DE10310758A1

DE10310758A1 - Identifizierung von schmerzrelevanten Genen der SNSR (Sensory Neuron Specific Receptor)-Familie

Info

Publication number: DE10310758A1
Application number: DE10310758A
Authority: DE
Inventors: Clemens Dr. Gillen; Kay Dr. Hofmann
Original assignee: Gruenenthal GmbH
Current assignee: Gruenenthal GmbH
Priority date: 2003-03-11
Filing date: 2003-03-11
Publication date: 2004-09-23
Also published as: WO2004081042A3; WO2004081042A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Gene von Rezeptoren der SNSR ("Sensory Neuron Specific Receptor")-Familie, die mit Schmerzzuständen, insbesondere chronischem Schmerz, im Zusammenhang stehen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Funktion der neuen SNSR-Rezeptoren modulieren, um somit schmerzrelevante Substanzen aufzufinden. Weiter betrifft die Erfindung die Verwendung solcher Verbindungen sowie Antikörper und Antisense-Nukleinsäuren gegen die neuen Rezeptoren der SNSR-Familie in Arzneimitteln und Diagnostika zur Behandlung bzw. Diagnose von Schmerzen bzw. damit im Zusammenhang stehenden krankhaften Zuständen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Gene von Rezeptoren der SNSR ("Sensory Neuron Specific Receptor")-Familie, die mit Schmerzzuständen, insbesondere chronischem Schmerz, in Zusammenhang stehen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Funktion der neuen SNSR-Rezeptoren modulieren, um somit schmerzrelevante Substanzen aufzufinden. Weiter betrifft die Erfindung die Verwendung solcher Verbindungen sowie Antikörper und Antisense-Nukleinsäuren gegen die neuen Rezeptoren der SNSR-Familie in Arzneimitteln und Diagnostika zur Behandlung bzw. Diagnose von Schmerzen bzw. damit in Zusammenhang stehenden krankhaften Zuständen.

Zur Therapie von Schmerzen stehen unterschiedliche Arzneimittel zur Verfügung, wie z.B. Acetylsalicylsäure, Paracetamol, Dipyrone, Tramadol, Morphin und Fentanyl, aber auch Substanzen wie Amitryptilin und Ketamin kommen zur Behandlung von Schmerzpatienten zum Einsatz. Trotz zunehmend verfeinerter Therapieschemata kann jedoch insbesondere bei chronischen Schmerzzuständen oft keine dauerhafte Verbesserung für die Patienten erzielt werden. Hierfür ist unter anderem auch die Tatsache verantwortlich, dass es beim chronischen Schmerz zu dauerhaften Veränderungen beteiligter Nervenzellen kommt.

Die Schmerzforschung der letzten Jahre erbrachte die grundlegende Erkenntnis, dass der Entwicklung gerade chronischer Schmerzzustände plastische Veränderungen des Nervensystems, insbesondere in den nozizeptiven Neuronen der Hin terwurzelganglien (engl. „dorsal root ganglia", DRG) und der Neurone im Bereich der Dorsalhörner des Rückenmarks, zugrunde liegen (vgl. Coderre et al., 1993; Zimmermann & Herdegen, 1996). Die neuronale Plastizität geht einher mit Veränderungen in der Expression bestimmter Gene und führt zu langanhaltenden Veränderungen des Phänotyps der betroffenen Neuronen. Das Konzept der neuronalen Plastizität wurde bisher vor allem auf Entwicklungs-, Lern- und Regenerationsprozesse angewandt, doch die neueren Befunde aus der Schmerzforschung zeigen, dass dieses Konzept auch bei pathophysiologischen Vorgängen greift (Tölle, 1997).

Die Chronofizierung des Schmerzes ist tierexperimentell auf phänomenologischer Ebene bereits relativ gut charakterisiert. Bei der Induktion chronischer Schmerzzustände wurden bspw. eine erhöhte Empfindlichkeit und verringerte Reizschwelle peripherer Nozizeptoren, eine Aktivierung sog. stiller Nozizeptoren, eine Reorganisation rezeptiver Felder und eine Erregbarkeitszunahme im Rückenmark festgestellt.

Neben der Analyse von Genen, die in Schmerzmodellen differenziell reguliert werden, stellt die Identifizierung von Genen, die selektiv in schmerzrelevanten Neuronen exprimiert werden, eine vielversprechende Strategie dar, um neue selektive Analgetika bereitzustellen. Vor allem die in den Spinalganglien vorhandenen Neurone und hier besonders die C-Faser-Neurone und die Aδ-Faser-Neurone sind Gegenstand intensiver Forschung, da eine Reihe von Anhaltspunkten für eine derartige Vorgehensweise sprechen. So stellen die Nozizeptoren das erste Glied in der Kette der Schmerzwahrnehmung dar. Daher können Schmerzen durch Modulation derartiger Nozizeptoren an der Quelle bekämpft werden. Weiterhin spielen die Nozizeptoren besonders bei chronischem Schmerz eine entscheidende Rolle, da die Chronifizierung zu einem Großteil auf dynamische Veränderungen in den Spinalganglienneuronen (z.B. eine periphere Sensitivierung) zurückzuführen sind. Aufgrund der spezifischen Aufgabe als Detektoren nozizeptiver Reize exprimieren die Nozizeptoren ein einzigartiges Repertoire an Ionenka nälen und Rezeptoren, die nur in diesen Neuronen vorkommen und daher bei einer pharmakologischen Intervention eine nebenwirkungsarme Therapie erwarten lassen. Weiterhin gibt es eine Reihe von Beispielen für Gene, die ausschließlich oder überwiegend in den DRG-Neuronen exprimiert werden und als interessante molekulare Angriffspunkte für Analgetika Gegenstand intensiver Forschungsbemühungen sind (z.B. der Capsaicin-Rezeptor TrpV1, der purinerge Rezeptor P2X3, der Tetrodotoxin-resistente Natriumkanal Nav1.8, der Kainat-Rezeptor GluR5, der NGF-Rezeptor TrkA, das Neurotrophin GDNF, das Neuropeptid CGRP usw.). Des Weiteren bieten die Spinalganglien als Angriffspunkt potentieller Analgetika den Vorteil, dass sie außerhalb der Blut-Hirn-Schranke liegen und somit leichter für Medikamente zugänglich sind und auch eine Abtrennung von möglichen ZNS-Nebenwirkungen erlauben. Schließlich entfaltet eine Reihe klinisch relevanter Schmerzmittel ihre Wirkung zu einem Großteil über die Hemmung primärer Afferenzen, wie die folgende Tabelle zeigt:

Kürzlich wurden einige Mitglieder der Familie der "sensory neuron specific receptors" (SNSR)/Mas-related genes type X(MRGX) beschrieben (Dong et al., 2001; Lembo et al., 2002). Mit Gensonden wurde sowohl in Mäusen (Dong et al., 2001) als auch in Ratten und Menschen (Lembo et al., 2002) die Gewebeexpression untersucht und in allen drei Spezies eine ausschließliche Expression in dorsalen Spinalganglien und trigeminalen Ganglien nachgewiesen. Vertiefte Analysen zeigten, dass die SNSR nur in den IB4-positiven kleinen nozizeptiven Neuronen exprimiert werden (Dong et al., 2001; Lembo et al., 2002).

Des Weiteren wurde ein endogenes Neuropeptid "Bovine Adrenomedullary peptide 22" (BAM22) als hochaffiner Agonist der Rezeptoren hSNSR4 (EC50 = 16 nM) und hSNSR3 (EC50 = 13 nM) beschrieben (Lembo et al., 2002). BAM22 ist ein Abbauprodukt des schmerzrelevanten Proproteins Proenkephalin und kann daher als weiterer Hinweis darauf gesehen werden, dass die Rezeptoren der SNSR-Familie bei der endogenen Modulation der Schmerzempfindung eine Rolle spielen. Bei den Rezeptoren der SNSR-Familie handelt es sich um G-Protein gekoppelte Rezeptoren. Nahezu die Hälfte aller auf dem Markt befindlichen Medikamente sind Liganden für G-Protein gekoppelte Rezeptoren (engl. „G protein-coupled receptor" GPCR). Die Größe der SNSR-Genfamilie ist in den bisher analysierten Spezies Mensch, Maus und Ratte erstaunlich divergent. In Lembo et al. (2002) werden sechs humane Mitglieder der Familie beschrieben und als SNSR1-6 bezeichnet. In Dong et al. (2001) sind vier humane Proteine der SNSR-Familie beschrieben und werden dort als MRGX1-4 bezeichnet. Die in den genannten Publikationen beschriebenen sechs SNSR-Sequenzen und vier MRGX-Sequenzen sind nicht vollständig identisch, obwohl teilweise sehr ähnlich. In Dong et al. (2001) werden weiterhin 17 murine MRGX-Gene nebst weiteren 33 Pseudogenen beschrieben. Lembo et al. (2002) beschreiben lediglich ein SNSR bei der Ratte. Trotz wiederholter Versuche wurden keine weiteren Rezeptoren in der Ratte identifiziert.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, weitere Mitglieder der SNSR-Genfamilie bereitzustellen, insbesondere, um sie so als Angriffsziele schmerztherapeutischer Wirkstoffe zugänglich zu machen.

Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.

Insbesondere wird ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, insbesondere schmerzrelevanter Verbindungen bereitgestellt, welche die extra- und/oder intrazelluläre Funktion von SNSR-Rezeptoren, insbesondere des SNSR-L2- und/oder des SNSR-L3-Rezeptors der Ratte, modulieren, umfassend die Schritte:

(a) Bereitstellen eines Zellsystems, in welchem ein mindestens 10 Aminosäuren umfassender Abschnitt mindestens eines Polypeptids exprimiert wird, ausgewählt aus Polypeptiden, die durch die Nukleotidsequenz gemäß Positionen 179475 bis 180485 (bzw. 180488 einschließlich Stop-Codon) der 2 (genomische Sequenz des bisher bekannten SNSR der Ratte), durch die Nukleotidsequenz gemäß Positionen 132249 bis 133316 (bzw. 133319 einschließlich Stop-Codon) der 2 (genomische Sequenz des SNSR-L2 der Ratte), durch die Nukleotidsequenz gemäß Positionen 33328 bis 32417 (bzw. 32414 einschließlich Stop-Codon) der 2 (genomische Sequenz des SNSR-L3 der Ratte, inverse Orientierung), durch die Nukleotidsequenz gemäß 3 (cDNA von SNSR-L2) oder durch die Nukleotidsequenz gemäß 4 (cDNA von SNSR-L3), einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Fragmente, Allele dieser Sequenzen oder mit diesen Nukleotidsequenzen unter Standardbedingungen hybridisierenden Sequenzen, codiert werden,
(b) Inkontaktbringen des Zellsystems mit einer Testverbindung und
(c) Messen mindestens eines durch Wechselwirkung und/oder indirekte Beeinflussung des (der) mindestens 10 Aminosäuren umfassenden Abschnitts (Abschnitte) des Polypeptids (der Polypeptide) veränderlichen Parameters im Vergleich zur Kontrolle ohne Inkontaktbringen des Zellsystems mit der Testverbindung.

Erfindungsgemäß wird ein Screening-Verfahren bereitgestellt, das aufgrund der Identifizierung von Verbindungen, welche die extra- und/oder Intrazelluläre Funktion von SNSR-Rezeptoren, bspw. SNSR-L2- und/oder SNSR-L3, beeinflussen, der Identifizierung von Substanzen dient, welche eine potentielle Schmerzwirksamkeit aufweisen. Das Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung basiert daher darauf, dass eine potentielle Schmerzwirksamkeit einer Substanz bzw. Verbindung über ihre Wechselwirkung mit den erfindungsgemäß als schmerzrelevanten Peptid- oder Proteinstrukturen, welche einem Abschnitt von oder einem vollständigen SNSR-Rezeptor, insbesondere SNSR-L2- und/oder SNSR-L3-Rezeptor(en), entsprechen, aufgefunden werden kann.

Der Begriff „Substanz" umfaßt jede chemische Verbindung, insbesondere solche, die als Arzneimittel-Wirkstoff geeignet sind. Eine erfindungsgemäße chemische Verbindung ist bspw. eine organisch-chemische Verbindung, insbesondere eine niedermolekulare Spezies, z.B. mit einem Molekulargewicht von <5000, insbesondere <3000, vor allem <1500 und ist typischerweise physiologisch gut verträglich. Ggf. wird sie Bestandteil einer Zusammensetzung mit mindestens einem weiteren Wirkstoff sowie vorzugsweise Hilfs- und/oder Zusatzstoffen sein und als Arzneimittel eingesetzt werden können. Besonders bevorzugt wird das organische Molekül dann sein, wenn die Bindungskonstante für die Bindung an ein erfindungsgemäßes Protein mindestens 10⁷ mol^–1 beträgt. Die erfindungsgemäße Verbindung wird vorzugsweise so beschaffen sein, dass sie die Zellmembran passieren kann, sei es durch Diffusion oder über (intra)membranöse Transportproteine. Weitere erfindungsgemäße Substanzen sind biologisch-chemische Verbindungen wie Nukleinsäuren, insbesondere DNA oder RNA und deren jeweilige Bausteine, Fette, und deren Bestandteile, Zucker, seien es Mono-, Oligo- oder Polysaccharide, Peptide, insbesondere Oilgo- oder Polypeptide, oder Proteine wie Enzyme, Antikörper usw. Des weiteren kann eine „Substanz" im Sinne der vorliegenden Erfindung selbstverständlich aus mehreren gleichen oder verschiedenen der vorgenannten Spezies zusammengesetzt sein oder ein Gemisch derselben darstellen.

Vorzugsweise werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mehrere parallele Versuche mit ansteigenden Konzentrationen der Testsubstanz angesetzt, um im Falle einer pharmazeutischen Wirksamkeit, bspw. eine analgetische Wirkung, der Testsubstanz deren ID₅₀-Wert bestimmen zu können.

Die Modulation der extra- bzw. intrazellulären Funktion der erfindungsgemäßen SNSR-Rezeptoren, insbesondere SNSR-L2 bzw. SNSR-L3, kann dabei eine Verstärkung als auch eine Verminderung bis zur vollständigen Ausschaltung der genannten Funktionen sein. Somit können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren insbesondere vollständige oder partielle Agonisten, Antagonisten, inverse Agonisten und allosterische Modulatoren der SNSR-Rezeptoren identifiziert werden.

Das "Zellsystem", in dem ein erfindungsgemäßes Polypeptid bzw. ein Abschnitt davon exprimiert wird, kann einerseits eine intakte Zelle sein, bspw. aus gegebenenfalls immortalisierten Zelllinien, Primärzelllinien oder anderen Zelllinien oder die Zelle kann nativ aus einem Gewebe stammen, wobei der Zellverband zur Isolierung der Zellen meist aufgelöst ist. Des Weiteren kann das Zellsystem im erfindungsgemäßen Verfahren ein aus einer ursprünglich intakten Zelle hervorgegangenes System sein, wobei es sich hierbei üblicherweise um eine entsprechende Präparation aus Zellen handeln wird. Die "Präparation" umfaßt insbesondere Homogenate von Zellen, bspw. entsprechende Zellysate, z.B. das Cytosol, eine Membranfraktion der Zellen mit Membranfragmenten, eine Suspension isolierter Zellorganellen usw.

Im Schritt (b) des erfindungsgemäßen Identifizierungsverfahrens wird das Zellsystem mit einer Testsubstanz in Kontakt gebracht, was im allgemeinen eine entsprechende Inkubation des Zellsystems in Anwesenheit der Testverbindung einschließt. Das Inkontaktbringen bzw. die Inkubation erfolgt dabei typischerweise in einem wässrigen Medium über eine definierte Zeit, so dass die Testsubstanz gegebenenfalls mit den bzw. dem gemäß Schritt (a) von dem Zellsystem exprimierten Polypeptid(en) bzw. Peptid(en) reagieren kann bzw. in irgendeiner Weise die extra- oder intrazelluläre Funktion der exprimierten Peptide bzw. Polypeptide beeinflußt, d.h. modulieren kann.

Bei einer derartigen Inkubation im Rahmen des Inkontaktbringens der Testverbindung mit dem Zellsystem kann das vorzugsweise wässrige Medium temperiert werden, bspw. zwischen 4°C und 40°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur oder bei 37°C. Die Dauer des Inkontaktbringens, d.h. die Inkubationszeit, kann zwischen wenigen Sekunden und mehreren Stunden, aber auch bis zu mehreren Tagen oder sogar Wochen, variiert werden, wobei hier die Art und Weise der Wechselwirkung der Substanz mit dem Zellsystem, insbesondere dem bzw. den darin exprimierten erfindungsgemäßem Peptid(en) oder Proteinen) zu berücksichtigen sein wird. Bevorzugte Inkubationszeiten sind bspw. zwischen 1 min und 60 min. Das Medium, insbesondere das wässrige Medium, kann geeignete Salze und/oder Puffersysteme enthalten, so dass bei der Inkubation bspw. ein pH zwischen 6 und 8, vorzugsweise pH 7,0 bis 7,5 im Medium herrscht. Geeignete Puffersysteme sind bspw. Acetat-, Phosphat- und Tris-HCl-Puffer, denen üblicherweise zur Einstellung einer geeigneten Ionenstärke Salze, insbesondere NaCl, KCl, CaCl₂, MgCl₂ usw. zugefügt werden. Bevorzugt verwendete Puffersysteme sind bspw. Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) oder Tris-gepufferte Salzlösung (TBS). Dem Medium können weiter geeignete Substanzen, wie Coenzyme, Nährstoffe, Wachstumsfaktoren usw. beigefügt werden. Die geeigneten Bedingungen können von einem Fachmann in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Wechselwirkung der Substanz mit dem bzw. den Peptid(en) oder Proteinen) bzw. in Abhängigkeit von der Art der Modulation des Peptids oder Proteins bzw. der Peptide oder Proteine anhand der Literatur und/oder weniger, einfacher Vorversuche leicht festgelegt werden, um im erfindungsgemäßen Verfahren im Schritt (c) einen möglichst eindeutigen Meßwert zu erhalten.

Die im Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens im Zellsystem exprimierten Proteine bzw. Abschnitte davon spielen aufgrund ihrer Zugehörigkeit zur SNSR-Familie, deren Mitglieder überwiegend oder ausschließlich in dorsalen Spinalganglien und trigeminalen Ganglien, insbesondere den IB4-positiven kleinen nozizeptiven Neuronen, exprimiert werden, bei der endogenen Modulation der Schmerzempfindung eine Rolle. Daher sind sie als Angriffspunkt für potentiell analgetisch wirksame Substanzen besonders interessant.

Da im erfindungsgemäßen Verfahren die Wechselwirkung von Substanzen mit im Schmerzbereich bisher nicht verwendeten Proteinen und Peptiden als Maßstab für das Auffinden schmerzregulierender Substanzen ermöglicht wird, können mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung schmerzrelevante Substanzen aufgefunden werden, die bei den im Stand der Technik bisher bekannten Verfahren, insbesondere mit anderen Peptiden oder Proteinen, nicht identifiziert werden können, was einen erheblichen Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens darstellt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise ein Polypeptid mit einer Aminsäuresequenz gemäß 4 und/oder ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß 6 bzw. ein Polypeptid, welches von einer Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz gemäß 3 codiert wird und/oder ein Polypeptid, welches von einer Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz gemäß 5 codiert wird, exprimiert. Erfindungsgemäß sind jedoch Abschnitte von für entsprechende Polypeptide bzw. Proteine codierende Nukleotidsequenzen verwendbar, wobei es sich dabei aber mindestens um einen für mindestens 10, vorzugsweise 20, mehr bevorzugt mindestens 40, am meisten bevorzugt mindestens 60 Aminosäuren des Polypeptids bzw. Proteins codierenden Abschnitt handeln sollte. Dementsprechend sind für ein Screeningverfahren auch nur Teilabschnitte eines der erfindungsgemäßen Polypeptide von mindestens 10, vorzugsweise 20, mehr bevorzugt mindestens 40, am meisten bevorzugt mindestens 60 Aminosäuren verwendbar. Zum Einsatz kommen können auch Peptide und Proteine, für die eine Nukleotidsequenz codiert, die ein Fragment, ein Derivat oder ein Allel bzw. eine Mutante der für die vorstehend genannten Polypeptide codierenden oder der in den vorstehend genannten Figuren gezeigten Sequenzen darstellt. Eine Mutante bzw. ein Allel oder auch ein Derivat einer erfindungsgemäßen Sequenz geht dabei insbesondere durch Deletion, Addition, Insertion und/oder Substitution eines oder mehrere Nukleotide der jeweiligen Wildtyp-Sequenz aus dieser hervor. Vorzugsweise sind derartige Fragmente, Derivate oder Allele einer der abgebildeten Sequenzen zu mindestens 60%, vorzugsweise zu mindestens 80%, mehr bevorzugt zu mindestens 90% und am stärksten bevozugt zu mindestens 95% homolog ist. Wesentlich hierbei ist, dass die Sequenzveränderung derart ist, dass die Wechselwirkung mit dem/den im Zellsystem exprimierten Peptid(en) oder Proteinen) und damit die Funktion des Verfahrens nicht beeinflusst wird. Dabei versteht man unter x % Homologie eine x %-ige Übereinstimmung der Basenfolge (Sequenzidentität) im kodierenden Bereich des Polynukleotids. Weitere Ausführungen hinsichtlich funktionshomologen Derivaten, Fragmenten und Allelen (Allelvarianten) erfindungsgemäß verwendbarer Sequenzen sind nachstehend angegeben.

Die Proteine bzw. (Poly-)Peptide können auch ausgewählt sein aus solchen funktionshomologen Spezies, die durch eine Nukleinsäure codiert werden, die unter Standardbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen (d.h. Bedingungen, unter denen nur perfekt basengepaarte Nukleinsäure-Stränge gebildet werden und stabil bleiben), an eine Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz gemäß Positionen 179475 bis 180485 (bzw. 180488 einschließlich Stop-Codon) der 2, gemäß Positionen 132249 bis 133316 (bzw. 133319 einschließlich Stop-Codon) der 2, gemäß Positionen 33328 bis 32417 (bzw. 32414 einschließlich Stop-Codon) der 2, gemäß der 3 oder gemäß der 5 oder deren Antisense-Polynukleotid bzw. Antisense-Nukleinsäure binden.

In Hinblick auf die Hybridisierungsbedingungen wird im einzelnen offenbart, dass homologe oder sequenzverwandte Nukleotidsequenzen aus allen Säugerspezies, einschließlich Mensch, nach gängigen Verfahren durch Homologie-Screening durch Hybridisierung mit einer Probe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon isoliert werden. Unter funktionellen Äquivalenten sind auch Homologe der nativen Sequenzen, bspw. der in vorstehenden Sequenzen, beispielsweise ihre Homologen aus anderen Mammalia, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der codierenden und nicht-codierenden DNA-Sequenz zu verstehen.

Zur Hybridisierung können z.B. kurze Oligonukleotide der konservierten Bereiche, die auf dem Fachmann bekannte Weise ermittelt werden können, verwendet werden. In jedem Fall wird die Verwendung und Funktion von mindestens 10, vorzugsweise mindestens 20 Aminosäure langen Nukleotidabschnitten (auch als solche offenbart) der in erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen als Primer für PCR-Reaktionen oder als Oligonukleotide auf DNA-Chips, insbesondere in Form von Mikroarrays offenbart. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure-Sequenz (Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz) bzw. je nachdem, welche Nukleinsäureart (DNA oder RNA) für die Hybridisierung verwendet werden, varieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca. 10 °C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge. Unter Standardbedingungen sind beispielsweise, je nach Nukleinsäure, Temperaturen zwischen 42 und 58 °C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid, wie beispielsweise 42 °C in 5 × SSC, 50% Formamid, zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 20 °C bis 45 °C, bevorzugt zwischen etwa 30 °C bis 45 °C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 30 °C bis 55 °C, bevorzugt zwischen etwa 45 °C bis 55 °C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise bei Sambrook et al. ("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989), beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln, beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Ein „Antisense-Polynukleotid" bzw. eine „Antisense-Nukleinsäure" gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein aus mehreren natürlichen oder modifizierten Nukleinsäurebausteinen bestehendes Molekül, dessen Basenabfolge mindestens teil- bzw. bereichsweise komplementär zur Basenabfolge eines Teilbereiches einer in der Natur vorkommenden Spezies, bspw. der in der Natur vorkommenden mRNA, ist. Augrund der Komplementarität ist das erfindungsgemäße Antisense-Polynukleotid bzw. die erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure unter Standardhybridisierungen, wie oben definiert, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen gemäß obiger Definition, mit dem Zielmolekül befähigt.

Grundsätzlich kann es für das erfindungsgemäße Verfahren genügen, wenn ein mindestens 10 Aminosäuren langes Teilprotein eines der vorgenannten Proteine und/oder Peptide verwendet wird, da bereits 10 Aminosäuren, vorzugsweise 15, insbesondere 20 Aminosäuren völlig spezifisch sind oder sein können.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird das Zellsystem bzw. die Zelle, aus welchem das Zellsystem, insbesondere eine entsprechende Zellpräparation, des erfindungsgemäßen Identifizierungsverfahrens hervorgeht, zur Expression des (der) mindestens 10 Aminosäuren umfassenden Abschnitte) des Polypeptids (der Polypeptide) und/oder zur Messung des mindestens einen Parameters gentechnisch manipuliert. Dabei wird genetisches Material in die Zelle bzw. das Zellsystem eingebracht, insbesondere eine oder mehrere Polynukleotidsequenzen. Vorzugsweise wird dabei die Zelle bzw. das Zellsystem mit einem oder mehreren Vektor(en), vorzugsweise Expressionvektor(en), transfiziert, der (die) für die vorstehend definierten Polypeptide oder Abschnitte davon und/oder (mindestens) ein G-Protein und/oder (mindestens) ein Reportergen codiert.

In einer weiter bevorzugten Variante dieser Ausführungsform erlaubt die gentechnische Manipulation die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktionellen Parameter. In dieser Ausführungsform werden durch gentechnische Manipulation Voraussetzungen geschaffen, unter denen die Veränderung eines funktionellen Parameters überhaupt oder verbessert gemessen werden kann. Dabei ist es insbesondere bevorzugt, dass durch die gentechnische Manipulation eine in der Zelle nicht endogen exprimierte Form eines G-Proteins exprimiert oder ein Reportergen eingeführt wird. Darunter ist insbesondere die gentechnische Einführung eines endogen nicht vorhandenen oder physiologisch nicht exprimierten G-Proteins (GTP-bindenden Proteins) in die Zelle zu verstehen, beispielsweise die Einführung eines chimären G-Proteins, das eine Veränderung des Signalweges erlaubt oder eines promiskuitiven G-Proteins, das sehr bindungsfreudig ist. Die Einführung eines Reportergens wiederum erlaubt die Messung einer (extrazellulär ausgelösten) induzierten Expression des Genproduktes.

Somit kann durch Transfektion der Zelle mit einer für eines der vorstehend definierten Polypeptide oder einen Abschnitt davon codierenden Nukleinsäure (Polynukleotid) bspw. erreicht werden, dass ein Peptid oder Protein, das in der im Verfahren verwendeten Zelle oder Präparation nicht endogen exprimiert wird, von der Zelle synthetisiert wird. Dabei ist es insbesondere bevorzugt, wenn das Polynukleotid in einem rekombinanten DNA-Konstrukt enthalten ist. Unter einem (rekombinanten) DNA-Konstrukt versteht man ein in vitro hergestelltes DNA-Molekül, insbesondere einen entsprechenden Vektor, vorzugsweise Expressionsvektor.

Wenn beim erfindungsgemäßen Verfahren im Schritt (a) die Zelle gentechnisch manipuliert wird, ist es bevorzugt, dass die Zelle nach der gentechnischen Manipulation unter Bedingungen, die eine Expression erlauben, kultiviert wird, gegebenenfalls unter Selektionsdruck. Unter „kultivieren° versteht man, Zellen oder Gewebe bei Bedingungen, die ein Überleben der Zellen, bzw. deren Nachfolgegeneration sichern, zu halten. Dabei sollten die Bedingungen hier so gewählt werden, dass eine Expression des durch die gentechnische Manipulation einge fügten Materials ermöglicht wird. Dazu sollten pH, Sauerstoffgehalt und Temperatur physiologisch gehalten sein und ausreichend Nährstoffe und notendige Cofaktoren beigefügt sein. Der Selektionsdruck erlaubt, nur die Zellen weiter zu kultivieren, bei denen die gentechnische Manipulation zumindest teilweise erfolgreich war. Dazu gehört beispielsweise die Einführung einer Antibiotikaresistenz über ein DNA-Konstrukt.

Es ist beim erfindungsgemäßen Verfahren besonders bevorzugt, wenn die verwendete Zelle eine Amphibienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder eine immortalisierte oder native Säugetierzelle ist bzw. das Zellsystem aus einer derartigen Zelle hervorgeht. Beispiele für Amphibienzellen sind Xenopus-Oocyten, für Bakterienzellen E. coli-Zellen, für Hefezellen solche von Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris usw., für Insektenzellen Sf9-Zellen, für immortalisierte Säugetierzelle HeLa-Zellen und für native Säugetierzellen die CHO (Chinese Hamster Ovary)-Zelle. Hinsichtlich weiterer geeigneter Zell- und Vektorsysteme für das erfindungsgemäße Screeningverfahren wird auf die diesbezüglichen Ausführungen unter dem Gesichtspunkt des erfindungsgemäßen Vektors und der erfindungsgemäßen Wirtszelle verwiesen.

Bei einer bevorzugten Messmethode zur Feststellung der Wechselwirkung der Substanz mit dem erfindungsgemäßen Peptid oder Protein erfolgt die Messung über die Verdrängung eines bekannten markierten Liganden vom Peptid oder Protein und/oder über die daran gebundene Aktivität einer markierten Testsubstanz. Dabei ist ein Ligand ein mit ausreichender, insbesondere hoher Spezifität an das Protein oder Peptid bindendes Molekül, das aus der Bindungsstelle verdrängt wird, wenn eine Testsubstanz ebenfalls an dieser Bindungsstelle bindet, möglicherweise jedoch unter Konformationsumwandlung des Peptids bzw. Proteins an einer anderen Stelle mit diesem wechselwirkt, so dass der bekannte Ligand freigesetzt wird. Unter Markierung ist eine den Nachweis erleichternde oder ermöglichende chemische Modifikation des Moleküls zu verstehen. Beispiele sind radioaktive oder lumineszierende, insbesondere fluoreszierende Markierungen.

Wird das Identifikationsverfahren der vorliegenden Erfindung derart durchgeführt, dass eine Modulation der SNSR-Rezeptoren auf Basis einer Wechselwirkung der Testsubstanz mit diesen Rezeptoren (oder Abschnitten davon) festgestellt wird, so ist es bevorzugt, wenn in einem weiteren Schritt (c) der Bindungsplatz der Testsubstanz auf dem (den) Polypeptid(en) bzw. einem entsprechenden Abschnitt davon, umfassend mindestens 10 Aminosäuren, ermittelt wird. Dies erfolgt üblicherweise durch ein geeignetes strukturbiologisches Verfahren, insbesondere durch röntgenkristallographische Analysen und/oder NMR-Untersuchungen. Allerdings kann auch mit Hilfe einem Fachmann bekannter Mutationsanalysen, insbesondere der zielgerichteten Mutagenese, der Herstellung entsprechender Deletionsmutanten des ursprünglich im Identifizierungsverfahren eingesetzten Polypeptids oder des Abschnitts davon usw., der Bindungsplatz der im Test als positiv bzgl. der Wechselwirkung erkannten Substanz eingegrenzt und bei entsprechend genauer Mutationsanalyse die für die Wechselwirkung essentiellen Aminosäuren bestimmt werden. Hinsichtlich im Stand der Technik weit verbreiteter Mutagenese-Techniken wird bspw. auf den diesbezüglichen Offenbarungsgehalt in Sambrook et al. 1989 und 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, verwiesen.

Bei einer anderen bevorzugten Messmethode zur Feststellung der durch die Wechselwirkung, insbesondere Bindung der Substanz an ein Peptid oder Protein im erfindungsgemäßen Verfahren ausgelösten Veränderung der funktionellen Parameter, erfolgt die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktionellen Parameter über Messung der Regulation, Hemmung und/oder Aktivierung von Rezeptoren, Ionenkanälen und/oder Enzymen, insbesondere über Messung der Veränderung der Genexpression, des Ionenmilieus, des pH oder des Membranpotentials, über Veränderung der Enzymaktivität und/oder der Konzentration der 2ⁿ ^d Messenger. Damit ist auf der einen Seite direkt die Messung der Wirkung der Substanz über die Beeinflussung von (anderen) Rezeptoren, Ionenkanälen und/oder Enzymen erfasst, auf der anderen Seite als bevorzugt zu messende Beispiele sich ändernder Parameter wie Genexpression, Ionenmilieu, pH, Membranpotential, Enzymaktivität oder Konzentration der 2^nd Messenger. Dabei versteht man unter Ionenmilieu insbesondere die Konzentration eines oder mehrer Ionen in einem Zellkompartiment, insbesondere dem Cytosol, unter Membranpotential die Ladungsdiffferenz zwischen zwei Seiten einer Biomembran und unter einem 2^nd Messenger einen Botenstoff eines intrazellulären Signalwegs, wie z.B. zyklisches AMP (cAMP), Inositoltriphosphat (IP3) oder Diacylglycerol (DAG).

Die Kenntnis der Primärsequenz der erfindungsgemäßen Rezeptoren der SNSR-Familie kann benutzt werden, um rekombinante Konstrukte herzustellen, die die Eigenschaften schon charakterisierter und nach dem Stand der Technik bekannter SNSRs ausnutzen. So können z.B. bestimmte Sequenzbereiche von erfindungsgemäßen SNSR-Proteinen gegen bestimmte Sequenzbereiche eines bekannten, gut charakterisierten SNSRs ausgetauscht werden. Das resultierende Konstrukt kann herangezogen werden, um mit bekannten Liganden oder Agonisten, die G-Protein-Kopplung, und die benutzten 2^nd Messenger-Systeme zu identifizieren, oder bekannte G-Protein-Kopplung für die Auffindung von Liganden, insbesondere Agonisten (vollständig, partiell, invers usw.) oder Antagonisten sowie allosterischen Modulatoren, zu benutzen. Die Herstellung chimärer erfindungsgemäßer Rezeptoren bspw. zu den vorgenannten Verwendungen kann bspw. nach einem Verfahren, wie von Kobilka et al. beschrieben (und zur Offenbarung der vorliegenden Erfindung gehörig), durchgeführt werden (Kobilka BK, Kobilka TS, Daniel K, Regan JW, Caron MG, Lefkowitz RJ (1988) Chimeric alpha 2-,beta 2-adrenergic receptors: delineation of domains involved in effector coupling and ligand binding specificity. Science 240:1310–1316).

Im vorstehend definierten Identifizierungsverfahren können erfindungsgemäß konstitutiv aktive Rezeptormutanten der SNSR-Familie zur Charakterisierung der Wirkung dieser Rezeptoren auf Signaltransduktionswege und zum „Screening" nach Liganden eingesetzt werden. Erfindungsgemäße Rezeptoren als Vertreter der G-Protein gekoppelten Rezeptoren können auf bestimmte Weise mutiert werden, um Veränderungen des physiologischen und pharmakologischen Verhaltens dieser Rezeptoren hervorzurufen. Dies kann beispielsweise dazu benutzt werden, intrazelluläre Signalwege zu identifizieren, wenn der natürliche Ligand oder ein Agonist unbekannt sind.

Alternativ kann zur Identifikation von endogenen oder surrogaten Liganden eine Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden, die auf der Verwendung immobilisierter funktioneller erfindungsgemäßer Rezeptoren beruht. Erfindungsgemäße Rezeptoren der SNSR-Familie können hierbei als Fusionsproteine mit GST, dem Flag-Tag oder dem TAP-Tag exprimiert werden. Die entsprechenden Zellen werden entweder nach gängigen Methoden zu Membranen verarbeitet oder direkt zur Solubilisation eingesetzt. Mit geeigneten Detergenzien, z.B. Dodecylmaltosid, Digitonin, Cholat oder Detergenzmischungen, werden die Rezeptoren solubilisiert und an die entsprechenden Affinitätsmatritzen wie GST-Sepharose, Anti-Flag-M2-Agarose oder IgG-Sepharose etc. gebunden. Nach Waschen der Matritzen werden sie mit Gewebsextrakten oder Zellüberständen inkubiert und wieder gewaschen. Enthält der Extrakt einen aktiven Liganden, z.B. ein Peptid, so bindet dieser an den immobiliserten Rezeptor und kann nach Elution durch analytische Methoden identifiziert werden, z.B. mittels Massenspektrometrie.

Sog. Internalisierungstests stellen erfindungsgemäß eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Identifizierungsverfahrens dar, um natürlichen oder insbesondere Sunogatliganden für erfindungsgemäße Rezeptoren, insbesondere SNSR-L2 bzw. -L3, identifizieren zu können. Hierbei werden ebnfalls die unterschiedlichen Eigenschaften eines Proteins der GPCR-Klasse ausgenutzt. Bspw. kann das Internalisierungsverhalten von Proteinen der GPCR-Klasse herangezogen werden. Dies ist als Regulationsmechanismus nach Aktivierung des Rezeptors zu vertehen. Der Vorteil einer „Screening"-Methode die auf diesem Verhalten aufbaut, ist, dass eine genauere Kenntnis der Physiologie des jeweiligen Rezeptors nicht nötig ist. Insbesondere muß keine Kenntnis über die koppelnden G-Proteine, und die benutzten Signaltransduktionswege vorhanden sein.

Ein solcher Test wird z.B. von Lenkei et al. (2000, J Histochem Cytochem, 48, 1553–64) beschrieben und kann erfindungsgemäß analog bei den erfindungsgemäßen Rezeptoren eingesetzt werden. Hierzu wird erfindungsgemäß zunächst ein C-terminales Fusionskonstrukt erfindungsgemäßen Proteins mit EGFP hergestellt. Danach werden stabile CHO-Zellen nach Standardverfahren hergestellt. Stabile Klone werden mit Hilfe eines FACS-Sorters nach EGFP-Fluoreszenz selektiert. Die endgültige Auswahl erfolgte mit Hilfe fluoreszenzmikroskopischer Beurteilung hinsichtlich der Oberflächenexpression. Die Zellen werden danach mit HPLC-Fraktionen von Gewebeextrakten inkubiert, und die Internalisierung mit Hilfe eines konfokalen Mikroskops bestimmt. Die Auswertung erfolgt mit Hilfe morphometrischer Software (NIH Image) nach dem Prinzip der Distanz fluoreszenter Signale vom Zellmittelpunkt. Eine Häufigkeits/Distanzverteilung ergibt eine gute Diskrimination für die Internalisierung.

Zur Auffindung unbekannter Liganden werden vorteilhafter Weise sukzessive Fraktionierungen durchgeführt, um bspw. ein entsprechend wechselwirkendes oder den erfindungsgemäßen Rezeptor der SNSR-Familie anderweitig (d.h. indirekt) beeinflussendes (bspw. die Expression usw. beeinflussendes) Peptid oder Protein bis zur Reinheit zu isolieren, und danach bspw. durch Sequenzierung oder MALDI-TOF zu identifizieren. Eine andere Anwendung des prinzipiell gleichen Verfahrens wird von Ghosh et al. (2000, Biotechniques, 29, 170–5; Conway et al., 1999, J Biomol Screen, 4, 75–86) beschrieben, die beide vollinhaltlich Bestandteil der vorliegenden Offenbarung sind.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Identifizierungs- bzw. Screeningverfahrens wird ein funktioneller Ca-Test herangezogen, der darüber hinaus auch zur Charakterisierung erfindungsgemäßer Rezeptoren verwendbar ist. Hierbei macht man sich erfindungsgemäß zunutze, dass eine Vielzahl von 7TM-Rezeptoren (Rezeptoren mit 7 Transmembran-Domänen), die in HEK293 Zellen, in CHO Zellen oder anderen Zellen produziert werden, über die Kopplung an G-Proteine der Gq-Klasse zur Aktivierung der PLC und zur Mobilisation von intrazellulärem Ca²⁺ führen. Für den Fall, dass gewisse erfindungs gemäße Rezeptoren nicht an G-Proteine der Gq-Klasse koppeln sollten, können diese durch Co-Expression von chimären G-Proteinen oder den relativ unspezifisch mit Rezeptoren koppelnden G-Proteinen G_α15 oder G_α16 zur Signaltransduktion über PLC, d.h. zur Ca²⁺-Freisetzung, gezwungen werden. Die erfindungsgemäßen Rezeptoren der SNSR-Familie können bspw. in HEK293- und in CHO-Zellen sowohl stabil als auch transient allein und zusammen mit dem chimären G-Protein Gqi5 und alternativ mit dem G-Protein G_α15 exprimiert werden. Die Zellen werden dann vorzugsweise mit einem membranpermeablen Ca²⁺-bindenden Fluoreszenzfarbstoff, z.B. Fura-2 oder Fluo-3 bzw. -4 (diese und weitere geeignete Fluoreszenzfarbstoffe sind bspw. bei Molecular Probes erhätlich) beladen und nach dem Waschen der Zellen mit verschiedenen Testsubstanzen versetzt und gleichzeitig die Ca²⁺-Freisetzung, d.h. die intrazelluläre Ca²⁺-Konzentration, gemessen, z.B. mit einem FLIPR-Gerät der Firma Molecular Devices. Testsubstanzen, die ein positives Signal ergeben, werden schließlich vorzugsweise in Kontrollzellen (nur mit dem Vektor transfiziert) getestet, und wenn das Signal sich als spezifisch herausstellt, pharmakologisch, d.h. mit Konzentrations-Response-Kurven, charakterisiert.

Alternativ kann jedoch die durch eine Testsubstanz hervorgerufene Ca²⁺-Antwort auch durch andere Ca²⁺-Detektoren gemessen werden, z.B. über AequoScreen von Euroscreen (Brüssel, Belgien; siehe z.B. http://www.pharmaceuticaltechnology.com/contractors/compound_man/euroscreen/). Dabei werden Zellen eingesetzt, die das Gen des Proteins Apoaequorin exprimieren. Nach Beladung der Zellen mit Coelenterazin, das an Apoaequorin bindet, entsteht Aequorin. Wird durch eine Testsubstanz Ca²⁺ freigesetzt, wodurch sich die intrazelluläre Ca²⁺-Konzentration erhöht, aktiviert das Ca²⁺ das Aequorin zur Oxidation von Coelenterazin, wodurch Licht freigesetzt wird. Die Intensität der Lichtemission ist der Erhöhung der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration proportional und damit ein Maß für die Aktivität der als Ligand identifizierten Testsubstanz (unter Berücksichtigung der entsprechenden Kontrollen).

Um erfindungsgemäße Antagonisten zu identifizieren, werden die Rezeptoren in Gegenwart genügend hoher Konzentrationen verschiedenster Testsubstanzen mit einem bekannten Agonist, bspw. BAM22-6, Neuropeptid FF (NPFF) oder Neuropeptid AF (NPAF), stimuliert. Ein gegenüber der Kontrolle (nur Agonist, ohne weitere Testsubstanz) verändertes Signal, bspw. ein niedrigeres Ca²⁺-Signal, deutet auf einen kompetitiven Antagonisten hin.

Weiterhin können auch cAMP-Tests zur Charakterisierung der erfindungsgemäßen Rezeptoren der SNSR-Familie, insbesondere zur Identifikation von Liganden dienen. Hintergrund dieses erfindungsgemäßen Ansatzes zur Identifizierung von Liganden (Agonisten oder Antagonisten) aber auch zur pharmakologischen Charakterisierung von Rezeptoren der SNSR-Familie ist die Eigenschaft von Rezeptoren der Klasse der GPCRs, bspw. also von erfindungsgemäßen Proteinen, entweder stimulierend oder inhibierend auf Adenylatcyclasen wirken zu können, in der Regel durch Aktivierung von sog. stimulierenden Gs- oder inhibierenden Gi-Proteinen. Abhängig von der Wirkung von Testsubstanzen, bspw. in einem Hochdurchsatz-Screening (engl. „high throughput screening, HTS), kann über direkte oder indirekte Messungen die damit verbundene Änderung des cAMP-Spiegels in der Zelle untersucht werden werden. Die Rezeptorgene oder Teile davon werden hierbei stabil oder transient in Säugerzellen exprimiert. Bei GPCRs, die Adenylatcyclasen aktivieren, wodurch der cAMP-Spiegel in der Zelle steigt, wird ein potentieller Agonist unter den Testsubstanzen durch eine gegenüber Kontrollzellen erhöhte cAMP-Konzentration identifiziert. Antagonisten unter den Testsubstanzen, bspw. in einem HTS-Ansatz, werden durch ihre Blockierung der durch einen Agonisten hervorgerufenen Erhöhung der cAMP-Konzentration identifiziert. Bei Gigekoppelten erfindungsgemäßen SNSRs wird im Test die Adenylatcyclase entweder direkt mit Forskolin oder durch Aktivierung eines Gs-gekoppelten Rezeptors stimuliert, wodurch der cAMP-Spiegel steigt. Ein Agonist des Gi-gekoppelten Rezeptors hemmt diesen Anstieg. Für direkte cAMP-Messungen können eine Anzahl im Handel erhältlicher Tests, wie bspw. des cAMP^[3H]-Test-Systems der Fa. Amersham, verwendet werden, die z.B. auf dem Prinzip der kompetitiven Verdrängung von endogen gebildetem cAMP durch zugegebenes radioaktiv markier tes (Tritium) CAMP beruhen. Indirekte cAMP-Messungen werden in der Regel durch Reporter-Tests durchgeführt. Dazu werden die Rezeptoren in Zellinien exprimiert, die Reportersysteme enthalten, z.B. das CRE-Luziferase-System. cAMP aktiviert die Expression der Luziferase, deren Aktivität durch Umsetzung entsprechender Substrate und luminometrische Messung der Produkte gemessen wird. Reporter-Tests eignen sich ganz besonders für Massen-Screening-Methoden.

Schließlich sind – neben den vorangehend beschriebenen Tests – erfindungsgemäß auch die folgenden Test-Systeme zur Identifizierung von Liganden erfindungsgemäßer SNSR-Proteine bzw. zur Charakterisierung von 2ⁿ ^d Messenger-Systemen dieser Rezeptoren möglich, erfindungsgemäß insbesondere zur Bestimmung der Adenylatcyclase-Aktivität in Zellen oder Membranen nach Salomon (Salomon et al. (1979) Adv. Cyclic Nucleotide Res. 10: 35–55), zur Bestimmung der Inositol-3-phosphat-Konzentration oder zur Messung einer veränderten Arachidonsäurefreisetzung. Beispielsweise können die SNSR-Proteine in gängigen Zellinien überexprimiert werden, und nach Aktivierung durch Gewebeextrakte kann die Aktivität der o.a. 2ⁿ ^d Messenger-Systeme bestimmt werden. Im einzelnen sind Tests für 2ⁿ ^d Messenger-Systemen von Rezeptoren der GPCR-Klasse einem Fachmann bekannt, und im Einzelfall der Literatur zu entnehmen (vgl. z.B. Signal Transduction: A practical approach, G. Milligan, Ed. Oxford University Press, Oxford, England). Weitere Reporter-Tests für das erfindungsgemäße Screeningverfahren umfassen MAP-Kinase/Luziferase- und NFAT-Luziferase-Systeme.

Wie oben erwähnt, dient die Aktivierung von 2ⁿ ^d Messengern erfindungsgemäß zur Identifikation von Liganden, insbesondere Agonisten oder Antagonisten, die an erfindungsgemäße Rezeptoren binden und derart ihre agonistische und/oder antagonistische Wirkung für die Reizentstehung bzw. -weiterleitung im Zusammenhang mit Schmerzen entfalten können. Bspw. können Microphysiometern zur Identifikation von Liganden eingesetzt werden. Durch Ligandenbindung an einen Rezeptor der SNSR-Familie ausgelöste Signale stellen energieverbrauchende Prozesse dar. Deshalb gehen derartige Vorgänge im allgemeinen mit geringen metabolischen Veränderungen, unter anderem einer geringen pH Verschiebung, einher. Diese können extrazellulär von bspw. einem Microphysiometer (Cytosensor, Molecular Devices) erfaßt werden.

Nach Identifizierung von Liganden, insbesondere Agonisten oder Antagonisten, mit Bindungspotential an erfindungsgemäße Proteine der SNSR-Familie können erfindungsgemäß zu deren näherer Charakterisierung Ligandenbindungstests durchgeführt werden. Ligandenbindungstests ermöglichen in direkter Weise die Pharmakologie eines Rezeptors, d.h. die Affinität verschiedenster Liganden für diesen Rezeptor, zu messen. Für Bindungsstudien wird hierbei typischerweise ein nach einem der vorgenannten Verfahren identifizierter oder auf andere Weise bekannter chemisch reiner Ligand mit einer hohen spezifischen Aktivität (30–2000 Ci/mmol) radioaktiv markiert, so dass die radioaktive Markierung die Aktivität des Liganden bezüglich des Rezeptors nicht verringert. Die Testbedingungen werden sowohl für die Verwendung von den Rezeptor exprimierenden Zellen wie auch von daraus hergestellten Membranen bezüglich Pufferzusammensetzung, Salz, Modulatoren wie z.B. Nukleotiden oder Stabilisatoren, wie z.B. Glyzerin, so optimiert, dass die Messung ein brauchbares Signal/Hintergrund-Verhältnis ergibt. Für diese Bindungstests wird die spezifische Rezeptorbindung definiert als die Differenz von der gesamten mit der Rezeptorpräparation (Zellen oder Membranen) assoziierten Radioaktivität, d.h. gemessen in Gegenwart von nur einem spezifischen, nämlich des Radioliganden und der Radioaktivität, die in Gegenwart sowohl des Radioliganden als auch eines Überschusses an nicht radioaktiv markiertem Ligand gemessen wird. Der nicht markierte Ligand verdrängt dabei kompetitiv den Radioligand. Wenn möglich, werden mindestens zwei chemisch verschiedene kompetitierende Liganden verwendet, um die unspezifische Bindung festzulegen. Eine spezifische Bindung, die mindestens 50% der Gesamtbindung beträgt, ist optimal. Der Bindungstest wird entweder inhomogen als Filtrationstest durchgeführt oder homogen als sog. „Scintillation Proximity Test" oder „Flashplate-Test".

Im ersten Fall wird die den Rezeptor enthaltende Präparation (Zellen oder Membranen) mit den Liganden in einer geeigneten Pufferlösung inkubiert, bis sich das Bindungsgleichgewicht eingestellt hat, typischweise 1 h bei RT oder bei 4°C über Nacht, und dann über geeignete Filter, z.B. Whatman oder Schleicher & Schuell Glasfaserfilter, die gegebenenfalls vorbehandelt wurden, z.B. mit Polyethylenimin, abfiltriert, um den nicht-gebundenen von dem gebundenen Radioliganden zu trennen. Nach Waschen der Filter werden diese getrocknet oder feucht mit geeignetem Szintillator versetzt und nach eventuell nötiger Inkubation im Szintillationszähler die enthaltene Radioaktivität gemessen. Beim „Scintillation Proximity Test" werden geeignete Szintillation-Kügelchen, z.B. WGA-Kügelchen, mit den Liganden und Rezeptor enthaltenden Membranen in geeigneter Pufferlösung inkubiert, bis sich das Bindungsgleichgewicht eingestellt hat, und dann die Radioaktivität in einem geeigneten Szintillationszähler gemessen. Beide Bindungstests sind im HTS-Format durchführbar.

Solubiliserte oder gereinigte Rezeptoren können mit dem „Scintillation Proximity Test" oder mit gängigen inhomogenen Tests wie dem Filtrationstest nach PEG-Fällung, dem Adsorptions- oder dem Gelfiltrationstest gemessen werden (Hulme E, Birdsall N (1986) Distinctions in acetylcholine receptor activity. Nature 323: 396–397).

Anstelle eines Radioliganden kann auch ein fluoreszierender Ligand, z.B. ein Ligand, der kovalent einen fluoreszierenden Farbstoff wie BODIPY gebunden hat, eingesetzt werden. Die Bindung des fluoreszierenden Liganden an den Rezeptor wird mittels Fluoreszenzpolarisation gemessen. Die Methode eignet sich sowohl für primäre Screenings im HTS-Format wie auch in Sekundärtests.

Nach Identifizierung hochaffiner, selektiver Substanzen nach vorgenannten erfindungsgemäßen Verfahren werden diese auf ihre Verwendung als Medikamente gegen Schmerzen getestet. Darüber hinaus können die Bindungsplätze der identifizierten und pharmakologisch wirksamen Substanzen an die erfindungsgemäßen SNSR-Genprodukte, insbesondere den Sequenzen gemäß den 4 und 6, mit Hilfe des Yeast-Two-Hybrid-Systems oder anderen Tests ermittelt werden, d.h., dass die für die Interaktion, bspw. auch für die Interaktion zwischen nativen Proteinen, verantwortlichen Aminosäuren, wie bereits vorstehend erwähnt, eingegrenzt werden. In einem nächsten Schritt können hochaffine Substanzen (Surrogatliganden), die speziell die zuvor identifizierten für die Bindung der nativen Interaktionspartner verantwortlichen Aminosäuren (Strukturbereiche) aufweisen, durch die in der vorliegenden Patentanmeldung beschriebenen Screeningverfahren identifiziert werden. Auf diese Weise können auch Substanzen aufgefunden werden, mit denen die Interaktion zwischen erfindungsgemäßen Polypeptiden und etwaigen nativen intrazellulären Interaktionspartnern derselben beeinflußt, bspw. inhibiert, werden können. Hierdurch wird erfindungsgemäß ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen mit spezifischer Bindungsaffinität zum erfindungsgemäßen Protein offenbart. Insbesondere wird in diesem Zusammenhang auf Verfahren, wie bei Klein et al. (1998, Nat Biotechnol, 16, 1334–7) beschrieben, verwiesen. Die bekannten Eigenschaften eines erfindungsgemäßen Proteins, das zur Klasse der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren gehört (Kopplung an G-Proteine, Signalweitergabe), können zudem benutzt werden, um erfindungsgemäß Inhibitoren zu identifizieren.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, enthaltend eine Nukleotidsequenz, insbesondere eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß 4 oder einen mindestens 10 Aminosäuren umfassenden Abschnitt davon und/oder die für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß 6 oder einen mindestens 10 Aminosäuren umfassenden Abschnitt davon codiert, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Fragmente oder Allele. Weiterhin bevorzugt sind solche Nukleinsäure-Sequenzen, insbesondere DNA-Sequenzen, die einen Sequenzbereich enthalten, der für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz eines Proteins der Mitglieder SNSR-L2 oder -L3 der SNSR-Familie codiert, wobei insbesondere der C-terminale (intrazelluläre) Abschnitt eines erfindungsgemäßen Proteins oder ein Fragment desselben (vorzugsweise mindestens von einer Länge von 25 Aminosäure) eingeschlossen sein sollte. Insbesondere sind alle Nukleinsäure- Sequenzen offenbarungsgerecht mitumfaßt, die mit den erfindungsgemäßen Sequenzen unter Standardbedinungen, wie vorstehend definiert, hybridisieren, einschließlich der jeweils im Doppelstrang komplementären Sequenzen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden DNA-Sequenzen offenbart, deren Genprodukt für ein Polypeptid codiert, wie in einer der 4 oder 6 wiedergegeben, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Allele oder Fragmente einer solchen DNA-Sequenz und auch infunktioneller Derivate, Allele, Analoga oder Fragmente (bspw. DN-Varianten), die die physiologische Funktion inhibieren können. Auch mit diesen erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen hybridisierende DNA-Sequenzen (einschließlich der Sequenzen des komplementären DNA-Stranges) sind mitoffenbart. Vorzugsweise bleibt bei den Derivaten, Allelen, Fragmenten oder Analoga der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen gemäß den 4 und 6 bzw. weiteren nativen Mitgliedern der SNSR-Familie mindestens eine biologische Eigenschaft erhalten. Die Herstellung derartiger Derivate, Analoga, Fragmente oder Allele geschieht durch Standardverfahren (Sambrook et al. 1989 und 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY). Hierbei werden bei den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, gehörend zur SNSR-Familie, insbesondere gemäß 3 und 5, ein oder mehrere Codon(s) insertiert, deletiert oder substituiert, um nach Transkription und Translation ein Polypeptid zu erhalten, das einen Unterschied in bezug auf mindestens eine Aminosäure gegenüber den dazugehörigen nativen SNSR-Proteinen der Erfindung, insbesondere den in den 4 oder 6 dargestellten Sequenzen aufweist.

Zum Erfindungsgegenstand der vorliegenden Anmeldung gehören auch Teilsequenzen der erfindungsgemäßen nativen SNSR-Sequenzen, insbesondere der in der 3 oder 5 dargestellten Sequenz. Diese Teilsequenzen enthalten typischerweise mindestens 30, mehr bevorzugt 60, stärker bevorzugt mindestens 150 und noch stärker bevorzugt mindestens 250 Nukleotide umfassende Fragmente der in den 3 und 5 dargestellten Nukleotidsequenzen. Mitoffenbart sind alle Derivate, Analoga oder Allele der vorgenannten offenbarten Teilsequenzen. Auch die sich aus diesen erfindungsgemäßen Teilsequenzen ergebenden Aminosäuresequenzen sind als solche oder als Bestandteil in größeren rekombinanten Proteinen mitoffenbart. Insbesondere sind auch alle denkbaren bzw. nativ auftretenden Spleißvarianten der erfindungsgemäßen Sequenzen Bestandteil der vorliegenden Offenbarung.

Weiterhin bevorzugt sind Nukleinsäuresequenzen, insbesondere DNA-Sequenzen, die für ein Protein codieren, das mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 80%, mehr bevorzugt mindestens 90% und noch stärker bevorzugt mindestens 95% Sequenzidentität (Homologie) mit den Sequenzen gemäß den 4 bzw. 6 aufweist. Nach Isolierung und Sequenzierung sind die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen, insbesondere gemäß 3 oder 5, oder deren funktionelle oder infunktionelle Äquivalente, wie z.B. Allelvarianten oder Isoformen, erhältlich. Unter Allelvarianten werden im Sinne der vorliegenden Erfindung Varianten verstanden, die 60 bis 100 % Homologie auf Aminosäureebene, bevorzugt 70 bis 100 %, ganz besonders bevorzugt 90 bis 100 % aufweisen. Allelvarianten umfassen insbesondere solche funktionellen oder infunktionellen Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus nativen SNSR-Sequenzen, bspw. den erfindungsgemäßen SNSR-L2- oder SNSR-L3-Sequenzen, erhältlich sind, wobei wenigstens noch eine der wesentlichen biologischen Eigenschaften erhalten bleibt.

Hinsichtlich der Isolierung und Definituion funktionshomologer Äquivalente, Derivate, Fragmente, Allele, Mutanten, unter Standard- bzw. stringenten Bedingungen hybridisierender Sequenzen usw. wird auf die entsprechenden Ausführungen im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Identifizierungsverfahren verwiesen.

Zu Äquivalenten von erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen gehören insbesondere auch Derivate der in den 3 und 5 dargestellten Sequenzen, wie beispielsweise Promotorvarianten. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen gemeinsam oder einzeln vorgeschaltet sind, können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) verändert sein, wobei die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren erhalten bleiben oder, je nach Bedarf, verändert werden kann. So können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden. Unter Derivaten sind erfindungsgemäß auch Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz im Bereich –1 bis –1000 vor dem Startkodon so verändert wurden, dass die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, bevorzugt erhöht, wird.

Weiterhin sind unter Derivaten auch Varianten zu verstehen, die vorzugsweise am 3'-Ende verändert wurden. Als solche "Tags" sind in der Literatur z. B. Hexa-Histidin-Anker bekannt oder Epitope, die als Antigene verschiedener Antikörper erkannt werden können (z.B. auch der Flag-Tag)(Studier et al., Meth. Enzymol., 185, 1990: 60–89 und Ausubel et al. (eds.) 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). und/oder mindestens eine Signalsequenz zum Transport des translatierten Proteins, bspw. in eine bestimmte Zellorganelle oder in den extrazellulären Raum.

Darüber hinaus kann ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt oder eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, bspw. gemäß 3 oder 5, bzw. deren Derivate, Varianten, Homologe oder insbesondere Fragmente auch in therapeutisch oder diagnostisch geeigneter Form exprimiert werden. Zur Generierung des rekombinanten Proteins können Vektorsysteme oder Oligonukleotide verwendet werden, die die Nukleinsäuren oder das Nukleinsäurekonstrukt um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide kodieren, die bspw. einer einfacheren Reinigung dienen, insbesondere wird hierbei auch auf die Verlängerung durch die oben beschriebenen Tag-Sequenzen verwiesen.

Bevorzugt sind weiterhin Nukleinsäuren, die (c)DNA-Sequenzen erfindungsgemäßer genomischer Nukleotidsequenzen, insbesondere Positionen 132249 bis 133316 (bzw. 133319 einschließlich Stop-Codon) der 2 oder Positionen 33328 bis 32417 (bzw. 32414 einschließlich Stop-Codon) der 2, enthalten oder diesen entsprechen.

Weiterhin werden erfindungsgemäß vorzugsweise alle DNA-Sequenzen mitoffenbart, die für ein Protein codieren, das im wesentlichen der Aminosäuresequenz gemäß 4 oder 6 entspricht. Diese DNA-Sequenzen enthalten nur eine geringe Zahl an Veränderungen gegenüber der in den vorgenannten Figuren angegebenen Sequenzen, bspw. kann es sich um Isoformen handeln. Die Zahl der Sequenzveränderungen wird typischerweise nicht größer als 10 sein. Derartige im wesentlichen mit den für die Proteine mit den Aminosäuresequenzen gemäß den 4 bzw. 6 codierenden DNA-Sequenzen entsprechenden DNA-Sequenzen, die gleichfalls für ein biologisch aktives Protein codieren, können durch allgemein bekannte Mutagenese-Verfahren erhalten und die biologische Aktivität der durch die Mutanten codierten Proteine durch Screening-Verfahren, bspw. Bindungsstudien oder die Fähigkeit zur Ausprägung der biologischen Funktion, bspw. im Zusammenhang mit neuronalen Vorgängen oder der Apoptose, identifiziert werden. Zu den entsprechenden Mutagenese-Verfahren gehören die „site-directed"-Mutagenese, die die automatisch durchgeführte Synthese eines Primers mit mindestens einer Basenveränderung vorsieht. Nach der Polymersierungsreaktion wird der Heteroduplex-Vektor in einen geeignetes Zellsystem transferiert (z.B. E. coli) und entsprechend transformierte Klone isoliert.

Darüber hinaus kommen alle dem Fachmann geläufigen Methoden für die Herstellung, Modifikation und/oder Detektion von erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, die in vivo, in situ oder in vitro ausgeführt werden können in Betracht (PCR (Innis et al. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications) oder chemische Synthese). Durch entsprechende PCR-Primer können bspw. neue Funktionen in eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz eingeführt werden, wie z.B. Restriktionsschnittstellen, Terminationscodons. Hierdurch können erfindungsgemäße Sequenzen für den Transfer in Klonierungsvektoren entsprechend entworfen werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor, d.h. ein rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt, das eine, wie oben beschrieben, erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, typischerweise eine DNA-Sequenz enthält.

Vorzugsweise handelt es sich bei dem erfidungsgemäßen Vektor um einen Expressionsvektor. Vorteilhafterweise werden hierbei die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen mit mindestens einem genetischen Regulationselement, wie bspw. Transkriptions- und Translationssignalen, funktionell verknüpft. Diese Verknüpfung kann je nach gewünschter Anwendung zu einer nativen Expressionsrate oder auch zu einer Erhöhung bzw. Erniedrigung der nativen Genexpression führen. Mit den solchermaßen hergestellten Expressionsvektoren können anschließend Wirtsorganismen bzw. Wirtszellen transformiert werden, z.B. Zellkulturen aus Säugetierzellen.

Bei dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor wird (werden) typischerweise das (die) native(n) Regulationselement(e) eingesetzt werden, d.h. die bspw. Promotor und/oder Enhancer-Region des Gens für ein erfindungsgemäßes Protein aus der SNSR-Familie, insbesondere für ein Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß der 4 oder 6, insbesondere entsprechende Regulationssequenzen aus der Ratte. Ggf. können diese nativen oben bezeichneten Regulationssequenzen auch genetisch verändert sein, um eine veränderte Expressionsintensität hervorzurufen. Zusätzlich zu diesen nativen vorbezeichneten Regulationssequenzen oder anstelle dieser nativen Regulationssequenzen können für andere Gene native Regulationselemente erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen vor- und/oder nachgeschaltet (5'- oder 3'-Regulationssequenzen) sein und gegebenenfalls auch genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation unter der Kontrolle der vorbezeichneten nativen Regulationssequenzen ausgeschaltet ist und die Expression der Gene – je nach Wunsch – hierdurch erhöht oder erniedrigt werden kann.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für den erfindungsgemäßen Vektor, der insbesondere im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbar ist, sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, I-PR- oder im I-PL-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren wie amy und SPO2, in den Hefepromotoren wie ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH oder in Mammaliapromotoren wie CaM-Kinasell, CMV, Nestin, L7, BDNF, NF, MBP, NSE, beta-Globin, GFAP, GAP43, Tyrosin Hydroxylase, Kainat-Rezeptor-Untereinheit 1, Glutamat-Rezeptor-Untereinheit B enthalten. Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die bspw. oben genannten für einen erfindungsgemäße Expressionsvektor verwendet werden.

Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden. Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

Als Regulationssequenzen werden alle dem Fachmann geläufigen Elemente bezeichnet, die auf der Transkriptions- und/oder Translationsebene die Expression der erfindungsgemäßen Sequenzen beeinflussen können. Insbesondere sind dabei neben Promotorsequenzen sog. "Enhancer"-Sequenzen hervorzuheben, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA eine erhöhte Expression bewirken können. Als weitere Regulationssequenzen seien beispielhaft die sog. "Locus Control Regions", "Silencer" oder jeweilige Teilsequenzen davon genannt. Diese Sequenzen können vorteilhaft für eine gewebespezifische Expression verwendet werden. Auch sog. Terminatorsequenzen wer den vorteilhafterweise in einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor vorhanden sein und erfindungsgemäß unter den Terminus "Regulationssequenz" subsumiert.

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verknüpfung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure mit einem Promotor, wobei der Promotor typisch 5' "upstream" von einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz zu liegen kommt. Weitere Regulationssignale, wie bspw. 3'-gelegene Terminatoren, Polyadenylierungssignale oder Enhancer, können funktionell in dem Expressionsvektor enthalten sein. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen, insbesondere für die Sequenzen gemäß 3 und 5 bzw. für die entsprechenden Proteine, in einer oder mehreren Kopien in einem Genkonstrukt nach dieser Erfindung enthalten sein, oder ggf. auch auf getrennten Genkonstrukten lokalisiert sein.

Unter den Begriff "Expressionsvektor" fallen sowohl rekombinante Nukleinsäurekonstrukte bzw. Genkonstrukte, wie zuvor beschrieben, als auch komplette Vektorkonstrukte, die neben erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und etwaigen Regulationssequenzen typischerweise auch weitere Elemente enthalten. Diese Vektorkonstrukte oder Vektoren werden zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus verwendet. Vorteilhafterweise wird mindestens eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz, bspw. ein Gen der Ratte aus der SNSR-Familie, insbesondere SNSR-L2 oder -L3, oder bspw. eine Teilsequenz eines solchen Gens, in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im ausgesuchten Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Sindbisvirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können auto nom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Für die Integration in Mammalia wird typischerweise lineare DNA verwendet.

Die Expression erfindungsgemäßer Nukleinsäuresequenzen kann vorteilhaft durch Erhöhen der Genkopienzahl und/oder durch Verstärkung regulatorischer Faktoren, die die Genexpression positiv beeinflussen, erhöht werden. So kann eine Verstärkung regulatorischer Elemente vorzugsweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem stärkere Transkriptionssignale, wie Promotoren und Enhancer, verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert oder die Ableseeffizienz dieser mRNA an den Ribosomen erhöht wird. Zur Erhöhung der Genkopienzahl können die Nukleinsäuresequenzen oder homologe Gene, beispielsweise in ein Nukleinsäurefragment bzw. in einen Vektor eingebaut werden, der vorzugsweise die den jeweiligen Genen zugeordnete, regulatorische Gensequenzen oder analog wirkende Promotoraktivität enthält. Insbesondere werden solche regulatorische Sequenzen verwendet, die die Genexpression verstärken.

Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen können zusammen mit den für interagierende oder für potentiell interagierende Proteine kodierenden Sequenzen in einen einzelnen Vektor kloniert werden und anschließend in vitro in einer Wirtszelle oder in vivo in einem Wirtsorganismus exprimiert werden. Alternativ kann auch jede der potentiell interagierenden Nukleinsäuresequenzen und die erfindungsgemäßen kodierenden Sequenzen aus der SNSR-Familie in je einen einzelnen Vektor gebracht und diese getrennt in den jeweiligen Organismus über übliche Methoden, wie bspw. Transformation, Transfektion, Transduktion, Elektroporation oder Partikel-Gun verbracht werden.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform kann mindestens ein Marker-Gen (bspw. Antibiotika-Resistenz-Gene und/oder Gene, die für ein fluoreszierendes Protein kodieren, insbesondere GFP) in einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor, insbesondere einem kompletten Vektorkonstrukt, enthalten sein.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Wirtszellen, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure und/oder einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor, insbesondere einem Vektorkonstrukt transformiert sind. Als Wirtszellen sind prinzipiell alle Zellen geeignet, die eine Expression erfindungsgemäßer Nukleotidsequenzen (wodurch als Derivate bspw. auch ihre Allele oder funktionelle Äquivalente eingeschlossen sind) allein oder im Verbund mit weiteren Sequenzen, insbesondere Regulationssequenzen, gestatten. Als Wirtszellen kommen alle Zellen pro- oder eukaryontischer Natur in Betracht, beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen. Bevorzugte Wirtszellen sind Bakterien, wie Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikroorganismen, wie Aspergillus oder Saccharomyces cerevisiae oder die gewöhnliche Bäckerhefe (Stinchcomb et al., Nature, 282:39, (1997)). Insbesondere um größere Mengen an erfindungsgemäßen Proteinen herstellen zu können, eignen sich vorteilhafterweise methylotrophe Hefen, insbesondere Pichia pastoris. Die Rezeptoren werden dazu in geeignete Expressionsvektoren kloniert, die z.B. auch die Expression als Fusionsprotein mit zur Reinigung geeigneten „Tag"-Sequenzen erlauben. Nach Elektroporation der Hefen werden schließlich stabile Klone selektiert. Eine gute Beschreibung der Methode sowie alle dafür nötigen Mittel werden von der Firma Invitrogen angeboten. Anschließend können die Expressionsprodukte funktionell charakterisiert und ggf. für erfindungsgemäße „Screening"-Verfahren eingesetzt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden jedoch zur Expression von erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen Zellen aus multizellulären Organismen gewählt. Dies geschieht auch vor dem Hintergrund einer möglicherweise erforderlichen Glykosylierung (N- und/oder O-gekoppelt) der codierten Proteine. Diese Funktion kann in höheren Eukaryotenzellen – im Vergleich zu Prokaryotenzellen – in geeigneter Weise ausgeführt werden. Im Prinzip ist jede höhere eukaryotische Zellkultur als Wirtszelle verfügbar, wenn auch Zellen von Säugern, beispielsweise Affen, Ratten, Hamstern oder Menschen, ganz besonders bevorzugt sind. Dem Fachmann ist eine Vielzahl von etablierten Zellinien bekannt. In einer keineswegs abschließenden Aufzählung werden die folgenden Zellinien genannt: 293T (Embryonennierenzellinie), (Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59 (1997)), BHK (Babyhamstemierenzellen), CHO (Zellen aus den Hamsterovarien), (Urlaub und Chasin, P. N. A. S. (USA) 77:4216, (1980)), HeLa (humane Cervixkarzinomzellen) und weitere – insbesondere für den Laboreinsatz etablierte – Zellinien, wie bspw. CHO-, HeLa-, HEK293-, Sf9- oder COS-Zellen. Ganz besonders bevorzugt sind humane Zellen, insbesondere Zellen des Immunsystems oder adulte Stammzellen, bspw. Stammzellen des Blut bildenden Systems (aus dem Knochenmark). Erfindungsgemäß können die Zellen bzw. Zellinien die erfindungsgemäßen SNSR-Rezeptoren endogen als auch exogen exprimieren. Humane erfindungsgemäße transformierte Zellen, insbesondere autologe Zellen des Patienten, eignen sich nach (vor allem ex vivo) Transformation mit erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen oder erfindungsgemäßen Expressionsvektoren, ganz besonders als Arzneimittel für bspw. gentherapeutische Zwecke, also nach Durchführung einer Zellentnahme, ggf. ex vivo Expansion, Transformation, Selektion und abschließender Retransplantation.

Erfindungsgemäß werden insbesondere vorteilhafterweise erfindungsgemäße Proteine der SNSR-Familie heterolog in Insektenzellen zur funktionellen Charakterisierung und zum Einsatz für erfindungsgemäße „Screening"-Verfahren hergestellt werden. Da die Konzentration endogener G-Proteine in Insektenzellen relativ niedrig ist, so sind z.B. Gi-Proteine im „Western Blot" nicht nachzuweisen, und Insektenzellen den zu untersuchenden Rezeptor in der Regel nicht exprimieren, sind sie zur in vivo Rekonstitution von Signaltransduktionswegen erfindungsgemäßer Rezeptoren der SNSR-Familie besonders geeignet. Die Rezeptoren der SNSR-Familie werden in diesem Fall mittels des Baculovirus-Expressionssystems in verschiedenen Insektenzellinien, z.B. Sf9, Sf21, Tn 368 oder Tn High Five, oder MB-Zellen exprimiert. Dazu werden z.B. mit dem BaculoGold Kit von Pharmingen rekombinante Baculoviren hergestellt und die obengenannten Insektenzellinien infiziert. Um erfindungsgemäß die Kopplung an G-Proteine zu untersuchen, werden Ko-Infektionen durchgeführt. Dazu werden die Zellen mit dem Rezeptorvirus und zusätzlich noch mit den die drei G-Protein-Untereinheiten exprimierenden Viren infiziert und entsprechende Tests, z.B. cAMP-Tests durchgeführt. So kann der Einfluß verschiedener G-Protein-Untereinheiten auf die Aktivität des Rezep tors untersucht werden. Insektenzellen die Rezeptoren exprimieren oder deren Membranen können ebenfalls in Screening-Tets eingesetzt werden. Insektenzellen können leicht in großen Mengen sowohl in Fermentern als auch in Schüttelkolben vermehrt werden und sind damit geeignetes Ausgangsmaterial, um rekombinantes Zell- oder Membranmaterial sowohl für „Screening"-Verfahren als auch für Rezeptorreinigungen bereitzustellen.

Die Kombination aus einer Wirtszelle und einem zu den Wirtszellen passenden erfindungsgemäßen Expressionsvektor, wie Plasmide, Viren oder Phagen, wie beispielsweise Plasmide mit dem RNA-Polymerase/Promoter System, die Phagen I, Mu oder andere temperänte Phagen oder Transposons, und/oder weiteren vorteilhaften regulatorischen Sequenzen, bilden eine erfindungsgemäße Wirtszelle, die als Expressionssystem dienen kann. Bevorzugte erfindungsgemäße Expressionssysteme auf der Basis erfindungsgemäßer Wirtszellen sind beispielsweise die Kombination aus Säugetierzellen, wie bspw. CHO-Zellen, und Vektoren, wie bspw. pcDNA3neo-Vektor, oder bspw. HEK293-Zellen und CMV Vektor, die für Säugetierzellen besonders geeignet sind.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure codierten Genprodukte. Unter Genprodukten versteht man im Sinne dieser Erfindung sowohl Primärtranskripte, also RNA, vorzugsweise mRNA, als auch Proteine bzw. Polypeptide, insbesondere in aufgereinigter Form. Diese Proteine regulieren oder transportieren insbesondere mit Schmerzen in Zusammenhang stehende Signale. Bevorzugt ist ein aufgereinigtes Genprodukt dann, wenn es ein funktionshomologes oder die Funktion inhibierendes (infunktionelles) Allel, Fragment, Analoges oder Derivat dieser Sequenz enthält oder typischerweise aus einer solchen Aminosäuresequenz besteht. Funktionshomologie wird im Sinne der vorliegenden Erfindung so definiert, dass mindestens noch eine der wesentlichen funktionellen Eigenschaften der gemäß 4 bzw. 6 dargestellten Proteine erhalten bleibt. Typischerweise werden funktionshomologe erfindungsgemäße Proteine insbesondere eine charakteristische, bspw. mindestens 60%ige, vorzugsweise mindestens 80%ige, mehr bevorzugt mindestens 90%ige Sequenz identität mit den biologisch funktionellen Abschnitten der erfindungsgemäßen Proteine, die bspw. Protein-Interaktionsdomänen darstellen, aufweisen.

Unter einem Derivat werden dabei insbesondere solche Aminosäuresequenzen verstanden, die durch Modifikationen ihrer Seitenketten verändert sind. Bspw. durch Konjugation eines Antikörpers, Enzyms oder Rezeptors an eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz. Derivate können aber auch die Kopplung eines Zuckers (über eine N- oder O-glykosidische Bindung) oder Fett(säure)-restes (bspw. Myristylsäure), einer oder auch mehrerer Phosphatgruppe(n) und/oder jeder beliebigen Modifikation einer Seitenkette, insbesondere einer freien OH-Gruppe oder NH₂-Gruppe oder am N- oder C-Terminus eines erfindungsgemäßen Oligo- oder Polypeptids. Darüber hinaus schließt der Begriff "Derivat" auch Fusionsproteine ein, bei denen also eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz an beliebige Oligo- oder Polypeptide gekoppelt ist.

Als "Analoge" werden Sequenzen bezeichnet, die sich durch mindestens eine Aminosäure-Veränderung gegenüber der nativen Sequenz auszeichnen (Insertion, Substitution). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind solche konservativen Substitutionen bevorzugt, bei denen der physikochemische Charakter (Raumerfüllung, Basizität, Hydrophobizität etc.) der ausgetauschten Aminosäure erhalten bleibt (polare Aminosäure, lange aliphatische Kette, kurze aliphatische Kette, negativ oder positiv geladene Aminosäure, Aminosäure mit aromatischer Gruppe). Die Substitutionen können biologisch funktionelle, tw. Funktionelle oder biologisch infunktionelle Sequenzen ergeben. Beispielsweise können Argininreste gegen Lysinreste, Valinreste gegen Isoleucinreste oder Asparaginsäurereste gegen Glutaminsäurereste ausgetauscht werden. Es können aber auch ein oder mehrere Aminosäuren in ihrer Reihenfolge vertauscht, hinzugefügt oder entfernt werden, oder es können mehrere dieser Maßnahmen miteinander kombiniert werden. Die solchermaßen gegenüber den nativen SNSR-Proteinen, insbesondere gegenüber den gemäß 4 oder 6 veränderten Proteine besitzen typischerweise wenigstens 60%, bevorzugt wenigstens 70% und besonders bevor zugt wenigstens 90% Sequenzidentität zu den Sequenzen in den vorgenannten Figuren, berechnet nach dem Algorithmus von Altschul et al. (J. Mol. Biol., 215, 403–410, 1990). Das isolierte Protein lässt sich vorteilhafterweise aus den dorsalen Sinalganglien sowie trigeminalen Ganglien von Mammalia; insbesondere Rattus norvegicus, isolieren. Auch Homologe aus anderen Mammalia sind unter funktionellen Varianten zu verstehen.

Bevorzugt sind erfindungsgemäß Analoge dann, wenn die Sekundärstruktur, wie sie in der nativen Sequenz auftritt, auch bei ihnen erhalten bleibt. Neben konservative Substitutionen können auch weniger konservative Aminosäure-Variationen erfindungsgemäß in die native Sequenz eingeführt werden. Dabei behalten sie typischerweise ihre biologische Funktion, insbesondere als Transduktor eines schmerzrelevanten Signals, bei. Der Effekt einer Substitution oder Deletion kann ohne weiteres durch entsprechende Untersuchungen, Bindungtests oder bspw. cytotoxische Tests, überprüft werden.

Gleichwohl werden erfindungsgemäß aber auch Sequenzen einbezogen, die einen sogenannten dominant-negativen Effekt hervorrufen können, d.h. auf Grund ihre veränderten Primärsequenz zwar noch Bindungsaktivität an einen extrazellulären Liganden aufweisen, das Signal aber nicht stromabwärts, d.h. intrazellulär, weitergeben können. Derartige Analoge fungieren daher als Inhibitoren der biologischen Funktion, insbesondere als Inhibitoren der Apoptose. Derartige Analoge werden durch gentechnische Maßnahmen hergestellt, und zwar typischerweise durch die sog. "site-directed"-Mutagenese einer Nukleotidsequenz, die für ein erfindungsgemäßes Protein (typischerweise Sequenzen gemäß der 3 oder 5), codiert. Hierdurch wird die dem Analogen zugrundliegende Nukleotidsequenz hergestellt, die schließlich das Protein in einer rekombinanten Zellkultur exprimieren kann (Sambrook et al., 1989, s.o.). Auch alle Derivate der vorbeschriebenen Analoge werden mitoffenbart, genauso wie die den vorbeschriebenen Aminosäuresequenzen zugrundeliegenden Nukleotidsequenzen.

Weiterhin gehören auch Fragmente einer nativen erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Fragmente zeichnen sich durch Deletionen aus (N- oder C-terminal oder auch intrasequentiell). Sie können einen dominant-negativen oder dominant-positiven Effekt haben.

Zu den erfindungsgemäßen Genprodukten (Proteinen) gehören aber auch all jene Genprodukte (Proteine), die sich von erfindungsgemäßen von Nukleinsäure-Derivaten, -Fragmenten oder -Allelen der in den Figuren angegebenen Nukleinsäure-Sequenzen nach Transkription und Translation ableiten.

Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Proteine chemisch modifiziert sein. So etwa kann eine Schutzgruppe am N-Terminus vorliegen. Es können Glykosylgruppen an Hydroxyl- oder Aminogruppen angefügt sein, Lipide können kovalent mit dem erfindungsgemäßen Protein verbunden sein, ebenso Phosphate oder Acetylgruppen und ähnliches. Auch beliebige chemische Substanzen, Verbindungen oder Gruppen können auf einem beliebigen Syntheseweg an das erfindungsgemäße Protein gebunden sein. Auch zusätzliche Aminosäuren, z.B. in Form einzelner Aminosäuren oder in Form von Peptiden oder in Form von Proteindomänen und ähnliches, können mit dem N- und/oder C-Terminus eines erfindungsgemäßen Proteins.

Insbesondere sind hier sogenannte Signal- oder "Leader"-Sequenzen am N-Terminus der Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen Proteins bevorzugt, die das Peptid cotranslational oder posttranslational in eine bestimmte Zellorganelle oder in den extrazellulären Raum (bzw. das Kulturmedium) führen. Am N- oder am C-Terminus können auch Aminosäuresequenzen vorliegen, die als Antigen die Bindung der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz an Antikörper erlauben. Zu nennen ist hier insbesondere das Flag-Peptid, dessen Sequenz im Einbuchstabencode der Aminosäuren lautet: DYKDDDDK. Oder auch ein His- Tag mit mindestens 3, vorzugsweise mindestens 6 Histidin-Resten. Diese Sequenzen haben stark antigene Eigenschaften und erlauben somit eine schnelle Überprüfung und leichte Reinigung des rekombinanten Proteins. Monoklonale Antikörper, die das Flag-Peptid bin den, sind von der Firma Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, Connecticut erhältlich.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner mindestens 10, vorzugsweise 20, stärker bevorzugt mindestens 30 und noch stärker bevorzugt mindestens 50 Aminosäuren umfassende Teilabschnitte der nativen SNSR-Sequenzen, insbesondere den in den 4 und 6 offenbarten Sequenzen. Derartige Teilsequenzen können nach dem Fachmann geläufigen Verfahren bspw. chemisch synthetisiert werden und können vorzugsweise als Antigene für die Produktion von Antikörpern eingesetzt werden. Vorzugsweise wird es sich bei diesen Teilabschnitten bzw. deren Derivaten, Allelen oder Fragmenten um offenbarte Sequenzen handeln, die im räumlichen Modell der Proteine solche Regionen bilden, die zumindest teilweise die Proteinoberfläche ausmachen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein transgener nicht-humaner Organismus, der genetisch dahingehend verändert ist, dass er eine im Vergleich zum normalen, d.h. nicht veränderten, Organismus, (spezifisch) veränderte Menge mindestens einer erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz, insbesondere einer Aminosäuresequenz gemäß 4 und/oder 6, bzw. eine spezifisch gegenüber einer nativen SNSR-L2- und/oder SNSR-L3-Aminosäuresequenz, insbesondere einer Aminosäuresequenz gemäß 4 oder 6, veränderte erfindungsgemäße Aminosäuresequenz enthält, oder dass dem transgenen Organismus eine native SNSR-L2- und/oder SNSR-L3-Aminosäuresequenz fehlt, insbesondere eine Aminosäuresequenz gemäß 4 und/oder 6 der ein Teil davon fehlt oder verändert vorliegt. Somit ist im erfindungsgemäßen transgenen nicht-humanen Organismus eine veränderte Menge mindestens eines erfindungsgemäßen Genprodukts in mindestens einem Gewebe enthalten bzw. darin exprimiert (bspw. durch Modifikation der Promotorbereichs eines erfindungsgemäßen Gens), oder es wird ein verändertes Genprodukt (bspw. ein erfindungsgemäßes Derivat eines Proteins der SNSR-Familie, bspw. auch ein Fragment) in dem mindestens einem Gewebe enthalten oder wird darin exprimiert. Hierbei sind erfindungsgemäß auch solche Tiere eingeschlossen, die die nativ vorhandene erfindungsgemäße Nukleotidsequenz (a) auf der genetischen Ebene entweder teilweise oder vollständig nicht mehr aufweisen oder (b) zwar auf der genetischen Ebene erfindungsgemäße Sequenzen aufweisen, diese jedoch nicht transkribieren und/oder translatieren können und daher das Genprodukt nicht mehr enthalten. Darüber hinaus kann (können) bei einem transgenen Organismus, insbesondere einem transgenen Tier, die native erfindungsgemäßen Sequenz(en), also Sequenzen der SNSR-Familie, bspw. Sequenzen gemäß den 3 und 5, um mindestens eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz ergänzt bzw. durch mindestens eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz substituiert sein. Insbesondere kann es sich bei der (den) substituierten und/oder ergänzten Sequenzen) um erfindungsgemäße Sequenzen handeln, die nicht-nativer Natur sind.

Die Herstellung von in bezug auf erfindungsgemäße Sequenzen transgenen und/oder „knock-out" Tieren, insbesondere Mäusen, Ratten Schweinen, Rindern, Schafen, Fruchtfliegen (Drosophila), C. elegans oder Zebrafischen, erfolgt auf dem Fachmann geläufige Weise. Hierzu wird z.B. eine erfindungsgemäße cDNA Sequenz oder native oder nicht-native Variante in transgenen Mäusen exprimiert, z.B. unter einem NSE-Promotor in Neuronen, unter einem MBP-Promotor in Oligodendrozyten etc.. Die genetisch veränderten Tiere können danach in unterschiedlichen Krankheitsmodellen untersucht werden (z.B. experimentell herbeigeführtem Schlaganfall, MCAO). Die Herstellung von „knock-out" Tieren kann zudem Hinweise auf die Auswirkungen von Inhibitoren auf den Gesamtorganismen liefern, da ein „knock out Modell" insoweit der Inhibition erfindungsgemäßer nativer Sequenzen entspricht. Insoweit kann ein derartiges Verfahren bei einer präklinischen Prüfung von erfindungsgemäßen inhibitorischen Substanzen, z.B. erfindungsgemäße Peptide, Peptidanaloga oder andere kleine organische Verbindungen, zum Einsatz kommen.

Sämtliche multizellulären Organismen können erfindungsgemäß transgen ausgestaltet sein, insbesondere Säugetiere, bspw. Mäuse, Ratten, Schafe, Rinder oder Schweine. Auch transgene Pflanzen sind im Prinzip denkbar. Bei den trans genen Organismen kann es sich auch um sogenannte "Knock-Out"-Tiere handeln. Dabei können die transgenen Tiere eine funktionelle oder nicht funktionelle erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder ein funktionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt allein oder in Kombination mit einer funktionellen oder nicht funktionellen Sequenz, die für erfindungsgemäße Proteine codiert, enthalten.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausgestaltung der oben beschriebenen transgenen nicht-humanen Orgismen sind transgene Tiere, in deren Keimzellen oder der Gesamtheit oder einem Teil der somatischen Zellen oder in deren Keimzellen oder der Gesamtheit oder einem Teil der somatischen Zellen die native(n) erfindungsgemäße(n) Nukleotidsequenz(en) SNSR-Familie, insbesondere der Sequenzen gemäß den 3 oder 5), durch gentechnische Verfahren verändert oder durch Einfügen von DNA-Elementen unterbrochen wurden. Eine weitere Möglichkeit des Einsatzes einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz oder Teilen davon ist die Erzeugung transgener oder knock-out- oder konditioneller oder regionenspezifischer knock-out Tiere oder spezifischer Mutationen bei gentechnisch veränderten Tieren (Ausubel et al. (eds.) 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York und Tones et al., (eds.) 1997, Laboratory protocols for conditional gene targeting, Oxford University Press, Oxford). Darüber hinaus können ebenso bestimmte Mutationen, bspw. Veränderungen der Promotoren oder Insertion von Enhancern, eingeführt werden, um beispielsweise konstitutiv aktive SNSR-Proteine in den transgenen Tieren zu erzeugen („knock-in"-Tiere). Auch derartige Tiere können bspw. erfindungsgemäß eingesetzt werden, um in präklinischen Untersuchungen Analogiemodelle für potentielle Agonisten der SNSR-Proteinfunktion zu liefern.

Über transgene Überexpression oder genetische Mutation (Nullmutation oder spezifische Deletionen, Insertionen oder Veränderungen) durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen kann man Tiermodelle erzeugen, die wertvolle weitere Informationen über die (Patho-)Physiologie der erfindungsgemäßen Sequenzen liefern. Solchermaßen hergestellte Tiermodelle können essen tielle Testsysteme zur Evaluierung neuartiger Therapeutika darstellen, die die biologische Funktion von erfindungsgemäßen Proteinen, insbesondere von Proteinen mit einer der Sequenzen gemäß den 4 und 6, für neurale oder andere Prozesse beeinflussen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Antikörper, der gegen ein Epitop auf einem bereits als vorstehend beschriebenes Genprodukt, insbesondere ein erfindungsgemäßes Peptid oder Protein, gerichtet ist.

Der Begriff "Antikörper" umfaßt i.S. der vorliegenden Erfindung sowohl polyklonale Antikörper als auch monoklonale Antikörper, chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, die alle in gebundener oder löslicher Form vorliegen können, sowie auch Fragmente der vorgenannten Antikörper. Neben den Fragmenten von erfindungsgemäßen Antikörpern in Alleinstellung können erfindungsgemäße Antikörper auch in rekombinanter Form als Fusionsproteine mit anderen (Protein)-Bestandteilen auftreten. Fragmente als solche oder Fragmente von erfindungsgemäßen Antikörpern als Bestandteile von Fusionsproteinen werden typischerweise durch die Methoden enzymatischer Spaltung, der Protein-Synthese oder die dem Fachmann geläufigen Rekombinationsmethoden hergestellt. Als Antikörper werden nach der vorliegenden Erfindung also sowohl polyklonale, monoklonale, humane oder humanisierte oder rekombinante Antikörper oder Fragmente davon, single chain Antikörper, bspw. scFv-Konstrukte, oder auch synthetische Antikörper bezeichnet.

Bei den polyklonalen Antikörpern handelt es sich um heterogene Mischungen von Antikörpermolekülen, die aus Seren von Tieren hergestellt werden, die mit einem Antigen immunisiert worden sind. Zum Gegenstand der Erfindung gehören aber auch polyklonale monospezifische Antikörper, die nach Aufreinigung der Antikörper (bspw. über eine Säule, die mit Peptiden eines spezifischen Epitops beladen sind) erhalten werden. Ein monoklonaler Antikörper enthält eine im wesentlichen homogene Population von Antikörpern, die spezifisch gegen Antigene gerichtet sind, wobei die Antikörper im wesentlichen gleiche Epitop-Bindungsstellen auf weisen. Monoklonale Antikörper können durch die im Stand der Technik bekannten Verfahren erhalten werden (z. B. Köhler und Milstein, Nature, 256, 495-397, (1975); US-Patent 4,376,110; Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor Laboratory (1988); Ausubel et al., (eds), 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). Die in den vorgenannten Literaturstellen enthaltene Beschreibung wird als Bestandteil der vorliegenden Erfindung in die Offenbarung der vorliegenden Erfindung einbezogen.

Auch lassen sich gentechnisch manipulierte erfindungsgemäße Antikörper nach Verfahren, wie in den vorgenannten Druckschriften beschrieben herstellen. Kurz gesagt, werden dazu Antikörper-produzierende Zellen angezogen und die mRNA bei ausreichender optischer Dichte der Zellen über Zellyse mit Guanidiniumthiocyanat, Ansäuern mit Natriumacetat, Extraktion mit Phenol, Chloroform/Isoamylalkohol, Fällungen mit Isopropanol und Waschen mit Ethanol aus den Zellen in bekannter Weise isoliert. Anschließend wird mit Hilfe der Reversen Transcriptase cDNA aus der mRNA synthetisiert. Die synthetisierte cDNA kann direkt oder nach genetischer Manipulation beispielsweise durch "site directed mutagenesis", Einführung von Insertionen, Inversionen, Deletionen oder Basenaustausche in geeignete tierische, pilzliche, bakterielle oder virale Vektoren insertiert und in den entsprechenden Wirtsorganismen exprimiert werden. Bevorzugt werden bakterielle oder Hefe-Vektoren wie pBR322, pUC18/19, pACYC184, Lambda oder Hefe-mu-Vektoren zur Klonierung der Gene und die Expression in Bakterien wie E. coli bzw. in der Hefe wie Saccharomyces cerevisiae.

Erfindungsgemäße Antikörper können einer der folgenden Immunglobulinklassen angehören: IgG, IgM, IgE, IgA, GILD und ggf. einer Unterklasse der vorgenannten Klassen, wie die Subklassen des IgG oder deren Mischungen. Bevorzugt sind IgG und seine Subklassen wie beispielsweise IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 oder IgGM. Besonders bevorzugt sind die IgG Subtypen IgG1/k oder IgG2b/k. Ein Hybridom-Zellklon, der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper produziert, kann in vitro, in situ oder in vivo kultiviert werden. Die Herstellung von großen Titern an monoklonalen Antikörpern erfolgt vorzugsweise in vivo oder in situ.

Bei den erfindungsgemäßen chimären Antikörpern handelt es sich um Moleküle, die verschiedene Bestandteile enthalten, wobei diese sich aus verschiedenen Tierarten ableiten (z. B. Antikörper, die eine variable Region, die aus einem Mäuse-monoklonalen Antikörper abgeleitet ist, und eine konstante Region eines humanen Immunglobulins aufweisen). Chimäre Antikörper werden vorzugsweise eingesetzt, um einerseits die Immunogenizität bei der Anwendung zu reduzieren und andererseits die Ausbeuten bei der Produktion zu erhöhen, z.B. ergeben murine monoklonale Antikörper höhere Ausbeuten aus Hybridom-Zellinien, führen aber auch zu einer höheren Immunogenizität beim Menschen, so dass human/murine chimäre Antikörper vorzugsweise eingesetzt werden. Noch mehr bevorzugt ist ein monoklonaler Antikörper, der die hypervariablen, Komplementaritäts-bestimmenden Regionen (CDR, engl. „complementarity defining region") eines murinen monoklonalen Antikörpers mit den übrigen Bereichen eines humanen Antikörpers in sich vereinigt. Ein derartiger Antikörper wird humanisierter Antikörper genannt. Chimäre Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus dem Stand der Technik bekannt (Cabilly et al., Proc. Natl. Sci. USA 81: 3273–3277 (1984); Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:6851–6855 (1984); Boulianne et al. Nature 312 643–646 (1984); Cabilly et al., EP-A-125023 ; Neuberger et al., Nature 314: 268–270 (1985); Taniguchi et al., EP-A-171496 ; Morrion et al., EP-A-173494 ; Neuberger et al., WO 86/01533; Kudo et al., EP-A-184187 ; Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066–1074 (1986); Robinson et al., WO 87/02671; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 3439–3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 214218 (1987); Better et al., Science 240: 1041–1043 (1988) und Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, supra. Diese Zitatstellen werden als zur Offenbarung gehörig in die vorliegende Erfindung einbezogen.

Die Bezeichnung "Antikörper" soll sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente derselben einschließen. Als Fragmente seien alle verkürzten oder veränderten Antikörperfragmente mit einer oder zwei Antigen-komplementären Bindungsstellen, wie Antikörperteile mit einer den Antikörper entsprechenden von leichter und schwerer Kette gebildeten Bindungsstelle wie Fv-, Fab- oder F(ab')2-Fragmente oder Einzelstrangfragmente, genannt. Bevorzugt sind verkürzte Doppelstrangfragmente wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂. Fab und F(ab')₂-Fragmente entbehren eines Fc-Fragments, wie etwa in einem intakten Antikörper vorhanden, so dass sie im Blutkreislauf schneller transportiert werden können und vergleichsweise weniger nicht-spezifische Gewebsbindung als intakte Antikörper aufweisen. Solche Fragmente werden typischerweise durch proteolytische Spaltung hergestellt, indem Enzyme, wie z. B. Papain (zur Herstellung von Fab-Fragmenten) oder Pepsin (zur Herstellung von F(ab')₂, Fragmenten) verwendet werden, oder durch chemische Oxidation oder durch gentechnische Manipulation der Antikörpergene erhalten werden.

Es ist die besonders ausgewählte Form des Antikörpers, wenn er gegen ein Peptid oder Protein gerichtet ist, für das eine Nukleinsäure bzw. Polynukleotid, oder ein dazu mindestens 90 %, vorzugsweise 95 %, insbesondere 97% homologes Polynukleotid gemäß 3 oder 5, oder ein Polynukleotid, oder ein dazu mindestens 90 %, vorzugsweise 95 %, insbesondere 97% homologes Polynukleotid, das die Sequenz gemäß den 3 oder 5 enthält oder ein Polynukleotid, oder ein dazu mindestens 90 %, vorzugsweise 95 %, insbesondere 97% homologes Polynukleotid, das durch ein Herstellungsverfahren ausgehend von einem Genfragment gemäß einer der 3 oder 5, codiert.

Besonders bevorzugte Antikörper der vorliegenden Erfindung sind dabei gegen einen Sequenzabschnitt auf der extrazellulären Domäne von SNSR-L2 und/oder SNSR-L3 als Epitop gerichtet.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Antisense-Polynukleotid bzw. eine Antisense-Nukleinsäure, wobei es sich auch um eine PNA handeln kann, das/die eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an ein erfindungsgemäßes Polynukleotid zu binden. Dabei versteht man unter PNA (engl. „peptidic nucleic acid") eine peptidische Nukleinsäure, die zwar die Basenpaare trägt, aber dessen Rückrat peptidisch gebunden ist. Eine Antisense-Nukleinsäure zeigt die komplementäre Basenabfolge zu mindestens einem Teil einer Basis-Nukleinsäure. Die erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure ist vorzugsweise Teil eines Ribozyms, insbesondere eines Hammerhead-Ribozyms, oder eines DNA-Enzyms oder einer sonstigen katalytischen RNA bzw. DNA. Unter Ribozym ist eine katalytisch aktive Ribonukleinsäure zu verstehen, unter DNA-Enzym ein entsprechende Desoxyribonukleinsäure, also katalytische RNA bzw. DNA. Eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Antisense-Nukleinsäure bildet eine siRNA, die gegen eine der erfindungsgemäßen Gene gerichtet ist. Der Begriff „siRNA" ist erfindungsgemäß ein doppelsträngiges RNA-Molekül (dsRNA), das 19 bis 29 Bp, insbesondere 21 bis 23 Bp, umfasst und eine der mRNA der erfindungsgemäßen Gene komplementäre Sequenz aufweist. siRNA-Moleküle können bei verschiedenen Anbietern, bspw. IBA GmbH (Göttingen, Deutschland), bezogen werden.

Die siRNA der vorliegenden Erfindung liegt gemäß bevorzugten Ausführungsformen chemisch modifiziert vor, insbesondere, wie nachstehend weiter ausgeführt, um einen vorzeitigen Abbau durch Nukleasen zu umgehen.

Ein „Antisense-Polynukleotid" bzw. eine „Antisense-Nukleinsäure" gemäß der vor liegenden Erfindung ist somit ein aus mehreren natürlichen oder modifizierten Nukleinsäurebausteinen bestehendes Molekül, dessen Basenabfolge mindestens teil- bzw. bereichsweise komplementär zur Basenabfolge eines Teilbereiches einer in der Natur vorkommenden Spezies, bspw. der in der Natur vorkommenden mRNA, ist. Augrund der Komplementarität ist das erfindungsgemäße Antisense-Polynukleotid bzw. die erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure unter Standardbedinungen, wie oben definiert, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, zur Hybridisierung mit dem Zielmolekül befähigt. Erfindungsgemäß umfasst die Antisense-Nukleinsäure bzw. das Antisense-Polynukleotid DNA- oder RNA-Spezies, die unmodifizierte oder modifizierte Nukleotide enthalten oder auch daraus bestehen können. Insbesondere bei RNA-Spezies, wie Antisense-RNA und siRNA, ist es außerdem bevorzugt, dass diese zur Stabilisierung gegenüber dem Abbau durch RNAsen mindestens ein Analoges natürlich vorkommender Nukleotide aufweist. Dies beruht auf der Tatsache, dass die in den Zellen vorkommen den RNA-abbauenden Enzyme als Substrat vorzugsweise natürlich vorkommende Nukleotide erkennen. Durch Einfügen von Nukleotidanaloga kann daher der RNA-Abbau erschwert werden, wobei die Auswirkung auf die Translationseffizienz bei Einfügen von diesen Analoga, insbesondere in den codierenden Bereich der mRNA, einen positiven oder negativen Effekt auf die Translationseffizienz haben kann.

Die Modifikation des Analogons gegenüber dem natürlich vorkommenden Nukleotid kann sowohl die Base als auch die Zucker- und/oder Phosphorsäure-Einheit des jeweiligen Nukleinsäurebausteins betreffen. In einer keineswegs abschließenden Aufzählung können als Beispiele erfindungsgemäß verwendbarer Nukleotidanaloga Phosphoramidate, Phosphorthioate, Peptidnukleotide (d.h. die Antisense-Nukleinsäure ist mindestens teilweise eine Peptidnukleisäure (engl. „peptide nucleic acid" PNA)), Methylphosphonate, 7-Deazaguaonsin, 5-Methylcytosin und Inosin genannt werden.

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden weiterhin Verfahren zur Expression von erfindungsgemäßen SNSR-Genprodukten, insbesondere also von Polypeptiden gemäß 4 oder 6, einschließlich aller Derivate, Analoge und Fragmente, offenbart, wobei hierfür Wirtszellen mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformiert werden. Dieses Verfahren zur Expression von Genprodukten, die auf einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz beruhen, dient nicht dazu, das entsprechende Genprodukt zu konzentrieren und aufzureinigen, sondern vielmehr dazu, den Zellstoffwechsel durch das Einführen der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen über die Expression des dazugehörigen Genprodukts zu beeinflussen. Hier ist insbesondere an die Verwendung der mit Hilfe von Expressionsvektoren transformierten Wirtszellen als Arzneimittel bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels, insbesondere zum Zwecke der Behandlung von Schmerzen, besonders chronischen Schmerzen, zu denken. Allgemein werden erfindungsgemäße Wirtszellen bei Erkrankungen zur Verfügung gestellt, denen eine Fehlregulation der Schmerzentstehung und/oder -weiterleitung zugrunde liegt. Die derart erfindungsgemäß ex vivo transformierten autologen oder allogenen Wirtszellen können dann Patienten transplantiert werden.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Isolierung von erfindungsgemäßen Genprodukten (vorzugsweise mit mindestens einer mit der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen), insbesondere der Sequenzen gemäß den 4 oder 6, zumindest über eine Teilsequenz von mindestens 10, vorzugsweise 20, mehr bevorzugt mindestens 30 Aminosäuren homologen Teilsequenz, wobei die (i) Wirtszellen mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformiert und dann unter geeigneten, die Expression fördernden Bedingungen, gegebenenfalls unter Selektionsdruck (vgl. hierzu die Ausführungen unter dem Gesichtspunkt des erfindungsgemäßen Identifizierungsverfahrens) kultiviert werden, so dass (ii) das Genprodukt schließlich aus der Kultur aufgereinigt werden kann. Das erfindungsgemäße Genprodukt der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz kann dabei, abhängig von dem Expressionssystem, aus einem Kulturmedium oder aus Zellextrakten isoliert werden. Der Fachmann kann ohne weiteres erkennen, dass die jeweiligen Isolierungsmethoden und das Verfahren bei der Aufreinigung des von einer erfindungsgemäßen DNA kodierten, rekombinanten Proteins stark vom Typ der Wirtszelle oder auch von dem Umstand, ob das Protein in das Medium sekretiert wird, abhängt. Zum Beispiel können Expressionssysteme eingesetzt werden, die zur Sekretion des rekombinanten Proteins aus der Wirtszelle führen. Das Kulturmedium muß in diesem Fall durch kommerziell erhältliche Proteinkonzentrationsfilter, z.B. Amicon oder Millipore Pelicon, aufkonzentriert werden. Nach dem Konzentrationsschritt kann ein Reinigungsschritt erfolgen, z.B. ein Gelfiltrationsschritt oder eine Reinigung mit Hilfe von säulenchromatographische Methoden. Alternativ kann aber auch ein Anionenaustauscher eingesetzt werden, der eine Matrix mit DEAE aufweist.

Als Matrix dienen dabei alle aus der Proteinreinigung bekannten Materialien, z.B. Acrylamid oder Agarose oder Dextran oder ähnliches. Es kann aber auch ein Kationenaustauscher eingesetzt werden, der dann typischerweise Carboxymethyl-Gruppen enthält. Zur weiteren Reinigung eines durch eine erfindungsgemäße DNA codierten Polypeptids können dann HPLC-Schritte dienen. Es kann sich um einen oder mehrere Schritte handeln. Insbesondere wird die "Reversed- Phase"-Methode eingesetzt. Diese Schritte dienen zum Erhalt eines im wesentlichen homogenen rekombinanten Proteins einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz.

Neben bakteriellen Zellkulturen zur Isolierung des Genprodukts können auch transformierte Hefezellen eingesetzt werden. In diesem Fall kann das translatierte Protein sekretiert werden, so dass die Proteinreinigung vereinfacht wird. Sekretiertes rekombinantes Protein aus einer Hefewirtszelle kann durch Methoden erhalten werden, wie sie bei Urdal et al. (J. Chromato. 296:171 (1994)) offenbart sind und Bestandteil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung sind.

Erfindungsgemäße Nukleinsäuren, insbesondere erfindungsgemäße DNA, und/oder erfindungsgemäße Genprodukte können als Arzneimittel bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels Verwendung finden. Diese können als solche verabreicht werden (bspw. bukkal, intravenös, oral, parenteral, nasal, subkutan) oder in Kombination mit weiteren Wirk-, Hilfs- oder arzneimitteltypischen Zusatzstoffen. Erfindungsgemäße Nukleinsäure kann als nackte Nukleinsäure, insbesondere intravenös, injiziert werden oder aber mit Hilfe von Vektoren dem Patienten verabreicht werden. Bei diesen Vektoren kann es sich um Plasmide als solche handeln, aber auch um virale Vektoren, insbesondere retrovirale oder adenovirale Vektoren, oder auch um Liposomen, die nackte erfindungsgemäße DNA oder ein Plasmid, das erfindungsgemäße DNA enthält, aufweisen können.

Die Verwendung von erfindungsgemäßen Sequenzen, insbesondere der Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen der genannten Figuren bzw. deren Varianten, sowie erfindungsgemäßer Proteinheteromere sowie davon abgeleiteter erfindungsgemäßer Reagenzien (Oligonukleotide, Antikörper, Peptide) kommt somit für die Herstellung eines Arzneimittels zu therapeutischen Zwecken, d.h. zur Behandlung von Erkrankungen, in Betracht. Ganz besonders bevorzugt ist dabei der therapeutische Einsatz zur Behandlung bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Schmerzen, insbesondere Erkrankungen oder pathophysio logischen Zuständen, die auf fehlgesteuerter Entstehung und/oder Weiterleitung von Schmerzen, vorzugsweise chronischer Art, beruhen.

Damit kommt die Verwendung erfindungsgemäßer Gegenstände, bspw. erfindungsgemäßer Nukleinsäuren, Antisense-Nukleinsäuren, Oligo- oder Polypeptide, Expressionsvektoren, Wirtszellen oder von Surrogatliganden, die sich an alle für die Regulation relevanten Positionen von erfindungsgemäßen Rezeptoren anlagern können, insbesondere für die Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Schmerzen in Betracht.

Um auf auf der Basis molekularer Zusammenhänge zu weiteren Indikationen zu gelangen, erweisen sich erfindungsgemäß Zell-basierte HTS-Tests zur funktionellen Rezeptor-Aktivierung, gemessen durch Enzymkomplementation, als geeignet. Der Test basiert auf dem allgemeinen Regulationsmechanismus von GPCRs und mißt die Wechselwirkung zwischen dem aktivierten Rezeptor und β-Arrestin. Dazu werden inaktive sich komplementierende β-Galactosidasefragmente an den C-Terminus des Rezeptors und an β-Arrestin fusioniert. Durch die Aktivierung des Rezeptors wird beta-Arrestin rekrutiert. Dadurch werden die zwei Hälften der beta-Galactosidase zusammengebracht so dass ein funktionierendes beta-Galactosidaseenzym entsteht, das entsprechende Substrat umsetzen kann, die als Meßsignal dienen (ICAST System). Prinzipiell kann dieser Test mit allen Enzymen durchgeführt werden, die als Fusionsproteine von zwei sich komplementierenden Hälften exprimiert werden können und eine durch gängige Meßmethoden erfaßbare Substratreaktion durchführen.

Im Zusammenhang mit der therapeutischen Anwendung erfindungsgemäßer Sequenzen steht ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, nämlich die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder Proteinsequenz, einschließlich aller Derivate, Allele, Fragmente usw., wie oben definiert, zur Gentherapie bei Säugetieren, z.B. beim Menschen bzw. auch derartige gentherapeutische Verfahren. Gentherapie umfaßt dabei alle Therapieformen, die entweder erfindungsgemäße Nukleotidsequenzen in den Körper oder Teile davon, bspw. einzelne Gewebe, einbringen, oder die Expression von erfindungsgemäßer Sequenzen beeinflussen. Dazu können alle dem Fachmann geläufigen Modifikationen im Rahmen der Gentherapie verwendet werden, bspw. Oligonukleotide, z.B. antisense- oder Hybrid-RNA-DNA Oligonukleotide, mit beliebigen Modifikationen, die erfindungsgemäße Sequenzen enthalten, benutzt werden. Ebenfalls können virale Konstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Sequenzen (dies schließt alle Varianten, wie Fragmente, Isoformen, Allele, Derivate ein) benutzt werden. Auch entsprechende erfindungsgemäße nackte DNA-Sequenzen, kommen im Rahmen der Gentherapie in Betracht. Ebenso können Nukleinsäurestücke mit enzymatischer Aktivität (z.B. Ribozyme) für gentherapeutische Zwecke benutzt werden.

Neben den therapeutischen Anwendungen kommen auch diagnostische Verwendungen erfindungsgemäßer Nukleinsäuren oder Polypeptide, erfindungsgemäßer Proteinheteromere sowie davon abgeleiteter erfindungsgemäßer Reagenzien (Oligonukleotide, Antikörper, Peptide) in Betracht, bspw. zur Diagnose von menschlichen Erkrankungen oder von genetischen Prädispositionen, bspw. auch im Rahmen von Schwangerschaftsuntersuchungen. Bei diesen Erkrankungen oder Prädispositionen handelt es sich insbesondere um die oben im Zusammenhang mit therapeutischen Anwendungen, vor allem im Zusammenhang mit Schmerzen stehende, genannten Erkrankungen. Diese diagnostischen Verfahren können als in vivo, typischerweise jedoch ex vivo Verfahren ausgestaltet sein. Ex vivo wird eine typische Anwendung eines diagnostischen erfindungsgemäßen Verfahrens zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure in einer biologischen Probe dienen. Ein solches Verfahren umfaßt vorzugsweise die folgenden Schritte: (A) Inkubation einer biologischen Probe mit einer bekannten Menge an erfindungsgemäßer Nukleinsäure oder einer bekannten Menge an Oligonukleotiden, die als Primer für eine Amplifikation der erfindungsgemäßen Nukleinsäure geeignet sind, (B) Nachweis der erfindungsgemäßen Nukleinsäure durch spezifische Hybridisierung oder PCR-Amplifikation, (C) Vergleich der Menge an hybridisierender Nukleinsäure oder an durch PCR-Amplifikation gewonnener Nukleinsäure mit einem Mengenstandard.

Erfindungsgemäße Sequenzen können in Verfahren zur Bestimmung von Polymorphismen derselben z.B. bei Menschen verwendet werden. Auf diese ermittelte Polymorphismen erfindungsgemäßer Sequenzen unterfallen nicht nur der Offenbarung der vorliegenden Erfindung, sondern können auch prognostische Marker für die Diagnose bzw. für die Diagnose einer Prädisposition von Erkrankungen, die im Zusammenhang mit einer durch infunktionale Expression erfindungsgemäßer Sequenzen, durch Expression infunktionaler erfindungsgemäßer Sequenzen und/oder oder deren Überexpression dienen. Darüber hinaus ist erlauben erfindunsgemäße Sequenzen die Erforschung humaner Erbkrankheiten, und zwar sowohl monogener als auch polygener Erkrankungen.

Neben therapeutischen und/oder diagnostischen Verwendungszwecken im Bereich der Human- und/oder Tiermedizin kommt auch die Verwendung erfindungsgemäßer Nukleinsäuren oder Polypeptide zum wissenschaftlichen Einsatz in Betracht. Insbesondere erlauben die erfindungsgemäßen Sequenzen auf dem Fachmann bekannte Weise, bspw. über cDNA-Bibliotheken verwandte Sequenzen bei ein- oder mehrzelligen Organismen zu identifizieren oder aber im humanen Genom verwandte Sequenzen zu lokalisieren. Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen, insbesondere die Sequenzen gemäß den 3 und 5 (einschließl. aller Varianten), können also dazu verwendet werden, Gene für mRNAs, die für diese Nukleinsäuren oder deren funktionellen Äquivalente, Homologe oder Derivate kodieren, im bspw. murinen oder anderen Tiergenomen und im menschlichen Genom mit gängigen Methoden durch Homologiescreening zu isolieren, zu kartieren und mit Markern für humane Erbkrankheiten zu korrelieren.

Mit Hilfe erfindungsgemäßer Nukleinsäuren lassen sich damit insbesondere humane Erbkrankheiten diagnostizieren, und zwar sowohl monogene als auch polygene Erkrankungen, weswegen sie als Marker Verwendung finden, wobei hieraus ein erfindungsgemäßes Diagnoseverfahren für erbliche Erkrankungen erwächst.

Insbesondere wird erfindungsgemäß für die wissenschaftliche Anwendung ein Testsystem offenbart, das auf erfindungsgemäßen Aminosäure- und/oder Nukleotid-Sequenzen beruht. In diesem Zusammenhang können die cDNA, die genomische DNA, die regulatorischen Elemente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, als auch das Polypeptid, sowie Teilfragmente davon in rekombinanter oder nicht-rekombinanter Form zur Ausarbeitung eines Testsystems verwendet werden. Ein solches erfindungsgemäßes Testsystem ist insbesondere geeignet, die Aktivität des Promotors oder des Proteins in Anwesenheit der Testsubstanz zu messen. Bevorzugt handelt es sich hierbei um einfache Meßmethoden (kolorimetrische, luminometrische, auf Fluoreszenz beruhende oder radioaktive), die die schnelle Messung einer Vielzahl von Testsubstanzen erlauben (Böhm, Klebe, Kubinyl, 1996, Wirkstoffdesign, Spektrum-Verlag, Heidelberg). Die beschriebenen Testsysteme erlauben das Durchsuchen von chemischen Bibliotheken nach Substanzen, die hemmende oder aktivierende Wirkungen auf erfindungsgemäße Proteine, insbesondere der Sequenzen gemäß den 4 und 6 (bzw. deren Derivate oder Fragmente), haben. Die Identifizierung solcher Substanzen stellt den ersten Schritt auf dem Weg zur Identifizierung neuartiger Medikamente dar, die spezifisch auf die SNSR-assoziierte Signaltransduktion wirken. Insbesondere werden hierbei Testsysteme zur Verfügung gestellt, die die bekannten Eigenschaften von G-Protein gekoppelten Proteinen benutzen, bspw. die weiter unten offenbarten Testsysteme.

Eine ggf. pathologisch gesteigerte Schmerzentstehung bzw. -weiterleitung, die auf einer entsprechenden Fehlsteuerung erfindungsgemäßer Sequenzen beruht, kann auch durch Ribozym-Methoden therapiert werden. Hierzu werden Ribozyme verwendet, die eine Ziel-mRNA schneiden können. Im vorliegenden Fall werden daher Ribozyme offenbart und stellen einen Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar, die native SNSR-mRNA, bspw. von SNSR-L2 oder SNSR-L3, spalten können. Erfindungsgemäße Ribozyme müssen dabei mit der erfindungsgemäßen Ziel-mRNA interagieren können, bspw. über Basenpaarung, und anschließend die mRNA spalten, um die Translation von bspw. SNSR-L2 oder SNSR-L3 zu blockie ren. Die erfindungsgemäßen Ribozyme werden über geeignete Vektoren in die Zielzellen geschleust (insbesondere Plasmide, modifizierte Tierviren, insbesondere Retroviren), wobei die Vektoren neben ggf. anderen Sequenzen eine cDNA-Sequenz für ein erfindungsgemäßes Ribozym aufweist).

Neben den vorgenannten Möglichkeiten zur Modulation der biologischen Funktion erfindungsgemäßer Genprodukte, insbesondere der Genprodukte gemäß 3 und 5, typischerweise der Modulation der Funktion erfindungsgemäßer Genprodukte bei der abnormen Schmerzweiterleitung ist dies auch mit Hilfe eines weiteren Gegenstands der vorliegenden Erfindung möglich. Eine erfindungsgemäße chemische Verbindung wird die intra- und/oder extrazelluläre Funktion der erfindungsgemäßen Proteine der SNSR-Familie modulieren, typischerweise inhibieren oder auch aktivieren, oder auf der Ebene der zugrundeliegenden erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, bspw. durch Bindung an die DNA (bspw. den Promotorbereich) oder durch Bindung an einen der ein erfindungsgemäßes Gen steuernden Transkriptionsfaktoren, die biologische Funktion beeinflussen. Erfindungsgemäße Verbindungen werden typischerweise spezifisch an ein erfindungsgemäßes Protein, insbesondere an ein Protein mit einer der Aminosäuresequenzen gemäß den 4 oder 6, bzw. an eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, insbesondere an eine Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz gemäß einer der 3 oder 5, binden und dadurch eine pharmakologische, insbesondere analgetische Wirkung, hervorrufen. Erfindungsgemäße Verbindungen sind vorteilhafter weise durch das vorstehend definierte Screeningverfahren erhältlich.

Daher werden erfindungsgemäß chemische Verbindungen offenbart, vorzugsweise eine organisch-chemische Verbindung, mit einem Molekulargewicht von <5000, insbesondere <3000, vor allem <1500, die typischerweise physiologisch gut verträglich ist und vorzugsweise die Blut-Hirn-Schranke passieren kann. Ggf. wird sie Bestandteil einer Zusammensetzung mit mindestens einem weiteren Wirkstoff sowie vorzugsweise Hilfs- und/oder Zusatzstoffen sein und als Arzneimittel eingesetzt werden können. Besonders bevorzugt wird das organische Molekül dann sein, wenn die Bindungskonstante für die Bindung an ein erfindungs gemäßes Protein, insbesondere an die cytosolische Domäne oder an die extrazelluläre Domäne eines erfindungsgemäßen Proteins, mindestens 10⁷ mol^–1 beträgt. Die erfindungsgemäße Verbindung wird vorzugsweise so beschaffen sein, dass sie die Zellmembran passieren kann, sei es durch Diffusion oder über (intra)membranöse Transportproteine, ggf. nach entsprechender Modifikation, bspw. mit einer angekoppelten Aminosäuresequenz. Weiterhin bevorzugt sind jene Verbindungen, die die Interaktion von erfindungsgemäßen Proteinen der SNSR-Familie mit Bindungspartnern, insbesondere für die Transduktion eines Schmerzsignals, inhibiert oder verstärkt. Insbesondere besetzen derartige Verbindungen Positionen auf der Oberfläche erfindungsgemäßer Proteine oder rufen bei den erfindungsgemäßen Proteinen einen lokalen Konformationswechsel hervor, so dass die Bindung eines nativen Bindungspartners an ein erfindungsgemäßes Protein verhindert wird.

Über Strukturanalysen eines erfindungsgemäßen Proteins lassen sich gezielt erfindungsgemäße Verbindungen finden, die eine spezifische Bindungsaffinität aufweisen (Rationales Drug Design (Böhm, Klebe, Kubinyl, 1996, Wirkstoffdesign, Spektrum-Verlag, Heidelberg)). Hier wird die Struktur oder eine Teilstruktur, Derivat, Allel, Isoform oder ein Teil einer solchen von einem der erfindungsgemäßen Proteine, insbesondere von einem der Proteinen mit den Sequenzen gemäß einer der 4 und 6, über NMR- oder Röntgenkristallographie-Verfahren (nach entsprechender Kristallisierung, z.B. nach der Methode des „hängenden Tropfens") ermittelt oder, sofern eine solche hochaufgelöste Struktur nicht vorliegt, mit Hilfe von Strukturvorhersage-Algorithmen ein Strukturmodell eines erfindungsgemäßen Proteins, bspw. auch mit Hilfe von homologen bereits strukturell aufgeklärten Proteinen (z.B. von Rhodopsin), erstellt, und dieses) benutzt, um mit Unterstützung von Molecular Modelling Programmen Verbindungen, die als Agonisten oder Antagonisten wirken können, zu identifizieren, für die sich eine hohe Affinität zum erfindungsgemäßen Protein vorhersagen läßt. Ggf. Lassen sich die oben bezeichneten Verfahren zur Strukturaufklärung auch miteinander kombinieren. Geeignete Kraftfelder werden zur Simulation der Affinität einer potentiell affinen Verbindung an eine interessante Substrukur eines erfindungsgemäßen Proteins, bspw. das aktive Zentrum, eine Bindungstasche oder eine „hinge"-Region, eingesetzt. Diese Substanzen werden dann synthetisiert und in geeigneten Testverfahren auf ihr Bindungsvermögen und ihre therapeutische Nutzbarkeit getestet. Derartige in silico Verfahren zur Identifizierung potentieller Wirkstoffe, die ihre Wirkung durch Bindung an erfindungsgemäße SNSR-Proteine entfalten, sind gleichfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die erfindungsgemäße Verbindung ein Antikörper, vorzugsweise ein gegen ein erfindungsgemäßes Protein der SNSR-Familie, bspw. SNSR-L2 oder SNSR-L3, gerichteter Antikörper oder auch gegen die zugrundeliegenden mRNA gerichteter Antikörper, der ex vivo in retransplantierte Wirtszellen oder durch gentherapeutische in vivo Verfahren in Wirtszellen eingeschleust wird und dort als "Intrabody" nicht sekretiert wird, sondern intrazellulär seine Wirkung entfalten kann. Durch derartige erfindungsgemäße "Intrabodies" können die Zellen vor einer fehlgeleiteten Schmerzreaktion, bspw. durch Überexpression eines erfindungsgemäßen Proteins, geschützt werden. Eine derartige Vorgehensweise wird typischerweise für Zellen jener Gewebe in Betracht kommen, die beim Patienten ein pathophysiologisch verändertes Schmerzweiterleitungsverhalten zeigen, also insbesondere dorsale Spinalganglien und trigeminale Ganglien. Neben den Antikörpern oder Intrabodies sind auch derartig mit erfindungsgemäßen "Intrabodies" gentherapeutisch modifizierte Zellen Bestandteil der vorliegenden Erfindung.

Eine erfindungsgemäße Verbindung mit der Funktion der Blockade, ggf. aber auch Aktivierung der biologischen Funktion von nativem erfindungsgemäßem SNSR-Protein, bspw. von Sequenzen gemäß den 4 und 6, oder entsprechender nativer Allele oder nativer Spleißvarianten, bspw. der schmerzrelevanten Funktion, kann als Arzneimittel Verwendung finden. Hierbei sind als Verbindungen alle vorgenannten Varianten eingeschlossen, also bspw. organischchemische Verbindungen, Antikörper, Anti-sense-Oligonukleotide, (Hammerhead-)Ribozyme, siRNA. Insbesondere ist eine erfindungsgemäße Verbindung (zur Herstellung eines Arzneimittels) zur Behandlung von Schmerzen, insbesondere solche chronischer Natur, geeignet. Damit kann ein erfindungsgemäßer Inhibitor (bspw. ein inhibitorisch wirkender Antikörper (insbesondere ein Intrabody), ein (Hammerhead-)Ribozym, Anti-sense RNA, insbesondere siRNA, dominantnegative Mutanten oder eine der vorgenannten ggf. inhibitorischen organischchemischen Verbindungen, vorzugsweise eine hochaffine Verbindung, bspw. erhältlich aus einem der vorgenannten Verfahren) der zellulären Funktion eines erfindungsgemäßen nativen Proteins, insbesondere eines Proteins mit den Sequenzen gemäß der 4 und 6, oder seiner nativen Varianten, also bspw. der chronischen Schmerzreaktion, als Arzneimittel und ganz besonders bei der Behandlung von chronischen Schmerzen verwendet werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel, enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes Peptid oder Protein, einen erfindungsgemäßen Vektor, einen erfindungsgemäßen Antikörper, eine erfindungsgemäße Wirtszelle und/oder eine erfindungsgemäße Verbindung sowie gegebenenfalls geeignete Hilfs-, Träger- und/oder Zusatzstoffe. Vorzugsweise dient das erfindungsgemäße Arzneimittel der Behandlung von Schmerzen, insbesondere solcher chronischer Natur, die bspw. neuropathisch und/oder entzündungsbedingt sein können.

Entsprechende Wege zur geeigneten Formulierung und Herstellung derartiger Formulierungen sind bspw. bei "Remington's Pharraceutical Sciences" (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980) offenbart, das vollinhaltlich Bestandteil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung ist. Für die parenterale Verabreichung kommen als Hilfs- bzw. Zusatzstoffe bspw. steriles Wasser, sterile Kochsalzlösung, Polyalkylenglykole, hydrierte Naphthalene und insbesondere biokompatible Lactidpolymere, Lactid/Glykolidcopolymere oder Polyoxyethylen-/Polyoxypropylencopolymere in Betracht. Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen können Füllsubstanzen oder Substanzen, wie Laktose, Manitol, Substanzen zur kovalenten Anknüpfung von Polymeren, wie z.B. Polyethylenglykol an erfin dungsgemäße Nukleinsäuren, Proteine oder Antikörper, Komplexierung mit Metallionen oder Einschluß von Materialien in oder auf besondere Präparationen von Polymerverbindungen, wie z.B. Polylaktat, Polyglykolsäure, Hydrogel oder auf Liposomen, Mikroemulsionen, Mizellen, unilamerare oder multilamelare Vehikel, Erythrozyten-Fragmente oder Spheroblasten, enthalten. Die jeweiligen Ausführungsformen der pharmazeutischen Zusammensetzungen werden abhängig vom physikalischen Verhalten, bspw. in Hinblick auf die Löslichkeit, die Stabilität, Bioverfügbarkeit oder Abbaubarkeit gewählt. Kontrollierte oder konstante Freisetzung der erfindungsgemäßen Wirkstoffkomponenten schließt die Formulierung auf Basis lipophiler Depots ein (z.B. Fettsäuren, Wachse oder Öle). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden auch Beschichtungen erfindungsgemäßer pharmazeutischer Zusammensetzungen bzw. Arzneimittel, enthaltend die therapeutisch wirksamen Substanzen, nämlich Beschichtungen mit Polymeren offenbart (z.B. Polyoxamere oder Polyoxamine). Weiterhin können erfindungsgemäße therapeutisch wirksame Substanzen oder Zusammensetzungen protektive Beschichtungen, z.B. Proteaseinhibitoren, Nukleaseinhibitoren oder Permeabilitätsverstärker, aufweisen. Bevorzugte Träger sind typischerweise wässrige Trägermaterialien, wobei Wasser zur Injektion (WFI) oder Wasser, gepuffert mit Phosphat, Zitrat, HEPES oder Acetat usw. verwendet wird und der pH typischerweise auf 5,0 bis 8,0 (vorzugsweise 6,5 bis 7,5) eingestellt wird. Der Träger bzw. das Vehikel wird zusätzlich vorzugsweise Salzbestandteile enthalten, z.B. Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder andere Komponenten, welche die Lösung bspw. isotonisch machen. Weiterhin kann der Träger bzw. das Vehikel neben den vorstehend genannten Bestandteilen zusätzliche Komponenten, wie humanes Serumalbumin (HSA), Polysorbat 80, Zucker oder Aminosäuren usw., enthalten.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können als flüssige Arzneiformen in Form von Injektionslösungen, Tropfen oder Säfte, als halbfeste Arzneiformen in Form von Granulaten, Tabletten, Pellets, Patches, Kapseln, Pflaster oder Aerosolen verabreicht werden und enthalten neben den mindestens einem erfindungsgemäßen Gegenstand je nach galenischer Form gegebenenfalls vorstehend genannte Trägermaterialien, Füllstoffe, Lösungsmittel, Verdünnungsmittel, Farbstoffe und/oder Bindemittel. Die Auswahl der Hilfsstoffe sowie die einzusetzenden Mengen derselben hängt davon ab, ob das Arzneimittel oral, peroral, parenteral, intravenös, intraperitoneal, intradermal, intramuskulär, intranasal, buccal, rectal oder örtlich, zum Beispiel auf Infektionen an der Haut, der Schleimhäute und an den Augen, appliziert werden soll. Für die orale Applikation eignen sich Zubereitungen in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulaten, Tropfen, Säften und Sirupen, für die parenterale, topische und inhalative Applikation Lösungen, Suspensionen, leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen sowie Sprays. Erfindungsgemäße Gegenstände in einem Depot in gelöster Form oder in einem Pflaster, gegebenenfalls unter Zusatz von die Hautpenetration fördernden Mitteln, sind geeignete perkutane Applikationszubereitungen. Oral oder perkutan anwendbare Zubereitungsformen können die erfindungsgemäßen Gegenstände verzögert freisetzen. Die an den Patienten zu verabreichende Wirkstoffmenge variiert in Abhängigkeit vom Gewicht des Patienten, von der Applikationsart, der Indikation und dem Schweregrad der Erkrankung. Üblichweise werden 2 bis 500 mg/kg wenigstens eines erfindungsgemäßen Gegenstandes appliziert. Wenn das Arzneimittel insbesondere zur Gentherapie verwendet werden soll, empfehlen sich als geeignete Hilfs- oder Zusatzstoffe beispielsweise eine physiologische Kochsalzlösung, Stabilisatoren, Proteinase-, DNAse-Inhibitoren, RNAse-Inhibitoren etc.

Besonders bevorzugt ist weiterhin ein Arzneimittel, das die vorstehend aufgeführten bevorzugten Formen oder die besonders ausgewählte Form(en) der Nukleinsäure(n), der Antisense-Nukleinsäure(n), Genprodukte(s), insbesondere der vorstehenden Peptide oder Proteine, Vektoren, Antikörper, Wirtszellen, und/oder Verbindungen enthält.

Wie bereits vorstehend dargelegt, eignen sich die erfindungsgemäßen Gegenstände, auch für diagnostische Anwendungen. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Diagnostikum bereit, enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes Genprodukt, insbesondere ein erfindungsgemäßes Peptid oder Protein, einen erfindungsgemäßen Vektor, Antikörper oder Teile davon und/oder eine erfindungsgemäße Wirtszelle sowie gegebenenfalls geeignete Hilf- und/oder Zusatzstoffe. Dabei versteht man unter Diagnostikum ein Hilfsmittel zur Diagnose beispielsweise eines mit Schmerzen in Zusammenhang stehenden Krankheitsgeschehens.

Besonders bevorzugt ist ein Diagnostikum, das die vorstehend als besonders bevorzugte Form der Nukleinsäuren, Antisense-Nukleinsäure(n), Genprodukte, insbesondere Peptide oder Proteine oder eines Teiles davon, Vektoren, Antikörper und/oder der Wirtszelle enthält.

Besonders bevorzugt ist eine Form des Diagnostikums, das eine Antisense-Nukleinsäure enthält, die eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an eine erfindungsgemäße Nukleinsäure zu binden.

Ferner werden erfindungsgemäß diagnostische in vitro Verfahren offenbart, die es erlauben, in einem Organismus, insbesondere beim Menschen, auf molekularer Grundlage der Ursache für auftretende krankhafte Schmerzzustände nachzugehen bzw. mit Schmerzen einhergehende Erkrankungen nachzuweisen (vgl. auch die vostehenden Ausführungen zu den verschiedenen Anwendungsmöglichkeiten erfindungsgemäßer Gegenstände). Für derartige Verwendungszwecke eignen sich insbesondere PCR-Methoden, bspw. RT-PCR-Verfahren, also die Diagnose auf der Basis von mRNA, die in vitro entsprechend in cDNA übersetzt wird und dann mit Hilfe von herkömmlichen PCR-Verfahren vervielfältigt wird. Auch entsprechende Array-Techniken, die erfindungsgemäße Oligonukleotide auf einem Chip positionieren, erlauben die Diagnostik mit Hilfe von Hybridisierungsreaktionen. Hierbei wird die Patientenprobe gegen einen Array mit erfindungsgemäßen Oligonukleotiden, die die erfindungsgemäßen Sequenzen repräsentieren, getestet. Entsprechend gegenüber einem Vergleichsexperiment mit einer Probe eines gesunden Organismus abweichende Signale auf dem Array bei Oligonukleotiden lassen daher eine entsprechende Diagnose zu. Selbstverständlich können derartige Diagnosen auf Nukleinsäure-Ebene auch mit klassischen Blot-Verfahren (Northern- und/oder Southern-Blot) durchgeführt werden.

In ähnlicher Weise eignen sich auch Tests mit (erfindungsgemäßen) Antikörpern gegen die erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen, um eine veränderte Expression der erfindungsgemäß mit der Schmerzregulation zusammenhängenden Proteine oder Peptide in einem kranken, d.h. mit akuten, vorzugsweise chronischen Schmerzen belasteten Organismus, insbesondere einem humanen Patienten, gegenüber einem gesunden Vergleichsorganismus nachzuweisen. Hierzu stehen einem Fachmann entsprechende Testformate, bspw. Radioimmunoassays, ELISA-Tests usw. zur Verfügung.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Gegenstands, bspw. einer Nukleinsäure, einer Antisense-Nukleinsäure, eines Genprodukts, insbesondere einer Peptids oder Proteins, Vektors, Antikörpers, einer Wirtszelle und/oder einer Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Schmerz bzw. als Arzneimittel bzw. zur Anwendung als Arzneimittel zur Behandlung von Schmerz.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung zur Behandlung des chronischen, insbesondere des neuropathisch oder entzündungsbedingten Schmerzes.

Die Figuren zeigen:

1 zeigt die genomische Organisation der drei SNSR-Gene der Ratte. Der Abstand zwischen dem SNSR-L3- und dem SNSR-L2-Gen beträgt etwa 100 kB, während der Abstand zwischen dem SNSR-L2-Gen und dem SNSR-Gen etwa 48 kB beträgt. Die Orientierung ist für jedes Gen mit einem Pfeil angegeben.

2 zeigt die genomische Sequenz des SNSR-Genclusters der Ratte. Das SNSR-Gen umfasst die Positionen 179475 bis 180485 (bzw. 180488 einschließlich Stop-Codon). Das SNSR-L2-Gen umfasste die Positionen 132249 bis 133316 (bzw. 133319 einschließlich Stop-Codon). Das SNSR-L3-Gen ist invers orientiert und umfasst die Positionen 33328 bis 32417 (bzw. 32414 einschließlich Stop-Codon).

3 zeigt die Nukleotidsequenz des SNSR-L2-Gens der Ratte (Nukleotide 250 bis 1317 (bzw. 1320 einschließlich Stop-Codon)).

4 zeigt die Aminosäuresequenz des Rezeptors SNSR-L2 der Ratte.

5 zeigt die Nukleotidsequenz des SNSR-L3-Gens der Ratte (Nukleotide 1 bis 912 (bzw. 915 einschließlich Stop-Codon)).

6 zeigt die Aminosäuresequenz des Rezeptors SNSR-L3 der Ratte.

7 zeigt ein Dendrogramm zur Darstellung der Struktur der SNSR-Genfamilie. Dazu wurde ein Alignment der codierenden Bereiche der cDNA-Sequenzen der fünf humanen (MRGX1, Genbank-Zugriffsnummer AY042213; MRGX2, Genbank-Zugriffsnummer AY042214; MRGX3, Genbank-Zugriffsnummer AY042215; MRGX4, Genbank-Zugriffsnummer AY042216; SNSRneu_HUMAN, Genbank-Zugriffsnummer AX282380) und der drei Ratten-Gene (SNSR (Ratte), Genbank-Zugriffsnummer AF474986; SNSR-L2, vgl. 3; SNSR-L3, vgl. 5 sowie Genbank-Zugriffsnummer AJ311952) sowie eines bekanntermaßen außerhalb der SNSR-Familie liegenden Gens (humanes Mas, Genbank-Zugriffsnummer M13150; „outgroup") erstellt. Die Sequenzunterschiede werden in einem phylogenetischen Baum dargestellt. Es ist eindeutig zu erkennen, dass keine direkte Zuordnung von SNSR-Sequenzen der Ratte und des Menschen möglich ist. Die humanen SNSR-Gene sind untereinander enger verwandt als zu jedem der Ratten-Gene. Die Verwandtschaft der Ratten-Gene ist weniger stark ausgeprägt.

Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung näher, ohne sie einzuschränken.

Beispiel 1: Identifizierung neuer SNSR-Gene im Genom der Ratte
Ausgehend von genomischen Datenbanken und EST-Daten wurden neue SNSR-Gene der Ratte identifiziert. Dazu wurden genomische Daten der Ratte aus öffentlich geförderten Genomprojekten, wie sie in der „HTGS"-Sektion der EMBL/GenBank-Datenbank gespeichert sind, mit Hilfe des BLAST-Programms nach Sequenzen mit Ähnlichkeit zu humanen SNSR-Proteinen durchsucht. Die bei der Suche gefundenen Kandidaten wurden dann mit dem „ClustalW" Programm einem Alignment unterzogen und einer Dendrogramm-Analyse (s.u.) unterworfen, um festzustellen, ob sie Mitlieder der inneren SNSR-Familie sind.
Die dabei gefundenen Kandidaten lagen alle auf einer zusammenhängenden genomischen Region, die durch die EMBL/GenBank-Klone AC115232 und AC095926 repräsentiert wird. Zusätzlich wurden Suchen in der öffentlichen EST-Datenbank dbEST durchgeführt. Zwei dabei gefundene EST-Sequenzen (Al578247 und BF523870) bestätigten die aus der Genomsequenz abgeleitete SNSR-L2-Sequenz, ohne diese vollständig zu umfassen.
Ähnlich der Situation beim Menschen ist das bisher einzige bekannte SNSR-Gen der Ratte (Genbank-Zugriffsnummer AF474986) intronlos. Erfindungsgemäß wurde jedoch festgestellt, dass es in einem genomischen Cluster aus mehreren miteinander verwandten Genen liegt. Anhand einer genomischen Sequenz (2), welche das bekannte SNSR-Gen der Ratte enthält (Positionen 179475 bis 180485 (bzw. 180488 einschließlich Stop-Codon) der Sequenz gemäß 2), wurden zwei weitere SNSR-Gene (SNSR-L2 und SNSR-L3) identifiziert. Diese umfassen die Positionen 132249 bis 133316 (bzw. 133319 einschließlich Stop-Codon) (SNSR-L2) bzw. 33328 bis 32417 (bzw. 32414 einschließlich Stop- Codon) (SNSR-L3, inverse Orientierung) der Sequenz gemäß 2. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass bislang unbekannte Teile des Rattengenoms weitere Gene der SNSR-Famillie enthalten. Allerdings wird der in 2 abgebildete SNSR-Cluster mit drei SNSR-Genen von größeren DIVA-Abschnitten flankiert, die keine SNSR-Sequenzen enthalten. Dies deutet darauf hin, dass die vorliegend beschriebenen drei SNSR-Gene den kompletten Satz dieser Genfamilie in der Ratte darstellen. Das neu identifizierte SNSR-L2-Gen liegt dem bekannten SNSR-Gen benachbart. Das dritte SNSR-Gen der Ratte (SNSR-L3) befindet sich etwa 100 kB stromaufwärts vom SNSR-L2-Gen. Sowohl SNSR-L2 als SNSR-L3 gehören eindeutig zur SNSR-Familie.
Die genomische Organisation der SNSR-Gene der Ratte ist in der 1 schematisch dargestellt. 2 zeigt die Sequenz des SNSR-Clusters der Ratte. 3 zeigt die cDNA-Sequenz des neu identifizierten Rezeptors SNRS-L2 und 4 die davon abgeleitete Aminosäuresequenz. 5 zeigt die cDNA-Sequenz des weiteren identifizierten Rezeptors SNRS-L3 und 6 die davon abgeleitete Aminosäuresequenz.
Beispiel 2 Struktur der SNSR-Genfamilie
In einer weiteren Analyse wurden die Verwandtschaftsverhältnisse der fünf humanen und der drei Ratten-Gene der SNSR-Familie aufgeklärt. Hierzu wurde ein Alignment der acht SNSR-Sequenzen und zusätzlich eines bekanntermaßen außerhalb der SNRS-Familie befindlichen Gens (human Mas) als „Outgroup" mit Hilfe des Programms „ClustalW" erstellt. Das Ergebnis ist als Dendrogramm in 7 dargestellt.
Auf Aminosäure-Ebene wurden zwischen den neuen Ratten-Sequenzen SNSR-L2 und -L3 zu den humanen Mitgliedern der SNSR-Familie und dem bekannten SNSR der Ratte folgende paarweise Identitäten festgestellt:
Beispiel 3: Beispiel für ein Arzneimittel enthaltend einen erfindungsgemässen Wirkstoff – Tablettenformulierung
Tabletten können durch direktes Verpressen von Mischungen des erfindungsgemäßen Wirkstoffes mit entprechenden Hilfsstoffen oder durch Verpressen von wirkstoffhaltigen Granulaten (mit gegebenenfalls weiteren Hilfsstoffen) hergestellt werden. Die Granulate können dabei entweder durch Feuchtgranulation mit z.B. wäßrigen Granulierflüssigkeiten und anschließender Trocknung dieser Granulate oder durch Trockengranulation z.B. über Kompaktierung hergestellt werden.
Direktverpressung
Homogene Mischung des Wirkstoffes mit den Hilfsstoffen herstellen und diese auf einer Tablettenpresse zu Tabletten mit einem ⌀ von 10 mm verpressen.
Trockengranulation
Homogene Mischung des Wirkstoffes mit der Mikrokristallinen Cellulose und der I-HPC herstellen und diese Kompaktieren. Nach dem Sieben der Komprimate wird das entstandene Granulat mit Magnesiumstearat und Siliziumdioxid gemischt und auf einer Tablettenpresse zu Tabletten mit einem ⌀ von 9 mm verpreßt.
Feuchtgranulation
Homogene Mischung des Wirkstoffes mit der Mikrokristallinen Cellulose und dem Crospovidon herstellen und diese in einem Granulator mit einer wässerigen Lösung des Povidons granulieren. Das feuchte Granulat wird anschließend nachgranuliert und nach der Trocknung im Trockenschrank (50°C) 10 h getrocknet. Das trockene Granulat wird mit dem Magnesiumstearat zusammen gesiebt, endgemischt und auf einer Tablettenpresse zu Tabletten mit einem ⌀ von 8 mm verpresst.
Beispiel 4: Beispiel für ein Arzneimittel enthaltend einen erfindungsgemäßen Wirkstoff – parenterale Lösung
1 g eines erfindungsgemäßen Wirkstoffes wird in 1 l Wasser für Injektionszwecke bei Raumtemperatur gelöst und anschließend durch Zugabe von NaCl (Natriumchlorid) auf isotone Bedingungen eingestellt.
Literatur

Corderre et al. (1993) Pain 52: 259–285
Dickenson (195) Pain Rev. 2: 1–12
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Simonin & Kieffer (2002) Nature Neurosci. 5: 185–186
Tölle (1997) Chronischer Schmerz. In: Herdegen et al. (Hrsg.) Klinische Neurobi logie, S. 307–336, Spektrum Verlag, Heidelberg
Zimmermann & Herdegen (1996) Progr. Brain Res. 110: 233–259

SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, welche die extra- und/oder intrazelluläre Funktion von Rezeptoren der SNSR-Familie, insbesondere des SNSR-L2- und/oder SNSR-L3-Rezeptors der Ratte, modulieren, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Zellsystems, in welchem ein mindestens 10 Aminosäuren umfassender Abschnitt mindestens eines Polypeptids exprimiert wird, ausgewählt aus Polypeptiden, die durch die Nukleotidsequenz gemäß Positionen 179475 bis 180485 der 2, durch die Nukleotidsequenz gemäß Positionen 132249 bis 133316 der 2, durch die Nukleotidsequenz gemäß Positionen 33328 bis 32417 der 2, durch die Nukleotidsequenz gemäß 3 oder durch die Nukleotidsequenz gemäß 4, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Fragmente, Allele dieser Sequenzen oder mit diesen Nukleotidsequenzen unter Standardbedingungen hybridisierenden Sequenzen, codiert werden, (b) Inkontaktbringen des Zellsytems mit einer Testsubstanz und (c) Messen mindestens eines durch Wechselwirkung und/oder indirekte Beeinflussung des (der) mindestens 10 Aminosäuren umfassenden Abschnitts (Abschnitte) des Polypeptids (der Polypeptide) veränderlichen Parameters im Vergleich zur Kontrolle ohne Inkontaktbringen des Zellsystems mit der Testsubstanz.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zellsystem eine Zellpräparation ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Zellsystem eine Amphibienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder eine immortalisierte oder native Säugetierzelle ist oder daraus gewonnen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Zellsystem zur Expression des (der) mindestens 10 Aminosäuren umfassenden Abschnitt(e) des Polypeptids (der Polypeptide) und/oder zur Messung des mindestens einen Parameters gentechnisch manipuliert wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Zellsystem mit einem oder mehreren Vektor(en) transfiziert wird, der (die) für den (die) Abschnitt(e) des Polypeptids (der Polypeptide) und/oder ein G-Protein und/oder ein Reportergen codiert (codieren).
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der (die) Vektor(en) ein (mehrere) Expressionsvektor(en) ist (sind).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Wechselwirkung durch Detektion der Verdrängung eines bekannten markierten Liganden des (der) mindestens 10 Aminosäuren umfassenden Abschnitts (Abschnitte) des (der) Polypeptids (Polypeptide) durch die Testsubstanz und/oder durch Detektion der Wechselwirkung einer markierten Testsubstanz mit dem (den) mindestens 10 Aminosäuren umfassenden Abschnitt(en) des (der) Polypeptids (Polypeptide) gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 7, weiter umfassend den Schritt (c) Ermitteln des Bindungsplatzes der Testsubstanz auf dem (den) mindestens 10 Aminosäuren umfassenden Abschnitt(en) des Polypeptids (der Polypeptide) durch ein geeignetes biochemisches oder strukturbiologisches Verfahren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Messung des mindestens einen veränderlichen Parameters über eine Veränderung der Genexpression, des Ionenmilieus, des pH, des Membranpotentials, der Veränderung der Enzymaktivität und/oder der Konzentration eines oder mehrerer 2ⁿ ^d Messenger(s) erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die intrazelluläre Ca²⁺-Konzentration gemessen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Zellsystem ein Polypeptid, enthaltend die Aminosäuresequenz gemäß 4, einschließlich aller funktionshomologen Allele, Fragmente oder Derivate, und/oder ein Polypeptid, enthaltend die Aminosäuresequenz gemäß 6, einschließlich aller funktionshomologen Allele, Fragmente oder Derivate, exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Allel, Fragment oder Derivat zur Aminosäuresequenz gemäß 4 oder 6 zu mindestens 90% homolog ist.
Nukleinsäure, enthaltend eine Nukleotidsequenz, die für einen mindestens 10 Aminosäuren umfassenden Abschnitt eines Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz gemäß 4 und/oder eines Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz gemäß 6 codiert, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Fragmente oder Allele oder hiermit unter Standardbedingungen hybridisierenden Nukleotidsequenzen, wobei die Figuren Bestandteil des Anspruchs sind.
Nukleinsäure nach Anspruch 13, enthaltend eine Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß 4 oder 6 codiert, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Fragmente oder Allele oder hiermit unter Standardbedingungen hybridisierenden Nukleotidsequenzen, wobei die Figuren Bestandteil des Anspruchs sind.
Nukleinsäure nach Anspruch 13 oder 14, enthaltend einen mindestens 30 Nukleotide umfassenden Abschnitt der Sequenz gemäß 3 oder gemäß 5, wobei die Figuren Bestandteil des Anspruchs ist.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 13 bis 15, welche die Nukleotidsquenz gemäß 3 oder 5 aufweist, wobei die Figuren Bestandteil des Anspruchs sind.
Vektor, enthaltend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 13 bis 16.
Vektor nach Anspruch 17, der ein Expressionsvektor ist.
Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 17 oder 18 transfiziert ist.
Wirtszelle nach Anspruch 19, die eine Säugerzelle, insbesondere eine humane Zelle, ist.
Aufgereinigtes Genprodukt, das durch eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 13 bis 16 codiert wird.
Aufgereinigtes Genprodukt nach Anspruch 21, das ein Polypeptid ist.
Aufgereinigtes Genprodukt nach Anspruch 21 oder 22, wobei es die Aminosäuresequenz gemäß 4 oder 6 enthält, einschließlich aller funktionshomologen Allele, Fragmente oder Derivate.
Antikörper, der ein Epitop auf einem Genprodukt nach einem der Ansprüche 21 bis 23 erkennt.
Antikörper nach Anspruch 24, der monoklonal ist.
Antikörper nach Anspruch 24 oder 25, der gegen einen Sequenzabschnitt auf der extrazellulären Domäne von SNSR-L2 und/oder SNSR-L3 als Epitop gerichtet ist.
Antisense-Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, die gegen eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 13 bis 16 gerichtet ist.
Antisense-Nukleinsäure nach Anspruch 27, die ein Abschnitt eines Hammerhead-Ribozyms oder eines DNA-Enzyms ist.
Antisense-Nukleinsäure nach Anspruch 27, die eine siRNA ist.
Antisense-Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 27 bis 29, die ein oder mehrere modifizierte Nukleotide enthält.
Transgener nicht-humaner Organismus, der genetisch derart verändert ist, dass er eine im Vergleich zum nicht veränderten Organismus (spezifisch) veränderte Menge mindestens einer Aminosäuresequenz nach Anspruch 22 oder 23, insbesondere einer Aminosäuresequenz gemäß 4 und/oder 6, oder eine spezifisch gegenüber einer nativen SNSR-L2- und/oder SNSR-L3-Aminosäuresequenz, insbesondere einer Aminosäuresequenz gemäß 4 oder 6, veränderte Aminosäuresequenz nach Anspruch 22 oder 23 enthält, oder dass dem transgenen Organismus eine native SNSR-L2- und/oder SNSR-L3-Aminosäuresequenz fehlt, insbesondere eine Aminosäuresequenz gemäß 4 und/oder 6 oder ein Teil davon fehlt oder verändert vorliegt.
Verfahren zu Expression von Genprodukten nach einem der Ansprüche 21 bis 23, bei welchem Wirtszellen mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 18 transfiziert werden.
Verfahren zur Isolierung von Genprodukten nach einem der Ansprüche 21 bis 23, umfassend die Schritte: (i) Kultivieren von Wirtszellen nach Anspruch 19 oder 20 unter geeigneten, die Expression fördernden Bedingungen, gegebenenfalls unter Selektionsdruck, und (ii) Aufreinigen des Genprodukts aus dem Kulturüberstand und/oder den Wirtszellen.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 13 bis 16 oder Genprodukt nach einem der Ansprüche 21 bis 23 oder Antikörper nach einem der 24 bis 26 oder Antisense-Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 27 bis 30 als Arzneimittel.
Verbindung, welche die intra- und/oder extrazelluläre Funktion des SNSR-L2- und/oder SNSR-L3-Rezeptors moduliert.
Verbindung nach Anspruch 35, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12.
Verbindung nach Anspruch 35 oder 36, die eine niedermolekulare organisch-chemische Verbindung, insbesondere mit einem Molekulargewicht von < 3000, ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 35 bis 37, welche die Zellmembran durch Diffusion oder über membranöse Transportproteine passiert.
Arzneimittel, enthaltend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 13 bis 16 und/oder einen Vektor nach Anspruch 17 oder 18 und/oder eine Wirtszelle nach Anspruch 19 oder 20 und/oder ein Genprodukt nach einem der Ansprüche 21 bis 23 und/oder einen Antikörper nach einem der Ansprüche 24 bis 26 und/oder eine Antisense-Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 27 bis 30 und/oder eine Verbindung nach einem der Ansprüche 35 bis 38, gegebenenfalls in Verbindung mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoff(en).
Arzneimittel nach Anspruch 39 zur Behandlung von Schmerz.
Arzneimittel nach Anspruch 40, wobei der Schmerz chronisch, insbesondere neuropathisch oder entzündungsbedingt, ist.
Diagnostikum, enthaltend eine Nukleinäure nach einem der Ansprüche 13 bis 16 und/oder einen Vektor nach Anspruch 17 oder 18 und/oder eine Wirtszelle nach Anspruch 19 oder 20 und/oder ein Genprodukt nach einem der Ansprüche 21 bis 23 und/oder einen Antikörper nach einem der Ansprüche 24 bis 26 und/oder eine Antisense-Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 27 bis 30 und/oder eine Verbindung nach einem der Ansprüche 35 bis 38, gegebenenfalls in Verbindung mit einem oder mehreren Zusatzstoff(en).
Verwendung einer Nukleinäure nach einem der Ansprüche 13 bis 16 und/oder eines Vektors nach Anspruch 17 oder 18 und/oder einer Wirtszelle nach Anspruch 19 oder 20 und/oder eines Genprodukts nach einem der Ansprüche 21 bis 23 und/oder eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 24 bis 26 und/oder einer Antisense-Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 27 bis 30 und/oder einer Verbindung nach einem der Ansprüche 35 bis 38 zur Behandlung von bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Schmerz.
Verwendung nach Anspruch 43, wobei der Schmerz chronisch, insbesondere neuropathisch oder entzündungsbedingt, ist.
Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 13 bis 16 und/oder eines Vektors nach Anspruch 17 oder 18 und/oder einer Wirtszelle nach Anspruch 19 oder 20 und/oder einer Antisense-Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 27 bis 30 zur Gentherapie.