KR100851255B1 - Ｇ 단백질 커플된 수용체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아데닌에 대해 특이성을 갖는 G 단백질 커플된 수용체(아데닌 결합 GPCR)를 코딩하는 핵산, 분리된 아데닌 결합 GPCR, 동일물을 이용하는 분석 및 치료 방법을 제공한다.

Description

Ｇ 단백질 커플된 수용체 {G protein coupled receptor}

본 발명은 신규의 포유류 G 단백질 커플된 수용체, 그것을 코딩하는 핵산 및 분석에서의 그것의 용도에 관한 것이다.

GTP-결합 단백질 (G 단백질)은 호르몬과 다른 화학적 매개자의 G 단백질 커플된 수용체 (GPCRs)에의 결합과 세포내 작용자의 활성화 간의 중개자로서 작용한다. 리간드가 GPCR에 결합한 후에, 수용체의 세포질 부위는 수용체와 G 단백질의 상호작용을 가능하게 하는 형태적 변화를 일으키고, 이것은 다음 아데닐레이트 사이클라제, 포스포리파제 C 또는 이온 채널과 같은 세포내 중개자의 활성을 가능하게 한다. 이런 시스템은 하나의 리간드가 GPCR에 결합하는 것에 반응하여 많은 2차 전달자가 생성될 수 있을 정도로 원래의 신호가 증폭되도록 한다. 이 기작을 통하여, 세포는 그들의 외부 환경의 변화를 탐지하고 그에 반응할 수 있다.

G 단백질 커플된 수용체는 완전한 원형질막 단백질의 수퍼패밀리를 형성하고, 각 수용체는 공통 특징의 7개의 소수성 막통과 부위를 공유하고, 이들 각각은 20~30개의 아미노산 길이이고 다양한 길이의 친수성 아미노산 서열에 의해 연결되어진다. 수용체의 아미노 말단은 세포외이고 카복시 말단은 세포의 원형질 내에서 발견된다.

GPCRs는 다양한 범위의 조직 및 세포 유형에서 발견되고 많은 상이한 생리학적 절차와 연관이 있다. 그것들은 넓은 범위의 리간드, 예를 들어, 황체화 호르몬, 여포 자극 호르몬, 융모성 성선자극호르몬, 갑상선자극호르몬, 부신피질자극호르몬, 글루카곤 및 바소프레신과 같은 호르몬; 5-HT, 아세틸콜린(무스카린성 AchR), 히스타민, 프로스타글란딘, 칼시토닌, 류코트리엔 및 Ca²⁺와 같은 신경절달물질에 의해 활성화된다. GPCRs의 광범위한 분포와 다양한 역할은 GPCRs이 다양한 병리학적 질병에서 중요한 역할을 수행할 수 있음을 나타낸다. 실제, GPCRs은 기관지수축, 고혈압, 염증, 호르몬 장애, 당뇨병, 세포소멸, 침해수용, 신경전달 촉진 및 진전 장애와 관련된 질병에 관련되어 있음이 밝혀졌다.

누클레오티드에 대한 수용체로서 작용하는 한 그룹의 GPCRs이 매우 관심을 끈다. 누클레오티드 수용체는 3개의 패밀리: P1, P2Y 및 P2X로 구성되며 (Ralevic and Burnstock, 1998 Pharmacological Reviews 50(3): 413-492), 그 중 P1과 P2Y 패밀리는 GPCRs이다. P1 수용체는 아데노신에 의해 활성화되고 아데닌과 결합하지 않는다 (Bruns et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77 (50: 5547-51, 1980; Schwabe and Trost, 1980 Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 313(3): 197-87; Schwabe et al., 1982, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 321(1): 84-87). P1 수용체 패밀리의 멤버는 3개의 서브패밀리로 분리되는데, 이것은 아데노신 유형 1 패밀리, 아데노신 유형 2 패밀리 및 아데노신 유형 3 패밀리로 알려져 있다.

P2Y 패밀리는 누클레오티드에 의해 활성화되는 4개의 패밀리의 GPCRs를 포함 한다. 상세하게는, 이것들은 P2Y1(ADP 및 ATP에 의해 활성화됨), P2Y2(P2U라고도 함, 이들 GPCRs는 ATP 및 UTP에 의해 동일한 효능으로 활성화됨), P2Y3 및 P2Y6(상대적인 효능제 세기는 UDP>UTP>ADP) 및 P2Y4(UTP>ADP)이다. P2Y2 그룹에 서열 상동성을 갖는 많은 다른 GPCRs는 처음에 역시 누클레오티드 수용체라고 생각했지만(P2Y5, P2Y7, P2Y9, P2Y10), 지금은 누클레오티드에 의해 활성화되지 않는다고 알려져 있다.

P2X 패밀리는 G 단백질에 결합되지 않는 무관한 단백질 그룹이다. 이 그룹의 멤버는 리간드 관문 이온 채널이다.

G 단백질 커플된 수용체는 넓은 범위의 세포 및 생리학적 과정에서 이러한 중요한 역할을 수행하기 때문에, 이러한 수용체의 기능과 다양한 질병에서의 그들의 잠재적 역할 평가에 계속적인 관심이 있다.

발명의 요약

GPCRs에 대한 연구 과정에서, 본 발명자들은 새로운 부류의 GPCR을 나타내고 아데닌 결합 GPCR이라고 명명된 신규의 GPCR을 발견하였다. 래트의 신규 GPCR 서열을 공지 기술에서 이용가능한 서열과 비교했을 때, 놀랍게도 본 발명자들은 가장 가깝게 관련된 GPCR이 신규의 수용체와 단지 약 50% 서열 상동성을 공유함을 발견하였고, 이것은 신규의 GPCR이 새로운 부류의 GPCR의 멤버임을 나타낸다. 추가적인 연구로 아데닌에 대한 수용체의 자연적인 리간드(natural ligand)를 동정하였다. 이것은 아데닌을 그것의 자연적인 리간드로서 갖는 GPCR의 첫 번째 입증이고, 이는 GPCR이 새로운 부류의 GPCR을 나타내는 것을 암시한다. 실제로, 이것은 아데닌을 그것의 자연적인 수용체로서 갖는 모든 종류의 수용체의 첫 번째 입증이고, 신규의 수용체는 포유류의 피질에 존재함이 밝혀졌고, 신경전달물질으로서 아데닌의 첫 번째 개시를 나타낸다. 추가적인 연구는 6개의 인간 수용체 상동체를 동정하였고, 이것은 또한 본 발명의 일부이다.

본 발명은 아데닌 결합 G 단백질 커플된 수용체를 제공한다. 상세하게는, 본 발명은 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 서열을 갖는 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 상기 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 폴리펩티드 단편인 폴리펩티드가 또한 제공되고, 상기 단편은 적어도 10, 예를 들어 적어도 20, 30, 40, 50, 75, 100 또는 150 이상의 아미노산 크기이다. 이러한 단편은 각각 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 N-말단 부위로부터 유래될 수 있다. N-말단 부위를 포함하는 단편은 수용체 결합 위치를 제공하는 수용체의 세포외 부위를 재구성하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 단편은 아데닌에 결합하는 능력을 보유할 것이다.

다른 예에서, 본 발명은 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 폴리펩티드에 대해 적어도 50% 및 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 상동성을 갖는 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 이런 폴리펩티드는 아데닌에 결합하는 능력 및 바람직하게는 아데닌에 의해 활성화될 수 있는 수용체를 형성하는 능력을 바람직하게 보유한다. 유사하게, N-말단 단편을 포함하는, 대응하는 길이의 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 단편에 대해 적어도 50% 및 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 상동성을 바람직하게 갖는 이런 폴리펩티드의 적어 도 20개의 아미노산 단편인 폴리펩티드가 제공된다. 이런 폴리펩티드는 아데닌에 결합하는 능력 및 바람직하게는 아데닌에 의해 활성화될 수 있는 수용체를 형성하는 능력을 바람직하게 보유한다.

본 발명은 또한 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 핵산 서열을 제공한다. 바람직한 면에서, 분리된 서열은 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 그것이다. 본 발명은 또한 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자를 제공한다. 이전 두 단락에서 언급한 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 핵산이 본 발명에 의해 또한 제공된다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자가 또한 제공된다.

본 발명의 핵산은 또한 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 6, 7, 8 또는 9 또는 그들의 상보체에 대하여 적어도 50% 및 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 바람직하게는, 이들 서열은 비특이적 결합을 최소화하도록 조절된 조건 하에서 대응하는 핵산과 혼성화할 것이다. 바람직하게는 엄격한 내지는 적당히 엄격한 혼성화 조건이 바람직하다. 예를 들어, 약 80~90% 동일한 서열의 검출을 위한 적절한 조건은 0.25M Na₂HPO₄, pH 7.2, 6.5% SDS, 10% 덱스트란 설페이트 내, 42℃에서 밤새도록 혼성화시키고, 0.1×SSC, 0.1% SDS 내, 55℃에서 최종 세척하는 것을 포함한다. 약 90% 이상의 동일한 서열의 검출을 위한 적절한 조건은 0.25M Na₂HPO₄, pH 7.2, 6.5% SDS, 10% 덱스트란 설페이트 내, 65℃에서 밤새도록 혼성화시키고, 0.1×SSC, 0.1% SDS 내, 60℃에서 최종 세척하는 것을 포함한다.

이런 핵산은 "완전한 길이의" 폴리펩티드를 충분하게 코딩하지 않고, 따라서 예를 들어, 정지 코돈을 생성하는 치환이나 격자이동 돌연변이에 의한 코딩 서열이 조숙하게 종결되는 아데닌 결합 GPCR 유전자의 돌연변이형을 나타내는 핵산을 포함하는 것이 이해될 것이다. 이것은 또한 본 발명의 핵산이다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 단편인 핵산을 제공한다. 한 면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 서열 또는 그것의 상보체의 15 내지 50, 예를 들어 15 내지 35, 18 내지 35, 15내지 24, 18 내지 30, 18 내지 21 또는 21 내지 24개의 누클레오티드를 필수성분으로하여 구성되는 핵산 프라이머를 제공한다.

본 발명의 핵산과 폴리펩티드는 치료학적으로 질병의 치료에 사용될 수 있다. 상세하게는, 그것들은 퓨린 수용체에서의 작용과 관련된 질병, 이상, 특히 원래의 아데닌 결합 GPCRs 발현의 돌연변이 또는 하부조절과 관련된 것을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 특히, 그것들은 항발작제(anticonvulsives), 진정제(sedatives), 최면제(hypnotics), 저혈압제(hypotensives), 항부정맥제(antiarrhythmics), 음성주기변동제(negative chronotropics), 변전도제(dromotropics) 및 강심제(inotropics)로서 또는 병리학적 진전(pathological tremor disoder), 운동실조증(ataxia) 또는 신경전달의 침해수용(nociception)이나 촉진(facilitation)과 관련된 질병의 치료에 사용될 수 있다. 또한, CNS와 관련된 질병에서의 용도를 발견할 뿐만 아니라, 그것들은 혈소판 응집의 억제제, 심장혈관계에서 혈관 내피 세포에 의한 NO 생성의 자극제, 위액 분비의 억제제로서 또는 세포사멸(apotosis), 기관지수축(bronchoconstriction), 혈관확장(vasodilation) 또는 염증(inflammation)과 관련된 질병에서 사용될 수 있다.

다른 면에서, 상기 핵산의 서열을 포함하는 벡터, 특히 작동적으로 본 발명의 핵산 서열과 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 상기 벡터는 숙주 세포에 의해 운반되고, 상기 세포 내에서 발현된다. 상기 발현 후에, 본 발명의 폴리펩티드는 회복될 수 있다.

다른 면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 결합하거나 그의 활성을 조절하는 물질을 동정하기 위한 분석 방법을 제공한다. 상세하게는 펩티드이거나 비펩티드일 수 있는 이런 물질이 상기 처리 방법에서 사용되는 것이 고찰된다.

본 발명자들은 그것의 자연적인 리간드로서 아데닌을 갖는 모든 종류의 수용체를 처음으로 동정하였고, 신규 수용체가 포유류의 피질에 존재하는 것이 밝혀졌기 때문에, 아데닌을 신경전달물질로서 개시한 것은 본 발명자들이 처음이다. 따라서, 본 발명자들은 치료학적 적용에서 아데닌 자체 및/또는 아데닌을 모방하거나 길항하는 화합물을 사용하는 가능성을 열었다. 따라서 본 발명은 또한 인간이나 동물의 치료 방법에서의 사용을 위한 아데닌으로 확장한다. 상세하게는, 아데닌이 퓨린 수용체, 특히 아데닌 수용체에서의 활성과 관련된 질병, 이상의 치료에 사용될 수 있음이 고찰된다. 또한, 본 발명은 상기의 모든 질병이나 이상의 치료를 위한 약제의 제조에서 아데닌의 용도로 확장된다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드에 선택적으로 결합할 수 있는 항체와 그의 결합 단편을 제공한다. 따라서 항체와 결합 단편은 생물학적 샘플에서 본 발명의 폴리펩티드의 동정을 위한 진단적인 시험에서 사용될 수 있다.

본 발명의 이들 및 다른 면은 본 명세서에서 보다 상세하게 설명된다.

서열의 설명

서열 번호 1은 랫트 아데닌 결합 GPCR에 대한 누클레오티드 서열이다.

서열 번호 2는 랫트 아데닌 결합 GPCR에 대한 아미노산 서열이다.

서열 번호 3은 인간 아데닌 결합 GPCR1에 대한 누클레오티드 서열이다.

서열 번호 4는 인간 아데닌 결합 GPCR1에 대한 아미노산 서열이다.

서열 번호 5는 인간 아데닌 결합 GPCR2에 대한 누클레오티드 서열이다.

서열 번호 6은 인간 아데닌 결합 GPCR3에 대한 누클레오티드 서열이다.

서열 번호 7은 인간 아데닌 결합 GPCR4에 대한 누클레오티드 서열이다.

서열 번호 8은 인간 아데닌 결합 GPCR5에 대한 누클레오티드 서열이다.

서열 번호 9는 인간 아데닌 결합 GPCR6에 대한 누클레오티드 서열이다.

도 1은 랫트 아데닌 결합 GPCR (서열 번호 2)와 인간 아데닌 결합 GPCR1 (서열 번호 4)의 아미노산 서열의 서열 정렬을 도시한다.

도 2는 Gαqo 키메라를 발현하는 HEK293 세포로 일시적인(transient) 트랜스펙션 후에 돼지 피질 추출물 C18 단편에 의한 랫트 아데닌 결합 GPCR의 활성을 도시한다.

도 3은 Gαqi 키메라를 발현하는 HEK293 세포로 순간적인 트랜스펙션 후에 돼지 피질 추출물 C18 단편에 의한 랫트 아데닌 결합 GPCR의 활성을 도시한다.

도 4는 3.3nM 내지 33μM의 아데닌의 투여에 의한 랫트 아데닌 결합 GPCR/pcDNA3로 트랜스펙션한 HEK293/Gαqi 세포에서 Ca²⁺ 순간치의 자극을 도시한 다.

도 5는 3.3μM의 우리딘, 구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, 카페인, UDP 및 아데닌의 투여에 의한 랫트 아데닌 결합 GPCR/pcDNA3로 트랜스펙션한 HEK293/Gαqi 세포에서의 Ca²⁺ 순간치를 도시한다.

도 6은 3.3μM의 아데노신, AMP, ADP, ATP 및 아데닌의 투여에 의한 랫트 아데닌 결합 GPCR/pcDNA3로 트랜스펙션한 HEK293/Gαqi 세포에서의 Ca²⁺ 순간치를 도시한다.

도 7은 3μM의 PBS, 잔틴, 구아닌 및 하이포잔틴의 투여에 의한 랫트 아데닌 결합 GPCR/pcDNA3로 트랜스펙션한 HEK293/Gαqi 세포에서의 Ca²⁺ 순간치를 도시한다.

도 8a는 랫트 아데닌 결합 GPCR로 순간적으로 트랜스펙션된, CHO 막 상에 결합하는 [³⁵S]GTPγS의 자극을 도시한다. 데이터는 3번의 독립적인 실험의 평균값으로 제시된다(±SEM; n=3).

도 8b는 야생형 CHO 막 상에 결합하는 [³⁵S]GTPγS의 자극을 도시한다. 데이터는 3번의 독립적인 실험의 평균값으로 제시된다(±SEM; n=3).

도 9a는 랫트 아데닌 결합 GPCR로 순간적으로 트랜스펙션된, CHO 세포 상의 포스콜린 자극된 cAMP 형성의 억제를 도시한다. 분석은 NEN으로부터의 직접적인 RIA 키트를 사용하여, 0.5% hiFCS에서 수행되었다. 대표 곡선.

도 9b는 랫트 아데닌 결합 GPCR로 순간적으로 트랜스펙션된, CHO 세포 상의 포스콜린 자극된 cAMP 형성의 억제를 도시한다. 분석은 NEN으로부터의 직접적인 RIA 키트를 사용하여, 2% hiFCS에서 수행되었다. 대표 곡선.

도 10은 랫트 아데닌 결합 GPCR로 영구적으로 트랜스펙션된, CHO 막 상의 [³⁵S]GTPγS 결합의 자극에 대한 아데닌 복용량 반응 곡선을 도시한다.

도 11a는 랫트 아데닌 결합 GPCR(클론 28)로 영구적으로 트랜스펙션된, CHO 세포 상의 포스콜린 자극된 cAMP 형성의 억제를 도시한다. 도는 각각 Na-부티르산염 유도의 존재 및 부재 하에서, 0.5 및 10% 혈청 농도를 사용하여 얻어지는 대표 곡선을 나타낸다.

도 11b는 야생형 CHO 세포 상의 포스콜린 자극된 cAMP 형성의 억제를 도시한다. 도는 각각 Na-부티르산염 유도의 존재 및 부재 하에서, 0.5 및 10% 혈청 농도를 사용하여 얻어지는 대표 곡선을 나타낸다.

도 12a는 Na-부티르산염의 존재 및 부재 하에서 랫트 아데닌 결합 GPCR(클론 28)로 영구적으로 트랜스펙션된, CHO 세포 상의 세포내 Ca²⁺ 측정의 아데닌 복용량 반응 곡선을 도시한다.

도 12b는 Na-부티르산염의 존재 및 부재 하에서 야생형 CHO 세포 상의 세포내 Ca²⁺ 측정의 아데닌 복용량 반응 곡선을 도시한다.

발명의 상세한 설명

핵산

핵산은 DNA(게놈 및 cDNA 모두 포함) 및 RNA를 포함한다. 본 발명에 따른 핵산이 RNA를 포함하는 경우, 첨부되는 목록에 나타낸 서열에 대한 언급은 T를 U로 치환한 RNA 동등체에 대한 언급으로 간주되어야 한다.

본 발명의 핵산은 단일 또는 이중 사슬일 수 있다. 본 발명의 단일 사슬 핵산은 안티-센스 핵산을 포함한다. 따라서 서열 번호 1 또는 서열 번호 1을 포함하는 서열 또는 그의 단편에 대한 언급은 상황이 명확하게 반대가 아니라면 상보적인 서열을 포함한다고 이해될 것이다. 서열 번호 3, 5, 6, 7, 8 및 9에 대해서도 동일하게 적용된다.

일반적으로, 본 발명에 따른 핵산은 분리체로서, 분리되고/거나 정제된 형태, 또는 가능한 하나 이상의 발현용 조절 서열을 제외하고 인간 게놈에서의 유전자와 측면으로 접하는 핵산이 없거나 실질적으로 없는 것과 같은, 자연적으로 관련된 물질이 없거나 실질적으로 없는 것으로 제공된다. 핵산은 완전히 또는 부분적으로 합성일 수 있고 게놈 DNA, cDNA 또는 RNA를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 단편인 핵산을 제공한다. 한 면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 서열이나 그것의 상보체의 15 내지 50, 예를 들어 15 내지 35, 18 내지 35, 15 내지 24, 18 내지 30, 18 내지 21 또는 21 내지 24개의 누클레오티드를 필수성분으로하여 구성되는 핵산 프라이머를 제공한다.

용어 "필수성분으로 하여 구성되는"은 추가적인 5' 또는 3' 핵산 서열을 포함하지 않는 핵산을 말한다. 하지만 본 발명의 다른 면에서, 상기에서 정의된 바와 같이 15 내지 30개의 누클레오티드를 필수성분으로 하여 구성되는 본 발명의 핵산은 3'에서 하지만 바람직하게는 5' 말단에서 자연적으로 연결되지 않는 짧은(예를 들어 4 내지 10과 같은 4 내지 15 누클레오티드) 추가적인 서열까지 연결될 수 있다. 이런 추가적인 서열은 바람직하게는 본 발명이 예를 들어 PCR 프라이머로서 사용되는 경우 클로닝을 촉진하는 제한 효소 인식 위치를 포함하는 연결자이다.

본 발명의 프라이머는 바람직하게 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 선택적으로 혼성화될 수 있다. "선택적인"은, 다른 퓨린 수용체를 코딩하는 서열에 관하여 그리고 특히 아데닌 수용체 외의 수용체에 관하여 선택적인 것을 의미한다. 선택적으로 혼성화하는 서열의 능력은 실험이나 계산에 의해 결정될 수 있다.

예를 들어, 프라이머의 Tm을 계산하는 한 방법은 상동성 표적 서열에 대한 프라이머의 Tm을 계산하기한 공식에 대한 언급에 의한다. 공식은 Tm(℃)=2(A+T) + 4(G+C) - 5이다. 이것은 3×SSC 및 0.1% SDS(여기서 SSC는 0.15M NaCl, 0.015M 소듐 시트레이트, pH7)의 조건 하에서의 Tm을 제공할 것이다. 이 공식은 일반적으로 길이가 약 50 누클레오티드까지의 프라이머에 적절하다. 본 발명에 있어서, 이 공식은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 서열로부터 유래된 특이적인 서열에 대한 프라이머의 명목상 Tm을 계산하는 알고리즘으로서 사용될 수 있다. Tm은 이들 다른 서열의 모든 부분에 대한 정합의 최대수에 기초하여, 인간과 랫트의 GPCR 서열에 대한 계산된 Tm과 비교될 수 있다.

표적 서열에 혼성화하는 프라이머에 대한 적절한 조건은 또한 실험적으로 측정될 수 있다. 적절한 실험 조건은 낮은 엄격성의 혼성화 조건 (예를 들어 55℃에 서 6×SSC) 하에서 후보 프라이머를 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 고체 지지체 상의 다른 아데닌 수용체를 코딩하는 핵산에 혼성화하고, 감소된 SSC 및/또는 높은 온도에서, 예를 들어 45℃의 0.2×SSC에서 세척하고, 프라이머가 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 혼성화하지만 핵산을 코딩하는 다른 퓨린 수용체에는 하지 않게 하는 혼성화 조건을 결정하기 위해 점차 혼성화 온도를 증가시키는 것을 포함한다.

본 발명의 핵산, 특히 프라이머는 가시적인 표지를 수반할 수 있다. 적절한 표지는 ³²P 또는 ³⁵S, 형광 표지, 효소 표지 또는 다른 비오틴과 같은 단백질 표지와 같은 방사선 동위원소를 포함한다. 이런 표지는 폴리누클레오티드나 본 발명의 프라이머에 첨가될 수 있고 그 자체가 알려진 기술에 의해 사용하여 검출될 수 있다.

본 발명의 프라이머는 세포 내에서 핵산의 안정성을 향상시키도록 의도되는 변형된 등뼈 구조를 갖는 것과 같은, 합성된 핵산으로 구성될 수 있다. 올리고누클레오티드에 대한 많은 상이한 유형이 본 분야에서 공지이다. 이것들은 메틸포스포네이트 및 포스포로티오에이트 등뼈, 분자의 3' 및/또는 5' 말단에서의 아크리딘이나 폴리리신 사슬의 첨가를 포함한다. 본 발명의 목적을 위하여, 본 명세서에서 기술되는 폴리누클레오티드는 본 분야에서 이용가능한 모든 방법에 의해 변형될 수 있다. 이런 변형은 본 발명의 폴리누클레오티드의 생체내 활성이나 수명을 증가시키기 위하여 수행될 수 있다.

본 명세서에서 기술되는 핵산 서열, 바람직하게는 올리고누클레오티드, 특히 안정화된 올리고누클레오티드 또는 리보자임의 형태에 기초한 안티센스 서열이 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

안티센스 올리고누클레오티드는 주어진 표적 DNA 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 생성을 방해하도록, 핵산, 전-mRNA 또는 성숙 mRNA의 상보적인 서열에 혼성화하도록 디자인될 수 있고, 따라서 그것의 발현은 감소되거나 모두 정지될 수 있다. 리보자임은 바람직하게는 아데닌 결합 GPCR에 특이적인 표적 서열, 즉 다른 GPCR 서열에 공통되지 않는 서열에서, 본 발명의 핵산 서열을 코딩하는 아데닌 결합 GPCR에 의해 코딩되는 mRNA를 쪼개도록 디자인될 것이다. 안티센스 서열의 구성과 그것의 용도는 Peyman and Ulman, Chemical Reviews, 90:543-584, (1990), Crooke, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:329-376, (1992), 및 Zamecnik and Stephenson, P.N.A.S, 75:280-284, (1974)에 기술되어 있다. 리보자임의 구성과 그들의 용도는 예를 들어 Gibson and Shillitoe, Molecular Biotechnology 7(2): 125-137, (1997)에 기술되어 있다.

본 발명의 안티센스 및 리보자임 서열은 예를 들어 이 유전자의 하부-조절을 유발하고 표현형 효과를 관참함으로써, 아데닌 결합 GPCR의 기능을 연구하거나 아데닌 결합 GPCR과 관련된 본 명세서에서 기술하는 단백질의 발현이나 위치를 연구하기 위한 배지에서 포유류 세포주로 도입시킬 수 있다. 아데닌 결합 GPCR의 비정상적인 발현이 발생하는 세포에서, 이런 안티센스 및 리보자임 서열은 유전자의 발현을 하류-조절하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 GPCR의 cDNA 서열은 표준 PCR (중합체 연쇄 반응) 클로닝 기술을 사용하여 클로닝될 수 있다. 이것은 서열 번호 1의 반대쪽 사슬 상에서 5' 및 3' 말단에 대한 한 쌍의 프라이머를 제작하고, 이 프라이머를 포유류 피질 세포로부터 얻은 mRNA 또는 cDNA와 접촉시키고, 원하는 부위의 증폭을 야기하는 조건 하에서 중합효소 연쇄 반응을 수행하고, (예를 들어 반응 혼합물을 아가로스 겔 상에서 정제함으로써) 증폭된 단편을 분리하고 증폭된 DNA를 회수하는 것을 포함한다. 프라이머는 적절한 제한 효소 인식 위치를 포함하도록 디자인될 수 있고 따라서 증폭된 DNA는 적절한 클로닝 벡터로 클로닝될 수 있다. 서열 번호 3, 5, 6, 7, 8 및 9에도 동일하게 적용한다.

서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 서열에 100% 상동이지는 않지만 서열 번호 2나 서열 번호 4 또는 본 발명의 다른 폴리펩티드를 코딩하는 폴리누클레오티드를 여러 방법으로 얻을 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 서열의 위치 지시된 돌연변이유발이 수행될 수 있다. 이것은 예를 들어 침묵 코돈 변화가 폴리누클레오티드 서열이 발현되는 특정 숙주 세포에 대한 코돈 선호를 최적화하는 서열에 대해 필요한 것에 유용하다. 다른 서열 변화를 제한 효소 인식 위치를 도입시키기 위해서 또는 폴리누클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 특성이나 기능을 변경시키기 위하여 원할 수 있다. 추가의 변화는 예를 들어, 보존성 치환을 제공하는데 필요한 특정 코딩 변화를 나타내기 위하여 바람직할 수 있다.

본 발명의 핵산은 5' 또는 3' 말단에서의 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 합성 또는 자연 5' 선도 서열은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 결합할 수 있다. 추가적인 서열은 특정 숙주 세포에서 본 발명의 핵산의 전사에 필요한 5' 또는 3'의 번역되지 않은 부위를 또한 포함할 수 있다.

또한, 다른 동물 특히 포유류(예를 들어 인간이나 토끼), 보다 특히 인간을 포함하는 영장류에서 아데닌 결합 GPCR의 상동체가 획득될 수 있다. 이런 서열은 세포나 조직을 분리하여 제조되는 cDNA 라이브러리 또는 다른 동물 종으로부터의 게놈 DNA 라이브러리를 제조하거나 획득하고, 중간 내지 고도로 엄격한 조건 하에서 (예를 들어 약 50℃ 내지 약 60℃에서 0.03M 염화나트륨 및 0.03M 시트르산염 나트륨) 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 전부 또는 부분을 포함하는 프로프보 이런 라이브러리를 조사하여 얻어진다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 분리된 DNA 서열로 연장되지만 코딩 서열은 둘 이상의 (바람직하게는 5개 이하, 예를 들어 4 또는 3) 엑손으로 나뉜다. 이런 엑손 서열은 자연적이고 게놈 클론으로부터 얻거나 합성될 수 있다. 엑손 서열은 서열이 하나 이상의 엑손 서열에 의해 방해되는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 소형유전자 서열의 제조에서 사용될 수 있다.

소형유전자는 또한 모든 진핵 소스로부터 유도되는, 헤테로 엑손을 상용하여 제조될 수 있다.

완전한 길이의 코딩 서열이나 올리고누클레오티드 프로브나 프라이머와 같은, 본 발명에 따른 핵산은 키트의 부분으로서, 예를 들어 내용물이 외부 환경으로부터 보호되는 작은병과 같은 적절한 용기 내에서 제공될 수 있다. 키트는 예를 들어 PCR 및/또는 시험 샘플에서 관심의 핵산의 존재를 결정하는 방법에서, 핵산의 사용에 대한 설명서를 포함할 수 있다. PCR에서 사용되도록 의도된 핵산이 있는 키트는 중합효소, 누클레오시드, 완충액 등과 같은 반응에 필요한 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다.

본 발명의 핵산은 랫트, 인간 또는 다른 포유류 몸이나 그것에서 얻은 샘플에서 서열을 코딩하는 아데닌 결합 GPCR을 검출하기 위한 핵산-기초한 시험에 사용될 수 있다. 검출의 경우, 이것은 DNA 칩 상의 마이크로어레이 기술과 같은 방법을 포함하는 정성적이고/거나 정량적일 수 있다. 검출은 전체로 또는 부분으로 유전자를 시퀀싱하는 것을 포함하는 것과 같은 분석적 단계를 포함한다.

검출을 위한 이런 시험은 일반적으로 혼성화 조건 하에서 DNA 또는 RNA를 포함하는 인간 샘플을 본 발명의 핵산이나 본 발명의 프라이머를 포함하는 프로브와 접촉시키고 샘플 내의 프로브와 핵산 간에 형성된 모든 이중 사슬을 검출하는 것을 포함한다. 이런 검출은 PCR과 같은 기술을 이용하거나 고체 지지체 상의 프로브를 고정하고, 프로브와 혼성화되지 않는 샘플내의 핵산을 제거하고, 다음 프로브에 혼성화하는 핵산을 검출함에 의해 달성될 수 있다. 또한, 샘플 핵산은 고체 지지체 상에 고정될 수 있고, 이런 지지체에 결합하는 프로브의 양이 검출될 수 있다. 이 모든 다른 형식의 적절한 분석 방법이 예를 들어 WO89/03891 및 WO90/13667에서 발견될 수 있다.

본 발명에 따른 다른 검출 방법은 예를 들어 단일 사슬 형태적 다형성(SSCP) 분석을 사용하는, 단일 염기 변화를 포함하는, 야생형 아데닌 결합 GPCR 유전자에 대한 변화를 검출하는 것이다. 샘플 내의 DNA 또는 RNA를 코딩하는 아데닌 결합 GPCR의 모두 또는 부분으로부터의 핵산 서열은 참조 서열에 혼성화될 수 있고, 하이브리드의 이동성은 이중사슬 내의 모든 비혼성화된 지역이 이동성에서 변화를 일으키는 조건 하에서 겔 내에서 하이브리드의 이동성을 관찰한다.

본 발명의 핵산은 피질, 후근, CNS 및 PNS 및 다른 조직에서의 이 유전자의 분포의 지식을 확인하고 연장하는, 조직 분포 연구에서 또한 유용하다.

폴리펩티드

본 발명의 분리된 폴리펩티드는 분리형으로 상기에서 정의된 바와 같은 것이고, 세포에서 발견되는 다른 폴리펩티드와 자연적으로 연관된 물질이 없거나 실질적으로 없다. 폴리펩티드는 물론 희석제나 애쥬번트와 함께 제제화될 수 있고 또한 실용적 목적을 위하여 분리될 수 있고-예를 들어 폴리펩티드는 면역분석에서 사용하기 위해 마이크로티터 플레이트를 코팅하는데 사용된다면 젤라틴이나 다른 담체와 함께 보통 혼합된다. 폴리펩티드는 자연적으로 또는 이종 진핵 세포 시스템에 의해 글리코실화될 수 있거나, 그것들은 (예를 들어 원핵 세포에서 발현에 의해 생성될 수 있다면) 비글리코실화될 수 있다. 폴리펩티드는 인산화 및/또는 아세틸화될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 또한 실질적으로 정제형일 수 있고, 이 경우 그것은 일반적으로 제조에서 90% 이상, 예를 들어 95%, 98% 또는 99%의 폴리펩티드가 본 발명의 폴리펩티드인 제조에서의 폴리펩티드를 포함할 것이다.

본 발명의 폴리펩티드는 예를 들어 그것의 정제를 돕기 위한 히스티딘 잔기의 첨가에 의해 또는 세포로부터의 그들의 분비를 촉진시키기 위한 단일 서열의 첨가에 의해 변형될 수 있다.

서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 대해 적어도 50%, 예를 들어 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열 변이체, 대립유전자, 유도체 또는 돌연변이체인 폴리펩티드일 수 있고 또한 본 발명에 의해 제공된다. 예를 들어 이런 폴리펩티드는 하나 이상의 (예를 들어 1 내지 20, 예를 들어 2, 3, 4 또는 5 내지 10) 아미노산의 하나 이상의 첨가, 치환, 삭제 및 삽입에 의해 서열 번호 2 내지 서열 번호 4에서 주어진 것과 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 폴리펩티드 서열의 퍼센트 상동성은 참조 서열(예를 들어 본 발명의 서열 번호 2 또는 서열 번호 4)를 의문 서열과 비교하는 상업적으로 이용가능한 알고리즘을 사용하여 계산될 수 있다. 상동성을 평가하는 다른 상세는 하기에 기술되어 있다.

본 연구에서, 누클레오티드 서열 번호 2는 공지의 리간드와 관련된 GPCRs이 발견될 수 있을지를 결정하는 BLAST(Altschul et al., 1997) 조사에 의해 분석되었다. 하지만, 검색된 이 오어펀(orphan) GPCR의 가장 가까운 상동체는 오어펀 GPCRs 자체였다. 이들은 랫트 아데닌 결합 GPCR과 약 50%의 공통 잔기를 갖는 배근 신경절로부터 클로닝된 인간 GPCRs의 패밀리이다(Derwent sequence database accession number z10067, z10069, z10070, z10071 및 z10072). 이제 본 발명은 이 6개의 오어펀 GPCRs을 6개의 랫트 아데닌 결합 GPCR의 인간 상도체로서 동정하였다. 이 6개의 상동체는 각각 인간 아데닌 결합 GPCR 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로 명명되었다. 다음으로 가장 가까운 상동체는 아데닌 결합 GPCR과 33%의 잔기를 공유하는 마스(mas) 관련된 유전자이다.

의문 서열이 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 그것에 대해 아데닌 결합 수용체 활성을 보유하는 폴리펩티드의 그것인 적어도 50% 및 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%의 상기 서열의 상동성을 갖는지를 결정하는데 있어서, 이런 서열은 본 발명의 부분을 형성한다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 예를 들어 코딩된 핵산으로부터 발현에 의한 생성 후에 분리되고/거나 정제될 수 있다. 분리되고/거나 정제된 폴리펩티드는 조성물의 제제로 사용될 수 있고, 이것은 적어도 하나의 추가 구성성분, 예를 들어 약제학적으로 허용가능한 부형제, 운반체나 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 면역원으로서 또는 다르게는 특이적인 항체를 얻는데 사용될 수 있다. 항체는 정제와 다른 폴리펩티드의 조작, 진단 스크리닝과 치료학적 내용에서 유용하다. 이것은 하기에서 추가로 논의된다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 그것에 결합하거나 그것의 작용이나 기능을 조절하는 분자를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 이런 분자는 치료학적(가능하게는 예방적을 포함) 용도에 유용하다.

본 발명의 폴리펩티드는 보이는 표지로 표지화될 수 있다. 보이는 표지는 폴리펩티드를 검출하도록 하는 모든 적절한 표지일 수 있다. 적절한 표지는 방사동위원소, 예를 들어 ¹²⁵I, 효소, 항체, 폴리누클레오티드 및 바이오틴과 같은 링커를 포 함한다. 본 발명의 표지된 폴리펩티드는 샘플 내에서 본 발명의 폴리펩티드의 양을 결정하기 위한 면역분석과 같은 진단학적 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드나 표지된 폴리펩티드는 또한 표준 프로토콜을 사용하는 동물이나 인간에서의 상기 폴리펩티드에 대한 면역 작용성의 검출을 위한 혈청학적 또는 세포 매개된 면역 분석에서 사용될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 또는 표지된 폴리펩티드 또는 그의 단편은 또한 고체상, 예를 들어 면역 분석 웰이나 딥스틱의 표면에 고정될 수 있다.

이런 표지되고/거나 고정된 폴리펩티드는 적절한 시약, 대조군, 지시 등과 함께 적절한 용기내의 키트로 포장될 수 있다.

이런 폴리펩티드와 키트는 면역 분석에 의한 샘플이나 활성 부위에 존재하는 이런 폴리펩티드에 대한 항체의 검출 방법에서 사용될 수 있다.

면역분석 방법은 본 분야에서 주지이고 일반적으로:

(a) 상기 단백질에 대한 항체에 의해 결합가능한 항원결정기를 포함하는 폴리펩티드를 제공하고;

(b) 항체-항원 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에서 생물학적 샘플을 상기 폴리펩티드와 배양하고;

(c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 항원-항체 복합체가 형성되는지 여부를 결정하는 것을 포함한다.

서열 상동성

핵산 및 폴리펩티드 서열의 퍼센트 동일성은 참조 서열을 의문 서열과 비교하는 상업적으로 이용가능한 알고리즘을 사용하여 계산될 수 있다. 하기 프로그램(National Center for Biotechnology Information에 의해 제공됨)은 상동성/동일성을 결정하기 위하여 사용될 수 있다: BLAST, gapped BLAST, BLASTN 및 PSI-BLAST, 이것은 디폴트 파라미터와 함께 사용될 수 있다.

알고리즘 GAP (Genetics Computer Group, Madison, WI)은 정합의 수를 최대화하고 차이의 수를 최소화하는 2개의 완전한 서열을 정렬하는 Needleman 및 Wunsch 알고리즘을 사용한다. 일반적으로, 차이 생성 패널티 = 12 및 차이 연장 패널티 = 4를 갖는, 디폴트 파라미터가 사용된다.

핵산 서열이나 그의 부위와 의문 서열 간의 최고의 전체 정합을 결정하기 위한 다른 방법은 Brutlag et al (Comp. App. Biosci., 6; 237-245 (1990))에 기초한 FASTDB 컴퓨터 프로그램의 용도이다. 프로그램은 전체적 서열 정열을 제공한다. 상기 전체 서열 정열의 결과는 퍼센트 동일성 내이다. 퍼센트 동일성을 계산하기 위한 DNA 서열의 FASTDB 조사에서 사용되는 적절한 파라미터는: Matrix=Unitary, k-tuple=4, Mismatch penalty=1, Joining Penalty=30, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=1, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty=0.05, and Window Size=500 또는 누클레오티드 염기 내의 의문 서열 길이 중 짧은 것. 아미노산 정렬의 퍼센트 동일성 및 유사성을 계산하기 위한 적절한 파라미터는: Matrix=PAM 150, k-tuple=2, Mismatch Penalty=1, Joining Penalty=20, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=1, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty=0.05, 및 Window=500 또는 누클레오티드 염기 내의 의문 서열 길이 중 짧은 것.

항체

본 발명의 폴리펩티드의 제공은 특이적인 방법으로 랫트나 인간 아데닌 결합 GPCR과 결합할 수 있는 항체의 생성을 가능하게 한다. 따라서 본 발명은 특이적으로 본 발명의 폴리펩티드와 결합할 수 있지만 다른 퓨린성 GPCRs에 결합할 수 없는 항체를 제공한다. 이런 항체는 본 발명의 폴리펩티드에 대하여 다른 퓨린성 GPCRs보다 적어도 100배, 바람직하게는 적어도 1000배의 친화성을 갖는다. 이런 항체는 다른 GPCRs에 존재하지 않는 본 발명의 폴리펩티드의 항원결정기를 사용하여 생성될 수 있다. 이런 항원결정기는 본 발명의 폴리펩티드와 다른 퓨린성 GPCR 서열 간의 차이점을 찾아서 결정될 수 있다.

항체는 본 분야에서 표준인 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 항체를 생산하는 방법은 포유류(예를 들어 마우쓰, 랫트, 토끼)를 본 발명의 폴리펩티드에 대한 면역성을 주는 것을 포함한다. 항체는 본 분야에서 공지인 모든 다양한 기술을 사용하여 면역화된 동물로부터 얻을 수 있고 바람직하게는 관심의 항원에 대한 항체의 결합을 사용하여 스크리닝 할 수 있다. 웨스턴 블랏팅 기술이나 면역침전법이 사용될 수 있다(Armitage et al, Nature, 357:80-82, 1992).

동물을 펩티드로 면역화하는데 대한 대용물이나 보충물로서, 단백질에 특이적인 항체는 예를 들어, 표면에 기능적 면역글로불린 결합 부위를 나타내는 람다 박테리오파지 또는 필라멘트성 박테리오파지를 이용하여 발현된 면역글로불린 변이가능한 부위의 재조합으로 생성된 라이브러리로부터 얻을 수 있다; 예를 들어 WO92/01047 참조.

본 발명에 따른 항체는 많은 방법으로 변형될 수 있다. 실제로 용어 "항체"는 필요한 특이성을 갖는 결합 부위를 갖는 모든 결합 물질을 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 따라서 본 발명은 합성 분자 및 항원이나 항원결정기에 결합하게 하는 항체의 그것을 모방하는 모양을 갖는 분자를 포함하는, 항체 단편, 유도체, 기능적 균등체와 항체의 상동체를 포괄한다.

항원이나 다른 결합 파트너와 결합할 수 있는 항체 단편의 예는 VL, VH, C1 및 CH1 부위로 구성되는 Fab 단편; VH 및 CH1 부위로 구성되는 Fd 단편; 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 부위로 구성되는 Fv 단편; 분리된 CDR 부위 및 연결 부위에 이황산 브리지에 의해 연결되는 2개의 Fab 단편을 포함하는 F(ab')2 단편, 2가 단편이다. 단일 사슬 Fv 단편이 또한 포함된다.

샘플 상의 항체의 반응성은 모든 적절한 방법에 의해 결정될 수 있다. 개별적 리포터 분자로 꼬리표 달기는 한가지 가능한 방법이다. 리포터 분자는 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 및 바람직하게는 측정가능한 신호를 생성한다. 리포터 분자의 연결은 직접적이거나 간접적, 펩티드 결합을 통한 공유 또는 비공유일 수 있다. 펩티드 결합을 통한 결합은 항체와 리포터 분자를 코딩하는 유전자 융합의 재조합 발현의 결과일 수 있다.

결합을 결정하는 방식은 본 발명의 특징이 아니고 본 분야의 당업자는 그들의 선호와 일반적인 지식에 따라 적절한 형식을 선택할 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 예를 들어 논의된 세포나 세포 용해질을 포함하는 시험 샘플 내에서, 폴리펩티드의 존재를 스크리닝하는데 사용될 수 있고, 예를 들어 핵산의 코딩으로부터의 발현에 의한 하기의 폴리펩티드의 생성인, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 정제하고/거나 분리하는데 사용될 수 있다. 그 폴리펩티드가 개체에서 해로운 효과를 가진다면, 항체는 그들이 결합하는 폴리펩티드의 활성을 조절할 것이고, 치료학적 내용에서 유용할 수 있다(예방을 포함할 수 있음).

항체는 예를 들어 시험 샘플에서 특정 물질의 존재를 결정하는데 있어서, 항체의 용도에 대한 지시를 포함할 수 있는, 키트로서 제공될 수 있다. 표지 분자, 완충 용액, 용출액 등과 같은 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다. 시약은 봉합된 작은병과 같은, 외부 환경으로부터 보호하는 용기 내에서 제공될 수 있다.

벡터

본 발명의 핵산 서열은 벡터, 특히 발현 벡터로 도입될 수 있다. 벡터는 호환성 숙주 세포내의 핵산을 복제하는데 사용될 수 있다. 따라서 다른 예에서, 본 발명은 본 발명의 폴리누클레오티드를 복제가능한 벡터에 도입하고, 벡터를 호환 숙주 세포에 도입하고, 벡터의 복제를 가능케 하는 조건 하에서 숙주 세포를 성장시켜 본 발명의 제조 방법을 제공한다. 벡터는 숙주 세포로부터 회수될 수 있다. 적절한 숙주 세포는 발현 벡터와 관련하여 하기에서 기술한다.

바람직하게는, 벡터내의 본 발명의 폴리누클레오티드는 숙주 세포에 의해 코딩 서열의 발현을 제공할 수 있는 대조 서열에 작용 가능하게 연결되고, 즉 벡터는 발현 벡터이다.

용어 "작동 가능하게 연결된"은 기술된 구성성분이 그들의 의도된 방법으로 기능하게 하는 관계에 있는 것을 말한다. 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 대조 서열은 대조 서열과 호환하는 조건 하에서 코딩 서열의 발현이 달성되는 방법으로 연결된다.

적절한 벡터는 프로모터 서열, 종결 단편, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 표지 유전자 및 다른 적절한 서열을 포함하는, 적절한 조절 서열을 포함하여 선택 되거나 구성될 수 있다. 벡터는 플라스미드, 바이러스 예를 들어 파지, 파지미드 또는 배큘로바이러스, 코스미드 YACs, BACs, 또는 적절한 PACs일 수 있다. 벡터는 유전자 치료 벡터, 예를 들어 아데노바이러스, 아데노-관련된 바이러스, 리트로바이러스(예를 들어 HIV 또는 MLV) 또는 알파 바이러스 벡터에 기초한 벡터를 포함한다.

벡터에 복제 기원, 임의로 상기 폴리누클레오티드의 발현에 대한 프로모터 및 임의로 프로모터의 조절자를 제공할 수 있다. 벡터는 하나 이상의 선택가능한 표지 유전자, 예를 들어 포유류 벡터에 대한 박테리아 플라스미드 또는 네오마이신 내성 유전자의 경우 앰피실린 내성 유전자를 포함한다. 벡터는 예를 들어 RNA의 생성을 위하여 시험관 내에서 사용될 수 있거나 숙주 세포를 형질감염하거나 트렌스펙션하는데 사용될 수 있다. 벡터는 예를 들어 유전자 치료 방법에서, 생체내에서 사용하는데 또한 적용될 수 있다. 매우 다양한 숙주 세포에서 폴리펩티드의 클로닝과 발현을 위한 시스템은 주지이다. 적절한 숙주 세포는 박테리아, 포유류와 효모와 같은 진핵 세포 및 배큘로바이러스 시스템을 포함한다. 이성 폴리펩티드의 발현을 위한 본 분야에서 이용가능한 포유류 세포주는 중국 햄스터 난소 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 세포, COS 세포 및 많은 다른 것들을 포함한다.

프로모터 및 다른 발현 조절 신호는 발현 벡터가 디자인되는 숙주 세포와 호환가능하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 효모 프로모터는 S. cerevisiae GAL4 및 ADH 프로모터, S. pombe nmt1 및 adh 프로모터를 포함한다. 포유류 프로모터는 카드뮴과 같은 중금속에 반응하여 유도될 수 있는 메탈로티오네인 프로모터를 포함한 다. SV40 대형 T 항원 프로모터 또는 아데노바이러스 프로모터와 같은 바이러스 프로모터는 또한 사용될 수 있다. 이런 모든 프로모터는 본 분야에서 쉽게 이용가능하다.

벡터는 삽입된 핵산, 핵산 서열의 발현을 하게 하는 프로모터나 인핸서와 같은 다른 서열을 포함할 수 있고 따라서 폴리펩티드는 분비 신호를 코딩하는 융합 및/또는 핵산으로서 생성되고 따라서 숙주 세포에서 생성된 폴리펩티드는 세포로부터 분비된다.

유전자 치료에서의 사용을 위한 본 발명의 폴리펩티드의 생성을 위한 벡터는 본 발명의 소형유전자 서열을 운반하는 벡터를 포함한다.

다른 자세한 것을 위하여, 예를 들어, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press 참조. 예를 들어 핵산 구성의 제조, 돌연변이유발, 시퀀싱, DNA를 세포에 도입 및 유전자 발현, 및 단백질의 분석에서 핵산의 조작을 위한 많은 공지의 기술과 프로토콜은 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. des., John Wiley & Sons, 1992에 상세하게 설명되어 있다.

벡터는 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 제공하기 위해 상기의 적절한 숙주 세포로 형질전환될 수 있다. 따라서 다른 면에서 본 발명은 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 서열의 벡터에 의해 발현을 제공하는 조건 하에서 상기의 발현 벡터로 형질전환이나 트랜스펙션된 숙주 세포를 배양하고, 발현된 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 폴리펩티드는 또한 망상적혈구 용해질과 같은, 시험관내 시스템에서 발현된다.

본 발명의 다른 예는 본 발명의 폴리펩티드의 복제와 발현을 위한 벡터로 형질전환되거나 트랜스펙션된 숙주 세포를 제공한다. 상기 세포는 상기 벡터와 호환가능한 것으로 선택될 것이고 예를 들어 박테리아, 효모, 곤충이나 포유류일 수 있다. 숙주 세포는 유전자의 발현을 위한 조건 하에서 배양될 수 있고, 따라서 코딩된 폴리펩티드가 생성된다. 만약 폴리펩티드가 적절한 신호 선도 펩티드와 커플되어 발현된다면 그것은 세포로부터 배양 배지로 분비될 것이다. 예를 들어 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제, 운반체 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물과 같은, 하나 이상의 첨가 구성성분을 포함할 수 있는 조성물의 제형화에서, 발현에 의한 생성 후에, 폴리펩티드는 숙주 세포 및/또는 배양 배지로부터 분리되고/거나 정제될 수 있고, 경우가 그럴 수 있고, 이어서 원하는데로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 폴리누클레오티드는 또한 안티센스 RNA나 리보자임의 생성을 제공하기 위하여 안티센스 기원으로 상기의 벡터로 첨가될 수 있다.

분석

본 발명은 또한 본 발명의 아데닌 결합 GPCR 폴리펩티드와 상호작용할 수 있는 화합물의 분석법을 제공하고, 이 분석은 본 발명에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 G 단백질 커플된 수용체를 제공하고, 수용체를 추정되는 결합 화합물과 접촉시키고; 상기 화합물이 상기 수용체와 상호결합할 수 있는지를 결정하는 것을 포함한다.

분석의 한 예에서, 수용체 또는 수용체의 서브유닛은 결합 분석에 사용될 수 있다. 결합 분석은 경쟁성 또는 비경쟁성일 수 있다. 이런 분석은 어떤 화합물이 폴리펩티드에 결합할 수 있는지를 결정하는 매우 많은 화합물의 신속한 스크리닝을 제공할 수 있다. 이어서, 보다 상세한 분석은 이런 화합물이 본 발명의 폴리펩티드의 효능제(agonist) 또는 길항제(antigonist)로서 작용하는지 여부를 추가로 결정하기 위하여, 결합하는 것으로 밝혀진 그 화합물로 수행될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 수용체의 활성을 조절하는 화합물을 동정하기 위한 생분석을 제공한다. 한 예에서, 생분석은 내인성 GPCRs 및 G 단백질을 대치하는 본 발명의 GPCRs 및 랫트나 인간 G 단백질로 처리한, 사카로마이스 세레피시아(Saccharomyces cerevisiae) 세포를 사용하여 조작되는데, 그것은 보통 효모 세포의 접합과 짝짓기에 필요한 페로몬 경로로서 기능한다. 활성화 리간드 (성장 정지)에 반응하는 보통의 효모는 양성 성장으로 전환되도록 조작된다. 이런 조작으로, 효모 세포는 GPCR의 활성화를 나타내는 성장을 갖는, 본 발명의 GPCRs에 대한 효능제와 길항제를 동정하기 위한 기능 분석에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 생분석은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 GPCR을 발현하는 이런 효모 세포를 적어도 하나의 잠재적인 효능제와 결합시키고 그 이후에 성장 활성의 변화를 위해 세포를 모니터링하여 수행된다. 또 다른 예에서, 생분석은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 수용체를 발현하는 이런 효모 세포를 아데닌과 같은 공지의 효능제의 일정한 양에 결합시키고 적어도 하나의 잠재적인 길항제의 양을 증가시키고 그 이후에 성장 변화를 위해 세포를 모니터링하여 수행된다.

본 발명은 또한 아데닌 결합 GPCR 유전자의 조절 부위를 조절하는 화합물을 동정하기 위한 생분석을 제공한다. 이런 분석은 본 발명의 (바람직하게는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의) 폴리펩티드를 발현할 수 있는 랫트나 인간 세포를 이용하여 수행된다. 세포는 조절 부위를 조절하는 상기 화합물의 능력이 공지인 하나 이상의 화합물과 접촉한다. 이후에, 세포는 본 발명의 핵산의 발현을 위해 모니터링된다. 또한, 사용되는 리포터 유전자는 예를 들어 클로르암페니콜 아세틸트렌스퍼라제 유전자, 루시퍼라제 유전자 등을 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드의 "활성을 조절하는" 화합물이나 신호는 폴리펩티드의 활성을 변경하여 그것이 화합물이나 신호가 없을 때에 비해 화합물이나 신호가 있을 때 다르게 행동하는 화합물이나 신호를 말한다. 조절에 영향을 주는 화합물은 효능제와 길항제를 포함한다. 효능제는 아데닌 결합 GPCR 기능을 활성화하는 아데닌과 같은 화합물을 포함한다. 또한, 길항제는 아데닌 결합 GPCR 기능을 방해하는 화합물을 포함한다. 전형적으로, 길항제의 효능은 효능제-유도된 수용체 활성을 억제하는 것으로 관찰된다. 길항제는 경쟁적 및 비경쟁적 길항제를 포함한다. 경쟁적 길항제(또는 경쟁적 블록커)는 효능제 결합에 특이적인 사이트나 근처와 상호작용한다. 비경쟁적 길항제 또는 블록커는 효능제 상호작용 위치 외의 위치와 상호작용하여 수용체의 기능을 불활성화시킨다. 하기와 같이, 구아닌은 이 수용체에 약한 길항제 효능을 갖는다.

본 분야의 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드와 같은 수용체의 활성을 조절하는 화합물을 동정하기 위한 생분석 방법은 일반적으로 대조 구와의 비교를 필요로 한다. 한 유형의 "대조구"는 "대조구" 세포나 배지가 화합물에 노출되지 않는 차이점을 갖는, 화합물에 노출된 시험 세포나 시험 배지와 실질적으로 동일하게 처리된 세포 또는 배지이다. 다른 유형의 사용되는 "대조구" 세포나 배지는 "대조구" 세포나 배지가 기능적 아데닌 결합 GPCR을 발현하지 않는 점을 제외하고, 트랜스펙션된 세포와 동일한 세포 또는 배지이다. 따라서, 트랜스펙션된 세포의 반응은 동일한 반응 조건 하에서 동일한 화합물에 대한 "대조구" 세포나 배지의 그것과 비교될 수 있다.

특히 바람직한 유형의 분석은 하기와 같이 수행될 수 있는 결합 분석 및 기능 분석을 포함한다:

결합 분석

세포주에서(포유류 HEK 293 세포, CHO 세포 및 Sf9 곤충 세포를 포함) 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 과발현은 리간드 결합 연구에 대해 상기 폴리펩티드를 포함하는 막 제조를 생성하는데 사용될 수 있다(이 섹션에서는 편의상 아데닌 결합 GPCR이라고 언급함). 이 막 제조는 방사-표지된 퓨린성 리간드([2-³H 아데닌 (Amersham, TRk311 및 8-³H 아데닌 (Amersham, TRK343] 포함)의 결합과 결합 위치에 대한 경쟁자에 의한 이런 방사-리간드의 치환을 검출하기 위하여 통상적인 필터-결합 분석 (예를 들어 브란델 필터 분석 장치 사용) 에서 또는 고처리 신틸레이션 근접 유형 결합 분석(SPA 및 시토스타-T 플래쉬플레이트 기술; Amersham Pharmacia Biotech)에서 사용될 수 있다. 방사활성도는 96-, 384-, 1536-마이크로 티터 웰 포맷으로부터 신속한 측정을 할 수 있는, Packard Topcount나 비슷한 장비로 측정될 수 있다. SPA/Cytostar-T 기술은 특히 고처리 스크리닝에 익숙하고 따라서 이 기술은 표준 리간드를 치환할 수 있는 화합물의 스크린으로서의 용도에 적합하다.

원래 상황에 접근하는 환경에서 리간드의 아데닌 결합 GPCR 단백질에의 결합을 연구하는 다른 접근은 비아코어 장치(Biacore)에 의해 활용되는 표면 플라스몬 공명 효과를 이용한다. 막 제조 또는 전체 세포에서 아데닌 결합 GPCR은 비아코어의 바이오센서 칩체 결합될 수 있고, 결합 위치에 대한 경쟁자를 동정하기 위해 화합물의 존재 쪼는 부존재하에 리간드 결합이 시험된다.

기능 분석

아데닌 결합 GPCR은 보통 GIRK(내부 수정 칼륨 채널)과 상호작용하는, G_i 또는 G_o (억제성 G 단백질)를 통해 작용하기 때문에, 칼륨 이온 유동은 이 수용체들의 활성화를 야기한다. 이 이온의 유동은 특정 화합물의 효능제 또는 길항제 효능을 결정하기 위한 다양한 기술을 사용하여 실시간으로 측정될 수 있다. 따라서, 세포주 또는 예를 들어 Xenopus 난모세포에서 발현되는 재조합 아데닌 결합 GPCR 수용체는 관심의 화합물의 작용 기작을 결정하는 전체 세포 및 단일 채널 전기생리학을 사용하여 특징화될 수 있다. 아데닌 결합 GPCR에서 활성인 화합물에 대한, 전기생리학적 스크리닝은 통상적인 전기생리학적 기술 및 이용가능한 경우에는 최근에 개발 중인 고 처리 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

형광 - 칼슘 및 나트륨 유동은 플루오-3, 플루오-4, 플루오-5N, 푸라 레드, 소듐 그린, SBFI 및 분자 프로브를 포함하는 공급자로부터의 다른 유사한 프로브를 포함하는, 몇개의 이온-민감성 형광 염색제를 사용하여 측정가능하다. 아데닌 결합 GPCR의 결과로서의 칼슘 및 나트륨 유입은 따라서 이미지 분석 알고리즘과 함께 레이저 공촛점 방법과 함께 또는 없이 형광 마이크로스코피를 포함하는, 형광계 및 형광 이미징 기술을 사용하여 실시간으로 특징화될 수 있다.

다른 접근은 칼슘 트랜션트(transient)에 영향을 주는 효능제 또는 조절제로서 활성인 화합물에 대한 고 처리 스크리닝 분석이다. 이 분석은 형광 이미지 플레이트 판독기((FLIPR^R), Molecular Devices Corporation)라고 불리는 장치 주위에 기초한다. 그것의 가장 일반적인 형상에서, 그것은 형광에 기초한 염색제에 의해 방사되는 형광을 자극하고 측정한다. 그것은 형광체의 488nm에서 강력한 자극을 생성하는 아르곤-이온 레이저, 96-/384-웰 플레이트의 바닥 상을 신속하게 검색하는 광학 시스템 및 방사된 형광을 포획하는 민감하고, 냉각된 CCD 카메라를 사용한다. 그것은 기구가 시험약의 용액을 96-/384-웰 플레이트의 웰에 운반하게 하는 96-/384-웰 피펫팅 헤드를 포함한다. FLIPR 분석은 모든 96-/384-웰로부터 동시에, 실시간으로, 화합물의 첨가 전, 중 및 후에 세포의 군집으로부터 형광 신호를 측정하도록 디자인된다. FLIPR 분석은 세포주에서 발현되는, 재조합 아데닌 결합 GPCR, 예를 들어 랫트 또는 인간 아데닌 결합 GPCR에서 기능적으로 활성인 화합물을 스크리닝하고 묘사하는데 사용될 수 있다. 하기와 같이, 아데닌 결합 GPCR로 트랜스펙션된 세포에서 칼슘 트랜션트는 수용체의 자연적인 리간드를 결정하기 위하여 다양한 기질에 의한 수용체의 활성을 측정하기 위하여 FLIPR 분석을 사용하여 측정되었다.

본 발명의 폴리펩티드의 활성을 조절하는 것으로 밝혀진 화합물은 많은 치료학적 용도를 포함한다. BLAST 조사로부터 명백한 것과 같이 아데닌 결합 GPCR은 아데닌과 유사한 활성화된 구조인 GPCRs의 공지의 서브패밀의 어떤 것에도 속하지 않는다. 이것은 퓨린성이 현재까지 적용된 상이한 치료학적 분야에 대한 신규의 약리학을 개발하는 것이 가능할 퓨린성 GPCRs의 새로운 서브그룹의 멤버임을 제안한다. 특히, 이것은 세포사멸에 관련된 질병(Chow et al., 1997), 병리학적 진전(Mally and Stone, 1996), 침해수용(Burnstock, 1997)을 포함한다. 퓨린성 화합물은 또한 항경련제, 진정제, 마취제, 실조(CNS), 저혈압제, 항부정맥제, 음성 심박수변동제, 변전도제, 수축촉진제, 혈소판 응집의 억제제, 심장혈관계에서 혈관 내피 세포에 의한 NO 생성의 자극제 및 위액 분비의 억제제로서의 용도로 제안되었다(Gil-Rodrigo et al, Pharmacol. Res. 22(2):103-13, 1990). 유전자 변형 동물에 기초한 추가의 연구는 이 패밀로부터의 수용체가 기관지수축, 혈관확장, 염증 및 신경전달물질의 촉진에서 역할을 수행한다(Nyce, 1999). 요약하면 아데닌 결합 GPCR 및 관련된 수용체는 다양한 치료학적 분야에서 약물 개발을 위한 중요한 도구로서 사용될 수 있다.

아데닌 자체가 이 수용체에 대한 자연적인 리간드로서 작용하는 추가적인 설명은 상기 질병의 치료의 개발에서 아데닌 및 아데닌을 모방하거나 길항하는 화합물의 용도의 가능성을 연다.

조직 분포 연구

아데닌 결합 GPCR DNA 서열은 인간 건강과 질병에서 혼성화/PCR 연구에 의한 이 GPCR의 분포의 지식을 확인하고 연장하는데 유용하다. 세포주에서 재조합 아데닌 결합 GPCR은 아데닌 결합 GPCR 기능을 묘사하는데 유용하고 다양한 생화학 및 생물리학적 방법이 이 수용체를 분석하는데 유용하다. 본 명세서에서 설명되는 본 발명의 분석은 또한 약물 발견 스크리닝 목적에 대해 유용하다.

결합제

따라서 본 발명은 본 발명에 따른 분석에 의해 얻어지는 조절제 및 이 약물을 포함하는 조성물을 포함하는 신규의 결합제를 또한 제공한다. 수용체에 결합하고 효능제 또는 길항제 활성을 가질 수 있는 약물은 병상이 아데닌 결합 GPCR 수용체를 통한 작용으로 특징되는 질병을 치료하는 방법에서 사용될 수 있고 이런 용도는 본 발명의 다른 면을 형성한다. 이런 질병은 세포사멸과 관련된 질병, 병리학적 진전 및 침해수용, 기관지수축, 혈관확장, 염증 및 신경전달물질의 촉진을 포함할 수 있다. 또한, 약물은 항경련제, 진정제, 마취제, 실조(CNS), 저혈압제, 항부정맥제, 음성 심박수변동제, 변전도제, 수축촉진제, 혈소판 응집의 억제제, 심장혈관계에서 혈관 내피 세포에 의한 NO 생성의 자극제 및 위액 분비의 억제제가 유용한 치료에 사용될 수 있다. 약물은 유효 용량의 본 발명의 약물로서 투여될 수 있다. 많은 상기 증상이 만성이거나 종종 불치이기 때문에, "치료"는 몇 시간, 몇일, 또는 몇주와 같은 시간의 기간동안 증상이 감소되는 것을 포함하고 질병 진행을 감소시키는 것을 포함하는 것으로 의도된다고 이해될 것이다.

이 약물은 약제학적으로 허용가능한 담체나 희석제와 함께 약물을 포함하는 조성물로 제형화될 수 있다. 약물은 에스테르 또는 산 부가 염이나 염기 금속 염과 같은 염 또는 N 또는 S 산화물과 같은, 생리학적으로 기능적인 유도체의 형태일 수 있다. 조성물은 모든 적절한 경로와 투여 방법으로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체와 희석제는 경구, 직장, 비강, 흡입, 국소(입과 혀아래 포함), 질, 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 내피, 포막내 및 경막외를 포함) 투여에 적합한 제제에서 사용되는 것을 포함한다. 담체나 희석제의 선택은 물론 약물과 그것의 치료학적 목적에 의존할 수 있는, 제안된 투여 경로에 따를 것이다. 제제는 편리하게 단위 복용 형태로 제시될 수 있고 약학 분야에서 주지인 모든 방법에 의해 제조될 수 있다. 이런 방법은 활성 성분을 하나 이상의 보조 성분으로 구성되는 담체와 결합하는 단계를 포함한다. 일반적으로 제제는 활성 성분을 액체 담체나 정교하게 분리된 고체 담체나 양쪽 모두와 일정하고 밀접하게 결합시키고 다음 필요한 경우 생성물의 모양을 만들어서 제조된다.

고체 조성물에 대하여, 통상적인 비독성 고체 담체는 예를 들어 약제학적 등급의 마니톨, 락토스, 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 탈컴, 글루코스, 수크로스, 마그네슘 카보네이트 등이 사용될 수 있다. 상기에서 정의된 활성 화합물은 예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜, 아세틸화 트리글리세리드 등을 담체로 사용하는 좌약으로 제제화될 수 있다. 약제학적으로 투여가능한 액체 조성물은 예를 들어, 물, 샐린 수성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 같은 담체에서 상기에서 정의된 용해, 분산, 등의 활성 화합물과 임의적인 약제 학적 애쥬번트에 의해 제조될 수있고, 따라서 용액이나 현탁액을 형성할 수 있다. 원하는 경우, 투여되는 약제학적 조성물은 또한 습윤제 또는 에멀전화제, pH 완충제 등, 예를 들어 소듐 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 소듐 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올리에이트 등과 같은 소량의 비독성 보조 물질을 포함할 수 있다. 이런 복용 형태를 제조하는 실제적인 방법은 본 분야의 당업자에게 공지이거나 명백할 것이다; 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Science, Mack Published Company, Easton, Pennsylvania, 15th Edition, 1975 참조.

투여되는 조성물 또는 제제는 모든 경우에, 치료하는 대상의 증상이 완화되는데 유요한 양으로 활성 화합물의 양을 함유할 것이다.

비독성 담체로부터 구성되는 균형을 갖는 0.25 내지 95% 범위에서 활성 성분을 함유하는 복용 형태나 조성물이 제조될 수 있다.

경구 투여를 위하여, 약제학적으로 허용가능한 비독성 조성물이 예를 들어, 약제학적으로 허용가능한 수준의 마니톨, 락토스, 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 소듐 크로스카멜로스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 탈컴, 글루코스, 수크로스, 마그네슘, 카보네이트 등과 같은 보통 사용되는 부형제의 어느 것을 첨가하여 형성된다. 이런 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 서방성 제제 등의 형태를 취한다. 이런 조성물은 1% 내지 95%의 활성 성분, 보다 바람직하게는 2 내지 50%, 가장 바람직하게는 5 내지 8%를 함유할 것이다.

비경구적 투여는 일반적으로 피하, 근육내, 정맥내 주사로 특징화된다. 주사 제는 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전에 용액이나 액체 중의 현탁액으로 적합한 고체 형태, 또는 에멀전으로 통상적인 형태로 제제화될 수 있다. 적절한 부형제는 예를 들어 물, 샐린, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등이다. 또한, 원하는 경우, 투여되는 약제학적 조성물은 예를 들어 소듐 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올리에이트, 트리에탄아민 소듐 아세테이트 등과 같은 습윤제 또는 에멀젼제, pH 완충제 등과 같은 소량의 비독성 보조 물질을 함유할 수 있다. 이런 모체 조성물에 함유되어 있는 활성 화합물의 퍼센티지는 그의 특이적인 본질과 화합물의 활성과 대상의 필요에 크게 따른다. 하지만, 용액 중의 0.1% 내지 10%의 활성 성분의 퍼센티지는 사용가능하고, 조성물이 상기 퍼센티지에 이어서 희석될 고체라면 더 높을 것이다. 바람직하게는, 조성물은 용액 중에 0.2 내지 2%의 활성제를 포함할 것이다.

하기 실시예는 본 발명을 예시한다. 본 실시예에 비추어 당업자는 다른 예를 생각해 낼 것이다.

실시예 1: 신규 GPCR의 분석

서열 번호 1에서 기술된 서열을 공지의 리간드와 관련된 GPCRs이 발견될 수 있는지 여부를 결정하는 BLAST(Altschul et al., 1997) 조사에 의해 분석하였다. 검색된 이 오어펀(orphan) GPCR의 가장 가까운 상동체는 오어펀 GPCRs 자체였다. 이것은 신규의 GPCR(랫트 아데닌 결합 GPCR)과 약 50%의 공통 잔기를 갖는 후근 신경절로부터 클로닝된 인간 GPCRs의 패밀리이다(더원트 서열 데이터베이스 접근 번호 z10067, z10068, z10069, z10070, z10071 및 z10072). 다음으로 가장 가까운 상동체는 아데닌 결합 GPCR과 33%의 잔기를 공유하는 mas 관련 유전자이다.

서열 번호 1의 누클레오티드 서열을 사용하여, 본 발명자들은 랫트 신규의 GPCR의 6개의 인간 상도체인 상기 인간 GPCRs를 동정하였다. 이것들은 인간 아데닌 결합 GPCR1 (서열 번호 3), 인간 아데닌 결합 GPCR2 (서열 번호 5), 인간 아데닌 결합 GPCR3 (서열 번호 6), 인간 아데닌 결합 GPCR4 (서열 번호 7), 인간 아데닌 결합 GPCR5 (서열 번호 8) 및 인간 아데닌 결합 GPCR6 (서열 번호 9)로 명명되었다. 인간 아데닌 결합 GPCR1에 대한 누클레오티드 및 아미노산 서열은 서열 번호 3 및 서열 번호 4에 나타내었고 랫트 아데닌 결합 GPCR의 아미노산 서열(서열 번호 2) 및 인간 아데닌 결합 GPCR.1(서열 번호 4)는 도 1에 정렬되어 있다. 인간 아데닌 결합 GPCR1, 인간 아데닌 결합 GPCR2, 인간 아데닌 결합 GPCR3, 인간 아데닌 결합 GPCR4, 인간 아데닌 결합 GPCR5 및 인간 아데닌 결합 GPCR6에 대한 핵산 서열은 서열 번호 5 내지 9에 각각 나타내었다. 서열 번호 5에서의 "N"은 A 또는 T 또는 C 또는 G이다.

실시예 2: 신규 GPCR의 자연적인 리간드의 동정

공지의 리간드와 무관한 GPCRs이 공지기술에서 밝혀질 수 있는 것에 따라, 본 발명자들은 자연적인 리간드가 수용체에 결합하는지를 동정하기 위해 노력하였다. 시퀀싱된 GPCR의 자연적인 리간드를 동정하기 위하여 "역 약리학"이 사용되었다. GPCR이 발현되는 조직(뇌 피질)으로부터 실질적인 추출물을 제조하였고 자연적인 리간드의 정제 후에 오어펀 GPCR의 활성화에 기초한 세포 분석을 실시하였다.

실시예 3: 포유류 세포에서 순간적인 발현 및 FLIPR 분석

완전한 길이의 판독 프레임이 포유류 발현 벡터 pcDNA3(Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A.)에 삽입되고 생성된 발현 구성체를 pLEC/Gqi 또는 pLEC/Gqo(Molecular Device, Sunnyvale, CA, U.S.A.)와 함께 안정되게 트랜스펙션된 HEK293 세포로(E. Bender, unpublished) FuGENE 6 시약(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)와 함께 순간적으로 트랜스펙션시켰다. 세포를 공급자의 추천에 따라 Fluo-4(Molecular Probes, Eugene, OR, U.S.A.)로 충진하였다.

실시예 4: 조직 추출물의 제조 및 추출물 분획화

10kg의 돼지 피질을 균질화하고 메탄올/물/아세트산, 90/9/1, v/v/v에서 추출하였다. 원심분리 후에, 상층액을 n-헥산 추출로 탈지질화하고 수성층을 메가본델루트 분획으로 분획하였다. 50% 아세토니트릴/H₂O에서 용출하는 물질을 또한 HPLC C18 칼럼 상에서 분획하였다. 그로부터 유도된 분획물을 FLIPR 분석에서 신규의 GPCR의 활성화에 대해 시험하였다. 하이퍼실 C18, 분석적 C8 칼럼, 바이오셉 칼럼 및 마지막으로 HPLC C18 칼럼 상의 연속적인 정제 단계 이후에 또한 신규의 GPCR 트랜스펙션된 세포를 활성화하는 분획물에 대한 FLIPR 기초한 활성도 분석을 하였다. 최종 정제 단계 후에 활성을 함유하는 분획물을 매스 스펙트로메트리로 분석하였다(Q-TOF, MicroMass, Manchester, U.K.).

C18 칼럼 상의 첫번째 분획 후에 돼지 피질 추출물의 스크리닝을 하여 신규의 GPCR 발현 구성물로 순간적으로 트랜스펙션된 세포에 대해 순간적인 세포내 Ca²⁺ 방출을 야기하는 다소 넓은 범위의 분획물을 생성하였다. 이것은 Gqo 또는 Gqi 키메라를 발현하는 HEK293 세포에 대한 경우이지만(도 2 및 도 3), 야생형 HEK293에 대한 것이 아니었다(데이터는 나타내지 않음). 이 분획물 중의 하나인, G 단백질 키메라와 강한 자극을 생성하는 19번을 추가의 하부분획을 위해 선택하였고 위와 같이 수행하였다. 정제를 FLIPR 기초한 활성도 분석에 의해 수행하였고 마지막 칼럼 수행으로부터 활성을 보인 분획물은 그것이 포함하는 화합물의 순도와 구조를 결정하기 위하여 질량 분광분석을 수행하였다.

실시예 5: 질량 분광분석에 의한 활성 물질의 동정

시메트리 C18(4.6×250mm; 5㎛, Waters) 역상 칼럼으로부터의 활성 정제된 분획물의 질량 분석으로 m/z 136에서의 주요 이온을 얻었다. 질량은 관심의 이온에 대한 보다 정확한 질량(136.0623 Da)을 산출하는 (NaI+Na)⁺ 이온에 고정되었다(172.8840 Da). 이 질량은 기초적 성분 분석에 사용되었다. 질량 정확도 오차는 20ppm으로 고정하였다. 최고의 정합은 아데닌 + H⁺에 대응하는, C₅H₆N₅(136.0623 Da)에 의해 주어졌다. 원래 분자의 CID 스펙트럼을 합성 아데닌의 그것과 비교하였다.

두 모분자의 분획은 m/z 119.0, 109.0, 94.0, 92.0, 82.0, 77.0, 67.0 및 65.0에서 동일한 분획물 이온을 생성하였다. Q-TOF 상의 탠덤 질량 분광분석에 의 해 얻은 결과로부터의 결론은 활성 물질이 아데닌이라는 것이었다. 따라서 신규의 GPCR을 아데닌 결합 GPCR이라고 명명하였다.

실시예 6: 선택된 순수 화합물과 함께 신규 GPCR의 시험

질량 분광분석으로부터 얻은 결과를 확인하기 위하여 순수 아데닌을 PBS에 용해시켜 최종 농도 3.3nM-33μM로 만들고 랫트 신규 GPCR(아데닌 결합 GPCR)/pcDNA3 발현 구성물로 순간적으로 트랜스펙션된 HEK293/Gaqo 세포와 빈 발현 벡터로 트랜스펙션된 그것에 첨가하였다. 상기의 FLIPR 분석을 사용하여, 두 트랜션트 간의 차이로서 측정된 신규 GPCR에 기인한 트랜션트를 갖는 양 세포 세트에서 칼슘 트랜션트를 측정하였다. 결과는 도 4에 도시되어 있다. 아데닌은 세포에서 복용 반응 칼슘 트랜션트를 자극하고, 이는 신규 GPCR(아데닌 결합 GPCR)은 이 화합물에 대해 고도의 친화성을 가짐을 나타낸다. 반대로, 다른 퓨린이나 피리미딘은 효능적 활성을 나타내지 않았다. 도 5는 칼슘 트랜션트가 3.3μM의 우리딘, 구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, 카페인, UDP 또는 UDP의 첨가에 의해 HEK293/Gaqo 세포에서 유도될 수 없었고, 이는 아데닌에 대한 아데닌 결합 GPCR 수용체의 특이성을 확인한다. 아데닌에 대한 수용체의 특이성을 추가로 시험하기 위하여, 많은 누클레오시드 및 누클레오티드 유도체를 동일한 분석을 사용하여 시험하였다. 결과는 도 6에 나타나 있다. 아데닌의 누클레오시드와 누클레오티드 유도체에 대하여 아데노신과 AMP 만이 높은 농도에서(>3.3μM) 약한 부분적 효능작용을 보인다.

동일한 화합물 중에서 길항제 특성을 갖는 분자를 발견할 수 있는지 조사하기 위하여, 아데닌 결합 GPCR로 트랜스펙션된 세포를 FLIPR에서 Ca²⁺ 트랜션트를 측정하면서 30μM 내지 30pM의 농도 범위에서 다양한 퓨린(구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, 카페인, 테오필린), 피리미딘(우리딘, UDP, UTP), 다른 누클레오시드 수용체에서의 공지의 길항제(수라민, 리액티브 블루) 및 아데닌의 누클레오시드나 누클레오티드 유도체(아데노신, AMP, ADP, ATP)에 노출시켰다. 이 실험에서 상기의 것 외에 추가의 효능 효과가 발견되지 않았다. 실온에서 15분의 배양 후에, 동일한 세포를 30nM 아데닌으로 면역검사를 하여, 첫회의 과융해에 첨가된 분자의 길항제 작용을 검출하였다. 구아닌만이 30 및 3μM에서 약한 길항 작용을 보였다(도 7). 모든 다른 화합물은 시험 농도에서 아데닌 결합 GPCR에 대한 길항 작용을 유도하지 않았다.

실시예 7 내지 12: 순간적으로 및 영구적으로 트랜스펙션된 CHO 세포 상의 랫트 아데닌 수용체의 특성

신규의 랫트 아데닌 수용체의 특성을 추가로 표시하기 위하여, CHO 세포를 리포펙타민 플러스 방법을 사용하여 순간적으로 또는 영구적으로 트랜스펙션시켰다. 다양한 아데닌-유도체의 약리학적 특성을 방사리간드 결합 실험, [³⁵S]GTPγS 결합의 자극 및 cAMP 측정을 이용하여 평가하였다. 이 모든 실험은 대조군으로서 야생형 CHO 세포와 병행하여 수행하였다.

실시예 7은 순간적으로 및 영구적으로 트랜스펙션된 CHO 세포에서 [³H]아데닌을 사용하여 방사리간드 결합 실험을 설명한다. 아데닌에 반응하는 [³⁵S]GTPγS의 결합 측정은 순간적으로 및 영구적으로 트랜스펙션된 세포에 대하여 실시예 8 및 10에서 각각 설명하였다. 아데닌에 반응하는 cAMP의 측정은 순간적으로 및 영구적으로 트랜스펙션된 세포에 대하여 실시예 9 및 11에서 각각 설명하였다.
실시예 12에서는, 세포내 Ca²⁺에 대한 아데닌의 효과가 설명되어 있다.

세포 배양 및 트랜스펙션 방법

CHO 세포를 10% 열 불활성화된 소 태아 혈청, 및 100 IU/㎖ 페니실린 G, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신 설페이트, 110㎍/㎕ 피루브산 및 300㎍/㎖ L-글루타민을 포함하는 항생제 용액으로 보충된 1:1의 비율의 둘베코의 변형된 이글의 배지(DMEM)/영양 혼합물 햄의 F12(Life Technologies, Belgium)에 유지시켰다. 세포를 5% CO₂ 환경의 37℃에서 175㎠ 배양 플라스크에서 성장시켰다. 영구적으로 트랜스펙션된 세포에 대하여 2주일에 한번, 트랜스펙션된 세포를 800㎍/㎖ 제네티신(G418)을 함유하는 선택배지(둘베코의 변형 이글의 배지(DMEM) 영양 혼합물 햄의 F12(비율 1:1), Life Technologies, Belgium)에서 배양하였다.

CHO 세포의 순간적인 트랜스펙션을 위하여 리포펙타민 플러스(Life Technologies) 방법을 사용하였다. 트랜스펙션 하루 전에, CHO 세포를 DMEM 영양 혼합물 햄의 F12(비율 1:1) (Life Technologies, Belgium) 중에 20,000세포/㎠의 밀도로 50mm의 페트리 디쉬에 시딩(seeding)하였다. 하나의 페트리 디쉬의 트랜스펙션에 대하여, 6.5㎍ DNA를 17.5㎕ 플러스 시약(Life Technologies)에 첨가하고, 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양하였다(용액 A). 15㎕의 리포펙타민 플러스 시약을 735㎕의 혈청이 없는 배지에 첨가하였다(용액 B). 용액 A와 B를 배합하고, 살짝 혼합하고 실온에서 15분동안 배양하여 복합체를 형성시켰다. 15분 후에, 3.5㎖의 혈청이 없는 배지를 혼합물에 첨가하였다. 세포를 혈청이 없는 배지로 한번 세척하고 DNA-리포펙타민 플러스 복합체(최종 부피 5㎖)를 세포에 첨가하고 5% CO₂ 배양기에서 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 20% 열 불활성화된 소 태아 혈청으로 보충된, 5㎖의 DMEM/햄의 F12(비율 1:1)를 세포에 첨가하고 배양기에 밤새도록 두었다. 다음 날에, 배지를 제거하고 상기와 동일한 배양 배지로 교체하였다.

리포펙타민 플러스 방법은 또한 약간 변형하여 CHO 세포의 영구적인 트랜스펙션에 사용될 수 있다. 트랜스펙션 후 하루에, 배지를 2 내지 3일 마다 교체한 선택배지로 교체하였다. 세포를 콜로니가 보일때까지 성장시키고(8 내지 10일) 추가의 배양과 실험을 위하여 175㎠ 배양 플라스크로 분리하였다. 모노클로날 세포를 96 웰 플레이트에서의 제한된 희석 시딩에 의해 제조하였다.

막 제조

막을 총 미립자 분획으로서 제조하였다. 세포주를 145mm 페트리 디쉬에서 90% 콘플루언시까지 배양하고 수집 24시간 전에 5 mM 소듐 부티레이트로 처리하였다. 배양 배지를 제거하고 세포를 세포를 빙냉 인산 완충된 샐린(Ca²⁺ 및 Mg²⁺가 없는 PBS)으로 두 번 세척하고, 50mM Tris-HCl 버퍼, pH 7.4에서 플레이트로부터 스크레이핑하고 원심분리로 수집하였다(4℃ 16,000RPM으로 10분). 세포 펠렛을 저장성 5mM Tris-HCl 버퍼, pH 7.4에서 재현탁시키고 울트라 터랙스 호모제나이저(Janker Kunkel, Germany)로 균질화시켰다. 균질액을 4℃에서 20분 동안 18,000RPM으로 원심분리하였다. 최종 펠렛을 50mM Tris-HCl 버퍼, pH 7.4에서 재현탁시키고 분취하여 -70℃로 저장하였다. 단백질 결정은 표준의 소 혈청 알부민(BSA)를 사용하는 브래드포드 단백질 분석 (Biorad, Germany)을 사용하여 수행되었다.

실시예 7: [ ³ H]아데닌 결합

A) 방법 - 트랜스펙션 전의 야생형 세포주와 순간적으로 및 영구적으로 트랜스펙션된 세포주를 특징화하기 위하여 [³H]아데닌 결합 실험을 수행하였다. 막을 얼음 상에서 녹이고 10 mM MgCl₂ 및 1 mM EGTA로 보충된 50 mM HEPES 버퍼, pH 7.4 에서 희석하였다. 비특이적인 결합은 1μM 아데닌의 존재 하에서 [³H]아데닌으로 25℃에서 1시간 배양으로 정의하였고(30.4 Ci/mmol의 특이적인 활성), 포화와 경쟁 결합 분석에 대해 적합하다고 밝혀졌다. 양 분석은 트랜스펙션된 CHO 세포에 대한 18㎍의 막 단백질과 포화 결합에 대한 야생형 CHO 세포에 대한 30㎍의 막 단백질을 사용하여, 최종 부피 500㎕에서 수행하였다. 경쟁 결합 실험에 대하여, 15 및 50㎍의 막 단백질이 각각 트랜스펙션된 및 야생형 세포에 대하여 사용되었다. 반응을 브랜덜 멀티-채널 세포 수집기(96 웰)를 사용하여 와트맨 GF/B 필터를 통해 신속히 여과하여 종결시켰다. 필터를 3㎖ 빙냉 50 mM HEPES 버퍼, pH 7.4로 세번 세척하고, 액체 신틸레이션 바이얼로 옮기고 3㎖의 신틸레이션 용액(Ultima Gold MV, Packard, Netherland)을 첨가하였다. β-신틸레이션 카운터에서 샘플의 수를 세고 적어도 6시간 후에 유리 섬유 여과기가 일정하게 반투명이 되도록 하였다.

[³H]아데닌 결합의 포화 분석을 0.2 내지 90 nM 범위의 18 농도의 방사리간드(radioligand)를 사용하여 수행하였다.

화합물, 아데닌, 1-메틸아데닌 및 다른 유사체에 의한 [³H]아데닌의 경쟁적인 억제는 5 등급의 크기에 걸쳐, 15 nM의 [³H]아데닌 및 다양한 농도의 표지되지 않은 화합물으로 수행하였다.

결합 지역의 최대 수(B_max), 겉보기(apparent) 평형 분해 상수(K_D) 및 pIC₅₀ 값(IC₅₀ 값은 50%의 특이적 방사리간드 결합을 억제하는 농도를 나타낸다)을 비선형 곡선 피팅으로부터 도출하였다.

b)결과: [³H]아데닌으로 예비적인 방사리간드 결합 실험을 상이한 야생형 세포에서 실시하였다. 분석 조건은 트랜스펙션된 세포에서의 그것과 동일하였다. 상이한 세포주에서 얻은 결합 결과는 하기와 같다:

C6 글리오마: 839 fmoles/mg 단백질

Cos7: 226 fmoles/mg 단백질

HEK293: 168 fmoles/mg 단백질

NIH3T3: 642 fmoles/mg 단백질

CHO: 303 fmoles/mg 단백질 (풀 1)

583 fmoles/mg 단백질 (풀 2)

CHO 세포를 랫트 아데닌 수용체로 트랜스펙션하고 추가로 실험하기 위하여 선택하였다.

트랜스펙션 후 48시간에서 독립적인 실험에서(당업자에게 공지된 통상의 기술을 사용하는 β-갈(gal) 염색에 의해 평가된 효율이 50~60%였다) CHO 세포를 [³H]아데닌 결합에 대해 평가하였다. 4 nM [³H]아데닌을 사용하여 수행되는 예비적 결합 실험에서, 하기 결합 수준이 관찰되었다:

풀 1 3554 fmoles/mg 단백질

풀 2 3444 fmoles/mg 단백질

풀 3 2436 fmoles/mg 단백질

풀 4 1717 fmoles/mg 단백질

[³H]아데닌의 포화 결합 분석을, 0.1 내지 80nM 범위에서 16 방사리간드 농도의 평균을 사용하여(표 1), 트랜스펙션된 및 야생형 CHO 세포 상에서 100μM의 구아닐릴이미도디포스페이트(Gpp-NHp)와 함께 또는 그것 없이 수행하였다. Gpp-NHp의 첨가는 GPCRs의 고친화성 또는 효능제 결합 위치를 차폐하고, 따라서 저친화성 지역만이 이용가능하다.

트랜스펙션된 세포에서 평균 포화 결합 수준은 19pmol/mg 주위였고 [³H]아데닌에 대한 K_D-값은 24nM였다. 유사한 K_D를 갖는 특이적인 결합은 또한 야생형 CHO 세포에서 또한 관찰되었지만, 매우 낮은 Bmax값을 가졌다(~1.1pmol/mg). 또한, 트랜스펙션된 세포의 K_D는 Gpp-NHp 첨가에 민감하였지만, 야생형 세포에서의 K_D는 그렇지 않았다.

다양한 아데닌 유도체에 의한 [³H]아데닌 결합의 경쟁적인 억제는 수용체로 순간적으로 트랜스펙션된 세포 상에서 및 야생형 CHO 세포 상에서 15 nM의 [³H]아데닌을 사용하여 수행되었다(표 2).

고친화성 경쟁 결합은 아데닌 자체로만 얻어질 수 있었고, 직접적으로 측정된 K_D-값과 매우 가까운 18nM의 K_i-값을 가졌다.

실시예 8: 순간적으로 감염된 세포에서의 [ ³⁵ S]GTPγS 결합

a) 방법 - G 단백질에 대한 [³⁵S]GTPγS 결합의 결정을 라자레노의 변형된 방법(Methods Mol. Biol., 83:107-116, 1997)에 따라 수행하였다. 이 실험을 막 제조의 수준에서 수용체의 첫번째 기능 평가에 대하여 수행하였다.

예비적 [³⁵S]GTPγS 결합 실험에서, 분석 조건이 최적화되었고, 이것은 하기의 배양 버퍼: 100 mM NaCl, 10μM GDP, 10mM MgCl₂ 및 10㎍의/㎖ 사포닌을 함유하는 20 mM Hepes, pH 7.4의 선택을 야기하였다. 이 분석 혼합물은 트랜스펙션된 세포 및 야생형 CHO 세포에 대해 각각 10 및 35㎍의 막 단백질을 함유하였다.

효능 활성을 시험하기 위하여, 175㎕의 희석된 막을 25㎕의 버퍼와 25㎕의 다양한 농도의 화합물과 함께 총 부피가 225㎕가 되게 하여 상기의 버퍼에서 사전 배양시켰다. 30℃에서 20분의 사전배양 기간 후에, 25㎕의 [³⁵S]GTPγS를 첨가하여 최종 농도 0.25 nM가 되게 하고 분석 혼합물을 추가로 30℃에서 20분 동안 배양하였다. 결합하고 유리된 [³⁵S]GTPγS를 필터메이트 196 여과 (Packard Company, Netherlands)를 사용하여 감압하에서 UniFilter^TM-96, GF/B^TM 상에서 고속 여과에 의해 분리하였다. 여과기 유닛 상의 결합한 방사활성의 양은 여과기를 건조하고 액체 신틸레이션 카운팅에 의한 신틸레이션 첨가(Microscint-o; Packard Company) 후에 결정되었다.

기초 [³⁵S]GTPγS 결합을 화합물의 부재 하에서 측정하였다. 효능제에 의한 자극은 기초 수준 상의 퍼센티지 증가로서 계산되었다. S자형 효능제 농도-반응 곡선은 그래프패드 프리즘 프로그램을 사용하여 비선형 회귀에 의해 분석되었다. 상이한 농도점은 두 번 수행되었고 보고된 데이터는 독립적인 실험으로부터 회수되었다.

b) 결과 - 순간적으로 트랜스펙션된 CHO 세포로부터의 막 상의 [³⁵S]GTPγS 결합은 기초 결합 수준 상의 150%의 아데닌에 의한 최대 자극을 가졌다. 아데닌에 대한 평균 EC₅₀은 112 nM였다. 1-메틸아데닌과 AMP는 경쟁 결합 분석에서 그들의 낮은 친화도와 대응하는, 매우 낮은 효능을 가지고 부분적으로 수용체를 자극하였다.

GTPγS 결합의 자극은 야생형 CHO 세포에서 측정되지 않았다 (표 3 및 도 8a(순간적으로 트랜스펙션된 CHO) 및 도 8b(야생형 CHO)). 퍼센티지 값은 최대 아데닌 반응에 표준화되고, 즉 기초 수준 상의 아데닌 자극은 100%로 간주된다.

실시예 9: 순간적으로 트랜스펙션된 CHO 세포에서 cAMP 측정

a) 방법 - 순간적으로 트랜스펙션된 CHO 세포에 대하여, cAMP 측정을 NEN(Belgium)로부터의 직접적인 RIA 키트를 사용하여 수행하였다.

1ml 0.04% EDTA를 첨가하고 그것을 PBS(Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 없음)에서 그것을 재현탁하여 세포를 50 mm 페트리 디쉬로부터 수집하였다. 다음 세포를 1,500RPM에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고 펠렛을 자극 버퍼(공급자, NEN에 의해 제공됨)에서 재현탁시켰다. 세포의 수를 세고 10⁶ 세포/웰의 농도로 96-웰 플래쉬플레이트의 각 웰에 50㎕를 첨가하였다. cAMP의 표준 곡선을 10 내지 1,000 nM의 범위의 자극 버퍼에서 제조하였고, 플래쉬플레이트에 50㎕를 첨가하였다.

화합물을 포스콜린(forskolin)(50μM)을 함유한 PBS로 희석하고, 최종 농도의 2배인 리간드 50㎕를 세포에 첨가하고 37℃에서 20분 동안 배양하였다. 20분 배양 후에, 100㎕의 [¹²⁵I]cAMP 추적자(2μCi)를 각 웰에 첨가하여 최종 부피 200㎕/웰을 만들었다. 플레이트를 실온에서 방치하고, 탑카운트^TM 마이크로플레이트 신틸레이션 카운터(Packard, Netherlands)에서 수를 세었다. S자형 농도 반응 곡선(이중점)을 그래프패드 그리즘 프로그램(GraphPad Software, CA, USA)를 사용하여 분석하였다.

b) 결과 - 직접적인 방법으로 포스콜린 자극된 cAMP의 억제는 매우 낮았다(15-30%). 양 방법의 포스콜린, 기초 및 pEC₅₀ 값은 표 4에 주어졌고; 분석으 로부터의 대표적인 곡선은 도 9a(0.5%hiFCS) 및 9b(2%hiFCS)에 나타내었다.

분석의 반응 창이 낮음에도 불구하고, 분석은 수용체 상의 아데닌의 효능제 활성을 확인하였고 측정된 EC₅₀(~15 nM)은 그것의 아데닌 친화도에 가까웠다.

순간적으로 트랜스펙션된 세포 상의 기능적 cAMP 분석에서의 낮은 신호가 세포의(트랜스펙션된 및 트랜스펙션 되지 않은 세포) 이성 성질에 기인하기 때문에 영구적으로 트랜스펙션된 세포주를 선택하기 위해 결정되었다.

많은 모노클로날 세포주를 추가의 연구를 위해 선택한 3개의 클론 26(모 플레이트 1), 28, 29 및 30(모 플레이트 9)로 상기 방사리간드 결합에 의해 조사하였다.

실시예 10 영구적으로 트랜스펙션된 세포에서의 [ ³⁵ S]GTPγS 결합

모노클로날 세포주의 첫 번째 기능적 특징화는 [³⁵S]GTPγS 실험에서 수행되었다. 4개의 선택된 클론의 각각에 대한 아데닌에의한 [³⁵S]GTPγS 결합의 최대 자극은 순간적인 트랜스펙션에서 발견된 것보다 매우 높았고(500-650 배)(표 5 참조), 이는 영구적인 세포주에서 예상된 더 좋은 커플링을 확인하였다. 하지만 62 nM의 평균 EC₅₀은 순간적인 제조에 가깝다(실시예 8 참조). 아데닌에 의한 [³⁵S]GTPγS 결합 억제의 예는 도 10에 나타내었다.

실시예 11 영구적으로 트랜스펙션된 CHO 세포에서 cAMP 측정

영구적으로 트랜스펙션된 CHO 세포에 대하여, NEN(Belgium)로부터의 간접적 인 RIA 키트를 사용하여 cAMP 측정을 수행하였다.

a) 방법: 실험일에 약 90% 콘플루언스가 되는데 필요한 농도로 실험 2일 전에 96 웰 플레이트에 세포를 시딩하였다. 성장 배지를 제거한 후에, 세포를 25 mM Tris-HCl, pH 7.4, 120 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 15 mM 글루코스 및 15 mg/l 페놀 레드를 함유하는 조절된 염 용액(CSS) (이 염 용액에 1 mM 및 0.1% BSA의 농도로 포스포디에스테라제 억제제 IBMX (3-이소부틸-1-메틸잔틴)을 첨가함)으로 두 번 세척하였다. 기초 cAMP 수준이 이 첨가제를 포함하는 CSS에서 결정되었고 최대로 자극된 cAMP 수준이 50μM 포스콜린의 존재하에서 결정되었다. 효능제 활성을 시험하기 위하여, 화합물을 37℃에서 20분 동안 세포와 함께 배양하였다. 빙냉 HClO₄(1N)을 첨가하여 반응을 정지시키고 -20℃에서 저장하였다. 녹인 후에 혼합물을 인산 완충된 KOH의 등가량으로 중화하고, 4℃에서 30분 동안 방치하여 염이 침전되도록 하고 4℃에서 5분 동안 2,000RPM으로 원심분리하였다.

cAMP 수준의 정량적 결정을 위하여, 공급자의 프로토콜에 따라, NEN으로부터의 96-웰 플래쉬플레이트 방사면역분석 키트를 사용하였다. S자형 농도 반응 곡선(이중점)을 그래프패드 프리즘 프로그램을 사용하여 분석하였다.

b) 결과 - 나트륨-부티르산염 유도와 상이한 혈장 농도의 효과를 평가하였다. 4개의 선택된 클론을 조사한 결과, 클론 28(MP9)이 포스콜린 자극된 cAMP 수준의 높은 (-75%) 억제를 보였다. 야생형 CHO 세포는 아데닌에 대해 어떤 반응도 보이지 않았다. 클론 28 및 야생형 CHO 세포의 포스콜린, 기초 및 pEC₅₀ 값은 표 6에 나타내었다. cAMP 실험에서의 신뢰할만한 고도의 창은 수용체 발현 수준의 나트륨-부티르산염 유도 후에만 얻어졌다. 측정된 EC50은 낮은 나노몰 범위(3 nM)였다. 대표적인 농도 반응 곡선이 영구적으로 트랜스펙션된 및 야생형 CHO 세포에 대해 각각 도 11a 및 도 11b에 도시되어 있다.

실시예 12 영구적으로 트랜스펙션된 CHO 세포에서 세포내 칼슘 측정

마지막으로, 세포내 Ca²⁺의 측정을 가장 기능적으로 커플링된 CHO 세포주, 클론 28에 대해서 수행하였다. 나트륨-부티르산염 예비처리의 효과를 아데닌의 복용량 반응 곡선을 사용하여 조사하였다.

a) 방법 - 실험일에 대략 90% 세포 콘플루언스이 되는데 필요한 농도로 실험 2일 전에 세포를 96 웰 플레이트에 뿌렸다. 화합물을 그들의 최종 농도까지 두 번 칼슘 버퍼(5 mM HEPES/NaOH, pH 7.4, 140 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 5 mM KCl, 10 mM 글루코스, 1.25 mM CaCl₂, 2.5 mM 프로벤시드, pH 7.4)에서 희석시켰다. 기초 값을 위하여, 칼슘 버퍼를 적용하고 최대 반응을 위하여 10μM 이오노미신을 사용하였다. 성장 배지를 제거하고 세포를 37℃ 배양기에서 프로벤시드 (5 mM), 지시약 플루오-3 (2 μM), 20 mM HEPES/NaOH, pH 7.4 및 0.1% BSA로 보충된 혈청이 없는 성장 배지에 시딩하였다. 60분 배양 후에, 세포를 칼슘 버퍼로 3번 세척하였따. 100㎕의 희석된 화합물을 웰로 옮기고 세포내 칼슘 수준에서의 변화를 FLIPR^R(플루오로메트릭 이미징 플레이트 리더, Molecular Devices)로 측정하였다. 각 데이터 점을 중복해서 실시하고 Ca²⁺-트랜션트의 최고점을 상대적인 신호로 간주하였다. S자형 농도 반응 곡선을 그래프패드 프리즘 프로그램을 사용하여 분석하였다.

b) 결과 - 야생형 CHO 세포는 아데닌에 대해 어떤 반응도 보이지 않았다. 비-나트륨-부티르산염이 처리된 세포에 대하여, 아데닌은 6800 내지 8500의 범위의 기초 상대적인 형광 유닛(RFU)의 1.25배의 증가를 야기시켰다. 나트륨-부티르산염 처리된 세포에 대하여, 아데닌은 6600 내지 19800 범위의 RFU에서 3배 증가를 유도하였다. 아데닌 반응의 pEC₅₀ 값은 각각 7.14 및 7.83였다. 아데닌에 의해 촉발되는 Ca²⁺ 반응의 대표적인 예를 영구적으로 트랜스펙션된 및 야생형 CHO 세포에 대하여 각각 도 12a 및 도 12b에 표시하였다.

표 1: CHO 막, 아데닌 결합 랫트 수용체로 순간적으로 트랜스펙션된 CHO 세포 대 야생형 CHO 세포 상의 [³H]아데닌 포화 결합

표 2: CHO 막, 아데닌 결합 랫트 수용체로 순간적으로 트랜스펙션된 CHO 세포 대 야생형 CHO 세포 상의 [³H]아데닌 경쟁 결합

표 3: CHO 막, 아데닌 결합 랫트 수용체로 순간적으로 트랜스펙션된 CHO 세포 대 야생형 CHO 세포 상의 [³⁵S]GTPγS 결합

표 4: 아데닌 결합 랫트 수용체로 순간적으로 트랜스펙션된, CHO 세포 상의 cAMP 측정

표 5: 아데닌 결합 랫트 수용체로 영구적으로 트랜스펙션된, CHO 막 상의 [³⁵S]GTPγS 결합. 아데닌에 의한 기초에 대한 자극.

표 6: 아데닌 결합 랫트 수용체로 영구적으로 트랜스펙션된, CHO 세포 상의 cAMP 측정

<110> Janssen Pharmaceutica N.V. <120> G Protein Coupled Receptor <130> Novel GPCR <140> <141> <150> UK/0008252.9 <151> 2000-04-04 <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 999 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 1 atgggggaaa gcttcaccgg tacagggttt ataaacctaa acacctcagc ctcgacaata 60 gcagtcacaa caacaaatcc aatggacaaa accatacctg gaagtttcaa cggcaggacc 120 ctgatcccaa atttgttgat catcatctcg ggactggtcg ggctgatagg aaacgccatg 180 gtgttctggc tcctgggctt ccgcttagcc aggaatgcct tctcagtcta catcctaaac 240 ttggccctgg ctgacttcct cttcctcctc tgtcacatca tagattccac gctgctcctt 300 ctcaagtttt cctaccccaa cattatcttt ctcccatgct ttaacaccgt catgatggtc 360 ccctacatcg caggcctgag catgctcagt gccatcagca ccgagcgctg cctgtctgtt 420 gtgtgcccca tctggtatcg ctgccgccgc ccaaaacaca cttcaactgt catgtgctct 480 gcgatctggg tcctgtcact gttgatctgc attctgaata ggtatttctg tggcttctta 540 gataccaaat acgaaaagga caaccggtgt ctggcatcga acttctttac tgccgcgtgc 600 ctgatatttt tgtttgtagt cctctgtctg tccagtctgg ctctgctggt cagatcgttc 660 tgtggcgctg ggcggatgaa gctcaccaga ttgtacgcga ccattatgct gaccgttttg 720 gtttttctcc tctgcgggtt gccctttggc atccactggt tcctgttaat ctggattaag 780 attgattatg gtaaatttgc ttacggtctt tacctggcgg cactcgtcct gactgctgtt 840 aacagctgtg ccaaccccat catttacttc ttcgtgggct ccttcaggca tcagaagcac 900 cagaccctca aaatggttct ccagagggcg ctgcaggaca cccctgagac agcggaaaac 960 acggtggaga tgtcaagcag caaggtggag ccgtgatga 999 <210> 2 <211> 331 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 2 Met Gly Glu Ser Phe Thr Gly Thr Gly Phe Ile Asn Leu Asn Thr Ser 1 5 10 15 Ala Ser Thr Ile Ala Val Thr Thr Thr Asn Pro Met Asp Lys Thr Ile 20 25 30 Pro Gly Ser Phe Asn Gly Arg Thr Leu Ile Pro Asn Leu Leu Ile Ile 35 40 45 Ile Ser Gly Leu Val Gly Leu Ile Gly Asn Ala Met Val Phe Trp Leu 50 55 60 Leu Gly Phe Arg Leu Ala Arg Asn Ala Phe Ser Val Tyr Ile Leu Asn 65 70 75 80 Leu Ala Leu Ala Asp Phe Leu Phe Leu Leu Cys His Ile Ile Asp Ser 85 90 95 Thr Leu Leu Leu Leu Lys Phe Ser Tyr Pro Asn Ile Ile Phe Leu Pro 100 105 110 Cys Phe Asn Thr Val Met Met Val Pro Tyr Ile Ala Gly Leu Ser Met 115 120 125 Leu Ser Ala Ile Ser Thr Glu Arg Cys Leu Ser Val Val Cys Pro Ile 130 135 140 Trp Tyr Arg Cys Arg Arg Pro Lys His Thr Ser Thr Val Met Cys Ser 145 150 155 160 Ala Ile Trp Val Leu Ser Leu Leu Ile Cys Ile Leu Asn Arg Tyr Phe 165 170 175 Cys Gly Phe Leu Asp Thr Lys Tyr Glu Lys Asp Asn Arg Cys Leu Ala 180 185 190 Ser Asn Phe Phe Thr Ala Ala Cys Leu Ile Phe Leu Phe Val Val Leu 195 200 205 Cys Leu Ser Ser Leu Ala Leu Leu Val Arg Ser Phe Cys Gly Ala Gly 210 215 220 Arg Met Lys Leu Thr Arg Leu Tyr Ala Thr Ile Met Leu Thr Val Leu 225 230 235 240 Val Phe Leu Leu Cys Gly Leu Pro Phe Gly Ile His Trp Phe Leu Leu 245 250 255 Ile Trp Ile Lys Ile Asp Tyr Gly Lys Phe Ala Tyr Gly Leu Tyr Leu 260 265 270 Ala Ala Leu Val Leu Thr Ala Val Asn Ser Cys Ala Asn Pro Ile Ile 275 280 285 Tyr Phe Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gln Lys His Gln Thr Leu Lys 290 295 300 Met Val Leu Gln Arg Ala Leu Gln Asp Thr Pro Glu Thr Ala Glu Asn 305 310 315 320 Thr Val Glu Met Ser Ser Ser Lys Val Glu Pro 325 330 <210> 3 <211> 969 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggatccaa ccatctcaac cttggacaca gaactgacac caatcaacgg aactgaggag 60 actctttgct acaagcagac cttgagcctc acggtgctga cgtgcatcgt ttcccttgtc 120 gggctgacag gaaacgcagt tgtgctctgg ctcctgggct gccgcatgcg caggaacgcc 180 ttctccatct acatcctcaa cttggccgca gcagacttcc tcttcctcag cggccgcctt 240 atatattccc tgttaagctt catcagtatc ccccatacca tctctaaaat cctctatcct 300 gtgatgatgt tttcctactt tgcaggcctg agctttctga gtgccgtgag caccgagcgc 360 tgcctgtccg tcctgtggcc catctggtac cgctgccacc gccccacaca cctgtcagcg 420 gtggtgtgtg tcctgctctg ggccctgtcc ctgctgcgga gcatcctgga gtggatgtta 480 tgtggcttcc tgttcagtgg tgctgattct gcttggtgtc aaacatcaga tttcatcaca 540 gtcgcgtggc tgattttttt atgtgtggtt ctctgtgggt ccagcctggt cctgctgatc 600 aggattctct gtggatcccg gaagataccg ctgaccaggc tgtacgtgac catcctgctc 660 acagtactgg tcttcctcct ctgtggcctg ccctttggca ttcagttttt cctattttta 720 tggatccacg tggacaggga agtcttattt tgtcatgttc atctagtttc tattttcctg 780 tccgctctta acagcagtgc caaccccatc atttacttct tcgtgggctc ctttaggcag 840 cgtcaaaata ggcagaacct gaagctggtt ctccagaggg ctctgcagga cgcgtctgag 900 gtggatgaag gtggagggca gcttcctgag gaaatcctgg agctgtcggg aagcagattg 960 gagcagtga 969 <210> 4 <211> 322 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Asp Pro Thr Ile Ser Thr Leu Asp Thr Glu Leu Thr Pro Ile Asn 1 5 10 15 Gly Thr Glu Glu Thr Leu Cys Tyr Lys Gln Thr Leu Ser Leu Thr Val 20 25 30 Leu Thr Cys Ile Val Ser Leu Val Gly Leu Thr Gly Asn Ala Val Val 35 40 45 Leu Trp Leu Leu Gly Cys Arg Met Arg Arg Asn Ala Phe Ser Ile Tyr 50 55 60 Ile Leu Asn Leu Ala Ala Ala Asp Phe Leu Phe Leu Ser Gly Arg Leu 65 70 75 80 Ile Tyr Ser Leu Leu Ser Phe Ile Ser Ile Pro His Thr Ile Ser Lys 85 90 95 Ile Leu Tyr Pro Val Met Met Phe Ser Tyr Phe Ala Gly Leu Ser Phe 100 105 110 Leu Ser Ala Val Ser Thr Glu Arg Cys Leu Ser Val Leu Trp Pro Ile 115 120 125 Trp Tyr Arg Cys His Arg Pro Thr His Leu Ser Ala Val Val Cys Val 130 135 140 Leu Leu Trp Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ser Ile Leu Glu Trp Met Leu 145 150 155 160 Cys Gly Phe Leu Phe Ser Gly Ala Asp Ser Ala Trp Cys Gln Thr Ser 165 170 175 Asp Phe Ile Thr Val Ala Trp Leu Ile Phe Leu Cys Val Val Leu Cys 180 185 190 Gly Ser Ser Leu Val Leu Leu Ile Arg Ile Leu Cys Gly Ser Arg Lys 195 200 205 Ile Pro Leu Thr Arg Leu Tyr Val Thr Ile Leu Leu Thr Val Leu Val 210 215 220 Phe Leu Leu Cys Gly Leu Pro Phe Gly Ile Gln Phe Phe Leu Phe Leu 225 230 235 240 Trp Ile His Val Asp Arg Glu Val Leu Phe Cys His Val His Leu Val 245 250 255 Ser Ile Phe Leu Ser Ala Leu Asn Ser Ser Ala Asn Pro Ile Ile Tyr 260 265 270 Phe Phe Val Gly Ser Phe Arg Gln Arg Gln Asn Arg Gln Asn Leu Lys 275 280 285 Leu Val Leu Gln Arg Ala Leu Gln Asp Ala Ser Glu Val Asp Glu Gly 290 295 300 Gly Gly Gln Leu Pro Glu Glu Ile Leu Glu Leu Ser Gly Ser Arg Leu 305 310 315 320 Glu Gln <210> 5 <211> 979 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (251)..(350) <223> n=a, t, c or g <400> 5 atggccaaat aaaaacagtt ctggtctgca gctcccagcg ggaccaacgc agaagactgg 60 tgatttctgc atttccaact caggtaccca gttcatctca ttgagactgg ttaggcagtg 120 tgtacaaccc acggagagca aggagaagca gggtggggca tcgcttcatc tgcgaagtac 180 aaggagccag gggacacctg tcccccaatc aagggaagct gtgaggaacc ctgctaccag 240 cccagtacta nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 300 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gagtgccatg 360 agcaccgagc gctgcctgtg cgtcctgtgg cccatatggt accgctgcct cctcccccca 420 cacacctgtc agcggtcgtg tgtgtcttgc tttgggccct gtccctactg cggagcatcc 480 tggagtgaat gttctgtgac ttcctgttta gtgatgctga ttctatttgg tgtcaaccat 540 cagatttcat cacagtcgtg tggctgattt ttttatgtgt ggttctctgt gggtccagcc 600 tggtcctgct gattaggatt ctctgtggat cctggaagat gcctctgacc gggctgtacg 660 tgacgatcct gctcacagtg ctagtcttcc tactccgcag cctgcccttc ggcattcggt 720 gggctctgtc tactgggatc cacctggatt tggaagtcat tttctgtcat gtccatctag 780 tttccatttt cctgtcccct ctaaacggta gtgccaaccc cgtcatttac ttcttcgtgg 840 gctcctttag gcagcgtcaa aataggcaga acctgaagct ggttctccag agggctctgc 900 aggacatgcc tgaggtgaag gtggagggcg gcttcctgag ggaaccctgg agctgtcggg 960 aagcagattc gggcagtga 979 <210> 6 <211> 966 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gtggatccaa ccatcccagc cttgggtaca gaactgacac caatcaatgg acgtgaggag 60 actccttgct acaagcaaac cctgagcctc acagggctga cgtgcatcgt ttcccttgtc 120 gggatgacag gaaatgcagt cgtgctctgg ctcctgggct tccgcatgcg caggaacgcc 180 ttctccatct acatcttcaa cctgtccatg gccgacttcc tctttctcag aagccacatt 240 atacgttttc cgttaagcct catcaatatc ctccatccca tcttcaaaat cctcagccct 300 gtgatgatgt tttcctacct tgcaagcctg agctttctaa gcgccatgag caccgagcgc 360 tgcctgtacg tcctgtggcc catctggtag cgctgccgcc cccgccccta cacctgtcag 420 cggtcgtgtg tgtcatgctc tgggccctgt ctctgctgcg gagcgtcctg gagtggagtt 480 tctgtgactt cctgtttagt ggtgctgatt ctgtttggtg ttaaacatca gatttcatca 540 tagtaggggg gctgattttt ttatgtgtgg ctctctgtgg ttccagcctg gtcctgctgg 600 tcaggatcct ttgtgggtcc cggaagatgc cactgaccag gctgtacgtg accatcctgc 660 tcatagcgct ggtcttcctc ctctgtggcc tgccctttgg cattcggttt ttcctatttt 720 catggaacca cgtggatttg gaagtcttat attgtcacgt tcatctagtt tccattttcc 780 tttcctctct taacggccaa ccccaacatt tacttcttcg tgggctcctt taggcagtgt 840 caaaataggc agaacctgaa gctggttctc cagagggctc tgcaggacac gactgaggtg 900 aatgaaggtg gacgatggct tcctgaggaa accctggagc tgtcaggaag cagatttggg 960 cagtga 966 <210> 7 <211> 961 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atggatccaa ccatcccagc cttgggtaca gaactgacat caatcaatag gaccgaggag 60 acccatcttc aacattgtgg catggagatc atgatcctca tgttgctgct cctcatcgtt 120 gacctggtcc agctggcagg aaatgcagtc atttcctctg gctcctggga ttccgcctgc 180 acaggaacac cttctccctc tacaccctca acctggccgg ggccgacttc ttcctctgct 240 cccagatttt agaaattgtg aatttctacc atgacttctt cctttccatc tccacctatt 300 tcaccactgt gatgaccttt ctctacttta caggcctgag catgctgggc tccatcagca 360 ccaagcactg cctgtccatc ctgtggccca tctagtaccg ctgccaccac cccacacacc 420 tgtcagcagt cgtgtgtcct gctctgggcc ctgtccctgc tgcagagcat cctggaatgg 480 atgttctgtg gcttcctgtc tagtggtgct gattctgttt ggtgtgaaac atcagatttc 540 atcacagtca catggctgat ttttttatgt gtggttctct gcgggtccag cccggtcctg 600 ctggtcagga tcctttgtgg atcccggaag atgcccttga ccaggctgta catgaccatc 660 ctgctcagag tgctggtctt cctcctctgt gacctgccct ttggcattca gtgattccta 720 tttttctgga tccacgtgga tttgtcacgt tcgtctagtt tccattttcc tgtccactct 780 taacagcagt gccaacccca ttatttactt cttcatgggc tcctttaggc agcttcaaaa 840 caggaagact ctctagctgg ttctccagag ggctctgcag gacacgcctg aggtggaaga 900 aggcagatgg cggctttctg aggaaaccct ggagctgtca tgaagcagat tggggccatg 960 a 961 <210> 8 <211> 994 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 atgaatccaa ccatcccagc cttggataca gaaattgcac caattagtga tacagaggag 60 acccatcctc atcgttgtgg catggaggtc ctggtcctca tagtgctgat cctcatcatt 120 gacctggtcg ggctggcagg aaatgcagtc atgctctggc tcctgggctt ctgcatgcac 180 agtaacacct tctctctcta catcctcaac ctggccaggg ctgacttcct ctgcacctgc 240 ttccagatta taacattcat taatttcttc agtgactttg ttagttctct ctccatccat 300 ttctctagat ttgtcaccac ggtgttgttc tccgcctgta ttacaggcct gagcatgctg 360 agcaccatca gcaccgagca ccgcctgtcc gtcctgtggc ccatctggta ctgctgccac 420 tgccccacac acctgtcagc ggtcatgtgt gtcctgctct gggccctgtc cctgttgcag 480 agcatcctgg agtggatgtt ctgtagcttc ctgtttagtg atgttgactc tgataattgg 540 tgtcaaatat tagatttcct cactgctgtg tggctgattt ttttaatctg tggttctctg 600 tgggttcacc ctggtcctgc ttgtcaggat catatgtgga tcccagaaga tgccgctgac 660 caggctgtat gtgaccatcc tgctcacagg gctggtcttc ctcttctgca gcctgcccct 720 cagcattcag tgattcctat tatactggat cgagaaggat ttggatgact taccttgtgt 780 tgttcgttta atttccattt tcctgtctgc tcttaacagc agtgccaacc ccatcattta 840 cttcttcatg ggctccttta ggcagcttca aaacaggaag accctcaagc tggttctcca 900 gagggctctg caggacatgc ttgaggtgga tgaaggtgga gggcagcttc ctgaggaaac 960 cctgaagctg tcgggaagca gattggggcc atga 994 <210> 9 <211> 966 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 atggatccaa ccatcccagt cttgggtaca gaactgacac caatcaacgg aactgaggag 60 actccttgct acaatcagac cctgagcttc acggtgctga cgtgcatcgt ttcccttgtc 120 gcgctgacag gaaacgcggt tgtgctctgg ctcctgggct tccgcatgtg caggaacgct 180 gtctccatct acatcctcaa cctggtcgcg gccaacttcc tcctcctcag cagccacatt 240 atacatccct gttacacctc atcaataacg tccatcccat ctctctaatc ctctagcctg 300 tgatgacctt tccctacttg gcaggcctga atattctgag tgccatgagc accaagcgct 360 gcctgtcaat cctgtggccc atctggtaac gctgccgcca ccccacacac ctgtcaacgg 420 tcgtgtgtgt cctgctctgg gccctgtccc tgctgtagag catcctggag tggatgttct 480 gtgactccct gtttagtgat gctgattctg tttggtgtca aacatcagat tcatcacagt 540 tacgtggctg atttttttat ttgtggttct ctgtgtgtcc agcctggtcc tagtggtcag 600 gatcctctgt ggatcccaga agatgccgct gaccaggctg tacatgacca tctgctcaca 660 gtgctggtct tcctcctctg cggcctgccc attggcattc agtgggccct gttttccagg 720 atccacatgg actgggaagt cttatattct catgttcatc tgccttccat tttcctgtcg 780 tctcttaaca gcagtgccaa ccccatcatt tacttcttca tgggtttcgt taggcagcat 840 caaaattggc agaacctgaa gctggttctc cagagggatc tgcaggacac gcctgaggtg 900 gatgaaggtg gatggtgcct tcctcaggaa accctggagc tgtcgggaag cagattcagg 960 cagtga 966

Claims (27)

1. 서열 번호 2의 폴리펩티드 또는 서열 번호 2의 폴리펩티드에 대해 적어도 90%의 서열 상동성을 가지고 아데닌 결합 수용체 활성을 보유하는 폴리펩티드로 이루어지는 아데닌-결합 G 단백질 커플된 수용체를 코딩하는 분리된 핵산 서열.
2. 제 1항에 있어서, 핵산 서열이 서열 번호 1 또는 서열번호 1과 적어도 90%의 서열 상동성을 가지는 서열로 이루어지는 분리된 핵산 서열.
3. 삭제
4. 서열 번호 2의 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 적어도 90% 서열 상동성을 가지고 아데닌-결합 수용체 활성을 보유하는, 아데닌-결합 G 단백질 커플된 수용체 폴리펩티드.
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 조절 서열에 작동가능하게 연결된 제 1항에서 정의된 핵산을 포함하는 발현 벡터.
10. 제 9항에 따른 벡터를 운반하는 분리된 숙주 세포.
11. 삭제
12. 서열 번호 1에 대해 적어도 90%의 서열 상동성을 가지는 분리된 핵산 서열에 의해 코딩되며 아데닌-결합 활성을 가지는 적어도 하나의 폴리펩티드로 이루어지는 G 단백질 커플된 수용체를 제공하고;

    상기 수용체를 추정되는 상호작용 화합물과 접촉시키며;

    임의로 상기 수용체를 동시 또는 순차적으로 아데노신과 접촉시키고;

    상기 화합물이 아데닌-유도 수용체 활성화의 효능제(agonist) 또는 길항제(antigonist)인지를 결정하는 것을 포함하는, 아데닌-결합 G 단백질 커플된 수용체와 상호작용할 수 있는 화합물의 분석법.
13. 제 12항에 있어서, 상기 상호작용이 상기 수용체에 결합하는 화합물의 능력에 의해 결정되는 분석법.
14. 제 12항에 있어서, 상기 상호작용이 상기 수용체의 활성을 조절하는 화합물의 능력에 의해 결정되는 분석법.
15. 제 12항에 있어서, 상기 수용체가 제 4항에 따른 폴리펩티드가 제 9항에 따른 벡터로부터 발현되는 세포막에 위치하는 분석법.
16. 제 12항의 분석법을 이용하여 퓨린 수용체와 관련된 질병의 치료용 조절제 화합물을 동정 방법.
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 제 16항에 있어서, 질병이 퓨린성 화합물을 이용한 치료로부터 이익을 얻는 질병인 동정 방법.
25. 제 16항에 있어서, 질병이 병리학적 진전, 침해수용, 기관지수축, 혈관확장 또는 염증과 관련된 동정 방법.
26. 제 16항에 있어서, 상기 조절제가 항발작제, 진정제, 최면제, 운동실조증, 저혈압제, 항부정맥제, 음성주기변동제, 변전도제, 강심제, 혈소판 응집의 억제제, NO 생성의 자극제, 또는 위액 분비의 억제제로서 작용하는 동정 방법.
27. 숙주 세포에 아데닌-결합 G 단백질 커플된 수용체를 코딩하는 서열 번호 1에 대해 적어도 90%의 서열 상동성를 가지며 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산을 제공하고;

    상기 숙주 세포를 추정되는 상호작용 화합물과 접촉시키며;

    임의로 상기 수용체를 동시 또는 순차적으로 아데노신과 접촉시키고;

    상기 화합물이 아데닌-유도 수용체 활성화의 효능제(agonist) 또는 길항제(antigonist)인지를 결정하는 것을 포함하는 아데닌-결합 G 단백질 커플된 수용체와 상호작용할 수 있는 화합물 분석법.

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