JPWO2002036631A1 - 抗血小板剤スクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質、機能的等価改変体、又は相同タンパク質である抗血小板剤スクリーニングツール、及び前記の各種タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞である抗血小板剤スクリーニングツールを開示する。また、前記抗血小板剤スクリーニングツールを用いるＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド又はアンタゴニスト若しくはアゴニストの検出方法、及び前記検出方法による抗血小板剤のスクリーニング方法を開示する。
Description
技術分野
本発明は、抗血小板剤スクリーニング方法に関する。
背景技術
血小板は、ドンネ（Ｄｏｎｎｅ）によって１８４２年に発見［Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ｐａｒｉｓ），１４，３３６−３６８，１８４２］されて以来、長い間、止血に必要な血液中の１成分として扱われてきた。今日では血小板は単に止血機構の主役を演ずるだけでなく、臨床的に注目される動脈硬化の成立、血栓性疾患を含む循環器疾患、癌転移、炎症、移植後の拒絶反応、更には、免疫反応への関与など、多機能性を示すことが明らかにされている。
現在、血栓性疾患及び虚血性疾患に対して、薬剤又は物理的方法によって血行の再開を図る治療が行なわれている。しかしながら、最近、血行再建が行なわれた後に、内皮細胞を含む血管組織の破綻、あるいは、薬剤そのものによる線溶・凝固バランスの崩壊等で、血小板の活性化、粘着、及び／又は凝集が亢進する現象が発見され、臨床的にも問題になっている。例えば、ｔ−ＰＡ等を用いた血栓溶解療法により再疎通が得られた後、線溶能及び／又は凝固能が活性化され、全身の凝固・線溶バランスが崩壊することが明らかになってきた。臨床上は、再閉塞をもたらし、治療上大きな問題となっている（Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１２，６１６−６２３，１９８８）。
一方、狭心症若しくは心筋梗塞などの冠動脈狭窄、又は大動脈狭窄を基盤とした疾患の治療において、ＰＴＣＡ（Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｔｒａｎｓｌｕｍｉｎａｌ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）療法が急速に普及し、一定の成果を挙げている。しかし、この療法は、内皮細胞を含む血管組織を傷害し、急性冠閉塞、更には、３割近くの治療例で発現する再狭窄が大きな問題となっている。
このような血行再建療法後の種々の血栓性弊害（再閉塞等）には、血小板が重要な役割を果たしている。従って、これらの血栓性弊害を予防・治療する薬剤として、抗血小板剤が期待されている。
ところで、血小板の活性化、粘着、及び凝集を惹起又は亢進する重要な因子として、アデノシン二リン酸（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ５’−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＡＤＰ）が知られている。ＡＤＰは、コラーゲンやトロンビン等で活性化された血小板から、あるいは、血行再建等により傷ついた血球、血管内皮細胞、又は臓器から放出される。ＡＤＰは、血小板膜に存在するＧタンパク質共役型のＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔを介して、血小板を活性化すると言われている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３３６，５１３−５２３，１９９８）。
血小板ＡＤＰ受容体としては、Ｇタンパク質の１種であるＧｑに共役してホスホリパーゼＣ（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ；ＰＬＣ）を介して細胞内Ｃａ２＋濃度を上げるタイプの血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＰＬＣと、Ｇタンパク質の１種であるＧｉに共役してアデニル酸シクラーゼ（Ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ；ＡＣ）の活性を抑制する血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣとの存在が示唆されていた。現在、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＰＬＣは、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２Ｙ１と呼ばれる受容体であることが同定されているが、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣは、これまでその実体が同定されていなかった（Ｋｕｎａｐｕｌｉ，Ｓ．Ｐ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１９，３９１−３９４，１９９８）。
抗血小板剤として利用されているチクロピジン（Ｔｉｃｌｏｐｉｄｉｎｅ）やクロピドグレル（Ｃｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌ）は、体内での代謝物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣを阻害することで効果をもたらしていると考えられている（Ｓａｖｉ，Ｐ．Ｊ．，Ｐｈａｒｍａｃｌｏ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２６９，７７２−７７７，１９９４）。また、生体内のＡＤＰ受容体拮抗物質であるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の誘導体として合成されたＡＲＬ６７０８５は、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対する拮抗作用によりＡＤＰによる血小板凝集の抑制作用を有しており、血栓症モデルにおいてその有効性が示されている（Ｍｉｌｌｓ，Ｄ．Ｃ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．，７６，８３５−８５６，１９９６；及びＨｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｒ．Ｇ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１６，１７９−１８１，１９９５）。更に、Ａｐ４Ａ［Ｐ１，Ｐ４−ｄｉ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ−５’）ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ］の誘導体も、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対する拮抗作用によりＡＤＰによる血小板凝集の抑制作用を有しており、血栓症モデルにおいてその有効性が示されている（Ｋｉｍ，Ｂ．Ｋ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，２３７０−２３７３，１９９２）。
以上の知見から、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対する拮抗薬は、強力な抗血小板剤となることが期待される。しかし、チクロピジンやクロピドグレルは、抗血栓作用が弱く、しかも、副作用が強い等の問題点を抱えており、また、ＡＴＰ類縁体であるＡＲＬ６７０８５若しくはその誘導体、又はＡｐ４Ａの誘導体などについても、ＡＤＰ受容体拮抗薬として研究が進められているが、全てヌクレオチドの誘導体であり、経口活性が充分でなく、しかも、血小板凝集抑制活性が弱いなどの問題を抱えており、強力で経口活性を有するＡＤＰ受容体拮抗薬が熱望されている（ＣＡＰＲＩＥ ＳＴＥＥＲＩＮＧ ＣＯＭＭＩＴＴＥＥ，Ｌａｎｃｅｔ，３４８，１３２９−１３３９，１９９６）。
しかしながら、これまで、血小板に存在するＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質は、同定されておらず、簡便な化合物スクリーニング系の構築が困難であったため、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ拮抗薬の開発は進展していなかった。
なお、本発明で用いることのできるヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質と同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、及び前記ＤＮＡがコードする推定アミノ酸配列については、種々の報告（ＷＯ００／２２１３１号、ＷＯ００／３１２５８号、ＷＯ００／２８０２８号、及びＷＯ９８／５０５４９号各パンフレット）があるが、いずれもリガンドが解明されておらず、血小板に存在するＡＤＰ受容体であるとの記載もない。
発明の開示
従って、本発明の課題は、抗血小板剤として有用なアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）受容体Ｐ２ＴＡＣ拮抗薬を得るための簡便なスクリーニング系及び新たな抗血小板剤を提供することにある。
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、Ｐ２ＴＡＣ受容体をコードする核酸（具体的にはＨＯＲＫ３遺伝子）を単離することに成功し、塩基配列及び推定アミノ酸配列を決定した。次に、前記受容体をコードする核酸を含むベクター、及び前記ベクターを含む宿主細胞を順次作成し、前記宿主細胞を用いてＰ２ＴＡＣ受容体を発現させることにより、新規な組換えＰ２ＴＡＣ受容体の生産を可能にし、前記受容体がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ活性を有することから、前記受容体及び前記受容体を発現する細胞が抗血小板剤スクリーニングツールとなることを確認した。また、前記受容体又は前記受容体を発現する細胞を用い、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出する方法、及び前記検出方法を用いた抗血小板剤のスクリーニング方法を確立した。更に、抗血小板作用を示す物質として知られている化合物（具体的には、２ＭｅＳＡＭＰ又はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ）が、前記検出方法にて前記受容体のアンタゴニスト活性を示すことを確認し、前記受容体のアンタゴニストが確かに抗血小板剤として有用であることを示した。そして、前記検出工程を含む、抗血小板用医薬組成物の製造方法を確立し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、
［１］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質と称することがある）、又は（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰと結合し、Ｇｉに共役することにより、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制する活性（以下、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ活性と称する）を有するポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）である、抗血小板剤スクリーニングツール；
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰと結合し、Ｇｉに共役することにより、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制する活性を有するポリペプチド（以下、相同タンパク質と称する）である、抗血小板剤スクリーニングツール（以下、［１］又は［２］記載の抗血小板剤スクリーニングツールを、総称して、ポリペプチド型抗血小板剤スクリーニングツールと称する）；
［３］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（すなわち、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質）、又は（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰと結合し、Ｇｉに共役することにより、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制する活性を有するポリペプチド（すなわち、機能的等価改変体）をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞である、抗血小板剤スクリーニングツール；
［４］配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰと結合し、Ｇｉに共役することにより、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制する活性を有するポリペプチド（すなわち、相同タンパク質）をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞である、抗血小板剤スクリーニングツール（以下、［３］又は［４］記載の抗血小板剤スクリーニングツールを、総称して、形質転換細胞型抗血小板剤スクリーニングツールと称する）；
［５］［１］若しくは［２］記載のポリペプチド（すなわち、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質、機能的等価改変体、又は相同タンパク質）、前記ポリペプチドを含む細胞膜画分、又は［３］若しくは［４］記載の形質転換細胞と、試験化合物とを、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ標識リガンド存在下で、接触させる工程、及び
前記ポリペプチド、細胞膜画分、又は形質転換細胞への標識リガンドの結合量の変化を分析する工程
を含む、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンドであるか否かを検出する方法（以下、リガンド検出方法と称する）；
［６］Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１１で表されるアミノ酸配列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇタンパク貿のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧタンパク質キメラを共発現している［３］又は［４］記載の形質転換細胞と、試験化合物とを接触させる工程、及び
前記形質転換細胞内におけるＣａ２＋濃度の変化を分析する工程
を含む、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する方法（以下、Ｃａ２＋型検出方法と称する）；
［７］［３］又は［４］記載の形質転換細胞と試験化合物とを、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニストの共存下において、接触させる工程、及び
前記形質転換細胞内におけるｃＡＭＰ濃度の変化を分析する工程
を含む、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する方法（以下、ｃＡＭＰ型検出方法と称する）；
［８］前記リガンド検出方法、Ｃａ２＋型検出方法、又はｃＡＭＰ型検出方法、あるいは、これらを組み合わせることにより、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出する工程、及び
ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニストを選択する工程
を含む、抗血小板剤をスクリーニングする方法；並びに
［９］前記リガンド検出方法、Ｃａ２＋型検出方法、又はｃＡＭＰ型検出方法、あるいは、これらを組み合わせることにより、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出する工程、及び
製剤化工程
を含む、抗血小板用医薬組成物の製造方法
に関する。
前記「Ｇｉ」は、受容体と共役して細胞内へのシグナル伝達・増幅因子として機能するＧタンパク質のサブファミリーの１つであって、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制するＧタンパク質である。アデニル酸シクラーゼの活性が抑制されると、例えば、細胞内ｃＡＭＰ濃度が低下する。
また、前記「ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇタンパク質」は、受容体と共役して細胞内へのシグナル伝達・増幅因子として機能するＧタンパク質のサブファミリーの１つであって、ホスホリパーゼＣの活性を促進するＧタンパク質である。ホスホリパーゼＣの活性が促進されると、例えば、細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇する。ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇタンパク質としては、例えば、Ｇｑを挙げることができる。
更に、前記「ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ」は、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣを有するポリペプチドを意味する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）抗血小板剤スクリーニングツール
本発明の抗血小板剤スクリーニングツールには、ポリペプチド型抗血小板剤スクリーニングツールと、形質転換細胞型抗血小板剤スクリーニングツールとが含まれる。
１）ポリペプチド型抗血小板剤スクリーニングツール
本発明のポリペプチド型抗血小板剤スクリーニングツールには、
（ｉ）ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質、すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、抗血小板剤スクリーニングツール；
（ｉｉ）機能的等価改変体、すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ活性を有するポリペプチドである、抗血小板剤スクリーニングツール；及び
（ｉｉｉ）相同タンパク質、すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ活性を有するポリペプチドである、抗血小板剤スクリーニングツール
が含まれる。
本発明のポリペプチド型抗血小板剤スクリーニングツールとして用いることのできる、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、３４２個のアミノ酸残基からなるヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質である。ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質は、血小板に存在することが示唆されていたものの、本発明者が今回始めてその機能を解明するまで、その実体は同定されていなかった。
そして、本願の優先日後の文献で、初めて、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが血小板ＡＤＰ受容体であることが公表された［Ｎａｔｕｒｅ，４０９，１１ Ｊａｎｕａｒｙ ２００１，２０２−２０７；Ｊ．Ｂ．Ｃ．，２７６，（１１），Ｍａｒｃｈ １６，８６０８−８６１５，２００１；ＷＯ０１／４６４５４号パンフレット］。なお、ＷＯ０１／４６４５４号パンフレットの優先権の基礎となる特許出願では、ラットのＡＤＰ受容体遺伝子をクローニングし、配列決定しているものの、ヒトのＡＤＰ受容体遺伝子については、部分配列を含むクローンを取得し、配列決定しているにすぎない。従って、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質及びこれをコードするポリヌクレオチドを取得し、その機能を初めて解明し、これらを用いる抗血小板剤をスクリーニング方法の発明に関する特許出願を行なったのは、本願出願人の方が早い。
本発明のポリペプチド型抗血小板剤スクリーニングツールとして用いることのできる機能的等価改変体は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、それぞれ、１又は複数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ活性を有するポリペプチドである限り、特に限定されるものではなく、その起源もヒトに限定されない。
例えば、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのヒトにおける変異体が含まれるだけでなく、ヒト以外の生物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）由来のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ又はその変異体が含まれる。更には、それらの天然タンパク質（すなわち、ヒト由来の変異体、又はヒト以外の生物由来のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ若しくはその変異体）又はヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣを元にして遺伝子工学的に人為的に改変したタンパク質などが含まれる。なお、本明細書において「変異体」（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とは、同一種内の同一タンパク質にみられる個体差、あるいは、数種間の相同タンパク質にみられる差異を意味する。
ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのヒトにおける変異体、又はヒト以外の生物由来のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ若しくはその変異体は、当業者であれば、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列）の情報を基にして、取得することができる。なお、遺伝子組換え技術については、特に断りがない場合、公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２等）に従って実施することが可能である。
例えば、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ遺伝子の塩基配列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブを設計し、前記プライマー又はプローブと、目的とする生物［例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）］由来の試料（例えば、総ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ画分、ｃＤＮＡライブラリー、又はファージライブラリー）とを用いてＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション法を実施することにより、タンパク質の遺伝子を取得し、その遺伝子を適当な発現系を用いて発現させ、発現したタンパク質が、例えば、実施例３又は実施例４に記載の方法により、ＡＤＰと結合し、Ｇｉに共役することによってアデニル酸シクラーゼの活性を抑制することを確認することにより、所望のタンパク質を取得することができる。
また、前記の遺伝子工学的に人為的に改変したタンパク質は、常法、例えば、部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）により、タンパク質の遺伝子を取得し、その遺伝子を適当な発現系を用いて発現させ、発現したタンパク質が、例えば、実施例３又は実施例４に記載の方法により、ＡＤＰと結合し、Ｇｉに共役することによってアデニル酸シクラーゼの活性を抑制することを確認することにより、所望のタンパク質を取得することができる。
本発明のポリペプチド型抗血小板剤スクリーニングツールとして用いることのできる相同タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ活性を有するポリペプチドである限り、特に限定されるものではないが、配列番号２で表されるアミノ酸配列に関して、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有することができる。
なお、本明細書における前記「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｎｇｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，１９９０）検索により得られた値を意味し、アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用いて決定することができる。具体的には、ＢＬＡＳＴパッケージ（ｓｇｉ３２ｂｉｔ版，バージョン２．０．１２；ＮＣＢＩより入手）のｂｌ２ｓｅｑプログラム（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ及びＴｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７４，２４７−２５０，１９９９）を用い、デフォルトパラメーターに従って算出することができる。ペアワイズ・アラインメント・パラメーターとして、プログラム名「ｂｌａｓｔｐ」を使用し、Ｇａｐ挿入Ｃｏｓｔ値を「０」で、Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値を「０」で、Ｑｕｅｒｙ配列のフィルターとして「ＳＥＧ」を、Ｍａｔｒｉｘとして「ＢＬＯＳＵＭ６２」をそれぞれ使用する。
本発明のポリペプチド型抗血小板剤スクリーニングツールとして用いることのできる各種ポリペプチド（すなわち、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質、機能的等価改変体、及び相同タンパク質；以下、スクリーニングツール用ポリペプチドと称する）は、種々の公知の方法によって得ることができ、例えば、目的タンパク質をコードする遺伝子を用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。より具体的には、後述する形質転換細胞（すなわち、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞）を、スクリーニングツール用ポリペプチドの発現が可能な条件下で培養し、受容体タンパク質の分離及び精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から目的タンパク質を分離及び精製することにより調製することができる。
スクリーニングツール用ポリペプチドを調製する際に、それをコードする遺伝子を取得する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質を調製する場合には、それをコードする遺伝子として、例えば、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡを用いることができる。なお、所望アミノ酸に対するコドンはそれ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば、利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従って決定することができる（Ｃｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，ｒ４３−ｒ７４，１９８１）。
配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡは、例えば、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を結合することにより取得することもできるし、あるいは、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質の産生能力を有する細胞又は組織に由来するｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、配列番号１で表される塩基配列に基づいて設計した適当なプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１，１９８８）により、取得することもできる。前記のヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質の産生能力を有する細胞又は組織としては、例えば、ヒト血小板又はヒト脳などを挙げることができる。また、前記プライマーセットとしては、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせを挙げることができる。
スクリーニングツール用ポリペプチドの調製において使用することのできる分離及び精製方法は、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順で実施することができる。例えば、スクリーニングツール用ポリペプチドを表面に発現した細胞を培養し、これらをバッファーに懸濁した後、ホモジナイズし、遠心分離することにより、スクリーニングツール用ポリペプチドを含む細胞膜画分を得ることができる。得られた細胞膜画分を可溶化した後、通常のタンパク質沈殿剤による処理、限外濾過、各種液体クロマトグラフィー［例えば、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等］、若しくは透析法、又はこれらの組合せ等により、スクリーニングツール用ポリペプチドを精製することができる。なお、細胞膜画分を可溶化する際には、できるだけ緩和な可溶化剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、又はジキトニン等）を用いることにより、可溶化後も受容体の特性を保持することができる。
スクリーニングツール用ポリペプチドを調製する際には、所望に応じて、スクリーニングツール用ポリペプチドと適当なマーカー配列とをインフレームで融合して発現させることで、前記ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、又は精製等を容易に行なうことができる。前記マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。また、マーカー配列とスクリーニングツール用ポリペプチドとの間に、プロテアーゼ（例えば、エンテロキナーゼ、ファクターＸａ、又はトロンビンなど）が認識する特異的な配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することが可能である。例えば、ムスカリンアセチルコリン受容体とヘキサ−ヒスチジン・タグとをトロンビン認識配列で連結した報告がある（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．Ｋ．及びＨａｇａ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２０，１２３２−１２３８，１９９６）。
２）形質転換細胞型抗血小板剤スクリーニングツール
本発明の形質転換細胞型抗血小板剤スクリーニングツールには、
（ｉ）ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞である、抗血小板剤スクリーニングツール；
（ｉｉ）機能的等価改変体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞である、抗血小板剤スクリーニングツール；及び
（ｉｉｉ）相同タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞である、抗血小板剤スクリーニングツール
が含まれる。
本発明の形質転換細胞型抗血小板剤スクリーニングツールとして用いることのできる各種形質転換細胞（以下、スクリーニングツール用形質転換細胞と称する）を作成するために使用することのできる宿主細胞は、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現することができる限り、特に限定されるものではなく、例えば、通常使用される公知の微生物、例えば、大腸菌又は酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、あるいは、公知の培養細胞、例えば、脊椎動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、又はＣＯＳ細胞）又は昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）を挙げることができる。前記脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，Ｃｅｌｌ，２３，１７５−１８２，１９８１）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．及びＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、あるいは、前記ＨＥＫ２９３細胞にエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を挙げることができる。
スクリーニングツール用形質転換細胞を作成するために使用することのできる発現ベクターは、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現することができる限り、特に限定されるものではなく、使用する宿主細胞の種類に応じて、適宜選択することができる。
例えば、脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用することができ、更に必要により、複製起点を有していることができる。前記発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４−８６４，１９８１）、ヒトの延長因子プロモーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はサイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができる。
より詳細には、宿主細胞としてＣＯＳ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、更に、転写プロモーター、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、ｐＭＥ１８Ｓ（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．及びＴａｋｅｂｅ，Ｙ．，Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７−３２，１９９０）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８４２，１９８７）等を挙げることができる。
前記発現ベクターは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．及びＭａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１，１２９５−１３０８，１９８３）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｄ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４５７，１９７３）、カチオン性リポソーム試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）を用いた方法、あるいは、電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１，８４１−８４５，１９８２）等により、ＣＯＳ細胞に取り込ませることができる。
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現することのできるベクター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）又はｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１，１９８２）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、スクリーニングツール用ポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
更に、宿主細胞として２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、エプスタイン・バーウイルスの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己増殖が可能なｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などを用いることができる。
スクリーニングツール用形質転換細胞は、常法に従って培養することができ、前記培養により細胞内又は細胞表面にスクリーニングツール用ポリペプチドが生産される。前記培養に用いることのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択することができる。例えば、ＣＯＳ細胞の場合には、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地又はダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応じて牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加した培地を使用することができる。また、２９３−ＥＢＮＡ細胞の場合には、牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えた培地を使用することができる。
スクリーニングツール用形質転換細胞は、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現している限り、特に限定されるものではない。スクリーニングツール用形質転換細胞は、スクリーニングツール用ポリペプチドに加え、Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１１で表されるアミノ酸配列（Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）であるＧタンパク質を発現していることが好ましい。配列番号１１で表されるアミノ酸配列は、ＧｉのＣ末端の５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、以下、「Ｃ末端のアミノ酸配列が配列番号１１で表されるアミノ酸配列であるＧタンパク質」を「Ｃ末端Ｇｉ型Ｇタンパク質」と称する。
前記Ｃ末端Ｇｉ型Ｇタンパク質としては、例えば、（１）Ｇｉ、又は（２）Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１１で表されるアミノ酸配列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇタンパク質（例えば、Ｇｑ）のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧタンパク質キメラを挙げることができる。以下、ＧｑのホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧタンパク質キメラを、Ｇｑｉと称する。
スクリーニングツール用ポリペプチドは、ＧｉのＣ末端の５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（すなわち、配列番号１１で表されるアミノ酸配列）を認識して、Ｇｉと結合する。従って、スクリーニングツール用ポリペプチドは、Ｇｉのみならず、Ｇｑｉとも結合することができる。スクリーニングツール用形質転換細胞において、スクリーニングツール用ポリペプチドとＣ末端Ｇｉ型Ｇタンパク質とが発現されると、これらのポリペプチドは細胞内で結合することができる。
前記Ｇｑｉにおける「ＧｑのホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチド」は、Ｇｑと共役する血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＰＬＣとの結合に必要なＣ末端アミノ酸配列を含まず、しかも、ホスホリパーゼＣの活性を促進する活性を有する限り、特に限定されるものではないが、例えば、Ｃ末端の５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を欠失したＧｑのＮ末端側部分ポリペプチドを挙げることができる。
前記Ｇｑｉにおける「Ｇｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチド」は、ＧｉのＣ末端の５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、しかも、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制する活性を有しない限り、特に限定されるものではないが、例えば、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるＧｉのＣ末端側部分ポリペプチドを挙げることができる。
（２）ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニスト検出方法
前記スクリーニングツール用ポリペプチド、又はスクリーニングツール用形質転換細胞を検出ツールに用いて、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出することができる。
本発明による、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出する方法には、
１）血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するリガンドであるか否かを検出する方法（すなわち、リガンド検出方法）；
２）形質転換細胞内におけるＣａ２＋濃度の変動を指標として、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する方法（すなわち、Ｃａ２＋型検出方法）；
３）形質転換細胞内におけるｃＡＭＰ量の変動を指標として、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する方法（すなわち、ｃＡＭＰ型検出方法）；及び
４）ＧＴＰγＳ結合法を利用する血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する方法（以下、ＧＴＰγＳ結合型検出方法と称する）
が含まれる。これらの検出方法について、順次説明する。
１）リガンド検出方法
本発明のリガンド検出方法は、（ｉ）ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質、機能的等価改変体、又は相同タンパク質（以下、検出ツール用ポリペプチドと称する）、検出ツール用ポリペプチドを含む細胞膜画分、あるいは、検出ツール用ポリペプチドを発現させた形質転換細胞（以下、検出ツール用ポリペプチド、前記細胞膜画分、及び前記形質転換細胞を総称して、リガンド検出ツールと称する）と、（ｉｉ）標識リガンドとを用いる限り、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により実施することができる。
まず、リガンド検出ツールを調製する。アッセイ条件（例えば、使用する緩衝液の種類及び濃度、緩衝液に添加するイオンの種類及び濃度、並びにアッセイ系のｐＨ）を最適化し、最適化したバッファー中で、リガンド検出ツールと、標識リガンドとを、試験化合物と共に一定時間インキュベーションする。前記標識リガンドとしては、例えば、［３Ｈ］２−メチルチオ−ＡＤＰ（２ＭｅＳＡＤＰ）を用いることができる。反応後、反応液をガラスフィルター等で濾過し、適量のバッファーで洗浄した後、フィルターに残存する放射活性を液体シンチレーションカウンター等で測定する。得られた放射活性リガンドの結合阻害を指標として、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するリガンドであるか否かを検出することができる。すなわち、試験化合物不在下の場合のフィルター残存放射活性よりも、試験化合物存在下の場合のフィルター残存放射活性が低下した場合には、前記試験化合物は、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するリガンドであると判定することができる。例えば、実施例６に記載の条件で行なうことができる。
２）Ｃａ２＋型検出方法
本発明のＣａ２＋型検出方法は、形質転換細胞として、（ｉ）検出ツール用ポリペプチドと、（ｉｉ）Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１１で表されるアミノ酸配列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇタンパク質のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧタンパク質キメラ（例えば、Ｇｑｉ）とを共発現している形質転換細胞（以下、Ｃａ２＋型検出用形質転換細胞と称する）を使用する。なお、前記形質転換細胞は、形質転換する前の宿主細胞が、ＡＤＰを作用させても細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇しない細胞であることが好ましい。このような細胞としては、例えば、ラットグリオーマ細胞株の一種であるＣ６−１５（Ｃｈａｎｇｅ，Ｋ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２６１５２−２６１５８，１９９５）を挙げることができる。
本発明のＣａ２＋型検出方法においてアゴニストであるか否かを検出する場合には、Ｃａ２＋型検出用形質転換細胞と試験化合物とを接触させ、前記Ｃａ２＋型検出用形質転換細胞内のＣａ２＋濃度の変化を、直接的又は間接的に分析（すなわち、測定又は検出）する。Ｃａ２＋濃度の変化は、例えば、カルシウム結合性蛍光試薬（例えば、ｆｕｒａ２又はｆｌｕｏ３等）を用いて、直接的にＣａ２＋濃度の変化を分析することもできるし、あるいは、Ｃａ２＋濃度に依存して転写量が調節される遺伝子［例えば、ルシフェラーゼの遺伝子の上流にアクチベータープロテイン１（ＡＰ１）応答配列を挿入した遺伝子］の転写活性を分析することにより、間接的にＣａ２＋濃度の変化を分析することもできる。
Ｃａ２＋型検出用形質転換細胞と試験化合物とを接触させた場合に、Ｃａ２＋型検出用形質転換細胞内のＣａ２＋濃度が上昇すれば、前記試験化合物は、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアゴニストであると判定することができる。なお、コントロールとして、検出ツール用ポリペプチドとＧｑｉとを共発現しているＣａ２＋型検出用形質転換細胞の代わりに、検出ツール用ポリペプチドが発現されておらず、しかも、Ｇｑｉが発現しているコントロール用形質転換細胞、あるいは、形質転換前の宿主細胞を用いて同様の操作を行ない、前記試験化合物により前記コントロール用形質転換細胞又は前記宿主細胞内のＣａ２＋濃度が上昇しないことを確認することが好ましい。
本発明のＣａ２＋型検出方法においてアンタゴニストであるか否かを検出する場合には、Ｃａ２＋型検出用形質転換細胞と試験化合物とを、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニスト（例えば、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ）の共存下において接触させ、Ｃａ２＋型検出用形質転換細胞内のＣａ２＋濃度の変化を、直接的又は間接的に分析（すなわち、測定又は検出）する。Ｃａ２＋型検出用形質転換細胞と試験化合物とを、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニストの共存下において接触させた場合に、前記アゴニストによるＣａ２＋型検出用形質転換細胞内のＣａ２＋濃度の上昇が、前記試験化合物により阻害又は抑制されれば、前記試験化合物は、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニストであると判定することができる。例えば、実施例３に記載の条件で行なうことができる。
なお、コントロールとして、Ｃａ２＋型検出用形質転換細胞と血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニストとを、試験化合物の不在下において接触させ、前記アゴニストによるＣａ２＋型検出用形質転換細胞内のＣａ２＋濃度の上昇の程度を確認しておくことが必要である。
これまで説明したように、本発明のＣａ２＋型検出方法においては、共役タンパク質としてＧｉをそのまま使用するのではなく、Ｇｑｉを使用するので、ｃＡＭＰ濃度ではなく、Ｃａ２＋濃度を分析することによりアンタゴニスト又はアゴニストであるか否かの検出を実施することができる。通常、ｃＡＭＰ濃度に比べ、Ｃａ２＋濃度の方が、より簡易且つ迅速に測定することができる。
３）ｃＡＭＰ型検出方法
本発明のｃＡＭＰ型検出方法は、形質転換細胞として、検出ツール用ポリペプチドを発現している形質転換細胞（以下、ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞と称する）を使用する。通常の宿主細胞ではＧｉが構成的に発現しているので、検出ツール用ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞を得ることができる。なお、前記形質転換細胞は、形質転換する前の宿主細胞が、ＡＤＰを作用させても細胞内ｃＡＭＰ濃度が低下しない細胞であることが好ましい。このような細胞としては、例えば、ＣＨＯ細胞を挙げることができる。
本発明のｃＡＭＰ型検出方法においてアゴニストであるか否かを検出する場合には、ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞と試験化合物とを接触させ、前記ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞内のｃＡＭＰ濃度の変化を、直接的又は間接的に分析（すなわち、測定又は検出）する。ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞と試験化合物とを接触させる際には、ｃＡＭＰ濃度を上昇させることのできる化合物（例えば、フォルスコリン）を共存させることが好ましい。
ｃＡＭＰ濃度の変化は、例えば、市販のｃＡＭＰ測定キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社等）を用いて、直接的にｃＡＭＰ濃度の変化を分析することもできるし、あるいは、ｃＡＭＰ濃度に依存して転写量が調節される遺伝子［例えば、ルシフェラーゼの遺伝子の上流にｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を挿入した遺伝子］の転写活性を分析することにより、間接的にｃＡＭＰ濃度の変化を分析することもできる。
ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞と試験化合物とを接触させた場合に、ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞内のｃＡＭＰ濃度が低下すれば、前記試験化合物は、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアゴニストであると判定することができる。この場合、ｃＡＭＰ濃度を上昇させることのできる化合物（例えば、フォルスコリン）を共存させておくと、試験化合物によるｃＡＭＰ濃度の低下を、より容易に判定することができる。また、コントロールとして、検出ツール用ポリペプチドとＧｉとを発現しているｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞の代わりに、検出ツール用ポリペプチドが発現されていない宿主細胞を用いて同様の操作を行ない、前記試験化合物により前記宿主細胞内のｃＡＭＰ濃度が低下しないことを確認することが好ましい。
本発明のｃＡＭＰ型検出方法においてアンタゴニストであるか否かを検出する場合には、ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞と試験化合物とを、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニスト（例えば、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ）の共存下において接触させ、前記ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞内のｃＡＭＰ濃度の変化を、直接的又は間接的に分析（すなわち、測定又は検出）する。ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞と試験化合物とを、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニスト（例えば、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ）の共存下において接触させた場合に、前記アゴニストによるｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞内のｃＡＭＰ濃度の低下が、前記試験化合物により阻害又は抑制されれば、前記試験化合物は、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニストであると判定することができる。この場合、ｃＡＭＰ濃度を上昇させることのできる化合物（例えば、フォルスコリン）を共存させておくと、試験化合物によるｃＡＭＰ濃度の変動を、より容易に判定することができる。例えば、実施例４又は実施例５に記載の条件で、行うことができる。
また、コントロールとして、ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞と血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニストとを、試験化合物の不在下において接触させ、前記アゴニストによるｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞内のｃＡＭＰ濃度の低下の程度を確認しておくことが必要である。
４）ＧＴＰγＳ結合型検出方法
本発明のＧＴＰγＳ結合型検出方法は、検出ツール用ポリペプチド、前記ポリペプチドを含む細胞膜画分、あるいは、前記ポリペプチドを発現させた形質転換細胞を用いて、ＧＴＰγＳ結合法（Ｌａｚａｒｅｎｏ，Ｓ．及びＢｉｒｄｓａｌｌ，Ｎ．Ｊ．Ｍ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１０９，１１２０−１１２７，１９９３）を利用して、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出することができる。
例えば、以下の手順により実施することができる。
すなわち、検出ツール用ポリペプチドを発現させた細胞膜を、２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２、及び５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＧＤＰ混合溶液中で、３５Ｓで標識されたＧＴＰγＳ（４００ｐｍｏｌ／Ｌ）と混合する。試験化合物存在下と試験化合物不在下とでインキュベートした後、反応液をガラスフィルター等で濾過し、フィルターに残存するＧＴＰγＳの放射活性を液体シンチレーションカウンター等で測定する。試験化合物存在下における特異的なＧＴＰγＳ結合の上昇を指標に、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアゴニストであるか否かを検出することができる。また、試験化合物存在下における、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのリガンド（例えば、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ）によるＧＴＰγＳ結合上昇の抑制を指標に、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニストであるか否かを検出することができる。
（３）抗血小板剤スクリーニング方法
本発明の抗血小板剤スクリーニングツール（ポリペプチド型抗血小板剤スクリーニングツール及び形質転換細胞型抗血小板剤スクリーニングツールの両方を含む）を用いると、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストをスクリーニングすることができる。
既に説明したように、ＡＤＰは、血小板の活性化、粘着、及び凝集を惹起又は亢進する重要な因子として知られている。また、ＡＤＰは、血小板膜に存在するＧタンパク質共役型のＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔを介して、血小板を活性化すると言われている（Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｊ．，３３６，５１３−５２３，１９９８）。更に、公知の抗血小板剤であるチクロピジンやクロピドグレルは、体内での代謝物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣを阻害することで効果をもたらしていると考えられている（Ｓａｖｉ，Ｐ．Ｊ．，Ｐｈａｒｍａｃｌｏ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２６９，７７２−７７７，１９９４）し、ＡＴＰ類縁体であるＡＲＬ６７０８５若しくはその誘導体、又はＡｐ４Ａ［Ｐ１，Ｐ４−ｄｉ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ−５’）ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ］の誘導体などは、Ｐ２ＴＡＣ拮抗作用によりＡＤＰによる血小板凝集の抑制作用を有していることが示されている（Ｍｉｌｌｓ，Ｄ．Ｃ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．，７６，８３５−８５６，１９９６；Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｒ．Ｇ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１６，１７９−１８１，１９９５；及びＫｉｍ，Ｂ．Ｋ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，２３７０−２３７３，１９９２）。そして、実施例７で示したとおり、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト（例えば、２ＭｅＳＡＭＰ又はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ）は、抗血小板作用を有する。
これらの知見によれば、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するリガンド又はアンタゴニストは、血小板の活性化、粘着、及び凝集を制御することのできる物質として有用である。従って、これまで説明したスクリーニングツール用ポリペプチドそれ自体、あるいは、スクリーニングツール用形質転換細胞それ自体を、抗血小板剤のスクリーニングに用いることができる。すなわち、スクリーニングツール用ポリペプチドそれ自体、あるいは、スクリーニングツール用形質転換細胞それ自体を、スクリーニングツールとして使用することができる。
本発明の抗血小板剤スクリーニングツールを用いてスクリーニングにかけることのできる試験化合物としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験化合物として用いることができる。更には、本発明の抗血小板剤スクリーニングツールにより選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
本発明のスクリーニング方法は、検出方法により、以下の４つに大別されるが、いずれかの方法を用いて、あるいは、これらを組み合わせて、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出し、試験化合物の中からアンタゴニストを選択することによって、抗血小板剤として有用な物質をスクリーニングすることができる。以下、本発明のスクリーニング方法、
１）血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するリガンドをスクリーニングする方法（以下、リガンドスクリーニング方法と称する）；
２）形質転換細胞内におけるＣａ２＋濃度の変動を指標として、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニスト又はアゴニストをスクリーニングする方法（以下、Ｃａ２＋型スクリーニング方法と称する）；
３）形質転換細胞内におけるｃＡＭＰ量の変動を指標として、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニスト又はアゴニストをスクリーニングする方法（以下、ｃＡＭＰ型スクリーニング方法と称する）；及び
４）ＧＴＰγＳ結合法を利用する血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニスト又はアゴニストをスクリーニングする方法（以下、ＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法と称する）
について、順次説明する。
１）リガンドスクリーニング方法
本発明のリガンドスクリーニング方法は、本発明のリガンド検出方法により、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンドであるか否かを検出する工程、及びＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンドを選択する工程を含む限り、特に限定されるものではない。
前記リガンド検出方法により得られた放射活性リガンドの結合阻害を指標として、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するリガンドをスクリーニングすることができる。例えば、実施例６に記載の条件で、試験化合物を一定時間作用させ、［３Ｈ］−２ＭｅＳＡＤＰの結合阻害を指標に、そのＩＣ５０が１０μＭ以下（更に好ましくは１μＭ以下）の試験化合物を、リガンドとして選択することができる。
本発明のリガンドスクリーニング方法でスクリーニングしたリガンドを、更に、以下に説明するＣａ２＋型スクリーニング方法、ｃＡＭＰ型スクリーニング方法、及び／又はＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法にかけ、アンタゴニストをスクリーニングすることにより、抗血小板剤として有用な物質をスクリーニングすることができる。
２）Ｃａ２＋型スクリーニング方法
本発明のＣａ２＋型スクリーニング方法は、本発明のＣａ２＋型検出方法により、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する工程、及びＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト又はアゴニストを選択する工程を含む限り、特に限定されるものではない。
アゴニストは、前記Ｃａ２＋型検出方法において、試験化合物によるＣａ２＋型検出用形質転換細胞内のＣａ２＋濃度の上昇を指標に、スクリーニングすることができる。
アンタゴニストは、前記Ｃａ２＋型検出方法において、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニスト（例えば、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ）によるＣａ２＋型検出用形質転換細胞内のＣａ２＋濃度の上昇が、試験化合物により阻害又は抑制されることを指標に、スクリーニングすることができる。
例えば、実施例３に記載の条件で、試験化合物を一定時間作用させ、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰによる細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇の阻害を指標に、そのＩＣ５０が１０μＭ以下（更に好ましくは１μＭ以下）の試験化合物を、アンタゴニスト活性を有する物質として選択することができる。
本発明のＣａ２＋型スクリーニング方法でアンタゴニストをスクリーニングすることにより、抗血小板剤として有用な物質をスクリーニングすることができる。
３）ｃＡＭＰ型スクリーニング方法
本発明のｃＡＭＰ型スクリーニング方法は、本発明のｃＡＭＰ型検出方法により、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する工程、及びＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト又はアゴニストを選択する工程を含む限り、特に限定されるものではない。
アゴニストは、前記ｃＡＭＰ型検出方法において、試験化合物によるｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞内のｃＡＭＰ濃度低下を指標に、スクリーニングすることができる。
アンタゴニストは、前記ｃＡＭＰ型検出方法において、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニスト（例えば、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ）によるｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞内のｃＡＭＰ濃度の低下が、試験化合物により阻害又は抑制されることを指標にスクリーニングすることができる。
例えば、実施例４又は実施例５に記載の条件で、試験化合物を一定時間作用させ、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰによる細胞内ｃＡＭＰ濃度の低下の阻害を指標に、そのＩＣ５０が１０μＭ以下（更に好ましくは１μＭ以下）の試験化合物を、アンタゴニスト活性を有する物質として選択することができる。
本発明のｃＡＭＰ型スクリーニング方法でアンタゴニストをスクリーニングすることにより、抗血小板剤として有用な物質をスクリーニングすることができる。
４）ＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法
本発明のＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法は、本発明のＧＴＰγＳ結合型検出方法により、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する工程、及びＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト又はアゴニストを選択する工程を含む限り、特に限定されるものではない。
アゴニストは、前記ＧＴＰγＳ結合型検出方法における、試験化合物による特異的なＧＴＰγＳ結合の上昇を指標にスクリーニングすることができる。
また、アンタゴニストは、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニスト（例えば、２ＭｅＳＡＤＰやＡＤＰ）によるＧＴＰγＳ結合上昇が、試験化合物により抑制されることを指標に、スクリーニングすることができる。
本発明のＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法でアンタゴニストをスクリーニングすることにより、抗血小板剤として有用な物質をスクリーニングすることができる。
（４）抗血小板用医薬組成物の製造
本発明には、前記２）〜４）記載のスクリーニング方法により、あるいは、１）〜４）記載のスクリーニング方法を組み合わせることにより選択されるＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニストである物質（例えば、化合物、ペプチド、抗体、又は抗体断片）を有効成分とする抗血小板剤が包含される。
選択されたＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニストが抗血小板作用を有することは、例えば、実施例７記載の方法で、ヒト血小板凝集阻害活性を検出することにより、確認することができる。
また、抗血小板用医薬組成物の品質規格の確認試験において、本発明のリガンド検出方法、Ｃａ２＋型検出方法、ｃＡＭＰ型検出方法、及び／又はＧＴＰγＳ結合型検出方法によるＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出する工程、及び製剤化工程を含む、抗血小板用医薬組成物の製造方法も本発明に含まれる。
本発明のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト（例えば、化合物、ペプチド、抗体又は抗体断片）を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注若しくは筋注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与又は消化を受けない製剤化手段、例えば、ＷＯ９５／２８９６３号パンフレットに記載の製剤化手段が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、前記スクリーニング法により選択された有効成分の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。また、非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇである。
実施例
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２等）に従って実施することが可能である。
実施例１：ＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ ＡＣ 遺伝子ＨＯＲＫ３の単離
本実施例では、以下に示す手順に従って、ヒト脳ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）をテンプレートとして、ＰＣＲ法により、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ遺伝子ＨＯＲＫ３（以下、単に、ＨＯＲＫ３遺伝子と称する）の全長ｃＤＮＡを取得した。
すなわち、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして用いた。なお、前記フォワードプライマー及びリバースプライマーの各々の５’末端には、ＸｂａＩ認識部位を含む塩基配列が付加されている。ＰＣＲは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社製）を用いて、５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）存在下で、９４℃（２０秒間）／５８℃（２０秒間）／７４℃（１．５分間）からなるサイクルを５回、９４℃（２０秒間）／５５℃（２０秒間）／７４℃（１．５分間）からなるサイクルを５回、そして、９４℃（２０秒間）／５０℃（２０秒間）／７４℃（１．５分間）からなるサイクルを２５回、順次繰り返した。その結果、約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。このＤＮＡ断片をＸｂａＩで消化した後、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）のＸｂａＩ部位に挿入することにより、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３を得た。
プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３におけるＨＯＲＫ３遺伝子の塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてジデオキシターミネーター法により決定した。ＨＯＲＫ３遺伝子の塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列のとおりであった。
配列番号１で表される塩基配列は、１０２９塩基のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有しており、このＯＲＦから予測されるアミノ酸配列（３４２アミノ酸）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列のとおりであった。
実施例２：血球細胞におけるＨＯＲＫ３遺伝子の発現分布の確認
健常人ボランティアよりヘパリン採血し、４００×ｇで１０分間遠心処理を行なった。得られた上層を多血小板血漿として分取した。
また、下層には６％デキストラン／生理食塩水を１／３量加えて室温にて１時間放置した。その上清を取り、１５０×ｇで５分間遠心処理した後、沈渣をＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓｏｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に懸濁した。これを等量のフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に重層し、４００×ｇで３０分間遠心処理を行なった。こうして得られた中間層を「単核球画分」として、沈渣を多形核白血球として分取した。
前記多形核白血球にＣＤ１６マイクロビーズ（第一化学薬品社製）を加え、磁器スタンドにて「好中球画分」と「好酸球画分」とに分離した。
また、先に得られた前記多血小板血漿に最終濃度２ｍｍｏｌ／ＬになるようにＥＤＴＡを加え、２５００×ｇで１５分間遠心し、得られた沈殿を１２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ／２ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ／３０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に再懸濁した後、再び２５００×ｇで１５分間遠心して得られた沈殿を「血小板画分」とした。単核球画分、好中球画分、及び好酸球画分は、それぞれ生理食塩水にて洗浄した。
単核球画分、好中球画分、好酸球画分、及び血小板画分から、市販の総ＲＮＡ精製試薬（ｉｓｏｇｅｎ；日本ジーン社製）を用いて総ＲＮＡをそれぞれ精製した。各分画由来の総ＲＮＡ５μｇをＤＮアーゼ（ＤＮａｓｅ；Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ社製）を用いて３７℃で１５分間反応させた。ＤＮアーゼ処理した総ＲＮＡをスーパースクリプトファーストストランドシステム（ＲＴ−ＰＣＲ用）（ＧＩＢＣＯ社製）を用いてｃＤＮＡに変換した。
血球細胞でのＨＯＲＫ３ｍＲＮＡ発現量の検討は、前記の各ｃＤＮＡを鋳型として、シークエンスディテクター（Ｐｒｉｓｍ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行なった。配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを、プライマーセットとして用いた。また、５’側を蛍光指示薬ＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）で標識し、３’側を蛍光指示薬ＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）で標識した配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、ＨＯＲＫ３ｃＤＮＡを特異的に認識するプローブとして用いた。
ＰＣＲは、市販のＰＣＲ試薬（ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ ｃｏｒｅ ｒｅａｇｅｎｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、５％ＤＭＳＯ存在下で、９５℃（１５秒間）／６０℃（６０秒間）からなるサイクルを５０回繰り返した。また、ｍＲＮＡ発現量算出の標準曲線を得るために、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセット及びプローブを用いて同条件のＰＣＲを行なった［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．９８，９−２０（２０００）］。
更に、内部標準として、ヒトβ−アクチンの発現量を算出するために、前記の各ｃＤＮＡ及びヒトゲノムＤＮＡをそれぞれ鋳型として、配列番号８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーセットとし、５’側を蛍光指示薬ＦＡＭで標識し、３’側を蛍光指示薬ＴＡＭＲＡで標識した配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをβ−アクチンを特異的に認識するプローブとして用い、同条件のＰＣＲを行なった。
単核球画分、好中球画分、好酸球画分、及び血小板画分の各画分におけるβ−アクチンｍＲＮＡの発現量は、それぞれ、総ＲＮＡ１ｎｇ当たり、１５０００コピー、１９０００コピー、２５０００コピー、及び３３０００コピーであった。それに対して、ＨＯＲＫ３ｍＲＮＡは、血小板特異的に発現しており（コピー数＝８０５）、単核球、好中球、及び好酸球ではほとんど発現していないことがわかった。
実施例３：ＨＯＲＫ３タンパク質及びＧｑｉを共発現させたＣ６−１５細胞における２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰによる細胞内Ｃａ ２＋ 濃度の上昇の確認
ＡＤＰ又は２ＭｅＳＡＤＰ（２−メチルチオ−ＡＤＰ）等のプリン類の多くは、細胞に作用させると、内在性の細胞膜受容体を介して細胞内Ｃａ２＋の上昇を認める。そのため、外来性に導入した遺伝子由来のタンパク質が、ＡＤＰ又は２ＭｅＳＡＤＰに反応するか否かを検定するためには、これらの物質に反応しない細胞を用いてタンパク質を発現させることが好ましい。ラットグリオーマ細胞株の一種であるＣ６−１５は、ＡＤＰ等に反応しないことが知られている（Ｃｈａｎｇｅ，Ｋ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２６１５２−２６１５８，１９９５）。本実施例では、ＨＯＲＫ３タンパク質を発現させる細胞としてＣ６−１５を使用した。
また、ＨＯＲＫ３タンパク質を発現させるための発現プラスミドとして、前記実施例１で得られたプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３を用いた。
本実施例で使用したＧｑとＧｉとのキメラタンパク質を発現するための発現プラスミドは、Ｃｏｎｋｌｉｎ，Ｂ．Ｒ．らの方法（Ｎａｔｕｒｅ，３６３，２７４−２７６，１９９３）に従い、ＧｑのＣ末端側の５アミノ酸（Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ；配列番号１２で表されるアミノ酸配列）を、ＧｉのＣ末端側の５アミノ酸（Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ；配列番号１１で表されるアミノ酸配列）と置換して構築した遺伝子（以下、Ｇｑｉ遺伝子と称する）を、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳにクローニングして作製した。構築したプラスミドは、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉと命名した。
９６ウェルプレート（９６ｗｅｌｌ Ｂｌａｃｋ／ｃｌｅａｒ ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔ，ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ ｃｏａｔｅｄ；ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）に、Ｃ６−１５細胞を、１ウェル当たり２×１０４細胞となるように播種して４８時間培養した後、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３（１ウェル当たり５０ｎｇ）とプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉ（１ウェル当たり５０ｎｇ）との組み合わせを、トランスフェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いて遺伝子導入した。なお、コントロールとして、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３とプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉとの組み合わせに代えて、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ（すなわち、ＨＯＲＫ３遺伝子を含まない空ベクター）とプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉとの組み合わせを用いて遺伝子導入した。
前記の遺伝子導入操作から２４時間経過した後、培地を廃棄し、４μｍｏｌ／Ｌ−Ｆｌｕｏ−３，ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）、０．００４％プルロニックアシッド（商標＝Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）、１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ、及び２．５ｍｍｏｌ／Ｌプロベネシドを含むＨＢＢＳ（Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓｏｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（１ウェル当たり１００μＬ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。細胞を２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ及び２．５ｍｍｏｌ／Ｌプロベネシド含有ＨＢＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製）で４回洗浄した後、２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ及び２．５ｍｍｏｌ／Ｌプロベネシド含有ＨＢＳＳ（１ウェル当たり１００μＬ）を添加した。
細胞内Ｃａ２＋濃度の変化は、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｕｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いて経時的に測定した。すなわち、測定開始から１０秒経過後に、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰを、最終濃度３×１０−５ｍｏｌ／Ｌ〜１×１０−１２ｍｏｌ／Ｌになるように、ウェルに添加し、添加後、５０秒間は１秒ごとに、更に４分間は６秒ごとに蛍光強度を測定した。
プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３とプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉとの組み合わせを遺伝子導入した細胞では、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰの濃度依存的な細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が観察された。一方、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ（空ベクター）とプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉとの組み合わせを遺伝子導入した細胞では、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰによる細胞内Ｃａ２＋濃度の変化は観察されなかった。
プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３とプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉとを遺伝子導入した細胞における２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰによる細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を測定し、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰの各濃度におけるピーク値をプロットして、ロジスティック（Ｌｏｇｉｓｔｉｃ）回帰法により濃度依存性を解析した。その結果、２ＭｅＳＡＤＰのＥＣ５０は、５．４ｎｍｏｌ／Ｌであり、ＡＤＰのＥＣ５０は、２２０ｎｍｏｌ／Ｌであることがわかった。以上のように、検出ツール用ポリペプチドとＧｑｉとを共発現させたＣａ２＋型検出用形質転換細胞では、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰに反応して容量依存的に細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を誘導することが確認された。
以上のことから、検出用ポリペプチドの１つであるＨＯＲＫ３タンパク質は、ＡＤＰに反応する受容体であり、Ｇｉに共役していることが判明した。また、本実施例の結果から明らかなように、検出ツール用ポリペプチドの１つであるＨＯＲＫ３タンパク質及びＧｑｉを共発現するＣ６−１５細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を測定することで、アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニングが可能となった。
実施例４：ＨＯＲＫ３タンパク質を発現するＣＨＯ細胞における２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰによるｃＡＭＰ産生阻害の確認
前記実施例３により、前記ＡＤＰ受容体がＧｉ共役型受容体であることが判明したことから、前記ＡＤＰ受容体はアデニル酸シクラーゼの活性を抑制する活性を持っていることが予測される。そこで、本発明のｃＡＭＰ型スクリーニング方法を実施するには、前記ＡＤＰ受容体タンパク質を発現させるための宿主細胞として、ＡＤＰや２ＭｅＳＡＤＰによってアデニル酸シクラーゼの活性を抑制する活性を持っていない細胞株を選択することが好ましい。以下の方法に従い、ＡＤＰや２ＭｅＳＡＤＰによってフォルスコリン刺激によるｃＡＭＰの産生量を下げない細胞を検索した結果、ＣＨＯ細胞が最適であることが判明したので、前記ＡＤＰ受容体タンパク質を発現させるための細胞としてＣＨＯ細胞を用いた。なお、本実施例では、核酸の新生合成に必須の酵素であるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を欠失した細胞株［ＣＨＯ−ｄｈｆｒ（−）株］を特に使用した。ＨＯＲＫ３タンパク質を発現させるための発現プラスミドとしてｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３を使用した。
１０ｃｍシャーレに、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ（−）株を、１×１０６細胞となるように、αＭＥＭ（核酸存在）培地を用いて播種し、１日培養した後、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３（８μｇ）をトランスフェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いて遺伝子導入した。なお、コントロールとして、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３に代えて、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ（すなわち、ＨＯＲＫ３遺伝子を含まない空ベクター）を用いて遺伝子導入した。
前記の遺伝子導入操作から２４時間経過した後、遺伝子導入した細胞を回収し、ＤＨＦＲの競合的阻害剤である１００ｎｍｏｌ／Ｌメトトレキセート（和光純薬社製）を含有するαＭＥＭ（核酸非存在）培地に懸濁した後、段階希釈して１０ｃｍシャーレに播き直した。２週間後に出現したコロニーを個別に取得し、ＨＯＲＫ３タンパク質発現ＣＨＯ細胞、あるいは、コントロール用の空ベクター導入ＣＨＯ細胞として、以下の実験に使用した。
ＨＯＲＫ３タンパク質発現ＣＨＯ細胞又は空ベクター導入ＣＨＯ細胞を、２４ウェルプレートに、１ウェル当たり１×１０５細胞となるように播種した。１日培養した後、１ｍｍｏｌ／Ｌ−３−イソブチル−１−メチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ社製）及び０．１％ＢＳＡ含有αＭＥＭ（核酸非存在）培地で１０分間処理した後、３μｍｏｌ／Ｌフォルスコリン（和光純薬社製）と２ＭｅＳＡＤＰ（最終濃度＝１×１０−１２〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ）との組み合わせ、あるいは、３μｍｏｌ／ＬフォルスコリンとＡＤＰ（最終濃度＝１×１０−１０〜１×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）との組み合わせを滴下した。３７℃で３０分間インキュベートした後に培養上清を除去し、ｃＡＭＰ−ＥＩＡシステム（ＢＩＯＴＲＡＫ；アマシャム社製）に含まれる細胞溶解液を用いて細胞を溶解した。
各条件における細胞のｃＡＭＰ産生量の測定は、ｃＡＭＰ−ＥＩＡシステムを用い、その添付プロトコールに従って実施した。３μｍｏｌ／Ｌフォルスコリン単独刺激でのｃＡＭＰ産生量を１００％とし、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ共存下でのｃＡＭＰ量の濃度依存曲線を作製した。濃度依存曲線から、ＨＯＲＫ３タンパク質に対する２ＭｅＳＡＤＰ及びＡＤＰの応答性は、それぞれＥＣ５０＝０．０７ｎｍｏｌ／Ｌ及びＥＣ５０＝３５ｎｍｏｌ／Ｌであった。
一方、空ベクター導入ＣＨＯ細胞では、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰを添加しても、フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量に変化は見られなかった。
実施例５：ＨＯＲＫ３タンパク質を発現するＣ６−１５細胞における２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰによるｃＡＭＰ産生阻害の確認および阻害剤の影響
ＡＤＰや２ＭｅＳＡＤＰによってフォルスコリン刺激によるｃＡＭＰの産生量を下げない細胞として、Ｃ６−１５細胞も最適であることが判明したので、ＡＤＰ受容体タンパク質を発現させるための細胞としてＣ６−１５細胞も用いた。
ＡＤＰ受容体を発現させるための発現ベクターとしてｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３を使用した。
１０ｃｍシャーレにＣ６−１５細胞を、１×１０６細胞となるようにＤＭＥＭ培地を用いて播種し、１日培養した後、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３（８μｇ）とｐＥＦ−ＢＯＳ−ｎｅｏ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０；０．８μｇ）をトランスフェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いて遺伝子導入した。
前記の遺伝子導入操作から２４時間経過した後、遺伝子導入した細胞を回収し、０．６ｍｇ／ｍＬ−Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を含有するＤＭＥＭ培地に懸濁した後、段階希釈して１０ｃｍシャーレに播き直した。２週間後に出現したコロニーを個別に取得し、ＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞として、以下の実験に使用した。
ＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞を、９６ウェルプレートに１×１０４細胞で播種した。１日培養した後、１ｍｍｏｌ／Ｌ−３−イソブチル−１−メチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ社製）及び０．１％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ培地で１０分間処理した後、１μｍｏｌ／Ｌフォルスコリン（和光純薬社製）と２ＭｅＳＡＤＰ（最終濃度＝１×１０−１２〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ）との組み合わせ、あるいは、１μｍｏｌ／ＬフォルスコリンとＡＤＰ（最終濃度＝１×１０−１０〜１×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）との組み合わせをを滴下した。３７℃で３０分間インキュベートした後に培養上清を除去し、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳを用いて細胞を溶解した。
各条件における細胞のｃＡＭＰ産生量の測定は、ｃＡＭＰ ＨＴＲＦキット（ＣＩＳ ｂｉｏ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を用い、添付プロトコールに従って実施した。１μｍｏｌ／Ｌフォルスコリン単独刺激でのｃＡＭＰ産生量を１００％とし、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ共存下でのｃＡＭＰ量の濃度依存曲線を作製した。濃度依存曲線から、ＨＯＲＫ３タンパク質に対する２ＭｅＳＡＤＰ及びＡＤＰの応答性は、それぞれＥＣ５０＝０．０８ｎｍｏｌ／Ｌ、ＥＣ５０＝４２ｎｍｏｌ／Ｌであった。ＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞においても実施例４で示したＨＯＲＫ３タンパク質発現ＣＨＯ細胞とほぼ同様の性質を示した。
次に、ＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞におけるフォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量の２ＭｅＳＡＤＰによる抑制に対する、血小板凝集を抑制することが知られる化合物の影響を検討した。血小板凝集を抑制する化合物として、２ＭｅＳＡＭＰ（２−ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，８１，１１１−１１７，１９９９）又はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ（Ｎ６−［２−ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｅｔｈｙｌ］−２−［３，３，３−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ］−５’−ａｄｅｎｙｌｉｃ ａｃｉｄ，ｍｏｎｏａｎｈｙｄｒｉｄｅ ｗｉｔｈ ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４２，２１３−２２０，１９９９）を用いた。前記測定系において、１ｍｍｏｌ／Ｌ−３−イソブチル−１−メチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ社製）及び０．１％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ培地に２ＭｅＳＡＭＰ（１０−７〜１０−４ｍｏｌ／Ｌ）又はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ（１０−１２〜１０−６ｍｏｌ／Ｌ）を溶解したもので１０分間処理した後、１μｍｏｌ／Ｌフォルスコリン（和光純薬社製）と１０ｎｍｏｌ／Ｌ−２ＭｅＳＡＤＰとの組み合わせを滴下した。３７℃で３０分間インキュベートした後に培養上清を除去し、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳを用いて細胞を溶解した。ｃＡＭＰ産生量の測定はｃＡＭＰ ＨＴＲＦキットを用い、添付プロトコールに従って実施した。１μｍｏｌ／Ｌフォルスコリン単独刺激でのｃＡＭＰ産生量を０％とし、１μｍｏｌ／Ｌフォルスコリンと１０ｎｍｏｌ／Ｌ−２ＭｅＳＡＤＰとの組み合わせで刺激したときのｃＡＭＰ産生量を１００％として、阻害剤の濃度依存曲線を作製した。濃度依存曲線から、フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量の２ＭｅＳＡＤＰによる抑制に対する２ＭｅＳＡＭＰ及びＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸの阻害効果は、それぞれＩＣ５０＝５μｍｏｌ／Ｌ、ＩＣ５０＝２．４ｎｍｏｌ／Ｌであった。
実施例６：ＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞と２ＭｅＳＡＤＰとの結合実験
実施例５で作製したＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞を回収及び洗浄した後、５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡとプロテアーゼインヒビターカクテルセットＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ（ベーリンガーマンハイム社製）とを含有する２０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に懸濁して、ポリトロンにてホモジェナイズした。超遠心を行った後、沈殿を１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、及びＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭを含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に懸濁し、これを膜画分とした。
膜画分２０μｇに［３Ｈ］−２ＭｅＳＡＤＰ（Ｍｏｒａｖｅｋ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を最終濃度０．２５〜５０ｎｍｏｌ／Ｌになるように加え、１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、及びＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭを含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）２５０μＬ中で室温で１時間インキュベーションした後、セルハーベスターにてグラスフィルターに回収した。グラスフィルターにマイクロシンチレーターを加え、液体シンチレーションカウンターで膜画分への総結合量を測定した。さらに、前述の試験に最終濃度５０μｍｏｌ／Ｌ−２ＭｅＳＡＤＰを加えることで、膜画分への非特異的結合量を測定した。その結果、［３Ｈ］−２ＭｅＳＡＤＰはＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞の膜画分に特異的に結合することが分かった。この結合のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析の結果、ＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞の膜画分に対する［３Ｈ］−２ＭｅＳＡＤＰの結合の解離定数はＫｄ＝０．２７ｎｍｏｌ／Ｌで、最大結合はＢｍａｘ＝３．７ｐｍｏｌ／ｍｇであった。一方、ＨＯＲＫ３タンパク質を発現していないホストのＣ６−１５細胞の膜画分では特異的結合は観察されなかった。
次に、２ＭｅＳＡＭＰ又はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸの影響を、実施例６で作製したＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞の膜画分を用いて、［３Ｈ］−２ＭｅＳＡＤＰの結合を阻害する活性を指標にして検討した。実際には、ＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞膜画分２０μｇに、２ＭｅＳＡＭＰ（１０−７〜１０−４ｍｏｌ／Ｌ）又はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ（１０−１２〜１０−６ｍｏｌ／Ｌ）と１ｎｍｏｌ／Ｌ［３Ｈ］−２ＭｅＳＡＤＰとを添加し、室温で２時間インキュベーションした後、セルハーベスターにてグラスフィルターに回収した。グラスフィルターにマイクロシンチレーターを加え、液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。また、同時に、前述の試験において化合物を添加しないもの、及び最終濃度１０μｍｏｌ／Ｌ−２ＭｅＳＡＤＰを加えたものを、それぞれ、総結合量、及び非特異的結合量として、放射活性を測定した。それぞれの化合物の濃度依存曲線から、ＨＯＲＫ３タンパク質と２ＭｅＳＡＤＰとの結合に対する２ＭｅＳＡＭＰ及びＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸの阻害効果は、それぞれＩＣ５０＝４．９μｍｏｌ／Ｌ、ＩＣ５０＝９．８ｎｍｏｌ／Ｌであった。
前記実施例３の結果に併せて、更に、実施例４及び５において、ＨＯＲＫ３タンパク質を発現するＣＨＯ細胞及びＣ６−１５細胞におけるフォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量が２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰによって抑制されたことから、本ＡＤＰ受容体がＧｉに共役していることが更に明確になった。また、実施例４及び５の結果から、スクリーニングツール用ポリペプチドの１つであるＨＯＲＫ３タンパク質を発現するＣＨＯ細胞又はＣ６−１５細胞の細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化を測定することで、アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニングが可能となった。また、実施例６に記載の方法で、ＨＯＲＫ３タンパク質を発現するＣ６−１５細胞の膜画分への２ＭｅＳＡＤＰの結合阻害を測定することで、リガンドのスクリーニングも可能である。
以上、実施例２〜６の結果より、ＨＯＲＫ３タンパク質は、血小板に発現しているＧｉ共役型のＡＤＰ受容体であることから、これまで存在が示唆されていた血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣの実体であると考えられる。
実施例７：ヒト血小板凝集阻害活性の確認
健常人（成人，男子）より１／１０容クエン酸ナトリウムにて採血を行ない、Ｄｅ Ｍａｒｃｏらの方法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７７，１２７２−１２７７，１９８６）に従い、多血小板血漿（ＰＲＰ）を調製した。ＰＲＰは、自動血球計数器（ＭＥＫ６２５８；日本光電）を用いて、３×１０８／ｍＬに調製して使用した。凝集惹起剤であるＡＤＰは、ＭＣメディカル社の製品を使用した。実施例５でＨＯＲＫ３タンパク質アンタゴニスト活性を示すことを確認した２ＭｅＳＡＭＰ又はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸを使用し、前記化合物を溶解する溶媒としては、生理食塩水を用いた。
血小板凝集は、血小板凝集計（ＭＣＭヘマトレーサー２１２；ＭＣメディカル）を用いて測定した。すなわち、ＰＲＰ（８０μＬ）とサンプル（２ＭｅＳＡＭＰ又はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ）又は溶媒（１０μＬ）とを、３７℃で１分間インキュベートした後、ＡＤＰ（２０〜２００μｍｏｌ／Ｌ）１０μＬを添加し、透過光の変化を１０分間記録し、その最大凝集率から凝集阻害（％）を算出した。
図１に、２ＭｅＳＡＭＰを用いた場合の結果を示し、図２に、ＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸを用いた場合の結果を示す。２ＭｅＳＡＭＰのデータ（図１）は、ボランティア２名を用いた実験結果の「平均値」で表し、ＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸのデータ（図２）は、ボランティア３名を用いた実験結果の「平均値＋標準誤差」で表した。両薬剤ともに、ＡＤＰ惹起血小板凝集を濃度依存的に阻害し、その阻害強度は、惹起剤であるＡＤＰの濃度に依存していた。
本実施例より、ＨＯＲＫ３タンパク質アンタゴニストが抗血小板作用を示すことが明確である。
産業上の利用可能性
血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ活性を阻害する物質は、抗血小板作用を示し、血栓性弊害の治療を可能とする。
従って、本発明の抗血小板剤スクリーニングツールによれば、抗血小板剤として有用な血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニストをスクリーニング及び評価することができる。
本発明のアンタゴニスト若しくはアゴニスト検出方法を用い、又は本発明のリガンド検出方法とアンタゴニスト若しくはアゴニスト検出方法とを組み合わせて用いることにより、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニストを選択し、抗血小板剤として有用な物質をスクリーニングすることができる。
次いで、前記スクリーニング方法で選択された物質を有効成分とし、担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて製剤化することにより、抗血小板用医薬組成物を製造することができる。
また、本発明のリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニスト検出方法は、抗血小板剤として有用な物質をスクリーニングする為のみでなく、抗血小板用医薬組成物の品質規格の確認試験において、用いることも可能である。
本発明のリガンド、アンタゴニスト又はアゴニスト検出方法を用いて、試験化合物が血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出し、次いで、前記アンタゴニスト又はリガンドを製剤化することにより、抗血小板用医薬組成物を製造することができる。
配列表フリーテキスト
配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号３又は配列番号４の配列で表される塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドは、人工的に合成したプライマー配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、ヒトクエン酸血由来多血小板血漿（ＰＲＰ）のＡＤＰ惹起血小板凝集における２ＭｅＳＡＭＰの効果を示すグラフである。
図２は、ヒトクエン酸血由来ＰＲＰのＡＤＰ惹起血小板凝集におけるＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸの効果を示すグラフである。
本発明は、抗血小板剤スクリーニング方法に関する。
背景技術
血小板は、ドンネ（Ｄｏｎｎｅ）によって１８４２年に発見［Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ｐａｒｉｓ），１４，３３６−３６８，１８４２］されて以来、長い間、止血に必要な血液中の１成分として扱われてきた。今日では血小板は単に止血機構の主役を演ずるだけでなく、臨床的に注目される動脈硬化の成立、血栓性疾患を含む循環器疾患、癌転移、炎症、移植後の拒絶反応、更には、免疫反応への関与など、多機能性を示すことが明らかにされている。
現在、血栓性疾患及び虚血性疾患に対して、薬剤又は物理的方法によって血行の再開を図る治療が行なわれている。しかしながら、最近、血行再建が行なわれた後に、内皮細胞を含む血管組織の破綻、あるいは、薬剤そのものによる線溶・凝固バランスの崩壊等で、血小板の活性化、粘着、及び／又は凝集が亢進する現象が発見され、臨床的にも問題になっている。例えば、ｔ−ＰＡ等を用いた血栓溶解療法により再疎通が得られた後、線溶能及び／又は凝固能が活性化され、全身の凝固・線溶バランスが崩壊することが明らかになってきた。臨床上は、再閉塞をもたらし、治療上大きな問題となっている（Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１２，６１６−６２３，１９８８）。
一方、狭心症若しくは心筋梗塞などの冠動脈狭窄、又は大動脈狭窄を基盤とした疾患の治療において、ＰＴＣＡ（Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｔｒａｎｓｌｕｍｉｎａｌ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）療法が急速に普及し、一定の成果を挙げている。しかし、この療法は、内皮細胞を含む血管組織を傷害し、急性冠閉塞、更には、３割近くの治療例で発現する再狭窄が大きな問題となっている。
このような血行再建療法後の種々の血栓性弊害（再閉塞等）には、血小板が重要な役割を果たしている。従って、これらの血栓性弊害を予防・治療する薬剤として、抗血小板剤が期待されている。
ところで、血小板の活性化、粘着、及び凝集を惹起又は亢進する重要な因子として、アデノシン二リン酸（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ５’−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＡＤＰ）が知られている。ＡＤＰは、コラーゲンやトロンビン等で活性化された血小板から、あるいは、血行再建等により傷ついた血球、血管内皮細胞、又は臓器から放出される。ＡＤＰは、血小板膜に存在するＧタンパク質共役型のＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔを介して、血小板を活性化すると言われている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３３６，５１３−５２３，１９９８）。
血小板ＡＤＰ受容体としては、Ｇタンパク質の１種であるＧｑに共役してホスホリパーゼＣ（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ；ＰＬＣ）を介して細胞内Ｃａ２＋濃度を上げるタイプの血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＰＬＣと、Ｇタンパク質の１種であるＧｉに共役してアデニル酸シクラーゼ（Ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ；ＡＣ）の活性を抑制する血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣとの存在が示唆されていた。現在、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＰＬＣは、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２Ｙ１と呼ばれる受容体であることが同定されているが、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣは、これまでその実体が同定されていなかった（Ｋｕｎａｐｕｌｉ，Ｓ．Ｐ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１９，３９１−３９４，１９９８）。
抗血小板剤として利用されているチクロピジン（Ｔｉｃｌｏｐｉｄｉｎｅ）やクロピドグレル（Ｃｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌ）は、体内での代謝物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣを阻害することで効果をもたらしていると考えられている（Ｓａｖｉ，Ｐ．Ｊ．，Ｐｈａｒｍａｃｌｏ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２６９，７７２−７７７，１９９４）。また、生体内のＡＤＰ受容体拮抗物質であるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の誘導体として合成されたＡＲＬ６７０８５は、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対する拮抗作用によりＡＤＰによる血小板凝集の抑制作用を有しており、血栓症モデルにおいてその有効性が示されている（Ｍｉｌｌｓ，Ｄ．Ｃ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．，７６，８３５−８５６，１９９６；及びＨｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｒ．Ｇ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１６，１７９−１８１，１９９５）。更に、Ａｐ４Ａ［Ｐ１，Ｐ４−ｄｉ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ−５’）ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ］の誘導体も、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対する拮抗作用によりＡＤＰによる血小板凝集の抑制作用を有しており、血栓症モデルにおいてその有効性が示されている（Ｋｉｍ，Ｂ．Ｋ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，２３７０−２３７３，１９９２）。
以上の知見から、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対する拮抗薬は、強力な抗血小板剤となることが期待される。しかし、チクロピジンやクロピドグレルは、抗血栓作用が弱く、しかも、副作用が強い等の問題点を抱えており、また、ＡＴＰ類縁体であるＡＲＬ６７０８５若しくはその誘導体、又はＡｐ４Ａの誘導体などについても、ＡＤＰ受容体拮抗薬として研究が進められているが、全てヌクレオチドの誘導体であり、経口活性が充分でなく、しかも、血小板凝集抑制活性が弱いなどの問題を抱えており、強力で経口活性を有するＡＤＰ受容体拮抗薬が熱望されている（ＣＡＰＲＩＥ ＳＴＥＥＲＩＮＧ ＣＯＭＭＩＴＴＥＥ，Ｌａｎｃｅｔ，３４８，１３２９−１３３９，１９９６）。
しかしながら、これまで、血小板に存在するＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質は、同定されておらず、簡便な化合物スクリーニング系の構築が困難であったため、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ拮抗薬の開発は進展していなかった。
なお、本発明で用いることのできるヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質と同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、及び前記ＤＮＡがコードする推定アミノ酸配列については、種々の報告（ＷＯ００／２２１３１号、ＷＯ００／３１２５８号、ＷＯ００／２８０２８号、及びＷＯ９８／５０５４９号各パンフレット）があるが、いずれもリガンドが解明されておらず、血小板に存在するＡＤＰ受容体であるとの記載もない。
発明の開示
従って、本発明の課題は、抗血小板剤として有用なアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）受容体Ｐ２ＴＡＣ拮抗薬を得るための簡便なスクリーニング系及び新たな抗血小板剤を提供することにある。
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、Ｐ２ＴＡＣ受容体をコードする核酸（具体的にはＨＯＲＫ３遺伝子）を単離することに成功し、塩基配列及び推定アミノ酸配列を決定した。次に、前記受容体をコードする核酸を含むベクター、及び前記ベクターを含む宿主細胞を順次作成し、前記宿主細胞を用いてＰ２ＴＡＣ受容体を発現させることにより、新規な組換えＰ２ＴＡＣ受容体の生産を可能にし、前記受容体がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ活性を有することから、前記受容体及び前記受容体を発現する細胞が抗血小板剤スクリーニングツールとなることを確認した。また、前記受容体又は前記受容体を発現する細胞を用い、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出する方法、及び前記検出方法を用いた抗血小板剤のスクリーニング方法を確立した。更に、抗血小板作用を示す物質として知られている化合物（具体的には、２ＭｅＳＡＭＰ又はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ）が、前記検出方法にて前記受容体のアンタゴニスト活性を示すことを確認し、前記受容体のアンタゴニストが確かに抗血小板剤として有用であることを示した。そして、前記検出工程を含む、抗血小板用医薬組成物の製造方法を確立し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、
［１］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質と称することがある）、又は（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰと結合し、Ｇｉに共役することにより、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制する活性（以下、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ活性と称する）を有するポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）である、抗血小板剤スクリーニングツール；
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰと結合し、Ｇｉに共役することにより、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制する活性を有するポリペプチド（以下、相同タンパク質と称する）である、抗血小板剤スクリーニングツール（以下、［１］又は［２］記載の抗血小板剤スクリーニングツールを、総称して、ポリペプチド型抗血小板剤スクリーニングツールと称する）；
［３］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（すなわち、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質）、又は（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰと結合し、Ｇｉに共役することにより、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制する活性を有するポリペプチド（すなわち、機能的等価改変体）をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞である、抗血小板剤スクリーニングツール；
［４］配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰと結合し、Ｇｉに共役することにより、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制する活性を有するポリペプチド（すなわち、相同タンパク質）をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞である、抗血小板剤スクリーニングツール（以下、［３］又は［４］記載の抗血小板剤スクリーニングツールを、総称して、形質転換細胞型抗血小板剤スクリーニングツールと称する）；
［５］［１］若しくは［２］記載のポリペプチド（すなわち、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質、機能的等価改変体、又は相同タンパク質）、前記ポリペプチドを含む細胞膜画分、又は［３］若しくは［４］記載の形質転換細胞と、試験化合物とを、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ標識リガンド存在下で、接触させる工程、及び
前記ポリペプチド、細胞膜画分、又は形質転換細胞への標識リガンドの結合量の変化を分析する工程
を含む、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンドであるか否かを検出する方法（以下、リガンド検出方法と称する）；
［６］Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１１で表されるアミノ酸配列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇタンパク貿のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧタンパク質キメラを共発現している［３］又は［４］記載の形質転換細胞と、試験化合物とを接触させる工程、及び
前記形質転換細胞内におけるＣａ２＋濃度の変化を分析する工程
を含む、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する方法（以下、Ｃａ２＋型検出方法と称する）；
［７］［３］又は［４］記載の形質転換細胞と試験化合物とを、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニストの共存下において、接触させる工程、及び
前記形質転換細胞内におけるｃＡＭＰ濃度の変化を分析する工程
を含む、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する方法（以下、ｃＡＭＰ型検出方法と称する）；
［８］前記リガンド検出方法、Ｃａ２＋型検出方法、又はｃＡＭＰ型検出方法、あるいは、これらを組み合わせることにより、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出する工程、及び
ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニストを選択する工程
を含む、抗血小板剤をスクリーニングする方法；並びに
［９］前記リガンド検出方法、Ｃａ２＋型検出方法、又はｃＡＭＰ型検出方法、あるいは、これらを組み合わせることにより、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出する工程、及び
製剤化工程
を含む、抗血小板用医薬組成物の製造方法
に関する。
前記「Ｇｉ」は、受容体と共役して細胞内へのシグナル伝達・増幅因子として機能するＧタンパク質のサブファミリーの１つであって、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制するＧタンパク質である。アデニル酸シクラーゼの活性が抑制されると、例えば、細胞内ｃＡＭＰ濃度が低下する。
また、前記「ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇタンパク質」は、受容体と共役して細胞内へのシグナル伝達・増幅因子として機能するＧタンパク質のサブファミリーの１つであって、ホスホリパーゼＣの活性を促進するＧタンパク質である。ホスホリパーゼＣの活性が促進されると、例えば、細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇する。ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇタンパク質としては、例えば、Ｇｑを挙げることができる。
更に、前記「ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ」は、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣを有するポリペプチドを意味する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）抗血小板剤スクリーニングツール
本発明の抗血小板剤スクリーニングツールには、ポリペプチド型抗血小板剤スクリーニングツールと、形質転換細胞型抗血小板剤スクリーニングツールとが含まれる。
１）ポリペプチド型抗血小板剤スクリーニングツール
本発明のポリペプチド型抗血小板剤スクリーニングツールには、
（ｉ）ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質、すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、抗血小板剤スクリーニングツール；
（ｉｉ）機能的等価改変体、すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ活性を有するポリペプチドである、抗血小板剤スクリーニングツール；及び
（ｉｉｉ）相同タンパク質、すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ活性を有するポリペプチドである、抗血小板剤スクリーニングツール
が含まれる。
本発明のポリペプチド型抗血小板剤スクリーニングツールとして用いることのできる、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、３４２個のアミノ酸残基からなるヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質である。ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質は、血小板に存在することが示唆されていたものの、本発明者が今回始めてその機能を解明するまで、その実体は同定されていなかった。
そして、本願の優先日後の文献で、初めて、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが血小板ＡＤＰ受容体であることが公表された［Ｎａｔｕｒｅ，４０９，１１ Ｊａｎｕａｒｙ ２００１，２０２−２０７；Ｊ．Ｂ．Ｃ．，２７６，（１１），Ｍａｒｃｈ １６，８６０８−８６１５，２００１；ＷＯ０１／４６４５４号パンフレット］。なお、ＷＯ０１／４６４５４号パンフレットの優先権の基礎となる特許出願では、ラットのＡＤＰ受容体遺伝子をクローニングし、配列決定しているものの、ヒトのＡＤＰ受容体遺伝子については、部分配列を含むクローンを取得し、配列決定しているにすぎない。従って、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質及びこれをコードするポリヌクレオチドを取得し、その機能を初めて解明し、これらを用いる抗血小板剤をスクリーニング方法の発明に関する特許出願を行なったのは、本願出願人の方が早い。
本発明のポリペプチド型抗血小板剤スクリーニングツールとして用いることのできる機能的等価改変体は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、それぞれ、１又は複数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ活性を有するポリペプチドである限り、特に限定されるものではなく、その起源もヒトに限定されない。
例えば、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのヒトにおける変異体が含まれるだけでなく、ヒト以外の生物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）由来のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ又はその変異体が含まれる。更には、それらの天然タンパク質（すなわち、ヒト由来の変異体、又はヒト以外の生物由来のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ若しくはその変異体）又はヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣを元にして遺伝子工学的に人為的に改変したタンパク質などが含まれる。なお、本明細書において「変異体」（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とは、同一種内の同一タンパク質にみられる個体差、あるいは、数種間の相同タンパク質にみられる差異を意味する。
ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのヒトにおける変異体、又はヒト以外の生物由来のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ若しくはその変異体は、当業者であれば、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列）の情報を基にして、取得することができる。なお、遺伝子組換え技術については、特に断りがない場合、公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２等）に従って実施することが可能である。
例えば、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ遺伝子の塩基配列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブを設計し、前記プライマー又はプローブと、目的とする生物［例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）］由来の試料（例えば、総ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ画分、ｃＤＮＡライブラリー、又はファージライブラリー）とを用いてＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション法を実施することにより、タンパク質の遺伝子を取得し、その遺伝子を適当な発現系を用いて発現させ、発現したタンパク質が、例えば、実施例３又は実施例４に記載の方法により、ＡＤＰと結合し、Ｇｉに共役することによってアデニル酸シクラーゼの活性を抑制することを確認することにより、所望のタンパク質を取得することができる。
また、前記の遺伝子工学的に人為的に改変したタンパク質は、常法、例えば、部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）により、タンパク質の遺伝子を取得し、その遺伝子を適当な発現系を用いて発現させ、発現したタンパク質が、例えば、実施例３又は実施例４に記載の方法により、ＡＤＰと結合し、Ｇｉに共役することによってアデニル酸シクラーゼの活性を抑制することを確認することにより、所望のタンパク質を取得することができる。
本発明のポリペプチド型抗血小板剤スクリーニングツールとして用いることのできる相同タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ活性を有するポリペプチドである限り、特に限定されるものではないが、配列番号２で表されるアミノ酸配列に関して、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有することができる。
なお、本明細書における前記「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｎｇｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，１９９０）検索により得られた値を意味し、アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用いて決定することができる。具体的には、ＢＬＡＳＴパッケージ（ｓｇｉ３２ｂｉｔ版，バージョン２．０．１２；ＮＣＢＩより入手）のｂｌ２ｓｅｑプログラム（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ及びＴｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７４，２４７−２５０，１９９９）を用い、デフォルトパラメーターに従って算出することができる。ペアワイズ・アラインメント・パラメーターとして、プログラム名「ｂｌａｓｔｐ」を使用し、Ｇａｐ挿入Ｃｏｓｔ値を「０」で、Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値を「０」で、Ｑｕｅｒｙ配列のフィルターとして「ＳＥＧ」を、Ｍａｔｒｉｘとして「ＢＬＯＳＵＭ６２」をそれぞれ使用する。
本発明のポリペプチド型抗血小板剤スクリーニングツールとして用いることのできる各種ポリペプチド（すなわち、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質、機能的等価改変体、及び相同タンパク質；以下、スクリーニングツール用ポリペプチドと称する）は、種々の公知の方法によって得ることができ、例えば、目的タンパク質をコードする遺伝子を用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。より具体的には、後述する形質転換細胞（すなわち、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞）を、スクリーニングツール用ポリペプチドの発現が可能な条件下で培養し、受容体タンパク質の分離及び精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から目的タンパク質を分離及び精製することにより調製することができる。
スクリーニングツール用ポリペプチドを調製する際に、それをコードする遺伝子を取得する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質を調製する場合には、それをコードする遺伝子として、例えば、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡを用いることができる。なお、所望アミノ酸に対するコドンはそれ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば、利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従って決定することができる（Ｃｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，ｒ４３−ｒ７４，１９８１）。
配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡは、例えば、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を結合することにより取得することもできるし、あるいは、ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質の産生能力を有する細胞又は組織に由来するｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、配列番号１で表される塩基配列に基づいて設計した適当なプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１，１９８８）により、取得することもできる。前記のヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質の産生能力を有する細胞又は組織としては、例えば、ヒト血小板又はヒト脳などを挙げることができる。また、前記プライマーセットとしては、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせを挙げることができる。
スクリーニングツール用ポリペプチドの調製において使用することのできる分離及び精製方法は、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順で実施することができる。例えば、スクリーニングツール用ポリペプチドを表面に発現した細胞を培養し、これらをバッファーに懸濁した後、ホモジナイズし、遠心分離することにより、スクリーニングツール用ポリペプチドを含む細胞膜画分を得ることができる。得られた細胞膜画分を可溶化した後、通常のタンパク質沈殿剤による処理、限外濾過、各種液体クロマトグラフィー［例えば、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等］、若しくは透析法、又はこれらの組合せ等により、スクリーニングツール用ポリペプチドを精製することができる。なお、細胞膜画分を可溶化する際には、できるだけ緩和な可溶化剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、又はジキトニン等）を用いることにより、可溶化後も受容体の特性を保持することができる。
スクリーニングツール用ポリペプチドを調製する際には、所望に応じて、スクリーニングツール用ポリペプチドと適当なマーカー配列とをインフレームで融合して発現させることで、前記ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、又は精製等を容易に行なうことができる。前記マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。また、マーカー配列とスクリーニングツール用ポリペプチドとの間に、プロテアーゼ（例えば、エンテロキナーゼ、ファクターＸａ、又はトロンビンなど）が認識する特異的な配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することが可能である。例えば、ムスカリンアセチルコリン受容体とヘキサ−ヒスチジン・タグとをトロンビン認識配列で連結した報告がある（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．Ｋ．及びＨａｇａ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２０，１２３２−１２３８，１９９６）。
２）形質転換細胞型抗血小板剤スクリーニングツール
本発明の形質転換細胞型抗血小板剤スクリーニングツールには、
（ｉ）ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞である、抗血小板剤スクリーニングツール；
（ｉｉ）機能的等価改変体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞である、抗血小板剤スクリーニングツール；及び
（ｉｉｉ）相同タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞である、抗血小板剤スクリーニングツール
が含まれる。
本発明の形質転換細胞型抗血小板剤スクリーニングツールとして用いることのできる各種形質転換細胞（以下、スクリーニングツール用形質転換細胞と称する）を作成するために使用することのできる宿主細胞は、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現することができる限り、特に限定されるものではなく、例えば、通常使用される公知の微生物、例えば、大腸菌又は酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、あるいは、公知の培養細胞、例えば、脊椎動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、又はＣＯＳ細胞）又は昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）を挙げることができる。前記脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，Ｃｅｌｌ，２３，１７５−１８２，１９８１）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．及びＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、あるいは、前記ＨＥＫ２９３細胞にエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を挙げることができる。
スクリーニングツール用形質転換細胞を作成するために使用することのできる発現ベクターは、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現することができる限り、特に限定されるものではなく、使用する宿主細胞の種類に応じて、適宜選択することができる。
例えば、脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用することができ、更に必要により、複製起点を有していることができる。前記発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４−８６４，１９８１）、ヒトの延長因子プロモーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はサイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができる。
より詳細には、宿主細胞としてＣＯＳ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、更に、転写プロモーター、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、ｐＭＥ１８Ｓ（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．及びＴａｋｅｂｅ，Ｙ．，Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７−３２，１９９０）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８４２，１９８７）等を挙げることができる。
前記発現ベクターは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．及びＭａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１，１２９５−１３０８，１９８３）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｄ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４５７，１９７３）、カチオン性リポソーム試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）を用いた方法、あるいは、電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１，８４１−８４５，１９８２）等により、ＣＯＳ細胞に取り込ませることができる。
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現することのできるベクター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）又はｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１，１９８２）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、スクリーニングツール用ポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
更に、宿主細胞として２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、エプスタイン・バーウイルスの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己増殖が可能なｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などを用いることができる。
スクリーニングツール用形質転換細胞は、常法に従って培養することができ、前記培養により細胞内又は細胞表面にスクリーニングツール用ポリペプチドが生産される。前記培養に用いることのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択することができる。例えば、ＣＯＳ細胞の場合には、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地又はダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応じて牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加した培地を使用することができる。また、２９３−ＥＢＮＡ細胞の場合には、牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えた培地を使用することができる。
スクリーニングツール用形質転換細胞は、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現している限り、特に限定されるものではない。スクリーニングツール用形質転換細胞は、スクリーニングツール用ポリペプチドに加え、Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１１で表されるアミノ酸配列（Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）であるＧタンパク質を発現していることが好ましい。配列番号１１で表されるアミノ酸配列は、ＧｉのＣ末端の５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、以下、「Ｃ末端のアミノ酸配列が配列番号１１で表されるアミノ酸配列であるＧタンパク質」を「Ｃ末端Ｇｉ型Ｇタンパク質」と称する。
前記Ｃ末端Ｇｉ型Ｇタンパク質としては、例えば、（１）Ｇｉ、又は（２）Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１１で表されるアミノ酸配列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇタンパク質（例えば、Ｇｑ）のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧタンパク質キメラを挙げることができる。以下、ＧｑのホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧタンパク質キメラを、Ｇｑｉと称する。
スクリーニングツール用ポリペプチドは、ＧｉのＣ末端の５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（すなわち、配列番号１１で表されるアミノ酸配列）を認識して、Ｇｉと結合する。従って、スクリーニングツール用ポリペプチドは、Ｇｉのみならず、Ｇｑｉとも結合することができる。スクリーニングツール用形質転換細胞において、スクリーニングツール用ポリペプチドとＣ末端Ｇｉ型Ｇタンパク質とが発現されると、これらのポリペプチドは細胞内で結合することができる。
前記Ｇｑｉにおける「ＧｑのホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチド」は、Ｇｑと共役する血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＰＬＣとの結合に必要なＣ末端アミノ酸配列を含まず、しかも、ホスホリパーゼＣの活性を促進する活性を有する限り、特に限定されるものではないが、例えば、Ｃ末端の５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を欠失したＧｑのＮ末端側部分ポリペプチドを挙げることができる。
前記Ｇｑｉにおける「Ｇｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチド」は、ＧｉのＣ末端の５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、しかも、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制する活性を有しない限り、特に限定されるものではないが、例えば、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるＧｉのＣ末端側部分ポリペプチドを挙げることができる。
（２）ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニスト検出方法
前記スクリーニングツール用ポリペプチド、又はスクリーニングツール用形質転換細胞を検出ツールに用いて、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出することができる。
本発明による、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出する方法には、
１）血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するリガンドであるか否かを検出する方法（すなわち、リガンド検出方法）；
２）形質転換細胞内におけるＣａ２＋濃度の変動を指標として、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する方法（すなわち、Ｃａ２＋型検出方法）；
３）形質転換細胞内におけるｃＡＭＰ量の変動を指標として、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する方法（すなわち、ｃＡＭＰ型検出方法）；及び
４）ＧＴＰγＳ結合法を利用する血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する方法（以下、ＧＴＰγＳ結合型検出方法と称する）
が含まれる。これらの検出方法について、順次説明する。
１）リガンド検出方法
本発明のリガンド検出方法は、（ｉ）ヒトＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣタンパク質、機能的等価改変体、又は相同タンパク質（以下、検出ツール用ポリペプチドと称する）、検出ツール用ポリペプチドを含む細胞膜画分、あるいは、検出ツール用ポリペプチドを発現させた形質転換細胞（以下、検出ツール用ポリペプチド、前記細胞膜画分、及び前記形質転換細胞を総称して、リガンド検出ツールと称する）と、（ｉｉ）標識リガンドとを用いる限り、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により実施することができる。
まず、リガンド検出ツールを調製する。アッセイ条件（例えば、使用する緩衝液の種類及び濃度、緩衝液に添加するイオンの種類及び濃度、並びにアッセイ系のｐＨ）を最適化し、最適化したバッファー中で、リガンド検出ツールと、標識リガンドとを、試験化合物と共に一定時間インキュベーションする。前記標識リガンドとしては、例えば、［３Ｈ］２−メチルチオ−ＡＤＰ（２ＭｅＳＡＤＰ）を用いることができる。反応後、反応液をガラスフィルター等で濾過し、適量のバッファーで洗浄した後、フィルターに残存する放射活性を液体シンチレーションカウンター等で測定する。得られた放射活性リガンドの結合阻害を指標として、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するリガンドであるか否かを検出することができる。すなわち、試験化合物不在下の場合のフィルター残存放射活性よりも、試験化合物存在下の場合のフィルター残存放射活性が低下した場合には、前記試験化合物は、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するリガンドであると判定することができる。例えば、実施例６に記載の条件で行なうことができる。
２）Ｃａ２＋型検出方法
本発明のＣａ２＋型検出方法は、形質転換細胞として、（ｉ）検出ツール用ポリペプチドと、（ｉｉ）Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１１で表されるアミノ酸配列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇタンパク質のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧタンパク質キメラ（例えば、Ｇｑｉ）とを共発現している形質転換細胞（以下、Ｃａ２＋型検出用形質転換細胞と称する）を使用する。なお、前記形質転換細胞は、形質転換する前の宿主細胞が、ＡＤＰを作用させても細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇しない細胞であることが好ましい。このような細胞としては、例えば、ラットグリオーマ細胞株の一種であるＣ６−１５（Ｃｈａｎｇｅ，Ｋ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２６１５２−２６１５８，１９９５）を挙げることができる。
本発明のＣａ２＋型検出方法においてアゴニストであるか否かを検出する場合には、Ｃａ２＋型検出用形質転換細胞と試験化合物とを接触させ、前記Ｃａ２＋型検出用形質転換細胞内のＣａ２＋濃度の変化を、直接的又は間接的に分析（すなわち、測定又は検出）する。Ｃａ２＋濃度の変化は、例えば、カルシウム結合性蛍光試薬（例えば、ｆｕｒａ２又はｆｌｕｏ３等）を用いて、直接的にＣａ２＋濃度の変化を分析することもできるし、あるいは、Ｃａ２＋濃度に依存して転写量が調節される遺伝子［例えば、ルシフェラーゼの遺伝子の上流にアクチベータープロテイン１（ＡＰ１）応答配列を挿入した遺伝子］の転写活性を分析することにより、間接的にＣａ２＋濃度の変化を分析することもできる。
Ｃａ２＋型検出用形質転換細胞と試験化合物とを接触させた場合に、Ｃａ２＋型検出用形質転換細胞内のＣａ２＋濃度が上昇すれば、前記試験化合物は、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアゴニストであると判定することができる。なお、コントロールとして、検出ツール用ポリペプチドとＧｑｉとを共発現しているＣａ２＋型検出用形質転換細胞の代わりに、検出ツール用ポリペプチドが発現されておらず、しかも、Ｇｑｉが発現しているコントロール用形質転換細胞、あるいは、形質転換前の宿主細胞を用いて同様の操作を行ない、前記試験化合物により前記コントロール用形質転換細胞又は前記宿主細胞内のＣａ２＋濃度が上昇しないことを確認することが好ましい。
本発明のＣａ２＋型検出方法においてアンタゴニストであるか否かを検出する場合には、Ｃａ２＋型検出用形質転換細胞と試験化合物とを、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニスト（例えば、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ）の共存下において接触させ、Ｃａ２＋型検出用形質転換細胞内のＣａ２＋濃度の変化を、直接的又は間接的に分析（すなわち、測定又は検出）する。Ｃａ２＋型検出用形質転換細胞と試験化合物とを、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニストの共存下において接触させた場合に、前記アゴニストによるＣａ２＋型検出用形質転換細胞内のＣａ２＋濃度の上昇が、前記試験化合物により阻害又は抑制されれば、前記試験化合物は、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニストであると判定することができる。例えば、実施例３に記載の条件で行なうことができる。
なお、コントロールとして、Ｃａ２＋型検出用形質転換細胞と血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニストとを、試験化合物の不在下において接触させ、前記アゴニストによるＣａ２＋型検出用形質転換細胞内のＣａ２＋濃度の上昇の程度を確認しておくことが必要である。
これまで説明したように、本発明のＣａ２＋型検出方法においては、共役タンパク質としてＧｉをそのまま使用するのではなく、Ｇｑｉを使用するので、ｃＡＭＰ濃度ではなく、Ｃａ２＋濃度を分析することによりアンタゴニスト又はアゴニストであるか否かの検出を実施することができる。通常、ｃＡＭＰ濃度に比べ、Ｃａ２＋濃度の方が、より簡易且つ迅速に測定することができる。
３）ｃＡＭＰ型検出方法
本発明のｃＡＭＰ型検出方法は、形質転換細胞として、検出ツール用ポリペプチドを発現している形質転換細胞（以下、ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞と称する）を使用する。通常の宿主細胞ではＧｉが構成的に発現しているので、検出ツール用ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞を得ることができる。なお、前記形質転換細胞は、形質転換する前の宿主細胞が、ＡＤＰを作用させても細胞内ｃＡＭＰ濃度が低下しない細胞であることが好ましい。このような細胞としては、例えば、ＣＨＯ細胞を挙げることができる。
本発明のｃＡＭＰ型検出方法においてアゴニストであるか否かを検出する場合には、ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞と試験化合物とを接触させ、前記ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞内のｃＡＭＰ濃度の変化を、直接的又は間接的に分析（すなわち、測定又は検出）する。ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞と試験化合物とを接触させる際には、ｃＡＭＰ濃度を上昇させることのできる化合物（例えば、フォルスコリン）を共存させることが好ましい。
ｃＡＭＰ濃度の変化は、例えば、市販のｃＡＭＰ測定キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社等）を用いて、直接的にｃＡＭＰ濃度の変化を分析することもできるし、あるいは、ｃＡＭＰ濃度に依存して転写量が調節される遺伝子［例えば、ルシフェラーゼの遺伝子の上流にｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を挿入した遺伝子］の転写活性を分析することにより、間接的にｃＡＭＰ濃度の変化を分析することもできる。
ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞と試験化合物とを接触させた場合に、ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞内のｃＡＭＰ濃度が低下すれば、前記試験化合物は、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアゴニストであると判定することができる。この場合、ｃＡＭＰ濃度を上昇させることのできる化合物（例えば、フォルスコリン）を共存させておくと、試験化合物によるｃＡＭＰ濃度の低下を、より容易に判定することができる。また、コントロールとして、検出ツール用ポリペプチドとＧｉとを発現しているｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞の代わりに、検出ツール用ポリペプチドが発現されていない宿主細胞を用いて同様の操作を行ない、前記試験化合物により前記宿主細胞内のｃＡＭＰ濃度が低下しないことを確認することが好ましい。
本発明のｃＡＭＰ型検出方法においてアンタゴニストであるか否かを検出する場合には、ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞と試験化合物とを、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニスト（例えば、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ）の共存下において接触させ、前記ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞内のｃＡＭＰ濃度の変化を、直接的又は間接的に分析（すなわち、測定又は検出）する。ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞と試験化合物とを、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニスト（例えば、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ）の共存下において接触させた場合に、前記アゴニストによるｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞内のｃＡＭＰ濃度の低下が、前記試験化合物により阻害又は抑制されれば、前記試験化合物は、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニストであると判定することができる。この場合、ｃＡＭＰ濃度を上昇させることのできる化合物（例えば、フォルスコリン）を共存させておくと、試験化合物によるｃＡＭＰ濃度の変動を、より容易に判定することができる。例えば、実施例４又は実施例５に記載の条件で、行うことができる。
また、コントロールとして、ｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞と血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニストとを、試験化合物の不在下において接触させ、前記アゴニストによるｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞内のｃＡＭＰ濃度の低下の程度を確認しておくことが必要である。
４）ＧＴＰγＳ結合型検出方法
本発明のＧＴＰγＳ結合型検出方法は、検出ツール用ポリペプチド、前記ポリペプチドを含む細胞膜画分、あるいは、前記ポリペプチドを発現させた形質転換細胞を用いて、ＧＴＰγＳ結合法（Ｌａｚａｒｅｎｏ，Ｓ．及びＢｉｒｄｓａｌｌ，Ｎ．Ｊ．Ｍ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１０９，１１２０−１１２７，１９９３）を利用して、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出することができる。
例えば、以下の手順により実施することができる。
すなわち、検出ツール用ポリペプチドを発現させた細胞膜を、２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２、及び５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＧＤＰ混合溶液中で、３５Ｓで標識されたＧＴＰγＳ（４００ｐｍｏｌ／Ｌ）と混合する。試験化合物存在下と試験化合物不在下とでインキュベートした後、反応液をガラスフィルター等で濾過し、フィルターに残存するＧＴＰγＳの放射活性を液体シンチレーションカウンター等で測定する。試験化合物存在下における特異的なＧＴＰγＳ結合の上昇を指標に、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアゴニストであるか否かを検出することができる。また、試験化合物存在下における、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのリガンド（例えば、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ）によるＧＴＰγＳ結合上昇の抑制を指標に、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニストであるか否かを検出することができる。
（３）抗血小板剤スクリーニング方法
本発明の抗血小板剤スクリーニングツール（ポリペプチド型抗血小板剤スクリーニングツール及び形質転換細胞型抗血小板剤スクリーニングツールの両方を含む）を用いると、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストをスクリーニングすることができる。
既に説明したように、ＡＤＰは、血小板の活性化、粘着、及び凝集を惹起又は亢進する重要な因子として知られている。また、ＡＤＰは、血小板膜に存在するＧタンパク質共役型のＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔを介して、血小板を活性化すると言われている（Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｊ．，３３６，５１３−５２３，１９９８）。更に、公知の抗血小板剤であるチクロピジンやクロピドグレルは、体内での代謝物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣを阻害することで効果をもたらしていると考えられている（Ｓａｖｉ，Ｐ．Ｊ．，Ｐｈａｒｍａｃｌｏ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２６９，７７２−７７７，１９９４）し、ＡＴＰ類縁体であるＡＲＬ６７０８５若しくはその誘導体、又はＡｐ４Ａ［Ｐ１，Ｐ４−ｄｉ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ−５’）ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ］の誘導体などは、Ｐ２ＴＡＣ拮抗作用によりＡＤＰによる血小板凝集の抑制作用を有していることが示されている（Ｍｉｌｌｓ，Ｄ．Ｃ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．，７６，８３５−８５６，１９９６；Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｒ．Ｇ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１６，１７９−１８１，１９９５；及びＫｉｍ，Ｂ．Ｋ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，２３７０−２３７３，１９９２）。そして、実施例７で示したとおり、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト（例えば、２ＭｅＳＡＭＰ又はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ）は、抗血小板作用を有する。
これらの知見によれば、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するリガンド又はアンタゴニストは、血小板の活性化、粘着、及び凝集を制御することのできる物質として有用である。従って、これまで説明したスクリーニングツール用ポリペプチドそれ自体、あるいは、スクリーニングツール用形質転換細胞それ自体を、抗血小板剤のスクリーニングに用いることができる。すなわち、スクリーニングツール用ポリペプチドそれ自体、あるいは、スクリーニングツール用形質転換細胞それ自体を、スクリーニングツールとして使用することができる。
本発明の抗血小板剤スクリーニングツールを用いてスクリーニングにかけることのできる試験化合物としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験化合物として用いることができる。更には、本発明の抗血小板剤スクリーニングツールにより選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
本発明のスクリーニング方法は、検出方法により、以下の４つに大別されるが、いずれかの方法を用いて、あるいは、これらを組み合わせて、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出し、試験化合物の中からアンタゴニストを選択することによって、抗血小板剤として有用な物質をスクリーニングすることができる。以下、本発明のスクリーニング方法、
１）血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するリガンドをスクリーニングする方法（以下、リガンドスクリーニング方法と称する）；
２）形質転換細胞内におけるＣａ２＋濃度の変動を指標として、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニスト又はアゴニストをスクリーニングする方法（以下、Ｃａ２＋型スクリーニング方法と称する）；
３）形質転換細胞内におけるｃＡＭＰ量の変動を指標として、血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニスト又はアゴニストをスクリーニングする方法（以下、ｃＡＭＰ型スクリーニング方法と称する）；及び
４）ＧＴＰγＳ結合法を利用する血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するアンタゴニスト又はアゴニストをスクリーニングする方法（以下、ＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法と称する）
について、順次説明する。
１）リガンドスクリーニング方法
本発明のリガンドスクリーニング方法は、本発明のリガンド検出方法により、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンドであるか否かを検出する工程、及びＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンドを選択する工程を含む限り、特に限定されるものではない。
前記リガンド検出方法により得られた放射活性リガンドの結合阻害を指標として、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣに対するリガンドをスクリーニングすることができる。例えば、実施例６に記載の条件で、試験化合物を一定時間作用させ、［３Ｈ］−２ＭｅＳＡＤＰの結合阻害を指標に、そのＩＣ５０が１０μＭ以下（更に好ましくは１μＭ以下）の試験化合物を、リガンドとして選択することができる。
本発明のリガンドスクリーニング方法でスクリーニングしたリガンドを、更に、以下に説明するＣａ２＋型スクリーニング方法、ｃＡＭＰ型スクリーニング方法、及び／又はＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法にかけ、アンタゴニストをスクリーニングすることにより、抗血小板剤として有用な物質をスクリーニングすることができる。
２）Ｃａ２＋型スクリーニング方法
本発明のＣａ２＋型スクリーニング方法は、本発明のＣａ２＋型検出方法により、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する工程、及びＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト又はアゴニストを選択する工程を含む限り、特に限定されるものではない。
アゴニストは、前記Ｃａ２＋型検出方法において、試験化合物によるＣａ２＋型検出用形質転換細胞内のＣａ２＋濃度の上昇を指標に、スクリーニングすることができる。
アンタゴニストは、前記Ｃａ２＋型検出方法において、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニスト（例えば、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ）によるＣａ２＋型検出用形質転換細胞内のＣａ２＋濃度の上昇が、試験化合物により阻害又は抑制されることを指標に、スクリーニングすることができる。
例えば、実施例３に記載の条件で、試験化合物を一定時間作用させ、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰによる細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇の阻害を指標に、そのＩＣ５０が１０μＭ以下（更に好ましくは１μＭ以下）の試験化合物を、アンタゴニスト活性を有する物質として選択することができる。
本発明のＣａ２＋型スクリーニング方法でアンタゴニストをスクリーニングすることにより、抗血小板剤として有用な物質をスクリーニングすることができる。
３）ｃＡＭＰ型スクリーニング方法
本発明のｃＡＭＰ型スクリーニング方法は、本発明のｃＡＭＰ型検出方法により、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する工程、及びＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト又はアゴニストを選択する工程を含む限り、特に限定されるものではない。
アゴニストは、前記ｃＡＭＰ型検出方法において、試験化合物によるｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞内のｃＡＭＰ濃度低下を指標に、スクリーニングすることができる。
アンタゴニストは、前記ｃＡＭＰ型検出方法において、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニスト（例えば、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ）によるｃＡＭＰ型検出用形質転換細胞内のｃＡＭＰ濃度の低下が、試験化合物により阻害又は抑制されることを指標にスクリーニングすることができる。
例えば、実施例４又は実施例５に記載の条件で、試験化合物を一定時間作用させ、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰによる細胞内ｃＡＭＰ濃度の低下の阻害を指標に、そのＩＣ５０が１０μＭ以下（更に好ましくは１μＭ以下）の試験化合物を、アンタゴニスト活性を有する物質として選択することができる。
本発明のｃＡＭＰ型スクリーニング方法でアンタゴニストをスクリーニングすることにより、抗血小板剤として有用な物質をスクリーニングすることができる。
４）ＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法
本発明のＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法は、本発明のＧＴＰγＳ結合型検出方法により、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する工程、及びＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト又はアゴニストを選択する工程を含む限り、特に限定されるものではない。
アゴニストは、前記ＧＴＰγＳ結合型検出方法における、試験化合物による特異的なＧＴＰγＳ結合の上昇を指標にスクリーニングすることができる。
また、アンタゴニストは、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニスト（例えば、２ＭｅＳＡＤＰやＡＤＰ）によるＧＴＰγＳ結合上昇が、試験化合物により抑制されることを指標に、スクリーニングすることができる。
本発明のＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法でアンタゴニストをスクリーニングすることにより、抗血小板剤として有用な物質をスクリーニングすることができる。
（４）抗血小板用医薬組成物の製造
本発明には、前記２）〜４）記載のスクリーニング方法により、あるいは、１）〜４）記載のスクリーニング方法を組み合わせることにより選択されるＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニストである物質（例えば、化合物、ペプチド、抗体、又は抗体断片）を有効成分とする抗血小板剤が包含される。
選択されたＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニストが抗血小板作用を有することは、例えば、実施例７記載の方法で、ヒト血小板凝集阻害活性を検出することにより、確認することができる。
また、抗血小板用医薬組成物の品質規格の確認試験において、本発明のリガンド検出方法、Ｃａ２＋型検出方法、ｃＡＭＰ型検出方法、及び／又はＧＴＰγＳ結合型検出方法によるＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出する工程、及び製剤化工程を含む、抗血小板用医薬組成物の製造方法も本発明に含まれる。
本発明のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト（例えば、化合物、ペプチド、抗体又は抗体断片）を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注若しくは筋注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与又は消化を受けない製剤化手段、例えば、ＷＯ９５／２８９６３号パンフレットに記載の製剤化手段が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、前記スクリーニング法により選択された有効成分の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。また、非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇである。
実施例
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２等）に従って実施することが可能である。
実施例１：ＡＤＰ受容体Ｐ２Ｔ ＡＣ 遺伝子ＨＯＲＫ３の単離
本実施例では、以下に示す手順に従って、ヒト脳ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）をテンプレートとして、ＰＣＲ法により、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ遺伝子ＨＯＲＫ３（以下、単に、ＨＯＲＫ３遺伝子と称する）の全長ｃＤＮＡを取得した。
すなわち、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして用いた。なお、前記フォワードプライマー及びリバースプライマーの各々の５’末端には、ＸｂａＩ認識部位を含む塩基配列が付加されている。ＰＣＲは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社製）を用いて、５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）存在下で、９４℃（２０秒間）／５８℃（２０秒間）／７４℃（１．５分間）からなるサイクルを５回、９４℃（２０秒間）／５５℃（２０秒間）／７４℃（１．５分間）からなるサイクルを５回、そして、９４℃（２０秒間）／５０℃（２０秒間）／７４℃（１．５分間）からなるサイクルを２５回、順次繰り返した。その結果、約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。このＤＮＡ断片をＸｂａＩで消化した後、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）のＸｂａＩ部位に挿入することにより、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３を得た。
プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３におけるＨＯＲＫ３遺伝子の塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてジデオキシターミネーター法により決定した。ＨＯＲＫ３遺伝子の塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列のとおりであった。
配列番号１で表される塩基配列は、１０２９塩基のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有しており、このＯＲＦから予測されるアミノ酸配列（３４２アミノ酸）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列のとおりであった。
実施例２：血球細胞におけるＨＯＲＫ３遺伝子の発現分布の確認
健常人ボランティアよりヘパリン採血し、４００×ｇで１０分間遠心処理を行なった。得られた上層を多血小板血漿として分取した。
また、下層には６％デキストラン／生理食塩水を１／３量加えて室温にて１時間放置した。その上清を取り、１５０×ｇで５分間遠心処理した後、沈渣をＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓｏｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に懸濁した。これを等量のフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に重層し、４００×ｇで３０分間遠心処理を行なった。こうして得られた中間層を「単核球画分」として、沈渣を多形核白血球として分取した。
前記多形核白血球にＣＤ１６マイクロビーズ（第一化学薬品社製）を加え、磁器スタンドにて「好中球画分」と「好酸球画分」とに分離した。
また、先に得られた前記多血小板血漿に最終濃度２ｍｍｏｌ／ＬになるようにＥＤＴＡを加え、２５００×ｇで１５分間遠心し、得られた沈殿を１２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ／２ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ／３０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に再懸濁した後、再び２５００×ｇで１５分間遠心して得られた沈殿を「血小板画分」とした。単核球画分、好中球画分、及び好酸球画分は、それぞれ生理食塩水にて洗浄した。
単核球画分、好中球画分、好酸球画分、及び血小板画分から、市販の総ＲＮＡ精製試薬（ｉｓｏｇｅｎ；日本ジーン社製）を用いて総ＲＮＡをそれぞれ精製した。各分画由来の総ＲＮＡ５μｇをＤＮアーゼ（ＤＮａｓｅ；Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ社製）を用いて３７℃で１５分間反応させた。ＤＮアーゼ処理した総ＲＮＡをスーパースクリプトファーストストランドシステム（ＲＴ−ＰＣＲ用）（ＧＩＢＣＯ社製）を用いてｃＤＮＡに変換した。
血球細胞でのＨＯＲＫ３ｍＲＮＡ発現量の検討は、前記の各ｃＤＮＡを鋳型として、シークエンスディテクター（Ｐｒｉｓｍ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行なった。配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを、プライマーセットとして用いた。また、５’側を蛍光指示薬ＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）で標識し、３’側を蛍光指示薬ＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）で標識した配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、ＨＯＲＫ３ｃＤＮＡを特異的に認識するプローブとして用いた。
ＰＣＲは、市販のＰＣＲ試薬（ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ ｃｏｒｅ ｒｅａｇｅｎｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、５％ＤＭＳＯ存在下で、９５℃（１５秒間）／６０℃（６０秒間）からなるサイクルを５０回繰り返した。また、ｍＲＮＡ発現量算出の標準曲線を得るために、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセット及びプローブを用いて同条件のＰＣＲを行なった［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．９８，９−２０（２０００）］。
更に、内部標準として、ヒトβ−アクチンの発現量を算出するために、前記の各ｃＤＮＡ及びヒトゲノムＤＮＡをそれぞれ鋳型として、配列番号８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーセットとし、５’側を蛍光指示薬ＦＡＭで標識し、３’側を蛍光指示薬ＴＡＭＲＡで標識した配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをβ−アクチンを特異的に認識するプローブとして用い、同条件のＰＣＲを行なった。
単核球画分、好中球画分、好酸球画分、及び血小板画分の各画分におけるβ−アクチンｍＲＮＡの発現量は、それぞれ、総ＲＮＡ１ｎｇ当たり、１５０００コピー、１９０００コピー、２５０００コピー、及び３３０００コピーであった。それに対して、ＨＯＲＫ３ｍＲＮＡは、血小板特異的に発現しており（コピー数＝８０５）、単核球、好中球、及び好酸球ではほとんど発現していないことがわかった。
実施例３：ＨＯＲＫ３タンパク質及びＧｑｉを共発現させたＣ６−１５細胞における２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰによる細胞内Ｃａ ２＋ 濃度の上昇の確認
ＡＤＰ又は２ＭｅＳＡＤＰ（２−メチルチオ−ＡＤＰ）等のプリン類の多くは、細胞に作用させると、内在性の細胞膜受容体を介して細胞内Ｃａ２＋の上昇を認める。そのため、外来性に導入した遺伝子由来のタンパク質が、ＡＤＰ又は２ＭｅＳＡＤＰに反応するか否かを検定するためには、これらの物質に反応しない細胞を用いてタンパク質を発現させることが好ましい。ラットグリオーマ細胞株の一種であるＣ６−１５は、ＡＤＰ等に反応しないことが知られている（Ｃｈａｎｇｅ，Ｋ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２６１５２−２６１５８，１９９５）。本実施例では、ＨＯＲＫ３タンパク質を発現させる細胞としてＣ６−１５を使用した。
また、ＨＯＲＫ３タンパク質を発現させるための発現プラスミドとして、前記実施例１で得られたプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３を用いた。
本実施例で使用したＧｑとＧｉとのキメラタンパク質を発現するための発現プラスミドは、Ｃｏｎｋｌｉｎ，Ｂ．Ｒ．らの方法（Ｎａｔｕｒｅ，３６３，２７４−２７６，１９９３）に従い、ＧｑのＣ末端側の５アミノ酸（Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ；配列番号１２で表されるアミノ酸配列）を、ＧｉのＣ末端側の５アミノ酸（Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ；配列番号１１で表されるアミノ酸配列）と置換して構築した遺伝子（以下、Ｇｑｉ遺伝子と称する）を、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳにクローニングして作製した。構築したプラスミドは、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉと命名した。
９６ウェルプレート（９６ｗｅｌｌ Ｂｌａｃｋ／ｃｌｅａｒ ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔ，ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ ｃｏａｔｅｄ；ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）に、Ｃ６−１５細胞を、１ウェル当たり２×１０４細胞となるように播種して４８時間培養した後、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３（１ウェル当たり５０ｎｇ）とプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉ（１ウェル当たり５０ｎｇ）との組み合わせを、トランスフェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いて遺伝子導入した。なお、コントロールとして、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３とプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉとの組み合わせに代えて、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ（すなわち、ＨＯＲＫ３遺伝子を含まない空ベクター）とプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉとの組み合わせを用いて遺伝子導入した。
前記の遺伝子導入操作から２４時間経過した後、培地を廃棄し、４μｍｏｌ／Ｌ−Ｆｌｕｏ−３，ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）、０．００４％プルロニックアシッド（商標＝Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）、１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ、及び２．５ｍｍｏｌ／Ｌプロベネシドを含むＨＢＢＳ（Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓｏｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（１ウェル当たり１００μＬ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。細胞を２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ及び２．５ｍｍｏｌ／Ｌプロベネシド含有ＨＢＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製）で４回洗浄した後、２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ及び２．５ｍｍｏｌ／Ｌプロベネシド含有ＨＢＳＳ（１ウェル当たり１００μＬ）を添加した。
細胞内Ｃａ２＋濃度の変化は、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｕｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いて経時的に測定した。すなわち、測定開始から１０秒経過後に、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰを、最終濃度３×１０−５ｍｏｌ／Ｌ〜１×１０−１２ｍｏｌ／Ｌになるように、ウェルに添加し、添加後、５０秒間は１秒ごとに、更に４分間は６秒ごとに蛍光強度を測定した。
プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３とプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉとの組み合わせを遺伝子導入した細胞では、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰの濃度依存的な細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が観察された。一方、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ（空ベクター）とプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉとの組み合わせを遺伝子導入した細胞では、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰによる細胞内Ｃａ２＋濃度の変化は観察されなかった。
プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３とプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉとを遺伝子導入した細胞における２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰによる細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を測定し、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰの各濃度におけるピーク値をプロットして、ロジスティック（Ｌｏｇｉｓｔｉｃ）回帰法により濃度依存性を解析した。その結果、２ＭｅＳＡＤＰのＥＣ５０は、５．４ｎｍｏｌ／Ｌであり、ＡＤＰのＥＣ５０は、２２０ｎｍｏｌ／Ｌであることがわかった。以上のように、検出ツール用ポリペプチドとＧｑｉとを共発現させたＣａ２＋型検出用形質転換細胞では、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰに反応して容量依存的に細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を誘導することが確認された。
以上のことから、検出用ポリペプチドの１つであるＨＯＲＫ３タンパク質は、ＡＤＰに反応する受容体であり、Ｇｉに共役していることが判明した。また、本実施例の結果から明らかなように、検出ツール用ポリペプチドの１つであるＨＯＲＫ３タンパク質及びＧｑｉを共発現するＣ６−１５細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を測定することで、アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニングが可能となった。
実施例４：ＨＯＲＫ３タンパク質を発現するＣＨＯ細胞における２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰによるｃＡＭＰ産生阻害の確認
前記実施例３により、前記ＡＤＰ受容体がＧｉ共役型受容体であることが判明したことから、前記ＡＤＰ受容体はアデニル酸シクラーゼの活性を抑制する活性を持っていることが予測される。そこで、本発明のｃＡＭＰ型スクリーニング方法を実施するには、前記ＡＤＰ受容体タンパク質を発現させるための宿主細胞として、ＡＤＰや２ＭｅＳＡＤＰによってアデニル酸シクラーゼの活性を抑制する活性を持っていない細胞株を選択することが好ましい。以下の方法に従い、ＡＤＰや２ＭｅＳＡＤＰによってフォルスコリン刺激によるｃＡＭＰの産生量を下げない細胞を検索した結果、ＣＨＯ細胞が最適であることが判明したので、前記ＡＤＰ受容体タンパク質を発現させるための細胞としてＣＨＯ細胞を用いた。なお、本実施例では、核酸の新生合成に必須の酵素であるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を欠失した細胞株［ＣＨＯ−ｄｈｆｒ（−）株］を特に使用した。ＨＯＲＫ３タンパク質を発現させるための発現プラスミドとしてｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３を使用した。
１０ｃｍシャーレに、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ（−）株を、１×１０６細胞となるように、αＭＥＭ（核酸存在）培地を用いて播種し、１日培養した後、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３（８μｇ）をトランスフェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いて遺伝子導入した。なお、コントロールとして、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３に代えて、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ（すなわち、ＨＯＲＫ３遺伝子を含まない空ベクター）を用いて遺伝子導入した。
前記の遺伝子導入操作から２４時間経過した後、遺伝子導入した細胞を回収し、ＤＨＦＲの競合的阻害剤である１００ｎｍｏｌ／Ｌメトトレキセート（和光純薬社製）を含有するαＭＥＭ（核酸非存在）培地に懸濁した後、段階希釈して１０ｃｍシャーレに播き直した。２週間後に出現したコロニーを個別に取得し、ＨＯＲＫ３タンパク質発現ＣＨＯ細胞、あるいは、コントロール用の空ベクター導入ＣＨＯ細胞として、以下の実験に使用した。
ＨＯＲＫ３タンパク質発現ＣＨＯ細胞又は空ベクター導入ＣＨＯ細胞を、２４ウェルプレートに、１ウェル当たり１×１０５細胞となるように播種した。１日培養した後、１ｍｍｏｌ／Ｌ−３−イソブチル−１−メチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ社製）及び０．１％ＢＳＡ含有αＭＥＭ（核酸非存在）培地で１０分間処理した後、３μｍｏｌ／Ｌフォルスコリン（和光純薬社製）と２ＭｅＳＡＤＰ（最終濃度＝１×１０−１２〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ）との組み合わせ、あるいは、３μｍｏｌ／ＬフォルスコリンとＡＤＰ（最終濃度＝１×１０−１０〜１×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）との組み合わせを滴下した。３７℃で３０分間インキュベートした後に培養上清を除去し、ｃＡＭＰ−ＥＩＡシステム（ＢＩＯＴＲＡＫ；アマシャム社製）に含まれる細胞溶解液を用いて細胞を溶解した。
各条件における細胞のｃＡＭＰ産生量の測定は、ｃＡＭＰ−ＥＩＡシステムを用い、その添付プロトコールに従って実施した。３μｍｏｌ／Ｌフォルスコリン単独刺激でのｃＡＭＰ産生量を１００％とし、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ共存下でのｃＡＭＰ量の濃度依存曲線を作製した。濃度依存曲線から、ＨＯＲＫ３タンパク質に対する２ＭｅＳＡＤＰ及びＡＤＰの応答性は、それぞれＥＣ５０＝０．０７ｎｍｏｌ／Ｌ及びＥＣ５０＝３５ｎｍｏｌ／Ｌであった。
一方、空ベクター導入ＣＨＯ細胞では、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰを添加しても、フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量に変化は見られなかった。
実施例５：ＨＯＲＫ３タンパク質を発現するＣ６−１５細胞における２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰによるｃＡＭＰ産生阻害の確認および阻害剤の影響
ＡＤＰや２ＭｅＳＡＤＰによってフォルスコリン刺激によるｃＡＭＰの産生量を下げない細胞として、Ｃ６−１５細胞も最適であることが判明したので、ＡＤＰ受容体タンパク質を発現させるための細胞としてＣ６−１５細胞も用いた。
ＡＤＰ受容体を発現させるための発現ベクターとしてｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３を使用した。
１０ｃｍシャーレにＣ６−１５細胞を、１×１０６細胞となるようにＤＭＥＭ培地を用いて播種し、１日培養した後、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ−ＨＯＲＫ３（８μｇ）とｐＥＦ−ＢＯＳ−ｎｅｏ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０；０．８μｇ）をトランスフェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いて遺伝子導入した。
前記の遺伝子導入操作から２４時間経過した後、遺伝子導入した細胞を回収し、０．６ｍｇ／ｍＬ−Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を含有するＤＭＥＭ培地に懸濁した後、段階希釈して１０ｃｍシャーレに播き直した。２週間後に出現したコロニーを個別に取得し、ＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞として、以下の実験に使用した。
ＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞を、９６ウェルプレートに１×１０４細胞で播種した。１日培養した後、１ｍｍｏｌ／Ｌ−３−イソブチル−１−メチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ社製）及び０．１％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ培地で１０分間処理した後、１μｍｏｌ／Ｌフォルスコリン（和光純薬社製）と２ＭｅＳＡＤＰ（最終濃度＝１×１０−１２〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ）との組み合わせ、あるいは、１μｍｏｌ／ＬフォルスコリンとＡＤＰ（最終濃度＝１×１０−１０〜１×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）との組み合わせをを滴下した。３７℃で３０分間インキュベートした後に培養上清を除去し、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳを用いて細胞を溶解した。
各条件における細胞のｃＡＭＰ産生量の測定は、ｃＡＭＰ ＨＴＲＦキット（ＣＩＳ ｂｉｏ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を用い、添付プロトコールに従って実施した。１μｍｏｌ／Ｌフォルスコリン単独刺激でのｃＡＭＰ産生量を１００％とし、２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰ共存下でのｃＡＭＰ量の濃度依存曲線を作製した。濃度依存曲線から、ＨＯＲＫ３タンパク質に対する２ＭｅＳＡＤＰ及びＡＤＰの応答性は、それぞれＥＣ５０＝０．０８ｎｍｏｌ／Ｌ、ＥＣ５０＝４２ｎｍｏｌ／Ｌであった。ＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞においても実施例４で示したＨＯＲＫ３タンパク質発現ＣＨＯ細胞とほぼ同様の性質を示した。
次に、ＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞におけるフォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量の２ＭｅＳＡＤＰによる抑制に対する、血小板凝集を抑制することが知られる化合物の影響を検討した。血小板凝集を抑制する化合物として、２ＭｅＳＡＭＰ（２−ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，８１，１１１−１１７，１９９９）又はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ（Ｎ６−［２−ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｅｔｈｙｌ］−２−［３，３，３−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ］−５’−ａｄｅｎｙｌｉｃ ａｃｉｄ，ｍｏｎｏａｎｈｙｄｒｉｄｅ ｗｉｔｈ ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４２，２１３−２２０，１９９９）を用いた。前記測定系において、１ｍｍｏｌ／Ｌ−３−イソブチル−１−メチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ社製）及び０．１％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ培地に２ＭｅＳＡＭＰ（１０−７〜１０−４ｍｏｌ／Ｌ）又はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ（１０−１２〜１０−６ｍｏｌ／Ｌ）を溶解したもので１０分間処理した後、１μｍｏｌ／Ｌフォルスコリン（和光純薬社製）と１０ｎｍｏｌ／Ｌ−２ＭｅＳＡＤＰとの組み合わせを滴下した。３７℃で３０分間インキュベートした後に培養上清を除去し、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳを用いて細胞を溶解した。ｃＡＭＰ産生量の測定はｃＡＭＰ ＨＴＲＦキットを用い、添付プロトコールに従って実施した。１μｍｏｌ／Ｌフォルスコリン単独刺激でのｃＡＭＰ産生量を０％とし、１μｍｏｌ／Ｌフォルスコリンと１０ｎｍｏｌ／Ｌ−２ＭｅＳＡＤＰとの組み合わせで刺激したときのｃＡＭＰ産生量を１００％として、阻害剤の濃度依存曲線を作製した。濃度依存曲線から、フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量の２ＭｅＳＡＤＰによる抑制に対する２ＭｅＳＡＭＰ及びＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸの阻害効果は、それぞれＩＣ５０＝５μｍｏｌ／Ｌ、ＩＣ５０＝２．４ｎｍｏｌ／Ｌであった。
実施例６：ＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞と２ＭｅＳＡＤＰとの結合実験
実施例５で作製したＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞を回収及び洗浄した後、５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡとプロテアーゼインヒビターカクテルセットＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ（ベーリンガーマンハイム社製）とを含有する２０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に懸濁して、ポリトロンにてホモジェナイズした。超遠心を行った後、沈殿を１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、及びＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭを含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に懸濁し、これを膜画分とした。
膜画分２０μｇに［３Ｈ］−２ＭｅＳＡＤＰ（Ｍｏｒａｖｅｋ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を最終濃度０．２５〜５０ｎｍｏｌ／Ｌになるように加え、１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、及びＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭを含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）２５０μＬ中で室温で１時間インキュベーションした後、セルハーベスターにてグラスフィルターに回収した。グラスフィルターにマイクロシンチレーターを加え、液体シンチレーションカウンターで膜画分への総結合量を測定した。さらに、前述の試験に最終濃度５０μｍｏｌ／Ｌ−２ＭｅＳＡＤＰを加えることで、膜画分への非特異的結合量を測定した。その結果、［３Ｈ］−２ＭｅＳＡＤＰはＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞の膜画分に特異的に結合することが分かった。この結合のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析の結果、ＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞の膜画分に対する［３Ｈ］−２ＭｅＳＡＤＰの結合の解離定数はＫｄ＝０．２７ｎｍｏｌ／Ｌで、最大結合はＢｍａｘ＝３．７ｐｍｏｌ／ｍｇであった。一方、ＨＯＲＫ３タンパク質を発現していないホストのＣ６−１５細胞の膜画分では特異的結合は観察されなかった。
次に、２ＭｅＳＡＭＰ又はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸの影響を、実施例６で作製したＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞の膜画分を用いて、［３Ｈ］−２ＭｅＳＡＤＰの結合を阻害する活性を指標にして検討した。実際には、ＨＯＲＫ３タンパク質発現Ｃ６−１５細胞膜画分２０μｇに、２ＭｅＳＡＭＰ（１０−７〜１０−４ｍｏｌ／Ｌ）又はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ（１０−１２〜１０−６ｍｏｌ／Ｌ）と１ｎｍｏｌ／Ｌ［３Ｈ］−２ＭｅＳＡＤＰとを添加し、室温で２時間インキュベーションした後、セルハーベスターにてグラスフィルターに回収した。グラスフィルターにマイクロシンチレーターを加え、液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。また、同時に、前述の試験において化合物を添加しないもの、及び最終濃度１０μｍｏｌ／Ｌ−２ＭｅＳＡＤＰを加えたものを、それぞれ、総結合量、及び非特異的結合量として、放射活性を測定した。それぞれの化合物の濃度依存曲線から、ＨＯＲＫ３タンパク質と２ＭｅＳＡＤＰとの結合に対する２ＭｅＳＡＭＰ及びＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸの阻害効果は、それぞれＩＣ５０＝４．９μｍｏｌ／Ｌ、ＩＣ５０＝９．８ｎｍｏｌ／Ｌであった。
前記実施例３の結果に併せて、更に、実施例４及び５において、ＨＯＲＫ３タンパク質を発現するＣＨＯ細胞及びＣ６−１５細胞におけるフォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ産生量が２ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰによって抑制されたことから、本ＡＤＰ受容体がＧｉに共役していることが更に明確になった。また、実施例４及び５の結果から、スクリーニングツール用ポリペプチドの１つであるＨＯＲＫ３タンパク質を発現するＣＨＯ細胞又はＣ６−１５細胞の細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化を測定することで、アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニングが可能となった。また、実施例６に記載の方法で、ＨＯＲＫ３タンパク質を発現するＣ６−１５細胞の膜画分への２ＭｅＳＡＤＰの結合阻害を測定することで、リガンドのスクリーニングも可能である。
以上、実施例２〜６の結果より、ＨＯＲＫ３タンパク質は、血小板に発現しているＧｉ共役型のＡＤＰ受容体であることから、これまで存在が示唆されていた血小板のＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣの実体であると考えられる。
実施例７：ヒト血小板凝集阻害活性の確認
健常人（成人，男子）より１／１０容クエン酸ナトリウムにて採血を行ない、Ｄｅ Ｍａｒｃｏらの方法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７７，１２７２−１２７７，１９８６）に従い、多血小板血漿（ＰＲＰ）を調製した。ＰＲＰは、自動血球計数器（ＭＥＫ６２５８；日本光電）を用いて、３×１０８／ｍＬに調製して使用した。凝集惹起剤であるＡＤＰは、ＭＣメディカル社の製品を使用した。実施例５でＨＯＲＫ３タンパク質アンタゴニスト活性を示すことを確認した２ＭｅＳＡＭＰ又はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸを使用し、前記化合物を溶解する溶媒としては、生理食塩水を用いた。
血小板凝集は、血小板凝集計（ＭＣＭヘマトレーサー２１２；ＭＣメディカル）を用いて測定した。すなわち、ＰＲＰ（８０μＬ）とサンプル（２ＭｅＳＡＭＰ又はＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸ）又は溶媒（１０μＬ）とを、３７℃で１分間インキュベートした後、ＡＤＰ（２０〜２００μｍｏｌ／Ｌ）１０μＬを添加し、透過光の変化を１０分間記録し、その最大凝集率から凝集阻害（％）を算出した。
図１に、２ＭｅＳＡＭＰを用いた場合の結果を示し、図２に、ＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸを用いた場合の結果を示す。２ＭｅＳＡＭＰのデータ（図１）は、ボランティア２名を用いた実験結果の「平均値」で表し、ＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸのデータ（図２）は、ボランティア３名を用いた実験結果の「平均値＋標準誤差」で表した。両薬剤ともに、ＡＤＰ惹起血小板凝集を濃度依存的に阻害し、その阻害強度は、惹起剤であるＡＤＰの濃度に依存していた。
本実施例より、ＨＯＲＫ３タンパク質アンタゴニストが抗血小板作用を示すことが明確である。
産業上の利用可能性
血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ活性を阻害する物質は、抗血小板作用を示し、血栓性弊害の治療を可能とする。
従って、本発明の抗血小板剤スクリーニングツールによれば、抗血小板剤として有用な血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニストをスクリーニング及び評価することができる。
本発明のアンタゴニスト若しくはアゴニスト検出方法を用い、又は本発明のリガンド検出方法とアンタゴニスト若しくはアゴニスト検出方法とを組み合わせて用いることにより、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニストを選択し、抗血小板剤として有用な物質をスクリーニングすることができる。
次いで、前記スクリーニング方法で選択された物質を有効成分とし、担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて製剤化することにより、抗血小板用医薬組成物を製造することができる。
また、本発明のリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニスト検出方法は、抗血小板剤として有用な物質をスクリーニングする為のみでなく、抗血小板用医薬組成物の品質規格の確認試験において、用いることも可能である。
本発明のリガンド、アンタゴニスト又はアゴニスト検出方法を用いて、試験化合物が血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出し、次いで、前記アンタゴニスト又はリガンドを製剤化することにより、抗血小板用医薬組成物を製造することができる。
配列表フリーテキスト
配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号３又は配列番号４の配列で表される塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドは、人工的に合成したプライマー配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、ヒトクエン酸血由来多血小板血漿（ＰＲＰ）のＡＤＰ惹起血小板凝集における２ＭｅＳＡＭＰの効果を示すグラフである。
図２は、ヒトクエン酸血由来ＰＲＰのＡＤＰ惹起血小板凝集におけるＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＸの効果を示すグラフである。
Claims (13)
- （１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰと結合し、Ｇｉに共役することにより、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制する活性を有するポリペプチドである、抗血小板剤スクリーニングツール。 - 配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載の抗血小板剤スクリーニングツール。
- 配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、ＡＤＰと結合し、Ｇｉに共役することにより、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制する活性を有するポリペプチドである、抗血小板剤スクリーニングツール。
- 配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項３に記載の抗血小板剤スクリーニングツール。
- 請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞である、抗血小板剤スクリーニングツール。
- 配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞である、請求項５に記載の抗血小板剤スクリーニングツール。
- 請求項３に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞である、抗血小板剤スクリーニングツール。
- 配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞である、請求項７に記載の抗血小板剤スクリーニングツール。
- 請求項１若しくは３に記載のポリペプチド、前記ポリペプチドを含む細胞膜画分、又は請求項５若しくは７に記載の形質転換細胞と、試験化合物とを、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣ標識リガンド存在下で、接触させる工程、及び
前記ポリペプチド、細胞膜画分、又は形質転換細胞への標識リガンドの結合量の変化を分析する工程
を含む、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンドであるか否かを検出する方法。 - Ｃ末端のアミノ酸配列が、配列番号１１で表されるアミノ酸配列であり、しかも、ホスホリパーゼＣ活性促進性Ｇタンパク質のホスホリパーゼＣ活性促進活性を有する部分ポリペプチドとＧｉの受容体共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるＧタンパク質キメラを共発現している請求項５又は７に記載の形質転換細胞と、試験化合物とを接触させる工程、及び
前記形質転換細胞内におけるＣａ２＋濃度の変化を分析する工程
を含む、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する方法。 - 請求項５又は７に記載の形質転換細胞と試験化合物とを、血小板ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣのアゴニストの共存下において、接触させる工程、及び前記形質転換細胞内におけるｃＡＭＰ濃度の変化を分析する工程
を含む、試験化合物がＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニスト又はアゴニストであるか否かを検出する方法。 - 請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法、あるいは、これらを組み合わせることによる、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出する工程、及び
ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣアンタゴニストを選択する工程
を含む、抗血小板剤をスクリーニングする方法。 - 請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法、あるいは、これらを組み合わせることによる、ＡＤＰ受容体Ｐ２ＴＡＣリガンド、アンタゴニスト、又はアゴニストであるか否かを検出する工程、及び
製剤化工程
を含む、抗血小板用医薬組成物の製造方法。
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