JP3519078B2 - 抗血小板剤スクリーニング方法 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、抗血小板剤スクリーニング方法に関する。
背景技術
血小板は、ドンネ（Ｄｏｎｎｅ）によって１８４２年
に発見［Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｐａｒｉｓ），
１４，３３６−３６８，１８４２］されて以来、長い
間、止血に必要な血液中の１成分として扱われてきた。
今日では血小板は単に止血機構の主役を演ずるだけでな
く、臨床的に注目される動脈硬化の成立、血栓性疾患を
含む循環器疾患、癌転移、炎症、移植後の拒絶反応、更
には、免疫反応への関与など、多機能性を示すことが明
らかにされている。
に発見［Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｐａｒｉｓ），
１４，３３６−３６８，１８４２］されて以来、長い
間、止血に必要な血液中の１成分として扱われてきた。
今日では血小板は単に止血機構の主役を演ずるだけでな
く、臨床的に注目される動脈硬化の成立、血栓性疾患を
含む循環器疾患、癌転移、炎症、移植後の拒絶反応、更
には、免疫反応への関与など、多機能性を示すことが明
らかにされている。
現在、血栓性疾患及び虚血性疾患に対して、薬剤又は
物理的方法によって血行の再開を図る治療が行なわれて
いる。しかしながら、最近、血行再建が行なわれた後
に、内皮細胞を含む血管組織の破綻、あるいは、薬剤そ
のものによる線溶・凝固バランスの崩壊等で、血小板の
活性化、粘着、及び／又は凝集が亢進する現象が発見さ
れ、臨床的にも問題になっている。例えば、ｔ−ＰＡ等
を用いた血栓溶解療法により再疎通が得られた後、線溶
能及び／又は凝固能が活性化され、全身の凝固・線溶バ
ランスが崩壊することが明らかになってきた。臨床上
は、再閉塞をもたらし、治療上大きな問題となっている
（Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１２，６１６
−６２３，１９８８）。
物理的方法によって血行の再開を図る治療が行なわれて
いる。しかしながら、最近、血行再建が行なわれた後
に、内皮細胞を含む血管組織の破綻、あるいは、薬剤そ
のものによる線溶・凝固バランスの崩壊等で、血小板の
活性化、粘着、及び／又は凝集が亢進する現象が発見さ
れ、臨床的にも問題になっている。例えば、ｔ−ＰＡ等
を用いた血栓溶解療法により再疎通が得られた後、線溶
能及び／又は凝固能が活性化され、全身の凝固・線溶バ
ランスが崩壊することが明らかになってきた。臨床上
は、再閉塞をもたらし、治療上大きな問題となっている
（Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１２，６１６
−６２３，１９８８）。
一方、狭心症若しくは心筋梗塞などの冠動脈狭窄、又
は大動脈狭窄を基盤とした疾患の治療において、ＰＴＣ
Ａ（Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｔｒａｎｓｌｕｍｉｎ
ａｌ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）療
法が急速に普及し、一定の成果を挙げている。しかし、
この療法は、内皮細胞を含む血管組織を傷害し、急性冠
閉塞、更には、３割近くの治療例で発現する再狭窄が大
きな問題となっている。
は大動脈狭窄を基盤とした疾患の治療において、ＰＴＣ
Ａ（Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｔｒａｎｓｌｕｍｉｎ
ａｌ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）療
法が急速に普及し、一定の成果を挙げている。しかし、
この療法は、内皮細胞を含む血管組織を傷害し、急性冠
閉塞、更には、３割近くの治療例で発現する再狭窄が大
きな問題となっている。
このような血行再建療法後の種々の血栓性弊害（再閉
塞等）には、血小板が重要な役割を果たしている。従っ
て、これらの血栓性弊害を予防・治療する薬剤として、
抗血小板剤が期待されている。
塞等）には、血小板が重要な役割を果たしている。従っ
て、これらの血栓性弊害を予防・治療する薬剤として、
抗血小板剤が期待されている。
ところで、血小板の活性化、粘着、及び凝集を惹起又
は亢進する重要な因子として、アデノシン二リン酸（Ａ
ｄｅｎｏｓｉｎｅ ５′−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ；Ａ
ＤＰ）が知られている。ＡＤＰは、コラーゲンやトロン
ビン等で活性化された血小板から、あるいは、血行再建
等により傷ついた血球、血管内皮細胞、又は臓器から放
出される。ＡＤＰは、血小板膜に存在するＧタンパク質
共役型のＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔを介して、血小板を活性化
すると言われている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３３６，
５１３−５２３，１９９８）。
は亢進する重要な因子として、アデノシン二リン酸（Ａ
ｄｅｎｏｓｉｎｅ ５′−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ；Ａ
ＤＰ）が知られている。ＡＤＰは、コラーゲンやトロン
ビン等で活性化された血小板から、あるいは、血行再建
等により傷ついた血球、血管内皮細胞、又は臓器から放
出される。ＡＤＰは、血小板膜に存在するＧタンパク質
共役型のＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔを介して、血小板を活性化
すると言われている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３３６，
５１３−５２３，１９９８）。
血小板ＡＤＰ受容体としては、Ｇタンパク質の１種で
あるＧｑに共役してホスホリパーゼＣ（Ｐｈｏｓｐｈｏ
ｌｉｐａｓｅ Ｃ；ＰＬＣ）を介して細胞内Ｃａ２＋濃
度を上げるタイプの血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＰＬＣと、Ｇタンパク質の１種であるＧｉに共役してア
デニル酸シクラーゼ（Ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａ
ｓｅ；ＡＣ）の活性を抑制する血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２
ＴＡＣとの存在が示唆されていた。現在、血小板ＡＤＰ
受容体Ｐ２ＴＰＬＣは、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２Ｙ１と
呼ばれる受容体であることが同定されているが、血小板
ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣは、これまでその実体が同定さ
れていなかった（Ｋｕｎａｐｕｌｉ，Ｓ．Ｐ．ら，Ｔｒ
ｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１９，３９
１−３９４，１９９８）。
あるＧｑに共役してホスホリパーゼＣ（Ｐｈｏｓｐｈｏ
ｌｉｐａｓｅ Ｃ；ＰＬＣ）を介して細胞内Ｃａ２＋濃
度を上げるタイプの血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＰＬＣと、Ｇタンパク質の１種であるＧｉに共役してア
デニル酸シクラーゼ（Ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａ
ｓｅ；ＡＣ）の活性を抑制する血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２
ＴＡＣとの存在が示唆されていた。現在、血小板ＡＤＰ
受容体Ｐ２ＴＰＬＣは、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２Ｙ１と
呼ばれる受容体であることが同定されているが、血小板
ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣは、これまでその実体が同定さ
れていなかった（Ｋｕｎａｐｕｌｉ，Ｓ．Ｐ．ら，Ｔｒ
ｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１９，３９
１−３９４，１９９８）。
抗血小板剤として利用されているチクロピジン（Ｔｉ
ｃｌｏｐｉｄｉｎｅ）やクロピドグレル（Ｃｌｏｐｉｄ
ｏｇｒｅｌ）は、体内での代謝物がＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＡＣを阻害することで効果をもたらしていると考えられ
ている（Ｓａｖｉ，Ｐ．Ｊ．，Ｐｈａｒｍａｃｌｏ．Ｅ
ｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２６９，７７２−７７７，１９９
４）。また、生体内のＡＤＰ受容体拮抗物質であるアデ
ノシン三リン酸（ＡＴＰ）の誘導体として合成されたＡ
ＲＬ６７０８５は、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対
する拮抗作用によりＡＤＰによる血小板凝集の抑制作用
を有しており、血栓症モデルにおいてその有効性が示さ
れている（Ｍｉｌｌｓ，Ｄ．Ｃ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅ
ｍｏｓｔ．，７６，８３５−８５６，１９９６；及びＨ
ｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｒ．Ｇ．，Ｔｒｅｄｓ Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１６，１７９−１８１，１９９
５）。更に、Ａｐ４Ａ［Ｐ１，Ｐ４−ｄｉ（ａｄｅｎｏ
ｓｉｎｅ−５’）ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ］の誘
導体も、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対する拮抗作
用によりＡＤＰによる血小板凝集の抑制作用を有してお
り、血栓症モデルにおいてその有効性が示されている
（Ｋｉｍ，Ｂ．Ｋ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，２３７０−２３７３，１９９
２）。
ｃｌｏｐｉｄｉｎｅ）やクロピドグレル（Ｃｌｏｐｉｄ
ｏｇｒｅｌ）は、体内での代謝物がＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＡＣを阻害することで効果をもたらしていると考えられ
ている（Ｓａｖｉ，Ｐ．Ｊ．，Ｐｈａｒｍａｃｌｏ．Ｅ
ｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２６９，７７２−７７７，１９９
４）。また、生体内のＡＤＰ受容体拮抗物質であるアデ
ノシン三リン酸（ＡＴＰ）の誘導体として合成されたＡ
ＲＬ６７０８５は、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対
する拮抗作用によりＡＤＰによる血小板凝集の抑制作用
を有しており、血栓症モデルにおいてその有効性が示さ
れている（Ｍｉｌｌｓ，Ｄ．Ｃ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅ
ｍｏｓｔ．，７６，８３５−８５６，１９９６；及びＨ
ｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｒ．Ｇ．，Ｔｒｅｄｓ Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１６，１７９−１８１，１９９
５）。更に、Ａｐ４Ａ［Ｐ１，Ｐ４−ｄｉ（ａｄｅｎｏ
ｓｉｎｅ−５’）ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ］の誘
導体も、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対する拮抗作
用によりＡＤＰによる血小板凝集の抑制作用を有してお
り、血栓症モデルにおいてその有効性が示されている
（Ｋｉｍ，Ｂ．Ｋ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，２３７０−２３７３，１９９
２）。
以上の知見から、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに
対する拮抗薬は、強力な抗血小板剤となることが期待さ
れる。しかし、チクロピジンやクロピドグレルは、抗血
栓作用が弱く、しかも、副作用が強い等の問題点を抱え
ており、また、ＡＴＰ類縁体であるＡＲＬ６７０８５若
しくはその誘導体、又はＡｐ４Ａの誘導体などについて
も、ＡＤＰ受容体拮抗薬として研究が進められている
が、全てヌクレオチドの誘導体であり、経口活性が充分
でなく、しかも、血小板凝集抑制活性が弱いなどの問題
を抱えており、強力で経口活性を有するＡＤＰ受容体拮
抗薬が熱望されている（ＣＡＰＲＩＥ ＳＴＥＥＲＩＮ
Ｇ ＣＯＭＭＩＴＴＥＥ，Ｌａｎｃｅｔ，３４８，１３
２９−１３３９，１９９６）。
対する拮抗薬は、強力な抗血小板剤となることが期待さ
れる。しかし、チクロピジンやクロピドグレルは、抗血
栓作用が弱く、しかも、副作用が強い等の問題点を抱え
ており、また、ＡＴＰ類縁体であるＡＲＬ６７０８５若
しくはその誘導体、又はＡｐ４Ａの誘導体などについて
も、ＡＤＰ受容体拮抗薬として研究が進められている
が、全てヌクレオチドの誘導体であり、経口活性が充分
でなく、しかも、血小板凝集抑制活性が弱いなどの問題
を抱えており、強力で経口活性を有するＡＤＰ受容体拮
抗薬が熱望されている（ＣＡＰＲＩＥ ＳＴＥＥＲＩＮ
Ｇ ＣＯＭＭＩＴＴＥＥ，Ｌａｎｃｅｔ，３４８，１３
２９−１３３９，１９９６）。
しかしながら、これまで、血小板に存在するＡＤＰ受
容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質は、同定されておらず、簡便
な化合物スクリーニング系の構築が困難であったため、
ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ拮抗薬の開発は進展していなか
った。
容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質は、同定されておらず、簡便
な化合物スクリーニング系の構築が困難であったため、
ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ拮抗薬の開発は進展していなか
った。
なお、本発明で用いることのできるヒトＡＤＰ受容体
Ｐ２ＴＡＣタンパク質と同一のアミノ酸配列からなるポ
リペプチドをコードするＤＮＡ、及び前記ＤＮＡがコー
ドする推定アミノ酸配列については、種々の報告（ＷＯ
００／２２１３１号、ＷＯ００／３１２５８号、ＷＯ０
０／２８０２８号、及びＷＯ９８／５０５４９号各パン
フレット）があるが、いずれもリガンドが解明されてお
らず、血小板に存在するＡＤＰ受容体であるとの記載も
ない。
Ｐ２ＴＡＣタンパク質と同一のアミノ酸配列からなるポ
リペプチドをコードするＤＮＡ、及び前記ＤＮＡがコー
ドする推定アミノ酸配列については、種々の報告（ＷＯ
００／２２１３１号、ＷＯ００／３１２５８号、ＷＯ０
０／２８０２８号、及びＷＯ９８／５０５４９号各パン
フレット）があるが、いずれもリガンドが解明されてお
らず、血小板に存在するＡＤＰ受容体であるとの記載も
ない。
発明の開示
従って、本発明の課題は、抗血小板剤として有用なア
デノシン二リン酸（ＡＤＰ）受容体Ｐ２ＴＡＣ拮抗薬を
得るための簡便なスクリーニング系及び新たな抗血小板
剤を提供することにある。
デノシン二リン酸（ＡＤＰ）受容体Ｐ２ＴＡＣ拮抗薬を
得るための簡便なスクリーニング系及び新たな抗血小板
剤を提供することにある。
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を行
なった結果、Ｐ２ＴＡＣ受容体をコードする核酸（具体
的にはＨＯＲＫ３遺伝子）を単離することに成功し、塩
基配列及び推定アミノ酸配列を決定した。次に、前記受
容体をコードする核酸を含むベクター、及び前記ベクタ
ーを含む宿主細胞を順次作成し、前記宿主細胞を用いて
Ｐ２ＴＡＣ受容体を発現させることにより、新規な組換
えＰ２ＴＡＣ受容体の生産を可能にし、前記受容体がＡ
ＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ活性を有することから、前記受容
体及び前記受容体を発現する細胞が抗血小板剤スクリー
ニングツールとなることを確認した。また、前記受容体
又は前記受容体を発現する細胞を用い、試験化合物がＡ
ＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アンタゴニスト、又は
アゴニストであるか否かを検出する方法、及び前記検出
方法を用いた抗血小板剤のスクリーニング方法を確立し
た。更に、抗血小板作用を示す物質として知られている
化合物（具体的には、２ＭｅＳＡＭＰ又はＡＲ−Ｃ６９
９３１ＭＸ）が、前記検出方法にて前記受容体のアンタ
ゴニスト活性を示すことを確認し、前記受容体のアンタ
ゴニストが確かに抗血小板剤として有用であることを示
した。そして、前記検出工程を含む、抗血小板用医薬組
成物の製造方法を確立し、本発明を完成させた。
なった結果、Ｐ２ＴＡＣ受容体をコードする核酸（具体
的にはＨＯＲＫ３遺伝子）を単離することに成功し、塩
基配列及び推定アミノ酸配列を決定した。次に、前記受
容体をコードする核酸を含むベクター、及び前記ベクタ
ーを含む宿主細胞を順次作成し、前記宿主細胞を用いて
Ｐ２ＴＡＣ受容体を発現させることにより、新規な組換
えＰ２ＴＡＣ受容体の生産を可能にし、前記受容体がＡ
ＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ活性を有することから、前記受容
体及び前記受容体を発現する細胞が抗血小板剤スクリー
ニングツールとなることを確認した。また、前記受容体
又は前記受容体を発現する細胞を用い、試験化合物がＡ
ＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アンタゴニスト、又は
アゴニストであるか否かを検出する方法、及び前記検出
方法を用いた抗血小板剤のスクリーニング方法を確立し
た。更に、抗血小板作用を示す物質として知られている
化合物（具体的には、２ＭｅＳＡＭＰ又はＡＲ−Ｃ６９
９３１ＭＸ）が、前記検出方法にて前記受容体のアンタ
ゴニスト活性を示すことを確認し、前記受容体のアンタ
ゴニストが確かに抗血小板剤として有用であることを示
した。そして、前記検出工程を含む、抗血小板用医薬組
成物の製造方法を確立し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、
［１］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有す
るポリペプチド（以下、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタ
ンパク質と称することがある）、又は（２）配列番号２
で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、
１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加
されたアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰと結合し、
Ｇｉに共役することにより、アデニル酸シクラーゼの活
性を抑制する活性（以下、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ活性
と称する）を有するポリペプチド（以下、機能的等価改
変体と称する）である、抗血小板剤スクリーニングツー
ル； ［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が
９０％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰ
と結合し、Ｇｉに共役することにより、アデニル酸シク
ラーゼの活性を抑制する活性を有するポリペプチド（以
下、相同タンパク質と称する）である、抗血小板剤スク
リーニングツール（以下、［１］又は［２］記載の抗血
小板剤スクリーニングツールを、総称して、ポリペプチ
ド型抗血小板剤スクリーニングツールと称する）； ［３］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有す
るポリペプチド（すなわち、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＡＣタンパク質）、又は（２）配列番号２で表されるア
ミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個
のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ
酸配列を有し、しかも、ＡＤＰと結合し、Ｇｉに共役す
ることにより、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制する
活性を有するポリペプチド（すなわち、機能的等価改変
体）をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換
され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞で
ある、抗血小板剤スクリーニングツール； ［４］配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が
９０％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰ
と結合し、Ｇｉに共役することにより、アデニル酸シク
ラーゼの活性を抑制する活性を有するポリペプチド（す
なわち、相同タンパク質）をコードするＤＮＡを含む発
現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現し
ている形質転換細胞である、抗血小板剤スクリーニング
ツール（以下、［３］又は［４］記載の抗血小板剤スク
リーニングツールを、総称して、形質転換細胞型抗血小
板剤スクリーニングツールと称する）； ［５］［１］若しくは［２］記載のポリペプチド（すな
わち、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質、機能的
等価改変体、又は相同タンパク質）、前記ポリペプチド
を含む細胞膜画分、又は［３］若しくは［４］記載の形
質転換細胞と、試験化合物とを、ＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＡＣ標識リガンド存在下で、接触させる工程、及び 前記ポリペプチド、細胞膜画分、又は形質転換細胞への
標識リガンドの結合量の変化を分析する工程 を含む、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド
であるか否かを検出する方法（以下、リガンド検出方法
と称する）； ［６］Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１１で表され
るアミノ酸配列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性
促進性Ｇタンパク質のホスホリパーゼＣ活性促進活性を
有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有す
る部分ポリペプチドとのキメラであるＧタンパク質キメ
ラを共発現している［３］又は［４］記載の形質転換細
胞と、試験化合物とを接触させる工程、及び 前記形質転換細胞内におけるＣａ２＋濃度の変化を分析
する工程 を含む、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴ
ニスト又はアゴニストであるか否かを検出する方法（以
下、Ｃａ２＋型検出方法と称する）； ［７］［３］又は［４］記載の形質転換細胞と試験化合
物とを、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニストの
共存下において、接触させる工程、及び 前記形質転換細胞内におけるｃＡＭＰ濃度の変化を分析
する工程 を含む、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴ
ニスト又はアゴニストであるか否かを検出する方法（以
下、ｃＡＭＰ型検出方法と称する）； ［８］前記リガンド検出方法、Ｃａ２＋型検出方法、又
はｃＡＭＰ型検出方法、あるいは、これらを組み合わせ
ることにより、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アン
タゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出する工
程、及び ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニストを選択する工程 を含む、抗血小板剤をスクリーニングする方法；並びに ［９］前記リガンド検出方法、Ｃａ２＋型検出方法、又
はｃＡＭＰ型検出方法、あるいは、これらを組み合わせ
ることにより、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アン
タゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出する工
程、及び 製剤化工程 を含む、抗血小板用医薬組成物の製造方法 に関する。
るポリペプチド（以下、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタ
ンパク質と称することがある）、又は（２）配列番号２
で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、
１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加
されたアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰと結合し、
Ｇｉに共役することにより、アデニル酸シクラーゼの活
性を抑制する活性（以下、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ活性
と称する）を有するポリペプチド（以下、機能的等価改
変体と称する）である、抗血小板剤スクリーニングツー
ル； ［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が
９０％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰ
と結合し、Ｇｉに共役することにより、アデニル酸シク
ラーゼの活性を抑制する活性を有するポリペプチド（以
下、相同タンパク質と称する）である、抗血小板剤スク
リーニングツール（以下、［１］又は［２］記載の抗血
小板剤スクリーニングツールを、総称して、ポリペプチ
ド型抗血小板剤スクリーニングツールと称する）； ［３］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有す
るポリペプチド（すなわち、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＡＣタンパク質）、又は（２）配列番号２で表されるア
ミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個
のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ
酸配列を有し、しかも、ＡＤＰと結合し、Ｇｉに共役す
ることにより、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制する
活性を有するポリペプチド（すなわち、機能的等価改変
体）をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換
され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞で
ある、抗血小板剤スクリーニングツール； ［４］配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が
９０％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰ
と結合し、Ｇｉに共役することにより、アデニル酸シク
ラーゼの活性を抑制する活性を有するポリペプチド（す
なわち、相同タンパク質）をコードするＤＮＡを含む発
現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現し
ている形質転換細胞である、抗血小板剤スクリーニング
ツール（以下、［３］又は［４］記載の抗血小板剤スク
リーニングツールを、総称して、形質転換細胞型抗血小
板剤スクリーニングツールと称する）； ［５］［１］若しくは［２］記載のポリペプチド（すな
わち、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質、機能的
等価改変体、又は相同タンパク質）、前記ポリペプチド
を含む細胞膜画分、又は［３］若しくは［４］記載の形
質転換細胞と、試験化合物とを、ＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＡＣ標識リガンド存在下で、接触させる工程、及び 前記ポリペプチド、細胞膜画分、又は形質転換細胞への
標識リガンドの結合量の変化を分析する工程 を含む、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド
であるか否かを検出する方法（以下、リガンド検出方法
と称する）； ［６］Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１１で表され
るアミノ酸配列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性
促進性Ｇタンパク質のホスホリパーゼＣ活性促進活性を
有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有す
る部分ポリペプチドとのキメラであるＧタンパク質キメ
ラを共発現している［３］又は［４］記載の形質転換細
胞と、試験化合物とを接触させる工程、及び 前記形質転換細胞内におけるＣａ２＋濃度の変化を分析
する工程 を含む、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴ
ニスト又はアゴニストであるか否かを検出する方法（以
下、Ｃａ２＋型検出方法と称する）； ［７］［３］又は［４］記載の形質転換細胞と試験化合
物とを、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニストの
共存下において、接触させる工程、及び 前記形質転換細胞内におけるｃＡＭＰ濃度の変化を分析
する工程 を含む、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴ
ニスト又はアゴニストであるか否かを検出する方法（以
下、ｃＡＭＰ型検出方法と称する）； ［８］前記リガンド検出方法、Ｃａ２＋型検出方法、又
はｃＡＭＰ型検出方法、あるいは、これらを組み合わせ
ることにより、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アン
タゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出する工
程、及び ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニストを選択する工程 を含む、抗血小板剤をスクリーニングする方法；並びに ［９］前記リガンド検出方法、Ｃａ２＋型検出方法、又
はｃＡＭＰ型検出方法、あるいは、これらを組み合わせ
ることにより、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アン
タゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出する工
程、及び 製剤化工程 を含む、抗血小板用医薬組成物の製造方法 に関する。
前記「Ｇｉ」は、受容体と共役して細胞内へのシグナ
ル伝達・増幅因子として機能するＧタンパク質のサブフ
ァミリーの１つであって、アデニル酸シクラーゼの活性
を抑制するＧタンパク質である。アデニル酸シクラーゼ
の活性が抑制されると、例えば、細胞内ｃＡＭＰ濃度が
低下する。
ル伝達・増幅因子として機能するＧタンパク質のサブフ
ァミリーの１つであって、アデニル酸シクラーゼの活性
を抑制するＧタンパク質である。アデニル酸シクラーゼ
の活性が抑制されると、例えば、細胞内ｃＡＭＰ濃度が
低下する。
また、前記「ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇタンパク
質」は、受容体と共役して細胞内へのシグナル伝達・増
幅因子として機能するＧタンパク質のサブファミリーの
１つであって、ホスホリパーゼＣの活性を促進するＧタ
ンパク質である。ホスホリパーゼＣの活性が促進される
と、例えば、細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇する。ホスホリ
パーゼＣ活性促進性Ｇタンパク質としては、例えば、Ｇ
ｑを挙げることができる。
質」は、受容体と共役して細胞内へのシグナル伝達・増
幅因子として機能するＧタンパク質のサブファミリーの
１つであって、ホスホリパーゼＣの活性を促進するＧタ
ンパク質である。ホスホリパーゼＣの活性が促進される
と、例えば、細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇する。ホスホリ
パーゼＣ活性促進性Ｇタンパク質としては、例えば、Ｇ
ｑを挙げることができる。
更に、前記「ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ」は、ＡＤＰ受
容体Ｐ２ＴＡＣを有するポリペプチドを意味する。
容体Ｐ２ＴＡＣを有するポリペプチドを意味する。
図面の簡単な説明
図１は、ヒトクエン酸血由来多血小板血漿（ＰＲＰ）
のＡＤＰ惹起血小板凝集における２ＭｅＳＡＭＰの効果
を示すグラフである。
のＡＤＰ惹起血小板凝集における２ＭｅＳＡＭＰの効果
を示すグラフである。
図２は、ヒトクエン酸血由来ＰＲＰのＡＤＰ惹起血小
板凝集におけるＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸの効果を示すグ
ラフである。
板凝集におけるＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸの効果を示すグ
ラフである。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）抗血小板剤スクリーニングツール
本発明の抗血小板剤スクリーニングツールには、ポリ
ペプチド型抗血小板剤スクリーニングツールと、形質転
換細胞型抗血小板剤スクリーニングツールとが含まれ
る。
ペプチド型抗血小板剤スクリーニングツールと、形質転
換細胞型抗血小板剤スクリーニングツールとが含まれ
る。
１）ポリペプチド型抗血小板剤スクリーニングツール
本発明のポリペプチド型抗血小板剤スクリーニングツ
ールには、 （ｉ）ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質、すなわ
ち、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペ
プチドである、抗血小板剤スクリーニングツール； （ii）機能的等価改変体、すなわち、配列番号２で表さ
れるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は
複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加された
アミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ
活性を有するポリペプチドである、抗血小板剤スクリー
ニングツール；及び （iii）相同タンパク質、すなわち、配列番号２で表さ
れるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ
酸配列を有し、しかも、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ活性を
有するポリペプチドである、抗血小板剤スクリーニング
ツール が含まれる。
ールには、 （ｉ）ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質、すなわ
ち、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペ
プチドである、抗血小板剤スクリーニングツール； （ii）機能的等価改変体、すなわち、配列番号２で表さ
れるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は
複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加された
アミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ
活性を有するポリペプチドである、抗血小板剤スクリー
ニングツール；及び （iii）相同タンパク質、すなわち、配列番号２で表さ
れるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ
酸配列を有し、しかも、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ活性を
有するポリペプチドである、抗血小板剤スクリーニング
ツール が含まれる。
本発明のポリペプチド型抗血小板剤スクリーニングツ
ールとして用いることのできる、配列番号２で表される
アミノ酸配列を有するポリペプチドは、３４２個のアミ
ノ酸残基からなるヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク
質である。ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質は、血小
板に存在することが示唆されていたものの、本発明者が
今回始めてその機能を解明するまで、その実体は同定さ
れていなかった。
ールとして用いることのできる、配列番号２で表される
アミノ酸配列を有するポリペプチドは、３４２個のアミ
ノ酸残基からなるヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク
質である。ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質は、血小
板に存在することが示唆されていたものの、本発明者が
今回始めてその機能を解明するまで、その実体は同定さ
れていなかった。
そして、本願の優先日後の文献で、初めて、配列番号
２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが血小
板ＡＤＰ受容体であることが公表された［Ｎａｔｕｒ
ｅ，４０９，１１ Ｊａｎｕａｒｙ ２００１，２０２
−２０７；Ｊ．Ｂ．Ｃ．，２７６，（１１），Ｍａｒｃ
ｈ １６，８６０８−８６１５，２００１；ＷＯ０１／
４６４５４号パンフレット］。なお、ＷＯ０１／４６４
５４号パンフレットの優先権の基礎となる特許出願で
は、ラットのＡＤＰ受容体遺伝子をクローニングし、配
列決定しているものの、ヒトのＡＤＰ受容体遺伝子につ
いては、部分配列を含むクローンを取得し、配列決定し
ているにすぎない。従って、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＡＣタンパク質及びこれをコードするポリヌクレオチド
を取得し、その機能を初めて解明し、これらを用いる抗
血小板剤をスクリーニング方法の発明に関する特許出願
を行なったのは、本願出願人の方が早い。
２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが血小
板ＡＤＰ受容体であることが公表された［Ｎａｔｕｒ
ｅ，４０９，１１ Ｊａｎｕａｒｙ ２００１，２０２
−２０７；Ｊ．Ｂ．Ｃ．，２７６，（１１），Ｍａｒｃ
ｈ １６，８６０８−８６１５，２００１；ＷＯ０１／
４６４５４号パンフレット］。なお、ＷＯ０１／４６４
５４号パンフレットの優先権の基礎となる特許出願で
は、ラットのＡＤＰ受容体遺伝子をクローニングし、配
列決定しているものの、ヒトのＡＤＰ受容体遺伝子につ
いては、部分配列を含むクローンを取得し、配列決定し
ているにすぎない。従って、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＡＣタンパク質及びこれをコードするポリヌクレオチド
を取得し、その機能を初めて解明し、これらを用いる抗
血小板剤をスクリーニング方法の発明に関する特許出願
を行なったのは、本願出願人の方が早い。
本発明のポリペプチド型抗血小板剤スクリーニングツ
ールとして用いることのできる機能的等価改変体は、配
列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所に
おいて、それぞれ、１又は複数個（好ましくは１〜１０
個、より好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置
換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しか
も、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ活性を有するポリペプチド
である限り、特に限定されるものではなく、その起源も
ヒトに限定されない。
ールとして用いることのできる機能的等価改変体は、配
列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所に
おいて、それぞれ、１又は複数個（好ましくは１〜１０
個、より好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置
換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しか
も、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ活性を有するポリペプチド
である限り、特に限定されるものではなく、その起源も
ヒトに限定されない。
例えば、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのヒトにおける
変異体が含まれるだけでなく、ヒト以外の生物（例え
ば、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）由来のＡ
ＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ又はその変異体が含まれる。更に
は、それらの天然タンパク質（すなわち、ヒト由来の変
異体、又はヒト以外の生物由来のＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＡＣ若しくはその変異体）又はヒトＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＡＣを元にして遺伝子工学的に人為的に改変したタンパ
ク質などが含まれる。なお、本明細書において「変異
体」（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とは、同一種内の同一タン
パク質にみられる個体差、あるいは、数種間の相同タン
パク質にみられる差異を意味する。
変異体が含まれるだけでなく、ヒト以外の生物（例え
ば、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）由来のＡ
ＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ又はその変異体が含まれる。更に
は、それらの天然タンパク質（すなわち、ヒト由来の変
異体、又はヒト以外の生物由来のＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＡＣ若しくはその変異体）又はヒトＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＡＣを元にして遺伝子工学的に人為的に改変したタンパ
ク質などが含まれる。なお、本明細書において「変異
体」（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とは、同一種内の同一タン
パク質にみられる個体差、あるいは、数種間の相同タン
パク質にみられる差異を意味する。
ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのヒトにおける変異体、
又はヒト以外の生物由来のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ若し
くはその変異体は、当業者であれば、ヒトＡＤＰ受容体
Ｐ２ＴＡＣ遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１で表
される塩基配列）の情報を基にして、取得することがで
きる。なお、遺伝子組換え技術については、特に断りが
ない場合、公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，”
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８
２等）に従って実施することが可能である。
又はヒト以外の生物由来のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ若し
くはその変異体は、当業者であれば、ヒトＡＤＰ受容体
Ｐ２ＴＡＣ遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１で表
される塩基配列）の情報を基にして、取得することがで
きる。なお、遺伝子組換え技術については、特に断りが
ない場合、公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，”
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８
２等）に従って実施することが可能である。
例えば、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ遺伝子の塩基配
列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブを設
計し、前記プライマー又はプローブと、目的とする生物
［例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、
ハムスター、又はイヌ）］由来の試料（例えば、総ＲＮ
Ａ若しくはｍＲＮＡ画分、ｃＤＮＡライブラリー、又は
ファージライブラリー）とを用いてＰＣＲ法又はハイブ
リダイゼーション法を実施することにより、タンパク質
の遺伝子を取得し、その遺伝子を適当な発現系を用いて
発現させ、発現したタンパク質が、例えば、実施例３又
は実施例４に記載の方法により、ＡＤＰと結合し、Ｇｉ
に共役することによってアデニル酸シクラーゼの活性を
抑制することを確認することにより、所望のタンパク質
を取得することができる。
列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブを設
計し、前記プライマー又はプローブと、目的とする生物
［例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、
ハムスター、又はイヌ）］由来の試料（例えば、総ＲＮ
Ａ若しくはｍＲＮＡ画分、ｃＤＮＡライブラリー、又は
ファージライブラリー）とを用いてＰＣＲ法又はハイブ
リダイゼーション法を実施することにより、タンパク質
の遺伝子を取得し、その遺伝子を適当な発現系を用いて
発現させ、発現したタンパク質が、例えば、実施例３又
は実施例４に記載の方法により、ＡＤＰと結合し、Ｇｉ
に共役することによってアデニル酸シクラーゼの活性を
抑制することを確認することにより、所望のタンパク質
を取得することができる。
また、前記の遺伝子工学的に人為的に改変したタンパ
ク質は、常法、例えば、部位特異的突然変異誘発法（ｓ
ｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；
Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９
８４）により、タンパク質の遺伝子を取得し、その遺伝
子を適当な発現系を用いて発現させ、発現したタンパク
質が、例えば、実施例３又は実施例４に記載の方法によ
り、ＡＤＰと結合し、Ｇｉに共役することによってアデ
ニル酸シクラーゼの活性を抑制することを確認すること
により、所望のタンパク質を取得することができる。
ク質は、常法、例えば、部位特異的突然変異誘発法（ｓ
ｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；
Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９
８４）により、タンパク質の遺伝子を取得し、その遺伝
子を適当な発現系を用いて発現させ、発現したタンパク
質が、例えば、実施例３又は実施例４に記載の方法によ
り、ＡＤＰと結合し、Ｇｉに共役することによってアデ
ニル酸シクラーゼの活性を抑制することを確認すること
により、所望のタンパク質を取得することができる。
本発明のポリペプチド型抗血小板剤スクリーニングツ
ールとして用いることのできる相同タンパク質は、配列
番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上
であるアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰ受容体Ｐ２
ＴＡＣ活性を有するポリペプチドである限り、特に限定
されるものではないが、配列番号２で表されるアミノ酸
配列に関して、好ましくは９５％以上、より好ましくは
９８％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有す
るアミノ酸配列を有することができる。
ールとして用いることのできる相同タンパク質は、配列
番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上
であるアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰ受容体Ｐ２
ＴＡＣ活性を有するポリペプチドである限り、特に限定
されるものではないが、配列番号２で表されるアミノ酸
配列に関して、好ましくは９５％以上、より好ましくは
９８％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有す
るアミノ酸配列を有することができる。
なお、本明細書における前記「相同性」とは、ＢＬＡ
ＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｎｇｍｅｎｔ
ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．
ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１
０，１９９０）検索により得られた値を意味し、アミノ
酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用い
て決定することができる。具体的には、ＢＬＡＳＴパッ
ケージ（ｓｇｉ３２ｂｉｔ版，バージョン２．０．１
２；ＮＣＢＩより入手）のｂｌ２ｓｅｑプログラム（Ｔ
ａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ及びＴｈｏｍａｓ
Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｌｅｔｔ．，１７４，２４７−２５０，１９９９）を用
い、デフォルトパラメーターに従って算出することがで
きる。ペアワイズ・アラインメント・パラメーターとし
て、プログラム名「ｂｌａｓｔｐ」を使用し、Ｇａｐ挿
入Ｃｏｓｔ値を「０」で、Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値を
「０」で、Ｑｕｅｒｙ配列のフィルターとして「ＳＥ
Ｇ」を、Ｍａｔｒｉｘとして「ＢＬＯＳＵＭ６２」をそ
れぞれ使用する。
ＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｎｇｍｅｎｔ
ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．
ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１
０，１９９０）検索により得られた値を意味し、アミノ
酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用い
て決定することができる。具体的には、ＢＬＡＳＴパッ
ケージ（ｓｇｉ３２ｂｉｔ版，バージョン２．０．１
２；ＮＣＢＩより入手）のｂｌ２ｓｅｑプログラム（Ｔ
ａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ及びＴｈｏｍａｓ
Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｌｅｔｔ．，１７４，２４７−２５０，１９９９）を用
い、デフォルトパラメーターに従って算出することがで
きる。ペアワイズ・アラインメント・パラメーターとし
て、プログラム名「ｂｌａｓｔｐ」を使用し、Ｇａｐ挿
入Ｃｏｓｔ値を「０」で、Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値を
「０」で、Ｑｕｅｒｙ配列のフィルターとして「ＳＥ
Ｇ」を、Ｍａｔｒｉｘとして「ＢＬＯＳＵＭ６２」をそ
れぞれ使用する。
本発明のポリペプチド型抗血小板剤スクリーニングツ
ールとして用いることのできる各種ポリペプチド（すな
わち、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質、機能的
等価改変体、及び相同タンパク質；以下、スクリーニン
グツール用ポリペプチドと称する）は、種々の公知の方
法によって得ることができ、例えば、目的タンパク質を
コードする遺伝子を用いて公知の遺伝子工学的手法によ
り調製することができる。より具体的には、後述する形
質転換細胞（すなわち、スクリーニングツール用ポリペ
プチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転
換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細
胞）を、スクリーニングツール用ポリペプチドの発現が
可能な条件下で培養し、受容体タンパク質の分離及び精
製に一般的に用いられる方法により、その培養物から目
的タンパク質を分離及び精製することにより調製するこ
とができる。
ールとして用いることのできる各種ポリペプチド（すな
わち、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質、機能的
等価改変体、及び相同タンパク質；以下、スクリーニン
グツール用ポリペプチドと称する）は、種々の公知の方
法によって得ることができ、例えば、目的タンパク質を
コードする遺伝子を用いて公知の遺伝子工学的手法によ
り調製することができる。より具体的には、後述する形
質転換細胞（すなわち、スクリーニングツール用ポリペ
プチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転
換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細
胞）を、スクリーニングツール用ポリペプチドの発現が
可能な条件下で培養し、受容体タンパク質の分離及び精
製に一般的に用いられる方法により、その培養物から目
的タンパク質を分離及び精製することにより調製するこ
とができる。
スクリーニングツール用ポリペプチドを調製する際
に、それをコードする遺伝子を取得する方法は、特に限
定されるものではないが、例えば、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ
２ＴＡＣタンパク質を調製する場合には、それをコード
する遺伝子として、例えば、配列番号１で表される塩基
配列からなるＤＮＡを用いることができる。なお、所望
アミノ酸に対するコドンはそれ自体公知であり、その選
択も任意でよく、例えば、利用する宿主のコドン使用頻
度を考慮して常法に従って決定することができる（Ｃｒ
ａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，９，ｒ４３−ｒ７４，１９８１）。
に、それをコードする遺伝子を取得する方法は、特に限
定されるものではないが、例えば、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ
２ＴＡＣタンパク質を調製する場合には、それをコード
する遺伝子として、例えば、配列番号１で表される塩基
配列からなるＤＮＡを用いることができる。なお、所望
アミノ酸に対するコドンはそれ自体公知であり、その選
択も任意でよく、例えば、利用する宿主のコドン使用頻
度を考慮して常法に従って決定することができる（Ｃｒ
ａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，９，ｒ４３−ｒ７４，１９８１）。
配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡは、例
えば、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を結合す
ることにより取得することもできるし、あるいは、ヒト
ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質の産生能力を有する
細胞又は組織に由来するｃＤＮＡライブラリーを鋳型と
し、配列番号１で表される塩基配列に基づいて設計した
適当なプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）法（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２３９，４８７−４９１，１９８８）により、取得
することもできる。前記のヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ
タンパク質の産生能力を有する細胞又は組織としては、
例えば、ヒト血小板又はヒト脳などを挙げることができ
る。また、前記プライマーセットとしては、配列番号３
で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列
番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
との組み合わせを挙げることができる。
えば、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を結合す
ることにより取得することもできるし、あるいは、ヒト
ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質の産生能力を有する
細胞又は組織に由来するｃＤＮＡライブラリーを鋳型と
し、配列番号１で表される塩基配列に基づいて設計した
適当なプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）法（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２３９，４８７−４９１，１９８８）により、取得
することもできる。前記のヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ
タンパク質の産生能力を有する細胞又は組織としては、
例えば、ヒト血小板又はヒト脳などを挙げることができ
る。また、前記プライマーセットとしては、配列番号３
で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列
番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
との組み合わせを挙げることができる。
スクリーニングツール用ポリペプチドの調製において
使用することのできる分離及び精製方法は、特に限定さ
れるものではないが、例えば、以下の手順で実施するこ
とができる。例えば、スクリーニングツール用ポリペプ
チドを表面に発現した細胞を培養し、これらをバッファ
ーに懸濁した後、ホモジナイズし、遠心分離することに
より、スクリーニングツール用ポリペプチドを含む細胞
膜画分を得ることができる。得られた細胞膜画分を可溶
化した後、通常のタンパク質沈殿剤による処理、限外濾
過、各種液体クロマトグラフィー［例えば、分子ふるい
クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフ
ィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティ
クロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）等］、若しくは透析法、又はこれらの組合
せ等により、スクリーニングツール用ポリペプチドを精
製することができる。なお、細胞膜画分を可溶化する際
には、できるだけ緩和な可溶化剤（例えば、ＣＨＡＰ
Ｓ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、又はジキトニン等）を
用いることにより、可溶化後も受容体の特性を保持する
ことができる。
使用することのできる分離及び精製方法は、特に限定さ
れるものではないが、例えば、以下の手順で実施するこ
とができる。例えば、スクリーニングツール用ポリペプ
チドを表面に発現した細胞を培養し、これらをバッファ
ーに懸濁した後、ホモジナイズし、遠心分離することに
より、スクリーニングツール用ポリペプチドを含む細胞
膜画分を得ることができる。得られた細胞膜画分を可溶
化した後、通常のタンパク質沈殿剤による処理、限外濾
過、各種液体クロマトグラフィー［例えば、分子ふるい
クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフ
ィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティ
クロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）等］、若しくは透析法、又はこれらの組合
せ等により、スクリーニングツール用ポリペプチドを精
製することができる。なお、細胞膜画分を可溶化する際
には、できるだけ緩和な可溶化剤（例えば、ＣＨＡＰ
Ｓ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、又はジキトニン等）を
用いることにより、可溶化後も受容体の特性を保持する
ことができる。
スクリーニングツール用ポリペプチドを調製する際に
は、所望に応じて、スクリーニングツール用ポリペプチ
ドと適当なマーカー配列とをインフレームで融合して発
現させることで、前記ポリペプチドの発現の確認、細胞
内局在の確認、又は精製等を容易に行なうことができ
る。前記マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧエピ
トープ、ヘキサーヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・
タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができ
る。また、マーカー配列とスクリーニングツール用ポリ
ペプチドとの間に、プロテアーゼ（例えば、エンテロキ
ナーゼ、ファクターＸａ、又はトロンビンなど）が認識
する特異的な配列を挿入することにより、マーカー配列
部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することが
可能である。例えば、ムスカリンアセチルコリン受容体
とヘキサーヒスチジン・タグとをトロンビン認識配列で
連結した報告がある（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．Ｋ．及びＨ
ａｇａ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２０，１２３
２−１２３８，１９９６）。
は、所望に応じて、スクリーニングツール用ポリペプチ
ドと適当なマーカー配列とをインフレームで融合して発
現させることで、前記ポリペプチドの発現の確認、細胞
内局在の確認、又は精製等を容易に行なうことができ
る。前記マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧエピ
トープ、ヘキサーヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・
タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができ
る。また、マーカー配列とスクリーニングツール用ポリ
ペプチドとの間に、プロテアーゼ（例えば、エンテロキ
ナーゼ、ファクターＸａ、又はトロンビンなど）が認識
する特異的な配列を挿入することにより、マーカー配列
部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することが
可能である。例えば、ムスカリンアセチルコリン受容体
とヘキサーヒスチジン・タグとをトロンビン認識配列で
連結した報告がある（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．Ｋ．及びＨ
ａｇａ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２０，１２３
２−１２３８，１９９６）。
２）形質転換細胞型抗血小板剤スクリーニングツール
本発明の形質転換細胞型抗血小板剤スクリーニングツ
ールには、 （ｉ）ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質をコード
するＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポ
リペプチドを発現している形質転換細胞である、抗血小
板剤スクリーニングツール； （ii）機能的等価改変体をコードするＤＮＡを含む発現
ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現して
いる形質転換細胞である、抗血小板剤スクリーニングツ
ール；及び （iii）相同タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現
ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現して
いる形質転換細胞である、抗血小板剤スクリーニングツ
ール が含まれる。
ールには、 （ｉ）ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質をコード
するＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポ
リペプチドを発現している形質転換細胞である、抗血小
板剤スクリーニングツール； （ii）機能的等価改変体をコードするＤＮＡを含む発現
ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現して
いる形質転換細胞である、抗血小板剤スクリーニングツ
ール；及び （iii）相同タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現
ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現して
いる形質転換細胞である、抗血小板剤スクリーニングツ
ール が含まれる。
本発明の形質転換細胞型抗血小板剤スクリーニングツ
ールとして用いることのできる各種形質転換細胞（以
下、スクリーニングツール用形質転換細胞と称する）を
作成するために使用することのできる宿主細胞は、スク
リーニングツール用ポリペプチドを発現することができ
る限り、特に限定されるものではなく、例えば、通常使
用される公知の微生物、例えば、大腸菌又は酵母（Ｓｅ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、あ
るいは、公知の培養細胞、例えば、脊椎動物細胞（例え
ば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、又はＣＯＳ細胞）
又は昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）を挙げることがで
きる。前記脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞
であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，Ｃｅｌｌ，
２３，１７５−１８２，１９８１）、チャイニーズ・ハ
ムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクター
ゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．及びＣｈａｓｉｎ，Ｌ．
Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ヒト胎児
腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、あるいは、前記ＨＥＫ２９
３細胞にエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺
伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ社）を挙げることができる。
ールとして用いることのできる各種形質転換細胞（以
下、スクリーニングツール用形質転換細胞と称する）を
作成するために使用することのできる宿主細胞は、スク
リーニングツール用ポリペプチドを発現することができ
る限り、特に限定されるものではなく、例えば、通常使
用される公知の微生物、例えば、大腸菌又は酵母（Ｓｅ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、あ
るいは、公知の培養細胞、例えば、脊椎動物細胞（例え
ば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、又はＣＯＳ細胞）
又は昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）を挙げることがで
きる。前記脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞
であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，Ｃｅｌｌ，
２３，１７５−１８２，１９８１）、チャイニーズ・ハ
ムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクター
ゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．及びＣｈａｓｉｎ，Ｌ．
Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ヒト胎児
腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、あるいは、前記ＨＥＫ２９
３細胞にエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺
伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ社）を挙げることができる。
スクリーニングツール用形質転換細胞を作成するため
に使用することのできる発現ベクターは、スクリーニン
グツール用ポリペプチドを発現することができる限り、
特に限定されるものではなく、使用する宿主細胞の種類
に応じて、適宜選択することができる。
に使用することのできる発現ベクターは、スクリーニン
グツール用ポリペプチドを発現することができる限り、
特に限定されるものではなく、使用する宿主細胞の種類
に応じて、適宜選択することができる。
例えば、脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常
発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモータ
ー、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及
び転写終結配列等を有するものを使用することができ、
更に必要により、複製起点を有していることができる。
前記発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初
期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａ
ｍａｎｉ，Ｓ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｏｉｌ．，
１，８５４−８６４，１９８１）、ヒトの延長因子プロ
モーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍ
ａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又
はサイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ
４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができ
る。
発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモータ
ー、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及
び転写終結配列等を有するものを使用することができ、
更に必要により、複製起点を有していることができる。
前記発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初
期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａ
ｍａｎｉ，Ｓ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｏｉｌ．，
１，８５４−８６４，１９８１）、ヒトの延長因子プロ
モーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍ
ａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又
はサイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ
４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができ
る。
より詳細には、宿主細胞としてＣＯＳ細胞を用いる場
合には、発現ベクターとして、ＳＶ４０複製起点を有
し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、更に、
転写プロモーター、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプ
ライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、
ｐＭＥ１８Ｓ（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．及びＴａｋｅｂ
ｅ，Ｙ．，Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７−３
２，１９９０）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍ
ａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又
はｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２
９，８４０−８４２，１９８７）等を挙げることができ
る。
合には、発現ベクターとして、ＳＶ４０複製起点を有
し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、更に、
転写プロモーター、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプ
ライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、
ｐＭＥ１８Ｓ（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．及びＴａｋｅｂ
ｅ，Ｙ．，Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７−３
２，１９９０）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍ
ａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又
はｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２
９，８４０−８４２，１９８７）等を挙げることができ
る。
前記発現ベクターは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラ
ン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．及びＭａｇｎｕｓｓｏｎ，
Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１，
１２９５−１３０８，１９８３）、リン酸カルシウム−
ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．及びｖａｎ
ｄｅｒ Ｅｄ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４
５６−４５７，１９７３）、カチオン性リポソーム試薬
（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ
社）を用いた方法、あるいは、電気パルス穿孔法（Ｎｅ
ｕｍａｎｎ，Ｅ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１，８４１−８
４５，１９８２）等により、ＣＯＳ細胞に取り込ませる
ことができる。
ン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．及びＭａｇｎｕｓｓｏｎ，
Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１，
１２９５−１３０８，１９８３）、リン酸カルシウム−
ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．及びｖａｎ
ｄｅｒ Ｅｄ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４
５６−４５７，１９７３）、カチオン性リポソーム試薬
（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ
社）を用いた方法、あるいは、電気パルス穿孔法（Ｎｅ
ｕｍａｎｎ，Ｅ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１，８４１−８
４５，１９８２）等により、ＣＯＳ細胞に取り込ませる
ことができる。
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、
スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを含む発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーと
して機能するｎｅｏ遺伝子を発現することのできるベク
ター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
Ｊ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ
Ｙ，１９８９）又はｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐ
ｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１，１９８２）等
をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを
選択することにより、スクリーニングツール用ポリペプ
チドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができ
る。
スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを含む発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーと
して機能するｎｅｏ遺伝子を発現することのできるベク
ター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
Ｊ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ
Ｙ，１９８９）又はｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐ
ｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１，１９８２）等
をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを
選択することにより、スクリーニングツール用ポリペプ
チドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができ
る。
更に、宿主細胞として２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いる
場合には、発現ベクターとして、エプスタイン・バーウ
イルスの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己
増殖が可能なｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）な
どを用いることができる。
場合には、発現ベクターとして、エプスタイン・バーウ
イルスの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己
増殖が可能なｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）な
どを用いることができる。
スクリーニングツール用形質転換細胞は、常法に従っ
て培養することができ、前記培養により細胞内又は細胞
表面にスクリーニングツール用ポリペプチドが生産され
る。前記培養に用いることのできる培地としては、採用
した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択
することができる。例えば、ＣＯＳ細胞の場合には、例
えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地又はダルベッコ修正イー
グル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応じ
て牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加した培地を
使用することができる。また、２９３−ＥＢＮＡ細胞の
場合には、牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加し
たダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等
の培地にＧ４１８を加えた培地を使用することができ
る。
て培養することができ、前記培養により細胞内又は細胞
表面にスクリーニングツール用ポリペプチドが生産され
る。前記培養に用いることのできる培地としては、採用
した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択
することができる。例えば、ＣＯＳ細胞の場合には、例
えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地又はダルベッコ修正イー
グル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応じ
て牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加した培地を
使用することができる。また、２９３−ＥＢＮＡ細胞の
場合には、牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加し
たダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等
の培地にＧ４１８を加えた培地を使用することができ
る。
スクリーニングツール用形質転換細胞は、スクリーニ
ングツール用ポリペプチドを発現している限り、特に限
定されるものではない。スクリーニングツール用形質転
換細胞は、スクリーニングツール用ポリペプチドに加
え、Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１１で表される
アミノ酸配列（Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈ
ｅ）であるＧタンパク質を発現していることが好まし
い。配列番号１１で表されるアミノ酸配列は、ＧｉのＣ
末端の５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、以
下、「Ｃ末端のアミノ酸配列が配列番号１１で表される
アミノ酸配列であるＧタンパク質」を「Ｃ末端Ｇｉ型Ｇ
タンパク質」と称する。
ングツール用ポリペプチドを発現している限り、特に限
定されるものではない。スクリーニングツール用形質転
換細胞は、スクリーニングツール用ポリペプチドに加
え、Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１１で表される
アミノ酸配列（Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈ
ｅ）であるＧタンパク質を発現していることが好まし
い。配列番号１１で表されるアミノ酸配列は、ＧｉのＣ
末端の５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、以
下、「Ｃ末端のアミノ酸配列が配列番号１１で表される
アミノ酸配列であるＧタンパク質」を「Ｃ末端Ｇｉ型Ｇ
タンパク質」と称する。
前記Ｃ末端Ｇｉ型Ｇタンパク質としては、例えば、
（１）Ｇｉ、又は（２）Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列
番号１１で表されるアミノ酸配列であり、しかも、ホス
ホリパーゼＣ活性促進性Ｇタンパク質（例えば、Ｇｑ）
のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプ
チドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチド
とのキメラであるＧタンパク質キメラを挙げることがで
きる。以下、ＧｑのホスホリパーゼＣ活性促進活性を有
する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する
部分ポリペプチドとのキメラであるＧタンパク質キメラ
を、Ｇｑｉと称する。
（１）Ｇｉ、又は（２）Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列
番号１１で表されるアミノ酸配列であり、しかも、ホス
ホリパーゼＣ活性促進性Ｇタンパク質（例えば、Ｇｑ）
のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプ
チドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチド
とのキメラであるＧタンパク質キメラを挙げることがで
きる。以下、ＧｑのホスホリパーゼＣ活性促進活性を有
する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する
部分ポリペプチドとのキメラであるＧタンパク質キメラ
を、Ｇｑｉと称する。
スクリーニングツール用ポリペプチドは、ＧｉのＣ末
端の５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（すなわち、
配列番号１１で表されるアミノ酸配列）を認識して、Ｇ
ｉと結合する。従って、スクリーニングツール用ポリペ
プチドは、Ｇｉのみならず、Ｇｑｉとも結合することが
できる。スクリーニングツール用形質転換細胞におい
て、スクリーニングツール用ポリペプチドとＣ末端Ｇｉ
型Ｇタンパク質とが発現されると、これらのポリペプチ
ドは細胞内で結合することができる。
端の５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（すなわち、
配列番号１１で表されるアミノ酸配列）を認識して、Ｇ
ｉと結合する。従って、スクリーニングツール用ポリペ
プチドは、Ｇｉのみならず、Ｇｑｉとも結合することが
できる。スクリーニングツール用形質転換細胞におい
て、スクリーニングツール用ポリペプチドとＣ末端Ｇｉ
型Ｇタンパク質とが発現されると、これらのポリペプチ
ドは細胞内で結合することができる。
前記Ｇｑｉにおける「ＧｑのホスホリパーゼＣ活性促
進活性を有する部分ポリペプチド」は、Ｇｑと共役する
血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＰＬＣとの結合に必要なＣ末
端アミノ酸配列を含まず、しかも、ホスホリパーゼＣの
活性を促進する活性を有する限り、特に限定されるもの
ではないが、例えば、Ｃ末端の５アミノ酸残基からなる
アミノ酸配列を欠失したＧｑのＮ末端側部分ポリペプチ
ドを挙げることができる。
進活性を有する部分ポリペプチド」は、Ｇｑと共役する
血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＰＬＣとの結合に必要なＣ末
端アミノ酸配列を含まず、しかも、ホスホリパーゼＣの
活性を促進する活性を有する限り、特に限定されるもの
ではないが、例えば、Ｃ末端の５アミノ酸残基からなる
アミノ酸配列を欠失したＧｑのＮ末端側部分ポリペプチ
ドを挙げることができる。
前記Ｇｑｉにおける「Ｇｉの受容体共役活性を有する
部分ポリペプチド」は、ＧｉのＣ末端の５アミノ酸残基
からなるアミノ酸配列を含み、しかも、アデニル酸シク
ラーゼの活性を抑制する活性を有しない限り、特に限定
されるものではないが、例えば、配列番号１１で表され
るアミノ酸配列からなるＧｉのＣ末端側部分ポリペプチ
ドを挙げることができる。
部分ポリペプチド」は、ＧｉのＣ末端の５アミノ酸残基
からなるアミノ酸配列を含み、しかも、アデニル酸シク
ラーゼの活性を抑制する活性を有しない限り、特に限定
されるものではないが、例えば、配列番号１１で表され
るアミノ酸配列からなるＧｉのＣ末端側部分ポリペプチ
ドを挙げることができる。
（２）ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アンタゴニス
ト、又はアゴニスト検出方法 前記スクリーニングツール用ポリペプチド、又はスク
リーニングツール用形質転換細胞を検出ツールに用い
て、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、ア
ンタゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出する
ことができる。
ト、又はアゴニスト検出方法 前記スクリーニングツール用ポリペプチド、又はスク
リーニングツール用形質転換細胞を検出ツールに用い
て、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、ア
ンタゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出する
ことができる。
本発明による、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ
リガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストであるか否
かを検出する方法には、 １）血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するリガンド
であるか否かを検出する方法（すなわち、リガンド検出
方法）； ２）形質転換細胞内におけるＣａ２＋濃度の変動を指標
として、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアン
タゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する方法
（すなわち、Ｃａ２＋型検出方法）； ３）形質転換細胞内におけるｃＡＭＰ量の変動を指標と
して、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタ
ゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する方法
（すなわち、ｃＡＭＰ型検出方法）；及び ４）ＧＴＰγＳ結合法を利用する血小板のＡＤＰ受容体
Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニスト又はアゴニストであ
るか否かを検出する方法（以下、ＧＴＰγＳ結合型検出
方法と称する） が含まれる。これらの検出方法について、順次説明す
る。
リガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストであるか否
かを検出する方法には、 １）血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するリガンド
であるか否かを検出する方法（すなわち、リガンド検出
方法）； ２）形質転換細胞内におけるＣａ２＋濃度の変動を指標
として、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアン
タゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する方法
（すなわち、Ｃａ２＋型検出方法）； ３）形質転換細胞内におけるｃＡＭＰ量の変動を指標と
して、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタ
ゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する方法
（すなわち、ｃＡＭＰ型検出方法）；及び ４）ＧＴＰγＳ結合法を利用する血小板のＡＤＰ受容体
Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニスト又はアゴニストであ
るか否かを検出する方法（以下、ＧＴＰγＳ結合型検出
方法と称する） が含まれる。これらの検出方法について、順次説明す
る。
１）リガンド検出方法
本発明のリガンド検出方法は、（ｉ）ヒトＡＤＰ受容
体Ｐ２ＴＡＣタンパク質、機能的等価改変体、又は相同
タンパク質（以下、検出ツール用ポリペプチドと称す
る）、検出ツール用ポリペプチドを含む細胞膜画分、あ
るいは、検出ツール用ポリペプチドを発現させた形質転
換細胞（以下、検出ツール用ポリペプチド、前記細胞膜
画分、及び前記形質転換細胞を総称して、リガンド検出
ツールと称する）と、（ii）標識リガンドとを用いる限
り、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手
順により実施することができる。
体Ｐ２ＴＡＣタンパク質、機能的等価改変体、又は相同
タンパク質（以下、検出ツール用ポリペプチドと称す
る）、検出ツール用ポリペプチドを含む細胞膜画分、あ
るいは、検出ツール用ポリペプチドを発現させた形質転
換細胞（以下、検出ツール用ポリペプチド、前記細胞膜
画分、及び前記形質転換細胞を総称して、リガンド検出
ツールと称する）と、（ii）標識リガンドとを用いる限
り、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手
順により実施することができる。
まず、リガンド検出ツールを調製する。アッセイ条件
（例えば、使用する緩衝液の種類及び濃度、緩衝液に添
加するイオンの種類及び濃度、並びにアッセイ系のｐ
Ｈ）を最適化し、最適化したバッファー中で、リガンド
検出ツールと、標識リガンドとを、試験化合物と共に一
定時間インキュベーションする。前記標識リガンドとし
ては、例えば、［３Ｈ］２−メチルチオ−ＡＤＰ（２Ｍ
ｅＳＡＤＰ）を用いることができる。反応後、反応液を
ガラスフィルター等で濾過し、適量のバッファーで洗浄
した後、フィルターに残存する放射活性を液体シンチレ
ーションカウンター等で測定する。得られた放射活性リ
ガンドの結合阻害を指標として、ＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＡＣに対するリガンドであるか否かを検出することがで
きる。すなわち、試験化合物不在下の場合のフィルター
残存放射活性よりも、試験化合物存在下の場合のフィル
ター残存放射活性が低下した場合には、前記試験化合物
は、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するリガンドであると
判定することができる。例えば、実施例６に記載の条件
で行なうことができる。
（例えば、使用する緩衝液の種類及び濃度、緩衝液に添
加するイオンの種類及び濃度、並びにアッセイ系のｐ
Ｈ）を最適化し、最適化したバッファー中で、リガンド
検出ツールと、標識リガンドとを、試験化合物と共に一
定時間インキュベーションする。前記標識リガンドとし
ては、例えば、［３Ｈ］２−メチルチオ−ＡＤＰ（２Ｍ
ｅＳＡＤＰ）を用いることができる。反応後、反応液を
ガラスフィルター等で濾過し、適量のバッファーで洗浄
した後、フィルターに残存する放射活性を液体シンチレ
ーションカウンター等で測定する。得られた放射活性リ
ガンドの結合阻害を指標として、ＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＡＣに対するリガンドであるか否かを検出することがで
きる。すなわち、試験化合物不在下の場合のフィルター
残存放射活性よりも、試験化合物存在下の場合のフィル
ター残存放射活性が低下した場合には、前記試験化合物
は、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するリガンドであると
判定することができる。例えば、実施例６に記載の条件
で行なうことができる。
２）Ｃａ２＋型検出方法
本発明のＣａ２＋型検出方法は、形質転換細胞とし
て、（ｉ）検出ツール用ポリペプチドと、（ii）Ｃ末端
のアミノ酸配列が、配列番号１１で表されるアミノ酸配
列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇタン
パク質のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポ
リペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペ
プチドとのキメラであるＧタンパク質キメラ（例えば、
Ｇｑｉ）とを共発現している形質転換細胞（以下、Ｃａ
２＋型検出用形質転換細胞と称する）を使用する。な
お、前記形質転換細胞は、形質転換する前の宿主細胞
が、ＡＤＰを作用させても細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇し
ない細胞であることが好ましい。このような細胞として
は、例えば、ラットグリオーマ細胞株の一種であるＣ６
−１５（Ｃｈａｎｇｅ，Ｋ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２７０，２６１５２−２６１５８，１９９５）を
挙げることができる。
て、（ｉ）検出ツール用ポリペプチドと、（ii）Ｃ末端
のアミノ酸配列が、配列番号１１で表されるアミノ酸配
列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇタン
パク質のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポ
リペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペ
プチドとのキメラであるＧタンパク質キメラ（例えば、
Ｇｑｉ）とを共発現している形質転換細胞（以下、Ｃａ
２＋型検出用形質転換細胞と称する）を使用する。な
お、前記形質転換細胞は、形質転換する前の宿主細胞
が、ＡＤＰを作用させても細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇し
ない細胞であることが好ましい。このような細胞として
は、例えば、ラットグリオーマ細胞株の一種であるＣ６
−１５（Ｃｈａｎｇｅ，Ｋ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２７０，２６１５２−２６１５８，１９９５）を
挙げることができる。
本発明のＣａ２＋型検出方法においてアゴニストであ
るか否かを検出する場合には、Ｃａ２＋型検出用形質転
換細胞と試験化合物とを接触させ、前記Ｃａ２＋型検出
用形質転換細胞内のＣａ２＋濃度の変化を、直接的又は
間接的に分析（すなわち、測定又は検出）する。Ｃａ
２＋濃度の変化は、例えば、カルシウム結合性蛍光試薬
（例えば、ｆｕｒａ２又はｆｌｕｏ３等）を用いて、直
接的にＣａ２＋濃度の変化を分析することもできるし、
あるいは、Ｃａ２＋濃度に依存して転写量が調節される
遺伝子［例えば、ルシフェラーゼの遺伝子の上流にアク
チベータープロテイン１（ＡＰ１）応答配列を挿入した
遺伝子］の転写活性を分析することにより、間接的にＣ
ａ２＋濃度の変化を分析することもできる。
るか否かを検出する場合には、Ｃａ２＋型検出用形質転
換細胞と試験化合物とを接触させ、前記Ｃａ２＋型検出
用形質転換細胞内のＣａ２＋濃度の変化を、直接的又は
間接的に分析（すなわち、測定又は検出）する。Ｃａ
２＋濃度の変化は、例えば、カルシウム結合性蛍光試薬
（例えば、ｆｕｒａ２又はｆｌｕｏ３等）を用いて、直
接的にＣａ２＋濃度の変化を分析することもできるし、
あるいは、Ｃａ２＋濃度に依存して転写量が調節される
遺伝子［例えば、ルシフェラーゼの遺伝子の上流にアク
チベータープロテイン１（ＡＰ１）応答配列を挿入した
遺伝子］の転写活性を分析することにより、間接的にＣ
ａ２＋濃度の変化を分析することもできる。
Ｃａ２＋型検出用形質転換細胞と試験化合物とを接触
させた場合に、Ｃａ２＋型検出用形質転換細胞内のＣａ
２＋濃度が上昇すれば、前記試験化合物は、ＡＤＰ受容
体Ｐ２ＴＡＣに対するアゴニストであると判定すること
ができる。なお、コントロールとして、検出ツール用ポ
リペプチドとＧｑｉとを共発現しているＣａ２＋型検出
用形質転換細胞の代わりに、検出ツール用ポリペプチド
が発現されておらず、しかも、Ｇｑｉが発現しているコ
ントロール用形質転換細胞、あるいは、形質転換前の宿
主細胞を用いて同様の操作を行ない、前記試験化合物に
より前記コントロール用形質転換細胞又は前記宿主細胞
内のＣａ２＋濃度が上昇しないことを確認することが好
ましい。
させた場合に、Ｃａ２＋型検出用形質転換細胞内のＣａ
２＋濃度が上昇すれば、前記試験化合物は、ＡＤＰ受容
体Ｐ２ＴＡＣに対するアゴニストであると判定すること
ができる。なお、コントロールとして、検出ツール用ポ
リペプチドとＧｑｉとを共発現しているＣａ２＋型検出
用形質転換細胞の代わりに、検出ツール用ポリペプチド
が発現されておらず、しかも、Ｇｑｉが発現しているコ
ントロール用形質転換細胞、あるいは、形質転換前の宿
主細胞を用いて同様の操作を行ない、前記試験化合物に
より前記コントロール用形質転換細胞又は前記宿主細胞
内のＣａ２＋濃度が上昇しないことを確認することが好
ましい。
本発明のＣａ２＋型検出方法においてアンタゴニスト
であるか否かを検出する場合には、Ｃａ２＋型検出用形
質転換細胞と試験化合物とを、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２
ＴＡＣのアゴニスト（例えば、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤ
Ｐ）の共存下において接触させ、Ｃａ２＋型検出用形質
転換細胞内のＣａ２＋濃度の変化を、直接的又は間接的
に分析（すなわち、測定又は検出）する。Ｃａ２＋型検
出用形質転換細胞と試験化合物とを、血小板ＡＤＰ受容
体Ｐ２ＴＡＣのアゴニストの共存下において接触させた
場合に、前記アゴニストによるＣａ２＋型検出用形質転
換細胞内のＣａ２＋濃度の上昇が、前記試験化合物によ
り阻害又は抑制されれば、前記試験化合物は、ＡＤＰ受
容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニストであると判定す
ることができる。例えば、実施例３に記載の条件で行な
うことができる。
であるか否かを検出する場合には、Ｃａ２＋型検出用形
質転換細胞と試験化合物とを、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２
ＴＡＣのアゴニスト（例えば、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤ
Ｐ）の共存下において接触させ、Ｃａ２＋型検出用形質
転換細胞内のＣａ２＋濃度の変化を、直接的又は間接的
に分析（すなわち、測定又は検出）する。Ｃａ２＋型検
出用形質転換細胞と試験化合物とを、血小板ＡＤＰ受容
体Ｐ２ＴＡＣのアゴニストの共存下において接触させた
場合に、前記アゴニストによるＣａ２＋型検出用形質転
換細胞内のＣａ２＋濃度の上昇が、前記試験化合物によ
り阻害又は抑制されれば、前記試験化合物は、ＡＤＰ受
容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニストであると判定す
ることができる。例えば、実施例３に記載の条件で行な
うことができる。
なお、コントロールとして、Ｃａ２＋型検出用形質転
換細胞と血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニストと
を、試験化合物の不在下において接触させ、前記アゴニ
ストによるＣａ２＋型検出用形質転換細胞内のＣａ２＋
濃度の上昇の程度を確認しておくことが必要である。
換細胞と血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニストと
を、試験化合物の不在下において接触させ、前記アゴニ
ストによるＣａ２＋型検出用形質転換細胞内のＣａ２＋
濃度の上昇の程度を確認しておくことが必要である。
これまで説明したように、本発明のＣａ２＋型検出方
法においては、共役タンパク質としてＧｉをそのまま使
用するのではなく、Ｇｑｉを使用するので、ｃＡＭＰ濃
度ではなく、Ｃａ２＋濃度を分析することによりアンタ
ゴニスト又はアゴニストであるか否かの検出を実施する
ことができる。通常、ｃＡＭＰ濃度に比べ、Ｃａ２＋濃
度の方が、より簡易且つ迅速に測定することができる。
法においては、共役タンパク質としてＧｉをそのまま使
用するのではなく、Ｇｑｉを使用するので、ｃＡＭＰ濃
度ではなく、Ｃａ２＋濃度を分析することによりアンタ
ゴニスト又はアゴニストであるか否かの検出を実施する
ことができる。通常、ｃＡＭＰ濃度に比べ、Ｃａ２＋濃
度の方が、より簡易且つ迅速に測定することができる。
３）ｃＡＭＰ型検出方法
本発明のｃＡＭＰ型検出方法は、形質転換細胞とし
て、検出ツール用ポリペプチドを発現している形質転換
細胞（以下、ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞と称する）
を使用する。通常の宿主細胞ではＧｉが構成的に発現し
ているので、検出ツール用ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換すること
により、ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞を得ることがで
きる。なお、前記形質転換細胞は、形質転換する前の宿
主細胞が、ＡＤＰを作用させても細胞内ｃＡＭＰ濃度が
低下しない細胞であることが好ましい。このような細胞
としては、例えば、ＣＨＯ細胞を挙げることができる。
て、検出ツール用ポリペプチドを発現している形質転換
細胞（以下、ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞と称する）
を使用する。通常の宿主細胞ではＧｉが構成的に発現し
ているので、検出ツール用ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換すること
により、ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞を得ることがで
きる。なお、前記形質転換細胞は、形質転換する前の宿
主細胞が、ＡＤＰを作用させても細胞内ｃＡＭＰ濃度が
低下しない細胞であることが好ましい。このような細胞
としては、例えば、ＣＨＯ細胞を挙げることができる。
本発明のｃＡＭＰ型検出方法においてアゴニストであ
るか否かを検出する場合には、ｃＡＭＰ型検出用形質転
換細胞と試験化合物とを接触させ、前記ｃＡＭＰ型検出
用形質転換細胞内のｃＡＭＰ濃度の変化を、直接的又は
間接的に分析（すなわち、測定又は検出）する。ｃＡＭ
Ｐ型検出用形質転換細胞と試験化合物とを接触させる際
には、ｃＡＭＰ濃度を上昇させることのできる化合物
（例えば、フォルスコリン）を共存させることが好まし
い。
るか否かを検出する場合には、ｃＡＭＰ型検出用形質転
換細胞と試験化合物とを接触させ、前記ｃＡＭＰ型検出
用形質転換細胞内のｃＡＭＰ濃度の変化を、直接的又は
間接的に分析（すなわち、測定又は検出）する。ｃＡＭ
Ｐ型検出用形質転換細胞と試験化合物とを接触させる際
には、ｃＡＭＰ濃度を上昇させることのできる化合物
（例えば、フォルスコリン）を共存させることが好まし
い。
ｃＡＭＰ濃度の変化は、例えば、市販のｃＡＭＰ測定
キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社等）を用いて、直接的にｃ
ＡＭＰ濃度の変化を分析することもできるし、あるい
は、ｃＡＭＰ濃度に依存して転写量が調節される遺伝子
［例えば、ルシフェラーゼの遺伝子の上流にｃＡＭＰ応
答配列（ＣＲＥ）を挿入した遺伝子］の転写活性を分析
することにより、間接的にｃＡＭＰ濃度の変化を分析す
ることもできる。
キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社等）を用いて、直接的にｃ
ＡＭＰ濃度の変化を分析することもできるし、あるい
は、ｃＡＭＰ濃度に依存して転写量が調節される遺伝子
［例えば、ルシフェラーゼの遺伝子の上流にｃＡＭＰ応
答配列（ＣＲＥ）を挿入した遺伝子］の転写活性を分析
することにより、間接的にｃＡＭＰ濃度の変化を分析す
ることもできる。
ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞と試験化合物とを接触
させた場合に、ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞内のｃＡ
ＭＰ濃度が低下すれば、前記試験化合物は、ＡＤＰ受容
体Ｐ２ＴＡＣに対するアゴニストであると判定すること
ができる。この場合、ｃＡＭＰ濃度を上昇させることの
できる化合物（例えば、フォルスコリン）を共存させて
おくと、試験化合物によるｃＡＭＰ濃度の低下を、より
容易に判定することができる。また、コントロールとし
て、検出ツール用ポリペプチドとＧｉとを発現している
ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞の代わりに、検出ツール
用ポリペプチドが発現されていない宿主細胞を用いて同
様の操作を行ない、前記試験化合物により前記宿主細胞
内のｃＡＭＰ濃度が低下しないことを確認することが好
ましい。
させた場合に、ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞内のｃＡ
ＭＰ濃度が低下すれば、前記試験化合物は、ＡＤＰ受容
体Ｐ２ＴＡＣに対するアゴニストであると判定すること
ができる。この場合、ｃＡＭＰ濃度を上昇させることの
できる化合物（例えば、フォルスコリン）を共存させて
おくと、試験化合物によるｃＡＭＰ濃度の低下を、より
容易に判定することができる。また、コントロールとし
て、検出ツール用ポリペプチドとＧｉとを発現している
ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞の代わりに、検出ツール
用ポリペプチドが発現されていない宿主細胞を用いて同
様の操作を行ない、前記試験化合物により前記宿主細胞
内のｃＡＭＰ濃度が低下しないことを確認することが好
ましい。
本発明のｃＡＭＰ型検出方法においてアンタゴニスト
であるか否かを検出する場合には、ｃＡＭＰ型検出用形
質転換細胞と試験化合物とを、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２
ＴＡＣのアゴニスト（例えば、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤ
Ｐ）の共存下において接触させ、前記ｃＡＭＰ型検出用
形質転換細胞内のｃＡＭＰ濃度の変化を、直接的又は間
接的に分析（すなわち、測定又は検出）する。ｃＡＭＰ
型検出用形質転換細胞と試験化合物とを、血小板ＡＤＰ
受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニスト（例えば、２ＭｅＳＡＤ
Ｐ又はＡＤＰ）の共存下において接触させた場合に、前
記アゴニストによるｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞内の
ｃＡＭＰ濃度の低下が、前記試験化合物により阻害又は
抑制されれば、前記試験化合物は、ＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＡＣに対するアンタゴニストであると判定することがで
きる。この場合、ｃＡＭＰ濃度を上昇させることのでき
る化合物（例えば、フォルスコリン）を共存させておく
と、試験化合物によるｃＡＭＰ濃度の変動を、より容易
に判定することができる。例えば、実施例４又は実施例
５に記載の条件で、行うことができる。
であるか否かを検出する場合には、ｃＡＭＰ型検出用形
質転換細胞と試験化合物とを、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２
ＴＡＣのアゴニスト（例えば、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤ
Ｐ）の共存下において接触させ、前記ｃＡＭＰ型検出用
形質転換細胞内のｃＡＭＰ濃度の変化を、直接的又は間
接的に分析（すなわち、測定又は検出）する。ｃＡＭＰ
型検出用形質転換細胞と試験化合物とを、血小板ＡＤＰ
受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニスト（例えば、２ＭｅＳＡＤ
Ｐ又はＡＤＰ）の共存下において接触させた場合に、前
記アゴニストによるｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞内の
ｃＡＭＰ濃度の低下が、前記試験化合物により阻害又は
抑制されれば、前記試験化合物は、ＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＡＣに対するアンタゴニストであると判定することがで
きる。この場合、ｃＡＭＰ濃度を上昇させることのでき
る化合物（例えば、フォルスコリン）を共存させておく
と、試験化合物によるｃＡＭＰ濃度の変動を、より容易
に判定することができる。例えば、実施例４又は実施例
５に記載の条件で、行うことができる。
また、コントロールとして、ｃＡＭＰ型検出用形質転
換細胞と血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニストと
を、試験化合物の不在下において接触させ、前記アゴニ
ストによるｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞内のｃＡＭＰ
濃度の低下の程度を確認しておくことが必要である。
換細胞と血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニストと
を、試験化合物の不在下において接触させ、前記アゴニ
ストによるｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞内のｃＡＭＰ
濃度の低下の程度を確認しておくことが必要である。
４）ＧＴＰγＳ結合型検出方法
本発明のＧＴＰγＳ結合型検出方法は、検出ツール用
ポリペプチド、前記ポリペプチドを含む細胞膜画分、あ
るいは、前記ポリペプチドを発現させた形質転換細胞を
用いて、ＧＴＰγＳ結合法（Ｌａｚａｒｅｎｏ，Ｓ．及
びＢｉｒｄｓａｌｌ，Ｎ．Ｊ．Ｍ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｌ．，１０９，１１２０−１１２７，１９９
３）を利用して、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対
するアンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出
することができる。
ポリペプチド、前記ポリペプチドを含む細胞膜画分、あ
るいは、前記ポリペプチドを発現させた形質転換細胞を
用いて、ＧＴＰγＳ結合法（Ｌａｚａｒｅｎｏ，Ｓ．及
びＢｉｒｄｓａｌｌ，Ｎ．Ｊ．Ｍ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｌ．，１０９，１１２０−１１２７，１９９
３）を利用して、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対
するアンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出
することができる。
例えば、以下の手順により実施することができる。
すなわち、検出ツール用ポリペプチドを発現させた細
胞膜を、２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．
４）、１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／
Ｌ−ＭｇＣｌ２、及び５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＧＤＰ混合溶
液中で、３５Ｓで標識されたＧＴＰγＳ（４００ｐｍｏ
ｌ／Ｌ）と混合する。試験化合物存在下と試験化合物不
在下とでインキュベートした後、反応液をガラスフィル
ター等で濾過し、フィルターに残存するＧＴＰγＳの放
射活性を液体シンチレーションカウンター等で測定す
る。試験化合物存在下における特異的なＧＴＰγＳ結合
の上昇を指標に、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアゴ
ニストであるか否かを検出することができる。また、試
験化合物存在下における、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＡＣのリガンド（例えば、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ）
によるＧＴＰγＳ結合上昇の抑制を指標に、ＡＤＰ受容
体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニストであるか否かを検
出することができる。
胞膜を、２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．
４）、１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／
Ｌ−ＭｇＣｌ２、及び５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＧＤＰ混合溶
液中で、３５Ｓで標識されたＧＴＰγＳ（４００ｐｍｏ
ｌ／Ｌ）と混合する。試験化合物存在下と試験化合物不
在下とでインキュベートした後、反応液をガラスフィル
ター等で濾過し、フィルターに残存するＧＴＰγＳの放
射活性を液体シンチレーションカウンター等で測定す
る。試験化合物存在下における特異的なＧＴＰγＳ結合
の上昇を指標に、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアゴ
ニストであるか否かを検出することができる。また、試
験化合物存在下における、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＡＣのリガンド（例えば、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ）
によるＧＴＰγＳ結合上昇の抑制を指標に、ＡＤＰ受容
体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニストであるか否かを検
出することができる。
（３）抗血小板剤スクリーニング方法
本発明の抗血小板剤スクリーニングツール（ポリペプ
チド型抗血小板剤スクリーニングツール及び形質転換細
胞型抗血小板剤スクリーニングツールの両方を含む）を
用いると、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するリ
ガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストをスクリーニ
ングすることができる。
チド型抗血小板剤スクリーニングツール及び形質転換細
胞型抗血小板剤スクリーニングツールの両方を含む）を
用いると、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するリ
ガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストをスクリーニ
ングすることができる。
既に説明したように、ＡＤＰは、血小板の活性化、粘
着、及び凝集を惹起又は亢進する重要な因子として知ら
れている。また、ＡＤＰは、血小板膜に存在するＧタン
パク質共役型のＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔを介して、血小板を
活性化すると言われている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３
３６，５１３−５２３，１９９８）。更に、公知の抗血
小板剤であるチクロピジンやクロピドグレルは、体内で
の代謝物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣを阻害することで効
果をもたらしていると考えられている（Ｓａｖｉ，Ｐ．
Ｊ．，Ｐｈａｒｍａｃｌｏ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２６
９，７７２−７７７，１９９４）し、ＡＴＰ類縁体であ
るＡＲＬ６７０８５若しくはその誘導体、又はＡｐ４Ａ
［Ｐ１，Ｐ４−ｄｉ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ−５’）ｔｅ
ｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ］の誘導体などは、Ｐ２Ｔ
ＡＣ拮抗作用によりＡＤＰによる血小板凝集の抑制作用
を有していることが示されている（Ｍｉｌｌｓ，Ｄ．
Ｃ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．，７６，８３５−
８５６，１９９６；Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｒ．Ｇ．，Ｔ
ｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１６，１
７９−１８１，１９９５；及びＫｉｍ，Ｂ．Ｋ．，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，２
３７０−２３７３，１９９２）。そして、実施例７で示
したとおり、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト
（例えば、２ＭｅＳＡＭＰ又はＡＲ−Ｃ６９９３１Ｍ
Ｘ）は、抗血小板作用を有する。
着、及び凝集を惹起又は亢進する重要な因子として知ら
れている。また、ＡＤＰは、血小板膜に存在するＧタン
パク質共役型のＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔを介して、血小板を
活性化すると言われている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３
３６，５１３−５２３，１９９８）。更に、公知の抗血
小板剤であるチクロピジンやクロピドグレルは、体内で
の代謝物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣを阻害することで効
果をもたらしていると考えられている（Ｓａｖｉ，Ｐ．
Ｊ．，Ｐｈａｒｍａｃｌｏ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２６
９，７７２−７７７，１９９４）し、ＡＴＰ類縁体であ
るＡＲＬ６７０８５若しくはその誘導体、又はＡｐ４Ａ
［Ｐ１，Ｐ４−ｄｉ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ−５’）ｔｅ
ｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ］の誘導体などは、Ｐ２Ｔ
ＡＣ拮抗作用によりＡＤＰによる血小板凝集の抑制作用
を有していることが示されている（Ｍｉｌｌｓ，Ｄ．
Ｃ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．，７６，８３５−
８５６，１９９６；Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｒ．Ｇ．，Ｔ
ｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１６，１
７９−１８１，１９９５；及びＫｉｍ，Ｂ．Ｋ．，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，２
３７０−２３７３，１９９２）。そして、実施例７で示
したとおり、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト
（例えば、２ＭｅＳＡＭＰ又はＡＲ−Ｃ６９９３１Ｍ
Ｘ）は、抗血小板作用を有する。
これらの知見によれば、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＡＣに対するリガンド又はアンタゴニストは、血小板の
活性化、粘着、及び凝集を制御することのできる物質と
して有用である。従って、これまで説明したスクリーニ
ングツール用ポリペプチドそれ自体、あるいは、スクリ
ーニングツール用形質転換細胞それ自体を、抗血小板剤
のスクリーニングに用いることができる。すなわち、ス
クリーニングツール用ポリペプチドそれ自体、あるい
は、スクリーニングツール用形質転換細胞それ自体を、
スクリーニングツールとして使用することができる。
ＡＣに対するリガンド又はアンタゴニストは、血小板の
活性化、粘着、及び凝集を制御することのできる物質と
して有用である。従って、これまで説明したスクリーニ
ングツール用ポリペプチドそれ自体、あるいは、スクリ
ーニングツール用形質転換細胞それ自体を、抗血小板剤
のスクリーニングに用いることができる。すなわち、ス
クリーニングツール用ポリペプチドそれ自体、あるい
は、スクリーニングツール用形質転換細胞それ自体を、
スクリーニングツールとして使用することができる。
本発明の抗血小板剤スクリーニングツールを用いてス
クリーニングにかけることのできる試験化合物として
は、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカル
ファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチド
を含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅ
ｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５
１，８１３５−８１３７，１９９５）によって得られた
化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅ
ｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｌ．，２２２，３
０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたラ
ンダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生
物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、
又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験化合物
として用いることができる。更には、本発明の抗血小板
剤スクリーニングツールにより選択された化合物（ペプ
チドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物
（ペプチドを含む）を用いることができる。
クリーニングにかけることのできる試験化合物として
は、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカル
ファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチド
を含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅ
ｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５
１，８１３５−８１３７，１９９５）によって得られた
化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅ
ｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｌ．，２２２，３
０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたラ
ンダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生
物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、
又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験化合物
として用いることができる。更には、本発明の抗血小板
剤スクリーニングツールにより選択された化合物（ペプ
チドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物
（ペプチドを含む）を用いることができる。
本発明のスクリーニング方法は、検出方法により、以
下の４つに大別されるが、いずれかの方法を用いて、あ
るいは、これらを組み合わせて、ＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＡＣに対するリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニス
トであるか否かを検出し、試験化合物の中からアンタゴ
ニストを選択することによって、抗血小板剤として有用
な物質をスクリーニングすることができる。以下、本発
明のスクリーニング方法、 １）血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するリガンド
をスクリーニングする方法（以下、リガンドスクリーニ
ング方法と称する）； ２）形質転換細胞内におけるＣａ２＋濃度の変動を指標
として、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアン
タゴニスト又はアゴニストをスクリーニングする方法
（以下、Ｃａ２＋型スクリーニング方法と称する）； ３）形質転換細胞内におけるｃＡＭＰ量の変動を指標と
して、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタ
ゴニスト又はアゴニストをスクリーニングする方法（以
下、ｃＡＭＰ型スクリーニング方法と称する）；及び ４）ＧＴＰγＳ結合法を利用する血小板のＡＤＰ受容体
Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニスト又はアゴニストをス
クリーニングする方法（以下、ＧＴＰγＳ結合型スクリ
ーニング方法と称する） について、順次説明する。
下の４つに大別されるが、いずれかの方法を用いて、あ
るいは、これらを組み合わせて、ＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＡＣに対するリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニス
トであるか否かを検出し、試験化合物の中からアンタゴ
ニストを選択することによって、抗血小板剤として有用
な物質をスクリーニングすることができる。以下、本発
明のスクリーニング方法、 １）血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するリガンド
をスクリーニングする方法（以下、リガンドスクリーニ
ング方法と称する）； ２）形質転換細胞内におけるＣａ２＋濃度の変動を指標
として、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアン
タゴニスト又はアゴニストをスクリーニングする方法
（以下、Ｃａ２＋型スクリーニング方法と称する）； ３）形質転換細胞内におけるｃＡＭＰ量の変動を指標と
して、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタ
ゴニスト又はアゴニストをスクリーニングする方法（以
下、ｃＡＭＰ型スクリーニング方法と称する）；及び ４）ＧＴＰγＳ結合法を利用する血小板のＡＤＰ受容体
Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニスト又はアゴニストをス
クリーニングする方法（以下、ＧＴＰγＳ結合型スクリ
ーニング方法と称する） について、順次説明する。
１）リガンドスクリーニング方法
本発明のリガンドスクリーニング方法は、本発明のリ
ガンド検出方法により、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガン
ドであるか否かを検出する工程、及びＡＤＰ受容体Ｐ２
ＴＡＣリガンドを選択する工程を含む限り、特に限定さ
れるものではない。
ガンド検出方法により、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガン
ドであるか否かを検出する工程、及びＡＤＰ受容体Ｐ２
ＴＡＣリガンドを選択する工程を含む限り、特に限定さ
れるものではない。
前記リガンド検出方法により得られた放射活性リガン
ドの結合阻害を指標として、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに
対するリガンドをスクリーニングすることができる。例
えば、実施例６に記載の条件で、試験化合物を一定時間
作用させ、［３Ｈ］−２ＭｅＳＡＤＰの結合阻害を指標
に、そのＩＣ５０が１０μＭ以下（更に好ましくは１μ
Ｍ以下）の試験化合物を、リガンドとして選択すること
ができる。
ドの結合阻害を指標として、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに
対するリガンドをスクリーニングすることができる。例
えば、実施例６に記載の条件で、試験化合物を一定時間
作用させ、［３Ｈ］−２ＭｅＳＡＤＰの結合阻害を指標
に、そのＩＣ５０が１０μＭ以下（更に好ましくは１μ
Ｍ以下）の試験化合物を、リガンドとして選択すること
ができる。
本発明のリガンドスクリーニング方法でスクリーニン
グしたリガンドを、更に、以下に説明するＣａ２＋型ス
クリーニング方法、ｃＡＭＰ型スクリーニング方法、及
び／又はＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法にかけ、
アンタゴニストをスクリーニングすることにより、抗血
小板剤として有用な物質をスクリーニングすることがで
きる。
グしたリガンドを、更に、以下に説明するＣａ２＋型ス
クリーニング方法、ｃＡＭＰ型スクリーニング方法、及
び／又はＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法にかけ、
アンタゴニストをスクリーニングすることにより、抗血
小板剤として有用な物質をスクリーニングすることがで
きる。
２）Ｃａ２＋型スクリーニング方法
本発明のＣａ２＋型スクリーニング方法は、本発明の
Ｃａ２＋型検出方法により、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣア
ンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する工
程、及びＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト又はア
ゴニストを選択する工程を含む限り、特に限定されるも
のではない。
Ｃａ２＋型検出方法により、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣア
ンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する工
程、及びＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト又はア
ゴニストを選択する工程を含む限り、特に限定されるも
のではない。
アゴニストは、前記Ｃａ２＋型検出方法において、試
験化合物によるＣａ２＋型検出用形質転換細胞内のＣａ
２＋濃度の上昇を指標に、スクリーニングすることがで
きる。
験化合物によるＣａ２＋型検出用形質転換細胞内のＣａ
２＋濃度の上昇を指標に、スクリーニングすることがで
きる。
アンタゴニストは、前記Ｃａ２＋型検出方法におい
て、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニスト（例え
ば、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ）によるＣａ２＋型検出
用形質転換細胞内のＣａ２＋濃度の上昇が、試験化合物
により阻害又は抑制されることを指標に、スクリーニン
グすることができる。
て、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニスト（例え
ば、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ）によるＣａ２＋型検出
用形質転換細胞内のＣａ２＋濃度の上昇が、試験化合物
により阻害又は抑制されることを指標に、スクリーニン
グすることができる。
例えば、実施例３に記載の条件で、試験化合物を一定
時間作用させ、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰによる細胞内
Ｃａ２＋濃度の上昇の阻害を指標に、そのＩＣ５０が１
０μＭ以下（更に好ましくは１μＭ以下）の試験化合物
を、アンタゴニスト活性を有する物質として選択するこ
とができる。
時間作用させ、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰによる細胞内
Ｃａ２＋濃度の上昇の阻害を指標に、そのＩＣ５０が１
０μＭ以下（更に好ましくは１μＭ以下）の試験化合物
を、アンタゴニスト活性を有する物質として選択するこ
とができる。
本発明のＣａ２＋型スクリーニング方法でアンタゴニ
ストをスクリーニングすることにより、抗血小板剤とし
て有用な物質をスクリーニングすることができる。
ストをスクリーニングすることにより、抗血小板剤とし
て有用な物質をスクリーニングすることができる。
３）ｃＡＭＰ型スクリーニング方法
本発明のｃＡＭＰ型スクリーニング方法は、本発明の
ｃＡＭＰ型検出方法により、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣア
ンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する工
程、及びＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト又はア
ゴニストを選択する工程を含む限り、特に限定されるも
のではない。
ｃＡＭＰ型検出方法により、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣア
ンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する工
程、及びＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト又はア
ゴニストを選択する工程を含む限り、特に限定されるも
のではない。
アゴニストは、前記ｃＡＭＰ型検出方法において、試
験化合物によるｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞内のｃＡ
ＭＰ濃度低下を指標に、スクリーニングすることができ
る。
験化合物によるｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞内のｃＡ
ＭＰ濃度低下を指標に、スクリーニングすることができ
る。
アンタゴニストは、前記ｃＡＭＰ型検出方法におい
て、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニスト（例え
ば、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ）によるｃＡＭＰ型検出
用形質転換細胞内のｃＡＭＰ濃度の低下が、試験化合物
により阻害又は抑制されることを指標にスクリーニング
することができる。
て、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニスト（例え
ば、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ）によるｃＡＭＰ型検出
用形質転換細胞内のｃＡＭＰ濃度の低下が、試験化合物
により阻害又は抑制されることを指標にスクリーニング
することができる。
例えば、実施例４又は実施例５に記載の条件で、試験
化合物を一定時間作用させ、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ
による細胞内ｃＡＭＰ濃度の低下の阻害を指標に、その
ＩＣ５０が１０μＭ以下（更に好ましくは１μＭ以下）
の試験化合物を、アンタゴニスト活性を有する物質とし
て選択することができる。
化合物を一定時間作用させ、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ
による細胞内ｃＡＭＰ濃度の低下の阻害を指標に、その
ＩＣ５０が１０μＭ以下（更に好ましくは１μＭ以下）
の試験化合物を、アンタゴニスト活性を有する物質とし
て選択することができる。
本発明のｃＡＭＰ型スクリーニング方法でアンタゴニ
ストをスクリーニングすることにより、抗血小板剤とし
て有用な物質をスクリーニングすることができる。
ストをスクリーニングすることにより、抗血小板剤とし
て有用な物質をスクリーニングすることができる。
４）ＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法
本発明のＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法は、本
発明のＧＴＰγＳ結合型検出方法により、ＡＤＰ受容体
Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト又はアゴニストであるか否か
を検出する工程、及びＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴ
ニスト又はアゴニストを選択する工程を含む限り、特に
限定されるものではない。
発明のＧＴＰγＳ結合型検出方法により、ＡＤＰ受容体
Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト又はアゴニストであるか否か
を検出する工程、及びＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴ
ニスト又はアゴニストを選択する工程を含む限り、特に
限定されるものではない。
アゴニストは、前記ＧＴＰγＳ結合型検出方法におけ
る、試験化合物による特異的なＧＴＰγＳ結合の上昇を
指標にスクリーニングすることができる。
る、試験化合物による特異的なＧＴＰγＳ結合の上昇を
指標にスクリーニングすることができる。
また、アンタゴニストは、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＡＣのアゴニスト（例えば、２ＭｅＳＡＤＰやＡＤＰ）
によるＧＴＰγＳ結合上昇が、試験化合物により抑制さ
れることを指標に、スクリーニングすることができる。
ＡＣのアゴニスト（例えば、２ＭｅＳＡＤＰやＡＤＰ）
によるＧＴＰγＳ結合上昇が、試験化合物により抑制さ
れることを指標に、スクリーニングすることができる。
本発明のＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法でアン
タゴニストをスクリーニングすることにより、抗血小板
剤として有用な物質をスクリーニングすることができ
る。
タゴニストをスクリーニングすることにより、抗血小板
剤として有用な物質をスクリーニングすることができ
る。
（４）抗血小板用医薬組成物の製造
本発明には、前記２）〜４）記載のスクリーニング方
法により、あるいは、１）〜４）記載のスクリーニング
方法を組み合わせることにより選択されるＡＤＰ受容体
Ｐ２ＴＡＣアンタゴニストである物質（例えば、化合
物、ペプチド、抗体、又は抗体断片）を有効成分とする
抗血小板剤が包含される。
法により、あるいは、１）〜４）記載のスクリーニング
方法を組み合わせることにより選択されるＡＤＰ受容体
Ｐ２ＴＡＣアンタゴニストである物質（例えば、化合
物、ペプチド、抗体、又は抗体断片）を有効成分とする
抗血小板剤が包含される。
選択されたＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニストが
抗血小板作用を有することは、例えば、実施例７記載の
方法で、ヒト血小板凝集阻害活性を検出することによ
り、確認することができる。
抗血小板作用を有することは、例えば、実施例７記載の
方法で、ヒト血小板凝集阻害活性を検出することによ
り、確認することができる。
また、抗血小板用医薬組成物の品質規格の確認試験に
おいて、本発明のリガンド検出方法、Ｃａ２＋型検出方
法、ｃＡＭＰ型検出方法、及び／又はＧＴＰγＳ結合型
検出方法によるＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アン
タゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出する工
程、及び製剤化工程を含む、抗血小板用医薬組成物の製
造方法も本発明に含まれる。
おいて、本発明のリガンド検出方法、Ｃａ２＋型検出方
法、ｃＡＭＰ型検出方法、及び／又はＧＴＰγＳ結合型
検出方法によるＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アン
タゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出する工
程、及び製剤化工程を含む、抗血小板用医薬組成物の製
造方法も本発明に含まれる。
本発明のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト（例
えば、化合物、ペプチド、抗体又は抗体断片）を有効成
分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それ
らの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び／又は
その他の添加剤を用いて調製することができる。
えば、化合物、ペプチド、抗体又は抗体断片）を有効成
分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それ
らの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び／又は
その他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆
粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投
与、あるいは、静注若しくは筋注などの注射剤、坐剤、
経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を
挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあ
っては、静注等の非経口投与又は消化を受けない製剤化
手段、例えば、ＷＯ９５／２８９６３号パンフレットに
記載の製剤化手段が好ましい。
粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投
与、あるいは、静注若しくは筋注などの注射剤、坐剤、
経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を
挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあ
っては、静注等の非経口投与又は消化を受けない製剤化
手段、例えば、ＷＯ９５／２８９６３号パンフレットに
記載の製剤化手段が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ
以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、
例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロ
ース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリ
ビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシ
ウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法
に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢
剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤な
どを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要によ
り糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで
被覆することができる。
以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、
例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロ
ース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリ
ビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシ
ウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法
に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢
剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤な
どを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要によ
り糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで
被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液
剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むこと
ができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、
精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物
は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸
濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することがで
きる。
剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むこと
ができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、
精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物
は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸
濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することがで
きる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは
非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができ
る。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例
えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことが
できる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤として
は、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類
（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を
含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化
剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は
防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例え
ば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配
合、又は照射によって無菌化することができる。また、
無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はそ
の他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもでき
る。
非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができ
る。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例
えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことが
できる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤として
は、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類
（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を
含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化
剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は
防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例え
ば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配
合、又は照射によって無菌化することができる。また、
無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はそ
の他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもでき
る。
投与量は、前記スクリーニング法により選択された有
効成分の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別
等を考慮して適宜決定することができる。
効成分の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別
等を考慮して適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人
（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１
〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。ま
た、非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき
０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇで
ある。
（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１
〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。ま
た、非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき
０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇで
ある。
実施例
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、
これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、
特に断りがない場合は、公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ，Ｔ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，ＮＹ，１９８２等）に従って実施することが可能で
ある。
これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、
特に断りがない場合は、公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ，Ｔ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，ＮＹ，１９８２等）に従って実施することが可能で
ある。
実施例１：ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ遺伝子ＨＯＲＫ３の
単離 本実施例では、以下に示す手順に従って、ヒト脳ｃＤ
ＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）をテンプレートとして、
ＰＣＲ法により、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ遺伝子ＨＯＲ
Ｋ３（以下、単に、ＨＯＲＫ３遺伝子と称する）の全長
ｃＤＮＡを取得した。
単離 本実施例では、以下に示す手順に従って、ヒト脳ｃＤ
ＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）をテンプレートとして、
ＰＣＲ法により、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ遺伝子ＨＯＲ
Ｋ３（以下、単に、ＨＯＲＫ３遺伝子と称する）の全長
ｃＤＮＡを取得した。
すなわち、配列番号３で表される塩基配列からなるオ
リゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列
番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
をリバースプライマーとして用いた。なお、前記フォワ
ードプライマー及びリバースプライマーの各々の５’末
端には、ＸｂａＩ認識部位を含む塩基配列が付加されて
いる。ＰＣＲは、ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｘ
Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社製）
を用いて、５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）存在
下で、９４℃（２０秒間）／５８℃（２０秒間）／７４
℃（１．５分間）からなるサイクルを５回、９４℃（２
０秒間）／５５℃（２０秒間）／７４℃（１．５分間）
からなるサイクルを５回、そして、９４℃（２０秒間）
／５０℃（２０秒間）／７４℃（１．５分間）からなる
サイクルを２５回、順次繰り返した。その結果、約１．
０ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。このＤＮＡ断片を
ＸｂａＩで消化した後、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄ
ｈｆｒ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，
Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，
５３２２，１９９０）のＸｂａＩ部位に挿入することに
より、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ
３を得た。
リゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列
番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
をリバースプライマーとして用いた。なお、前記フォワ
ードプライマー及びリバースプライマーの各々の５’末
端には、ＸｂａＩ認識部位を含む塩基配列が付加されて
いる。ＰＣＲは、ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｘ
Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社製）
を用いて、５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）存在
下で、９４℃（２０秒間）／５８℃（２０秒間）／７４
℃（１．５分間）からなるサイクルを５回、９４℃（２
０秒間）／５５℃（２０秒間）／７４℃（１．５分間）
からなるサイクルを５回、そして、９４℃（２０秒間）
／５０℃（２０秒間）／７４℃（１．５分間）からなる
サイクルを２５回、順次繰り返した。その結果、約１．
０ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。このＤＮＡ断片を
ＸｂａＩで消化した後、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄ
ｈｆｒ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，
Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，
５３２２，１９９０）のＸｂａＩ部位に挿入することに
より、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ
３を得た。
プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３に
おけるＨＯＲＫ３遺伝子の塩基配列は、ＤＮＡシークエ
ンサー（ＡＢＩ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて
ジデオキシターミネーター法により決定した。ＨＯＲＫ
３遺伝子の塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列
のとおりであった。
おけるＨＯＲＫ３遺伝子の塩基配列は、ＤＮＡシークエ
ンサー（ＡＢＩ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて
ジデオキシターミネーター法により決定した。ＨＯＲＫ
３遺伝子の塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列
のとおりであった。
配列番号１で表される塩基配列は、１０２９塩基のオ
ープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有しており、
このＯＲＦから予測されるアミノ酸配列（３４２アミノ
酸）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列のとおりで
あった。
ープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有しており、
このＯＲＦから予測されるアミノ酸配列（３４２アミノ
酸）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列のとおりで
あった。
実施例２：血球細胞におけるＨＯＲＫ３遺伝子の発現分
布の確認 健常人ボランティアよりヘパリン採血し、４００×ｇ
で１０分間遠心処理を行なった。得られた上層を多血小
板血漿として分取した。
布の確認 健常人ボランティアよりヘパリン採血し、４００×ｇ
で１０分間遠心処理を行なった。得られた上層を多血小
板血漿として分取した。
また、下層には６％デキストラン／生理食塩水を１／
３量加えて室温にて１時間放置した。その上清を取り、
１５０×ｇで５分間遠心処理した後、沈渣をＨＢＳＳ
（Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓｏｌｔ Ｓｏｌ
ｕｔｉｏｎ）に懸濁した。これを等量のフィコール（Ｆ
ｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に重
層し、４００×ｇで３０分間遠心処理を行なった。こう
して得られた中間層を「単核球画分」として、沈渣を多
形核白血球として分取した。
３量加えて室温にて１時間放置した。その上清を取り、
１５０×ｇで５分間遠心処理した後、沈渣をＨＢＳＳ
（Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓｏｌｔ Ｓｏｌ
ｕｔｉｏｎ）に懸濁した。これを等量のフィコール（Ｆ
ｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に重
層し、４００×ｇで３０分間遠心処理を行なった。こう
して得られた中間層を「単核球画分」として、沈渣を多
形核白血球として分取した。
前記多形核白血球にＣＤ１６マイクロビーズ（第一化
学薬品社製）を加え、磁器スタンドにて「好中球画分」
と「好酸球画分」とに分離した。
学薬品社製）を加え、磁器スタンドにて「好中球画分」
と「好酸球画分」とに分離した。
また、先に得られた前記多血小板血漿に最終濃度２ｍ
ｍｏｌ／ＬになるようにＥＤＴＡを加え、２５００×ｇ
で１５分間遠心し、得られた沈殿を１２０ｍｍｏｌ／Ｌ
−ＮａＣｌ／２ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ／３０ｍｍｏｌ
／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に再懸濁した
後、再び２５００×ｇで１５分間遠心して得られた沈殿
を「血小板画分」とした。単核球画分、好中球画分、及
び好酸球画分は、それぞれ生理食塩水にて洗浄した。
ｍｏｌ／ＬになるようにＥＤＴＡを加え、２５００×ｇ
で１５分間遠心し、得られた沈殿を１２０ｍｍｏｌ／Ｌ
−ＮａＣｌ／２ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ／３０ｍｍｏｌ
／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に再懸濁した
後、再び２５００×ｇで１５分間遠心して得られた沈殿
を「血小板画分」とした。単核球画分、好中球画分、及
び好酸球画分は、それぞれ生理食塩水にて洗浄した。
単核球画分、好中球画分、好酸球画分、及び血小板画
分から、市販の総ＲＮＡ精製試薬（ｉｓｏｇｅｎ；日本
ジーン社製）を用いて総ＲＮＡをそれぞれ精製した。各
画分由来の総ＲＮＡ５μｇをＤＮアーゼ（ＤＮａｓｅ；
Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ社製）を用いて３７℃で１５分
間反応させた。ＤＮアーゼ処理した総ＲＮＡをスーパー
スクリプトファーストストランドシステム（ＲＴ−ＰＣ
Ｒ用）（ＧＩＢＣＯ社製）を用いてｃＤＮＡに変換し
た。
分から、市販の総ＲＮＡ精製試薬（ｉｓｏｇｅｎ；日本
ジーン社製）を用いて総ＲＮＡをそれぞれ精製した。各
画分由来の総ＲＮＡ５μｇをＤＮアーゼ（ＤＮａｓｅ；
Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ社製）を用いて３７℃で１５分
間反応させた。ＤＮアーゼ処理した総ＲＮＡをスーパー
スクリプトファーストストランドシステム（ＲＴ−ＰＣ
Ｒ用）（ＧＩＢＣＯ社製）を用いてｃＤＮＡに変換し
た。
血球細胞でのＨＯＲＫ３ｍＲＮＡ発現量の検討は、前
記の各ｃＤＮＡを鋳型として、シークエンスディテクタ
ー（Ｐｒｉｓｍ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅ
ｃｔｏｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
製）を用いて行なった。配列番号５で表される塩基配列
からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６で表される
塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを、プライマー
セットとして用いた。また、５’側を蛍光指示薬ＦＡＭ
（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）で標
識し、３’側を蛍光指示薬ＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏ
ｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）
で標識した配列番号７で表される塩基配列からなるオリ
ゴヌクレオチドを、ＨＯＲＫ３ｃＤＮＡを特異的に認識
するプローブとして用いた。
記の各ｃＤＮＡを鋳型として、シークエンスディテクタ
ー（Ｐｒｉｓｍ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅ
ｃｔｏｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
製）を用いて行なった。配列番号５で表される塩基配列
からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６で表される
塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを、プライマー
セットとして用いた。また、５’側を蛍光指示薬ＦＡＭ
（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）で標
識し、３’側を蛍光指示薬ＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏ
ｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）
で標識した配列番号７で表される塩基配列からなるオリ
ゴヌクレオチドを、ＨＯＲＫ３ｃＤＮＡを特異的に認識
するプローブとして用いた。
ＰＣＲは、市販のＰＣＲ試薬（ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ
ｃｏｒｅ ｒｅａｇｅｎｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、５％ＤＭＳＯ存在下で、
９５℃（１５秒間）／６０℃（６０秒間）からなるサイ
クルを５０回繰り返した。また、ｍＲＮＡ発現量算出の
標準曲線を得るために、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし
て、前記プライマーセット及びプローブを用いて同条件
のＰＣＲを行なった［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ．９８，９−２０（２０００）］。
ｃｏｒｅ ｒｅａｇｅｎｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、５％ＤＭＳＯ存在下で、
９５℃（１５秒間）／６０℃（６０秒間）からなるサイ
クルを５０回繰り返した。また、ｍＲＮＡ発現量算出の
標準曲線を得るために、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし
て、前記プライマーセット及びプローブを用いて同条件
のＰＣＲを行なった［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ．９８，９−２０（２０００）］。
更に、内部標準として、ヒトβ−アクチンの発現量を
算出するために、前記の各ｃＤＮＡ及びヒトゲノムＤＮ
Ａをそれぞれ鋳型として、配列番号８で表される塩基配
列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号９で表される
塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーセ
ットとし、５’側を蛍光指示薬ＦＡＭで標識し、３’側
を蛍光指示薬ＴＡＭＲＡで標識した配列番号１０で表さ
れる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをβ−アクチ
ンを特異的に認識するプローブとして用い、同条件のＰ
ＣＲを行なった。
算出するために、前記の各ｃＤＮＡ及びヒトゲノムＤＮ
Ａをそれぞれ鋳型として、配列番号８で表される塩基配
列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号９で表される
塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーセ
ットとし、５’側を蛍光指示薬ＦＡＭで標識し、３’側
を蛍光指示薬ＴＡＭＲＡで標識した配列番号１０で表さ
れる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをβ−アクチ
ンを特異的に認識するプローブとして用い、同条件のＰ
ＣＲを行なった。
単核球画分、好中球画分、好酸球画分、及び血小板画
分の各画分におけるβ−アクチンｍＲＮＡの発現量は、
それぞれ、総ＲＮＡ１ｎｇ当たり、１５０００コピー、
１９０００コピー、２５０００コピー、及び３３０００
コピーであった。それに対して、ＨＯＲＫ３ｍＲＮＡ
は、血小板特異的に発現しており（コピー数＝８０
５）、単核球、好中球、及び好酸球ではほとんど発現し
ていないことがわかった。
分の各画分におけるβ−アクチンｍＲＮＡの発現量は、
それぞれ、総ＲＮＡ１ｎｇ当たり、１５０００コピー、
１９０００コピー、２５０００コピー、及び３３０００
コピーであった。それに対して、ＨＯＲＫ３ｍＲＮＡ
は、血小板特異的に発現しており（コピー数＝８０
５）、単核球、好中球、及び好酸球ではほとんど発現し
ていないことがわかった。
実施例３：ＨＯＲＫ３タンパク質及びＧｑｉを共発現さ
せたＣ６−１５細胞における２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ
による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇の確認 ＡＤＰ又は２ＭｅＳＡＤＰ（２−メチルチオ−ＡＤ
Ｐ）等のプリン類の多くは、細胞に作用させると、内在
性の細胞膜受容体を介して細胞内Ｃａ２＋の上昇を認め
る。そのため、外来性に導入した遺伝子由来のタンパク
質が、ＡＤＰ又は２ＭｅＳＡＤＰに反応するか否かを検
定するためには、これらの物質に反応しない細胞を用い
てタンパク質を発現させることが好ましい。ラットグリ
オーマ細胞株の一種であるＣ６−１５は、ＡＤＰ等に反
応しないことが知られている（Ｃｈａｎｇｅ，Ｋ．ら，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２６１５２−２６
１５８，１９９５）。本実施例では、ＨＯＲＫ３タンパ
ク質を発現させる細胞としてＣ６−１５を使用した。
せたＣ６−１５細胞における２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ
による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇の確認 ＡＤＰ又は２ＭｅＳＡＤＰ（２−メチルチオ−ＡＤ
Ｐ）等のプリン類の多くは、細胞に作用させると、内在
性の細胞膜受容体を介して細胞内Ｃａ２＋の上昇を認め
る。そのため、外来性に導入した遺伝子由来のタンパク
質が、ＡＤＰ又は２ＭｅＳＡＤＰに反応するか否かを検
定するためには、これらの物質に反応しない細胞を用い
てタンパク質を発現させることが好ましい。ラットグリ
オーマ細胞株の一種であるＣ６−１５は、ＡＤＰ等に反
応しないことが知られている（Ｃｈａｎｇｅ，Ｋ．ら，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２６１５２−２６
１５８，１９９５）。本実施例では、ＨＯＲＫ３タンパ
ク質を発現させる細胞としてＣ６−１５を使用した。
また、ＨＯＲＫ３タンパク質を発現させるための発現
プラスミドとして、前記実施例１で得られたプラスミド
ｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３を用いた。
プラスミドとして、前記実施例１で得られたプラスミド
ｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３を用いた。
本実施例で使用したＧｑとＧｉとのキメラタンパク質
を発現するための発現プラスミドは、Ｃｏｎｋｌｉｎ，
Ｂ．Ｒ．らの方法（Ｎａｔｕｒｅ，３６３，２７４−２
７６，１９９３）に従い、ＧｑのＣ末端側の５アミノ酸
（Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ；配列番号
１２で表されるアミノ酸配列）を、ＧｉのＣ末端の５ア
ミノ酸（Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ；配
列番号１１で表されるアミノ酸配列）と置換して構築し
た遺伝子（以下、Ｇｐｉ遺伝子と称する）を、プラスミ
ドｐＥＦ−ＢＯＳにクローニングして作製した。構築し
たプラスミドは、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉと
命名した。
を発現するための発現プラスミドは、Ｃｏｎｋｌｉｎ，
Ｂ．Ｒ．らの方法（Ｎａｔｕｒｅ，３６３，２７４−２
７６，１９９３）に従い、ＧｑのＣ末端側の５アミノ酸
（Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ；配列番号
１２で表されるアミノ酸配列）を、ＧｉのＣ末端の５ア
ミノ酸（Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ；配
列番号１１で表されるアミノ酸配列）と置換して構築し
た遺伝子（以下、Ｇｐｉ遺伝子と称する）を、プラスミ
ドｐＥＦ−ＢＯＳにクローニングして作製した。構築し
たプラスミドは、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉと
命名した。
９６ウェルプレート（９６ｗｅｌｌ Ｂｌａｃｋ／ｃ
ｌｅａｒ ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔ，ｃｏｌｌａｇｅｎ
Ｉ ｃｏａｔｅｄ；ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯ
ＮＮ社製）に、Ｃ６−１５細胞を、１ウェル当たり２×
１０４細胞となるように播種して４８時間培養した後、
プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３（１
ウェル当たり５０ｎｇ）とプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−
Ｇｑｉ（１ウェル当たり５０ｎｇ）との組み合わせを、
トランスフェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮ
Ｅ ２０００；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いて遺伝
子導入した。なお、コントロールとして、プラスミドｐ
ＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３とプラスミドｐＥ
Ｆ−ＢＯＳ−Ｇｑｉとの組み合わせに代えて、プラスミ
ドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ（すなわち、ＨＯＲＫ３遺
伝子を含まない空ベクター）とプラスミドｐＥＦ−ＢＯ
Ｓ−Ｇｑｉとの組み合わせを用いて遺伝子導入した。
ｌｅａｒ ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔ，ｃｏｌｌａｇｅｎ
Ｉ ｃｏａｔｅｄ；ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯ
ＮＮ社製）に、Ｃ６−１５細胞を、１ウェル当たり２×
１０４細胞となるように播種して４８時間培養した後、
プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３（１
ウェル当たり５０ｎｇ）とプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−
Ｇｑｉ（１ウェル当たり５０ｎｇ）との組み合わせを、
トランスフェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮ
Ｅ ２０００；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いて遺伝
子導入した。なお、コントロールとして、プラスミドｐ
ＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３とプラスミドｐＥ
Ｆ−ＢＯＳ−Ｇｑｉとの組み合わせに代えて、プラスミ
ドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ（すなわち、ＨＯＲＫ３遺
伝子を含まない空ベクター）とプラスミドｐＥＦ−ＢＯ
Ｓ−Ｇｑｉとの組み合わせを用いて遺伝子導入した。
前記の遺伝子導入操作から２４時間経過した後、培地
を廃棄し、４μｍｏｌ／Ｌ−Ｆｌｕｏ−３，ＡＭ（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）、０．００４％プル
ロニックアシッド（商標＝Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２
７，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）、１％ウシ
胎仔血清（ＦＢＳ）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ、
及び２．５ｍｍｏｌ／Ｌプロベネシドを含むＨＢＢＳ
（Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓｏｌｔ Ｓｏｌ
ｕｔｉｏｎ）（１ウェル当たり１００μＬ）を添加し、
３７℃で１時間インキュベーションした。細胞を２０ｍ
ｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ及び２．５ｍｍｏｌ／Ｌプロベ
ネシド含有ＨＢＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製）で４回洗浄した
後、２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ及び２．５ｍｍｏｌ
／Ｌプロベネシド含有ＨＢＳＳ（１ウェル当たり１００
μＬ）を添加した。
を廃棄し、４μｍｏｌ／Ｌ−Ｆｌｕｏ−３，ＡＭ（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）、０．００４％プル
ロニックアシッド（商標＝Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２
７，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）、１％ウシ
胎仔血清（ＦＢＳ）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ、
及び２．５ｍｍｏｌ／Ｌプロベネシドを含むＨＢＢＳ
（Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓｏｌｔ Ｓｏｌ
ｕｔｉｏｎ）（１ウェル当たり１００μＬ）を添加し、
３７℃で１時間インキュベーションした。細胞を２０ｍ
ｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ及び２．５ｍｍｏｌ／Ｌプロベ
ネシド含有ＨＢＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製）で４回洗浄した
後、２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ及び２．５ｍｍｏｌ
／Ｌプロベネシド含有ＨＢＳＳ（１ウェル当たり１００
μＬ）を添加した。
細胞内Ｃａ２＋濃度の変化は、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いて経時的に測定
した。すなわち、測定開始から１０秒経過後に、２Ｍｅ
ＳＡＤＰ又はＡＤＰを、最終濃度３×１０−５ｍｏｌ／
Ｌ〜１×１０−１２ｍｏｌ／Ｌになるように、ウェルに
添加し、添加後、５０秒間は１秒ごとに、更に４分間は
６秒ごとに蛍光強度を測定した。
ｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いて経時的に測定
した。すなわち、測定開始から１０秒経過後に、２Ｍｅ
ＳＡＤＰ又はＡＤＰを、最終濃度３×１０−５ｍｏｌ／
Ｌ〜１×１０−１２ｍｏｌ／Ｌになるように、ウェルに
添加し、添加後、５０秒間は１秒ごとに、更に４分間は
６秒ごとに蛍光強度を測定した。
プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３と
プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉとの組み合わせを遺
伝子導入した細胞では、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰの濃
度依存的な細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が観察された。一
方、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ（空ベクタ
ー）とプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉとの組み合わ
せを遺伝子導入した細胞では、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤ
Ｐによる細胞内Ｃａ２＋濃度の変化は観察されなかっ
た。
プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉとの組み合わせを遺
伝子導入した細胞では、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰの濃
度依存的な細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が観察された。一
方、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ（空ベクタ
ー）とプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉとの組み合わ
せを遺伝子導入した細胞では、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤ
Ｐによる細胞内Ｃａ２＋濃度の変化は観察されなかっ
た。
プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３と
プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉとを遺伝子導入した
細胞における２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰによる細胞内Ｃ
ａ２＋濃度の変化を測定し、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ
の各濃度におけるピーク値をプロットして、ロジスティ
ック（Ｌｏｇｉｓｔｉｃ）回帰法により濃度依存性を解
析した。その結果、２ＭｅＳＡＤＰのＥＣ５０は、５．
４ｎｍｏｌ／Ｌであり、ＡＤＰのＥＣ５０は、２２０ｎ
ｍｏｌ／Ｌであることがわかった。以上のように、検出
ツール用ポリペプチドとＧｑｉとを共発現させたＣａ
２＋型検出用形質転換細胞では、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡ
ＤＰに反応して容量依存的に細胞内Ｃａ２＋濃度の変化
を誘導することが確認された。
プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉとを遺伝子導入した
細胞における２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰによる細胞内Ｃ
ａ２＋濃度の変化を測定し、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ
の各濃度におけるピーク値をプロットして、ロジスティ
ック（Ｌｏｇｉｓｔｉｃ）回帰法により濃度依存性を解
析した。その結果、２ＭｅＳＡＤＰのＥＣ５０は、５．
４ｎｍｏｌ／Ｌであり、ＡＤＰのＥＣ５０は、２２０ｎ
ｍｏｌ／Ｌであることがわかった。以上のように、検出
ツール用ポリペプチドとＧｑｉとを共発現させたＣａ
２＋型検出用形質転換細胞では、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡ
ＤＰに反応して容量依存的に細胞内Ｃａ２＋濃度の変化
を誘導することが確認された。
以上のことから、検出用ポリペプチドの１つであるＨ
ＯＲＫ３タンパク質は、ＡＤＰに反応する受容体であ
り、Ｇｉに共役していることが判明した。また、本実施
例の結果から明らかなように、検出ツール用ポリペプチ
ドの１つであるＨＯＲＫ３タンパク質及びＧｑｉを共発
現するＣ６−１５細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を測
定することで、アゴニスト又はアンタゴニストのスクリ
ーニングが可能となった。
ＯＲＫ３タンパク質は、ＡＤＰに反応する受容体であ
り、Ｇｉに共役していることが判明した。また、本実施
例の結果から明らかなように、検出ツール用ポリペプチ
ドの１つであるＨＯＲＫ３タンパク質及びＧｑｉを共発
現するＣ６−１５細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を測
定することで、アゴニスト又はアンタゴニストのスクリ
ーニングが可能となった。
実施例４：ＨＯＲＫ３タンパク質を発現するＣＨＯ細胞
における２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰによるｃＡＭＰ産生
阻害の確認 前記実施例３により、前記ＡＤＰ受容体がＧｉ共役型
受容体であることが判明したことから、前記ＡＤＰ受容
体はアデニル酸シクラーゼの活性を抑制する活性を持っ
ていることが予測される。そこで、本発明のｃＡＭＰ型
スクリーニング方法を実施するには、前記ＡＤＰ受容体
タンパク質を発現させるための宿主細胞として、ＡＤＰ
や２ＭｅＳＡＤＰによってアデニル酸シクラーゼの活性
を抑制する活性を持っていない細胞株を選択することが
好ましい。以下の方法に従い、ＡＤＰや２ＭｅＳＡＤＰ
によってフォルスコリン刺激によるｃＡＭＰの産生量を
下げない細胞を検索した結果、ＣＨＯ細胞が最適である
ことが判明したので、前記ＡＤＰ受容体タンパク質を発
現させるための細胞としてＣＨＯ細胞を用いた。なお、
本実施例では、核酸の新生合成に必須の酵素であるジヒ
ドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を欠失した細胞株
［ＣＨＯ−ｄｈｆｒ（−）株］を特に使用した。ＨＯＲ
Ｋ３タンパク質を発現させるための発現プラスミドとし
てｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３を使用した。
における２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰによるｃＡＭＰ産生
阻害の確認 前記実施例３により、前記ＡＤＰ受容体がＧｉ共役型
受容体であることが判明したことから、前記ＡＤＰ受容
体はアデニル酸シクラーゼの活性を抑制する活性を持っ
ていることが予測される。そこで、本発明のｃＡＭＰ型
スクリーニング方法を実施するには、前記ＡＤＰ受容体
タンパク質を発現させるための宿主細胞として、ＡＤＰ
や２ＭｅＳＡＤＰによってアデニル酸シクラーゼの活性
を抑制する活性を持っていない細胞株を選択することが
好ましい。以下の方法に従い、ＡＤＰや２ＭｅＳＡＤＰ
によってフォルスコリン刺激によるｃＡＭＰの産生量を
下げない細胞を検索した結果、ＣＨＯ細胞が最適である
ことが判明したので、前記ＡＤＰ受容体タンパク質を発
現させるための細胞としてＣＨＯ細胞を用いた。なお、
本実施例では、核酸の新生合成に必須の酵素であるジヒ
ドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を欠失した細胞株
［ＣＨＯ−ｄｈｆｒ（−）株］を特に使用した。ＨＯＲ
Ｋ３タンパク質を発現させるための発現プラスミドとし
てｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３を使用した。
１０ｃｍシャーレに、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ（−）株を、
１×１０６細胞となるように、αＭＥＭ（核酸存在）培
地を用いて播種し、１日培養した後、プラスミドｐＥＦ
−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３（８μｇ）をトランス
フェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０
００；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いて遺伝子導入し
た。なお、コントロールとして、プラスミドｐＥＦ−Ｂ
ＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３に代えて、プラスミドｐＥ
Ｆ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ（すなわち、ＨＯＲＫ３遺伝子を
含まない空ベクター）を用いて遺伝子導入した。
１×１０６細胞となるように、αＭＥＭ（核酸存在）培
地を用いて播種し、１日培養した後、プラスミドｐＥＦ
−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３（８μｇ）をトランス
フェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０
００；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いて遺伝子導入し
た。なお、コントロールとして、プラスミドｐＥＦ−Ｂ
ＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３に代えて、プラスミドｐＥ
Ｆ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ（すなわち、ＨＯＲＫ３遺伝子を
含まない空ベクター）を用いて遺伝子導入した。
前記の遺伝子導入操作から２４時間経過した後、遺伝
子導入した細胞を回収し、ＤＨＦＲの競合的阻害剤であ
る１００ｎｍｏｌ／Ｌメトトレキセート（和光純薬社
製）を含有するαＭＥＭ（核酸非存在）培地に懸濁した
後、段階希釈して１０ｃｍシャーレに播き直した。２週
間後に出現したコロニーを個別に取得し、ＨＯＲＫ３タ
ンパク質発現ＣＨＯ細胞、あるいは、コントロール用の
空ベクター導入ＣＨＯ細胞として、以下の実験に使用し
た。
子導入した細胞を回収し、ＤＨＦＲの競合的阻害剤であ
る１００ｎｍｏｌ／Ｌメトトレキセート（和光純薬社
製）を含有するαＭＥＭ（核酸非存在）培地に懸濁した
後、段階希釈して１０ｃｍシャーレに播き直した。２週
間後に出現したコロニーを個別に取得し、ＨＯＲＫ３タ
ンパク質発現ＣＨＯ細胞、あるいは、コントロール用の
空ベクター導入ＣＨＯ細胞として、以下の実験に使用し
た。
ＨＯＲＫ３タンパク質発現ＣＨＯ細胞又は空ベクター
導入ＣＨＯ細胞を、２４ウェルプレートに、１ウェル当
たり１×１０５細胞となるように播種した。１日培養し
た後、１ｍｍｏｌ／Ｌ−３−イソブチル−１−メチルキ
サンチン（Ｓｉｇｍａ社製）及び０．１％ＢＳＡ含有α
ＭＥＭ（核酸非存在）培地で１０分間処理した後、３μ
ｍｏｌ／Ｌフォルスコリン（和光純薬社製）と２ＭｅＳ
ＡＤＰ（最終濃度＝１×１０−１２〜１×１０−７ｍｏ
ｌ／Ｌ）との組み合わせ、あるいは、３μｍｏｌ／Ｌフ
ォルスコリンとＡＤＰ（最終濃度＝１×１０−１０〜１
×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）との組み合わせを滴下した。３
７℃で３０分間インキュベートした後に培養上清を除去
し、ｃＡＭＰ−ＥＩＡシステム（ＢＩＯＴＲＡＫ；アマ
シャム社製）に含まれる細胞溶解液を用いて細胞を溶解
した。
導入ＣＨＯ細胞を、２４ウェルプレートに、１ウェル当
たり１×１０５細胞となるように播種した。１日培養し
た後、１ｍｍｏｌ／Ｌ−３−イソブチル−１−メチルキ
サンチン（Ｓｉｇｍａ社製）及び０．１％ＢＳＡ含有α
ＭＥＭ（核酸非存在）培地で１０分間処理した後、３μ
ｍｏｌ／Ｌフォルスコリン（和光純薬社製）と２ＭｅＳ
ＡＤＰ（最終濃度＝１×１０−１２〜１×１０−７ｍｏ
ｌ／Ｌ）との組み合わせ、あるいは、３μｍｏｌ／Ｌフ
ォルスコリンとＡＤＰ（最終濃度＝１×１０−１０〜１
×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）との組み合わせを滴下した。３
７℃で３０分間インキュベートした後に培養上清を除去
し、ｃＡＭＰ−ＥＩＡシステム（ＢＩＯＴＲＡＫ；アマ
シャム社製）に含まれる細胞溶解液を用いて細胞を溶解
した。
各条件における細胞のｃＡＭＰ産生量の測定は、ｃＡ
ＭＰ−ＥＩＡシステムを用い、その添付プロトコールに
従って実施した。３μｍｏｌ／Ｌフォルスコリン単独刺
激でのｃＡＭＰ産生量を１００％とし、２ＭｅＳＡＤＰ
又はＡＤＰ共存下でのｃＡＭＰ量の濃度依存曲線を作製
した。濃度依存曲線から、ＨＯＲＫ３タンパク質に対す
る２ＭｅＳＡＤＰ及びＡＤＰの応答性は、それぞれＥＣ
５０＝０．０７ｎｍｏｌ／Ｌ及びＥＣ５０＝３５ｎｍｏ
ｌ／Ｌであった。
ＭＰ−ＥＩＡシステムを用い、その添付プロトコールに
従って実施した。３μｍｏｌ／Ｌフォルスコリン単独刺
激でのｃＡＭＰ産生量を１００％とし、２ＭｅＳＡＤＰ
又はＡＤＰ共存下でのｃＡＭＰ量の濃度依存曲線を作製
した。濃度依存曲線から、ＨＯＲＫ３タンパク質に対す
る２ＭｅＳＡＤＰ及びＡＤＰの応答性は、それぞれＥＣ
５０＝０．０７ｎｍｏｌ／Ｌ及びＥＣ５０＝３５ｎｍｏ
ｌ／Ｌであった。
一方、空ベクター導入ＣＨＯ細胞では、２ＭｅＳＡＤ
Ｐ又はＡＤＰを添加しても、フォルスコリン刺激による
ｃＡＭＰ産生量に変化は見られなかった。
Ｐ又はＡＤＰを添加しても、フォルスコリン刺激による
ｃＡＭＰ産生量に変化は見られなかった。
実施例５：ＨＯＲＫ３タンパク質を発現するＣ６−１５
細胞における２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰによるｃＡＭＰ
産生阻害の確認および阻害剤の影響 ＡＤＰや２ＭｅＳＡＤＰによってフォルスコリン刺激
によるｃＡＭＰの産生量を下げない細胞として、Ｃ６−
１５細胞も最適であることが判明したので、ＡＤＰ受容
体タンパク質を発現させるための細胞としてＣ６−１５
細胞も用いた。
細胞における２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰによるｃＡＭＰ
産生阻害の確認および阻害剤の影響 ＡＤＰや２ＭｅＳＡＤＰによってフォルスコリン刺激
によるｃＡＭＰの産生量を下げない細胞として、Ｃ６−
１５細胞も最適であることが判明したので、ＡＤＰ受容
体タンパク質を発現させるための細胞としてＣ６−１５
細胞も用いた。
ＡＤＰ受容体を発現させるための発現ベクターとして
ｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３を使用した。
ｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３を使用した。
１０ｃｍシャーレにＣ６−１５細胞を、１×１０６細
胞となるようにＤＭＥＭ培地を用いて播種し、１日培養
した後、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲ
Ｋ３（８μｇ）とｐＥＦ−ＢＯＳ−ｎｅｏ（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９
０；０．８μｇ）をトランスフェクション試薬（Ｌｉｐ
ｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ
社製）を用いて遺伝子導入した。
胞となるようにＤＭＥＭ培地を用いて播種し、１日培養
した後、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲ
Ｋ３（８μｇ）とｐＥＦ−ＢＯＳ−ｎｅｏ（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９
０；０．８μｇ）をトランスフェクション試薬（Ｌｉｐ
ｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ
社製）を用いて遺伝子導入した。
前記の遺伝子導入操作から２４時間経過した後、遺伝
子導入した細胞を回収し、０．６ｍｇ／ｍＬ−Ｇ４１８
（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を含有するＤＭＥＭ培地に
懸濁した後、段階希釈して１０ｃｍシャーレに播き直し
た。２週間後に出現したコロニーを個別に取得し、ＨＯ
ＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞として、以下の実
験に使用した。
子導入した細胞を回収し、０．６ｍｇ／ｍＬ−Ｇ４１８
（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を含有するＤＭＥＭ培地に
懸濁した後、段階希釈して１０ｃｍシャーレに播き直し
た。２週間後に出現したコロニーを個別に取得し、ＨＯ
ＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞として、以下の実
験に使用した。
ＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞を、９６ウ
ェルプレートに１×１０４細胞で播種した。１日培養し
た後、１ｍｍｏｌ／Ｌ−３−イソブチル−１−メチルキ
サンチン（Ｓｉｇｍａ社製）及び０．１％ＢＳＡ含有Ｄ
ＭＥＭ培地で１０分間処理した後、１μｍｏｌ／Ｌフォ
ルスコリン（和光純薬社製）と２ＭｅＳＡＤＰ（最終濃
度＝１×１０−１２〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ）との組
み合わせ、あるいは、１μｍｏｌ／Ｌフォルスコリンと
ＡＤＰ（最終濃度＝１×１０−１０〜１×１０−５ｍｏ
ｌ／Ｌ）との組み合わせを滴下した。３７℃で３０分間
インキュベートした後に培養上清を除去し、０．２％Ｔ
ｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳを用いて細胞を
溶解した。
ェルプレートに１×１０４細胞で播種した。１日培養し
た後、１ｍｍｏｌ／Ｌ−３−イソブチル−１−メチルキ
サンチン（Ｓｉｇｍａ社製）及び０．１％ＢＳＡ含有Ｄ
ＭＥＭ培地で１０分間処理した後、１μｍｏｌ／Ｌフォ
ルスコリン（和光純薬社製）と２ＭｅＳＡＤＰ（最終濃
度＝１×１０−１２〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ）との組
み合わせ、あるいは、１μｍｏｌ／Ｌフォルスコリンと
ＡＤＰ（最終濃度＝１×１０−１０〜１×１０−５ｍｏ
ｌ／Ｌ）との組み合わせを滴下した。３７℃で３０分間
インキュベートした後に培養上清を除去し、０．２％Ｔ
ｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳを用いて細胞を
溶解した。
各条件における細胞のｃＡＭＰ産生量の測定は、ｃＡ
ＭＰ ＨＴＲＦキット（ＣＩＳ ｂｉｏ ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ社製）を用い、添付プロトコールに従っ
て実施した。１μｍｏｌ／Ｌフォルスコリン単独刺激で
のｃＡＭＰ産生量を１００％とし、２ＭｅＳＡＤＰ又は
ＡＤＰ共存下でのｃＡＭＰ量の濃度依存曲線を作製し
た。濃度依存曲線から、ＨＯＲＫ３タンパク質に対する
２ＭｅＳＡＤＰ及びＡＤＰの応答性は、それぞれＥＣ
５０＝０．０８ｎｍｏｌ／Ｌ、ＥＣ５０＝４２ｎｍｏｌ
／Ｌであった。ＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細
胞においても実施例４で示したＨＯＲＫ３タンパク質発
現ＣＨＯ細胞とほぼ同様の性質を示した。
ＭＰ ＨＴＲＦキット（ＣＩＳ ｂｉｏ ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ社製）を用い、添付プロトコールに従っ
て実施した。１μｍｏｌ／Ｌフォルスコリン単独刺激で
のｃＡＭＰ産生量を１００％とし、２ＭｅＳＡＤＰ又は
ＡＤＰ共存下でのｃＡＭＰ量の濃度依存曲線を作製し
た。濃度依存曲線から、ＨＯＲＫ３タンパク質に対する
２ＭｅＳＡＤＰ及びＡＤＰの応答性は、それぞれＥＣ
５０＝０．０８ｎｍｏｌ／Ｌ、ＥＣ５０＝４２ｎｍｏｌ
／Ｌであった。ＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細
胞においても実施例４で示したＨＯＲＫ３タンパク質発
現ＣＨＯ細胞とほぼ同様の性質を示した。
次に、ＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞にお
けるフォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量の２Ｍｅ
ＳＡＤＰによる抑制に対する、血小板凝集を抑制するこ
とが知られる化合物の影響を検討した。血小板凝集を抑
制する化合物として、２ＭｅＳＡＭＰ（２−ｍｅｔｈｙ
ｌｔｈｉｏ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｈ
ａｔｅ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，８１，１
１１−１１７，１９９９）又はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ
（Ｎ６−［２−ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｅｔｈｙｌ］−２
−［３，３，３−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｐｒｏｐｙｌｔｈ
ｉｏ］−５′−ａｄｅｎｙｌｉｃ ａｃｉｄ，ｍｏｎｏ
ａｎｈｙｂｒｉｄｅ ｗｉｔｈ ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅ
ｔｈｙｌｅｎｅｂｉｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）
（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４２，２１３−３２０，１
９９９）を用いた。前記測定系において、１ｍｍｏｌ／
Ｌ−３−イソブチル−１−メチルキサンチン（Ｓｉｇｍ
ａ社製）及び０．１％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ培地に２Ｍｅ
ＳＡＭＰ（１０−７〜１０−４ｍｏｌ／Ｌ）又はＡＲ−
Ｃ６９９３１ＭＸ（１０−１２〜１０−６ｍｏｌ／Ｌ）
を溶解したもので１０分間処理した後、１μｍｏｌ／Ｌ
フォルスコリン（和光純薬社製）と１０ｎｍｏｌ／Ｌ−
２ＭｅＳＡＤＰとの組み合わせ滴下した。３７℃で３０
分間インキュベートした後に培養上清を除去し、０．２
％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳを用いて細
胞を溶解した。ｃＡＭＰ産生量の測定はｃＡＭＰ ＨＴ
ＲＦキットを用い、添付プロトコールに従って実施し
た。１μｍｏｌ／Ｌフォルスコリン単独刺激でのｃＡＭ
Ｐ産生量を０％とし、１μｍｏｌ／Ｌフォルスコリンと
１０ｎｍｏｌ／Ｌ−２ＭｅＳＡＤＰとの組み合わせで刺
激したときのｃＡＭＰ産生量を１００％として、阻害剤
の濃度依存曲線を作製した。濃度依存曲線から、フォル
スコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量の２ＭｅＳＡＤＰに
よる抑制に対する２ＭｅＳＡＭＰ及びＡＲ−Ｃ６９９３
１ＭＸの阻害効果は、それぞれＩＣ５０＝５μｍｏｌ／
Ｌ、ＩＣ５０＝２．４ｎｍｏｌ／Ｌであった。
けるフォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量の２Ｍｅ
ＳＡＤＰによる抑制に対する、血小板凝集を抑制するこ
とが知られる化合物の影響を検討した。血小板凝集を抑
制する化合物として、２ＭｅＳＡＭＰ（２−ｍｅｔｈｙ
ｌｔｈｉｏ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｈ
ａｔｅ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，８１，１
１１−１１７，１９９９）又はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ
（Ｎ６−［２−ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｅｔｈｙｌ］−２
−［３，３，３−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｐｒｏｐｙｌｔｈ
ｉｏ］−５′−ａｄｅｎｙｌｉｃ ａｃｉｄ，ｍｏｎｏ
ａｎｈｙｂｒｉｄｅ ｗｉｔｈ ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅ
ｔｈｙｌｅｎｅｂｉｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）
（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４２，２１３−３２０，１
９９９）を用いた。前記測定系において、１ｍｍｏｌ／
Ｌ−３−イソブチル−１−メチルキサンチン（Ｓｉｇｍ
ａ社製）及び０．１％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ培地に２Ｍｅ
ＳＡＭＰ（１０−７〜１０−４ｍｏｌ／Ｌ）又はＡＲ−
Ｃ６９９３１ＭＸ（１０−１２〜１０−６ｍｏｌ／Ｌ）
を溶解したもので１０分間処理した後、１μｍｏｌ／Ｌ
フォルスコリン（和光純薬社製）と１０ｎｍｏｌ／Ｌ−
２ＭｅＳＡＤＰとの組み合わせ滴下した。３７℃で３０
分間インキュベートした後に培養上清を除去し、０．２
％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳを用いて細
胞を溶解した。ｃＡＭＰ産生量の測定はｃＡＭＰ ＨＴ
ＲＦキットを用い、添付プロトコールに従って実施し
た。１μｍｏｌ／Ｌフォルスコリン単独刺激でのｃＡＭ
Ｐ産生量を０％とし、１μｍｏｌ／Ｌフォルスコリンと
１０ｎｍｏｌ／Ｌ−２ＭｅＳＡＤＰとの組み合わせで刺
激したときのｃＡＭＰ産生量を１００％として、阻害剤
の濃度依存曲線を作製した。濃度依存曲線から、フォル
スコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量の２ＭｅＳＡＤＰに
よる抑制に対する２ＭｅＳＡＭＰ及びＡＲ−Ｃ６９９３
１ＭＸの阻害効果は、それぞれＩＣ５０＝５μｍｏｌ／
Ｌ、ＩＣ５０＝２．４ｎｍｏｌ／Ｌであった。
実施例６：ＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞と
２ＭｅＳＡＤＰとの結合実験 実施例５で作製したＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−
１５細胞を回収及び洗浄した後、５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤ
ＴＡとプロテアーゼインヒビターカクテルセットＣｏｍ
ｐｌｅｔｅＴＭ（ベーリンガーマンハイム社製）とを含
有する２０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
４）に懸濁して、ポリトロンにてホモジェナイズした。
超遠心を行った後、沈殿を１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ、
１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、及び
ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭを含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に懸濁し、これを膜画分
とした。
２ＭｅＳＡＤＰとの結合実験 実施例５で作製したＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−
１５細胞を回収及び洗浄した後、５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤ
ＴＡとプロテアーゼインヒビターカクテルセットＣｏｍ
ｐｌｅｔｅＴＭ（ベーリンガーマンハイム社製）とを含
有する２０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
４）に懸濁して、ポリトロンにてホモジェナイズした。
超遠心を行った後、沈殿を１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ、
１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、及び
ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭを含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に懸濁し、これを膜画分
とした。
膜画分２０μｇに［３Ｈ］−２ＭｅＳＡＤＰ（Ｍｏｒ
ａｖｅｋ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を最終濃度
０．２５〜５０ｎｍｏｌ／Ｌになるように加え、１ｍｍ
ｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、
０．１％ＢＳＡ、及びＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭを含有する
５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）２
５０μＬ中で室温で１時間インキュベーションした後、
セルハーベスターにてグラスフィルターに回収した。グ
ラスフィルターにマイクロシンチレーターを加え、液体
シンチレーションカウンターで膜画分への総結合量を測
定した。さらに、前述の試験の最終濃度５０μｍｏｌ／
Ｌ−２ＭｅＳＡＤＰを加えることで、膜画分への非特異
的結合量を測定した。その結果、［３Ｈ］−２ＭｅＳＡ
ＤＰはＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞の膜画
分に特異的に結合することが分った。この結合のＳｃａ
ｔｃｈａｒｄ分析の結果、ＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ
６−１５細胞の膜画分に対する［３Ｈ］−２ＭｅＳＡＤ
Ｐの結合の解離定数はＫｄ＝０．２７ｎｍｏｌ／Ｌで、
最大結合はＢｍａｘ＝３．７ｐｍｏｌ／ｍｇであった。
一方、ＨＯＲＫ３タンパク質を発現していないホストの
Ｃ６−１５細胞の膜画分では特異的結合は観察されなか
った。
ａｖｅｋ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を最終濃度
０．２５〜５０ｎｍｏｌ／Ｌになるように加え、１ｍｍ
ｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、
０．１％ＢＳＡ、及びＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭを含有する
５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）２
５０μＬ中で室温で１時間インキュベーションした後、
セルハーベスターにてグラスフィルターに回収した。グ
ラスフィルターにマイクロシンチレーターを加え、液体
シンチレーションカウンターで膜画分への総結合量を測
定した。さらに、前述の試験の最終濃度５０μｍｏｌ／
Ｌ−２ＭｅＳＡＤＰを加えることで、膜画分への非特異
的結合量を測定した。その結果、［３Ｈ］−２ＭｅＳＡ
ＤＰはＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞の膜画
分に特異的に結合することが分った。この結合のＳｃａ
ｔｃｈａｒｄ分析の結果、ＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ
６−１５細胞の膜画分に対する［３Ｈ］−２ＭｅＳＡＤ
Ｐの結合の解離定数はＫｄ＝０．２７ｎｍｏｌ／Ｌで、
最大結合はＢｍａｘ＝３．７ｐｍｏｌ／ｍｇであった。
一方、ＨＯＲＫ３タンパク質を発現していないホストの
Ｃ６−１５細胞の膜画分では特異的結合は観察されなか
った。
次に、２ＭｅＳＡＭＰ又はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸの
影響を、実施例６で作製したＨＯＲＫ３タンパク質発現
Ｃ６−１５細胞の膜画分を用いて、［３Ｈ］−２ＭｅＳ
ＡＤＰの結合を阻害する活性を指標にして検討した。実
際には、ＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞膜画
分２０μｇに、２ＭｅＳＡＭＰ（１０−７〜１０−４ｍ
ｏｌ／Ｌ）又はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ（１０−１２〜
１０−６ｍｏｌ／Ｌ）と１ｎｍｏｌ／Ｌ［３Ｈ］−２Ｍ
ｅＳＡＤＰとを添加し、室温で２時間インキュベーショ
ンした後、セルハーベスターにてグラスフィルターに回
収した。グラスフィルターにマイクロシンチレーターを
加え、液体シンチレーションカウンターで放射活性を測
定した。また、同時に、前述の試験において化合物を添
加しないもの、及び最終濃度１０μｍｏｌ／Ｌ−２Ｍｅ
ＳＡＤＰを加えたものを、それぞれ、総結合量、及び非
特異的結合量として、放射活性を測定した。それぞれの
化合物の濃度依存曲線から、ＨＯＲＫ３タンパク質と２
ＭｅＳＡＤＰとの結合に対する２ＭｅＳＡＭＰ及びＡＲ
−Ｃ６９９３１ＭＸの阻害効果は、それぞれＩＣ５０＝
４．９μｍｏｌ／Ｌ、ＩＣ５０＝９．８ｎｍｏｌ／Ｌで
あった。
影響を、実施例６で作製したＨＯＲＫ３タンパク質発現
Ｃ６−１５細胞の膜画分を用いて、［３Ｈ］−２ＭｅＳ
ＡＤＰの結合を阻害する活性を指標にして検討した。実
際には、ＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞膜画
分２０μｇに、２ＭｅＳＡＭＰ（１０−７〜１０−４ｍ
ｏｌ／Ｌ）又はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ（１０−１２〜
１０−６ｍｏｌ／Ｌ）と１ｎｍｏｌ／Ｌ［３Ｈ］−２Ｍ
ｅＳＡＤＰとを添加し、室温で２時間インキュベーショ
ンした後、セルハーベスターにてグラスフィルターに回
収した。グラスフィルターにマイクロシンチレーターを
加え、液体シンチレーションカウンターで放射活性を測
定した。また、同時に、前述の試験において化合物を添
加しないもの、及び最終濃度１０μｍｏｌ／Ｌ−２Ｍｅ
ＳＡＤＰを加えたものを、それぞれ、総結合量、及び非
特異的結合量として、放射活性を測定した。それぞれの
化合物の濃度依存曲線から、ＨＯＲＫ３タンパク質と２
ＭｅＳＡＤＰとの結合に対する２ＭｅＳＡＭＰ及びＡＲ
−Ｃ６９９３１ＭＸの阻害効果は、それぞれＩＣ５０＝
４．９μｍｏｌ／Ｌ、ＩＣ５０＝９．８ｎｍｏｌ／Ｌで
あった。
前記実施例３の結果に併せて、更に、実施例４及び５
において、ＨＯＲＫ３タンパク質を発現するＣＨＯ細胞
及びＣ６−１５細胞におけるフォルスコリン刺激による
ｃＡＭＰ産生量が２ＭｅＳＡＤＰ及びＡＤＰによって抑
制されたことから、本ＡＤＰ受容体がＧｉに共役してい
ることが更に明確になった。また、実施例４及び５の結
果から、スクリーニングツール用ポリペプチドの１つで
あるＨＯＲＫ３タンパク質を発現するＣＨＯ細胞又はＣ
６−１５細胞の細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化を測定するこ
とで、アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング
が可能となった。また、実施例６に記載の方法で、ＨＯ
ＲＫ３タンパク質を発現するＣ６−１５細胞の膜画分へ
の２ＭｅＳＡＤＰの結合阻害を測定することで、リガン
ドのスクリーニングも可能である。
において、ＨＯＲＫ３タンパク質を発現するＣＨＯ細胞
及びＣ６−１５細胞におけるフォルスコリン刺激による
ｃＡＭＰ産生量が２ＭｅＳＡＤＰ及びＡＤＰによって抑
制されたことから、本ＡＤＰ受容体がＧｉに共役してい
ることが更に明確になった。また、実施例４及び５の結
果から、スクリーニングツール用ポリペプチドの１つで
あるＨＯＲＫ３タンパク質を発現するＣＨＯ細胞又はＣ
６−１５細胞の細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化を測定するこ
とで、アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング
が可能となった。また、実施例６に記載の方法で、ＨＯ
ＲＫ３タンパク質を発現するＣ６−１５細胞の膜画分へ
の２ＭｅＳＡＤＰの結合阻害を測定することで、リガン
ドのスクリーニングも可能である。
以上、実施例２〜６の結果より、ＨＯＲＫ３タンパク
質は、血小板に発現しているＧｉ共役型のＡＤＰ受容体
であることから、これまで存在が示唆されていた血小板
のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣの実体であると考えられる。
質は、血小板に発現しているＧｉ共役型のＡＤＰ受容体
であることから、これまで存在が示唆されていた血小板
のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣの実体であると考えられる。
実施例７：ヒト血小板凝集阻害活性の確認
健常人（成人，男子）より１／１０容クエン酸ナトリ
ウムにて採血を行ない、Ｄｅ Ｍａｒｃｏらの方法
（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７７，１２７２−１
２７７，１９８６）に従い、多血小板血漿（ＰＲＰ）を
調製した。ＰＲＰは、自動血球計数器（ＭＥＫ６２５
８；日本光電）を用いて、３×１０８／ｍＬに調製して
使用した。凝集惹起剤であるＡＤＰは、ＭＣメディカル
社の製品を使用した。実施例５でＨＯＲＫ３タンパク質
アンタゴニスト活性を示すことを確認した２ＭｅＳＡＭ
Ｐ又はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸを使用し、前記化合物を
溶解する溶媒としては、生理食塩水を用いた。
ウムにて採血を行ない、Ｄｅ Ｍａｒｃｏらの方法
（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７７，１２７２−１
２７７，１９８６）に従い、多血小板血漿（ＰＲＰ）を
調製した。ＰＲＰは、自動血球計数器（ＭＥＫ６２５
８；日本光電）を用いて、３×１０８／ｍＬに調製して
使用した。凝集惹起剤であるＡＤＰは、ＭＣメディカル
社の製品を使用した。実施例５でＨＯＲＫ３タンパク質
アンタゴニスト活性を示すことを確認した２ＭｅＳＡＭ
Ｐ又はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸを使用し、前記化合物を
溶解する溶媒としては、生理食塩水を用いた。
血小板凝集は、血小板凝集計（ＭＣＭヘマトレーサー
２１２；ＭＣメディカル）を用いて測定した。すなわ
ち、ＰＲＰ（８０μＬ）とサンプル（２ＭｅＳＡＭＰ又
はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ）又は溶媒（１０μＬ）と
を、３７℃で１分間インキュベートした後、ＡＤＰ（２
０〜２００μｍｏｌ／Ｌ）１０μＬを添加し、透過光の
変化を１０分間記録し、その最大凝集率から凝集阻害
（％）を算出した。
２１２；ＭＣメディカル）を用いて測定した。すなわ
ち、ＰＲＰ（８０μＬ）とサンプル（２ＭｅＳＡＭＰ又
はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ）又は溶媒（１０μＬ）と
を、３７℃で１分間インキュベートした後、ＡＤＰ（２
０〜２００μｍｏｌ／Ｌ）１０μＬを添加し、透過光の
変化を１０分間記録し、その最大凝集率から凝集阻害
（％）を算出した。
図１に、２ＭｅＳＡＭＰを用いた場合の結果を示し、
図２に、ＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸを用いた場合の結果を
示す。２ＭｅＳＡＭＰのデータ（図１）は、ボランティ
ア２名を用いた実験結果の「平均値」で表し、ＡＲ−Ｃ
６９９３１ＭＸのデータ（図２）は、ボランティア３名
を用いた実験結果の「平均値＋標準誤差」で表した。両
薬剤ともに、ＡＤＰ惹起血小板凝集を濃度依存的に阻害
し、その阻害強度は、惹起剤であるＡＤＰの濃度に依存
していた。
図２に、ＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸを用いた場合の結果を
示す。２ＭｅＳＡＭＰのデータ（図１）は、ボランティ
ア２名を用いた実験結果の「平均値」で表し、ＡＲ−Ｃ
６９９３１ＭＸのデータ（図２）は、ボランティア３名
を用いた実験結果の「平均値＋標準誤差」で表した。両
薬剤ともに、ＡＤＰ惹起血小板凝集を濃度依存的に阻害
し、その阻害強度は、惹起剤であるＡＤＰの濃度に依存
していた。
本実施例より、ＨＯＲＫ３タンパク質アンタゴニスト
が抗血小板作用を示すことが明確である。
が抗血小板作用を示すことが明確である。
産業上の利用可能性
血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ活性を阻害する物質
は、抗血小板作用を示し、血栓性弊害の治療を可能とす
る。
は、抗血小板作用を示し、血栓性弊害の治療を可能とす
る。
従って、本発明の抗血小板剤スクリーニングツールに
よれば、抗血小板剤として有用な血小板ＡＤＰ受容体Ｐ
２ＴＡＣアンタゴニストをスクリーニング及び評価する
ことができる。
よれば、抗血小板剤として有用な血小板ＡＤＰ受容体Ｐ
２ＴＡＣアンタゴニストをスクリーニング及び評価する
ことができる。
本発明のアンタゴニスト若しくはアゴニスト検出方法
を用い、又は本発明のリガンド検出方法とアンタゴニス
ト若しくはアゴニスト検出方法とを組み合わせて用いる
ことにより、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニ
ストを選択し、抗血小板剤として有用な物質をスクリー
ニングすることができる。
を用い、又は本発明のリガンド検出方法とアンタゴニス
ト若しくはアゴニスト検出方法とを組み合わせて用いる
ことにより、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニ
ストを選択し、抗血小板剤として有用な物質をスクリー
ニングすることができる。
次いで、前記スクリーニング方法で選択された物質を
有効成分とし、担体、賦形剤、及び／又はその他の添加
剤を用いて製剤化することにより、抗血小板用医薬組成
物を製造することができる。
有効成分とし、担体、賦形剤、及び／又はその他の添加
剤を用いて製剤化することにより、抗血小板用医薬組成
物を製造することができる。
また、本発明のリガンド、アンタゴニスト、又はアゴ
ニスト検出方法は、抗血小板剤として有用な物質をスク
リーニングする為のみでなく、抗血小板用医薬組成物の
品質規格の確認試験において、用いることも可能であ
る。
ニスト検出方法は、抗血小板剤として有用な物質をスク
リーニングする為のみでなく、抗血小板用医薬組成物の
品質規格の確認試験において、用いることも可能であ
る。
本発明のリガンド、アンタゴニスト又はアゴニスト検
出方法を用いて、試験化合物が血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２
ＴＡＣリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストであ
るか否かを検出し、次いで、前記アンタゴニスト又はリ
ガンドを製剤化することにより、抗血小板用医薬組成物
を製造することができる。
出方法を用いて、試験化合物が血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２
ＴＡＣリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストであ
るか否かを検出し、次いで、前記アンタゴニスト又はリ
ガンドを製剤化することにより、抗血小板用医薬組成物
を製造することができる。
配列表フリーテキスト
配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉ
ｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体
的には、配列表の配列番号３又は配列番号４の配列で表
される塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドは、人工
的に合成したプライマー配列である。
ｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体
的には、配列表の配列番号３又は配列番号４の配列で表
される塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドは、人工
的に合成したプライマー配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業
者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｇ０１Ｎ 33/50 Ａ６１Ｋ 45/00
33/566 Ａ６１Ｐ 7/02
// Ａ６１Ｋ 45/00 9/00
Ａ６１Ｐ 7/02 9/10 １０１
9/00 29/00
9/10 １０１ 35/04
29/00 37/00
35/04 37/06
37/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
37/06 5/00 Ｂ
(72)発明者 齋藤 哲
茨城県つくば市御幸が丘21 山之内製薬
株式会社内
(72)発明者 大石 崇秀
茨城県つくば市御幸が丘21 山之内製薬
株式会社内
(72)発明者 曽我 孝利
茨城県つくば市御幸が丘21 山之内製薬
株式会社内
(56)参考文献 国際公開98／050549（ＷＯ，Ａ１)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
C07K 14/00 - 14/825
G01N 33/15
G01N 33/50
A61K 45/00
A61P 7/02
Claims (4)
- 【請求項１】 （１）（ｉ）配列番号２で表されるアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド、（ii）配列番号２で表
されるアミノ酸配列の１〜１０個のアミノ酸が欠失、置
換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、し
かも、ＡＤＰと結合し、Ｇｉに共役することにより、ア
デニル酸シクラーゼの活性を抑制する活性を有するポリ
ペプチド、又は、（iii）配列番号２で表されるアミノ
酸配列との相同性が９５％以上であるアミノ酸配列を有
し、しかも、ＡＤＰと結合し、Ｇｉに共役することによ
り、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制する活性を有す
るポリペプチド、 前記ポリペプチドを含む細胞膜画分、あるいは、 前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクタ
ーで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形
質転換細胞と、 試験化合物とを、 ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ標識リガンド存在下で、接触さ
せる工程、並びに （２）前記ポリペプチド、細胞膜画分、又は形質転換細
胞への標識リガンドの結合量の変化を分析する工程 を含む、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド
であるか否かを検出する方法。 - 【請求項２】 （１）Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番
号１１で表されるアミノ酸配列であり、しかも、ホスホ
リパーゼＣ活性促進性Ｇタンパク質のホスホリパーゼＣ
活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体
共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧ
タンパク質キメラを共発現している、（ｉ）配列番号２
で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ii）
配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜１０個のアミ
ノ酸が欠失、置換、及び／若しくは付加されたアミノ酸
配列を有し、しかも、ＡＤＰと結合し、Ｇｉに共役する
ことにより、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制する活
性を有するポリペプチド、又は、（iii）配列番号２で
表されるアミノ酸配列との相同性が９５％以上であるア
ミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰと結合し、Ｇｉに共
役することにより、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制
する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含
む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発
現している形質転換細胞と、試験化合物とを接触させる
工程、及び （２）前記形質転換細胞内におけるＣａ２＋濃度の変化
を分析する工程 を含む、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴ
ニスト又はアゴニストであるか否かを検出する方法。 - 【請求項３】 （１）（ｉ）配列番号２で表されるアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド、（ii）配列番号２で表
されるアミノ酸配列の１〜１０個のアミノ酸が欠失、置
換、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、し
かも、ＡＤＰと結合し、Ｇｉに共役することにより、ア
デニル酸シクラーゼの活性を抑制する活性を有するポリ
ペプチド、又は、（iii）配列番号２で表されるアミノ
酸配列との相同性が９５％以上であるアミノ酸配列を有
し、しかも、ＡＤＰと結合し、Ｇｉに共役することによ
り、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制する活性を有す
るポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクター
で形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質
転換細胞と試験化合物とを、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ
ＡＣのアゴニストの共存下において、接触させる工程、
並びに、 （２）前記形質転換細胞内におけるｃＡＭＰ濃度の変化
を分析する工程 を含む、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴ
ニスト又はアゴニストであるか否かを検出する方法。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか一項に記載の方
法、あるいは、これらを組み合わせることによる、ＡＤ
Ｐ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アンタゴニスト、又はア
ゴニストであるか否かを検出する工程、及び ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニストを選択する工程 を含む、抗血小板剤をスクリーニングする方法。
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000334721 | 2000-11-01 | ||
| JP2000334721 | 2000-11-01 | ||
| JP2000-334721 | 2000-11-01 | ||
| JP2001003577 | 2001-01-11 | ||
| JP2001-3577 | 2001-01-11 | ||
| JP2001003577 | 2001-01-11 | ||
| PCT/JP2001/009534 WO2002036631A1 (fr) | 2000-11-01 | 2001-10-31 | Procede de criblage d'anti-plaquettes |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003353705A Division JP2004121254A (ja) | 2000-11-01 | 2003-10-14 | 抗血小板剤スクリーニング方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=26603288
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|---|---|---|---|
| JP2002539389A Expired - Fee Related JP3519078B2 (ja) | 2000-11-01 | 2001-10-31 | 抗血小板剤スクリーニング方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP1331228B1 (ja) |
| JP (1) | JP3519078B2 (ja) |
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| AU (1) | AU2002210982A1 (ja) |
| DE (1) | DE60127435T2 (ja) |
| ES (1) | ES2282304T3 (ja) |
| WO (1) | WO2002036631A1 (ja) |
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| EP1411134A1 (en) * | 2002-10-15 | 2004-04-21 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Association of the H2 haplotype of the P2Y12 receptor with an increased risk for thrombosis and peripheral arterial disease |
| EP1411130A1 (en) * | 2002-10-15 | 2004-04-21 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Association of the H2 haplotype of the P2Y12 receptor with an increased risk for thrombosis and peripheral arterial disease |
| US20070243632A1 (en) | 2003-07-08 | 2007-10-18 | Coller Barry S | Methods for measuring platelet reactivity of patients that have received drug eluting stents |
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| WO2005076007A2 (en) * | 2004-02-03 | 2005-08-18 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostics and therapeutics for diseases associated with g protein-coupled receptor p2y12 (p2y12) |
| EP1812429A4 (en) * | 2004-09-29 | 2010-07-21 | Portola Pharm Inc | SUBSTITUTED 2H-1,3-BENZOXAZIN-4 (3H) -ONE |
| TWI391378B (zh) | 2006-03-16 | 2013-04-01 | Astellas Pharma Inc | 喹啉酮衍生物或其製藥學上可被容許之鹽 |
| DE102006020386A1 (de) * | 2006-04-28 | 2007-10-31 | Dade Behring Marburg Gmbh | Verfahren zur Bestimmung der Thrombozytenfunktion unter Flussbedingungen |
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| KR20100017576A (ko) * | 2007-05-03 | 2010-02-16 | 아큐메트릭스, 인크. | 트롬빈 수용체 길항제에 의한 혈소판 응집 억제의 측정 방법 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| EP1123391A2 (en) * | 1998-09-01 | 2001-08-16 | BASF Aktiengesellschaft | Methods for improving the function of heterologous g protein-coupled receptors |
| NZ510712A (en) * | 1998-10-13 | 2004-11-26 | Arena Pharm Inc | Non-endogenous, constitutively activated human G protein-coupled receptors |
| WO2000028028A1 (en) | 1998-11-06 | 2000-05-18 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | G-protein coupled receptors, homologous to ebv-induced gpcr 2 (ebi-2). methods to seek for ligands thereof |
| KR100926208B1 (ko) | 1998-11-20 | 2009-11-09 | 아레나 파마슈티칼스, 인크. | 사람의 오르판 ｇ 단백질 커플링 수용체 |
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| US6689866B1 (en) | 1999-03-09 | 2004-02-10 | Curagen Corporation | Polynucleotides and proteins encoded thereby |
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