのレセ
プターに対する非特異的結合量に相当する。各種濃度の
標識2,3,7,8-TCDDが添加された反応液それぞれについ
て、全結合量から非特異的結合量を差し引いて、その反
応液における標識リガンドのレセプターに対する特異的
結合量を求める。次いで、Y軸に(特異的結合標識リガ
ンド濃度/遊離標識リガンド濃度)、X軸に特異的結合標
識リガンド濃度をプロットし、スキャッチャード解析す
ることにより、本発明のダイオキシンレセプターの2,3,
7,8-TCDDに対するKd値を求める。ダイオキシンレセプタ
ーに対する被験物の親和性を測定するには、上記と同様
にして1nM程度のトリチウム標識2,3,7,8-TCDDが入って
いるバインデイングアッセイ結合反応液へ被験物を終濃
度が1%程度となるよう添加する。なお被験物が添加さ
れない反応液には、被験物と同量の溶媒を系に加える。
被験物添加によりレセプターに対する標識2,3,7,8-TCDD
の結合量が低下する場合は、その被験物にはダイオキシ
ンレセプターに結合する物質が含まれると判断される。
【0022】
【発明の効果】本発明により、ダイオキシン様物質の測
定法に利用することのできる新たなダイオキシンレセプ
ター遺伝子等が提供可能となる。 [配列表フリーテキスト] 配列番号3 PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号4 PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号5 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号6 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号7 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号8 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号9 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号10 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号11 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号12 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号13 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号14 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号15 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号16 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号17 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号18 PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号19 PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号20 プロモーターDNAを作製するために設計されたオリゴヌ
クレオチド 配列番号21 プロモーターDNAを作製するために設計されたオリゴヌ
クレオチド
定法に利用することのできる新たなダイオキシンレセプ
ター遺伝子等が提供可能となる。 [配列表フリーテキスト] 配列番号3 PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号4 PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号5 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号6 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号7 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号8 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号9 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号10 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号11 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号12 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号13 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号14 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号15 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号16 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号17 塩基配列を決定するために設計されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー 配列番号18 PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号19 PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ
ー 配列番号20 プロモーターDNAを作製するために設計されたオリゴヌ
クレオチド 配列番号21 プロモーターDNAを作製するために設計されたオリゴヌ
クレオチド
【0023】
【配列表】 <110> Sumitomo Chemical Company Limited <120> Dioxin receptor gene <130> P150988 <150> JP 11/109646 <151> 1999-04-16 <160> 21 <210> 1 <211> 846 <212> PRT <213> Cava porcellus <400> 1 Met Asn Ser Gly Gly Ala Asn Ile Thr Tyr Ala Ser Arg Lys Arg Arg 1 5 10 15 Lys Pro Val Gln Lys Thr Val Lys Pro Ile Pro Ala Glu Gly Ile Lys 20 25 30 Ser Asn Pro Ser Lys Arg His Arg Asp Arg Leu Asn Thr Glu Leu Asp 35 40 45 Arg Leu Ala Ser Leu Leu Pro Phe Pro Gln Asp Val Ile Asn Lys Leu 50 55 60 Asp Lys Leu Ser Val Leu Arg Leu Ser Val Ser Tyr Leu Arg Ala Lys 65 70 75 80 Ser Phe Phe Asp Val Ala Leu Lys Ser Ser Pro Thr Asp Arg Asn Gly 85 90 95 Gly Gln Asp Asp Cys Gly Ala Pro Phe Arg Ser Arg Leu Asn Leu Gln 100 105 110 Glu Gly Glu Phe Leu Leu Gln Ala Leu Asn Gly Phe Val Leu Ala Val 115 120 125 Thr Thr Asp Ala Leu Val Phe Tyr Val Ser Ser Thr Ile Gln Asp Tyr 130 135 140 Leu Gly Phe Gln Gln Ser Asp Val Ile His Gln Ser Val Tyr Glu Leu 145 150 155 160 Ile His Thr Glu Asp Arg Ala Glu Phe Gln Arg Gln Leu His Trp Ala 165 170 175 Phe Asn Pro Ser Gln Cys Ser Asp Ser Gly Gln Ala Ile Pro Glu Pro 180 185 190 His Gly Leu Pro Gln Pro Gly Val Ser Tyr Thr Thr Glu Arg Leu Pro 195 200 205 Pro Glu Asn Ser Pro Leu Met Glu Arg Cys Phe Val Cys Arg Leu Arg 210 215 220 Cys Leu Leu Asp Asn Ser Ser Gly Phe Leu Ala Met Asn Phe Gln Gly 225 230 235 240 Arg Leu Lys Tyr Leu His Gly Gln Asn Lys Lys Gly Lys Asp Gly Ser 245 250 255 Val Leu Pro Pro Gln Leu Ala Leu Phe Ala Ile Ala Thr Pro Leu Gln 260 265 270 Ser Pro Ser Ile Leu Glu Leu Arg Thr Lys Asn Phe Leu Phe Arg Thr 275 280 285 Lys His Lys Leu Asp Phe Thr Pro Ile Gly Cys Asp Ala Lys Gly Gln 290 295 300 Ile Val Leu Gly Tyr Thr Glu Ala Glu Leu Cys Ala Lys Gly Ser Gly 305 310 315 320 Tyr Gln Phe Ile His Ala Gly Asp Met Leu His Cys Ala Glu Tyr His 325 330 335 Met Arg Met Ile Lys Thr Gly Glu Ser Gly Met Thr Val Phe Arg Leu 340 345 350 Leu Thr Lys His Asn Arg Trp Ile Trp Met Gln Ser Asn Ala Arg Val 355 360 365 Val Tyr Lys Asn Gly Arg Pro Asp Tyr Ile Ile Ala Thr Gln Arg Ala 370 375 380 Leu Thr Asp Glu Glu Gly Arg Glu His Leu Arg Lys Arg Gly Val Lys 385 390 395 400 Leu Pro Phe Met Phe Thr Thr Gly Glu Ala Val Leu Tyr Glu Thr Ser 405 410 415 Lys Ser Phe Pro Pro Gly Met Asp Ser Leu Pro Thr Gln Thr Lys Ser 420 425 430 Ala Thr Asn Gly Gln Gly Ser Ala Thr Leu Ser Thr Glu Lys Gly Ser 435 440 445 Pro His Pro Thr Ser Leu Leu Ala Ser Met Met Gln Gln Asp Glu Ser 450 455 460 Ile Tyr His Cys Pro Ala Ser Asn Thr Val Pro Phe Glu Thr Asn Phe 465 470 475 480 Phe Asn Asp Leu Ile Glu Tyr Ser Asn Trp Gln Asp Gly Ile Ala Pro 485 490 495 Met Arg Asn Asp Asn Ile Phe Lys His Lys Gln Ile Gly Gln Thr Gln 500 505 510 Glu Met Asn Pro Met Leu Ser Gly Gly His Thr Val Pro Phe Ser Asp 515 520 525 Asn Lys Asn Ser Glu Leu Tyr Ser Ile Met Lys Asn Leu Gly Ile Asp 530 535 540 Phe Glu Asp Ile Lys Cys Met Gln Asn Glu Glu Phe Phe Arg Thr Asp 545 550 555 560 Ala Ser Ser Glu Val Asp Phe Arg Asp Ile Asp Val Arg Asp Glu Ile 565 570 575 Leu Thr Tyr Val Gln Asp Ser Leu Ser Lys Ser Pro Phe Leu Ser Ser 580 585 590 Glu Tyr Gln Gln Gln Gln Ala Val Ala Leu Asn Ser Ser Cys Met Val 595 600 605 Gln Glu Gln Leu Gly Leu Glu Gln Gln Gln Gln Leu Gln Leu His Gly 610 615 620 Lys Pro Ile Val Val Glu Pro Gln Gln Gln Leu Cys Gln Lys Met Lys 625 630 635 640 His Met Gln Val Asn Gly Leu Leu Gly Asn Trp Ser Ala Gly Ser Ser 645 650 655 Val Pro Phe Ser Cys Pro Pro Gln Asp Leu Gln Gln Tyr Asn Met Phe 660 665 670 Pro Asp Leu His Gly Ala Asn Pro Glu Phe Pro Tyr Lys Ser Glu Leu 675 680 685 Glu Thr Val Pro Tyr Thr Gln Asn Phe Ala Pro Cys Glu Gln Pro Leu 690 695 700 Leu Pro Gln Arg Ser Lys Gly Thr Gln Leu Glu Phe Pro Ile Glu Asn 705 710 715 720 Phe Glu Pro Ser Leu Tyr Pro Thr Thr Ser Asn Leu Glu Gly Phe Ala 725 730 735 Ser Cys Leu Gln Val Pro Glu Asn Gln Arg His Gly Ile Asn Pro Gln 740 745 750 Ser Ser Ile Val Thr Pro Gln Thr Cys Tyr Ala Gly Thr Met Ser Ala 755 760 765 Tyr Gln Cys Gln Pro Glu Pro Gln His Ser His Val Asp Gln Met Gln 770 775 780 Tyr Asn Pro Ala Val Pro Gly Pro Gln Val Phe Leu Asn Lys Phe Pro 785 790 795 800 Asn Gly Gly Val Leu Asn Asp Val Tyr Pro Ala Gly Leu Asn Asp Ile 805 810 815 Asn Asn Thr Gln Ala Ala Thr His Leu Gln Pro Phe His His Pro Val 820 825 830 Glu Thr Arg Pro Phe Pro Asp Leu Thr Pro Ser Gly Phe Leu 835 840 845 <210> 2 <211> 3156 <212> DNA <213> Cava porcellus <220> <221> CDS <222> (40)...(2580) <400> 2 acctgcgcgc ggggacgcgg gacgcggcgg ggcggcacc atg aac agc ggc ggc 54 Met Asn Ser Gly Gly 1 5 gcc aac atc acc tac gcc agc cgc aag cgg cgg aag ccg gtg cag aaa 102 Ala Asn Ile Thr Tyr Ala Ser Arg Lys Arg Arg Lys Pro Val Gln Lys 10 15 20 aca gta aag cca atc cca gct gaa gga atc aag tca aat cct tcc aag 150 Thr Val Lys Pro Ile Pro Ala Glu Gly Ile Lys Ser Asn Pro Ser Lys 25 30 35 cga cat aga gat cga ctt aat act gag ttg gac cgt ttg gcc agt ctg 198 Arg His Arg Asp Arg Leu Asn Thr Glu Leu Asp Arg Leu Ala Ser Leu 40 45 50 ctg cct ttt cca caa gat gtt att aac aag ctg gac aaa ctt tca gtt 246 Leu Pro Phe Pro Gln Asp Val Ile Asn Lys Leu Asp Lys Leu Ser Val 55 60 65 ctt agg ctc agt gtc agt tac ctg aga gcc aaa agc ttc ttt gac gtt 294 Leu Arg Leu Ser Val Ser Tyr Leu Arg Ala Lys Ser Phe Phe Asp Val 70 75 80 85 gca tta aaa tct tcc ccc act gat aga aac ggg ggc cag gat gac tgt 342 Ala Leu Lys Ser Ser Pro Thr Asp Arg Asn Gly Gly Gln Asp Asp Cys 90 95 100 gga gca ccg ttc aga agt cgt ttg aac ttg caa gaa gga gaa ttt tta 390 Gly Ala Pro Phe Arg Ser Arg Leu Asn Leu Gln Glu Gly Glu Phe Leu 105 110 115 tta cag gct ctg aat ggc ttt gta ttg gct gtc act aca gat gct ttg 438 Leu Gln Ala Leu Asn Gly Phe Val Leu Ala Val Thr Thr Asp Ala Leu 120 125 130 gtc ttt tat gtg tct tca act ata caa gat tac ctg ggc ttt cag caa 486 Val Phe Tyr Val Ser Ser Thr Ile Gln Asp Tyr Leu Gly Phe Gln Gln 135 140 145 tct gat gtc ata cat cag agt gtg tat gaa ctt atc cac act gaa gat 534 Ser Asp Val Ile His Gln Ser Val Tyr Glu Leu Ile His Thr Glu Asp 150 155 160 165 cga gct gaa ttt cag cgt cag ctc cat tgg gca ttc aac cct tca cag 582 Arg Ala Glu Phe Gln Arg Gln Leu His Trp Ala Phe Asn Pro Ser Gln 170 175 180 tgt tca gac tct gga caa gca att cct gaa cct cat ggc ctc cca cag 630 Cys Ser Asp Ser Gly Gln Ala Ile Pro Glu Pro His Gly Leu Pro Gln 185 190 195 cca gga gtc tct tac acc aca gag cgg ctt cct cca gaa aac tcc cct 678 Pro Gly Val Ser Tyr Thr Thr Glu Arg Leu Pro Pro Glu Asn Ser Pro 200 205 210 tta atg gag agg tgc ttc gta tgc cga cta agg tgt ttg ctg gat aat 726 Leu Met Glu Arg Cys Phe Val Cys Arg Leu Arg Cys Leu Leu Asp Asn 215 220 225 tca tct ggc ttc ctg gca atg aat ttc caa gga agg tta aag tat ctt 774 Ser Ser Gly Phe Leu Ala Met Asn Phe Gln Gly Arg Leu Lys Tyr Leu 230 235 240 245 cac ggt cag aac aag aaa ggg aag gac ggg tca gtc ctt cct ccg cag 822 His Gly Gln Asn Lys Lys Gly Lys Asp Gly Ser Val Leu Pro Pro Gln 250 255 260 ctg gct ttg ttt gcc atc gcc act cca ctg cag tcc cca tcc ata ctt 870 Leu Ala Leu Phe Ala Ile Ala Thr Pro Leu Gln Ser Pro Ser Ile Leu 265 270 275 gaa ctt cga acc aaa aat ttc ctt ttt aga acc aaa cac aaa ctg gat 918 Glu Leu Arg Thr Lys Asn Phe Leu Phe Arg Thr Lys His Lys Leu Asp 280 285 290 ttt act cct att ggt tgt gat gcc aaa ggg cag att gtt tta ggg tac 966 Phe Thr Pro Ile Gly Cys Asp Ala Lys Gly Gln Ile Val Leu Gly Tyr 295 300 305 act gaa gca gaa ctg tgc gcc aaa ggg tcg ggg tat cag ttc att cat 1014 Thr Glu Ala Glu Leu Cys Ala Lys Gly Ser Gly Tyr Gln Phe Ile His 310 315 320 325 gct ggg gat atg ctt cat tgt gct gag tac cat atg cga atg att aag 1062 Ala Gly Asp Met Leu His Cys Ala Glu Tyr His Met Arg Met Ile Lys 330 335 340 act gga gaa agt ggc atg aca gtt ttc agg ctt ctt aca aaa cac aac 1110 Thr Gly Glu Ser Gly Met Thr Val Phe Arg Leu Leu Thr Lys His Asn 345 350 355 cgg tgg atc tgg atg cag tct aat gca cgt gta gtt tat aaa aat gga 1158 Arg Trp Ile Trp Met Gln Ser Asn Ala Arg Val Val Tyr Lys Asn Gly 360 365 370 aga ccg gat tat atc att gca act caa cga gct cta aca gat gaa gaa 1206 Arg Pro Asp Tyr Ile Ile Ala Thr Gln Arg Ala Leu Thr Asp Glu Glu 375 380 385 gga aga gag cat tta cgg aag cgc ggt gtg aaa ttg cct ttt atg ttt 1254 Gly Arg Glu His Leu Arg Lys Arg Gly Val Lys Leu Pro Phe Met Phe 390 395 400 405 acc act gga gaa gct gtg ttg tat gag acc agc aaa tct ttc ccc cct 1302 Thr Thr Gly Glu Ala Val Leu Tyr Glu Thr Ser Lys Ser Phe Pro Pro 410 415 420 ggg atg gat tcc tta cca aca cag act aaa agc gca act aat gga caa 1350 Gly Met Asp Ser Leu Pro Thr Gln Thr Lys Ser Ala Thr Asn Gly Gln 425 430 435 ggt tct gct acc ctg tca act gag aag ggt tct ccc cat ccc act tcc 1398 Gly Ser Ala Thr Leu Ser Thr Glu Lys Gly Ser Pro His Pro Thr Ser 440 445 450 ctg ttg gct tcc atg atg cag caa gat gag tct att tat cac tgc cct 1446 Leu Leu Ala Ser Met Met Gln Gln Asp Glu Ser Ile Tyr His Cys Pro 455 460 465 gct tca aat act gta cct ttt gaa aca aat ttt ttt aat gat tta att 1494 Ala Ser Asn Thr Val Pro Phe Glu Thr Asn Phe Phe Asn Asp Leu Ile 470 475 480 485 gaa tac agt aat tgg caa gat ggt att gca cca atg aga aat gac aat 1542 Glu Tyr Ser Asn Trp Gln Asp Gly Ile Ala Pro Met Arg Asn Asp Asn 490 495 500 atc ttc aaa cat aag caa att gga cag act caa gag atg aac cca atg 1590 Ile Phe Lys His Lys Gln Ile Gly Gln Thr Gln Glu Met Asn Pro Met 505 510 515 ctt tct gga ggt cac aca gtc ccc ttt tca gat aat aaa aat agt gaa 1638 Leu Ser Gly Gly His Thr Val Pro Phe Ser Asp Asn Lys Asn Ser Glu 520 525 530 ttg tac agc att atg aaa aac cta ggc att gat ttt gaa gat atc aag 1686 Leu Tyr Ser Ile Met Lys Asn Leu Gly Ile Asp Phe Glu Asp Ile Lys 535 540 545 tgc atg cag aac gag gaa ttt ttc aga act gat gct tcc agt gag gtc 1734 Cys Met Gln Asn Glu Glu Phe Phe Arg Thr Asp Ala Ser Ser Glu Val 550 555 560 565 gac ttc aga gac ata gac gta agg gat gaa ata cta aca tat gtc caa 1782 Asp Phe Arg Asp Ile Asp Val Arg Asp Glu Ile Leu Thr Tyr Val Gln 570 575 580 gat tct tta agt aag tcc cca ttc ctg agt tca gag tac cag cag caa 1830 Asp Ser Leu Ser Lys Ser Pro Phe Leu Ser Ser Glu Tyr Gln Gln Gln 585 590 595 cag gct gtt gct ctg aat tca agc tgt atg gta caa gaa caa cta ggg 1878 Gln Ala Val Ala Leu Asn Ser Ser Cys Met Val Gln Glu Gln Leu Gly 600 605 610 ttg gaa cag cag cag cag ctg cag ctc cat ggg aag ccc ata gtg gtg 1926 Leu Glu Gln Gln Gln Gln Leu Gln Leu His Gly Lys Pro Ile Val Val 615 620 625 gag cca cag caa caa ctg tgt cag aaa atg aaa cac atg caa gtt aat 1974 Glu Pro Gln Gln Gln Leu Cys Gln Lys Met Lys His Met Gln Val Asn 630 635 640 645 ggc ctg ctt gga aac tgg agc gct ggc tca tct gtg cct ttc agt tgt 2022 Gly Leu Leu Gly Asn Trp Ser Ala Gly Ser Ser Val Pro Phe Ser Cys 650 655 660 cct cca caa gac cta caa cag tat aat atg ttt cca gat tta cac ggg 2070 Pro Pro Gln Asp Leu Gln Gln Tyr Asn Met Phe Pro Asp Leu His Gly 665 670 675 gcg aat cca gag ttt ccc tac aaa tct gag ctg gag act gtg cct tac 2118 Ala Asn Pro Glu Phe Pro Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Thr Val Pro Tyr 680 685 690 aca cag aac ttt gct ccc tgt gag cag ccg tta tta ccc cag cgt tct 2166 Thr Gln Asn Phe Ala Pro Cys Glu Gln Pro Leu Leu Pro Gln Arg Ser 695 700 705 aag gga aca cag ttg gag ttt ccc ata gag aat ttc gaa cca tcc ctc 2214 Lys Gly Thr Gln Leu Glu Phe Pro Ile Glu Asn Phe Glu Pro Ser Leu 710 715 720 725 tac cct aca act tca aat tta gaa ggt ttt gcc agt tgt tta caa gtt 2262 Tyr Pro Thr Thr Ser Asn Leu Glu Gly Phe Ala Ser Cys Leu Gln Val 730 735 740 cct gaa aac caa agg cat gga ata aac cca cag tcc tct ata gta act 2310 Pro Glu Asn Gln Arg His Gly Ile Asn Pro Gln Ser Ser Ile Val Thr 745 750 755 ccc cag acg tgt tat gct ggg acc atg tca gca tat cag tgc caa cca 2358 Pro Gln Thr Cys Tyr Ala Gly Thr Met Ser Ala Tyr Gln Cys Gln Pro 760 765 770 gaa cct cag cac agc cat gtg gat cag atg cag tac aat cca gca gtt 2406 Glu Pro Gln His Ser His Val Asp Gln Met Gln Tyr Asn Pro Ala Val 775 780 785 ccg ggt cca cag gtg ttt tta aac aag ttt ccg aat gga gga gtt tta 2454 Pro Gly Pro Gln Val Phe Leu Asn Lys Phe Pro Asn Gly Gly Val Leu 790 795 800 805 aat gac gtg tac cct gcg gga tta aat gac ata aat aac act cag gct 2502 Asn Asp Val Tyr Pro Ala Gly Leu Asn Asp Ile Asn Asn Thr Gln Ala 810 815 820 gcc aca cat ctt cag cca ttt cat cac cca gtg gaa acc aga cct ttc 2550 Ala Thr His Leu Gln Pro Phe His His Pro Val Glu Thr Arg Pro Phe 825 830 835 cct gac ttg aca ccc agt gga ttc ctg taa tggcaaaccc agctttcact 2600 Pro Asp Leu Thr Pro Ser Gly Phe Leu 840 845 ttaatttttg attagtttgt gaagaatcac agaattaaaa aaaacgtcag tgttggttga 2660 cagcaagttc acacggtggc agtggtgcat gttgtttgca ctgttgattc cgaaccagat 2720 tttaaccttg gcttttgtaa aattcaacat tacacggact gaccttggta aagcagaaca 2780 tgtgctgcca gagtacacat ttcacatcct ctgggtacca caggacatgc aaaacttact 2840 caggagaaca ttaagacctt tgaaatcaag agactttcac catgtgaatt attgctgtca 2900 gaataaaaat gaaatacgtt aaatgttgaa cttacagatt ctcatcagtg tattagtaca 2960 aaggtaaaag actaacttct ctccctcttt ttcatctctg ctttttctca cctattaaat 3020 ggtttcgtgt ttttatgaaa agatcctctc aatgctttcc tcctgcactg ttaatgagaa 3080 cacagccact agtttgtcca agtctgggtg tgggtgggga ccttgtccgt tgtgaaagcc 3140 agtatcacgt gtgtct 3156 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 3 ggcaccatga acagcggcgg cgccaacatc acctac 36 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 4 gctgggtttg ccattacagg aatccactgg gtgtc 35 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to determine nucleotide sequence <400> 5 gcggcgccaa catcacctac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to determine nucleotide sequence <400> 6 gtaggtgatg ttggcgccgc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to determine nucleotide sequence <400> 7 acactgagcc taagaactga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to determine nucleotide sequence <400> 8 tcagttctta ggctcagtgt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to determine nucleotide sequence <400> 9 cagcaatctg atgtcataca 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to determine nucleotide sequence <400> 10 gataattcat ctggcttcct 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to determine nucleotide sequence <400> 11 gggtacactg aagcagaact 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to determine nucleotide sequence <400> 12 tacggaagcg cggtgtgaaa 20 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to determine nucleotide sequence <400> 13 tgccctgctt caaatactg 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to determine nucleotide sequence <400> 14 atcaagtgca tgcagaacg 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to determine nucleotide sequence <400> 15 gtggtggagc cacagcaac 19 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to determine nucleotide sequence <400> 16 cgttctaagg gaacacag 18 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to determine nucleotide sequence <400> 17 gcagttccgg gtccacagg 19 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 18 ttgagctagg cacgcaaata 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 19 gctttgattg gcagagcaca 20 <210> 20 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize promoter DNA <400> 20 gatctcgact ataaagaggg caggctgtcc tctaagcgtc accacgactt ca 52 <210> 21 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide to synthesize promoter DNA <400> 21 agcttgaagt cgtggtgacg cttagaggac agcctgccct ctttatagtc ga 52
【図1】本発明細胞を用いたレポーターアッセイによっ
て、2,3,7,8-TCDDのダイオキシンレセプター活性化能を
測定した結果を示す図である。カラムは左から、2,3,7,
8-TCDD溶液の溶媒に用いたDMSOのみを添加した区(DMS
O)、終濃度0.15pMとなるよう2,3,7,8-TCDDを添加した
区、終濃度1.5pMとなるよう2,3,7,8-TCDDを添加した
区、終濃度15pMとなるよう2,3,7,8-TCDDを添加した区、
終濃度150pMとなるよう2,3,7,8-TCDDを添加した区、終
濃度1.5nMとなるよう2,3,7,8-TCDDを添加した区、終濃
度15nMとなるよう2,3,7,8-TCDDを添加した区、終濃度15
0nMとなるよう2,3,7,8-TCDDを添加した区を示す。縦軸
には、ルシフェラーゼ活性値を、DMSOのみを添加した区
(DMSO)のルシフェラーゼ活性値を100%として示
す。
て、2,3,7,8-TCDDのダイオキシンレセプター活性化能を
測定した結果を示す図である。カラムは左から、2,3,7,
8-TCDD溶液の溶媒に用いたDMSOのみを添加した区(DMS
O)、終濃度0.15pMとなるよう2,3,7,8-TCDDを添加した
区、終濃度1.5pMとなるよう2,3,7,8-TCDDを添加した
区、終濃度15pMとなるよう2,3,7,8-TCDDを添加した区、
終濃度150pMとなるよう2,3,7,8-TCDDを添加した区、終
濃度1.5nMとなるよう2,3,7,8-TCDDを添加した区、終濃
度15nMとなるよう2,3,7,8-TCDDを添加した区、終濃度15
0nMとなるよう2,3,7,8-TCDDを添加した区を示す。縦軸
には、ルシフェラーゼ活性値を、DMSOのみを添加した区
(DMSO)のルシフェラーゼ活性値を100%として示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12Q 1/02 G01N 33/53 S G01N 33/53 33/566 33/566 C12N 5/00 B //(C12P 21/02 C12R 1:91)
Claims (19)
- 【請求項1】下記(a)または(b)の蛋白質をコードする遺
伝子。 (a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるダイオ
キシンレセプター。 (b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において1もし
くは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加された
アミノ酸配列であって、配列番号1で示されるアミノ酸
配列に対して95%以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸
配列を有するダイオキシンレセプター。 - 【請求項2】配列番号2で示される塩基配列のうちの塩
基番号40〜2577で表される塩基配列を有するダイ
オキシンレセプター遺伝子。 - 【請求項3】請求項1または2のいずれかに記載のダイ
オキシンレセプター遺伝子を含有するベクター。 - 【請求項4】ダイオキシンレセプター遺伝子にプロモー
ターが機能可能な形で結合されてなる請求項3記載のベ
クター。 - 【請求項5】ベクターがウイルスである請求項3または
4のいずれかに記載のベクター。 - 【請求項6】請求項1または2のいずれかに記載のダイ
オキシンレセプター遺伝子を含有するウイルス粒子。 - 【請求項7】宿主細胞内で複製可能なベクターに請求項
1または2のいずれかに記載のダイオキシンレセプター
遺伝子を組込むことを特徴とするベクターの製造方法。 - 【請求項8】請求項1または2のいずれかに記載のダイ
オキシンレセプター遺伝子が宿主細胞に導入されてなる
形質転換体。 - 【請求項9】請求項3〜5のいずれかに記載のベクター
が宿主細胞に導入されてなる形質転換体。 - 【請求項10】ダイオキシンレセプター遺伝子が宿主細
胞の染色体に導入されてなる請求項8または9のいずれ
かに記載の形質転換体。 - 【請求項11】宿主細胞が動物細胞である請求項8〜1
0のいずれかに記載の形質転換体。 - 【請求項12】宿主細胞が哺乳類動物細胞である請求項
8〜11のいずれかに記載の形質転換体。 - 【請求項13】宿主細胞が昆虫類動物細胞である請求項
8〜11のいずれかに記載の形質転換体。 - 【請求項14】請求項1または2のいずれかに記載のダ
イオキシンレセプター遺伝子を宿主細胞に導入すること
を特徴とする形質転換体の製造方法。 - 【請求項15】請求項8〜13のいずれかに記載の形質
転換体を培養してダイオキシンレセプターを産生させる
ことを特徴とするダイオキシンレセプターの製造方法。 - 【請求項16】配列番号1で示されるアミノ酸配列を有
するダイオキシンレセプター。 - 【請求項17】配列番号1で示されるアミノ酸配列にお
いて1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは
付加されたアミノ酸配列であって、配列番号1で示され
るアミノ酸配列に対して95%以上のアミノ酸同一性を示
すアミノ酸配列を有するダイオキシンレセプター。 - 【請求項18】ダイオキシン応答配列を含む転写制御領
域の下流に連結されたレポーター遺伝子と請求項1また
は2のいずれかに記載のダイオキシンレセプター遺伝子
とが宿主細胞に導入されてなる形質転換体と、被験物と
を接触させ、該形質転換体における前記レポーター遺伝
子の発現量を測定する工程を含むことを特徴とする被験
物のダイオキシンレセプター活性調節能の評価方法。 - 【請求項19】請求項16または17のいずれかに記載
のダイオキシンレセプターと被験物とを接触させ保温す
る工程を含むことを特徴とするレセプターバインディン
グアッセイ。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2000042475A JP2000354494A (ja) | 1999-04-16 | 2000-02-21 | ダイオキシンレセプター遺伝子およびその利用 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP11-109646 | 1999-04-16 | ||
JP10964699 | 1999-04-16 | ||
JP2000042475A JP2000354494A (ja) | 1999-04-16 | 2000-02-21 | ダイオキシンレセプター遺伝子およびその利用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2000354494A true JP2000354494A (ja) | 2000-12-26 |
Family
ID=26449382
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000042475A Pending JP2000354494A (ja) | 1999-04-16 | 2000-02-21 | ダイオキシンレセプター遺伝子およびその利用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2000354494A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111715052A (zh) * | 2019-03-20 | 2020-09-29 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种生活垃圾焚烧过程中二噁英类物质和NOx协同高效减排方法 |
-
2000
- 2000-02-21 JP JP2000042475A patent/JP2000354494A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111715052A (zh) * | 2019-03-20 | 2020-09-29 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种生活垃圾焚烧过程中二噁英类物质和NOx协同高效减排方法 |
CN111715052B (zh) * | 2019-03-20 | 2021-09-03 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种生活垃圾焚烧过程中二噁英类物质和NOx协同高效减排方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0720650B1 (en) | Human metabotropic glutamate receptor subtype hmglur7 and related dna compounds | |
CA2133843C (en) | Melanocyte stimulating hormone receptor and uses | |
JP2003516137A (ja) | 変異ERαおよび転写活性化の試験系 | |
JP3519078B2 (ja) | 抗血小板剤スクリーニング方法 | |
JPH08501942A (ja) | ヒト カルシトニン レセプター | |
JP2000354494A (ja) | ダイオキシンレセプター遺伝子およびその利用 | |
JP2002045188A (ja) | ダイオキシンレセプター遺伝子およびその利用 | |
JP2001078782A (ja) | ダイオキシンレセプター遺伝子およびその利用 | |
JP4622086B2 (ja) | エストロゲンレセプター遺伝子およびその利用 | |
JP2004254600A (ja) | 変異型アンドロゲンレセプターおよびその活性評価用細胞 | |
JP4400183B2 (ja) | 変異型エストロゲンレセプターαおよびその遺伝子 | |
JP2001352992A (ja) | エストロゲンレセプター遺伝子およびその利用 | |
JP4078481B2 (ja) | エストロゲンレセプター遺伝子及びその利用 | |
JP4400181B2 (ja) | 変異型エストロゲンレセプターαおよびその遺伝子 | |
JP2004254601A (ja) | 変異型アンドロゲンレセプターおよびその活性評価用細胞 | |
JP4400182B2 (ja) | 変異型エストロゲンレセプターαおよびその遺伝子 | |
US20090312245A1 (en) | SRA binding protein | |
JP2004008140A (ja) | 変異型アンドロゲンレセプターおよびその活性評価用細胞 | |
JP2004008141A (ja) | 変異型アンドロゲンレセプターおよびその活性評価用細胞 | |
JP2003199580A (ja) | エストロゲンレセプター遺伝子およびその利用 | |
JP2002360273A (ja) | エストロゲンレセプター遺伝子及びその利用 | |
EP0721507A1 (en) | High level expression of human cyclooxygenase-2 | |
JP2004254602A (ja) | 変異型アンドロゲンレセプターおよびその活性評価用細胞 | |
JP4474694B2 (ja) | 化学物質のアンドロゲンレセプター活性調節能の測定用細胞 | |
US7419800B2 (en) | Estrogen receptor genes |