DE60133455T2

DE60133455T2 - G-protein gekoppelter rezeptor

Info

Publication number: DE60133455T2
Application number: DE60133455T
Authority: DE
Inventors: Eckhard Bender; Arjan Buist; Martine Ercken; Geert Luc Elisabeth Baggerman; Mirek Jurzak; Liliane Amelie Schoofs; Walter Herman Luyten
Original assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Current assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Priority date: 2000-04-04
Filing date: 2001-04-02
Publication date: 2009-04-30
Anticipated expiration: 2021-04-03
Also published as: DE60133455D1; GB0008252D0; NO20024779D0; CA2404679C; NO331506B1; CA2404679A1; EP1274729B1; IL152062A; ES2304382T3; IL152062A0; KR20020086723A; EP1274729A2; US20030157516A1; KR100851255B1; WO2001074902A2; NO20024779L; AU2001250410B2; US20070087388A1; JP4928702B2; AU5041001A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen G-Protein-gekoppelten Rezeptor aus Säugetieren, Nukleinsäure, die ihn codiert und seine Verwendung in Assays.
Hintergrund der Erfindung
GTP-Bindungsproteine (G-Proteine) wirken als Vermittler zwischen der Bindung von Liganden, wie Hormonen und anderen chemischen Mediatoren, an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) und der Aktivierung von intrazellulären Effektoren. Bei der Bindung eines Liganden an einen GPCR unterlaufen die zytoplasmatischen Domänen des Rezeptors Konformationsänderungen, welche die Wechselwirkung des Rezeptors mit einem G-Protein ermöglichen, was wiederum die Aktivierung intrazellulärer Vermittler, wie Adenylatcyclase, Phospholipase C oder Ionenkanäle, ermöglicht. Durch ein solches System lässt sich das ursprüngliche Signal amplifizieren, da als Antwort auf die Bindung eines einzelnen Liganden an den GPCR viele Second Messengers produziert werden können. Durch diesen Mechanismus sind Zellen in der Lage, Änderungen in ihrer äußeren Umgebung wahrzunehmen und darauf zu reagieren.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren bilden eine Superfamilie integraler Plasmamembranproteine, wobei jeder Rezeptor das gemeinsame Merkmal von sieben hydrophoben Transmembrandomänen aufweist, die jeweils 20–30 Aminosäuren lang sind und durch hydrophile Aminosäuresequenzen unterschiedlicher Länge verknüpft sind. Der Aminoterminus des Rezeptors ist extrazellulär, der Carboxyterminus befindet sich im Zytoplasma der Zelle.
GPCRs kommen in einer großen Auswahl von Geweben und Zelltypen vor und sind an vielen verschiedenen physiologischen Prozessen beteiligt. Sie werden durch eine große Auswahl an Liganden aktiviert, beispielsweise Hormone, wie luteinisierendes Hormon, follikelstimulierendes Hormon, Choriongonadotropin, Thyreotropin, Kortikotropin, Glukagon und Vasopressin; Neurotransmitter wie 5-HT, Acetylcholin (muscarinischer AchR), Histamin, Prostaglandine, Calcitonin, Leukotriene und Ca²⁺. Die breite Verteilung und große Varietät der Funktionen von GPCRs weisen darauf hin, dass GPCRs eine bedeutende Rolle bei einer Vielzahl von pathologischen Zuständen spielen können. In der Tat wurde festgestellt, dass GPCRs an Krankheiten beteiligt sind, die mit Bronchokonstriktion, Hypertonie, Inflammation, Hormonstörung, Diabetes, Apoptose, Nozizeption, Erleichterung der Neurotransmission oder Tremor zusammenhängen.
Eine Gruppe von besonders interessanten GPCRs sind diejenigen, die als Rezeptoren für Nukleotide wirken. Nukleotidrezeptoren sind in drei Familien untergliedert: P1, P2Y und P2X (Ralevic und Burnstock, 1998 Pharmacological Reviews 50 (3): 413–492), von denen die P1- und die P2Y-Familie GPCRs sind. P1-Rezeptoren werden durch Adenosin aktiviert und binden nicht an Adenin (Bruns et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77 (50: 5547–51, 1980; Schwabe and Trost, 1980 Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 313 (3): 197–87; Schwabe et al., 1982, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 321 (1): 84–87). Mitglieder der P1-Rezeptorfamilie werden in drei Unterfamilien unterteilt, die als die Adenosin-Typ-1-Familie, die Adenosin-Typ-2-Familie und die Adenosin-Typ-3-Familie bekannt sind.
Die P2Y-Familie enthält vier Familien von GPCRs, die durch Nukleotide aktiviert werden. Im Einzelnen sind dies P2Y1 (aktiviert durch ADP und ATP), P2Y2 (auch P2U genannt, diese GPCRs werden mit gleicher Potenz durch ATP und UTP aktiviert), P2Y3 und P2Y6 (die relative Agonistenstärke ist UDP > UTP > ADP) und P2Y4 (UTP>ATP). Eine Anzahl von anderen GPCRs mit Sequenzhomologie zu der P2Y2-Gruppe wurde ursprünglich ebenfalls für Nukleotidrezeptoren gehalten (P2Y5, P2Y7, P2Y9 und P2Y10); mittlerweile ist jedoch bekannt, dass sie nicht durch Nukleotide aktiviert werden.
Die P2X-Familie ist eine Gruppe von nicht verwandten Proteinen, die nicht mit G-Proteinen in Beziehung steht. Mitglieder dieser Gruppe sind ligandenabhängige Ionenkanäle.
Da G-Protein-gekoppelte Rezeptoren eine solch bedeutende Rolle bei einer großen Auswahl von zellulären und physiologischen Prozessen spielen, besteht ein beständiges Interesse an der Einschätzung der Funktion solcher Rezeptoren und ihrer potenziellen Rollen bei einer Vielfalt von Krankheiten.
Zusammenfassung der Erfindung
Im Rahmen der Forschung an GPCRs haben die vorliegenden Erfinder einen neuen GPCR entdeckt, der eine neue Klasse von GPCRs repräsentiert und Adenin-bindender GPCR genannt wurde. Beim Vergleich der Sequenz des neuen GPCR aus der Ratte mit denjenigen, die nach dem Stand der Technik zur Verfügung standen, stellten die Erfinder zu ihrer Überraschung fest, dass der am engsten verwandte GPCR nur ungefähr 50% Sequenzidentität mit dem neuen Rezeptor aufweist, was nahelegt, dass der neue GPCR ein Mitglied einer neuen Klasse von GPCRs darstellt. Weitere Studien identifizierten den natürlichen Liganden des Rezeptors als Adenin. Dies ist der erste Nachweis eines GPCR, der Adenin als natürlichen Liganden aufweist, was nahelegt, dass der GPCR eine neue Klasse von GPCRs repräsentiert. Dies ist in der Tat der erste Nachweis für einen Rezeptor einer beliebigen Art, der Adenin als natürlichen Liganden aufweist, und offenbart Adenin erstmals als Neurotransmitter, da festgestellt wurde, dass der neue Rezeptor im Kortex von Säugetieren vorhanden ist. Weitere Studien identifizierten sechs humane Homologe des Rezeptors.
Die vorliegende Erfindung offenbart einen Adenin-bindenden G-Protein-gekoppelten Rezeptor. Insbesondere offenbart die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polypeptid mit der Sequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4. Polypeptide, die Fragmente des Polypeptids der SEQ ID NO: 2 oder der SEQ ID NO: 4 sind, sind ebenfalls offenbart, wobei die Fragmente mindestens 10, beispielsweise mindestens 20, 30, 40, 50, 75, 100 oder 150, oder mehr Aminosäuren lang sind. Solche Fragmente können von der N-terminalen Region der SEQ ID NO: 2 bzw. der SEQ ID NO: 4 abgeleitet werden. Fragmente, welche die N-terminale Region einschließen, können zur Rekonstitution des extrazellulären Teils des Rezeptors eingesetzt werden, um Rezeptorbindungsstellen bereitzustellen. Vorzugsweise behalten die Fragmente die Fähigkeit zur Bindung von Adenin.
In einer anderen Ausführungsform offenbart die Erfindung ein isoliertes Polypeptid mit mindestens 50% und vorzugsweise mindestens 60%, 70%, 80%, 90%, 95% oder 98% Sequenzidentität zu dem Polypeptid der SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4. Solche Polypeptide behalten wünschenswerterweise die Fähigkeit zur Bindung von Adenin und vorzugsweise zur Bildung eines Rezeptors, der durch Adenin aktiviert werden kann.
Gleichermaßen sind Polypeptide, die Fragmente von mindestens 20 Aminosäuren Länge dieser Polypeptide sind, vorzugsweise mit mindestens 50% und vorzugsweise mindestens 60%, 70%, 80%, 90%, 95% oder 98% Identität mit einem Fragment der SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 entsprechender Länge, einschließlich N-terminaler Fragmente, offenbart. Solche Polypeptide behalten wünschenswerterweise die Fähigkeit zur Bindung von Adenin und vorzugsweise zur Bildung eines Rezeptors, der durch Adenin aktiviert werden kann.
Die vorliegende Erfindung offenbart auch eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid der SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 codiert. Bei einem bevorzugten Aspekt ist die isolierte Sequenz diejenige der SEQ ID NO: 1 oder der SEQ ID NO: 3. Die Erfindung offenbart auch ein DNA-Molekül, welches das Polypeptid der SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 codiert. Ebenfalls durch die Erfindung offenbart sind isolierte Nukleinsäuren, welche die in den beiden vorherigen Abschnitten erwähnten Polypeptide codieren. Weiterhin offenbart sind DNA-Moleküle, welche die Polypeptide codieren.
Nukleinsäuren, die offenbart sind, umfassen weiterhin Nukleinsäuren, die eine Sequenz umfassen mit mindestens 50% und vorzugsweise mindestens 60%, 70%, 80%, 90%, 95% oder 98% Sequenzidentität zu den Nukleinsäuresequenzen der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8 oder 9 oder ihrer Komplemente. Vorzugsweise hybridisieren diese Sequenzen mit der entsprechenden Nukleinsäure unter Bedingungen, die kontrolliert werden, um unspezifische Bindung zu minimieren. Vorzugsweise sind stringente bis moderat stringente Hybridisierungsbedingungen bevorzugt. Geeignete Bedingungen umfassen, zum Beispiel zum Nachweis von Sequenzen, die zu etwa 80–90% identisch sind, Hybridisierung über Nacht bei 42°C in 0,25 M Na₂HPO₄, pH 7,2, 6,5% SDS, 10% Dextransulfat und eine abschließende Wäsche bei 55°C in 0,1 X SSC, 0,1% SDS. Zum Nachweis von Sequenzen, die mehr als etwa 90% identisch sind, umfassen geeignete Bedingungen Hybridisierung über Nacht bei 65°C in 0,25 M Na₂HPO₄, pH 7,2, 6,5% SDS, 10% Dextransulfat und eine abschließende Wäsche bei 60°C in 0,1 X SSC, 0,1% SDS.
Es wird davon ausgegangen, dass solche Nukleinsäuren nicht notwendigerweise „Volllängen"-Polypeptide codieren und somit Nukleinsäuren einschließen, die beispielsweise mutante Formen des Adenin-bindender-GPCR-Gens darstellen, in denen die codierende Sequenz vorzeitig terminiert worden ist, durch eine Substitution, die entweder zu einem Stopp-Codon oder zu einer Leserasterverschiebung führt.
Die Erfindung offenbart auch Nukleinsäuren, die Fragmente der Nukleinsäuren sind, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codieren. Bei einem Aspekt offenbart die Erfindung Nukleinsäure-Primer, die im Wesentlichen aus 15 bis 50, beispielsweise 15 bis 35, 18 bis 35, 15 bis 24, 18 bis 30, 18 bis 21 oder 21 bis 24 Nukleotiden einer Sequenz bestehen, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder sein Komplement codiert.
Nukleinsäuren und Polypeptide der Erfindung können therapeutisch zur Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden. Insbesondere können sie zur Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden, deren Pathologie mit der Wirkung an Purinrezeptoren zusammenhängt, insbesondere derjenigen, die mit Mutation oder Verminderung der Expression von nativen Adenin-bindenden GPCRs zusammenhängen. Speziell können sie als Antikonvulsiva, Sedativa, Hypnotika, Hypotensiva, Antiarrhythmika, als negativ chronotrope, dromotrope und inotrope Mittel, oder bei der Behandlung von pathologischem Tremor, Ataxie oder von Erkrankungen, die mit Nozizeption oder der Erleichterung der Neurotransmission assoziiert sind, eingesetzt werden. Weiterhin können sie sowohl bei Störungen, die mit dem ZNS zusammenhängen, Anwendung finden als auch als Inhibitoren der Blutplättchenaggregation, als Stimulatoren der NO-Produktion durch vaskuläre Endothelzellen im Herz-Kreislauf-System, als Inhibitoren der Magensekretion oder bei einer Erkrankung, die mit Apoptose, Bronchokonstriktion, Vasodilatation oder Inflammation assoziiert ist, eingesetzt werden.
Bei einem weiteren Aspekt sind Vektoren offenbart, welche die Sequenzen der Nukleinsäuren umfassen, insbesondere Expressionsvektoren, die einen Promotor umfassen, der mit den Nukleinsäuresequenzen der Erfindung funktionsfähig verknüpft ist. Die Vektoren können in eine Wirtszelle übertragen und innerhalb der Zelle exprimiert werden. Nach der Expression können erfindungsgemäße Polypeptide gewonnen werden.
Bei einem weiteren Aspekt offenbart die Erfindung Assay-Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die an Polypeptide der Erfindung binden oder deren Aktivität modulieren. Insbesondere ist vorgesehen, dass solche Substanzen, die Peptidsubstanzen oder Nicht-Peptidsubstanzen sein können, bei Verfahren zur Behandlung, wie vorstehend beschrieben, eingesetzt werden können.
Da die vorliegenden Erfinder als Erste einen Rezeptor einer beliebigen Art identifiziert haben, der Adenin als natürlichen Liganden aufweist, und da festgestellt wurde, dass der neue Rezeptor im Kortex von Säugetieren vorhanden ist, sind die Erfinder die Ersten, die Adenin als Neurotransmitter offenbaren. Daher eröffnet die vorliegende Erfindung die Möglichkeit der Verwendung von Adenin an sich und/oder Verbindungen, die Adenin bei therapeutischen Anwendungen imitieren oder antagonisieren. Daher offenbart die Erfindung weiterhin Adenin zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung eines humanen oder tierischen Körpers. Insbesondere ist vorgesehen, dass Adenin zur Behandlung von Krankheiten eingesetzt wird, deren Pathologie mit der Wirkung an Purinrezeptoren, insbesondere Adeninrezeptoren, assoziiert ist. Weiterhin offenbart die Erfindung die Verwendung von Adenin bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von einer der vorstehend beschriebenen Krankheiten oder Zustände.
Die Erfindung offenbart auch Antikörper und bindende Fragmente davon, die in der Lage sind, selektiv an erfindungsgemäße Polypeptide zu binden. Die Antikörper und die bindenden Fragmente können daher bei diagnostischen Tests zur Identifizierung der erfindungsgemäßen Polypeptide in biologischen Proben verwendet werden.
Diese und weitere Aspekte der Erfindung sind hier ausführlicher beschrieben.
Beschreibung der Sequenzen

SEQ ID NO: 1 ist die Nukleotidsequenz des Adenin-bindenden GPCR aus Ratte.
SEQ ID NO: 2 ist die Aminosäuresequenz des Adenin-bindenden GPCR aus Ratte.
SEQ ID NO: 3 ist die Nukleotidsequenz des humanen Adenin-bindenden GPCR1.
SEQ ID NO: 4 ist die Aminosäuresequenz des humanen Adenin-bindenden GPCR1.
SEQ ID NO: 5 ist die Nukleotidsequenz des humanen Adenin-bindenden GPCR2.
SEQ ID NO: 6 ist die Nukleotidsequenz des humanen Adenin-bindenden GPCR3.
SEQ ID NO: 7 ist die Nukleotidsequenz des humanen Adenin-bindenden GPCR4.
SEQ ID NO: 8 ist die Nukleotidsequenz des humanen Adenin-bindenden GPCR5.
SEQ ID NO: 9 ist die Nukleotidsequenz des humanen Adenin-bindenden GPCR6.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt das Sequenz-Alignment der Aminosäuresequenzen des Adenin-bindenden GPCR aus Ratte (SEQ ID NO: 2) und des humanen Adenin-bindenden GPCR1 (SEQ ID NO: 4).
2 illustriert die Aktivierung von Adenin-bindendem GPCR aus Ratte durch porcine Kortexextrakt-C18-Fraktionen nach transienter Transfektion in HEK293-Zellen, welche die Gαqo-Chimäre exprimieren.
3 illustriert die Aktivierung von Adenin-bindendem GPCR durch porcine Kortexextrakt-C18-Fraktionen nach transienter Transfektion in HEK293-Zellen, welche die Gαqi-Chimäre exprimieren.
4 illustriert die Stimulierung von Ca²⁺-Transienten in HEK293/Gαqi-Zellen, die mit Adenin-bindendem GPCR aus Ratte/pcDNA3 transfiziert wurden, durch Applikation von 3,3 nM bis 33 μM Adenin.
5 illustriert Ca²⁺-Transienten, die in HEK293/Gαgi-Zellen ausgelöst wurden, die mit Adenin-bindendem GPCR aus Ratte/pcDNA3 transfiziert wurden, durch Applikation von 3,3 μM Uridin, Guanin, Hypoxanthin, Xanthin, Koffein, UDP und Adenin.
6 illustriert die Ca²⁺-Transienten, die in HEK293/Gαqi-Zellen ausgelöst wurden, die mit Adenin-bindendem GPCR aus Ratte/pcDNA3 transfiziert wurden, durch Applikation von 3,3·M Adenosin, AMP, ADP, ATP und Adenin.
7 illustriert die Ca²⁺-Transienten, die in HEK293/Gαqi-Zellen ausgelöst wurden, die mit Adenin-bindendem GPCR aus Ratte/pcDNA3 transfiziert wurden, durch Applikation von 3·M PBS, Xanthin, Guanin und Hypoxanthin.
8a illustriert die Stimulierung der [³⁵S] GTPγS-Bindung an Membranen von CHO-Zellen, die transient transfiziert wurden mit dem Adenin-bindendem GPCR aus Ratte. Die Daten sind als Mittelwert von 3 unabhängigen Experimenten (±SEM; n = 3) dargestellt.
8b illustriert die Stimulierung der [³⁵S] GTPγS-Bindung an Membranen von Wildtyp-CHO-Zellen. Die Daten sind als Mittelwert von 3 unabhängigen Experimenten (±SEM; n = 3) dargestellt.
9a illustriert die Hemmung der Forskolin-stimulierten cAMP-Bildung in CHO-Zellen, die transient mit dem Adenin-bindendem GPCR aus Ratte transfiziert wurden. Der Assay wurde in 0,5% hiFCS unter Verwendung des Direct-RIA-Kits von NEN durchgeführt. Repräsentative Kurven.
9b illustriert die Hemmung der Forskolin-stimulierten cAMP-Bildung in CHO-Zellen, die transient mit dem Adenin-bindendem GPCR aus Ratte transfiziert wurden. Der Assay wurde 2% hiFCS unter Verwendung des Direct-RIA-Kits von NEN durchgeführt. Repräsentative Kurven.
10 zeigt die Adenin-Dosisreaktionskurve für die Stimulierung der [³⁵S] GTPγS-Bindung an CHO-Membranen, die permanent mit dem Adenin-bindendem GPCR aus Ratte transfiziert wurden.
11a illustriert die Hemmung der Forskolin-stimulierten cAMP-Bildung in CHO-Zellen, die permanent mit dem Adenin-bindendem GPCR aus Ratte (Klon 28) transfiziert wurden. Die Figur zeigt repräsentative Kurven, die unter Verwendung von 0,5 und 10% Serumkonzentration, jeweils in Gegenwart und Abwesenheit von Natriumbutyrat-Induktion, erhalten wurden.
11b illustriert die Hemmung der Forskolin-stimulierten cAMP-Bildung in Wildtyp-CHO-Zellen. Die Figur zeigt repräsentative Kurven, die unter Verwendung von 0,5 und 10% Serumkonzentration erhalten wurden, jeweils in Gegenwart und Abwesenheit von Natriumbutyrat-Induktion.
12a zeigt Adenin-Dosisreaktionskurven von intrazellulären Ca²⁺-Messungen in CHO-Zellen, die permanent mit dem Adenin-bindendem GPCR aus Ratte (Klon 28) transfiziert wurden, in Gegenwart und Abwesenheit von Natriumbutyrat.
12b zeigt die Adenin-Dosisreaktionskurven von intrazellulären Ca²⁺-Messungen an Wildtyp-CHO-Zellen, in Gegenwart und Abwesenheit von Natriumbutyrat.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung Nukleinsäure
Nukleinsäure umfasst DNA (einschließlich sowohl genomischer als auch cDNA) und RNA. Wenn Nukleinsäure gemäß der Erfindung RNA einschließt, sollte der Verweis auf die Sequenzen, die in den beigefügten Protokollen gezeigt sind, als Verweis auf das RNA-Äquivalent verstanden werden, wobei T durch U zu ersetzen ist.
Die erfindungsgemäße Nukleinsaure kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Erfindungsgemäße einzelsträngige Nukleinsäuren umfassen Antisense-Nukleinsäuren. Somit ist es selbstverständlich, dass ein Verweis auf die SEQ ID NO: 1 oder auf Sequenzen, die SEQ ID NO: 1 oder Fragmente davon einschließen, komplementäre Sequenzen umfasst, es sei denn, der Zusammenhang weist eindeutig auf das Gegenteil hin. Das Gleiche gilt für SEQ ID NOs: 3, 5, 6, 7, 8 und 9.
Im Allgemeinen wird erfindungsgemäße Nukleinsäure als ein Isolat, in isolierter und/oder gereinigter Form, oder frei oder im Wesentlichen frei von Material, mit dem sie natürlicherweise assoziiert ist, bereitgestellt, wie z. B. frei oder im Wesentlichen frei von Nukleinsäure, die das Gen im humanen Genom flankiert, möglicherweise mit Ausnahme von einer oder mehreren regulatorischen Sequenz(en) zur Expression. Die Nukleinsäure kann vollständig oder teilweise synthetisch sein und kann genomische DNA, cDNA oder RNA einschließen.
Die Erfindung offenbart auch Nukleinsäuren, die Fragmente der Nukleinsäuren sind, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codieren. Bei einem Aspekt offenbart die Erfindung Nukleinsäure-Primer, die im Wesentlichen aus 15 bis 50, beispielsweise 15 bis 35, 18 bis 35, 15 bis 24, 18 bis 30, 18 bis 21 oder 21 bis 24 Nukleotiden einer Sequenz bestehen, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder sein Komplement codiert.
Der Begriff „bestehen im Wesentlichen aus" bezieht sich auf Nukleinsäuren, die keine zusätzlichen 5'- oder 3'-Nukleinsäuresequenzen einschließen. Bei einem weiteren Aspekt der Erfindung können allerdings Nukleinsäuren der Erfindung, die, wie vorstehend definiert, im Wesentlichen aus 15 bis 30 Nukleotiden bestehen, am 3'-, jedoch vorzugsweise am 5'-Ende mit kurzen (z. B. 4 bis 15 Nukleotide, wie 4 bis 10 Nukleotide) zusätzlichen Sequenzen verknüpft sein, mit denen sie von Natur aus nicht verknüpft sind. Solche zusätzlichen Sequenzen sind vorzugsweise Linker, die eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle umfassen, um das Klonieren zu erleichtern, wenn die erfindungsgemäße Nukleinsäure beispielsweise als ein PCR-Primer verwendet wird.
Erfindungsgemäße Primer sind wünschenswerterweise in der Lage, selektiv mit Nukleinsäuren zu hybridisieren, welche die erfindungsgemäßen Polypeptide codieren. „Selektiv" bedeutet selektiv bezüglich Sequenzen, die andere Purinrezeptoren codieren, und insbesondere bezüglich anderer Rezeptoren als Adeninrezeptoren. Die Fähigkeit der Sequenz zur selektiven Hybridisierung kann experimentell bestimmt oder berechnet werden.
Beispielsweise besteht ein Weg zur Berechnung der im eines Primers in der Bezugnahme auf die Formel zur Berechnung der Tm von Primer gegenüber einer homologen Zielsequenz. Diese Formel ist Tm[°C] = 2(A + T) + 4(G + C) – 5. Dies liefert die Tm unter Bedingungen von 3 × SSC und 0,1% SDS (wobei SSC 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7, ist). Diese Formel ist im Allgemeinen für Primer von bis zu etwa 50 Nukleotiden Länge geeignet. Bei der vorliegenden Erfindung kann diese Formel als ein Algorithmus zur Berechnung einer nominalen Tm eines Primers für eine festgelegte Sequenz eingesetzt werden, die sich von einer Sequenz ableitet, die ein Polypeptid der Erfindung codiert. Die Tm kann mit einer berechneten Tm für die GPCR-Sequenzen von Mensch und Ratte verglichen werden, auf der Grundlage der maximalen Anzahl von Übereinstimmungen mit jedem beliebigen Teil dieser anderen Sequenzen.
Geeignete Bedingungen für einen Primer zur Hybridisierung an eine Zielsequenz können auch experimentell gemessen werden. Geeignete experimentelle Bedingungen umfassen die Hybridisierung eines Kandidaten-Primers mit sowohl Nukleinsäure, die ein Polypeptid der Erfindung codiert, als auch Nukleinsäure, die anderen Adeninrezeptoren codiert, an einem festen Träger unter Hybridisierungsbedingungen niedriger Stringenz (z. B. 6 × SSC bei 55°C), Waschen bei reduzierter SSC-Konzentration und/oder niedrigerer Temperatur, beispielsweise bei 0,2 × SSC bei 45°C, und inkrementelles Erhöhen der Hybridisierungstemperatur, um Hybridisierungsbedingungen zu bestimmen, durch die sich der Primer mit Nukleinsäure hybridisieren lässt, die ein Polypeptid der Erfindung codiert, jedoch nicht mit anderen Purinrezeptor-codierende Nukleinsäuren.
Erfindungsgemäße Nukleinsäuren, insbesondere Primer, können eine Detektionsmarkierung tragen. Geeignete Markierungen umfassen Radioisotope, wie ³²P oder ³⁵S, Fluoreszenzmarkierungen, Enzymmarkierungen oder andere Proteinmarkierungen, wie Biotin. Solche Markierungen können an Polynukleotide oder Primer der Erfindung angefügt werden und können unter Verwendung von an sich bekannten Techniken nachgewiesen werden.
Erfindungsgemäße Primer können aus synthetischen Nukleinsäuren bestehen, wie diejenigen mit modifizierten Rückgratstrukturen, die zur Verbesserung der Stabilität der Nukleinsäure in einer Zelle gedacht sind. Verschiedene Typen von Modifikationen an Oligonukleotiden sind im Fachgebiet bekannt. Diese umfassen Methylphosphonat- und Phosphorothioat-Rückgrat, die Addition von Acridin- oder Polylysin-Ketten am 3'- und/oder 5'-Ende des Moleküls. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist es selbstverständlich, dass die hier beschriebenen Polynukleotide durch jedes im Fachgebiet zur Verfügung stehende Verfahren modifiziert werden können. Solche Modifikationen können durchgeführt werden, um die In-vivo-Aktivität oder die Lebensdauer von erfindungsgemäßen Polynukieotiden zu verbessern.
Ebenfalls offenbart sind Antisense-Sequenzen, die auf den hier beschriebenen Nukleinsäure-Sequenzen basieren, vorzugsweise in der Form von Oligonukleotiden, insbesondere stabilisierten Oligonukleotiden oder Ribozymen.
Antisense-Oligonukleotide können zur Hybridisierung an die Komplementärsequenz von Nukleinsäure, prä-mRNA oder reifer mRNA, konstruiert sein, wobei sie die Produktion von Polypeptid stören, welches von einer gegebenen Ziel-DNA-Sequenz codiert wird, sodass dessen Expression herabgesetzt oder vollkommen verhindert wird. Ribozyme sind zur Spaltung von mRNA konstruiert, die von einer Adenin-bindender-GPCR-codierenden Nukleinsäuresequenz der Erfindung codiert wird, wünschenswerterweise einer Zielsequenz, die für den Adenin-bindenden GPCR spezifisch ist, d. h. eine, die in anderen GPCR-Sequenzen nicht vorkommt. Die Konstruktion von Antisense-Sequenzen und ihre Verwendung ist bei Peyman und Ulman, Chemical Reviews, 90: 543–584, (1990), Crooke, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32: 329–376, (1992), sowie Zamecnik und Stephenson, P. N. A. S, 75: 280–284, (1974) beschrieben. Die Konstruktion von Ribozymen und ihre Verwendung ist beispielsweise bei Gibson und Shillitoe, Molecular Biotechnology 7 (2): 125–137, (1997) beschrieben.
Erfindungsgemäße Antisense- und Ribozym-Sequenzen können in kultivierte Säugerzelllinien eingebracht werden, um die Funktion des Adenin-bindenden GPCR zu untersuchen, beispielsweise durch Verminderung der Expression dieses Gens und Beobachten von phänotypischen Effekten oder der Expression oder Lokalisation von hier beschriebenen Proteinen, die mit Adenin-bindendem GPCR assoziieren. In Fällen, wobei aberrante Expression von Adenin-bindendem GPCR auftritt, können solche Antisense- und Ribozym-Sequenzen zur Verminderung der Expression des Gens eingesetzt werden.
Die cDNA-Sequenz des erfindungsgemäßen GPCR kann unter Verwendung von Standard-PCR-(Polymerasekettenreaktion)-Klonierungstechniken kloniert werden. Dies umfasst das Herstellen eines Paares von Primern gegen 5'- und 3'-Ende an gegenüberliegenden Strängen der SEQ ID NO: 1, das Inkontaktbringen der Primer mit mRNA oder cDNA, die aus einer kortikalen Säugerzelle erhalten wurde, Durchführen einer Polymerasekettenreaktion unter Bedingungen, welche die Amplifikation der gewünschten Region bewirken, Isolierung des amplifizierten Fragments (z. B. durch Reinigen des Reaktionsgemisches auf einem Agarosegel) und Gewinnen der amplifizierten DNA. Die Primer können so konstruiert sein, dass sie geeignete Restriktionsenzym-Erkennungsstellen enthalten, sodass die amplifizierte DNA in einen geeigneten Klonierungsvektor kloniert werden kann. Das Gleiche gilt für die SEQ ID NOS: 3, 5, 6, 7, 8 und 9.
Polynukleotide, die nicht 100% homolog zu der Sequenz der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 sind, die aber entweder die SEQ ID NO: 2 oder die SEQ ID NO: 4 oder andere erfindungsgemäße Polypeptide codieren, können auf eine Anzahl von Wegen erhalten werden.
Beispielsweise kann eine ortsspezifische Mutagenese der Sequenz der SEQ ID NO: 1 oder der SEQ ID NO: 3 durchgeführt werden. Dies ist geeignet, wenn beispielsweise stille Codonänderungen an Sequenzen erforderlich sind, um die Codonpräferenzen für eine bestimmte Wirtszelle zu optimieren, in der die Polynukleotidsequenzen exprimiert werden. Andere Sequenzänderungen können gewünscht sein, um Restriktionsenzym-Erkennungsstellen einzubringen oder um die Eigenschaft oder Funktion der durch die Polynukleotide codierten Polypeptide zu ändern. Weitere Änderungen können erwünscht sein, um bestimmte Codonänderungen zu erzeugen, die erforderlich sind, um beispielsweise konservative Substitutionen bereitzustellen.
Die Nukleinsäuren der Erfindung können zusätzliche Sequenzen am 5'- oder 3'-Ende umfassen. Beispielsweise können synthetische oder natürliche 5'-Leader-Sequenzen mit der Nukleinsäure verknüpft sein, die erfindungsgemäße Polypeptide codiert. Die zusätzlichen Sequenzen können auch 5'- oder 3'-Untranslatierte-Regionen umfassen, die für die Transkription von erfindungsgemäßer Nukleinsäure in bestimmten Wirtszellen erforderlich sind.
Zusätzlich können andere tierische, insbesondere Säugetiere- (z. B. humane oder Kaninchen-), insbesondere Primaten-, einschließlich humane, Homologe von Adeninbindendem GPCR erhalten werden. Solche Sequenzen können erhalten werden durch Herstellen oder Erhalten von cDNA-Bibliotheken, die aus der Teilung von Zellen oder Geweben hergestellt werden, oder von genomischen DNA-Bibliotheken aus anderen tierischen Spezies, und Sondieren solcher Bibliotheken mit Sonden, welche die gesamte oder einen Teil der SEQ ID NO: 1 oder der SEQ ID NO: 3 umfassen, unter Bedingungen von mittlerer bis hoher Stringenz (beispielsweise 0,03 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat bei etwa 50°C bis etwa 60°C).
Die vorliegende Erfindung offenbart weiterhin eine isolierte DNA-Sequenz, die Sequenzen umfasst, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codieren, in dem jedoch die codierenden Sequenzen in zwei oder mehr (vorzugsweise nicht mehr als fünf, z. B. vier oder drei) Exons aufgeteilt sind. Solche Exonsequenzen können natürlich sein und können aus genomischen Klonen oder synthetisch erhalten werden. Exonsequenzen können bei der Konstruktion von Minigensequenzen eingesetzt werden, die Nukleinsäure umfassen, die Polypeptide der Erfindung codiert, wobei deren Sequenzen durch ein oder mehrere Exonsequenzen unterbrochen sind.
Minigene können auch unter Verwendung von heterologen Exons konstruiert werden, die aus einer beliebigen eukaryontischen Quelle stammen.
Erfindungsgemäße Nukleinsäure, wie eine codierende Sequenz voller Länge oder eine Oligonukleotidsonde oder ein Primer, können als Teil eines Kits, z. B. in einem geeigneten Behälter, wie einem Röhrchen, in dem der Inhalt vor der äußeren Umgebung geschützt ist, bereitgestellt werden. Das Kit kann Anweisungen zur Verwendung der Nukleinsäure, z. B. zur PCR und/oder bei einem Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart der betreffenden Nukleinsäure in einer Testprobe, einschließen. Ein Kit, bei dem die Nukleinsäure zur Verwendung bei einer PCR vorgesehen ist, kann eine oder mehrere weitere Reagenzien einschließen, die für die Reaktion erforderlich sind, wie Polymerase, Nucleotide, Pufferlösung, etc.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann in Nukleinsäure-basierten Tests zum Nachweis der Adenin-bindenden GPCR-codierenden Sequenzen im Körper von Ratte, Mensch oder anderen Säugertieren oder daraus erhaltenen Geweben oder Proben eingesetzt werden. Der Nachweis kann qualitativ und/oder quantitativ erfolgen, einschließlich solcher Verfahren wie Microarray-Technologie auf einem DNA-Chip. Der Nachweis umfasst analytische Schritte, wie diejenigen, die das vollständige oder teilweise Sequenzieren des Gens umfassen.
Solche Tests zum Nachweis umfassen im Allgemeinen das Inkontaktbringen einer humanen Probe, die DNA oder RNA enthält, mit einer Sonde, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäßen Primer umfasst, unter Hybridisierungsbedingungen und Nachweis jedes zwischen der Sonde und der Nukleinsäure in der Probe gebildeten Doppelstrangs. Ein solcher Nachweis kann unter Verwendung von Techniken, wie PCR, oder durch Immobilisieren der Sonde auf einem festen Träger, Entfernung von Nukleinsäure in der Probe, die nicht mit der Sonde hybridisiert hat und anschließendem Nachweis der Nukleinsäure, die mit der Sonde hybridisiert hat, erreicht werden. Alternativ kann die Proben-Nukleinsäure auf einem festen Träger immobilisiert werden, und es kann die an einen solchen Träger gebundene Menge an Sonde nachgewiesen werden. Geeignete Assay-Verfahren in diesem und allen anderen Formaten können beispielsweise in WO 89/03891 und WO 90/13667 gefunden werden.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Nachweisverfahren besteht im Nachweis von Änderungen an Wildtyp-Adenin-bindender-GPCR-Genen, einschließlich einzelner Basenpaaränderungen, beispielsweise unter Verwendung von Einzelstrang-Konformationspolymorphismus-(SSCP)-Analyse. Die Nukleinsäuresequenz einer ganzen oder von einem Teil einer Adenin-bindender-GPCR-codierenden DNA oder mRNA in einer Probe kann mit einer Referenzsequenz hybridisiert werden, und die Mobilität des Hybrids wird in einem Gel unter Bedingungen beobachtet, bei denen jegliche nicht hybridisierte Regionen innerhalb des Doppelstrangs Änderungen in der Mobilität verursachen.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sind auch für Gewebeverteilungsstudien geeignet, um die Kenntnis über die Verteilung dieses Gens im Kortex, in der Dorsalwurzel, im ZNS und PNS und anderen Geweben zu bestätigen und auszuweiten.
Polypeptide
Isolierte erfindungsgemäße Polypeptide sind jene in, wie vorstehend definiert, isolierter Form, frei oder im Wesentlichen frei von Material, mit dem sie natürlicherweise assoziiert sind, wie z. B. andere Polypeptide, mit denen sie in der Zelle vorkommen. Die Polypeptide können natürlich mit Verdünnungsmitteln oder Adjuvanzien formuliert sein und für praktische Zwecke immer noch isoliert sein; beispielsweise werden die Polypeptide normalerweise mit Gelatine oder anderen Trägern vermischt, wenn sie zur Beschichtung von Mikrotiterplatten zur Verwendung bei Immunoassays eingesetzt werden. Die Polypeptide können glycosyliert sein, entweder natürlicherweise oder durch Systeme von heterologen eukaryontischen Zellen, oder sie können (beispielsweise wenn sie durch Expression in einer prokaryontischen Zelle produziert werden) unglycosyliert sein. Die Polypeptide können phosphoryliert und/oder acetyliert sein.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann auch in einer im Wesentlichen gereinigten Form vorliegen; in diesem Fall umfasst es im Allgemeinen das Polypeptid in einer Zubereitung, in der mehr als 90%, z. B. 95%, 98% oder 99% des Polypeptids in der Zubereitung ein erfindungsgemäßes Polypeptid ist.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können modifiziert werden, beispielsweise durch Zugabe von Histidinresten, um ihre Reinigung zu erleichtern, oder durch die Zugabe einer Signalsequenz, um ihre Sekretion aus einer Zelle zu bewirken.
Polypeptide mit mindestens 50%, beispielsweise 60%, 70%, 80%, 90%, 95% oder 98% Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 können Polypeptide sein, die Aminosäuresequenzvarianten, Allele, Derivative oder Mutanten der SEQ ID NO: 2 bzw. SEQ ID NO: 4 sind, und sind auch in der vorliegenden Erfindung offenbart. Beispielsweise kann ein solches Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweisen, die sich von derjenigen, die in der SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 angegeben ist, um eine oder mehr aus Addition, Substitution, Deletion und Insertion von einer oder mehr (wie 1 bis 20, beispielsweise 2, 3, 4, oder 5 bis 10) Aminosäuren unterscheidet.
Die prozentuale Identität von Polypeptidsequenzen kann unter Verwendung von im Handel erhältlichen Algorithmen berechnet werden, die eine Referenzsequenz (z. B. SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 der vorliegenden Erfindung) mit einer Abfragesequenz vergleichen. Weitere Einzelheiten zur Bewertung der Identität sind nachstehend beschrieben.
Bei der vorliegenden Untersuchung wurde die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 2 durch BLAST-Suche (Altschul et al., 1997) analysiert, um zu überprüfen, ob verwandte GPCRs mit bekannten Liganden gefunden werden könnten. Allerdings waren die nächsten Homologe dieses Orphan-GPCR, die gefunden wurden, selbst Orphan-GPCRs. Dies war eine Familie von humanen GPCRs (Derwent Sequenzdatenbank-Zugriffsnummern 210067, 210068, 210069, 210070, 210071 und 210072), kloniert aus Dorsalwurzelganglion, die ungefähr 50% der Reste mit dem Adenin-bindenden GPCR aus Ratte gemeinsam hat. Die vorliegenden Erfinder haben nun diese sechs Orphan-GPCRs als sechs humane Homologe des Adenin-bindenden GPCR aus Ratte identifiziert. Die sechs Homologe wurden humaner Adenin-bindender GPCR 1, 2, 3, 4, 5 bzw. 6 genannt. Das nächste Homolog ist das Mas related Gene, welches 33% der Reste mit dem Adenin-bindenden GPCR gemeinsam hat.
Wenn ermittelt wird, dass eine in Abfragesequenz eine Identität von mindestens 50% und vorzugsweise von mindestens 60%, 70%, 80%, 90%, 95% oder 98%, zu der von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 aufweist, wobei die Sequenz die eines Polypeptids ist, das Adenin-bindender-Rezeptoraktivität behält, ist eine solche Sequenz ebenfalls offenbart.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann isoliert und/oder gereinigt werden (z. B. unter Verwendung eines Antikörpers), beispielsweise nach Produktion durch Expression aus codierender Nukleinsäure. Das isolierte und/oder gereinigte Polypeptid kann bei der Formulierung einer Zusammensetzung eingesetzt werden, die mindestens eine zusätzliche Komponente einschließen kann, beispielsweise eine pharmazeutische Zusammensetzung, einschließlich eines pharmazeutisch verträglichen Exzipienten, Vehikels oder Trägers.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann als ein Immunogen eingesetzt werden oder anderweitig zum Erhalt spezifischer Antikörper eingesetzt werden. Antikörper sind geeignet zur Reinigung und anderen Manipulationen von Polypeptiden, zum diagnostischen Screening und in therapeutischem Zusammenhang. Dies wird weiter unten erläutert.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann beim Screening nach Molekülen eingesetzt werden, die daran binden oder seine Aktivität oder Funktion modulieren. Solche Moleküle können in einem therapeutischen (möglicherweise einschließlich einem prophylaktischen) Zusammenhang geeignet sein.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann mit einer Detektionsmarkierung markiert sein. Die Detektionsmarkierung kann jede geeignete Markierung sein, die den Nachweis des Polypeptids erlaubt. Geeignete Marker umfassen Radioisotope, z. B. ¹²⁵1, Enzyme, Antikörper, Polynukleotide und Linker, wie Biotin. Markierte erfindungsgemäße Polypeptide können bei diagnostischen Verfahren, wie Immunoassays eingesetzt werden, um die Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptids in einer Probe zu bestimmen. Erfindungsgemäße Polypeptide oder erfindungsgemäße markierte Polypeptide können auch in serologischen oder Cell-mediated Immunoassays eingesetzt werden, zum Nachweis der Immunreaktivität gegenüber den Polypeptiden in Tieren und Menschen unter Verwendung von Standardprotokollen.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid, oder ein erfindungsgemäßes markiertes Polypeptid oder Fragment davon, kann auch an einer festen Phase fixiert werden, beispielsweise an der Oberfläche eines Immunoassay-Wells oder Teststäbchens. Solche markierten und/oder immobilisierten Polypeptide können in einem geeigneten Behälter zu Kits gepackt sein, zusammen mit geeigneten Reagenzien, Kontrollen, Anleitungen und dergleichen.
Solche Polypeptide und Kits können bei Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen solche Polypeptide, die in einer Probe vorhanden sind, oder von aktiven Teilen oder Fragmenten davon, mittels Immunoassay verwendet werden.
Immunoassay-Verfahren sind im Fachgebiet wohlbekannt und umfassen im Allgemeinen:

(a) Bereitstellen eines Polypeptids, das ein Epitop umfasst, das durch einen Antikörper gegen das Protein gebunden werden kann;
(b) Inkubieren einer biologischen Probe mit dem Polypeptid unter Bedingungen, die die Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes erlauben; und
(c) Bestimmen, ob der Antikörper-Antigen-Komplex, der das Polypeptid umfasst, gebildet wurde.

Sequenzidentität
Die prozentuale Identität von Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen kann unter Verwendung von im Handel erhältlichen Algorithmen berechnet werden, die eine Referenzsequenz mit einer Abfragesequenz vergleichen. Die folgenden Programme (bereitgestellt vom National Center for Biotechnology Information) können zur Bestimmung von Homologien/Identitäten verwendet werden: BLAST, gapped BLAST, BLASTN und PSI-BLAST, die mit Standardparametern verwendet werden können.
Der Algorithmus GAP (Genetics Computer Group, Madison, WI) verwendet den Needleman-Wunsch-Algorithmus zum Alignment von zwei vollständigen Sequenzen, welcher die Anzahl von Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl von Gaps minimiert. Im Allgemeinen werden die Standardparameter verwendet, mit einer Gap Creation Penalty = 12 und einer Gap Extension Penalty = 4.
Ein weiteres Verfahren zum Bestimmen der besten Gesamtübereinstimmung zwischen einer Nukleinsäuresequenz oder einem Teil davon und einer Abfragesequenz besteht in der Verwendung des FASTDB-Computerprogramms auf der Grundlage des Algorithmus von Brutlag et al. (Corp. App. Biosci., 6; 237–245 (1990)). Das Programm stellt ein globales Sequenz-Alignment bereit. Das Ergebnis des globalen Sequenz-Alignments wird in prozentualer Identität angegeben. Geeignete Parameter, die bei einer FASTDB-Analyse einer DNA-Sequenz verwendet werden, um die prozentuale Identität zu berechnen, sind: Matrix = Unitary, k-tuple = 4, Mismatch penalty = 1, Joining Penalty = 30, Randomization Group Length = 0, Cutoff Score = 1, Gap Penalty = 5, Gap Size Penalty = 0,05, und Window Score = 500 oder Abfragesequenzlänge in Nukleotidbasen, je nachdem was kürzer ist. Geeignete Parameter zur Berechnung der prozentualen Identität und Ähnlichkeit eines Aminosäure-Alignments sind: Matrix = PAM 150, k-tuple = 2, Mismatch Penalty = 1, Joining Penalty = 20, Randomization Group Length = 0, Cutoff Score = 1, Gap Penalty = 5, Gap Size Penalty = 0,05, und Window Score = 500 oder die Abfragesequenzlänge in Nukleotidbasen, je nachdem was kürzer ist.
Antikörper
Das Bereitstellen der erfindungsgemäßen Polypeptide ermöglicht die Produktion von Antikörpern, die in der Lage sind, in spezifischer Weise an einen Adenin-bindenden GPCR aus Ratte oder einen humanen Adenin-bindenden GPCR zu binden. Somit offenbart die Erfindung einen Antikörper, der in der Lage ist, spezifisch an ein erfindungsgemäßes Polypeptid und nicht an andere purinerge GPCRs zu binden. Ein solcher Antikörper besitzt eine Affinität für ein erfindungsgemäßes Polypeptid von mindestens 100fach, vorzugsweise mindestens 1000fach über derjenigen für andere purinerge GPCRs. Solche Antikörper können unter Verwendung von Epitopen von erfindungsgemäßen Polypeptiden produziert werden, die nicht in anderen GPCRs vorhanden sind. Solche Epitope können die Suche nach Unterschieden zwischen Polypeptiden der Erfindung und anderen purinergen GPCR-Sequenzen bestimmt werden.
Antikörper können unter Verwendung von Techniken erhalten werden, die im Fachgebiet Standard sind. Verfahren zur Produktion von Antikörpern umfassen das Immunisieren eines Säugertiers (z. B. Maus, Ratte, Kaninchen) mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid. Antikörper können aus immunisierten Tieren unter Verwendung von einer beliebigen aus einer Vielfalt von im Fachgebiet bekannten Techniken erhalten und vorzugsweise unter Verwendung der Bindung des Antikörpers an das Antigen von Interesse einem Screening unterzogen werden. Beispielsweise können Westernblottechniken oder Immunopräzipitation verwendet werden (Armitage et al, Nature, 357: 80–82, 1992).
Als Alternative oder Ergänzung zur Immunisierung eines Säugertiers mit einem Peptid, kann ein für ein Protein spezifischer Antikörper aus einer rekombinant hergestellten Bibliothek von exprimierten variablen Immunglobulindomänen erhalten werden, z. B. unter Verwendung von Lambda-Bakteriophagen oder filamentösen Bakteriophagen, die funktionelle Immunglobulin-bindende Domänen auf ihrer Oberfläche aufweisen; siehe beispielsweise WO 92/01047 .
Erfindungsgemäße Antikörper können in vielerlei Weise modifiziert werden. In der Tat sollte der Begriff „Antikörper" so ausgelegt werden, dass er jede Bindungssubstanz umfasst, die eine Bindedomäne mit der erforderlichen Spezifität aufweist. Somit umfasst die Erfindung Antikörperfragmente, Derivate, Funktionsäquivalente und Homologe von Antikörpern, einschließlich von synthetischen Molekülen und Molekülen, deren Form diejenige eines Antikörpers imitiert, was sie zur Bindung eines Antigens oder Epitops befähigt.
Beispielhafte Antikörperfragmente, die in der Lage sind, ein Antigen oder einen anderen Bindungspartner zu binden, sind das Fab-Fragment, bestehend aus den VL-, VH-, Cl- und CH1-Domänen; das Fd-Fragment, bestehend aus den VH- und CH1-Domänen; das Fv-Fragment, bestehend aus der VL- und VH-Domäne eines einzelnen Arms eines Antikörpers; das dAb-Fragment, das aus einer VH-Domäne besteht; isolierte CDR-Regionen und F(ab')2-Fragmente, ein bivalentes Fragment, das zwei Fab-Fragmente einschließt, die über eine Disulphidbrücke in der Scharnierregion verknüpft sind. Einzelketten-Fv-Fragmente sind ebenfalls offenbart.
Die Reaktivität von Antikörpern gegenüber einer Probe kann durch ein beliebiges geeignetes Mittel bestimmt werden. Die Markierung mit individuellen Reportermolekülen ist eine Möglichkeit. Die Reportermoleküle können direkt oder indirekt nachweisbare und vorzugsweise messbare Signale erzeugen. Die Verknüpfung von Reportermolekülen kann direkt oder indirekt, kovalent, z. B. über eine Peptidbindung, oder nichtkovalent sein.
Verknüpfung über eine Peptidbindung kann das Ergebnis der rekombinanten Expression einer Genfusion sein, die Antikörper und Reportermolekül codiert.
Die Art und Weise der Bestimmung der Bindung ist kein Merkmal der vorliegenden Erfindung; die Fachleute sind in der Lage, je nach ihrer Präferenz und ihrer allgemeinen Kenntnis eine geeignete Art zu wählen.
Erfindungsgemäße Antikörper können zum Screening nach der Gegenwart eines Polypeptids eingesetzt werden, beispielsweise in einer Testprobe, die Zellen oder Zelllysat, wie besprochen, enthält, und können zur Reinigung und/oder Isolierung eines erfindungsgemäßen Polypeptids beispielsweise nach Produktion des Polypeptids durch Expression von dafür codierender Nukleinsäure, verwendet werden. Antikörper können die Aktivität des Polypeptids modulieren, an das sie binden, und somit können sie, falls das Polypeptid eine nachteilige Auswirkung in einem Individuum besitzt, in einem therapeutischen Zusammenhang, der Prophylaxe einschließen kann, geeignet sein.
Ein Antikörper kann in einem Kit bereitgestellt werden, welches Anweisungen zur Verwendung des Antikörpers einschließen kann, z. B. zur Bestimmung der Gegenwart einer bestimmten Substanz in einer Testprobe. Ein oder mehrere andere Reagenzien können eingeschlossen sein, wie Markierungsmoleküle, Pufferlösungen, Elutionsmittel usw. Reagenzien können in Behältern bereitgestellt werden, die sie vor der äußeren Umgebung schützt, wie ein luftdicht verschlossenes Röhrchen.
Vektoren
Die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung können in Vektoren, insbesondere Expressionsvektoren, eingebaut werden. Der Vektor kann zur Replikation der Nukleinsäure in einer kompatiblen Wirtszelle verwendet werden. Somit offenbart die Erfindung bei einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen Polynukleotiden durch Einbau eines erfindungsgemäßen Polynukleotids in einen replizierbaren Vektor, Einbringen des Vektors in eine kompatible Wirtszelle und Kultivierung der Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Replikation des Vektors bewirken. Der Vektor kann aus der Wirtszelle gewonnen werden. Geeignete Wirtszellen sind nachstehend im Zusammenhang mit Expressionsvektoren beschrieben.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Polypeptid in einem Vektor funktionsfähig mit einer Kontrollsequenz verknüpft, die in der Lage ist, für die Expression der codierenden Sequenz durch die Wirtszelle zu sorgen; das heißt der Vektor ist ein Expressionsvektor.
Der Begriff „funktionsfähig verknüpft" bezieht sich auf eine Juxtaposition, wobei die beschriebenen Komponenten in einer Beziehung vorliegen, die ihnen die Funktion in der beabsichtigten Weise erlaubt. Eine Kontrollsequenz, die mit einer codierenden Sequenz „funktionsfähig verknüpft" ist, ist so ligiert, dass die Expression der codierenden Sequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind.
Geeignete Vektoren können gewählt oder konstruiert werden, die geeignete regulatorische Sequenzen, einschließlich Promotorsequenzen, Terminator-Fragmente, Polyadenylierungssequenzen, Enhancer-Sequenzen, Markergene und andere Sequenzen enthalten, wie jeweils angemessen. Vektoren können Plasmide sein, viral, z. B. ein Phage, Phagemid oder baculoviral, Cosmide, YACs, BACs, oder PACs, wie jeweils angemessen. Vektoren umfassen Gentherapievektoren, beispielsweise Vektoren auf der Basis von Adenovirus, Adeno-assoziiertem Virus, Retrovirus (wie HIV oder MLV) oder Alphavirus-Vektoren.
Der Vektor kann mit einem Replikationsursprung, gegebenenfalls einem Promotor zur Expression des Polynukleotids und gegebenenfalls einem Regulator des Promotors ausgestattet sein. Der Vektor kann ein oder mehrere Selektionsmarkergene enthalten, im Falle eines bakteriellen Plasmids beispielsweise ein Ampicillinresistenzgen oder für einen Säugervektor ein Neomycinresistenzgen. Vektoren können in vitro, beispielsweise zur Produktion von RNA oder zur Transfektion oder Transformation einer Wirtszelle verwendet werden. Der Vektor kann auch der Verwendung in vivo angepasst werden, beispielsweise bei gentherapeutischen Verfahren. Systeme zur Klonierung und Expression eines Polypeptids in einer Vielfalt verschiedener Wirtszellen sind wohlbekannt. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien, eukaryontische Zellen, wie Säugerzellen und Hefezellen, und Baculovirussysteme. Säugerzelllinien, die auf dem Fachgebiet zur Expression eines heterologen Polypeptids zur Verfügung stehen, umfassen Chinese Hamster Ovary (CHO) Cells, HeLa-Zellen, Baby Hamster Kidney Cells, COS-Zellen und viele andere.
Promotoren und andere Expressionsregulationssignale können gewählt werden, um mit der Wirtszelle kompatibel zu sein, für die der Expressionsvektor konstruiert ist. Beispielsweise umfassen Hefepromotoren S. cerevisiae GAL4- und ADH-Promotoren, S. pombe Nmtl- und Adh-Promotoren. Säugerpromotoren umfassen den Metallothionein-Promotor, der als Reaktion auf Schwermetalle, wie Cadmium, induziert werden kann. Virale Promotoren, wie der SV40-large-T-Antigen-Promotor oder Adenoviruspromotoren können ebenfalls verwendet werden. Alle diese Promotoren sind im Fachgebiet leicht erhältlich.
Die Vektoren können andere Sequenzen einschließen, wie Promotoren oder Enhancer, um die Expression der inserierten Nukleinsäure, Nukleinsäuresequenzen anzutreiben, sodass das Polypeptid als eine Fusion produziert wird, und/oder Nukleinsäure-codierende Sekretionssignale einschließen, sodass das in der Wirtszelle produzierte Polypeptid aus der Zelle sezerniert wird.
Vektoren zur Produktion von erfindungsgemäßen Polypeptiden zur Verwendung bei Gentherapie umfassen Vektoren, die eine Minigensequenz der Erfindung tragen.
Für weitere Einzelheiten siehe beispielsweise Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2. Ausgabe, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Viele bekannte Techniken und Protokolle zur Manipulation von Nukleinsäure, beispielsweise bei der Herstellung von Nukleinsäurekonstrukten, Mutagenese, Sequenzierung, Einbau von DNA in Zellen und Genexpression, sowie Analyse von Proteinen sind im Einzelnen beschrieben in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg., John Wiley & Sons, 1992.
Vektoren können in eine wie vorstehend beschrieben geeignete Wirtszelle transformiert werden, um für die Expression eines Polypeptids der Erfindung zu sorgen. Somit offenbart die Erfindung bei einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden gemäß der Erfindung, welches das Kultivieren einer Wirtszelle umfasst, die mit einem wie vorstehend beschriebenen Expressionsvektor transformiert oder transfiziert wurde, unter Bedingungen, die für die Expression einer codierenden Sequenz durch den Vektor sorgen, welche die Polypeptide codiert, und das Gewinnen der exprimierten Polypeptide. Die Polypeptide können auch in In-vitro-Systemen, wie Reticulocytenlysat, exprimiert werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung offenbart Wirtszellen, die mit den Vektoren zur Replikation und Expression von erfindungsgemäßen Polynukleotiden transformiert oder transfiziert sind. Die Zellen werden so gewählt, dass sie mit dem Vektor kompatibel sind und können beispielsweise bakterielle Zellen, Hefezellen, Insekten- oder Säugerzellen sein. Die Wirtszellen können unter Bedingungen zur Expression des Gens kultiviert werden, sodass das codierte Polypeptid produziert wird. Wenn das Polypeptid an ein geeignetes Signal-Leader-Peptid gekoppelt exprimiert wird, kann es aus der Zelle in das Kulturmedium sezerniert werden. Nach Produktion durch Expression kann ein Polypeptid aus der Wirtszelle und/oder dem Kulturmedium isoliert und/oder gereinigt werden, wie jeweils erforderlich, und anschließend wie gewünscht eingesetzt werden, z. B. bei der Formulierung einer Zusammensetzung, die eine oder mehrere zusätzliche Komponenten umfassen kann, wie eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Exzipienten, Vehikel oder Träger umfasst.
Erfindungsgemäße Polynukleotide können auch in einer Antisense-Orientierung in die vorstehend beschriebenen Vektoren inseriert werden, um für die Produktion von Antisense-RNA oder Ribozymen zu sorgen.
Assays
Die vorliegende Erfindung offenbart auch einen Assay für eine Verbindung, die in der Lage ist, mit Adenin-bindender-GPCR-Polypeptiden der vorliegenden Erfindung in Wechselwirkung zu treten, wobei der Assay umfasst: Bereitstellen eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors, der mindestens ein erfindungsgemäßes Polypeptid umfasst, Inkontaktbringen des Rezeptors mit einer mutmaßlichen bindenden Verbindung; und Bestimmen, ob die Verbindung in der Lage ist, mit dem Rezeptor in Wechselwirkung zu treten.
Bei einer Ausführungsform des Assays kann der Rezeptor, oder Untereinheiten des Rezeptors, in einem Bindungsassay eingesetzt werden. Bindungsassays können kompetitiv oder nichtkompetitiv sein. Ein solcher Assay kann das schnelle Screening einer großen Anzahl von Verbindungen ermöglichen, um zu bestimmen, welche Verbindungen, sofern vorhanden, in der Lage sind, an die Polypeptide zu binden. Anschließend können ausführlichere Assays mit jenen Verbindungen, von denen festgestellt wurde, dass sie binden, durchgeführt werden, um näher zu bestimmen, ob solche Verbindungen als Agonisten oder Antagonisten der erfindungsgemäßen Polypeptide wirken.
Die vorliegende Erfindung offenbart noch weiterhin einen Bioassay zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Aktivität von Rezeptoren modulieren, die erfindungsgemäße Polypeptide umfassen. Bei einer Ausführungsform wird der Bioassay unter Verwendung von Saccharomyces-cerevisiae-Zellen durchgeführt, die gentechnisch mit erfindungsgemäßen GPCRs und Ratten- oder humanen G-Proteinen modifiziert wurden, um die endogenen GPCRs und G-Proteine zu ersetzen, die normalerweise als der Pheromonsignalweg fungieren, der zur Konjugation und zur Paarung der Hefezellen erforderlich ist. Die normale Hefereaktion auf Aktivierung eines Liganden (Wachstumsstopp), wird ebenfalls modifiziert, sodass sie in positives Wachstum umgewandelt wird. Mit solchen Modifikationen können Hefezellen in Funktionsassays eingesetzt werden, um Agonisten und Antagonisten für die erfindungsgemäßen GPCRs zu identifizieren, wobei Wachstum die Aktivierung des GPCR anzeigt. Beispielsweise kann der Bioassay durchgeführt werden durch Zusammenbringen solcher Hefezellen, die den GPCR exprimieren, der ein erfindungsgemäßes Polypeptid umfasst, mit mindestens einem potenziellen Agonisten und anschließendes Überwachen der Zellen auf Änderungen in der Wachstumsaktivität. Bei wieder einer anderen Ausführungsform wird der Bioassay durchgeführt durch Zusammenbringen solcher Hefezellen, die einen Rezeptor exprimieren, der ein erfindungsgemäßes Polypeptid umfasst, mit einer konstanten Menge an einem bekanntem Agonisten, z. B. Adenin, und zunehmenden Mengen von mindestens einem potenziellen Antagonisten, und anschließendes Überwachen der Zellen auf Änderungen im Wachstum.
Die vorliegende Erfindung offenbart auch einen Bioassay zur Identifizierung von Verbindungen, welche die regulatorischen Regionen des Adenin-bindender-GPCR-Gens regulieren. Eine solcher Assay wird unter Verwendung von Rattenzellen oder humanen Zellen durchgeführt, die in der Lage sind, ein erfindungsgemäßes Polypeptid (vorzugsweise der SEQ ID NO: 2 oder der SEQ ID NO: 4) zu exprimieren. Die Zellen werden mit mindestens einer Verbindung in Kontakt gebracht, wobei die Fähigkeit der Verbindung zur Modulierung der regulatorischen Region bekannt ist. Anschließend werden die Zellen bezüglich Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure beobachtet. Alternativ kann der Promotor mit einem Reportergen verknüpft werden. Geeignete Reportergene, die eingesetzt werden können, umfassen beispielsweise das Chloramphenicolacetyltransferase-Gen, das Luciferase-Gen, und dergleichen.
Eine Verbindung oder ein Signal, das „die Aktivität" eines erfindungsgemäßen Polypeptids „moduliert" bezeichnet eine Verbindung oder ein Signal, das die Aktivität des Polypeptids verändert, sodass es sich in Gegenwart der Verbindung oder des Signals anders verhält als in Abwesenheit der Verbindung oder des Signals. Verbindungen, welche die Modulation beeinflussen, umfassen Agonisten und Antagonisten. Ein Agonist umfasst eine Verbindung, wie Adenin, welche die Funktion des Adenin-bindenden GPCR aktiviert. Demgegenüber umfasst ein Antagonist eine Verbindung, die mit der Funktion des Adenin-bindenden GPCR interferiert. Typischerweise wird die Wirkung eines Antagonisten als eine Blockierung der Agonisten-induzierten Rezeptoraktivierung beobachtet. Antagonisten umfassen kompetitive sowie nichtkompetitive Antagonisten. Ein kompetitiver Antagonist (oder kompetitiver Blocker) interagiert mit oder nahe der Stelle, die für die Agonistenbindung spezifisch ist. Ein nichtkompetitiver Antagonist oder Blocker inaktiviert die Funktion des Rezeptors durch Wechselwirkung mit einer Stelle, die von der Agonisten-Interaktionsstelle verschieden ist. Wie nachstehend beschrieben, weist Guanin eine schwache antagonistische Wirkung an diesen Rezeptoren auf.
Wie es für den Fachmann selbstverständlich ist, erfordern Bioassay-Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Aktivität von Rezeptoren modulieren, wie erfindungsgemäße Polypeptide, im Allgemeinen den Vergleich mit einer Kontrolle. Ein Typ von „Kontrolle" ist eine Zelle oder Kultur, die im Wesentlichen auf die gleiche Weise wie die Testzelle oder die Testkultur behandelt wird, die der Verbindung ausgesetzt ist, mit dem Unterschied, dass die „Kontroll"-Zelle oder -Kultur nicht der Verbindung ausgesetzt ist. Ein weiterer Typ von „Kontroll"-Zelle oder -Kultur, die eingesetzt werden kann, ist eine Zelle oder Kultur, die mit transfizierten Zellen identisch ist, mit der Ausnahme, dass die „Kontroll"-Zelle oder -Kultur keinen funktionsfähigen Adenin-bindenden GPCR exprimiert. Demnach kann die Reaktion der transfizierten Zelle mit derjenigen der „Kontroll"-Zelle oder -Kultur auf die gleiche Verbindung unter den gleichen Reaktionsbedingungen verglichen werden.
Besonders bevorzugte Assaytypen umfassen Bindungsassays und Funktionsassays, die wie folgt durchgeführt werden können:
Bindungsassays
Die Überexpression von Nukleinsäure-codierenden Polypeptiden der Erfindung in Zelllinien (einschließlich Säugetierzellen – HEK293-Zellen, CHO-Zellen – und Sf9-Insektenzellen) kann zur Herstellung von Membranpräparationen verwendet werden, welche die Polypeptide tragen (in diesem Abschnitt der Einfachheit halber als Adenin-bindender GPCR bezeichnet), für Ligandenbindungsstudien. Diese Membranpräparationen können in herkömmlichen Filter-Bindungsassays (z. B. unter Verwendung von Brandel Filterassayausrüstung) oder in durchsatzstarken Scintillation-Proximity-Bindungsassays (SPA und Cytostar-T Flashplate-Technologie; Amersham Pharmacia Biotech) eingesetzt werden, um die Bindung von radioaktiv markierten purinergen Liganden (einschließlich 2-³H-Adenin (Amersham, TRK311) und 8-³H-Adenin (Amersham, TRK343) und Verdrängung solcher Radioliganden durch Kompetitoren für die Bindungsstelle nachzuweisen. Radioaktivität kann mit Packard Topcount oder einem vergleichbaren Instrument gemessen werden, das in der Lage ist, schnelle Messungen in Mikrotiterplatten in 96-, 384-, 1536-Well-Formaten vorzunehmen. Die SPA/Cytostar-T-Technologie ist besonders für ein durchsatzstarkes Screening geeignet und darum ist diese Technologie zur Verwendung als ein Screening für Verbindungen geeignet, die in der Lage sind, Standardliganden zu verdrängen.
Ein weiterer Ansatz zur Untersuchung der Ligandenbindung an Adenin-bindendes GPCR-Protein in einer Umgebung, die sich der nativen Situation annähert, verwendet einen Oberflächenplasmonresonanzeffekt, der von dem Biacore-Instrument (Biacore) genutzt wird. Adenin-bindende GPCR in Membranpräparationen oder ganzen Zellen könnten an den Biosensor-Chip eines Biacore-Instruments gebunden werden, und die Bindung von Liganden in Gegenwart und Abwesenheit von Verbindungen überprüft werden, um Kompetitoren der Bindungsstelle zu identifizieren.
Funktionsassays
Da Adenin-bindender GPCR über G_i oder G_o (inhibitorisches G-Protein) wirkt, das in der Regel mit GIRK (einwärts gerichteten Kaliumkanälen) wechselwirkt, sollte ein Kaliumionenstrom auf Aktivierung dieser Rezeptoren folgen. Dieser Ionenstrom kann unter Verwendung einer Vielfalt von Techniken zur Bestimmung der agonistischen oder antagonistischen Wirkung von bestimmten Verbindungen in Realzeit gemessen werden. Daher können rekombinante Adenin-bindende GPCR-Rezeptoren, die in Zelllinien, oder beispielsweise Xenopus-Oocyten exprimiert werden, unter Verwendung von Gesamtzell- und Einzelkanalelektrophysiologie charakterisiert werden, um den Wirkmechanismus der Verbindungen von Interesse zu bestimmen. Elektrophysiologisches Screening auf Verbindungen, die an dem Adenin-bindenden GPCR wirken, kann unter Verwendung herkömmlicher elektrophysiologischer Techniken durchgeführt werden, und, wenn sie zur Verfügung stehen, unter Verwendung neuer durchsatzstarker Verfahren, die sich derzeit in Entwicklung befinden.
Fluoreszenz – Calcium- und Natriumströme sind unter Verwendung mehrer ionenempfindlicher Fluoreszenzfarbstoffe messbar, einschließlich von Fluo-3, Fluo-4, Fluo-5N, Fura Red, Sodium Green, SBFI und anderen vergleichbaren Sonden von Herstellern einschließlich Molecular Probes. Der Calcium- und Natriumeinstrom als Ergebnis der Aktivierung von Adenin-bindendem GPCR kann somit in Realzeit unter Verwendung von fluorometrischen und fluoreszenzbildgebenden Techniken, einschließlich Fluoreszenzmikroskopie mit oder ohne Laserkonfokalverfahren in Kombination mit Bildanalysealgorithmen charakterisiert werden Ein weiterer Ansatz ist ein durchsatzstarker Assay zum Screening nach Verbindungen, die entweder als Agonisten oder als Modulatoren wirken und Calciumtransienten beeinflussen. Dieser Assay beruht auf einem Instrument, das Fluorescence Imaging Plate Reader ((FLIPR^®), Molecular Devices Corporation) genannt wird. In seiner häufigsten Konfiguration regt es die durch Fluoreszein-basierte Farbstoffe emittierte Fluoreszenz an und misst diese. Es verwendet einen Argonionen-Laser zur Produktion von energiereichen Anregungswellen von 488 nm eines Fluorophors, ein optisches System zum schnellen Scannen des Bodens einer 96-/384-Weltplatte und eine empfindliche, gekühlte CCD-Kamera, um die emittierte Fluoreszenz einzufangen. Es enthält auch einen 96-/384-Well-Pipettierkopf, der es ermöglicht, dass das Instrument Lösungen von Testmitteln in die Vertiefungen einer 96-/384-Well-Mikrotiterplatte abgibt. Der FLIPR-Assay ist zur Messung von Fluoreszenzsignalen in Realzeit in Populationen von Zellen vor, während und nach Zugabe von Verbindungen von sämtlichen 96/384 Vertiefungen gleichzeitig ausgelegt. Der FLIPR-Assay kann zum Screening und zur Charakterisierung von Verbindungen eingesetzt werden, die funktionell an rekombinantem Adenin-bindendem GPCR wirken, z. B. an Ratten- oder humanem Adenin-bindendem GPCR, der in Zelllinien exprimiert wird.
Wie nachstehend beschrieben, wurden unter Verwendung des FLIPR-Assays Calciumtransienten in Zellen gemessen, die mit Adenin-bindendem GPCR transfiziert waren, um die Aktivierung der Rezeptoren durch verschiedene Substrate zu messen, um den natürlichen Liganden des Rezeptors zu bestimmen.
Verbindungen, von denen festgestellt wurde, dass sie die Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide modulieren, besitzen eine Anzahl von therapeutischen Anwendungen. Wie aus den BLAST-Suchen offensichtlich ist, gehört Adenin-bindender GPCR keiner der bekannten Unterfamilien von GPCRs an, die von Strukturen aktiviert werden, die Adenin ähnlich sind. Dies legt nahe, dass Adenin-bindender GPCR ein Mitglied einer neuen Untergruppe von purinergen GPCRs ist, womit es möglich ist, eine neue Pharmakologie für die verschiedenen therapeutischen Bereiche zu entwickeln, in denen bisher purinerge Mittel angewandt wurden. Im Speziellen umfasst dies Erkrankungen, die mit Apoptose (Chow et al., 1997), pathologischem Tremor (Mally and Stone, 1996) oder Nozizeption (Burnstock, 1997) zusammenhängen. Purinerge Verbindungen wurden ebenfalls bereits vorgeschlagen zur Verwendung als Antikonvulsiva, Sedativa, Hypnotika, bei Ataxie (CNS), als Hypotensiva, Antiarrhythmika, negativ chronotrope, dromotrope und inotrope Mittel, Inhibitoren der Blutplättchenaggregation, Stimulatoren der NO-Produktion durch vaskuläre Endothelzellen im Herz-Kreislauf-System und als Inhibitoren der Magensekretion (Gil-Rodrigo et al, Pharmacol. Res. 22(2): 103–13, 1990). Weiterhin legen Studien auf der Basis von transgenen Tieren nahe, dass Rezeptoren aus dieser Familie eine Rolle bei Bronchokonstriktion, Vasodilatation, Inflammation und Erleichterung der Neurotransmission (Nyce, 1999) spielen. Zusammenfassend können Adenin-bindender GPCR und verwandte Rezeptoren als wertvolle Werkzeuge zur Arzneimittelentwicklung in einer Vielfalt von therapeutischen Bereichen verwendet werden.
Außerdem eröffnet der Beweis, dass Adenin selbst als der natürliche Ligand für diesen Rezeptor wirkt, die Möglichkeit einer Verwendung von Adenin und Verbindungen, die Adenin imitieren oder antagonisieren, bei der Entwicklung von Behandlungen für die vorstehend erwähnten Krankheiten.
Gewebeverteilungsstudien
Adenin-bindender-GPCR-DNA-Sequenzen sind zur Bestätigung und Ausweitung des Wissens über die Verteilung dieses GPCRs bezüglich Humangesundheit und Humankrankheiten durch Hybridisierungs-/PCR-Studien geeignet. Rekombinante Adeninbindende GPCRs in Zelllinien sind zur Charakterisierung der Funktion des Adeninbindenden GPCR geeignet, und ein Auswahl von biochemischen und biophysikalischen Verfahren stehen zum Testen dieses Rezeptors zur Verfügung. Hier beschriebene Assays der Erfindung sind ebenfalls für Arzneimittel-Screening-Zwecke geeignet.
Bindungsmittel
Somit offenbart die Erfindung weiterhin neue Bindungsmittel, einschließlich modulatorischer Mittel, die durch einen erfindungsgemäßen Assay erhalten werden, und Zusammensetzungen, die solche Mittel umfassen. Mittel, die an den Rezeptor binden, und die agonistische oder antagonistische Aktivität aufweisen können, können bei Verfahren zur Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden, deren Pathologie durch Wirkung über den Adenin-bindenden GPCR-Rezeptor gekennzeichnet ist, und eine solche Verwendung bildet einen weiteren Aspekt der Erfindung. Solche Krankheiten können Krankheiten einschließen, die mit Apoptose, pathologischem Tremor und Nozizeption, Bronchokonstriktion, Vasodilatation, Inflammation und Erleichterung der Neurotransmission zusammenhängen. Weiterhin können die Mittel bei Behandlungen eingesetzt werden, bei denen Antikonvulsiva, Sedativa, Hypnotika, Mittel bei Ataxie (CNS), Hypotensiva, Antiarrhythmika, negativ chronotrope, dromotrope und inotrope Mittel, Inhibitoren der Blutplättchenaggregation, Stimulatoren der NO-Produktion durch vaskuläre Endothelzellen im Herz-Kreislauf-System oder Inhibitoren der Magensekretion geeignet sein können. Die Mittel können in einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Mittels verabreicht werden. Da viele der oben erwähnten Zustände chronisch und oft unheilbar sind, ist es selbstverständlich, dass „Behandlung" das Erreichen einer Verringerung der Symptome für eine Zeitdauer wie einige Stunden, Tage oder Wochen einschließen soll und eine Verlangsamung des Fortschritts des Krankheitsverlaufs einschließen soll.
Solche Mittel können zu Zusammensetzungen formuliert sein, die ein Mittel zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfassen. Das Mittel kann in Form eines physiologisch funktionsfähigen Derivats, wie als ein Ester oder ein Salz, wie ein Säureadditionssalz oder ein basisches Metallsalz, oder ein Stickstoff- oder Schwefeloxid vorliegen. Zusammensetzungen können für jeden geeigneten Verabreichungsweg und jede geeignete Verabreichungsform formuliert werden. Pharmazeutisch verträgliche Träger oder Verdünnungsmittel umfassen jene, die in Formulierungen verwendet werden, die zur oralen, rektalen, nasalen, inhalierbaren, topischen (einschließlich bukkalen und sublingualen), vaginalen oder parenteralen (einschließlich der subkutanen, intramuskulären, intravenösen, intradermalen, intrathekalen und epiduralen) Verabreichung geeignet sind. Die Wahl des Trägers oder Verdünnungsmittels hängt natürlich von dem vorgeschlagenen Verabreichungsweg ab, die von dem Mittel und seinem therapeutischen Zweck abhängen kann. Die Formulierungen können der Einfachheit halber in einer Einheitsdosierungsform dargereicht werden und können durch jedes der auf dem Fachgebiet der Pharmazie wohlbekannten Verfahren hergestellt werden. Solche Verfahren umfassen den Schritt des Inverbindungbringens des Wirkstoffs mit dem Träger, der ein oder mehrere akzessorische Bestandteile darstellt. Im Allgemeinen werden die Formulierungen durch gleichmäßiges und inniges Inverbindungbringen des Wirkstoffes mit flüssigen Trägern oder fein verteilten festen Trägern oder mit beidem und sodann, sofern notwendig, Formen des Produkts hergestellt.
Für feste Zusammensetzungen umfassen herkömmliche nichttoxische, feste Träger, die verwendet werden können beispielsweise Mannit, Lactose, Cellulose, Cellulosederivate, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talcum, Glucose, Saccharose, Magnesiumcarbonat, und dergleichen in pharmazeutischer Qualität. Die wirksame Verbindung, wie vorstehend definiert, kann als Suppositorium unter Verwendung von beispielsweise Polyalkylenglycolen, acetylierten Triglyceriden und dergleichen als der Träger formuliert werden. Flüssige pharmazeutisch verabreichbare Zusammensetzungen können beispielsweise durch Auflösen, Dispergieren, etc. einer, wie vorstehend definierten, aktiven Verbindung und frei wählbaren pharmazeutischen Adjuvanzien in einem Träger, wie beispielsweise Wasser, Kochsalzlösung, wässrige Dextroselösung, Glycerin, Ethanol, und dergleichen hergestellt werden, um dadurch eine Lösung oder Suspension zu bilden. Falls gewünscht, kann die zu verabreichende pharmazeutische Zusammensetzung auch kleinere Mengen von nichttoxischen Hilfssubstanzen enthalten, wie Netzmittel oder Emulgatoren, Säureregulatoren und dergleichen, beispielsweise Natriumacetat, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminnatriumacetat, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat, etc. Effektive Verfahren zur Herstellung solcher Dosierungsformen sind bekannt oder sind für die Fachleute offensichtlich, siehe beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 15. Auflage, 1975.
Die zu verabreichende Zusammensetzung oder Formulierung enthält in jedem Fall eine Menge der wirksamen Verbindung(en) in einer Menge, die wirksam ist, um die Symptome des Individuums zu lindern, das behandelt wird, Es können Dosierungsformen oder Zusammensetzungen, die Wirkstoff im Bereich von 0,25 bis 95% enthalten, wobei der Rest aus nichttoxischem Träger besteht, hergestellt werden.
Zur oralen Verabreichung wird eine pharmazeutisch verträgliche nichttoxische Zusammensetzung durch das Einarbeiten von einem der normalerweise eingesetzten Exzipienten, wie beispielsweise Mannit, Lactose, Zellulose, Zellulosederivate, Crosscarmellose-Natrium, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talkum, Glucose, Saccharose, Magnesium, Carbonat, und dergleichen in pharmazeutischer Qualität gebildet. Solche Zusammensetzungen können die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulvern, verzögert freisetzenden Formulierungen und dergleichen einnehmen. Solche Zusammensetzungen können 1%–95%, stärker bevorzugt 2–50%, am stärksten bevorzugt 5–8% Wirkstoff enthalten.
Die parenterale Verabreichung ist im Allgemeinen durch Injektion, entweder subkutan, intramuskulär oder intravenös, gekennzeichnet. Injizierbare Mittel können in herkömmlicher Form, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, feste Formen, die zur Lösung oder Suspension in Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind, oder als Emulsionen hergestellt werden. Geeignete Exzipienten sind beispielsweise Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder dergleichen. Zudem können die zu verabreichenden pharmazeutischen Zusammensetzungen wenn gewünscht, auch kleinere Mengen an nichttoxischen Hilfssubstanzen enthalten, wie Netzmittel oder Emulgatoren, Säureregulatoren und dergleichen, wie beispielsweise Natriumacetat, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat, Triethanolaminnatriumacetat, etc.
Der Prozentgehalt an Wirkstoff, der in solchen parenteralen Zusammensetzungen enthalten ist, ist stark abhängig von ihrer speziellen Natur, sowie von der Aktivität der Verbindung und den Bedürfnissen des Individuums. Allerdings ist ein Prozentgehalt an Wirkstoff von 0,1% bis 10% in Lösung einsetzbar und ist höher, wenn die Zusammensetzung ein Feststoff ist, der anschließend auf die obigen Prozentgehalte verdünnt wird. Vorzugsweise umfasst die Zusammensetzung 0,2 – 2% Wirkstoff in Lösung.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Angesichts dieser Beispiele werden dem Fachmann weitere Ausführungsformen einfallen.
Beispiel 1 Analyse des neuen GPCR
Die in SEQ ID NO: 1 beschriebene Sequenz wurde durch BLAST-Suche (Altschul et al., 1997) analysiert, um zu überprüfen, ob verwandte GPCRs mit bekannten Liganden gefunden werden könnten. Allerdings waren die nächsten Homologe dieses Orphan-GPCR, die gefunden wurden, selbst Orphan-GPCRs. Dies war eine Familie von humanen GPCRs (Derwent Sequenzdatenbank-Zugriffsnummern Z10067, Z10068, Z10069, Z10070, Z10071 und Z10072), kloniert aus dem Dorsalwurzelganglion, die ungefähr 50% der Reste mit dem neuen GPCR (Adenin-bindender GPCR aus Ratte) gemeinsam hat. Das nächstverwandte Homologe ist das Mas related Gene, das 33% der Reste mit dem Adenin-bindenden GPCR gemeinsam hat.
Unter Verwendung der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 haben die vorliegenden Erfinder die vorstehenden humanen GPCRs als sechs humane Homologe des neuen Adeninbindenden GPCR aus Ratte identifiziert. Diese wurden humaner Adenin-bindender GPCR1 (SEQ ID NO: 3), humaner Adenin-bindender GPCR2 (SEQ ID NO: 5), humaner Adeninbindender GPCR3 (SEQ ID NO: 6), humaner Adenin-bindender GPCR4 (SEQ ID NO: 7), humaner Adenin-bindender GPCR5 (SEQ ID NO: 8) und humaner Adenin-bindender GPCR6 (SEQ ID NO: 9) genannt. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen für den humanen Adenin-bindenden GPCR1 sind in SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 gezeigt; in 1 ist das Alignment der Aminosäuresequenzen des Adenin-bindenden GPCR aus Ratte (SEQ ID NO: 2) und des humanen Adenin-bindenden GPCR1 (SEQ ID NO: 4) gezeigt. Die Nukleinsäuresequenz für humanen Adenin-bindenden GPCR2, humanen Adenin-bindenden GPCR3, humanen Adenin-bindenden GPCR4, humanen Adeninbindenden GPCR5 und humanen Adenin-bindenden GPCR6 sind in den SEQ ID NOs: 5–9 gezeigt. „N" in SEQ ID NO: 5 ist A oder T oder C oder G.
Beispiel 2 Identifizierung des natürlichen Liganden des neuen GPCR
Da im Stand der Technik keine verwandten GPCRs mit bekannten Liganden gefunden werden konnten, haben die Erfinder versucht herauszufinden, welcher natürliche Ligand an den Rezeptor binden würde. Um den natürlichen Liganden des sequenzierten GPCR zu identifizieren, wurde „reverse Pharmakologie" eingesetzt. Im Wesentlichen wurde ein Extrakt aus dem Gewebe hergestellt, in dem dieser GPCR exprimiert wird (Hirnkortex), und auf die Reinigung des natürlichen Liganden folgte ein Zell-Assay, der auf der Aktivierung des Orphan-GPCR basierte.
Beispiel 3 Transiente Expression in Säugerzellen und FLIPR-Assay
Das Volllängen-Leseraster wurde in den Säuger-Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA, U. S. A.) inseriert, und das resultierende Expressionskonstrukt wurde transient mit dem FuGENE 6-Reagenz (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland) in HEK293-Zellen transfiziert, die stabil mit pLEC/Gqi oder pLEC/Gqo (Molecular Devices, Sunnyvale, CA-, U. S. A.) transfiziert waren (E. Bender, unveröffentlicht). Die Zellen wurden nach Empfehlungen des Anbieters mit Fluo-4 (Molecular Probes, Eugene, OR, U. S. A.) beladen.
Beispiel 4 Herstellung von Gewebeextrakten und Extraktfraktionierung
10 kg Schweinekortex wurden homogenisiert und in Methanol/Wasser/Essigsäure, 90/9/1, Vol./Vol./Vol. extrahiert. Nach Zentrifugation wurde der Überstand durch n-Hexan-Extraktion entfettet, und die wässrige Schicht wurde durch eine MegabondElute-Fraktionierung fraktioniert. Das Material, das bei 50% Acetonitril/H₂O eluierte, wurde weiterhin auf einer HPLC-C18-Säule fraktioniert. Die daraus entstammenden Fraktionen wurden im FLIPR-Assay auf Aktivierung des neuen GPCR getestet. Auf anschließende Reinigungsschritte über eine Hypersil C18, eine analytische C8-Säule, eine Biosee-Säule und schließlich eine HPLC-C18-Säule folgte ebenfalls der FLIPR-basierte Aktivitätsassay auf Fraktionen, welche die mit dem neuen GPCR transfizierten Zellen aktivieren. Die Fraktion, welche die Aktivität nach dem letzten Reinigungsschritt enthielt, wurde mittels Massenspektrometrie (Q-TOF, MicroMass, Manchester, U. K.) analysiert.
Das Screening des Schweinekortexextraktes nach der ersten Fraktionierung auf einer C18-Säule lieferte einen ziemlich großen Bereich von Fraktionen, die zur transienten intrazellulären Ca²⁺-Freisetzung in Zellen führten, die transient mit dem neuen GPCR-Expressionskonstrukt transfiziert waren. Dies war der Fall bei HEK293-Zellen, die entweder die Gqo- oder Gqi-Chimäre exprimierten (2 und 3), jedoch nicht bei Wildtyp-HEK293-Zellen (Daten nicht gezeigt). Eine dieser Fraktionen, Nummer 19, die bei beiden G-Protein-Chimären eine starke Stimulierung lieferte, wurde zur weiteren Subfraktionierung ausgewählt und wie vorstehend beschrieben prozessiert. Die Reinigung richtete sich nach dem FLIPR-basierten Aktivitätsassay, und die Fraktion aus dem letzten Säulendurchlauf, die Aktivität zeigte, wurde der Massenspektrometrie unterzogen, um die Reinheit sowie die Struktur der darin enthaltenen Verbindungen zu bestimmen.
Beispiel 5 Identifizierung von aktivierenden Substanzen durch Massenspektrometrie
Die Massenanalyse der aktiven gereinigten Fraktion aus der Symmetry C18 (4,6 × 250 mm; 5 um, Waters) Umkehrphasen-Säule ergab ein Haupt-Ion bei m/z 136. Die Masse wurde auf das (NaI + Na)⁺-Ion (172.8840 Da) eingestellt, was eine exaktere Masse für das Ion von Interesse (136.0623 Da) lieferte. Diese Masse wurde für die Analyse der Elementarzusammensetzung eingesetzt. Die Massentoleranz wurde auf 20 ppm eingestellt. Die beste Übereinstimmung lieferte C₅H₆N₅ (136.0623 Da), was Adenin + H⁺ entspricht. Das CID-Spektrum des nativen Moleküls wurde mit dem von synthetischem Adenin verglichen.
Fragmentierung beider Elternmoleküle ergab die gleichen Fragment-Ionen bei m/z 119,0, 109,0, 94,0, 92,0, 82,0, 77,0, 67,0 und 65,0. Aus den durch Tandem-Massenspektrometrie auf einer Q-TOF erhaltenen Ergebnissen wurde geschlossen, dass Adenin die aktivierende Substanz war. Der neue GPCR wurde daher Adenin-bindender GPCR genannt.
Beispiel 6 Test des neuen GPCR mit ausgewählten reinen Verbindungen
Um das aus der Massenspektrometrie erhaltene Ergebnis zu bestätigen, wurde reines Adenin in PBS zu einer Endkonzentration von 3,3 nM–33 μM aufgelöst und wurde HEK293/Gaqo-Zellen zugesetzt, die transient mit dem neuen Ratten-GPCR (Adeninbindender GPCR)/pcDNA3-Expressionskonstrukt transfiziert waren, und solchen, die mit dem leeren Expressionsvektor transfiziert waren. Unter Verwendung des FLIPR-Assays, wie vorstehend, wurden in beiden Sätzen von Zellen Calciumtransienten gemessen, wobei die Transienten, die dem neuen GPCR zugeordnet werden konnten, als Differenz zwischen den beiden Transienten gemessen wurden. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt. Adenin rief einen dosisabhängigen Calciumtransienten in Zellen hervor, was anzeigt, das der neue GPCR (Adenin-bindender GPCR) eine hohe Affinität für diese Verbindung besitzt. Im Gegensatz dazu zeigten andere Purine und Pyrimidine keine agonistische Aktivität. 5 zeigt, dass Calciumtransienten in den HEK293/Gaqo-Zellen nicht durch die Zugabe von 3,3 μM Uridin, Guanin, Hypoxanthin, Xanthin, Koffein, UDP oder UDP, ausgelöst werden konnten, was die Spezifität des Adenin-bindenden GPCR-Rezeptors für Adenin bestätigt. Um die Spezifität des Rezeptors auf Adenin genauer zu testen, wurde eine Anzahl von Nukleosid- und Nukleotidderivate unter Verwendung des gleichen Assays getestet. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Von den Nukleosid- und Nukleotidderivaten von Adenin zeigen nur Adenosin und AMP einen schwachen partiellen Agonismus in hohen Konzentrationen (> 3,3 μM).
Um zu überprüfen, ob unter den gleichen Verbindungen Moleküle mit antagonistischen Eigenschaften gefunden werden konnten, wurden mit Adenin-bindendem GPCR transfizierte Zellen verschiedenen Purinen (Guanin, Hypoxanthin, Xanthin, Koffein, Theophyllin), Pyrimidinen (Uridin, UDP, UTP), bekannten Antagonisten von anderen Nukleotidrezeptoren (Suramin, Reaktivblau) und Nukleosid- oder Nukleotidderivaten von Adenin (Adenosin, AMP, ADP, ATP) in Konzentrationen im Bereich von 30 μM bis 30 pM ausgesetzt, während Ca2+-Transienten im FLIPR gemessen wurden. Abgesehen von den vorstehend erwähnten wurden keine weiteren agonistischen Wirkungen bei diesem Experiment entdeckt. Nach einer 15 minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die gleichen Zellen mit 30 nM Adenin stimuliert, um antagonistische Eigenschaften von Molekülen nachzuweisen, die in der ersten Runde der Superfusion zugesetzt wurden. Nur Guanin zeigte eine schwache antagonistische Wirkung bei 30 und 3 μM (7). Alle anderen Verbindungen zeigten in den getesteten Konzentrationen keine antagonistische Wirkung auf den Adenin-bindenden GPCR.
Beispiele 7 bis 12 Charakterisierung des Ratten-Adenin-Rezeptors in transient und permanent transfizierten CHO-Zellen.
Um den neuen Ratten-Adenin-Rezeptor weiter zu charakterisieren, wurden CHO-Zellen unter Verwendung des Lipofectamine-PLUS-Verfahrens transient und permanent transfiziert. Die pharmakologischen Eigenschaften einer Vielzahl von Adenin-Derivativen wurden unter Verwendung von Radioligand-Bindungsexperimenten, Stimulation der [³⁵S]GTPγS-Bindung und durch cAMP-Messungen bewertet. Alle diese Experimente wurden parallel mit Wildtyp-CHO-Zellen als Kontrolle durchgeführt.
Beispiel 7 beschreibt Radioligand-Bindungsexperimente unter Verwendung von [³H]-Adenin in transient und permanent transfizierten CHO-Zellen. Die Messung der Bindung von [³⁵S]-GTPγS als Reaktion auf Adenin ist für transient und permanent transfizierte Zellen in den Beispielen 8 bzw. 10 beschrieben. Die Messung des cAMP-Anstiegs als Reaktion auf Adenin ist für transient und permanent transfizierte Zellen in den Beispielen 9 bzw. 11 beschrieben. In Beispiel 12 ist die Wirkung von Adenin auf intrazelluläres Ca²⁺ beschrieben.
Zellkultur und Transfektionsverfahren
CHO-Zellen wurden in Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)/Nährstoffmischung Ham's F12 (Life Technologies, Belgium) in einem Verhältnis von 1:1, angereichert mit 10% hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum und einer Antibiotikalösung, enthaltend 100 IU/ml Penicillin G, 100 μg/ml Streptomycinsulfat, 110 μg/μl Pyruvinsäure, und 300 μg/ml L-Glutamin, gehalten. Die Zellen wurden in 175 cm²-Kulturkolben bei 37°C in einer 5% CO₂-Umgebung kultiviert. Zum Erhalt von permanent transfizierten Zellen wurden die transfizierten Zellen einmal alle zwei Wochen in einem Selektionsmedium (Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) Nährgemisch Ham's F12 (Verhältnis 1:1), Life Technologies, Belgium), enthaltend 800 μg/ml Geneticin (G418), kultiviert.
Zur transienten Transfektion von CHO-Zellen wurde Lipofectamine-PLUS (Life Technologies)-Verfahren verwendet. Einen Tag vor der Transfektion wurden die CHO-Zellen in 50 mm Petrischalen in einer Dichte von 20.000 Zellen/cm² in DMEM/Nährstoffmischung Ham's F12 (Verhältnis 1:1) (Life Technologies) ausgesät. Für die Transfektion von einer Petrischale wurden 6,5 μg DNA und 17,5 μl Lipofectamine-PLUS-Reagenz (Life Technologies) zugesetzt, gemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert (Lösung A). 15 μl Lipofectamine-PLUS-Reagenz wurde zu 735 μl serumfreien Medium gegeben (Lösung B). Lösung A und B wurden kombiniert, vorsichtig gemischt und zur Bildung eines Komplexes 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 15 Minuten wurden dem Gemisch 3,5 ml serumfreies Medium zugesetzt. Die Zellen wurden einmal mit serumfreiem Medium gewaschen, und der DNA-Lipofectamine-PLUS-Komplex (in einem Endvolumen von 5 ml) wurde auf die Zellen gegeben und 3 h bei 37°C in einem 5% CO₂-Inkubator inkubiert. Nach der Inkubation wurden 5 ml DMEM/Ham's F12 (Verhältnis 1:1), angereichert mit 20% hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum, auf die Zellen gegeben und diese über Nacht im Inkubator stehen gelassen. Am nächsten Tag wurde das Medium entfernt und durch das gleiche Wachstumsmedium wie vorstehend ersetzt.
Das Lipofectamine-PLUS-Verfahren wurde mit leichten Modifikationen auch zur permanenten Transfektion von CHO-Zellen verwendet. Einen Tag nach der Transfektion wurde das Medium durch Selektionsmedium ersetzt, das alle 2 bis 3 Tage ausgetauscht wurde. Die Zellen wurden kultiviert, bis Kolonien erschienen (zwischen 8 und 10 Tage) und ein Teil wurde zur weiteren Kultur und für weitere Experimente in einen 175 cm² Kulturkolben überführt. Monoklonale Zelllinien wurden durch Aussähen in limitierender Verdünnung in 96 Wellplatten hergestellt.
Membranpräparation
Die Membranen wurden als Gesamtpartikel-Fraktionen hergestellt. Die Zelllinien wurden bis zu 90%iger Konfluenz auf 145 mm Petrischalen kultiviert und 24 Stunden vor dem Sammeln mit 5 mM Natriumbutyrat behandelt. Das Kulturmedium wurde entfernt und die Zellen wurden zweimal mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS ohne Cal²⁺ und Mg²⁺) gewaschen, von den Platten in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4, abgeschabt und durch Zentrifugation (10 Minuten bei 16.000 U/min bei 4°C) gesammelt. Das Zellpellet wurde in hyopotonem 5 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4, resuspendiert und mit einem Ultra Turrax Homogenisator (Janker Kunkel, Deutschland) homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 18.000 U/min 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Endpellet wurde in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4 resuspendiert und in Aliquots bei –70°C gelagert. Eine Proteinbestimmung wurde unter Verwendung des Bradford-Protein-Assays (Biorad, Deutschland) unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) durchgeführt.
Beispiel 7 [³H]-Adenin-Bindung
(A) Verfahren
[³H]-Adenin-Bindungsexperimente wurden zur Charakterisierung von Wildtyp-Zelllinien vor der Transfektion sowie von transient und permanent transfizierten Zelllinien durchgeführt. Membranen wurden auf Eis aufgetaut und mit 50 mM HEPES-Puffer, pH 7,4, angereichert mit 10 mM MgCl₂ und 1 mM EGTA, aufgetaut. Unspezifische Bindung wurde bestimmt in Gegenwart von 1 μM Adenin; eine 1 h-Inkubation bei 25°C mit [³H]-Adenin (spezifische Aktivität von 30,4 Ci/mmol) wurde als optimal für Sättigungs- und kompetitive Bindungsassays befunden. Beide Assays wurden in einem Endvolumen von 500 μl, für die Sättigungsbindung unter Verwendung von 18 μg Membranprotein bei den transfizierten CHO-Zellen und 30 μg Membranprotein bei den Wildtyp-CHO-Zellen durchgeführt. Für die kompetitiven Bindungsexperimente wurden 15 bzw. 30 μg Membranprotein für die transfizierten bzw. die Wildtyp-Zellen verwendet. Die Reaktion wurde durch schnelle Filtration über Whatman GF/B-Filter unter Verwendung eines Brandel Multikanal-Zellernters (96 Wells) gestoppt. Die Filter wurden dreimal mit 3 ml eiskaltem 50 mM HEPES-Puffer, pH 7,4, gewaschen, in Flüssigszintillationsröhrchen übergeführt, und es wurden 3 ml Szintillationisflüssigkeit (Ultima Gold MV, Packard, Niederlande) zugesetzt. Die Proben wurden nach mindestens 6 h, um die Glasfaserfilter gleichmäßig transluzent werden zu lassen, in einem β-Szintillationszähler gezählt.
Die Sättigungsanalyse der [³H]-Adenin-Bindung wurde unter Verwendung von 18 Konzentrationen des Radioliganden im Bereich von 0,2 bis 90 nM durchgeführt.
Die kompetitive Hemmung von [³H]-Adenin durch die Verbindungen Adenin, 1-Methyladenin und andere Analoge wurde mit 15 nM [³H]-Adenin und verschiedenen Konzentrationen der unmarkierten Verbindungen, die 5 Größenordnungen umspannten, durchgeführt.
Die maximale Anzahl von Bindungsstellen (B_max), die apparente Gleichgewichtsdissoziationskonstante (K_D) und die pIC₅₀-Werte (da der IC₅₀-Wert die Konzentration darstellt, die 50% der spezifischen Radioligandenbindung hemmt) wurden aus nichtlinearer Kurvenanpassung abgeleitet.
b) Ergebnisse:

Vorläufige Radioligand-Bindungsexperimente mit [³H]-Adenin wurden an verschiedenen Wildtyp-Zellen durchgeführt. Die Assaybedingungen waren identisch mit denjenigen für die transfizierten Zellen. Die Bindungsergebnisse, die mit den verschiedenen Zelllinien erhalten wurden, sind nachstehend gezeigt:

C6 Glioma:	839 fmoles/mg Protein
Cos7	226 fmoles/mg Protein
HEK293:	168 fmoles/mg Protein
NIH3T3:	642 fmoles/mg Protein
CHO:	303 fmoles/mg Protein (Pool 1)
	583 fmoles/mg Protein (Pool 2)

Die CHO-Zellen wurden zur Transfektion mit dem Ratten-Adenin-Rezeptor und weitere Experimente gewählt.
In unabhängigen Experimenten wurden 48 h nach Transfektion (die Effizienz betrug 50–60%, bestimmt durch β-Gal-Färbung unter Verwendung herkömmlicher Techniken, die dem Fachmann bekannt sind) CHO-Zellen bezüglich [³H]-Adenin-Bindung bewertet. In vorläufigen Bindungsexperimenten, die unter Verwendung von 4 nM [³H]-Adenin durchgeführt wurden, wurden die folgenden Bindungskonzentrationen beobachtet:

Pool 1 3554 fmoles/mg Protein

Pool 2 3444 fmoles/mg Protein

Pool 3 2436 fmoles/mg Protein

Pool 4 1717 fmoles/mg Protein
Sättigungsbindungsanalyse von [³H]-Adenin wurde mit und ohne Zugabe von 100 μM Guanylylimidodiphosphat (Gpp-NHp) zu den transfizierten sowie den Wildtyp-CHO-Zellen unter Verwendung von im Durchschnitt 16 Konzentrationen des Radioliganden im Bereich von 0,1 bis 80 nM (Tabelle 1) durchgeführt. Die Zugabe von Gpp-NHp blockiert die hochaffinen oder Agonisten-bindenden Stellen von GPCRs, sodass nur niederaffine Stellen zur Verfügung stehen.
In transfizierten Zellen betrug die durchschnittliche Sättigungsbindungskonzentration ungefähr 19 pmol/mg und der Kp-Wert für [³H]-Adenin betrug 24 nM. Spezifische Bindung mit ähnlicher Kp wurde auch in Wildtyp-CHO-Zellen, jedoch mit einer viel niedrigeren Bmax (ca. 1,1 pmol/mg). Weiterhin war die Kp von transfizierten Zellen empfindlich gegenüber Gpp-NHp-Zugabe, wohingegen die Kp in Wildtyp-Zellen dies nicht war.
Kompetitive Hemmung der [³H]-Adenin-Bindung durch eine Auswahl von Adenin-Derivaten wurden unter Verwendung von 15 nM [³H]-Adenin auf Zellen durchgeführt, die transient mit dem Rezeptor transfiziert worden waren, sowie auf den Wildtyp-CHO-Zellen (Tabelle 2).
Hochaffine kompetitive Bindung konnte nur mit Adenin selbst erreicht werden, mit einem Ki-Wert von 18 nM, war sehr dicht an dem direkt gemessenen Kp-Wert liegt.
Beispiel 8 [³⁵S]GTPγS-Bindung in transient transfizierten Zellen

a) Verfahren – Die Bestimmung, der [³⁵S]GIPS-Bindung an die G-Proteine wurde nach einer modifizierten Verfahrensweise von Lazareno (Methods Mol. Biol., 83: 107–116, 1997) durchgeführt. Diese Experimente wurden für eine erste funktionelle Bewertung des Rezeptors auf der Grundlage einer Membranpräparation durchgeführt.

In vorläufigen [³⁵S]-GTPγS-Bindungsexperimenten wurden die Testbedingungen optimiert, was zur Wahl des folgenden Inkubationspuffers führte: 20 mM Hepes, pH 7,4, enthaltend 100 mM NaCl, 10 μM GDP, 10 μM MgCl₂ und 10 μg/ml Saponin. Das Assaygemisch enthielt 10 bzw. 35 μg Membranprotein für die transfizierten bzw. Wildtyp-CHO-Zellen.
Zum Testen der agonistischen Aktivität wurden 175 μl verdünnte Membranen in dem vorstehend beschriebenen Puffer zusammen mit 25 μl Puffer und 25 μl variierenden Konzentrationen der Verbindung in einem Gesamtvolumen von 225 μl vorinkubiert. Nach einer 20 minütigen Vorinkubationszeit bei 30°C, wurden 25 μl [³⁵S]-GTPγS bis zu einer Endkonzentration von 0,25 nM zugesetzt, und die Assaygemische wurden für weitere 20 Minuten bei 30°C inkubiert. Gebundenes und freies [³⁵S]-GTPγS wurden durch schnelle Filtration über ein UniFilter^TM-96, GF/B^TM unter reduziertem Druck unter Verwendung von Filtermate-196-Filtration (Packard Company (Niederlande) getrennt. Die Menge der an die Filtereinheit gebundenen Radioaktivität wurde nach Trocknen der Filter und Szintillantionsmittelzugabe (Microscint-O; Packard Company) durch Flüssigszintillationszählung bestimmt.
Die basale [³⁵S]GTPγS-Bindung wurde in Abwesenheit von Verbindungen gemessen. Die Stimulation durch Agonisten wurde als die prozentuale Zunahme über den Basalniveaus berechnet. Die sigmoidalen Agonistendosisreaktionskurven wurden durch nichtlineare Regression unter Verwendung des GraphPad-Prism-Programms ausgewertet. Die Messungen mit verschiedenen Konzentrationen wurden in Duplikaten durchgeführt und die angegebenen Daten wurden aus unabhängigen Experimenten gewonnen.

b) Ergebnisse – Die maximale Stimulation der [³⁵S]GTPγS-Bindung an Membranen aus transient transfizierten CHO-Zellen durch Adenin lag bei 150% über den basalen Bindungsniveaus. Die mittlere EC₅₀ für Adenin betrug 112 nM. 1-Methyladenin und AMP stimulierten den Rezeptor partiell mit einer viel niedrigeren Potenz, entsprechend ihrer niedrigeren Affinität in kompetitiven Bindungsassays.

In Wildtyp-CHO-Zellen wurde keine Stimulation der GTPγS-Bindung gemessen (siehe Tabelle 3 und 8a (transient transfizierte CHO-Zellen) und 8b (Wildtyp-CHO-Zellen)). Die Prozentangaben sind auf die maximale Adeninreaktion normiert, d. h. die Adeninstimulation über die Basalniveaus wird mit 100% gleichgesetzt.
Beispiel 9 cAMP-Messungen in transient transfizierten CHO-Zellen

a) Verfahren – für transient transfizierte CHO-Zellen wurden cAMP-Messungen unter Verwendung des Direct-RIA-Kits von NEN (Belgien) durchgeführt.

Die Zellen wurden aus 50 mm Petrischalen durch Zugabe von 1 ml 0,04% EDTA und Resuspension in PBS (ohne Ca²⁺ und Mg²⁺) gesammelt. Anschließend wurden die Zellen 5 Minuten bei 1.500 U/min zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt, und die Pellets wurden in Stimulationspuffer (vom Anbieter, NEN, bereitgestellt) resuspendiert. Die Zellen wurden gezählt, und 50 μl wurden zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Flashplatte bei einer Dichte von 10⁶ Zellen/Vertiefung zugesetzt. Eine Standardkurve von cAMP wurde in Stimulationspuffer erstellt, die einen Bereich von 10 bis 1.000 nM abdeckte, und 50 μl wurden der Flashplatte zugesetzt.
Die Verbindungen wurden in PBS mit Forskolin (50 μM) verdünnt, und 50 μl des Liganden, in 2facher Endkonzentration, wurden den Zellen zugesetzt und 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach der 20 minütigen Inkubation wurden jeder Vertiefung 100 μl des [¹²⁵I]-cAMP-Tracers (2 μCi) zugesetzt, was zu einem Endvolumen von 200 μg/Vertiefung führte. Die Platte wurde bei Raumtemperatur stehengelassen, bis sie im Topcount^TM-Mikrotiterplattenszintillationszähler (Packard, Niederlande) gezählt wurde. Die sigmoidalen Dosisreaktionskurven (Messpunkte in Duplikaten) wurden unter Verwendung des GraphPad-Prism-Programms (GraphPad Software, CA, USA) ausgewertet.

b) Ergebnisse – Die Hemmung des Forskolin-stimulierten cAMP-Anstiegs mit dem direkten Verfahren war sehr gering (15–30%). Forskolin-, Basal- und pEC₅₀-Werte aus beiden Verfahren sind in der Tabelle 4 angegeben; repräsentative Kurven aus dem Assay sind in 9a (0,5% hiFCS) und 9b (2% hiFCS) gezeigt.

Obwohl der Reaktionsbereich der Assays klein war, bestätigte der Assay die agonistische Aktivität von Adenin an dem Rezeptor, und die gemessene EC₅₀ (ca. 15 nM) lag nahe an dessen Affinität für Adenin. Da das niedrige Signal in dem funktionellen cAMP-Assay in transient transfizierten Zellen auf der heterogenen Natur der Zellen (transfizierte und nichttransfizierte Zellen) beruhen könnte, wurde beschlossen, permanent transfizierte Zelllinien zu wählen.
Eine Anzahl von monoklonalen Zelllinien wurde durch Radioligandenbindung, wie vorstehend beschrieben untersucht, wobei vier (Klon 26 (Mutterplatte 1), 28, 29 und 30 (Mutterplatte 9), für weitere Studien ausgewählt wurden.
Beispiel 10 [³⁵S]GTPγS-Bindung in permanent transfizierten Zellen
Die erste funktionelle Charakterisierung der monoklonalen Zelllinien wurde mittels [³⁵S]-GTPγS-Bindungsexperimenten durchgeführt. Die maximale Stimulation der [³⁵S]-GTPγS-Bindung durch Adenin für jeden der 4 ausgewählten Klone war viel höher (500–650fach) als diejenige, die in den transienten Transfektionen festgestellt wurde, was die erwartete bessere Kopplung in permanenten Zelllinien bestätigte (siehe Tabelle 5). Die mittlere EC₅₀ von 62 nM liegt allerdings nahe an der transient transfizierten Präparation (Beispiel 8). Ein Beispiel für die Stimulation der [³⁵S]-GTPγS-Bindung durch Adenin ist in 10 gegeben.
Beispiel 11 cAMP-Messungen in permanent transfizierten CHO-Zellen
Für permanent transfizierte CHO-Zellen, wurden cAMP-Messungen unter Verwendung des Indirect-RIA-Kits von NEN (Belgien) durchgeführt.

a) Verfahren: Zwei Tage vor dem Experiment wurden die Zellen in 96-Wellplatten in einer Dichte ausgesät, die für ungefähr 90% Konfluenz am Tage des Experiments erforderlich war. Nach Entfernen des Wachstumsmediums wurden die Zellen zweimal mit einer kontrollierten Salzlösung (CSS) gewaschen, die 25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 120 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,8 mM MgCl₂, 1,8 mM CaCl₂, 15 mM Glucose und 15 mg/1 Phenolrot enthielt, mit dem Zusatz eines Phosphodiesterase-Inhibitors, IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthin), in einer Konzentration von 1 mM, und 0,1% BSA. Die basalen cAMP-Konzentrationen wurden in CSS bestimmt, der diese Zusätze enthielt, und die cAMP-Konzentrationen bei maximaler Stimulation wurden in Gegenwart von 50 μM Forskolin bestimmt. Zum Test der agonistischen Aktivität wurden die Verbindungen 20 Minuten bei 37°C mit den Zellen inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von eiskalter HClO₄ (IN) gestoppt und bei –20°C gelagert. Nach dem Auftauen wurden die Gemische mit einer äquivalenten Menge an phosphatgepuffertem KOH neutralisiert, 30 Minuten bei 4°C stehen gelassen, die Salze ausfallen zu lassen, und bei 2.000 U/min 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert.
Für die quantitative Bestimmung der cAMP-Konzentrationen wurde ein 96-Well-Flashplatten-Radioimmunoassay-Kit von NEN nach dem Protokoll des Anbieters verwendet. Die sigmoidalen Dosisreaktionskurven (Messpunkte in Duplikaten) wurden unter Verwendung des GraphPad-Prism-Programms ausgewertet.
b) Ergebnisse – Die Auswirkungen der Natriumbutyrat-Induktion und verschiedenen Serumkonzentrationen wurden bewertet.

Bei der Untersuchung der 4 gewählten Klone zeigte Klon 28 (MP9) die höchste (–75%) Hemmung der Forskolin-stimulierten cAMP-Konzentrationen. Wildtyp-CHO-Zellen zeigten keinerlei Reaktion auf Adenin. Forskolin-, Basal- und pEC₅₀-Werte von Klon 28 und Wildtyp-CHO-Zellen sind in Tabelle 6 angegeben. Ein verlässlich großer Reaktionsbereich bei den cAMP-Experimenten wurde nur nach Natriumbutyrat-Induktion der Rezeptorexpression erhalten. Die gemessene EC₅₀ lag im niedrigen nanomolaren Bereich (3 nM). Repräsentative Dosisreaktionskurven sind in 11a bzw. 11b für permanent transfizierte bzw. für Wildtyp-CHO-Zellen angegeben.
Beispiel 12 Intrazelluläre Calciummessungen in permanent transfizierten CHO-Zellen
Schließlich wurden Messungen des intrazellulären Ca²⁺ in der besten funktionell gekoppelten CHO-Zelllinie, Klon 28, durchgeführt.
Die Auswirkungen der Natriumbutyrat-Vorbehandlung wurden unter Verwendung einer Dosisreaktionskurve von Adenin untersucht.

a) Verfahren – Zwei Tage vor dem Experiment wurden die Zellen in einer 96-Wellplatte in einer Dichte ausgesät, die für ungefähr 90%ige Zellkonfluenz am Tage des Experiments erforderlich war. Die Verbindungen wurden in Calciumpuffer (5 mM HEPES/NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 5 mM KCl, 10 mM Glucose, 1,25 mM CaCl₂, 2,5 mM Probenecid, pH 7,4), zweimal um ihre Endkonzentrationen verdünnt. Für die Basalwerte wurde Calciumpuffer angewandt, und für die maximale Reaktion wurde 10 μm Ionomycin verwendet. Das Wachstumsmedium wurde entfernt, und die Zellen wurden in serumfreiem Wachstumsmedium, angereichert mit Probenecid (5 mM), dem Indikator Fluo-3 (2 μM), 20 mM HEPES/NaOH, pH, 7,4 und 0,1% BSA bei 37°C inkubiert. Nach 60 minütiger Inkubation wurden die Zellen dreimal mit dem Calciumpuffer gewaschen. 100 μl der verdünnten Verbindungen wurden in die Vertiefungen übergeführt, und Änderungen in den intrazellulären Calciumniveaus wurden mit FLIPR^® (Fluorometric Imaging Plate Reader, Molecular Devices) gemessen. Alle Messpunkte wurden in Duplikaten gemessen, und der Ca²⁺-Transient wurde als das relevante Signal betrachtet. Die sigmoidalen Dosisreaktionskurven wurden unter Verwendung des GraphPad-Prism-Programms ausgewertet.
b) Ergebnisse – Wildtyp-CHO-Zellen zeigten keinerlei Reaktion auf Adenin. In nicht Natriumbutyrat-behandelten Zellen verursachte Adenin eine 1,25 fache Zunahme des Basalwerts in relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU), die im Bereich von 6.800 bis 8.500 lag. In den Natriumbutyrat-behandelten Zellen löste Adenin eine dreifache Zunahme in den RFU aus, die im Bereich von 6.600 bis 19.800 lag. Die pEC₅₀-Werte der Adeninreaktion betrugen 7,14 bzw. 7,83. Ein repräsentatives Beispiel der durch Adenin ausgelösten Ca²⁺-Reaktion ist in 12a bzw. 12b für permanent transfizierte bzw. Wildtyp-CHO-Zellen angegeben.

³

	Transflzierte Zellen
Bedingungen	Bmax (fmoles/mg Protein)	SD	SEM	Kd (nM)	SD	SEM	n
Kein Gpp-NHp	17569			24
	13738			25
	25375			23
	18894	5931	3424	24	1	0.6	3
100 μM Gpp-NHp	12934			57
	31236			72
	7852			54
	17341	12299	7101	61	10	7	3

	Wildtyp-Zellen
Bedingungen	Bmax (fmoles/mg protein)	SD	SEM	Kd (nM)	SD	SEM	n
Kein Gpp-NI-Ip	1901			34
	1168			15
	362			30
	1144	770	444	26	10	6	3
100 μM Gpp-NHp	516			5
	797			25
	257			17
	523	270	156	16	10	6	3

SD: Standardabweichung,
SEM: Standardfehler des Mittelwerts

Tabelle 2: [³H]-Adenin-Kompetitionsbindung an Membranen aus CHO-Zellen, transient transfiziert mit Adenin-bindendem Rezeptor aus Ratte, oder Wildtyp-CHO-Zellen

	Transfizierte Zellen				Wildtyp-Zellen
Verbindung	pIC₅₀	SD	K_i (nM)	n	pIC₅₀	SD	K_i(nM)	n
Adenin	7.51		19		7.13		46
	7.48		20		6.8
	7.76		11		6.67		134
	7.44		22
	7.55	0.14	18	4	6.87	0.24	85	3
1-Methyladenin	5.21		3791		< 4
	5.01		6056		< 4
	5.24		3573
	5.15	0.13	4391	3	< 4			2
AMP	4.29		31887		< 4
	4.47		20847
	4.46		21210
	4.41	0.10	24503	3	< 4			1
ADP	< 4				< 4
	< 4
	< 4			2	< 4			1
ATP	4.02		58502		< 4
	4.18		40730
	4.02		58500
	4.07	0.09	52789	3	< 4			1
Adenosin	< 4				< 4
	4.14		44554
	4			2	< 4			1
6-Benzylaminopurin	4.00		61401		< 4
	4.06		54125
	4.03	0.04	58328	2	< 4			1
Hypoxanthin	< 4				< 4
	< 4
	< 4			2	< 4			1
Guanin	< 4				< 4
	< 4
	< 4			2	< 4			1
Uridin	< 4				< 4
	< 4
	< 4			2	< 4			1
Adrlanamycin	4.35		27792		< 4
	4.35		27918	1	< 4			1
Daunomycin	4.30		30990		< 4
	4.30		31324	1	< 4			1

Tabelle 3: [³⁵S]-GTPγS-Bindung an Membranen aus CHO-Zellen, transient transfiziert mit Adenin-bindendem Rezeptor aus Ratte, oder Wildtyp-CHO-Zellen

	Transienttransfizierte Zellen
Verbindung	pEC₅₀	SD	SEM	% Stim.	SD	SEM	n
Adenin	6.88			106
	6.94			111	= 100% ref
	7.02			177	= 100% ref
	6.94			199	= 100% ref
	6.95	0.06	0.03	148	47	23	4
1-Methyladenin	4.79			90	(81% ret)
	4.92			135	(76% ret)
	4.75			161	(81% ref)
	4.82	0.09	0.05	129	36	21	3
AMP	4.12			55	(50% ret)
	4.56			92	(52% ret)
	4.38			137	(69% ret)
	4.35	0.22	0.13	95	41	24	3
6-Benzylaminopurin	< 4			12	(11% ret)
	< 4			12			1

	Wildtyp-Zellen
Verbindung	pEC₅₀	SD	SEM	%Stim.	SD	SEM	n
Adenin	< 5			0
	< 5			0
	< 5			0
				0			3
1-Methyladenin	< 4			0
	< 4			0
				0			2
AMP	< 4			0
	< 4			0
				0			2
6-Benzylaminopurin

Tabelle 4: cAMP-Messungen in CHO-Zellen, transient transfiziert mit Adenin-bindendem Rezeptor aus Ratte

	Basal (pmol/well)	Forskolin 50 μM (pmol/well)	pEC₅₀ Adenin	pEC₅₀ l-Methvl-adenin
Direkter Test
0.5% hiFCS	2.8	145	7.68	5.31
2% hiFCS	2.5	105	8.15	5.20

Indirekter Test
0.5% hiFCS	0.5	74	8.48	5.10
2% hiFCS	0.4	62	6.96	no fit

Tabelle 5: [³⁵S]-GTPγS-Bindung an Membranen aus CHO-Zellen, transient transfiziert mit Adenin-bindendem Rezeptor aus Ratte. Stimulation über Basalwert durch Adenin

	Permanently transfected cells
	pEC₅₀	% Stimulation
Klon 26 (MP1)	7.19	632
Klon 28 (MP9)	7.31	657
Klon 29 (MP9)	7.10	527
Klon 30 (MP9)	7.24	534

Tabelle 6: cAMP-Messungen in CHO-Zellen, transient transfiziert mit Adenin-bindendem Rezeptor aus Ratte

	Basal (pmol/well)	Forskolin 50 μM (pmol/well)	pEC₅₀ Adenin
Wildtyp
0.5% hiFCS,keine Induktion	0.27	26	/
0.5% hiFCS, Induktion	0.59	25	/
10% hiFCS, keine Induktion	0.64	107	/
10% hiFCS, Induktion	1.08	63	/

transfizierte Zellen
0.5% hiFCS, keine Induktion	0.39	44	/
0.5% hiFCS, Induktion	0.71	45	8.54
10% hiFCS, keine Induktion	0.68	142	/
10% hiFCS, Induktion	1.24	65	8.53

LITERATURANGABEN

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte Nukleinsäuresequenz, codierend für einen Adenin bindenden G-Protein-gekoppelten Rezeptor, der das Polypeptid der SEQ ID NO: 2 umfaßt, oder für ein Polypeptid, bei dem die Adenin bindende Rezeptoraktivität erhalten ist und das eine Sequenzidentität von wenigstens 70% zu dem Polypeptid der SEQ ID NO: 2 aufweist.
Isolierte Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, umfassend die SEQ ID NO: 1 oder eine Sequenz, die eine Sequenzidentität von wenigstens 70% damit aufweist.
Adenin bindender G-Protein-gekoppelter Rezeptor oder Polypeptid, bei dem die Adenin bindende Rezeptoraktivität erhalten ist und das eine Sequenzidentität von wenigstens 70% zu dem Polypeptid mit der Sequenz der SEQ ID NO: 2 aufweist.
Expressionsvektor, umfassend eine Nukleinsäure mit der in Anspruch 1 oder 2 angegebenen Bedeutung in operativer Verknüpfung mit einem Promotor.
Isolierte Wirtszelle mit einem Vektor gemäß Anspruch 4.
Nukleinsäureprimer, bestehend aus einem Fragment von 15 bis 50 Nukleotiden einer für ein Polypeptid gemäß Anspruch 3 codierenden Nukleinsäure, der in der Lage ist, selektiv an die Nukleinsäure zu hybridisieren, gegebenenfalls in 5'- oder 3'-Verknüpfung mit einer Sequenz von 4 bis 15 Nukleotiden, mit der er nicht natürlicherweise verknüpft ist.
Test für eine Verbindung, die zur Wechselwirkung mit einem Adenin bindenden G-Protein-gekoppelten Rezeptor fähig ist, wobei man bei dem Test – einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor bereitstellt, der wenigstens ein Polypeptid umfaßt, das eine Adenin bindende Aktivität aufweist und von einer isolierten Nukleinsäuresequenz mit einer Sequenzidentität von wenigstens 70% zu SEQ ID NO: 1 codiert wird, – den Rezeptor mit einer mutmaßlichen wechselwirkenden Verbindung in Kontakt bringt, – den Rezeptor gegebenenfalls mit Adenin in Kontakt bringt und – bestimmt, ob es sich bei der Verbindung um einen Agonisten oder Antagonisten der durch Adenin induzierten Rezeptoraktivierung handelt.
Test gemäß Anspruch 7, wobei die Wechselwirkung über die Fähigkeit der Verbindung zur Bindung an den Rezeptor bestimmt wird.
Test gemäß Anspruch 7, wobei die Wechselwirkung über die Fähigkeit der Verbindung zur Modulation der Aktivität des Rezeptors bestimmt wird.
Test gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei der Rezeptor in der Membran einer Zelle, in der das Polypeptid gemäß Anspruch 3 von einem Vektor gemäß Anspruch 4 exprimiert wird, lokalisiert ist.
Verwendung eines Tests gemäß einem der Ansprüche 7 bis 10 zur Identifizierung einer Modulatorverbindung zur Behandlung einer Krankheit, deren Krankheitsbild mit einer Wirkung an Purinrezeptoren assoziiert ist.
Test nach Anspruch 7, wobei die Nukleinsäuresequenz mit einer Sequenzidentität von wenigstens 70% zu SEQ ID NO: 1 in einer Zelle von einem die Nukleinsäuresequenz in operativer Verknüpfung mit einem Promotor umfassenden Vektor exprimiert wird und man bei dem Test die Zelle mit der mutmaßlichen wechselwirkenden Verbindung in Kontakt bringt.