DE69427921T2

DE69427921T2 - Epsilon opioid rezeptor und dessen verwendungen

Info

Publication number: DE69427921T2
Application number: DE69427921T
Authority: DE
Inventors: F. Brian Scarborough O'Dowd
Original assignee: O'Dowd Brian F Scarborough
Current assignee: Euroscreen Sa Bruessel/bruxelles Be
Priority date: 1993-11-05
Filing date: 1994-11-07
Publication date: 2005-03-31
Anticipated expiration: 2014-11-08
Also published as: JP3570722B2; WO1995012670A1; US5591602A; JPH09507022A; JP2004261184A; EP0726949B1; DE69427921D1; CA2175476A1; JP3813156B2; CA2175476C; EP0726949A1; AU8056094A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Zusammensetzungen und Methoden zum Herstellen von Epsilon-Opioidrezeptoren. Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf die DNA-Sequenzen, die Epsilon-Opioidrezeptoren codieren, die rekombinanten Vektoren, die diese Sequenzen tragen, die rekombinanten Wirtszellen, die entweder die Sequenzen oder die Vektoren enthalten, und die rekombinanten Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptide. Die Erfindung umfaßt ebenfalls Methoden zur Verwendung der isolierten, rekombinanten Rezeptor-Polypeptide bei Tests zur Auswahl und Verbesserung von Versuchssubstanzen, wie Agonisten und Antagonisten von Epsilon-Opioidrezeptoren und Polypeptiden, für eine Verwendung bei der Diagnose, bei der Arzneimittelentwicklung und bei therapeutischen Anwendungen.
Hintergrund der Erfindung
Opioid-Arzneimittel haben verschiedene Wirkungen auf die Wahrnehmung von Schmerz, Bewußtsein, motorische. Steuerung, Stimmung, und die autonome Funktion, und sie können auch physische Abhängigkeit hervorrufen (Koob et al., 1992). Das endogene Opioidsystem spielt eine wichtige Rolle bei der Steuerung der endokrinen, kardiovaskulären, respiratorischen, gastrointestinalen und immunen Funktionen (Olson et al., 1989). Opioide üben ihre Wirkungen durch Bindung an spezifische membran-assoziierte Rezeptoren aus, die in dem ganzen zentralen und peripheren Nervensystem gelegen sind (Pert et al., 1973). Die endogenen Liganden dieser Opioidrezeptoren wurden als eine Familie aus mehr als 20 Opioidpeptiden identifiziert, die sich von den drei Vorläuferproteinen Proopiomelanocortin, Proenkephalin und Prodynorphin ableiten (Hughes et al., 1975; Akil et al., 1984). Obwohl die Opioidpeptide zu einer von den Opioidalkaloiden getrennten Klasse von Molekülen gehören, haben sie gemeinsame strukturelle Merkmale, die eine neben einem aromatischen Ring gelegene, positive Ladung umfassen, die für die Wechselwirkung mit dem Rezeptor erforderlich ist (Bradbury et al., 1976).
Pharmakologische Untersuchungen haben darauf hingedeutet, daß es zahlreiche Klassen von Opioidrezeptoren gibt, einschließlich derjenigen, die mit δ, κ, μ und ε bezeichnet werden (Simon, 1991; Lutz et al., 1992). Die Klassen unterscheiden sich in ihrer Affinität zu verschiedenen Opioidliganden und in ihrer zellularen Verteilung. Es wird angenommen, daß die verschiedenen Klassen von Opioidrezeptoren verschiedene physiologische Funktionen erfüllen (Olson et al., 1989; Simon, 1991; Lutz and Pfister, 1992). Es gibt jedoch eine wesentliche Überlappung der Funktion, sowie der Verteilung. Die biochemische Kennzeichnung der Opioidrezeptoren aus vielen Gruppen umfaßt eine molekulare Masse von 60.000 Da für alle drei Subtypen, was darauf hindeutet, daß sie verwandte Moleküle sein könnten (Loh et al., 1990). Außerdem wird die Ähnlichkeit der drei Rezeptorsubtypen durch die Isolierung von (i) antiidiotypischen monoklonalen Antikörpern, die mit sowohl μ-, als auch δ-Liganden aber nicht mit κ-Liganden konkurrieren (Gransch et al., 1988; Coscia et al., 1991) und (ii) eines gegen den gereinigten μ-Rezeptor gezüchteten, monoklonalen Antikörpers, der mit sowohl μ-, als auch κ-Rezeptoren interagiert (Bero et al., 1988), gestützt.
Morphin interagiert hauptsächlich mit μ-Rezeptoren, und die periphere Verabreichung dieses Opioids ruft die Freisetzung von Enzephalinen hervor (Bertolucci et al., 1992). Die δ-Rezeptoren binden sich mit der größten Affinität an Enzephaline, und haben eine diskretere Verteilung in dem Gehirn als μ- oder κ-Rezeptoren, mit hohen Konzentrationen in den basalen Ganglien und den limbischen Regionen. Folglich können die Enzephaline einen Teil der physiologischen Reaktion auf Morphin vermitteln, vermutlich durch Wechselwirkung mit δ-Rezeptoren. Trotz der pharmakologischen und physiologischen Heterogenität bewirken zumindest einige Typen der Opioidrezeptoren, daß durch einen toxin-empfindlichen Pertussismechanismus die Adenylatcyclase gehemmt wird, die K⁺-Konduktanz erhöht wird, und die Ca²⁺-Kanäle inaktiviert werden (Puttfarcken et al., 1988; Attali et al., 1989; Hsia et al., 1984). Diese und andere Ergebnisse deuten darauf hin, daß die Opioidrezeptoren zu der großen Familie von Zelloberflächenrezeptoren gehören, die über G-Proteine Signal geben (Di Chiara et al., 1992; Loh et al., 1990).
Die 6,7-Benzomorphane, wie Äthylketocyclazocin, markieren zwei Populationen von Nicht-μ-, Nicht-δ-Opioid-Bindestellen im Gehirn, welche die κ- und ε-Stellen sind (Chang et al., 1981). Es wurde nachgewiesen, daß das Benezencacctamid U-69.593 eine dieser 6,7-Benzomorphanstellen, die der κ-Opioidrezeptor-Stelle entspricht, in selektiver Weise markiert, aber der anderen Benzomorphanstelle fehlt ein selektiver Ligand (Nock et al., 1988). Die Art und Bezeichnung der gegen U-69.593 unempfindlichen Benzomorphanstelle wurde diskutiert, einschließlich der Vermutungen, daß sie wegen der eine hohe Affinität aufweisenden Wechselwirkungen mit gewissen κ-Opioidliganden ein κ-Opioidrezeptor-Subtyp sein könnte. Dynorphin und andere von Prodymorphin abgeleitete Peptide, von denen angenommen wird, daß sie die endogenen Liganden des κ-Opioidrezeptors sind, hatten jedoch eine sehr niedrige Affinität für diese Stelle, die eine hohe Affinität für (β-Endorphin hatte (Nock et al., 1993). Dieses pharmakologische Selektivitätsprofil entspricht demjenigen des Epsilon (ε)-Opioidrezeptors, gekennzeichnet als eine dynorphinunempfindliche, Nicht-μ-, Nicht-δ- Opioidbindestelle. Aufgrund von Biotests bei dem Vas deferens der Ratte und aus Untersuchungen der Radioligandsbindung im Gehirn wurde zuerst angenommen, daß es den ε-Rezeptor gibt; später wurde jedoch nachgewiesen, daß er die ergiebigste Opioidbindestelle im Gehirn ist (Nock et al., 1993).
Es wurde von mehreren Versuchen berichtet, cDNAs, die Opioidrezeptoren codieren, zu klonieren. Eine cDNA, die ein opioid-bindendes Protein (OBCAM) mit μ-Selektivität codiert, wurde isoliert (Schofield et al., 1989), aber dem vorhergesagten Protein fehlen Transmembranbereiche, die als notwendig für die Signaltransduktion angesehen werden. Später wurde von der Isolierung einer weiteren cDNA berichtet, die durch Expressionsklonieren erhalten wurde (Xie et al., 1992). Die abgeleitete Proteinsequenz weist sieben mutmaßliche Transmembranbereiche auf und ist dem menschlichen Neuromedin-K-Rezeptor sehr ähnlich. Die Affinität der Opioidliganden für diesen in COS-Zellen exprimierten Rezeptor liegt jedoch zwei Größenordnungen unter dem erwarteten Wert, und es kann keine Subtyp-Selektivität nachgewiesen werden.
Viele Zelloberflächenrezeptor/Transmembran-Systeme bestehen aus mindestens drei membran-gebundenen Polypeptidkomponenten: (a) einem Zelloberflächenrezeptor; (b) einem Effektor, wie einem Ionenkanal oder dem Enzym Adenylatcyclase; und (c) einem guaninnukleotid-bindenden, regelnden Polypeptid oder G-Protein, das sowohl mit dem Rezeptor, als auch mit seinem Effektor gekoppelt ist.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren vermitteln die Wirkungen von extrazellularen Signalen, die so verschiedenartig sind wie Licht, Geruchsstoffe, Peptidhormone und Neurotransmitter. Solche Rezeptoren wurden in so evolutionär divergenten Organismen wie Hefe und Mensch identifiziert. Beinahe alle G-Protein-gekoppelten Rezeptoren weisen Sequenzähnlichkeiten auf, und es wird angenommen, daß alle ein ähnliches topologisches Muster haben, das aus sieben hydrophoben (und potentiell α-spiralförmigen) Segmenten besteht, die sich über die Lipid-Doppelschicht erstrecken (Dohlman et al., 1987; Dohlman et al., 1991).
G-Proteine bestehen aus drei eng assoziierten Subeinheiten α, β, γ (1 : 1 : 1) in Reihenfolge der abnehmenden Masse. Nach der Agonistbindung an den Rezeptor wird eine Gestaltänderung nach dem G-Protein übertragen, was die Gα-Subeinheit veranlaßt, ein gebundenes GDP gegen GTP auszutauschen und von den βγ-Subeinheiten zu trennen. Die GTP-gebundene Form der α-Subeinheit ist gewöhnlich der effektor-steuernde Anteil. Die Signalverstärkung ergibt sich aus der Fähigkeit eines einzelnen Rezeptors, viele G-Protein-Moleküle zu aktivieren; und aus der Stimulation vieler katalytischer Zyklen des Effektors durch Gα-GTP.
Die Familie der regelnden G-Proteine weist eine Vielzahl verschiedener α-Subeinheiten (mehr als zwanzig bei dem Menschen) auf, die mit einer kleineren Gruppe von β- und γ-Subeinheiten (mehr als je vier) assoziieren (Strathmann und Simon, 1991). Folglich wird erwartet, daß Unterschiede bei den α-Subeinheiten wahrscheinlich die verschiedenen G-Protein-Oligomere unterscheiden, obwohl die Zielsuche oder die Funktion der verschiedenen α-Subeinheiten auch von den βγ-Subeinheiten, mit denen sie assoziieren, abhängen könnte (Strothman and Simon, 1991).
Verbesserungen bei der Zellkultur und bei den pharmakologischen Methoden, und später die Verwendung der molekularen Klonierens- und Genexpressionstechniken haben zu der Identifizierung und Kennzeichnung vieler Sieben-Transmembran-Segment-Rezeptoren, einschließlich neuer Subtypen und Sub-Subtypen von zuvor identifizierten Rezeptoren, geführt. Bei den α₁- und α₂-adrenergischen Rezeptoren, bei denen einst angenommen wurde, daß jeder aus einer einzigen Rezeptorspezies bestand, ist jetzt bekannt, daß jeder durch mindestens drei verschiedene Gene codiert wird (Kobilka et al.; 1987; Regan et al., 1988; Cotecchia et al., 1988; Lomasney, 1990). Außer Rhodopsin in den Stäbchenzellen, die das Sehen bei trübem Licht vermitteln, wurden drei sehr ähnliche Zäpfchenpigmente, die das Farbsehen vermitteln, kloniert (Nathans et al., 1986A; und Nathans et al., 1986B). Alle Mitglieder der Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren scheinen anderen Mitgliedern der Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren ähnlich zu sein (z. B. dopaminergisch, muskarinisch, serotonergisch, tachykininisch, usw.), und jedes scheint die charakteristische Topographie mit sieben Transmembran-Segmenten zu haben.
Wenn die Sieben-Transmembran-Segment-Rezeptoren miteinander verglichen werden, wird ein unterscheidbares Muster der Aminosäuresequenz-Erhaltung beobachtet. Die Transmembranbereiche sind oft die ähnlichsten, während die Amino- und Carboxyl-Endregionen und die zytoplasmatischen, Schleifen verbindenden Transmembransegmente V und VI ziemlich abweichend sein können (Dohlman et al., 1987).
Es wurde vorhergesagt, daß die Wechselwirkung mit zytoplasmatischen Polypeptiden, wie Kinasen und G-Proteinen, die hydrophoben Schleifen umfaßt, welche die Transmembranbereiche des Rezeptors verbinden. Die Herausforderung war jedoch zu bestimmen, welche Merkmale bei den Sieben-Transmembran-Segment-Rezeptoren wegen der Erhaltung der Funktion erhalten bleiben, und welche abweichenden Merkmale strukturelle Anpassungen an neue Funktionen repräsentieren. Um diese Ideen zu testen, wurden verschiedene Strategien verwendet, einschließlich der Verwendung von rekombinanter DNA und Genexpressionstechniken zur Konstruktion von Substitutions- und Deletionsmutanten, sowie von hybriden oder chimärischen Rezeptoren (Dohlman et al., 1991).
Infolge der wachsenden Anzahl von Rezeptor-Subtypen, G-Protein-Subeinheiten, und Effektoren ist die Kennzeichnung der Ligandbindungs- und G-Protein-Erkennungseigenschaften dieser Rezeptoren ein wichtiges Gebiet für die Untersuchung. Es ist seit langem bekannt, daß mehrere Rezeptoren an ein einzelnes G-Protein ankoppeln können, und wie in dem Fall des Epinephrins, das sich an β₂- und α₂-adrenergische Rezeptoren bindet, kann sich ein einzelner Ligand an mehrere, funktional verschiedene Rezeptor-Subtypen binden. Außerdem wurden G-Proteine mit ähnlichen Rezeptor- und Effektor-Kopplungsspezifizitäten ebenfalls identifiziert. Zum Beispiel wurden drei Spezies von menschlichen G_i kloniert (Itoh et al., 1988), und es wurde gezeigt, daß alternatives mRNA-Spleißen mehrere Varianten von G_s ergibt (Kozasa et al., 1988). Das Klonieren und die Überproduktion der muskarinischen und α₂-adrenergischen Rezeptoren führten zu dem Nachweis, daß ein einziger Rezeptor-Subtyp, wenn er mit hohen Niveaus in der Zelle exprimiert wird, an mehr als einen Typ des G-Proteins ankoppelt.
Es ist bekannt, daß Opioidrezeptoren empfindlich auf reduzierende Mittel sind, und das Vorkommen einer Disulfid-Brücke wurde als wesentlich für die Ligandbindung gefordert (Gioannini et al., 1989). Für Rhodopsin-, muskarinische und β-adrenergische Rezeptoren haben sich zwei erhaltene Cysteinreste in jeder der zwei ersten extrazellularen Schleifen als kritisch für die Stabilisierung der funktionalen Proteinstruktur erwiesen, und es wird angenommen, daß dies auf die Bildung einer Disulfid-Brücke zurückzuführen ist. Untersuchungen der Struktur und Funktion von Opioidliganden haben die Wichtigkeit einer protonierten Amingruppe für die Bindung mit hoher Affinität an den Rezeptor gezeigt. Die Bindestelle des Rezeptors könnte daher ein kritisches, negativ geladenes Gegenstück besitzen. Catecholaminrezeptoren weisen in ihrer Sequenz einen erhaltenen Aspartatrest auf, von dem gezeigt wurde, daß er notwendig für die Bindung der positiv geladenen Amingruppe ihrer Liganden ist.
In Anbetracht der Komplexität und der sichtbaren Degeneration der Funktion der verschiedenen Opioidrezeptoren ist eine Frage von fundamentaler Wichtigkeit: wie und unter welchen Umständen üben spezifische Subtyp- und Sub-Subtyp-Rezeptoren ihre physiologische Wirkung bei Anwesenheit des geeigneten stimulierenden Liganden aus. Eine herkömmliche Methode zur Beantwortung dieser Frage ist, die gereinigten Rezeptor- und G-Protein-Komponenten in vitro zu rekonstituieren. Unglücklicherweise waren die Reinigungsmethoden nur für eine sehr begrenzte Anzahl von Rezeptor-Subtypen und ihre verwandten G-Proteine erfolgreich. In alternativer Weise können heterologe Expressionssysteme bei der Kennzeichnung von klonierten Rezeptoren und bei der Aufklärung der G-Protein-Rezeptor-Kopplungsspezifizität von allgemeinerer Nützlichkeit sein (Marullo et al., 1988; Payette et al., 1990; King et al., 1990).
Ein solches System wurde kürzlich bei Hefezellen entwickelt, bei denen die Gene für einen β₂-adrenergischen Säuger-Rezeptor und eine G_s-α-Subeinheit coexprimiert wurden (King et al., 1990). Die Expression des β₂-adrenergischen Rezeptors wurde bis auf Niveaus, die einige hundert Mal höher als in irgendeinem menschlichen Gewebe sind, erreicht und es wurde gezeigt, daß die Ligandbindung eine geeignete Affinität, Spezifizität und Stereoselektivität hat. Außerdem wurde eine durch β₂-adrenergische Rezeptoren vermittelte, Aktivierung des Pheromonsignaltransduktionspfades durch mehrere Kriterien nachgewiesen, einschließlich Auferlegung von Wachstumshemmung, morphologischer Änderungen, und Induktion eines auf Pheromon ansprechenden Promotors (FUSI), fusioniert mit dem Escherichia coli lac Z-Gen (das β-Galactosidase codiert) (King et al., 1990).
Schließlich ist die Expression eines einzigen Rezeptors bei Abwesenheit anderer verwandter Subtypen oft unmöglich zu erreichen, selbst bei isolierten, nicht-rekombinanten Säugerzellen. Folglich gab es beträchtliche Schwierigkeiten bei Anwendung der Standardmethoden der herkömmlichen Genetik oder sogar der leistungsfähigen Techniken der Molekularbiologie zur Untersuchung von Opioidrezeptoren. Insbesondere werden Mittel für die Identifizierung der DNA-Sequenzen benötigt, welche individuelle Opioidrezeptoren codieren. Wenn man solche isolierten, rekombinanten Sequenzen hat, ist es möglich, die zuvor schwer zu bearbeitenen Probleme anzupacken, die mit der Entwicklung und dem Test von isoform-spezifischen Opioidrezeptor-Agonisten und -Antagonisten verbunden sind. Die Verfügbarkeit von cDNAs, welche die Opioidrezeptoren codieren, wird ausführliche Untersuchungen von Signaltransduktionsmechanismen ermöglichen, und die anatomische Verteilung der mRNAs dieser Rezeptoren offenbaren, die Information über ihr Expressionsmuster in dem Nervensystem liefert. Diese Information sollte schließlich ein besseres Verständnis des Opioidsystems bei Analgesie und auch die Entwicklung spezifischerer therapeutischer Arzneimittel ermöglichen.
Die Verfügbarkeit von Polynukleotidsequenzen, die Opioidrezeptoren codieren, und der Polypeptidsequenzen der codierten Rezeptoren wird die Fähigkeit, pharmazeutische Zusammensetzungen, wie Analgetika, mit erhöhter Funktionsspezifizität zu entwickeln, wesentlich vergrößern. Im allgemeinen wird die Verfügbarkeit dieser Polypeptidsequenzen ein wirksames Screening von Versuchszusammensetzungen ermöglichen. Das bei dem Screening-Prozeß wirksame Prinzip ist einfach: natürliche Agonisten und Antagonisten binden sich an Zelloberflächenrezeptoren und Kanäle, um physiologische Wirkungen hervorzurufen; gewisse andere Moleküle binden sich an Rezeptoren und Kanäle; daher können gewisse andere Moleküle physiologische Wirkungen hervorrufen und als therapeutische pharmazeutische Wirkstoffe, wirken. Folglich kann die Fähigkeit von Versuchsarzneimitteln, sich an Opioidrezeptoren zu binden, als ein extrem wirksames Screening-Kriterium für die Auswahl von pharmazeutischen Zusammensetzungen mit einer gewünschten funktionalen Wirksamkeit fungieren.
Die bisherigen Methoden für das Screening von Versuchsarzneimittelzusammensetzungen, die auf der Fähigkeit dieser Zusammensetzungen, sich vorzugsweise an Zelloberflächenrezeptoren zu binden, sind auf Gewebe-basierten Techniken begrenzt. Bei diesen Techniken werden tierische Gewebe, die reich an dem interessierenden Rezeptortyp sind, extrahiert und aufbereitet; dann läßt man die Versuchsarzneimittel mit dem aufbereiteten Gewebe interagieren, und die Arzneimittel, bei denen festgestellt wird, daß sie sich an die Rezeptoren binden, werden für die weitere Untersuchung ausgewählt. Diese auf Gewebe basierenden Screening-Techniken weisen jedoch verschiedene wesentliche Nachteile auf. Erstens sind sie teuer, weil die Quelle der Rezeptorzellgewebe – Labortiere – teuer ist. Zweitens ist eine umfangreiche technische Ausrüstung erforderlich, um die Screens durchzuführen. Und drittens können die Screens die Ergebnisse durcheinanderbringen, weil es keine Gewebe gibt, bei denen nur ein Rezeptorsubtyp ausschließlich exprimiert wird. Bei den herkömmlichen Screens des Standes der Technik betrachtet man im Grunde genommen die falschen Wechselwirkungen, oder bestenfalls die richtigen Wechselwirkungen, vermischt mit einer ganzen Vielfalt von unerwünschten Wechselwirkungen. Eine zusätzliche fundamentale Unzulänglichkeit von Tiergewebe-Screens ist, daß sie Tierrezeptoren enthalten – was ideal für die Entwicklung von Arzneimitteln für Tiere ist, aber von zweifelhaftem Wert bei menschlichen therapeutischen Wirkstoffen ist.
Die Nachteile des Standes der Technik können beseitigt werden, wenn ein in geeignete Wirtszellen transfiziertes Polynukleotid vorgesehen wird, das Polypeptidsequenzen, die Opioidrezeptoren entsprechen, sowohl in großen Mengen, als auch durch relativ einfache Laborverfahren, exprimieren kann. Das Ergebnis ist die Verfügbarkeit von extrem spezifischen Rezeptor-Arzneimittel-Wechselwirkungen, die frei von den konkurrierenden und unerwünschten Wechselwirkungen sind, die bei auf Gewebe basierenden Screens angetroffen werden. Eine weitere Expression in einem Mikroorganismus, wo es keine solchen endogenen Rezeptoren gibt (wie z. B. Hefezellen oder Säuger-Mutantenzellinien) kann für das Screening und die Beurteilung von subtyp-selektiven Arzneimitteln nützlich sein (Marullo et al., 1988; Payette et al., 1990; und King et al., 1990).
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem Aspekt wird bei der vorliegenden Erfindung ein isoliertes und gereinigtes Polynukleotid verwirklicht, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung ein DNA-Molekül.
Sogar noch besser codiert ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid, das die Aminosäurerestsequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 aufweist. Am besten weist ein isoliertes und gereinigtes Polynukleotid der Erfindung die Nukleotidbasensequenz von SEQ ID NO: 1 oder SED ID NO: 3 auf.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes und gereinigtes Polynukleotid betrachtet, das eine Basensequenz aufweist, die identisch mit, oder komplementär zu einem Segment mit mindestens 25 aneinandergrenzenden Basen von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 ist, wobei das Polynukleotid an ein Polynukleotid hybridisiert, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert. Vorzugsweise weist ein isoliertes und gereinigtes Polynukleotid eine Basensequenz auf, die identisch mit, oder komplementär zu einem Segment mit mindestens 25 bis 70 aneinandergrenzenden Basen von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 ist. Zum Beispiel kann ein Polynukleotid der Erfindung ein Basensegment aufweisen, das identisch mit, oder komplementär zu 40 bis 55 aneinandergrenzenden Basen der angegebenen Nukleotidsequenzen ist.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes und gereinigtes Polynukleotid verwirklicht, das eine Basensequenz aufweist, die identisch mit, oder komplementär zu einem, Segment mit mindestens 25 aneinandergrenzenden Basen von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 ist. Das Polynukleotid der Erfindung hybridisiert an SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3, oder einem Komplement von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3. Vorzugsweise weist das isolierte und gereinigte Polynukleotid eine Basensequenz auf, die identisch mit, oder komplementär zu einem Segment mit mindestens 25 bis 70 aneinandergrenzenden Basen von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 ist. Zum Beispiel kann das Polynukleotid der Erfindung ein Basensegment aufweisen, das identisch mit, oder komplementär zu 40 bis 55 aneinandergrenzenden Basen von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 ist.
Bei einer weiteren Ausführungsform wird bei der vorliegenden Erfindung ein isoliertes und gereinigtes Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid betrachtet. Vorzugsweise ist ein Polypeptid der Erfindung ein rekombinantes Polypeptid. Sogar noch besser weist ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid der vorliegenden Erfindung die Aminosäurerestsequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 auf.
Bei einer alternativen Ausführungsform wird bei der vorliegenden Erfindung ein Expressionsvektor verwirklicht, der ein Polynukleotid aufweist, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert. Vorzugsweise weist ein Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung ein Polynukleotid auf, das ein Polypeptid codiert, das die Aminosäurerestsequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 aufweist. Noch besser weist ein Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung ein Polynukleotid auf, das die Nukleotidbasensequenz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 aufweist. Sogar noch besser weist ein Expressionsvektor der Erfindung ein Polynukleotid auf, das mit einem Enhancer-Promotor funktionsfähig gekoppelt ist. Ebenfalls noch besser weist ein Expressionsvektor der Erfindung ein Polynukleotid auf, das mit einem prokaryotischen Promotor funktionsfähig gekoppelt ist. In alternativer Weise weist ein Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung ein Polynukleotid auf, das mit einem Enhancer-Promotor, der ein eukaryotischer Promotor ist, funktionsfähig gekoppelt ist, und der Expressionsvektor weist weiterhin ein Polyadenylierungssignal auf, das bei 3' der Aminosäure mit Carboxyl-Endgruppe und innerhalb einer Transkriptionseinheit des codierten Peptids positioniert ist.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform wird bei der vorliegenden Erfindung eine rekombinante Wirtszelle verwirklicht, die mit einem Polynukleotid transfiziert ist, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert. Vorzugsweise wird eine rekombinante Wirtszelle der vorliegenden Erfindung mit dem Polynukleotid von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 transfiziert. Sogar noch besser ist eine Wirtszelle der Erfindung eine eukaryotische Wirtszelle. Ebenfalls noch besser ist eine rekombinante Wirtszelle der vorliegenden Erfindung eine Hefezelle. In alternativer Weise ist eine rekombinante Wirtszelle der Erfindung eine COS-, CHO- oder BHK-Zelle. Gemäß einem weiteren Aspekt ist eine rekombinante Wirtszelle der vorliegenden Erfindung eine Bakterienzelle des DH5α-Stamms von Escherichia coli. Noch besser weist eine rekombinante Wirtszelle ein Polynukleotid unter der Transkriptionssteuerung von in der rekombinanten Wirtszelle funktionalen, regelnden Signalen, wobei die regelnden Signale die Expression eines Epsilon-Opiodrezeptor-Polypeptids in geeigneter Weise so steuern, daß alle notwenigen Modifikationen während der Transkription und nach der Transkription ermöglicht werden.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform wird bei der vorliegenden Erfindung ein Prozeß zur Herstellung eines Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptids betrachtet, der die Schritte aufweist, bei denen eine Zelle mit einem Polynukleotid, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert, transfiziert wird, um eine transformierte Wirtszelle zu erzeugen, und die transformierte Wirtszelle unter biologischen Bedingungen, die für die Expression des Polypeptids ausreichend sind, gehalten wird. Vorzugsweise ist die transformierte Wirtszelle eine eukaryotische Zelle. Noch besser ist die eukaryotische Zelle eine COS-, CHO- oder BHK-Zelle. In alternativer Weise ist die Wirtszelle eine prokaryotische Zelle. Noch besser ist die prokaryotische Zelle eine Bakterienzelle des DH5α-Stamms von Escherichia coli. Sogar noch besser weist ein in die transformierte Zelle transfiziertes Polynukleotid die Nukleotidbasensequenz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 auf.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform wird bei der vorliegenden Erfindung ein Antikörper verwirklicht, der immunoreaktiv mit einem Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid ist, wobei der Antikörper nicht immunoreaktiv mit Homologen ist, die Bereichen von Delta-Opioid-, Kappa-Opiod-, My-Opioid- und Somatostatin-SSTR3-Rezeptoren entsprechen, Vorzugsweise ist ein Antikörper der Erfindung ein monoklonaler Antikörper. Noch besser weist ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid die Aminosäurerestsequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 auf.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird bei der vorliegenden Erfindung ein Prozeß zur Herstellung eines Antikörpers betrachtet, der immunoreaktiv mit einem Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid ist, wobei der Prozeß die Schritte aufweist, bei denen (a) eine rekombinante Wirtszelle mit einem Polynukleotid, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert, transfiziert wird; (b) die Wirtszelle unter Bedingungen gezüchtet wird, die für die Expression des Polypeptids ausreichend sind; (c) das Polypeptid gewonnen wird; und (d) der Antikörper zu dem Polypeptid hergestellt wird. Vorzugsweise wird die Wirtszelle mit dem Polynukleotid von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 transfiziert. In alternativer Weise können die Schritte (a), (b) und (c) durch Verwendung eines synthetischen Polypeptids vermieden werden. Sogar noch besser wird bei der vorliegenden Erfindung ein gemäß dem oben beschriebenen Prozeß hergestellter Antikörper verwirklicht.
In alternativer Weise wird bei der vorliegenden Erfindung ein Prozeß zum Nachweisen eines Epsilon- Opioidrezeptor-Polypeptids verwirklicht, wobei man das Polypeptid einer Immunreaktion mit einem gemäß dem oben beschriebenen Prozeß hergestellten Antikörper unterwirft, um ein Antikörper-Polypeptid-Konjugat zu bilden, und das Konjugat nachgewiesen wird.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform wird bei der vorliegenden Erfindung ein Prozeß zum Nachweisen eines Messenger-RNA-Transkripts betrachtet, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert, wobei der Prozeß die Schritte aufweist, bei denen (a) das Messenger-RNA-Transkript mit einer Polynukleotidsequenz, die das Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert, hybridisiert wird, um ein Duplex zu bilden; und (b) das Duplex nachgewiesen wird. In alternativer Weise wird bei der vorliegenden Erfindung ein Prozeß zum Nachweisen eines DNA-Moleküls verwirklicht, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert, wobei der Prozeß die Schritte aufweist, bei denen (a) DNA-Moleküle mit einem Polynukleotid, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert, hybridisiert werden, um ein Duplex zu bilden; und (b) das Duplex nachgewiesen wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird bei der vorliegenden Erfindung eine diagnostische Testausrüstung zum Nachweisen. der Anwesenheit eines Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptids in einer biologischen Probe verwirklicht, wobei die Testausrüstung einen ersten Behälter aufweist, der einen ersten Antikörper enthält, der mit einem Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid eine Immunreaktion ausführen kann, wobei der erste Antikörper in einer Menge vorhanden ist, die ausreicht, um mindestens einen Test auszuführen. Vorzugsweise weist eine Testausrüstung der Erfindung weiterhin einen zweiten Behälter auf, der einen zweiten Antikörper enthält, der mit dem ersten Antikörper eine Immunreaktion ausführt. Vorzugsweise sind die Antikörper, die bei einer Testausrüstung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, monoklonale Antikörper. Sogar noch besser ist der erste Antikörper auf einer festen Unterlage fixiert. Ebenfalls noch besser weisen der erste und zweite Antikörper einen Indikator auf, und vorzugsweise ist der Indikator ein radioaktiver Marker oder ein Enzym.
Gemäß einem alternativen Aspekt wird bei der vorliegenden Erfindung eine diagnostische Testausrüstung verwirklicht, um die Anwesenheit eines Polynukleotids in biologischen Proben nachzuweisen, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert, wobei die Testausrüstung einen ersten Behälter aufweist, der ein zweites Polynukleotid enthält, das identisch mit, oder komplementär zu einem Segment mit mindestens 25 aneinandergrenzenden Nukleotidbasen von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 ist.
Bei einer weiteren Ausführungsform wird bei der vorliegenden Erfindung eine diagnostische Testausrüstung betrachtet, um in einer biologischen Probe einen mit einem Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid immunoreaktiven Antikörper nachzuweisen, wobei die Testausrüstung einen ersten Behälter aufweist, der ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid enthält, das eine Immunreaktion mit dem Antikörper ausführt, wobei das Polypeptid in einer ausreichenden Menge vorhanden ist, um mindestens einen Test auszuführen.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt wird bei der vorliegenden Erfindung ein Prozeß betrachtet zum Screening von Substanzen bezüglich ihrer Fähigkeit, mit einem Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid zu interagieren, wobei der Prozeß die Schritte aufweist, bei denen ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid vorgesehen wird, und die Fähigkeit von ausgewählten Substanzen, mit dem Opioidrezeptor-Polypeptid zu interagieren, getestet wird.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird bei der vorliegenden Erfindung ein Prozeß betrachtet, bei dem ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid vorgesehen wird, und eine Wirtszelle mit einem Polynukleotid, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert, transfiziert wird, um eine transformierte Zelle zu bilden, und die transformierte Zelle unter Bedingungen gehalten wird, die für die Expression des Opioidrezeptor-Polypeptids ausreichend sind. Vorzugsweise weist ein Polynukleotid, das verwendet wird, um eine Wirtszelle zu transfizieren, die Nukleotidsequenz von SEQ ID NOS: 1 oder 3 auf.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Zeichnungen, die einen Teil der Beschreibung bilden, stellen Folgendes dar:
1 (auf zwei mit 1-1 und 1-2 bezeichneten Tafeln wiedergegeben) gibt die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des mit Klon Nr. 12 bezeichneten, menschlichen ε-Rezeptors (SEQ ID NOS: 1 und 2) wieder.
2 (auf zwei mit 2-1 und 2-2 bezeichneten Tafeln wiedergegeben) gibt die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des mit Klon Nr. 11 bezeichneten, menschlichen ε-Rezeptors (SEQ ID NOS: 3 und 4) wieder.
3 gibt die Ausrichtung von klonierten Rezeptoren wieder (von oben nach unten): ε-, μ-, δ- und κ-Opiat-Rezeptor, und Somatostatin-Rezeptor (SSTR3). Die Aminosäuren, die zwischen ε und irgendeinem der Rezeptoren identisch sind, sind mit großen Buchstaben wiedergegeben. Die Transmembran-Bereiche sind durch die darüber angeordneten Zeilen gekennzeichnet, und Lücken (–) wurden eingeführt, um die Ausrichtungen zu maximieren.
4 gibt eine Bremazocin-Sättigungsisotherme und die Konkurrenzbindung an den in der BHK-Zelle exprimierten ε-Opioidrezeptor wieder.
5 zeigt die Hemmung der cAMP-Bildung durch Levorphanol bei BHK-Zellen, die ε-Rezeptoren exprimieren.
6 gibt eine Southern-Blot-Analyse von menschlicher DNA wieder. Die menschliche genomische DNA wurde mit HindIII, PstI und SacI digeriert, und der Elektrophorese (1% Agarose-Gel) und der Southern-Blot-Hybridisierung mit dem DNA-Sonde-Klon Nr. 12 unterworfen. Die menschliche DNA wurde aus Blutproben isoliert.
7 gibt eine Northern-Blot-Analyse von ausgewählten Menschen- und Nagergeweben wieder. Menschen- und Ratten-mRNAs von Striatum, Hypophyse, Hypothalamus, frontalem Kortex und Zerebellum wurden extrahiert (Chomczynski and Sacchi, 1987), auf Formaldehyd-Agarose-Gel ausgebreitet, und auf Nylon abgelöscht. Die abgelöschten Proben wurden dann mit P-markiertem Fragment versehen, mit 2 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C während 20 Minuten, und mit 0,1 × SSC, 0,1% SDS gewaschen, und über Nacht bei –70°C auf Röntgenstrahlenfilm mit Verstärkungsschirm gelegt.
8 gibt eine Zusammenfassung der FISH-Daten für den menschlichen Klon 12 auf dem Chromosom 10 wieder. Jeder Punkt repräsentiert ein doppeltes Fluoreszenzsignal auf Chromosomen mit DAPI-Banden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
I. Die Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert DNA-Segmente, gereinigte Polypeptide, Methoden zur Herstellung von Antikörpern, sowie Methoden zum Klonieren und zum Verwenden von rekombinanten Wirtszellen, die notwendig sind, um rekombinante Epsilon-Opioidrezeptoren zu erhalten und zu verwenden. Folglich wurden die Schwierigkeiten überwunden, die bei Anwendung der Standardmethoden der herkömmlichen Genetik oder der Techniken der Molekularbiologie auf Epsilon-Opioidrezeptoren angetroffen wurden. Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung allgemein Zusammensetzungen und Methoden zur Herstellung und Verwendung von Epsilon-Opioidrezeptoren.
Der Rezeptor der vorliegenden Erfindung hat eine hohe Affinität für 6,7-Benzomorphane und β-Endorphin, aber eine niedrige Affinität für die μ-, δ- und κ-Opioidrezeptor-Liganden, was ein Epsilon (ε)-Rezeptor-Affinitätsprofil bestätigt. Das in seiner codierenden Region intronlose ε-Rezeptor-Gen ist auf dem Chromosom 10 bei g11.2–g21.1 gelegen, und hat die gleiche Homologie wie der μ-, δ- und κ-Rezeptor-cDNA-Klon. Die mRNA, die den ε-Rezeptor codiert, wurde in dem zerebralen Kortex, dem frontalen Kortex, dem Hypothalamus und der Hypophyse nachgewiesen. Die In-situ-Hybridisierungs-Histochemie ergab mRNA-Transkripte in der Hypophyse, die eine selektive Lokalisierung in den seitlichen Flügeln der vorderen Hypophyse zeigten. Die Klonierung und Kennzeichnung des menschlichen ε-Rezeptors ergibt einen großen Antrieb für die Untersuchung von Opioid-Wirkungen, insbesondere derjenigen der supraspinalen Analgesie, bei der angenommen wird, daß sie durch diesen Rezeptor vermittelt wird.
II. Polynukleotid
A. Isolierte und gereinigte Polynukleotide, die Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptide codieren
Gemäß einem Aspekt wird bei der vorliegenden Erfindung ein isoliertes und gereinigtes Polynukleotid verwirklicht, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert.
Der hier verwendete Ausdruck „Epsilon-Opioidrezeptor" bedeutet einen Rezeptor, der ein Opioid und dergleichen auf eine hier beschriebene Weise bindet. Da die Klassifizierung und die Bezeichnung von Rezeptoren zu einem großen Teil auf Bindungsuntersuchungen basieren, ist für einen Fachmann auf diesem Gebiet leicht ersichtlich, daß die Klassifizierung oder der Name, die einem bestimmten Rezeptor gegeben wird, einer Änderung unterliegt, wenn neue Arzneimittel entwickelt werden. Der Name Epsilon-Opioidrezeptor wird folglich nur verwendet, um das pharmakologische Verhalten des hier beschriebenen Polypeptids auf einfache Weise zu kategorisieren.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung ein DNA-Molekül. Sogar noch besser codiert ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid, das die Aminosäurerestsequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 aufweist. Am besten weist ein isoliertes und gereinigtes Polynukleotid der Erfindung die Nukleotidbasensequenz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 auf.
Mehrere der Nager-Opioidrezeptoren (OR) wurden nun kloniert, nämlich der δ-, κ- und μ-Opioidrezeptor (Yasuda et al., 1993 und Chen et al., 1993). Zwei degenerierte Oligonukleotide, die auf der Nukleotidsequenz basieren, welche die dritte und siebte Transmembran (TM)-Regionen des Maus-δ-Opioidrezeptors codieren, wurden hergestellt. Die Genstruktur, die den OR codiert, wurde noch nicht mitgeteilt. Da viele bisher klonierte G-Protein-gekoppelte Rezeptoren auf einzelnen Exons codiert werden, wurden diese Oligonukleotide verwendet, um bei der Polymerasekettenreaktion (PCR) menschliche genomische DNA zu amplifizieren (Hazum et al., 1979). Die amplifizierte DNA (in dem Größenbereich 500 bis 1000 bp) wurde in das Bluescript-Plasmid subkloniert, und 150 der sich ergebenden Klone wurden sequenziert. Aus den erhaltenen Nukleotidsequenzen wurde ersichtlich, daß keiner der genomischen PCR-Klone die menschlichen Orthologen des Nager-ORs codierte. Ein Klon, Nr. 12, war identisch mit den δ-, μ- und κ-ORs. Um das ganze Gen, das von diesem PCR-abgeleiteten Fragment (540 bp) codiert wird, wurde eine menschliche genomische Bibliothek gescreent, und bei dem Screening wurden 18 positive Klone erhalten. Durch eine rasche PCR-Analyse dieser Phagenklone mit den ursprünglichen PCR-Oligonukleotiden gelang es, einen Phagen zu identifizieren, der die Sequenz des Klons Nr. 12 enthielt. Dieser Phage wurde gereinigt, und ein Fragment (4,5 kb) von diesem Klon wurde in das Bluescript-Plasmid subkloniert und sequenziert.
Dieser genomische Klon, der HG-12 genannt wird, enthielt ein intronloses Leseraster mit 981 Nukleotiden, die ein Protein mit 327 Aminosäuren codieren (siehe 1). Die PCR-Analyse, bei der zwei für die Sequenz des Klons Nr. 12 spezifische Oligonukleotide verwendet wurden, ergab DNA-Fragmente von gleicher Größe bei der genomischen DNA von Schimpanse, Affe, Ratte und Maus.
Der hier verwendete Ausdruck „Polynukleotid" bedeutet eine Sequenz von durch Phosphodiester-Kopplungen verbundenen Nukleotiden. Die Polynukleotide sind hier in der Richtung von 5' nach 3' dargestellt. Ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung kann ungefähr 680 bis ungefähr mehrere hunderttausend Basenpaare aufweisen. Vorzugsweise weist ein Polynukleotid ungefähr 680 bis ungefähr 150.000 Basenpaare auf. Bevorzugte Längen von bestimmten Polynukleotiden sind nachstehend angegeben.
Ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung kann ein Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Molekül oder ein Ribonukleinsäure (RNA)-Molekül sein. Wenn ein Polynukleotid ein DNA-Molekül ist, kann dieses Molekül ein Gen oder ein cDNA-Molekül sein. Die Nukleotidbasen sind hier durch einen Code aus einem einzigen Buchstaben bezeichnet: Adenin (A), Guanin (G), Thymin (T), Cytosin (C), Inosin (I) und Uracil (U).
Ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung kann mittels Standardtechniken, die einem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt sind, hergestellt werden. Die Herstellung eines cDNA-Moleküls, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, wird nachstehend bei den Beispielen 1 und 2 beschrieben. Ein Polynukleotid kann auch aus genomischen DNA-Bibliotheken mittels Lambda-Phagen-Technologien hergestellt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird bei der vorliegenden Erfindung ein isoliertes und gereinigtes Polynukleotid verwirklicht, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert, wobei das Polynukleotid mittels eines Prozesses herstellbar ist, der die Schritte aufweist, bei denen eine Bibliothek von cDNA-Klonen aus einer Zelle aufgebaut wird, die das Polypeptid exprimiert; die Bibliothek mit einer markierten cDNA-Sonde gescreent wird, die aus RNA, die das Polypeptid codiert, hergestellt ist; und ein Klon ausgewählt wird, der an die Sonde hybridisiert. Vorzugsweise wird das Polynukleotid der Erfindung mittels des obigen Prozesses hergestellt. Noch besser codiert das Polynukleotid der Erfindung ein Polypeptid, das die Aminosäurerestsequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 hat. Ebenfalls noch besser weist das Polynukleotid die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 auf.
B. Sonden und Primer
Gemäß einem weiteren Aspekt ermöglicht die von der vorliegenden Erfindung gelieferte DNA-Sequenz-Information die Herstellung von relativ kurzen DNA (oder RNA)-Sequenzen, welche die Fähigkeit haben, in spezifischer Weise an Gensequenzen des ausgewählten, hier beschriebenen Polynukleotids zu hybridisieren. Gemäß diesen Aspekten werden Nukleinsäuresonden von einer geeigneten Länge hergestellt, wobei eine geeignete Nukleotidsequenz zugrunde gelegt wird, z. B. eine Sequenz, wie diejenige, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 wiedergegeben ist. Die Fähigkeit solcher Nukleinsäuresonden, in spezifischer Weise an ein Polynukleotid, das einen Epsilon-Opioidrezeptor codiert, zu hybridisieren, macht sie bei einer Vielfalt von Ausführungsformen besonders nützlich. Besonders wichtig ist, daß die Sonden bei einer Vielfalt von Untersuchungen verwendet werden können, um bei einer bestimmten Probe die Anwesenheit von komplementären Sequenzen nachzuweisen.
Bei gewissen Ausführungsformen ist es vorteilhaft, Oligonukleotid-Primer zu verwenden. Die Sequenz solcher Primer wird unter Verwendung eines Polynukleotids der vorliegenden Erfindung entworfen, für die Verwendung beim Nachweisen, Amplifizieren oder Mutieren eines definierten Segments eines Gens oder Polynukleotids, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid aus Nager-Zellen mittels der PCR-Technologie codiert.
Um gewisse Vorteile der vorliegenden Erfindung zu erhalten, umfaßt eine bevorzugte Nukleinsäuresequenz, die für Hybridisierungsuntersuchungen oder -tests verwendet wird, Sondenmoleküle, die komplementär zu mindestens einem ungefähr 25 bis 70 Nukleotide langen Abschnitt eines Polynukleotids sind, das ein Epsilon-Opioidrezeptor- Polypeptid, wie dasjenige, das in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 wiedergegeben ist, codiert. Eine Größe von mindestens 25 Nukleotiden in der Länge trägt dazu bei, es sicherzustellen, daß das Fragment eine genügende Länge hat, um ein Duplexmolekül, das sowohl stabil, als auch selektiv ist, zu bilden. Moleküle, die komplementäre Sequenzen über Abschnitte, die größer als 25 Basen in der Länge sind, haben, werden jedoch im allgemeinen bevorzugt, um die Stabilität und die Selektivität des Hybrids zu erhöhen, und dadurch die Qualität und den Selektivitätsgrad der erhaltenen spezifischen Hybridmoleküle zu erhöhen. Im allgemeinen wird bevorzugt, Nukleinsäuremoleküle zu entwerfen, die gen-komplementäre Abschnitte mit 25 bis 40 Nukleotiden, 55 bis 70 Nukleotiden, oder wenn gewünscht, sogar noch längere Abschnitte haben. Solche Fragmente können leicht hergestellt werden, zum Beispiel durch direkte Synthese des Fragments mit chemischen Mitteln, durch Anwendung einer Nukleinsäure-Reproduktionstechnologie, wie der PCR-Technologie des US-Patents 4603102, oder durch Ausschneiden ausgewählter DNA-Fragmente aus rekombinanten Plasmiden, die geeignete Inserts und geeignete Restriktionsenzymstellen enthalten.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird bei der vorliegenden Erfindung ein isoliertes und gereinigtes Polynukleotid betrachtet, das eine Basensequenz aufweist, die identisch mit, oder komplementär zu einem Segment mit mindestens 25 aneinandergrenzenden Basen von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 ist, wobei das Polynukleotid an ein Polynukleotid hybridisiert, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert. Vorzugsweise weist das isolierte und gereinigte Polynukleotid eine Basensequenz auf, die identisch mit, oder komplementär zu einem Segment mit mindestens 25 bis 70 aneinandergrenzenden Basen von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 ist. Zum Beispiel kann das Polynukleotid der Erfindung ein Basensegment aufweisen, das identisch mit, oder komplementär zu 40 oder 55 aneinandergrenzenden Basen der beschriebenen Nukleotidsequenzen ist.
Demgemäß kann ein Polynukleotid-Sondenmolekül der Erfindung wegen seiner Fähigkeit, in selektiver Weise Duplexmoleküle mit komplementären Abschnitten des Gens zu bilden, verwendet werden. Je nach der beabsichtigten Anwendung wird man wünschen, verschiedene Hybridisierungsbedingungen zu verwenden, um einen verschiedenen Selektivitätsgrad der Sonde bezüglich der Zielsequenz zu erreichen. Für Anwendungen, die einen hohen Selektivitätsgrad erfordern, wird man gewöhnlich wünschen, relativ strenge Bedingungen zu verwenden, um die Hybride zu bilden. Zum Beispiel wird man Bedingungen mit relativ niedrigem Salzgehalt oder hoher Temperatur auswählen, wie sie bei 0,02 M–0,15 M NaCl bei Temperaturen von 50°C bis 70°C gegeben sind. Diese Bedingungen sind besonders selektiv und tolerieren wenig oder gar keinen Mismatch zwischen der Sonde und der Matrize oder dem Zielstrang.
Für einige Anwendungen, zum Beispiel, wenn man wünscht, Mutanten herzustellen, wobei ein mit einer darunter liegenden Matrize hybridisierter Mutantenprimerstrang verwendet wird, oder wenn man versucht, eine ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codierende Sequenz von anderen Zellen, funktionalen Äquivalenten, oder dergleichen zu isolieren, werden natürlich weniger strenge Hybridisierungsbedingungen benötigt, um die Bildung des Heteroduplex zu ermöglichen. Unter diesen Bedingungen kann man wünschen, Bedingungen, wie 0,15 M–0,9 M Salzgehalt bei Temperaturen zwischen 20°C und 70°C zu verwenden. Kreuzhybridisierende Spezies können dadurch leicht als positiv hybridisierende Signale bezüglich der Kontrollhybridisierungen identifiziert werden. In jedem Fall wird es allgemein geschätzt, daß die Bedingungen durch die Zugabe von zunehmenden Mengen Formamid strenger werden können, das dazu dient, das Hybridduplex auf die gleiche Weise wie eine erhöhte Temperatur zu destabilisieren. Folglich können die Hybridisierungsbedingungen leicht manipuliert werden, und folglich wird dies im allgemeinen eine Methode der Wahl sein, je nach den gewünschten Ergebnissen.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes und gereinigtes Polynukleotid verwirklicht, das eine Basensequenz aufweist, die identisch mit, oder komplementär zu einem Segment mit mindestens 25 aneinandergrenzenden Basen von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 ist. Das Polynukleotid der Erfindung hybridisiert an SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3, oder ein Komplement von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3. Vorzugsweise weist das isolierte und gereinigte Polynukleotid eine Basensequenz auf, die identisch mit, oder komplementär zu einem Segment mit mindestens 25 bis 70 aneinandergrenzenden Basen von SEQ ID NO: 1 oder SEQ NO ID NO: 3 ist. Zum Beispiel kann das Polynukleotid der Erfindung ein Basensegment aufweisen, das identisch mit, oder komplementär zu 40 bis 55 aneinandergrenzenden Basen von SEQ ID NO: 1 oder SEQ NO ID NO: 3 ist.
Bei gewissen Ausführungsformen ist es vorteilhaft, ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem geeigneten Marker zu verwenden, um Hybridbildung nachzuweisen. Eine große Vielfalt von geeigneten Markern ist auf diesem Gebiet bekannt, einschließlich radioaktiver, enzymatischer oder anderer Liganden, wie Avidin/Biotin, die fähig sind, ein nachweisbares Signal zu geben.
Im allgemeinen ist vorgesehen, daß eine hier beschriebene Hybridisierungssonde sowohl als Reagens bei Lösungshybridisierung, als auch bei Ausführungsformen, die eine feste Phase umfassen, nützlich ist. Bei Ausführungsformen, die eine feste Phase umfassen, wird die Test-DNA (oder Test-RNA) adsorbiert oder auf andere Weise an einer ausgewählten Matrize oder Oberfläche fixiert. Diese fixierte Nukleinsäure wird dann einer spezifischen Hybridisierung mit ausgewählten Sonden unter gewünschten Bedingungen unterworfen. Die ausgewählten Bedingungen hängen, wie auf dem Gebiet gut bekannt ist, von den besonderen Umständen und den erforderlichen Kriterien (z. B. von den G + C-Gehalten, der Art der Ziel-Nukleinsäure, der Quelle der Nukleinsäure, der Größe der Hybridisierungssonde) ab. Nach dem Waschen der Matrize, um nicht-spezifisch gebundene Sondenmoleküle zu entfernen, wird die spezifische Hybridisierung mittels des Markers nachgewiesen, oder sogar quantitativ bestimmt.
III. Epsilon-Opioidrezeptor
Bei einer Ausführungsform wird bei der vorliegenden Erfindung ein isoliertes und gereinigtes Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid betrachtet. Vorzugsweise ist ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid der Erfindung ein rekombinantes Polypeptid. Sogar noch besser weist ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid der vorliegenden Erfindung die Aminosäurerestsequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 auf. Ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid weist vorzugsweise weniger als ungefähr 500 Aminosäurereste, und noch besser weniger als ungefähr 400 Aminosäurereste auf.
Der Rest der abgeleiteten Aminosäure des menschlichen Klons 12 ist in der 1 wiedergegeben. Bei einer hydrophoben Analyse der Sequenz der abgeleiteten Aminosäure wurden die sieben Transmembran (TM)-Regionen nachgewiesen, die charakteristisch für die G-Protein-gekoppelten Rezeptorgene sind, und insgesamt war die Proteinsequenz dem OR in höchstem Grade ähnlich. Ein Vergleich der durch HG-12 codierten Aminosäuresequenz mit dem zuvor klonierten OR ergibt Aminosäuren, die identisch sind, und die konservativ substituiert sind, meistens in den sieben mutmaßlichen TM-Regionen. Die Prozentsätze der Aminosäuren, die identisch mit den durch HG-12 codierten sind, innerhalb der Transmembranregionen und insgesamt für das gesamte Protein sind: δ, 40% und 37%, κ, 43% und 35% (siehe 3). Das durch HG-12 codierte Protein enthält drei mutmaßliche Glykosylierungsstellen bei dem Amino-Ende, und Consensussequenzen für die Phosphorylierung durch Proteinkinase C und Proteinkinase A. Eine Asparginsäure in der dritten TM-Region, die auch bei den anderen ORen vorhanden ist, und die Catecholaminrezeptoren können einen Teil der Ligandenbindestelle bilden.
Die Polypeptide werden hier als Aminosäurerestsequenzen beschrieben. Diese Sequenzen sind von links nach rechts in der Richtung von dem Amino-Ende nach dem Carboxyl-Ende wiedergegeben. Gemäß der Standardnomenklatur werden Aminosäurerestsequenzen entweder mit einem Einbuchstaben- oder einen Dreibuchstabencode bezeichnet, wie nachstehend wiedergegeben ist.
Bei der Struktur eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung können Modifikationen und Änderungen gemacht werden, und dennoch kann ein Molekül erhalten werden, das gleiche Opioidrezeptor-Merkmale hat. Zum Beispiel können bei einer Sequenz gewisse Aminosäuren für andere Aminosäuren substituiert werden, ohne wesentlichen Verlust an Rezeptoraktivität. Da die interaktive Fähigkeit und die Art eines Polypeptids die biologische funktionale Aktivität dieses Polypeptids definieren, können gewisse Aminosäuresequenzsubstitutionen bei einer Polypeptidsequenz (oder natürlich ihrer zugrundeliegenden DNA-Codiersequenz) gemacht werden, und dennoch kann ein Polypeptid mit gleichen Eigenschaften erhalten werden.
Wenn solche Änderungen gemacht werden, kann der hydropathische Index der Aminosäuren betrachtet werden. Die Bedeutung des hydropathischen Aminsosäureindex bei der Übertragung einer interaktiven biologischen Funktion auf ein Polypeptid wird auf dem Gebiet im allgemeinen verstanden (Kyte, J. and R. F. Doolittle, 1982). Es ist bekannt, daß gewisse Aminosäuren für andere Aminosäuren, die einen ähnlichen hydropathischen Index oder eine ähnliche hydropathische Bewertung haben, substituiert werden können, und dennoch ein Polypeptid mit ähnlicher biologischer Aktivität erhalten wird. Jeder Aminosäure wurde auf der Basis ihrer Hydrophobizitäts- und Ladungseigenschaften ein hydropathischer Index zugeteilt. Diese Indizes sind: Isoleucin (+4,5); Valin (+4,2); Leucin (+3,8); Phenylalanin (+2,8); Cystein/Cystin (+2,5); Methionin (+1,9); Alanin (+1,8); Glycin (–0,4); Threonin (–0,7); Serin (–0,8); Tryptophan (–0,9); Tyrosin (–1,3); Prolin (–1,6); Histidin (–3,2); Glutamat (–3,5); Glutamin (–3,5); Aspartat (–3,5); Asparagin (–3,5); Lysin (–3,9); und Arginin (–4,5).
Es wird angenommen, daß der relative hydropathische Charakter der Aminosäure die sekundäre Struktur des sich ergebenden Polypeptids bestimmt, die wiederum die Wechselwirkung des Polypeptids mit anderen Molekülen, wie Enzymen, Substraten, Rezeptoren, Antikörpern, Antigenen und dergleichen definiert. Es ist auf diesem Gebiet bekannt, daß eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure, die einen ähnlichen hydropathischen Index hat, substituiert werden kann, und dennoch ein funktional äquivalentes Polypeptid erhalten wird. Bei solchen Änderungen wird die Substitution von Aminosäuren, deren hydropathische Indizes innerhalb von ±2 liegen, bevorzugt, die Substitution von Aminosäuren, deren hydropathische Indizes innerhalb von ±1 liegen, besonders bevorzugt, und die Substitution von Aminosäuren, deren hydropathische Indizes innerhalb von ±0,5 liegen, ganz besonders bevorzugt.
Die Substitution von ähnlichen Aminosäuren kann auch auf der Basis der Hydrophilizität gemacht werden, besonders, wenn das dadurch erzeugte, biologische, funktionale, äquivalente Polypeptid oder Peptid für die Verwendung bei immunologischen Ausführungsformen bestimmt ist. Im US-Patent 4554101 wird dargelegt, daß die größte örtliche mittlere Hydrophilizität eines Polypeptids, die von der Hydrophilizität seiner angrenzenden Aminosäuren bestimmt wird, mit seiner Immunogenizität und -antigenizität, d. h., mit einer biologischen Eigenschaft des Polypeptids korreliert.
Wie im US-Patent 4554101 angegeben ist, wurden den Aminosäureresten die folgenden Hydrophilizitätswerte zugeteilt: Arginin (+3,0); Lysin (+3,0); Aspartat (+3,0 ± 1); Glutamat (+3,0 ± 1); Serin (+0,3); Asparagin (+0,2); Glutamin (+0,2); Glycin (0); Prolin (–0,5 ± 1); Threonin (–0,4); Alanin (–0,5); Histidin (–0,5); Cystein (–1,0); Methionin (–1,3); Valin (–1,5); Leucin (–1,8); Isoleucin (–1,8); Tyrosin (–2,3); Phenylalanin (–2,5); Tryptophan (–3,4). Es gilt, daß eine Aminosäure für eine andere, die einen ähnlichen Hydrophilizitätswert hat, substituiert werden kann, und dennoch ein biologisch äquivalentes, und insbesondere ein immunologisch äquivalentes Polypeptid erhalten wird. Bei solchen Änderungen wird die Substitution von Aminosäuren, deren Hydrophilizitätswerte innerhalb von ±2 liegen, bevorzugt, die Substitution von Aminosäuren, deren Hydrophilizitätswerte innerhalb von ±1 liegen, besonders bevorzugt, und die Substitution von Aminosäuren, deren Hydrophilizitätswerte innerhalb von ±0,5 liegen, ganz besonders bevorzugt.

Wie oben dargelegt wurde, basieren Aminosäuresubstitutionen daher im allgemeinen auf der relativen Ähnlichkeit der Aminosäureseitenketten-Substituenten, zum Beispiel ihrer Hydrophobizität, Hydrophilizität, Ladung, Größe und dergleichen. Typische Substitutionen, bei denen verschiedene der obigen Eigenschaften berücksichtigt werden, sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt und umfassen: Arginin und Lysin; Glutamat und Aspartat; Serin und Threonin; Glutamin und Asparagin; und Valin, Leucin und Isoleucin (siehe die nachstehende Tabelle 1). Bei der vorliegenden Erfindung werden folglich funktionale oder biologische Äquivalente eines Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptids betrachtet, wie oben dargelegt wurde. TABELLE 1

Ursprünglicher Rest	Typische Substitutionen
Ala	Gly; Ser
Arg	Lys
Asn	Gln; His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asn
Glu	Asp
Gly	Ala
His	Asn; Gln
Ile	Leu; Val
Leu	Ile; Val
Lys	Arg
Met	Met; Leu; Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp; Phe
Val	Ile; Leu

Biologische oder funktionale Äquivalente eines Polypeptids können auch mittels stellen-spezifischer Mutagenese hergestellt werden. Die stellen-spezifische Mutagenese ist eine nützliche Technik bei der Herstellung von Polypeptiden der zweiten Generation, oder biologisch funktionalen, äquivalenten Polypeptiden oder Peptiden, die von ihren Sequenzen abgeleitet sind, durch spezifische Mutagenese der zugrunde liegenden DNA. Wie oben angemerkt wurde, können solche Änderungen wünschenswert sein, wenn Aminosäuresubstitutionen wünschenswert sind. Die Technik bietet weiterhin die Möglichkeit, Sequenzvarianten leicht herzustellen und zu testen, zum Beispiel, eine oder mehrere der obigen Überlegungen einzubeziehen, durch Einführen von einer oder mehreren Nukleotidsequenzänderungen in die DNA. Die stellen-spezifische Mutagenese ermöglicht die Erzeugung von Mutanten durch die Verwendung von spezifischen Oligonukleotidsequenzen, welche die DNA-Sequenz der gewünschten Mutation codieren, sowie einer genügenden Anzahl von angrenzenden Nukleotiden, um eine Primersequenz von genügender Größe und Sequenzkomplexität zu erhalten, um ein stabiles Duplex auf den beiden Seiten der Deletionsverbindungsstelle, die überspannt wird, zu bilden. Gewöhnlich wird ein Primer mit ungefähr 17 bis 25 Nukleotiden in der Länge bevorzugt, wobei ungefähr 5 bis 10 Reste auf den beiden Seiten der Verbindungsstelle der Sequenz verändert sind.
Im allgemeinen ist die Technik der stellen-spezifischen Mutagenese auf dem Gebiet gut bekannt, wie von (Adelman et al., 1983) erläutert wird. Wie ersichtlich ist, wird bei der Technik gewöhnlich ein Phagenvektor verwendet, der sowohl in einer einzelsträngigen, als auch in einer doppelsträngigen Form vorliegen kann. Typische Vektoren, die bei der stellen-spezifischen Mutagenese nützlich sind, umfassen Vektoren wie den M13-Phagen (Messing et al., 1981). Diese Phagen sind kommerziell erhältlich, und ihre Verwendung ist Fachleuten auf dem Gebiet im allgemeinen bekannt.
Im allgemeinen wird bei der stellen-gerichteten Mutagenese demgemäß zuerst ein einzelsträngiger Vektor genommen, der innerhalb seiner Sequenz eine DNA-Sequenz umfaßt, welche die ausgewählte Epsilon-Opioidrezeptor-Polypetid-Sequenz ganz oder teilweise codiert. Ein Oligonukleotidprimer, der die gewünschte mutierte Sequenz trägt, wird, im allgemeinen synthetisch, hergestellt, zum Beispiel mittels der Methode von (Crea et al., 1978). Dieser Primer wird dann an den einzelsträngigen Vektor annealed, und durch die Verwendung von Enzymen, wie des E. coli-Polymerase I-Klenow-Fragments, verlängert, um die Synthese des mutation-tragenden Strangs zu vervollständigen. Folglich wird ein Heteroduplex gebildet, bei dem ein Strang die ursprüngliche, nicht-mutierte Sequenz codiert, und der zweite Strang die gewünschte Mutation trägt. Dieser Heteroduplex-Vektor wird dann verwendet, um geeignete Zellen, wie E. coli-Zellen, zu transformieren, und es werden Klone ausgewählt, die rekombinante Vektoren, welche die Mutation tragen, umfassen. Kommerziell erhältliche Ausrüstungen werden mit allen notwendigen Reagenzien, außer den Oligonukleotid-Primern, geliefert.
Aminosäurereste können bei dem Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid mittels molekularbiologischer Standardtechniken hinzugefügt oder weggenommen werden, ohne die Funktionalität des Rezeptors zu verändern. Zum Beispiel können Bereiche des Epsilon-Opioidrezeptors weggenommen werden, um gekürzte Opioidrezeptoren zu erzeugen. Der gekürzte Rezeptor behält die Eigenschaften von Epsilon-Opioidrezeptoren, wie Ligandbindung und die Fähigkeit, mit anderen Proteinen (zum Beispiel G-Proteinen, Adenylylcyclase) zu interagieren. Von funktionalen gekürzten Proteinen wurde bei Phosphodiesterasen, Ionenkanälen und Membrantransportern berichtet. Die hier verwendeten, gekürzten Rezeptoren sind Rezeptoren, bei denen Aminosäuren von dem Wildtyp-Rezeptor weggenommen wurden, um einen kürzeren Rezeptor oder Bereiche davon zu erzeugen. Die hier verwendeten chimärischen Rezeptoren sind Rezeptoren, bei denen Aminosäuren zu dem Rezeptor hinzugefügt wurden. Ein chimärischer Rezeptor kann kürzer oder länger als der Wildtyp-Rezeptor sein, oder die gleiche Länge haben.
Die funktionale Aktivität von gekürzten und chimärischen Rezeptoren wurde bei einer gewissen Anzahl von Rezeptorsystemen nachgewiesen. Insbesondere wurde gezeigt, daß gekürzte und chimärische adrenergische Rezeptoren, die den Opioidrezeptoren strukturell ähnlich sind, funktionale Eigenschaften des adrenergischen Wildtyp-Rezeptors behalten.
Die meisten langen Carboxyl-Enden des β-adrenergischen Avian-Rezeptors können gestreicht werden oder proteolytisch weggenommen werden, ohne die Ligandbindungseigenschaften oder die regelnden Eigenschaften des Rezeptors zu verändern. Es wurde gefunden, daß die Ligandbindungseigenschaften von fünf gekürzten β-adrenergischen Rezeptoren bei sowohl Agonisten, als auch Antagonisten denjenigen des Wildtyp-Rezeptors ähnlich waren. Außerdem stimulierten die gekürzte adrenergische Rezeptoren auch die Adenylylcyclase-Aktivität. In der Tat, gekürzte β-adrenergische Rezeptoren zeigten bei Anwesenheit von Agonisten eine größere Stimulation der Adenylylcyclase-Aktivität als die durch den Wildtyp-Rezeptor bewirkte Stimulation (Parker et al., 1991).
Ähnliche Ergebnisse wurden bei dem α-adrenergischen Rezeptor erhalten. Ein gekürzter α-adrenergischer Rezeptor aktivierte die Phosphatidylinositol-Hydrolyse ebenso wirksam wie der α-adrenergische Wildtyp-Rezeptor (Cotecchia et al., 1990).
Funktionale chimärische Rezeptoren wurden auch von einer gewissen Anzahl von Forschern erzeugt. Funktionale chimärische adrenergische Rezeptoren wurden durch Zusammenspleißen von Abschnitten der α₂- und β₂-adrenergischen Rezeptoren erzeugt (Kobilka et al., 1988).
Funktionale Chimären wurden auch für die folgenden Rezeptoren erzeugt: zwischen β₁- und β₂-Rezeptoren (Frielle et al., 1988; Marullo et al., 1990); zwischen muskarinischen m2- und m3-Rezeptoren (Wess et al., 1990); zwischen muskarinischen m1- und β-adrenergischen Rezeptoren, (Wong et al., 1990); zwischen D₂-Dopamin und muskarinischen m1-Rezeptoren (England et al., 1991); zwischen Rezeptoren des luteinisierenden Hormons und β-adrenergischen Rezeptoren (Moyle et al., 1991); zwischen NK₁- und NK₃-Substanz P-Rezeptoren (Gether et al., 1993); und Rezeptoren des plättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktors und des epidermalen Wachstumsfaktors (Seedorf et al., 1991).
Chimärische Epsilon-Opioidrezeptoren können durch Spleißen von Abschnitten eines zweiten Rezeptors an einen Epsilon-Rezeptor erzeugt werden. Die zwei Rezeptoren können einander ähnlich sein. Für die Erzeugung von chimärischen Epsilon-Opioidrezeptoren sind folglich andere Opioidrezeptoren, wie Sigma-, Delta-, Kappa- und My-Opioidrezeptoren, ideale Quellen für Nukleotidsequenzen. Zum Beispiel kann ein Transmembranbereich bei dem Epsilon-Opioidrezeptor mit einem analogen Transmembranbereich von einem Sigma-, Delta- oder Kappa-Opioidrezeptor substituiert werden. Es wird angenommen, daß die Nukleotidquelle des zweiten Rezeptors nicht auf Opioidrezeptoren begrenzt ist. Chimärische Rezeptoren können aus dem Epsilon-Opioidrezeptor und anderen, ähnlichen Rezeptoren erzeugt werden, wie Rezeptoren für Acetylcholin, Adenosin, adrenergischen Rezeptoren, Rezeptoren für Angiotensin, Bombazin, Bradykinin, Cannabinoid, Dopamin, Endothelin, Histamin, Interleukin, das luteinisierende Hormon, Neuromedin K, Neuropeptid Y, Odorans, Prostaglandin, Parathyroidhormon, Serotin, Somatostatin, Substanz K, Substanz P, Thrombin, Thromboxan A2, Thyrotropin freisetzendes Hormon und Vasopressin.
Ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid der vorliegenden Erfindung soll nicht auf eine bestimmte Quelle begrenzt sein. Folglich ermöglicht die Erfindung den allgemeinen Nachweis und die Isolierung der Gattung der Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptide von einer Vielfalt von Quellen. Es wird angenommen, daß eine gewisse Anzahl der Spezies der Familie der Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptide geeignet ist für den Nachweis und die Isolierung mittels der Zusammensetzungen und Methoden der vorliegenden Erfindung.
Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung wird mittels Standardtechniken hergestellt, die Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind. Solche Techniken umfassen, aber sind nicht begrenzt auf, die Isolierung und Reinigung bei Geweben, von denen bekannt ist, daß sie dieses Polypeptid enthalten, und die Expression aus klonierter DNA, die ein solches Polypeptid mittels transformierter Zellen codiert.
Opioidrezeptor-Polypeptide werden in praktisch allen Säugern, einschließlich des Menschen, gefunden. Wie dies bei anderen Rezeptoren der Fall ist, gibt es wahrscheinlich nur eine geringe Variation bei der Struktur und Funktion eines Opioidrezeptors bei verschiedenen Spezies. Wenn es einen Unterschied zwischen den Spezies gibt, liegt die Identifizierung dieser Unterschiede innerhalb der Fähigkeiten eines Fachmannes. Folglich wird bei der vorliegenden Erfindung ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid von irgendeinem Säuger betrachtet. Ein bevorzugter Säuger ist ein Nagetier oder ein Mensch.
III. Expressionsvektoren
Bei einer alternativen Ausführungsform werden bei der vorliegenden Erfindung Expressionsvektoren verwirklicht, die ein Polynukleotid aufweisen, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert. Vorzugsweise weisen die Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung Polynukleotide auf, die Polypeptide codieren, welche die Aminosäurerestsequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 aufweisen. Noch besser weisen die Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung Polynukleotide auf, welche die Nukleotidbasensequenz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 aufweisen. Sogar noch besser weisen die Expressionsvektoren der Erfindung Polynukleotide auf, die an einen Enhancer-Promotor funktionsfähig gekoppelt sind. Ebenfalls noch besser weisen die Expressionsvektoren der Erfindung ein Polynukleotid auf, das an einen prokaryotischen Promotor funktionsfähig gekoppelt ist. In alternativer Weise weisen die Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung ein Polynukleotid auf, das an einen Enhancer-Promotor, der ein eukaryotischer Promotor ist, funktionsfähig gekoppelt ist. Die Expressionsvektoren weisen weiterhin ein Polyadenylierungssignal auf, das bei 3' der Aminosäure mit Carboxyl-Ende und innerhalb einer Transkriptionseinheit des codierten Polypeptids positioniert ist.
Ein Promotor ist eine Region eines DNA-Moleküls, die gewöhnlich innerhalb von ungefähr 100 Nukleotidpaaren vor (stromaufwärts von) dem Punkt liegt, bei dem die Transkription beginnt (d. h., einer Transkriptions-Startstelle). Diese Region enthält gewöhnlich mehrere Arten von DNA-Sequenz-Elementen, die in verschiedenen Genen bei ähnlichen relativen Positionen gelegen sind. Der hier verwendete Ausdruck „Promotor" umfaßt das, was auf dem Gebiet als eine Stromaufwärts-Promotorregion, eine Promotorregion, oder ein Promotor einer verallgemeinerten eukaryotischen RNA-Polymerase II-Transkriptionseinheit bezeichnet wird.
Eine andere Art von diskretem, regelndem Transkriptionssequenzelement ist ein Enhancer. Ein Enhancer sorgt für die Spezifizität von Zeit, Ort und Expressionsniveau für eine bestimmte codierende Region (z. B. ein Gen). Eine hauptsächliche Funktion eines Enhancers ist, das Niveau der Transkription einer codierenden Sequenz in einer Zelle, die einen oder mehr Transkriptionsfaktoren enthält, die an diesen Enhancer binden, zu erhöhen. Im Gegensatz zu einem Promotor kann ein Enhancer funktionieren, wenn er in variablen Entfernungen von Transkriptions-Startstellen gelegen ist, solange ein Promotor anwesend ist.
Der hier verwendete Ausdruck „Enhancer-Promotor" bedeutet eine Verbundeinheit, die sowohl Enhancer-, als auch Promotorelemente enthält. Ein Enhancer-Promotor ist an eine codierende Sequenz, die mindestens ein Genprodukt codiert, funktionsfähig gekoppelt. Der hier verwendete Ausdruck „funktionsfähig gekoppelt" bedeutet, daß ein Enhancer-Promotor mit einer codierenden Sequenz auf eine solche Weise verbunden ist, daß die Transkription dieser codierenden Sequenz durch diesen Enhancer-Promotor gesteuert und geregelt wird. Mittel, um einen Enhancer-Promotor an eine codierende Sequenz funktionsfähig zu koppeln, sind auf dem Gebiet gut bekannt. Wie auf dem Gebiet ebenfalls gut bekannt ist, ist die genaue Orientierung und Lage relativ zu einer codierenden Sequenz, deren Transkription gesteuert wird, inter alia abhängig von der spezifischen Art des Enhancer-Promotors. Folglich ist ein minimaler TATA-Box-Promotor gewöhnlich von ungefähr 25 bis zu ungefähr 30 Basenpaaren stromaufwärts von einer Transkriptions-Initiationsstelle gelegen, und ein Stromaufwärts-Promotorelement ist gewöhnlich von ungefähr 100 bis zu ungefähr 200 Basenpaaren stromaufwärts von einer Transkriptions-Initiationsstelle gelegen. Im Gegensatz dazu kann ein Enhancer stromabwärts von der Initiationsstelle gelegen sein und eine beträchtliche Entfernung von dieser Stelle haben.
Ein bei einem Vektorkonstrukt der vorliegenden Erfindung verwendeter Enhancer-Promotor kann irgendein Enhancer-Promotor sein, der die Expression in einer zu transfizierenden Zelle vorantreibt. Wenn ein Enhancer-Promotor mit gut bekannten Eigenschaften verwendet wird, können das Niveau und das Muster der Genproduktexpression optimiert werden.
Eine codierende Sequenz eines Expressionsvektors ist an eine Transkriptions-Terminationsregion funktionsfähig gekoppelt. Die RNA-Polymerase transkribiert eine codierende DNA-Sequenz über eine Stelle, wo Polyadenylierung erfolgt. DNA-Sequenzen, die einige hundert Basenpaare stromabwärts von der Polyadenylierungsstelle gelegen sind, dienen gewöhnlich dazu, die Transkription zu beenden. Diese DNA-Sequenzen werden hier als Transkriptions-Terminationsregionen bezeichnet. Diese Regionen sind für eine wirksame Polyadenylierung der transkribierten Messenger-RNA (RNA) erforderlich. Die Transkriptions-Terminationsregionen sind auf dem Gebiet gut bekannt. Eine bevorzugte Transkriptions-Terminationsregion ist von einem Rinderwachstumshormon-Gen abgeleitet.
Ein Expressionsvektor weist ein Polynukleotid auf, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert. Ein solches Polypeptid soll eine Sequenz von Nukleotidbasen umfassen, die ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codieren, das eine genügende Länge hat, um dieses Segment von einem Polynukleotidsegment, das ein Nicht-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert, zu unterscheiden. Ein Polypeptid der Erfindung kann auch biologisch funktional äquivalente Polypeptide codieren, oder Peptide codieren, die abweichende Aminosäuresequenzen haben, wie bei Änderungen, die aufgrund von zum Beispiel der relativen hydropathischen Bewertung der Aminosäuren, die ausgetauscht werden, ausgewählt werden. Diese abweichenden Sequenzen sind diejenigen, die aus natürlichen Quellen isoliert werden, oder in die hier beschriebenen Sequenzen mittels eines mutagenen Verfahrens, wie der stellen-gerichteten Mutagenese, induziert werden.
Vorzugsweise weisen die Expressionsvektoren. der vorliegenden Erfindung Polynukleotide auf, die Polypeptide codieren, welche die Aminosäurerestsequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 aufweisen. Ein Expressionsvektor kann eine Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codierende Region von irgendeinem der oben angegebenen Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptide umfassen, oder er kann codierende Regionen enthalten, die ausgewählte Veränderungen oder Modifikationen bei der grundlegenden codierenden Region eines solchen Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptids tragen. In alternativer Weise können solche Vektoren oder Fragmente größere Polypeptide codieren, oder Polypeptide codieren, die dennoch die grundlegende codierende Region umfassen. In jedem Fall sollte klar erkannt werden, daß infolge der Codonredundanz, sowie der biologischen funktionalen Äquivalenz dieser Aspekt der Erfindung nicht auf die speziellen DNA-Moleküle begrenzt ist, die den oben angegebenen Polypeptidsequenzen entsprechen.
Typische Vektoren umfassen die Säuger-Expressionsvektoren der pCMV-Familie, die pCMV6b und pCMV6c (Chiron Corp., Emeryville CA) und pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA) umfassen. In gewissen Fällen, und speziell in dem Fall dieser individuellen Säuger-Expressionsvektoren können die sich ergebenden Konstrukte eine Cotransfektion mit einem Vektor erfordern, der einen auswählbaren Marker, wie pSV2neo enthält. Über Cotransfektion in eine dihydrofolatreduktasedefiziente Eierstock-Zellinie des chinesischen Hamsters, wie DG44, können Klone, die Opioidpolypeptide exprimieren, aufgrund der in solche Expressionsvektoren eingebauten DNA nachgewiesen werden.
Ein DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung kann mittels einer gewissen Anzahl von Techniken, die auf dem Gebiet gut bekannt sind, in einen Vektor eingebaut werden. Zum Beispiel wurde nachgewiesen, daß der Vektor pUC18 von besonderem Wert ist. Ebenso können die verwandten Vektoren M13mp18 und M13mp19 bei gewissen Ausführungsformen der Erfindung, insbesondere beim Ausführen der Dideoxysequenzierung verwendet werden.
Ein Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung ist sowohl ein nützliches Mittel, um Mengen der Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codierenden DNA herzustellen, als auch ein nützliches Mittel, um die codierten Polypeptide herzustellen. Es wird angenommen, daß, wenn Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptide der Erfindung durch rekombinante Mittel hergestellt werden, man entweder prokaryotische oder eukaryotische Expressionsvektoren als Shuttle-Systeme verwenden kann. Da prokaryotische Systeme jedoch gewöhnlich unfähig sind, Vorläufer-Polypeptide richtig zu verarbeiten, und insbesondere solche Systeme unfähig sind, membran-assoziierte eukaryotische Polypeptide richtig zu verarbeiten, und da bei Verwendung der Informationen der beschriebenen Erfindung eukaryotische Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptide erwartet werden, exprimiert man solche Sequenzen wahrscheinlich in eukaryotischen Wirten. Selbst wenn das DNA-Segment ein eukaryotisches Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert, wird jedoch angenommen, daß die prokaryotische Expression einige zusätzliche Anwendungen haben kann. Daher kann die Erfindung in Kombination mit Vektoren verwendet werden, die sich zwischen den eukaryotischen und den prokaryotischen Zellen hin- und herbewegen können. Ein solches System, das die Verwendung von bakteriellen Wirtszellen, sowie von eukaryotischen Wirtszellen ermöglicht, wird hier beschrieben.
Wenn die Expression eines rekombinanten Polypeptids der vorliegenden Erfindung gewünscht wird, und ein eukaryotischer Wirt vorgesehen ist, ist es besonders wünschenswert, einen Vektor, wie ein Plasmid, zu verwenden, der einen eukaryotischen Replikationsstartpunkt enthält. Zum Zwecke der Expression in eukaryotischen Systemen wünscht man zusätzlich, die opioidrezeptor-codierende Sequenz neben einem wirksamen eukaryotischen Promotor und unter der Steuerung dieses Promotors, wie Promotoren, die in Kombination mit Eierstockzellen des chinesischen Hamsters verwendet werden, zu positionieren. Um eine codierende Sequenz unter die Steuerung eines Promotors zu bringen, unabhängig davon, ob er eukaryotisch oder prokaryotisch ist, ist es im allgemeinen erforderlich, das 5'-Ende der Translationsinitiationsseite des richtigen translationalen Leserasters des Polypeptids zwischen ungefähr 1 und ungefähr 50 Nukleotiden von dem 3'-Ende oder stromabwärts bezüglich des gewählten Promotors zu positionieren. Wenn eine eukaryotische Expression erwartet wird, würde man außerdem gewöhnlich wünschen, eine geeignete Polyadenylierungsstelle in die transkriptionale Einheit, die das Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid enthält, einzubauen.
Der pRc/CMV-Vektor (von Invitrogen erhältlich) ist ein typischer Vektor zum Exprimieren eines Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptids in Säugerzellen, besonders COS-, CHO- und BHK-Zellen. Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann unter der Steuerung eines CMV-Promotors in Säugerzellen wirksam exprimiert werden.
pCMV-Vektoren sind weitere typische Vektoren. Die pCMV-Plasmide sind eine Serie von Säuger-Expressionsvektoren, die bei der vorliegenden Erfindung von besonderer Nützlichkeit sind. Die Vektoren sind für die Verwendung bei im wesentlichen allen gezüchteten Zellen entworfen, und arbeiten bei SV40-transformierten Simian-COS- Zellinien äußerst gut. Die pCMV1, 2, 3 und 5-Vektoren unterscheiden sich bei gewissen einzelnen Restriktionsstellen in der Polylinkerregion jedes Plasmids. Der pCMV4-Vektor unterscheidet sich von diesen 4 Plasmiden dadurch, daß er einen Translationsenhancer in der Sequenz vor dem Polylinker enthält. Die funktional ähnlichen Vektoren pCMV6b und c sind zwar von der pCMV1-5-Serie von Vektoren nicht direkt abgeleitet, aber bei der Chiron Corp. in Emeryville, CA erhältlich, und sie sind identisch, mit Ausnahme der Orientierung der Polylinkerregion, die bei einem relativ zu dem anderen umgekehrt ist.
Die universellen Komponenten der pCMV-Plasmide sind nachstehend angegeben. Das Vektor-Rückgrat ist pTZ18R (Pharmacia), und enthält einen Bakteriophage f1-Replikationsstartpunkt für die Erzeugung von einzelsträngiger DNA und eines Ampicillin-Widerstand-Gens. Die CMV-Region besteht aus den Nukleotiden –760 bis +3 der leistungsfähigen promotor-regelnden Region des hauptsächlichen unmittelbaren frühen Gens des menschlichen Cytomegalovirus (Towne-Färbung) (Thomsen et al., 1984; Boshart et al., 1985). Das Fragment (hGH) des menschlichen Wachstumshormons enthält Transkriptionsterminations- und Polyadenylisierungssignale, welche die Sequenzen 1533 bis 2157 dieses Gens repräsentieren (Seeburg, 1982). In diesem Fragment gibt es eine mittlere, repetitive Alu-DNA-Sequenz. Schließlich sind der SV40-Replikationsstartpunkt und der von dem pcD-X-Plasmid (HindIII bis PstI-Fragment) abgeleitete, frühe Region-Promotor-Enhancer in (Okayama et al., 1983) beschrieben. Der Promotor in diesem Fragment ist so orientiert, daß die Transkription von der CMV/hGH-Expressionskassette weg fortschreitet.
Die pCMV-Plasmide sind durch Unterschiede in der Polylinkerregion und durch die Anwesenheit oder Abwesenheit des Translationsenhancers voneinander unterscheidbar. Das anfängliche pCMV1-Plasmid wurde in progressiver Weise modifiziert, um eine zunehmende Anzahl von einzelnen Restriktionsstellen in der Polylinkerregion aufzugeben. Um pCMV2 zu erzeugen, wurde eine der zwei EcoRI-Stellen bei pCMV1 zerstört. Um pCMV3 zu erzeugen, wurde pCMV1 durch Streichen eines kurzen Segments aus der SV40-Region (StuI bis EcoRI) modifiziert, und auf diese Weise wurde die PstI-SalI- und BamHI-Stelle in dem Polylinker einmalig gemacht. Um pCMV4 zu erzeugen, wurde ein synthetisches DNA-Fragment, das der 5'-untranslatierten Region einer von dem CMV-Promotor transkribierten mRNA entspricht, zu C hinzugefügt. Die Sequenz wirkt als ein translationaler Enhancer durch Verringerung der Anforderungen an die Initiationsfaktoren bei der Polypeptidsynthese (Jobling et al., 1987; Browning et al., 1988). Um pCMV5 zu erzeugen, wurde ein DNA-Segment (HpaI bis EcoRI) von der SV40-Startpunkt-Region von pCMV1 deletiert, um alle Stellen bei dem anfänglichen Polylinker einmalig zu machen.
Die pCMV-Vektoren wurden in Simian-COS-Zellen, Maus-L-Zellen, CHO-Zellen und HeLa-Zellen erfolgreich exprimiert. Bei mehreren Gegenüberstellungen haben sie 5- bis 10mal so hohe Expressionsniveaus in COS-Zellen wie auf SV40 basierende Vektoren ergeben. Die pCMV-Vektoren wurden verwendet, um den LDL-Rezeptor, den nuklearen Faktor 1, das G_s-Alpha-Polypeptid, Polypeptidphosphatase, Synaptophysin, Synapsin, den Insulinrezeptor, Grippe-Hämagglutinin, den Androgenrezeptor, Sterin 26-hydroxylase, Steroid 17- und 21-hydroxylase, Cytochrom P-450-oxidoreduktase, den beta-adrenergischen Rezeptor, den Folat-Rezeptor, das Cholesterin-Seitenkettenspaltungs-Enzym und einen Wirt anderer cDNAs zu exprimieren. Es sollte angemerkt werden, daß der SV40-Promotor in diesen Plasmiden verwendet werden kann, um andere Gene, wie dominante auswählbare Marker, zu exprimieren. Schließlich gibt es eine ATG-Sequenz in dem Polylinker zwischen der HindIII- und der PstI-Stelle in pCMV, die eine unechte Translationsinitiation verursachen kann. Dieses Codon sollte, wenn möglich, in Expressionsplasmiden vermieden werden. Ein Beitrag, in dem die Konstruktion und Verwendung der parenteralen pCMV1- und pCMV4-Vektoren beschrieben wird, wurde veröffentlicht (Andersson et al., 1989).
IV. Transfizierte Zellen
Bei noch einer weiteren Ausführungsform werden bei der vorliegenden Erfindung, rekombinante Wirtszellen mit einem Polynukleotid, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert, transformiert oder transfiziert, sowie von diesen transformierten oder transfizierten Zellen abgeleitete, transgene Zellen verwirklicht. Vorzugsweise werden die rekombinanten Wirtszellen der vorliegenden Erfindung mit einem Polynukleotid von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 transfiziert. Mittel zum Transformieren oder Transfizieren von Zellen mit einem exogenen Polynukleotid, wie DNA-Molekülen, sind auf dem Gebiet gut bekannt und umfassen Techniken, wie die Calciumphosphat- oder DEAE-dextran-vermittelte Transfektion, die Protoplastfusion, die Elektroporation, die liposom-vermittelte Transfektion, die direkte Mikroinjektion und die Adenovirusinfektion (Sambrook, Fritsch and Maniatis, 1989).
Die am häufigsten verwendete Methode ist die durch entweder Calciumphosphat oder DEAE-dextran vermittelte Transfektion. Obwohl der Mechanismus unklar ist, wird angenommen, daß die transfizierte DNA durch Endozytose in das Zytoplasma der Zelle eindringt und bis zu dem Kern transportiert wird. Je nach dem Zelltyp können bis zu 90% einer Population von gezüchteten Zellen zu irgendeiner Zeit transfiziert werden. Wegen ihrer hohen Wirksamkeit ist die durch Calciumphosphat oder DEAE-dextran vermittelte Transfektion die Methode der Wahl für Experimente, welche die transiente Expression der fremden DNA in einer großen Anzahl von Zellen erfordern. Die calciumphosphat-vermittelte Transfektion wird auch verwendet, um Zellinien zu bilden, die Kopien der fremden DNA, die gewöhnlich in Kopf-Schwanz-Tandemanordnungen angeordnet sind, in das Wirtszellengenom zu integrieren.
Bei der Protoplastfusionsmethode werden Protoplaste, die von Bakterien abgeleitet sind, die eine große Anzahl von Kopien eines interessierenden Plasmids tragen, mit gezüchteten Säugerzellen direkt gemischt. Nach der Fusion der Zellmembranen (gewöhnlich mit Polyäthylenglykol) werden die Inhalte der Bakterien in das Zytoplasma der Säugerzellen übergeben, und die Plasmid-DNA wird bis zu dem Kern transportiert. Bei vielen Zellinien, die gewöhnlich für transiente Expressionsuntersuchungen verwendet werden, ist die Protoplastfusion nicht so wirksam wie die Transfektion, aber sie ist nützlich bei Zellinien, bei denen die Endozytose von DNA unwirksam ist. Die Protoplastfusion ergibt häufig mehrere Kopien der tandemartig in das Wirtschromosom integrierten Plasmid-DNA.
Die Anwendung von kurzen elektrischen Hochspannungsimpulsen bei einer Vielfalt von Säuger- und Pflanzenzellen führt zu der Bildung von nanometer-großen Poren in der Plasmamembran. Die DNA dringt entweder durch diese Poren, oder als Folge der Umverteilung der Membrankomponenten, die mit der Schließung der Poren verbunden ist, direkt in das Zellzytoplasma ein. Die Elektroporation kann äußerst wirksam sein, und kann sowohl für die transiente Expression von klonierten Genen, als auch für die Bildung von Zellinien, die integrierte Kopien des interessierenden Gens tragen, verwendet werden. Im Gegensatz zu der calciumphosphat-vermittelten Transfektion und der Protoplastfusion entstehen bei der Elektroporation häufig Zellinien, die eine, oder höchstens einige wenige integrierte Kopien der fremden DNA tragen.
Die Liposomtransfektion umfaßt die Einkapselung von DNA und RNA in Liposomen, und die anschließende Fusion der Liposomen mit der Zellmembran. Der Mechanismus beim Eindringen der DNA in die Zelle ist unklar, aber die Transfektionswirkungsgrade können bis zu 90% betragen.
Die direkte Mikroinjektion eines. DNA-Moleküls in Kerne hat den Vorteil, daß die DNA nicht zellularen Kammern, wie Endosomen mit niedrigem pH ausgesetzt wird. Die Mikroinjektion wird daher in erster Linie als eine Methode verwendet, um Zellinien zu bilden, die integrierte Kopien der interessierenden DNA tragen.
Die Verwendung eines Adenovirus als ein Vektor für die Zelltransfektion ist auf dem Gebiet gut bekannt. Von einer adenovirusvektor-vermittelten Zelltransfektion wurde für verschiedene Zellen berichtet (Stratford-Perricaudet et al., 1992).
Eine transfizierte Zelle kann prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Vorzugsweise sind die Wirtszellen der Erfindung eukaryotische Wirtszellen. Noch besser sind die rekombinanten Wirtszellen der Erfindung COS-Zellen. Wenn es von Interesse ist, ein menschliches Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid zu erzeugen, sind gezüchtete Säugerzellen oder menschliche Zellen von besonderem Interesse.
Gemäß einem weiteren Aspekt sind die rekombinanten Wirtszellen der vorliegenden Erfindung prokaryotische Wirtszellen. Vorzugsweise sind die rekombinanten Wirtszellen der Erfindung Bakterienzellen des DH5α-Stamms von Escherichia coli. Im allgemeinen werden Prokaryoten bevorzugt für das anfängliche Klonieren von DNA-Sequenzen und das Konstruieren der bei der Erfindung nützlichen Vektoren. Zum Beispiel können E. coli K12-Stämme besonders nützlich sein. Weitere mikrobielle Stämme, die verwendet werden können, sind E. coli B. und E. coli X1776 (ATCC Nr. 31537). Diese Beispiele sollen natürlich illustrativ und nicht begrenzend sein.
Prokaryoten können auch für die Expression verwendet werden. Die obenerwähnten Stämme, sowie E. coli W3110 (F-, Lambda-, prototroph, ATCC Nr. 273325), Bazillen, wie Bacillus subtilus, oder andere Enterobacteriaceae, wie Salmonella typhimurium oder Serratus marcesans, und verschiedene Pseudomonas-Spezies können verwendet werden.
Im allgemeinen werden Plasmidvektoren, die Replikon- und Steuersequenzen enthalten, die von mit der Wirtszelle kompatiblen Spezies abgeleitet sind, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet. Der Vektor trägt gewöhnlich eine Replikonstelle, sowie markierende Sequenzen, die fähig sind, eine phänotypische Auswahl bei transformierten Zellen zu ergeben. Zum Beispiel kann E. coli mittels pBR322, einem von einer E. coli-Spezies abgeleiteten Plasmid, transformiert werden (Bolivar et al., 1977). pBR322 enthält Gene für die Ampicillin- und Tetracyclinwiderstand, und verschafft so ein leichtes Mittel, um transformierte Zellen zu identifizieren. Das pBR-Plasmid, oder andere mikrobielle Plasmide oder Phagen, müssen auch Fromotoren enthalten, oder so modifiziert werden, daß sie Promotoren enthalten, die von dem mikrobiellen Organismus für die Expression seiner eigenen Polypeptide verwendet werden können.
Die Promotoren, die gewöhnlich bei der Konstruktion der rekombinanten DNA verwendet werden, umfassen die β-Lactamase (Penicillinase)- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979; Goeddel et al., 1980), und ein Tryptophan (TRP)-Promotorsystem (EPO Appl. Publ. No. 0036776; Siebwenlist et al., 1980). Während diese Promotoren am häufigsten verwendet werden, wurden weitere mikrobielle Promotoren entdeckt und verwendet, und Details bezüglich ihrer Nukleotidsequenzen wurden veröffentlicht, die einem Fachmann ermöglichen, funktionale Promotoren in Plasmidvektoren einzuführen (Siebwenlist et al., 1980).
Außer Prokaryoten können eukaryotische Mikroben, wie Hefe, auch verwendet werden. Saccharomyces cerevisiae oder gewöhnliche Bäckerhefe ist der am häufigsten verwendete eukaryotische Mikroorganismus, wenn auch eine gewisse Anzahl anderer Stämme gewöhnlich erhältlich ist. Für die Expression in Saccharomyces wird zum Beispiel gewöhnlich das Plasmid YRp7 verwendet (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980). Dieses Plasmid enthält bereits das trpl-Gen, das einen Selektionsmarker liefert für einen Mutantenstamm von Hefe, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, zum Beispiel ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, 1977). Die Anwesenheit der trpl-Läsion als ein charakteristisches Merkmal des Hefewirtszellengenoms ergibt dann eine wirksame Umgebung zum Nachweisen der Transformation durch Wachstum bei Abwesenheit von Tryptophan.
Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., 1980) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978), wie Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-isomerase, 3-Phosphoglycerat-mutase, Pyruvatkinase, Triosephosphat-isomerase, Phosphoglucose-isomerase und Glucokinase. Beim Konstruieren geeigneter Expressionsplasmide werden die mit diesen Genen assoziierten Terminationssequenzen stromabwärts von den zu exprimierenden Sequenzen auch in den Expressionsvektor eingeführt, um eine Polyadenylierung der mRNA und eine Termination zu erhalten. Andere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil einer durch die Wachstumsbedingungen gesteuerten Transkription haben, sind die Promotorregion für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, degradative Enzyme, die mit dem Stickstoffstoffwechsel verknüpft sind, und die obenerwähnte Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, und Enzyme, welche die Maltose- und Galactoseverwendung beeinflussen. Jeder Plasmidvektor, der einen hefekompatiblen Promotor, einen Replikationsstartpunkt und Terminationssequenzen enthält, ist geeignet.
Außer Mikroorganismen können auch von multizellularen Organismen abgeleitete Zellkulturen als Wirte verwendet werden. Im Prinzip ist jede solche Zellkultur bearbeitbar, unabhängig davon, ob sie von einem Wirbeltier oder einem wirbellosen Tier stammt. Das Interesse für Wirbeltier-Zellen ist jedoch am größten, und die Vermehrung von Wirbeltier-Zellen in einer Kultur (Gewebekultur) ist in den letzten Jahren zu einem Routineverfahren geworden (Kruse and Peterson, 1973). Beispiele solcher nützlichen Wirtszellinien sind AtT-20-, VERO- und HeLa-Zellen, Eierstock-Zellinien des chinesischen Hamsters, und W138-, BHK-, COSM6-, COS-1-, COS-7.293- und MDCK-Zellinien. Die Expressionsvektoren für solche Zellinien umfassen gewöhnlich (wenn notwendig) einen Replikationsstartpunkt, einen stromaufwärts von dem zu exprimierenden Gen gelegenen Promotor, zusammen mit irgendwelchen notwendigen Ribosomebindestellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen, und transkriptionalen Terminatorsequenzen.
Zur Verwendung bei Säugerzellen werden die Steuerfunktionen bei den Expressionsvektoren oft von viralem Material abgeleitet. Zum Beispiel werden gewöhnlich verwendete Promotoren von Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus, und sehr häufig von Simian-Virus 40 (SV40) abgeleitet. Die frühen und späten Promotoren von SV40 sind besonders nützlich, weil beide aus dem Virus als ein Fragment, das auch den viralen SV40- Replikationsstartpunkt enthält, leicht erhalten werden (Fiers et al., 1978). Kleinere oder größere SV40-Fragmente können auch verwendet werden, sofern die ungefähr 250 bp lange Sequenz, die sich von der HindIII-Stelle zu der bei dem viralen Replikationsstartpunkt gelegenen BglI-Stelle hin erstreckt, eingeschlossen ist. Weiterhin ist es auch möglich, und oft wünschenswert, Promotor- oder Steuersequenzen zu verwenden, die normalerweise mit der gewünschten Gensequenz verknüpft sind, sofern solche Steuersequenzen mit den Wirtszellensystemen kompatibel sind.
Ein Replikationsstartpunkt kann bei der Konstruktion des Vektors so vorgesehen werden, daß er einen exogenen Startpunkt umfaßt, wie er von SV40 oder einer anderen viralen Quelle (z. B. Polyoma, Adeno, VSV, BPV, CMV) abgeleitet werden kann, oder er kann durch den chromosomalen Replikationsmechanismus der Wirtszelle vorgesehen werden. Wenn der Vektor in das Wirtszellen-Chromosom integriert wird, ist dies oft ausreichend.
V. Herstellung eines rekombinanten Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptids
Bei noch einer weiteren Ausführungsform wird bei der vorliegenden Erfindung ein Prozeß zur Herstellung eines Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptids betrachtet, der die Schritte aufweist, bei denen Zellen mit einem Polynukleotid transfiziert werden, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert, um transformierte Wirtszellen zu erzeugen; und die transformierten Wirtszellen unter für die Expression des Polypeptids ausreichenden biologischen Bedingungen gehalten werden. Vorzugsweise sind die transformierten Wirtszellen eukaryotische Zellen. Noch besser sind die eukaryotischen Zellen COS- oder BHK-Zellen. In alternativer Weise sind die Wirtszellen prokaryotische Zellen, Noch besser sind die prokaryotischen Zellen Bakterienzellen des DH5α-Stamms von Escherichia coli. Sogar noch besser weist das in die transformierten Zellen transfizierte Polynukleotid die Nukleotidbasensequenz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 auf. Am besten wird die Transfektion mittels eines oben beschriebenen Expressionsvektors ausgeführt.
Eine bei dem Prozeß verwendete Wirtszelle ist fähig, ein funktionales, rekombinantes Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid zu exprimieren. Eine bevorzugte Wirtszelle ist eine Eierstockzelle des chinesischen Hamsters oder eine Nierenzelle des Babyhamsters. Eine Vielfalt von Zellen ist jedoch für einen Prozeß der Erfindung geeignet, zum Beispiel Hefezellen, menschliche Zellinien, und andere eukaryotische Zellinien, die Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind.
Nach der Transfektion wird die Zelle während einer für die Expression eines Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptids ausreichenden Zeitdauer unter Kulturbedingungen gehalten. Die Kulturbedingungen sind auf dem Gebiet gut bekannt, und umfassen die ionische Zusammensetzung und Konzentration, die Temperatur, den pH und dergleichen. Gewöhnlich werden die transfizierten Zellen unter Kulturbedingungen in einem Kulturmedium gehalten. Geeignete Medien für verschiedene Zelltypen sind auf dem Gebiet gut bekannt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Temperatur zwischen ungefähr 20°C und ungefähr 50°C, vorzugsweise zwischen ungefähr 30°C und ungefähr 40°C, und noch besser bei ungefähr 37°C.
Der pH liegt vorzugsweise zwischen ungefähr 6,0 und ungefähr 8,0, noch besser zwischen ungefähr 6,8 und ungefähr 7,8, und am besten bei ungefähr 7,4. Die Osmolalität liegt vorzugsweise zwischen ungefähr 200 milliosmol pro Liter (mosm/l) und ungefähr 400 mosm/l, und noch besser zwischen ungefähr 290 mosm/l und ungefähr 310 mosm/l. Weitere biologische Bedingungen, die für die Transfektion und Expression eines codierten Proteins benötigt werden, sind auf dem Gebiet gut bekannt.
Die transfizierten Zellen werden während einer für die Expression eines Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptids ausreichenden Zeitdauer unter Kulturbedingungen gehalten. Eine geeignete Zeitdauer hängt inter alia von dem verwendeten Zelltyp ab und kann von einem Fachmann leicht bestimmt werden. Gewöhnlich liegt die Zeitdauer zwischen ungefähr 2 und ungefähr 14 Tagen.
Ein rekombinantes Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid wird entweder aus den transfizierten Zellen oder dem Medium, in dem diese Zellen gezüchtet werden, gewonnen. Die Gewinnung umfaßt die Isolierung und die Reinigung des rekombinanten Polypeptids. Die Isolierungs- und Reinigungstechniken für Polypeptide sind auf dem Gebiet gut bekannt, und umfassen Vorgänge wie Ausfällung, Filtration, Chromatographie, Elektrophorese und dergleichen.
VI. Antikörper
Bei noch einer weiteren Ausführungsform werden bei der vorliegenden Erfindung Antikörper verwirklicht, die immunoreaktiv mit einem Polypeptid der vorliegenden Erfindung sind. Vorzugsweise sind die Antikörper der Erfindung monoklonale Antikörper. Noch besser weist das Polypeptid die Aminosäurerestsequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 auf. Die Mittel zum Herstellen und Kennzeichnen der Antikörper sind auf dem Gebiet gut bekannt (siehe z. B. Harlow E. and D. Lane, 1988).
Kurz gesagt, um einen polyklonalen Antikörper herzustellen, wird ein Tier mit einem Immunogen, das ein Polypeptid oder ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung aufweist, immunisiert, und dann werden die Antiseren von diesem immunisierten Tier gewonnen. Für die Erzeugung von Antiseren kann ein großer Bereich von Tierspezies verwendet werden. Gewöhnlich ist das für die Erzeugung von Antiseren verwendete Tier ein Kaninchen, eine Maus, eine Ratte, ein Hamster oder ein Meerschweinchen. Wegen des relativ großen Blutvolumens von Kaninchen wird ein Kaninchen für die Erzeugung von polyklonalen Antikörpern bevorzugt.
Wie auf dem Gebiet gut bekannt ist, kann die Immunogenizität eines bestimmten Polypeptids oder Polynukleotids variieren. Es ist daher oft notwendig, das Immunogen (z. B. ein Polypeptid oder Polynukleotid der vorliegenden Erfindung) mit einem Träger zu koppeln. Typische und bevorzugte Träger sind Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH) und Rinderserumalbumin (BSA). Andere Albumine, wie Ovalbumin, Mausserumalbumin oder Kaninchenserumalbumin können auch als Träger verwendet werden.
Die Mittel zum Konjugieren eines Polypeptids oder eines Polynukleotids mit einem Trägerprotein sind auf dem Gebiet gut bekannt und umfassen Glutaraldehyd, m-Maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimid-ester, Carbodiimid und bis-biazotiertes Benzidin.
Es ist auch gut bekannt auf dem Gebiet, daß die Immunogenizität bei einem bestimmten Immunogen durch die Verwendung von nicht-spezifischen Stimulatoren der Immunreaktion, die als Adjuvanzien bekannt sind, erhöht werden kann. Typische und bevorzugte Adjuvanzien sind das komplette Freund-Adjuvans, das inkomplette Freund-Adjuvans und das Aluminiumhydroxid-Adjuvans.
Die Menge des zur Erzeugung von polyklanalen Antikörpern verwendeten Immunogens variiert inter alia je nach der Art des Immunogens, sowie des für die Immunisierung verwendeten Tieres. Um das Immunogen zu verabreichen, kann eine Vielfalt von Wegen (subkutan, intramuskulär, intradermal, intravenös und intraperitoneal) benutzt werden. Die Erzeugung von polyklonalen Antikörpern wird durch Blutentnahme bei dem immunisierten Tier zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung überwacht. Wenn ein gewünschtes Niveau der Immunogenizität erreicht ist, kann bei dem immunisierten Tier Blut abgenommen werden, und dann kann das Serum isoliert und aufbewahrt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird bei der vorliegenden Erfindung ein Prozeß betrachtet zum Erzeugen eines Antikörpers, der immunoreaktiv mit einem Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid ist, wobei der Prozeß die Schritte aufweist, bei denen (a) rekombinante Wirtszellen mit einem Polynukleotid, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert, transfiziert werden; (b) die Wirtszellen unter für die Expression des Polypeptids ausreichenden Bedingungen gezüchtet werden; (c) das Polypeptid gewonnen wird; und (d) die Antikörper des Polypeptids hergestellt werden. Vorzugsweise wird die Wirtszelle mit dem Polynukleotid von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 transfiziert. Noch besser werden bei der vorliegenden Erfindung gemäß dem oben beschriebenen Prozeß hergestellte Antikörper verwirklicht.
Ein monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung kann mittels gut bekannter Techniken, wie sie im US-Patent 4196265 illustriert sind, leicht hergestellt werden. Gewöhnlich wird bei einer solchen Technik zuerst ein geeignetes Tier mit einem ausgewählten Antigen (z. B. einem Polypeptid oder Polynukleotid der vorliegenden Erfindung) auf eine Weise immunisiert, die genügt, um eine Immunreaktion zu erhalten. Nagetiere, wie Mäuse und Ratten sind bevorzugte Tiere. Milzzellen von dem immunisierten Tier werden dann mit Zellen einer unsterblichen Myelomzelle fusioniert. Wenn das immunisierte Tier eine Maus ist, ist eine bevorzugte Myelomzelle eine murine NS-1-Myelomzelle.
Die fusionierten Milz/Myelom-Zellen werden in einem selektiven Medium gezüchtet, um fusionierte Milz/Myelom-Zellen aus den parentalen Zellen auszuwählen. Die fusionierten Zellen werden von dem Gemisch von nicht-fusionierten parentalen Zellen getrennt, zum Beispiel durch Zugabe von Agenzien, welche die De-novo-Synthese von Nukleotiden in den Gewebekulturmedien blockieren. Typische und bevorzugte Mittel sind Aminopterin, Methotrexat und Azaserin. Aminopterin und Methotrexat blockieren die De-novo-Synthese von sowohl Purinen, als auch Pyrimidinen, während Azaserin nur die Purinsynthese blockiert. Wenn Aminopterin oder Methotrexat verwendet wird, werden Hypoxanthin und Thymidin als eine Nukleotidquelle zu den Medien zugegeben. Wenn Azaserin verwendet wird, wird Hypoxanthin zu den Medien zugegeben.
Bei der Züchtung wird eine Population von Hybridomen erhalten, aus der spezifische Hybridome ausgewählt werden. Um Hybridome auszuwählen, werden die Zellen gewöhnlich durch Einzelklonverdünnung in Mikroliterplatten gezüchtet, und danach werden die einzelnen klonalen Überstände auf Reaktivität mit einem Antigen-Polypeptid getestet. Die ausgewählten Klone werden dann unbegrenzt vermehrt, um den monoklonalen Antikörper zu erhalten.
Bei einem spezifischen Beispiel werden, um einen Antikörper der vorliegenden Erfindung zu erzeugen, Mäusen ungefähr 1–200 μg eines Antigens, das ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung aufweist, intraperitoneal injiziert. Das Wachstum der B-Lymphozyten-Zellen wird stimuliert durch Injizieren des Antigens in Verbindung mit einem Adjuvans, wie dem kompletten Freund-Adjuvans (ein nicht-spezifischer Stimulator der Immunreaktion, der das abgetötete Mycobacterium tuberculosis enthält). Eine gewisse Zeit (z. B. mindestens zwei Wochen) nach der ersten Injektion werden die Mäuse durch Injektion einer zweiten Dosis des Antigens, gemischt mit dem inkompletten Freund-Adjuvans, geboostert.
Einige Wochen nach der zweiten Injektion wird den Mäusen am Schwanz Blut abgenommen, und die Seren werden durch Immunoausfällung gegen radioaktiv markiertes Antigen titriert. Vorzugsweise wird der Booster- und Titrierprozeß wiederholt, bis ein geeigneter Titer erreicht ist. Die Milz der Maus mit dem höchsten Titer wird herausgenommen, und dann werden die Milzlymphozyten durch Homogenisieren der Milz mit einer Spritze gewonnen. Gewöhnlich enthält eine Milz von einer immunisierten Maus ungefähr 5 × 10⁷ bis 2 × 10⁸ Lymphozyten.
Mutanten-Lymphozytzellen, die als Myelomzellen bekannt sind, werden von Labortieren erhalten, bei denen das Wachstum solcher Zellen durch eine Vielfalt von gut bekannten Methoden induziert wurde. Myelomzellen fehlt der rettende Pfad der Nukleotid-Biosynthese. Da Myelomzellen Tumorzellen sind, können sie in einer Gewebekultur unbegrenzt vermehrt werden, und folglich werden sie als unsterblich bezeichnet. Es wurden zahlreiche gezüchtete Zellinien von Myelomzellen von Mäusen und Ratten, wie murine NS-1-Myelomzellen, verwirklicht.
Myelomzellen werden unter Bedingungen, die geeignet sind, die Fusion zu begünstigen, mit den normalen, antikörper-erzeugenden Zellen von der Milz der Maus oder Ratte, denen das Antigen/Polypeptid der vorliegenden Erfindung injiziert wurde, kombiniert. Die Fusionsbedingungen umfassen zum Beispiel die Anwesenheit von Polyäthylenglykol. Die sich ergebenden fusionierten Zellen sind Hybridomzellen. Wie Myelomzellen wachsen Hybridomzellen in einer Kultur unbegrenzt.
Die Hybridomzellen werden von den unfusionierten Myelomzellen durch Züchten in einem Auswahlmedium, wie HAT-Medien (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin) getrennt. Den unfusionierten Myelomzellen fehlen die zum Synthetisieren notwendigen Enzyme von dem rettenden Pfad, weil sie bei Anwesenheit von Aminopterin, Methotrexat oder Azaserin getötet werden. Unfusionierte Lymphozyten wachsen in einer Gewebekultur ebenfalls nicht weiter. Folglich können nur Zellen, die erfolgreich fusioniert haben (Hybridomzellen) in den Selektionsmedien wachsen.
Jede der überlebenden Hybridomzellen erzeugt einen einzigen Antikörper. Diese Zellen werden dann gescreent bezüglich der Erzeugung des spezifischen Antikörpers, der immunoreaktiv mit einem Antigen/Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist. Einzelne Zellhydridome werden durch begrenzende Verdünnungen der Hybridome isoliert. Die Hybridome werden viele Male seriell verdünnt, und nachdem die Verdünnungen wachsen gelassen wurden, wird der Überstand auf die Anwesenheit eines monoklonalen Antikörpers getestet. Die Klone, die diesen Antikörper erzeugen, werden dann in großen Mengen gezüchtet, um einen Antikörper der vorliegenden Erfindung in einer geeigneten Menge zu erzeugen.
Mittels eines monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung können spezifische Polypeptide und Polynukleotide der Erfindung als Antigene erkannt und folglich identifiziert werden. Wenn sie einmal identifiziert sind, können diese Polypeptide und Polynukleotide mittels Techniken, wie die Antikörperaffinitäts-Chromatographie, isoliert und gereinigt werden. Bei der Antikörperaffinitäts-Chromatographie wird ein monoklonaler Antikörper an ein festes Substrat gebunden, und einer Lösung ausgesetzt, die das gewünschte Antigen enthält. Das Antigen wird durch eine immunspezifische Reaktion mit dem gebundenen Antikörper aus der Lösung herausgenommen. Das Polypeptid oder Polynukleotid wird dann leicht von dem Substrat entfernt und gereinigt.
VII. Pharmazeutische Zusammensetzungen
Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden bei der vorliegenden Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen verwirklicht, die ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid und einen physiologisch akzeptablen Träger aufweisen. Noch besser weist eine pharmazeutische Zusammensetzung ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid auf, das die Aminosäurerestsequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 hat. Sogar noch besser weist eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung ein Polynukleotid auf, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid und einen physiologisch akzeptablen Träger codiert. Ebenfalls noch besser weist. eine pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung die Aminosäurerestsequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 auf. In alternativer Weise weist eine pharmazeutische Zusammensetzung die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 auf.
Eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird gewöhnlich parenteral verabreicht, in Dosiseinheit-Formulierungen, die wie gewünscht standardisierte, gut bekannte, nicht-toxische, physiologisch akzeptable Träger, Adjuvanzien und Vehikel enthalten. Der hier verwendete Ausdruck parenteral umfaßt intravenöse, intramuskuläre und intraarterielle Injektions- oder Infusionstechniken.
Injizierbare Präparate, zum Beispiel sterile, Injizierbare, wässerige oder ölige Suspensionen werden gemäß der bekannten Technik unter Verwendung geeigneter Dispersions- oder Netzmittel und suspendierender Mittel formuliert. Das sterile Injizierbare Präparat kann auch eine sterile, Injizierbare Lösung oder Suspension in einem nichttoxischen, parenteral akzeptablen Verdünnungs- oder Lösungsmittel, wie zum Beispiel eine Lösung in 1,3-Butandiol sein.
Unter den akzeptablen Vehikeln und Lösungsmitteln, die verwendet werden können, sind Wasser, Ringer-Lösung und isotonische Natriumchloridlösung. Außerdem werden sterile, gebundene Öle in herkömmlicher Weise als ein Lösungsmittel oder ein suspendierendes Medium verwendet. Zu diesem Zweck kann irgendein mildes, gebundenes Öl verwendet werden, einschließlich synthetischer Mono- oder Diglyzeride. Außerdem finden Fettsäuren, wie Ölsäure, bei der Herstellung von Injektionslösungen Verwendung.
Bevorzugte Träger umfassen neutrale Salzlösungen, die mit Phosphat, Lactat, Tris und dergleichen gepuffert sind. Natürlich wird der Vektor genügend gereinigt, um ihn im wesentlichen frei zu machen von unerwünschten Verunreinigungen, wie schadhafte, störende Adenoviruspartikel, oder Endotoxine und andere Pyrogene, so daß er keine ungünstigen Reaktionen bei dem Individuum, welches das Vektorkonstrukt erhält, verursacht. Ein bevorzugtes Mittel zum Reinigen des Vektors ist die Verwendung von schwimmenden Dichtegradienten, wie die Cäsiumchloridgradient-Zentrifugation.
Ein Träger kann auch ein Liposom sein. Mittel zur Verwendung von Liposomen als Übergabevehikel sind auf dem Gebiet gut bekannt [siehe z. B. Gabizon et al., 1990; Ferruti et al., 1986; und Ranade, V. V., 1989].
Eine transfizierte Zelle kann auch als ein Träger dienen. Beispielsweise kann eine Leberzelle aus einem Organismus herausgenommen werden, und mit einem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung mittels der oben angegebenen Methoden transfiziert werden, und dann kann die transfizierte Zelle in den Organismus zurückgebracht werden (z. B. intravaskulär injiziert werden).
VIII. Ein Prozeß zum Nachweisen des Polynukleotids und der codierten Polypeptide
In alternativer Weise wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Prozeß zum Nachweisen eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung verwirklicht, wobei der Prozeß die Schritte aufweist, bei denen man das Polypeptid einer Immunreaktion mit Antikörpern, die gemäß einem oben beschriebenen Prozeß hergestellt wurden, unterworfen wird, um ein Antikörper-Polypeptid-Konjugat zu bilden, und die Konjugate nachgewiesen werden.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform wird bei der vorliegenden Erfindung ein Prozeß betrachtet zum Nachweisen eines Messenger-RNA-Transkripts, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert, wobei der Prozeß die Schritte aufweist, bei denen (a) das Messenger-RNA-Transkript mit einer Polynukleotidsequenz, die das Polypeptid codiert, hybridisiert wird, um ein Duplex zu bilden; und (b) das Duplex nachgewiesen wird. In alternativer Weise wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Prozeß verwirklicht zum Nachweisen eines DNA-Moleküls, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert, wobei der Prozeß die Schritte aufweist, bei denen (a) die DNA-Moleküle mit einem Polynukleotid, das ein Epsilon-Opioidrezeptor- Polypeptid codiert, hybridisiert werden, um ein Duplex zu bilden; und (b) das Duplex nachgewiesen wird.
IX. Screening-Tests
Gemäß noch einem weiteren Aspekt wird bei der vorliegenden Erfindung ein Prozeß betrachtet zum Screening von Substanzen bezüglich ihrer Fähigkeit, mit einem Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid zu interagieren, wobei der Prozeß die Schritte aufweist, bei denen ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung vorgesehen wird, und die Fähigkeit ausgewählter Substanzen, mit diesem Polypeptid zu interagieren, getestet wird.
Wenn die Methoden und Zusammensetzungen. der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können Screening-Tests zum Testen von Versuchssubstanzen, wie Agonisten und Antagonisten der Epsilon-Opioidrezeptoren, abgeleitet werden. Eine Versuchssubstanz ist eine Substanz, die durch Bindung oder eine andere intramolekulare Wechselwirkung mit einem Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid interagieren kann oder dieses Polypeptid modulieren kann. In manchen Fällen ist eine solche Versuchssubstanz ein Agonist des Rezeptors, und in anderen Fällen kann sie antagonistische Attribute zeigen, wenn sie mit dem Rezeptorpolypeptid interagiert. In anderen Fällen haben solche Substanzen gemischte agonistische und antagonistische Eigenschaften, oder sie können den Rezeptor auf andere Weise modulieren. In alternativer Weise können solche Substanzen die Transkription eines Epsilon-Opioidrezeptors fördern oder hemmen.
Die erfindungsgemäßen Expressionssysteme für rekombinante Rezeptoren haben eindeutige Vorteile gegenüber Gewebe-basierten Systemen. Die Methoden der vorliegenden Erfindung ermöglichen, große Mengen von Epsilon- Opioidrezeptoren für die Verwendung bei Screening-Tests zu erzeugen. Wichtiger ist jedoch die relative Reinheit der gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen Rezeptorpolypeptide. Die Herstellung von relativ reinen Polypeptiden zum Testen einer Protein-Protein-Wechselwirkung ermöglicht, ausweichende Methoden zu verwenden, ohne konkurrierende und unerwünschte Nebenreaktionen heraufzubeschwören.
Systeme für die klonierte Expression, wie diejenigen der vorliegenden Erfindung, sind auch nützlich, wenn es schwierig ist, Gewebe zu erhalten, das einen bestimmten Rezeptor zufriedenstellend exprimiert. Die Kosten sind ein weiterer echter Vorteil, zumindest im Hinblick auf die mikrobiellen Expressionssysteme der vorliegenden Erfindung. Für Antagonisten bei einem primären Screen sind die Mikroorganismen-Expressionssysteme der vorliegenden Erfindung preiswert im Vergleich zu Gewebescreeningmethoden des Standes der Technik.
In herkömmlicher Weise wurden bei Screening-Tests rohe Rezeptorpräparate verwendet. Gewöhnlich waren Tiergewebescheiben, bei denen angenommen wurde, daß sie reich an dem interessierenden Rezeptor sind, die Quelle des Rezeptors. In alternativer Weise homogenisierten die Forscher das Gewebe, und sie verwendeten das rohe Homogenat als eine Rezeptorquelle. Eine große Schwierigkeit bei dieser Methode ist, daß es keine Gewebearten gibt, bei denen nur ein Rezeptortyp exprimiert wird. Die erhaltenen Daten konnten daher nicht eindeutig mit einem bestimmten Rezeptor korreliert werden. Bei der kürzlich durchgeführten Klonierung von Rezeptor-Subtypen und -Sub-Subtypen wird diese Schwierigkeit hervorgehoben. Eine zweite fundamentale Schwierigkeit bei der herkömmlichen Methode ist, daß menschliches Gewebe zum Screening von potentiellen Arzneimitteln nicht verfügbar ist. Bei der herkömlichen Methode wurden beinahe immer tierische Rezeptoren verwendet. Beim Klonieren von menschlichen Rezeptoren besteht ein Bedürfnis nach Screening-Tests, bei denen menschliche Rezeptoren verwendet werden.
Wenn klonierte Rezeptoren verfügbar sind, haben Screening-Systeme mit rekombinanten Rezeptoren mehrere Vorteile gegenüber auf Gewebe basierenden Systemen. Ein großer Vorteil ist, daß der Forscher nun den Rezeptortyp, der bei einem Screening-Test verwendet wird, steuern kann. Spezifische Rezeptor-Subtypen und -Sub-Subtypen können in bevorzugter Weise exprimiert werden, und ihre Wechselwirkung mit einem Liganden kann identifiziert werden. Weitere Vorteile sind die Verfügbarkeit großer Mengen des Rezeptors, die Verfügbarkeit von seltenen Rezeptoren, die vorher bei Gewebeproben nicht verfügbar waren, und die Einsparung der mit der Haltung von lebenden Tieren verbundenen Kosten.
Die Screening-Tests der vorliegenden Erfindung umfassen im allgemeinen die Bestimmung der Fähigkeit einer Versuchssubstanz, sich an den Rezeptor zu binden und die Aktivität des Rezeptors zu beeinflussen, wie zum Beispiel das Screening von Versuchssubstanzen, um diejenigen zu identifizieren, die die Funktion des Rezeptors hemmen oder auf andere Weise modifizieren. Gewöhnlich umfaßt diese Methode die Herstellung von rekombinantem Rezeptorpolypeptid, und das anschließende Testen des rekombinanten Polypeptids; oder der Zellen, die das Polypeptid exprimieren, mit einer Versuchssubstanz, um die Fähigkeit der Substanz, seine physiologische Funktion zu beeinflussen, zu bestimmen. Bei bevorzugten Ausführungsformen bezieht sich die Erfindung auf das Screening von Versuchssubstanzen, um diejengen zu identifizieren, die die enzymatische Aktivität des menschlichen Rezeptors beeinflussen, und folglich für die Verwendung bei Menschen geeignet sein können.
Wie auf dem Gebiet gut bekannt ist, wird bei einem Screening-Test ein Rezeptor unter Bedingungen, die für die Bindung eines Wirkstoffes an den Rezeptor geeignet sind, vorgesehen. Diese Bedingungen umfassen, aber sind nicht begrenzt auf, den pH, die Temperatur, die Tonizität, die Anwesenheit von wichtigen Cofaktoren, und wichtige Modifikationen bei dem Polypeptid, wie Glykosylierung oder Prenylierung. Es wird angenommen, daß der Rezeptor in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle exprimiert und verwendet werden kann. Die Wirtszelle, die den Rezeptor exprimiert, kann als Ganzes verwendet werden, oder der Rezeptor kann aus der Wirtszelle isoliert werden. Der Rezeptor kann in der Membran der Wirtszelle membran-gebunden sein, oder er kann in dem Zytosol der Wirtszelle frei. sein. Die Wirtszelle kann auch in subzellulare Fraktionen fraktioniert sein, wo der Rezeptor gefunden werden kann. Zum Beispiel können Zellen, die den Rezeptor exprimieren, in den Kern, das endoplasmatische Retikulum, die Vesikel, oder die Membranoberflächen der Zelle fraktioniert werden.
Der pH liegt vorzugsweise zwischen ungefähr 6,0 und ungefähr 8,0, noch besser zwischen ungefähr 6,8 und ungefähr 7,8, und am besten bei ungefähr 7,4. Bei einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Temperatur zwischen ungefähr 20°C und ungefähr 50°C, vorzugsweise zwischen ungefähr 30°C und ungefähr 40°C, und noch besser bei ungefähr 37°C. Die Osmolalität liegt vorzugsweise zwischen ungefähr 5 milliosmol pro Liter (mosm/l) und ungefähr 400 mosm/l, und noch besser zwischen ungefähr 200 milliosmol pro Liter und ungefähr 400 mosm/l, und sogar noch besser zwischen ungefähr 290 mosm/l und ungefähr 310 mosm/l. Die Anwesenheit von Cofaktoren kann zum einwandfreien Funktionieren des Rezeptors erforderlich sein. Typische Cofaktoren sind Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium und Chlorid. Außerdem können kleine Nicht-Peptid-Moleküle, die als prosthetische Gruppen bekannt sind, erforderlich sein. Weitere biologische Bedingungen, die für die Rezeptorfunktion benötigt werden, sind auf dem Gebiet gut bekannt.
Es ist auf dem Gebiet gut bekannt, daß Proteine in künstlichen Membranen, Vesikeln oder Lipasomen rekonstituiert werden können (Danboldt et al., 1990). Bei der vorliegenden Erfindung wird angenommen, daß der Rezeptor in künstliche Membranen, Vesikel oder Lipsomen eingebaut werden kann. Der rekonstituierte Rezeptor kann bei Screening-Tests verwendet werden.
Weiterhin wird angenommen, daß der Rezeptor der vorliegenden Erfindung an eine feste Unterlage angekoppelt werden kann. Die feste Unterlage kann aus Agarose-Kügelchen, Polyacrylamid-Kügelchen, Polyacryl-Kügelchen oder anderen festen Matrizen, die an Proteine angekoppelt werden können, bestehen. Gut bekannte Kopplungsmittel sind Cyanogenbromid, Carbonyldiimidazol, Tosylchlorid und Glutaraldehyd.
Weiterhin wird angenommen, daß sekundäre Polypeptide, die in Verbindung mit dem Rezeptor der vorliegenden Erfindung wirken können, vorgesehen werden können. Zum Beispiel übt der Rezeptor der vorliegenden Erfindung seine physiologischen Wirkungen in Verbindung mit einem G-Protein und einem Effektor-Polypeptid aus.
Bei einem typischen Screening-Test zum Identifizieren von Versuchssubstanzen wird der gleiche rekombinante Expressionswirt als die Ausgangsquelle für die Gewinnung des Rezeptorpolypeptids verwendet, das im allgemeinen in der Form eines rohen Homogenats hergestellt wird. Rekombinante Zellen, die den Rezeptor exprimieren, werden gewaschen und homogenisiert, um ein rohes Polypeptid-Homogenat in einem wünschenswerten Puffer, wie er hier angegeben ist, herzustellen. Bei einem typischen Test wird eine gewisse Menge Polypeptid von dem Zellhomogenat in ein kleines Volumen eines geeigneten Testpuffers mit einem geeigneten pH gegeben. Die Versuchssubstanzen, wie Agonisten und Antagonisten, werden in geeigneten Konzentrationen zu dem Gemisch hinzugefügt, und die Wechselwirkung zwischen der Versuchssubstanz und dem Rezeptorpolypeptid wird überwacht.
Wenn man ein geeignetes bekanntes Substrat für den Rezeptor verwendet, kann man auf die vorstehende Weise eine Basislinien-Aktivität für den auf rekombinante Weise erzeugten Rezeptor erhalten. Um auf Inhibitoren oder Modifizierer der Rezeptorfunktion zu testen, kann man dann eine Versuchssubstanz, deren Wirkung auf den Rezeptor unbekannt ist, zu der Mischung zugeben. Durch Vergleichen der Reaktionen, die bei Anwesenheit oder Abwesenheit der Versuchssubstanz erfolgen, kann man dann Information über die Wirkung der Versuchssubstanz auf die normale Funktion des Rezeptors erhalten.
Demgemäß wird beabsichtigt, daß dieser Aspekts der vorliegenden Erfindung den Fachleuten auf dem Gebiet Methoden zur Identifizierung von Versuchssubstanzen gibt, die die Fähigkeit haben, die Wirksamkeit von Opioidrezeptor-Polypeptiden auf eine oder mehr Arten zu modifizieren.
Bei einer Ausführungsform wird ein Test entworfen, um die Versuchssubstanzen herauszufinden, die die wünschenswerten, aber nicht die unerwünschten Eigenschaften von Opioiden haben. Bei einer weiteren Ausführungsform werden Screening-Tests zum Testen von Versuchssubstanzen, wie Agonisten und Antagonisten von Epsilon-Opioidrezeptoren, verwendet, um solche Versuchssubstanzen zu identifizieren, die die selektive Fähigkeit haben, mit einem oder mehr der Opioidrezeptor-Polypeptide zu interagieren, wobei diese Polypeptide jedoch keine wesentlich überlappende Aktivität mit anderen Opioidrezeptoren haben.
Außerdem werden Screening-Tests zum Testen von Versuchssubstanzen entworfen, um die Erforschung von Strukturaktivitätsbeziehungen von Opioiden mit den Epsilon-Rezeptoren zu ermöglichen, z. B. die Untersuchung der Bindung von natürlich vorkommenden Hormonen oder anderen Substanzen, die fähig sind, mit dem Epsilon-Rezeptor zu interagieren oder diesen Rezeptor auf andere Weise zu modulieren, in Abhängigkeit von Untersuchungen der Aktivität, die durch die Bindung solcher Moleküle an den Epsilon-Rezeptor verursacht wird. Bei gewissen Ausführungsformen werden die Polypeptide der Erfindung kristallisiert, um kristallographische Röntgenuntersuchungen als ein Mittel zum Beurteilen der Wechselwirkungen von Versuchssubstanzen oder anderen Molekülen mit dem Opioidrezeptor-Polypeptid. Zum Beispiel sind die gereinigten, rekombinanten Polypeptide der Erfindung, wenn sie in einer geeigneten Form kristallisiert sind, geeignet für den Nachweis von intramolekularen Wechselwirkungen durch Röntgenstrahlen-Kristallographie.
Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines auf rekombinante Weise erzeugten Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptids bei Screening-Tests zur Identifizierung von Substanzen, die die Funktion des Rezeptors hemmen oder auf andere Weise modifizieren oder verändern können. Die Verwendung eines auf rekombinante Weise erzeugten Rezeptors ist von besonderem Nutzen, weil der natürlich vorkommende Rezeptor nur in kleinen Mengen vorhanden ist und sich als schwierig zu reinigen erwiesen hat. Außerdem ergibt dies eine einfache Rezeptorquelle, die bisher nicht verfügbar war.
Wie oben beschrieben wurde, können Rezeptoren bei Anwesenheit von Agonisten ihre physiologischen Wirkungen über ein sekundäres Molekül ausüben. Bei einem Screening-Test der Erfindung wird bei bevorzugten Ausführungsformen in einfacher Weise ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid. direkt aus dem rekombinanten Wirt, in dem es erzeugt wird, verwendet. Dies wird am besten dadurch erreicht, daß das ausgewählte Polypeptid einfach innerhalb des rekombinanten Wirtes, gewöhnlich eines eukaryotischen Wirtes, exprimiert wird, wonach ein rohes Homogenat hergestellt wird, das das Polypeptid enthält. Ein Teil des rohen Homogenats wird dann zusammen mit der zu testenden Versuchssubstanz einem geeigneten Effektor des Epsilon-Rezeptors zugemischt. Durch Vergleichen der Bindung des ausgewählten Effektors an den Rezeptor bei Anwesenheit oder Abwesenheit der Versuchssubstanz kann man Information über die physiologischen Eigenschaften der Versuchssubstanz erhalten.
Der Rezeptor kann in einer prokaryotischen oder einer eukaryotischen Zelle exprimiert werden. Rezeptoren wurden in E. coli (Bertin et al., 1992), in Hefe (King et al., 1990) und in Säugerzellen (Bouvier et al., 1988) exprimiert.
Eine Zelle, die einen Rezeptor exprimiert, kann als Ganzes verwendet werden, um Wirkstoffe zu screenen. Zum Beispiel können die Zellen, die den Rezeptor der vorliegenden Erfindung exprimieren, einem radioaktiv markierten Wirkstoff ausgesetzt werden, und dann kann die Stärke der Bindung des radiaktiv markierten Wirkstoffes an die Zelle bestimmt werden.
Die Zelle, die den Rezeptor exprimiert, kann zu subzellularen Komponenten, die den Rezeptor der vorliegenden Erfindung enthalten, fraktioniert werden. Methoden zum Reinigen von subzellularen Fraktionen sind auf dem Gebiet gut bekannt. Subzellulare Fraktionen umfassen, aber sind nicht begrenzt auf, das Zytoplasma, die Zellmembran, andere membranartige Fraktionen, wie das endoplasmatische Retikulum, Golgi-Körperchen, Vesikel und den Kern. Als subzellulare Fraktionen isolierte Rezeptoren können mit Zellmembranen kombiniert werden. Wenn zum Beispiel Zellmembranvesikel aus der Zelle, die den Rezeptor exprimiert, isoliert werden, kann das Rezeptormolekül membran-gebunden sein. Weiterhin wird angenommen, daß der Rezeptor der vorliegenden Erfindung von einer Zelle, die den Rezeptor exprimiert, gereinigt werden kann. Methoden zur Reinigung sind auf dem Gebiet gut bekannt. Der gereinigte Rezeptor kann bei Screening-Tests verwendet werden.
Da die meisten solchen Screening-Tests entworfen sind, um Wirkstoffe zu identifizieren, die beim Nachahmen der wünschenswerten Aspekte von Opioiden nützlich sind, während die unerwüschten Aspekte des Hormons eliminiert werden, werden bei bevorzugten Tests Opioide als der normale Agonist verwendet.
Es wird angenommen, daß es eine große Vielfalt von Ausführungsformen gibt, die verwendet werden können, um die Wirkung der Versuchssubstanz auf ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid der Erfindung zu bestimmen, und die Erfindung soll nicht auf irgendeine solche Methode begrenzt sein. Es ist jedoch im allgemeinen wünschenswert, ein System zu verwenden, bei dem man die Fähigkeit des Rezeptorpolypeptids, sich bei Anwesenheit einer bestimmten Substanz an den verwendeten Effektor zu binden, oder durch diesen Effektor modifiziert zu werden, messen kann.
Der Nachweis einer Wechselwirkung zwischen einem Wirkstoff und einem Rezeptor kann durch auf dem Gebiet gut bekannte Techniken erbracht werden. Diese Techniken umfassen, aber sind nicht begrenzt auf, Zentrifugation, Chromatographie, Elektrophorese und Spektroskopie. Die Verwendung von durch Isotope markierten Reagenzien in Verbindung mit diesen Techniken oder allein wird auch betrachtet. Gewöhnlich verwendete radioaktive Isotope sind ³H, ¹⁴C, ²²Na, ³²P, ³⁵S, ⁴⁵Ca, ⁶⁰Co, ¹²⁵I und ¹³¹I. Gewöhnlich verwendete stabile Isotope sind ²H, ¹³C, ¹⁵N, ¹⁸O.
Wenn zum Beispiel ein Wirkstoff sich an den Rezeptor der vorliegenden Erfindung binden kann, kann die Bindung mittels eines radioaktiv markierten Wirkstoffs oder eines radiaoktiv markierten Rezeptors nachgewiesen werden. Kurz gesagt, wenn ein radioaktiv markierter Wirkstoff oder ein radioaktiv markierter Rezeptor verwendet wird, kann der Wirkstoff-Rezeptor-Komplex durch Flüssigkeitsszintillation oder durch Belichtung von Röntgenfilm nachgewiesen werden.
Wenn ein Wirkstoff den Rezeptor modifiziert, kann der modifizierte Rezeptor auch durch Unterschiede bei der Mobilität zwischen dem modifizierten Rezeptor und dem unmodifizierten Rezeptor mittels Chromatographie, Elektrophorese oder Zentrifugation nachgewiesen werden. Wenn die verwendete Technik die Zentrifugation ist, sind die Unterschiede bei der Mobilität als der Sedimentationskoeffizient bekannt. Die Modifikation kann auch durch Unterschiede zwischen den spektroskopischen Eigenschaften des modifizierten und unmodifizierten Rezeptors nachgewiesen werden. Wenn als spezifisches Beispiel ein Wirkstoff einen Rezeptor auf kovalente Weise modifiziert, kann der Unterschied bei den Verweilzeiten zwischen dem modifizierten und dem unmodifizierten Rezeptor bei einer Hochdruck-Flüssigchromatographiesäule leicht nachgewiesen werden.
Wenn als spezifisches Beispiel ein Wirkstoff einen Rezeptor auf kovalente Weise modifiziert, können die spektroskopischen Unterschiede zwischen dem modifizierten und dem unmodifizierten Rezeptor bei den Spektren der magnetischen Kernresonanz nachgewiesen werden. In alternativer Weise kann man sich auf den Wirkstoff konzentrieren und die Unterschiede bei den spektroskopischen Eigenschaften oder den Unterschied bei der Mobilität zwischen dem freien Wirkstoff und dem Wirkstoff nach Modifikation des Rezeptors nachweisen.
Wenn ein sekundäres Polypeptid vorgesehen ist, kann der Wirkstoff-Rezeptor-sekundäres Polypeptid-Komplex oder der Rezeptor-sekundäres Polypeptid-Komplex nachgewiesen werden. Unterschiede bei der Mobilität oder Unterschiede bei spektroskopischen Eigenschaften, wie oben beschrieben, können nachgewiesen werden.
Es wird weiterhin angenommen, daß, wenn ein sekundäres Polypeptid vorgesehen ist, die enzymatische Aktivität des Effektorpolypeptids nachgewiesen werden kann. Zum Beispiel üben viele Rezeptoren physiologische Wirkungen durch die Stimulation oder Hemmung von Adenylylcyclase aus. Die enzymatische Aktivität von Adenylylcyclase bei Anwesenheit eines Wirkstoffs kann nachgewiesen werden.
Die Wechselwirkung eines Wirkstoffs und eines Rezeptors kann nachgewiesen werden, wenn ein Reporter-Gen vorgesehen wird. Gut bekannte Reporter-Gene sind β-Galactosidase (β-Gal), Chloramphenicoltransferase (CAT) und Luciferase. Das Reporter-Gen wird durch den Wirt exprimiert, und die enzymatische Reaktion des Reportergenprodukts kann nachgewiesen werden.
Bei bevorzugten Tests wird ein Gemisch, das das Polypeptid, den Effektor und die Versuchssubstanz enthält, während einer ausgewählten Zeitdauer inkubiert, und das sich ergebende inkubierte Gemisch wird einem Trennungsmittel unterworfen, um den in dem Gemisch verbliebenen, ungebundenen Effektor von einem so erzeugten Effektor/Rezeptor-Komplex zu trennen. Dann mißt man einfach die Menge jedes Bestandteils (z. B. im Vergleich zu einer Kontrollprobe, zu der keine Versuchssubstanz hinzugefügt wurde). Diese Messung kann zu verschiedenen Zeitpunkten gemacht werden, bei denen Geschwindigkeitsdaten gewünscht werden. Daraus kann man die Fähigkeit der Versuchssubstanz, die Funktion des Rezeptors zu verändern oder zu modifizieren, bestimmen.
Es sind zahlreiche Techniken bekannt, um den Effektor von dem Effektor/Rezeptor-Komplex zu trennen, und alle diese Methoden sollen in den Geltungsbereich der Erfindung fallen. Dünnschichtchromatographie, Hochdruck-Flüssigchromatographie, sowie spektrophotometrische, gaschromatographische/massenspektrophotometrische Analysen oder Kernresonanzanalysen können verwendet werden. Es wird angenommen, daß irgendeine solche Technik verwendet werden kann, solange sie fähig ist, zwischen dem Effektor und dem Komplex zu unterscheiden, und verwendet werden kann, um die enzymatische Funktion zu bestimmen, zum Beispiel durch Identifizierung oder quantitative Bestimmung des Substrats und des Produkts.
Der Effektor/Rezeptor-Komplex selbst kann auch der Gegenstand von Techniken, wie der Röntgenstrahlen-Kristallographie sein. Wenn eine Versuchssubstanz das Opioidmolekül hinsichtlich der Wirkungsweise des Arzneimittels ersetzt, sind Untersuchungen zur Überwachung der Ersetzung und ihrer Wirkung auf den Rezeptor von besonderem Nutzen.
A. Screening-Tests für Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptide
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Prozeß zum Screening einer biologischen Probe bezüglich der Anwesenheit eines Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptids verwirklicht. Eine zu screenende biologische Probe kann ein biologisches Fluid, wie ein extrazellulares oder intrazellulares Fluid, oder ein Zell- oder Gewebeextrakt oder – homogenat sein. Eine biologische Probe kann auch eine isolierte Zelle (z. B. in einer Kultur) oder eine Ansammlung von Zellen, wie bei einer Gewebeprobe oder Histologieprobe sein. Eine Gewebeprobe kann in einem flüssigen Medium suspendiert sein, oder auf einer festen Unterlage, wie einem Objektträger, fixiert sein.
Gemäß einem Screeningtest-Prozeß wird eine biologische Probe einem Antikörper ausgesetzt, der immunoreaktiv ist mit dem Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid, dessen Anwesenheit getestet wird. Gewöhnlich wird die Exposition ausgeführt durch Bildung einer Mischung in einem flüssigen Medium, die sowohl den Antikörper, als auch das Versuchs-Opioidrezeptor-Polypeptid enthält. Entweder der Antikörper oder die Probe mit dem Opioidrezeptor-Polypeptid kann auf einer festen Unterlage (z. B. einer Säule oder einer Mikroliterplatte) fixiert werden.
Die biologische Probe wird dem Antikörper unter biologischen Reaktionsbedingungen und während einer für die Antikörper-Polypeptid-Konjugat-Bildung ausreichenden Zeitdauer ausgesetzt. Die biologischen Reaktionsbedingungen umfassen die ionische Zusammensetzung und Konzentration, die Temperatur, den pH und dergleichen.
Die ionische Zusammensetzung und Konzentration können zwischen denjenigen von destilliertem Wasser und einer 2-molalen NaCl-Lösung liegen. Vorzugsweise liegt die Osmolalität zwischen ungefähr 100 mosmol/l und ungefähr 400 mosmol/l, und noch besser zwischen ungefähr 200 mosmol/l und ungefähr 300 mosmol/l. Die Temperatur liegt vorzugsweise zwischen ungefähr 4°C und ungefähr 100°C, noch besser zwischen ungefähr 15°C und ungefähr 50°C, und sogar noch besser zwischen ungefähr 25°C und ungefähr 40°C. Der pH liegt vorzugsweise zwischen ungefähr 4,0 und ungefähr 9,0, noch besser zwischen ungefähr 6,5 und ungefähr 8,5, und sogar noch besser zwischen ungefähr 7,0 und 7,5. Die einzige Grenze bei den biologischen Reaktionsbedingungen ist, daß die ausgewählten Bedingungen die Antikörper-Polypeptid-Konjugat-Bildung ermöglichen, und daß die Bedingungen weder den Antikörper, noch das Opioidrezeptor-Polypeptid nachteilig beeinflussen.
Die Expositionszeit variiert inter alia mit den verwendeten biologischen Bedingungen, der Konzentration des Antikörpers und des Polypeptids, und der Art der Probe (z. B. fluide Probe oder Gewebeprobe). Die Mittel zum Bestimmen der Expositionszeit sind einem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt. Wenn die Probe fluid ist und die Konzentration des Polypeptids in dieser Probe ungefähr 10^–10 M ist, liegt die Expositionszeit gewöhnlich zwischen ungefähr 10 Minuten und ungefähr 200 Minuten.
Die Anwesenheit von Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid in der Probe wird durch Nachweisen der Bildung und Anwesenheit von Antikörper-Epsilonopioidrezeptorpolypeptid-Konjugaten nachgewiesen. Die Mittel zum Nachweisen solcher Antikörper-Antigen (z. B. Rezeptorpolypeptid)-Konjugate oder -Komplexe sind auf dem Gebiet gut bekannt und umfassen Verfahren wie Zentrifugation, Affinitätschromatographie und dergleichen, und Binden eines sekundären Antikörpers an den Antikörper-Versuchsrezeptor-Komplex.
Bei einer Ausführungsform erfolgt der Nachweis durch Nachweisen eines an dem Antikörper fixierten Indikators. Typische und gut bekannte Indikatoren sind radioaktive Isotope (z. B. ³²P, ¹²⁵I, ¹⁴C), ein zweiter Antikörper, oder ein Enzym, wie Meerrettich-Peroxidase. Die Mittel zum Fixieren von Indikatoren an Antikörpern sind auf dem Gebiet gut bekannt. Kommerzielle Ausrüstungen sind erhältlich.
B. Screening-Test für den Anti-Epsilonopioidrezeptor-Antikörper
Gemäß einem weiteren Aspekt wird bei der vorliegenden Erfindung ein Prozeß verwirklicht, zum Screening einer biologischen Probe bezüglich der Anwesenheit von Antikörpern, die immunoreaktiv mit einem Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid (d. h. einem Anti-Epsilonopioidrezeptor-Antikörper) sind. Gemäß einem solchen Prozeß wird eine biologische Probe unter biologischen Bedingungen und während einer für die Antikörper-Polypeptid-Konjugatbildung ausreichenden Zeitdauer einem Opioidrezeptor-Polypeptid ausgesetzt, und die gebildeten Konjugate werden nachgewiesen.
C. Screening-Test für ein Polynukleotid, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert
Ein DNA-Molekül und besonders ein Sondenmolekül können zum Hybridisieren als Oligonukleotidsonden an eine DNA-Quelle verwendet werden, bei der vermutet wird, daß sie ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codierendes Polynukleotid oder Gen besitzt. Das Sondieren wird gewöhnlich ausgeführt durch Hybridisieren des Oligonukleotids an eine DNA-Quelle, bei der vermutet wird, daß sie ein solches Rezeptor-Gen besitzt. In einigen Fällen stellen die Sonden nur eine einzige Sonde dar, und in anderen Fällen stellen die Sonden ein Gruppe von Sonden dar, die auf einer gewissen Aminosäuresequenz oder Sequenzen des Opioidrezeptor-Polypeptids basieren, und in ihrer Verschiedenheit die mit dem genetischen Code verbundene Redundanz erklären.
Eine geeignete DNA-Quelle, um auf diese Weise zu sondieren, kann Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptide exprimieren, und eine genomische Bibliothek einer interessierenden Zellinie sein. In alternativer Weise kann eine DNA-Quelle die gesamte DNA von der interessierenden Zellinie umfassen. Wenn mit dem Hybridisierungsprozeß der Erfindung ein Versuchs-DNA-Segment einmal identifiziert wurde, bestätigt man durch weitere Hybridisierung, Restriktionsenzym-Kartieren, Sequenzieren und/oder Exprimieren und Testen, daß ein positiver Klon erhalten wurde.
In alternativer Weise können solche DNA-Moleküle bei einer gewissen Anzahl von Techniken verwendet werden, einschließlich ihrer Verwendung als: (1) diagnostische Hilfsmittel, um normale und anormale DNA-Sequenzen in DNA, die von den Zellen eines Patienten abgeleitet wurde, nachzuweisen; (2) Mittel zum Nachweisen und Isolieren weiterer Mitglieder der Opioidrezeptorfamilie und verwandter Polypeptide aus einer DNA-Bibliothek, die möglicherweise solche Sequenzen enthält; (3) Primer zum Hybridisieren an verwandte Sequenzen zum Zwecke der Amplifizierung dieser Sequenzen; (4) Primer zum Verändern der nativen Opioidrezeptor-DNA-Sequenzen; sowie bei anderen Techniken, die auf der Ähnlichkeit der DNA-Sequenzen mit denjenigen der hier beschriebenen Opioidrezeptor-DNA-Segmente beruhen.
Wie oben dargelegt wurde, ermöglicht die durch die Erfindung gelieferte DNA-Sequenz-Information bei gewissen Aspekten die Herstellung von relativ kurzen DNA (oder RNA)-Sequenzen (z. B. Sonden), die in spezifischer Weise an codierende Sequenzen des ausgewählten Opioidrezeptor-Gens hybridisieren. Bei diesen Aspekten werden Nukleinsäuresonden von geeigneter Länge hergestellt, die auf einer Überlegung bezüglich der ausgewählten Opioidrezeptorsequenz basiert (z. B. einer Sequenz, wie sie in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3) wiedergegeben ist. Die Fähigkeit solcher Nukleinsäuresonden, in spezifischer Weise an epsilon- opioidrezeptor-codierende Sequenzen zu hybridisieren, macht sie bei einer Vielfalt von Ausführungsformen besonders nützlich. Sehr wichtig ist, daß die Proben bei einer Vielfalt von Tests zum Nachweisen der Anwesenheit von komplementären Sequenzen bei einer bestimmten Probe verwendet werden können. Es sind jedoch Verwendungen beabsichtigt, einschließlich der Verwendung von Sequenzinformation für die Herstellung von Mutantenspezies-Primern, oder Primern für die Verwendung beim Herstellen anderer genetischer Konstruktionen.
Um gewisse Vorteile gemäß der Erfindung zu bieten, umfaßt eine bevorzugte Nukleinsäuresequenz, die für Hybridisierungsuntersuchungen oder -tests verwendet wird, Sondensequenzen, die komplementär zu einem mindestens 14 bis 40 Nukleotide langen Abschnitt der epsilon-opioidrezeptor-codierenden Sequenz, wie der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 wiedergegebenen ist. Eine Größe von mindestens 14 Nukleotiden in der Länge trägt dazu bei, sicherzustellen, daß das Fragment eine genügende Länge hat, um ein Duplexmolekül zu bilden, das sowohl stabil, als auch selektiv ist. Die Moleküle, die komplementäre Sequenzen über Abschnitte mit mehr als 14 Basen in der Länge haben, werden jedoch im allgemeinen bevorzugt, um die Stabilität und die Selektivität des Hybrids zu erhöhen, und dadurch die Qualität und den Selektivitätsgrad der erhaltenen spezifischen Hybridmoleküle zu verbessern. Im allgemeinen wird bevorzugt, Nukleinsäuremoleküle zu entwerfen, die gen-komplementäre Abschnitte mit 14 bis 20 Nukleotiden haben, oder sogar noch länger sind, wenn dies gewünscht wird. Solche Fragmente können leicht hergestellt werden, zum Beispiel durch direkte Synthese des Fragments mit chemischen Mitteln, durch Anwendung einer Nukleinsäure-Reproduktionstechnologie, wie der PCR-Technologie des US-Patents 4603102, oder durch Einführen ausgewählter Sequenzen in rekombinante Vektoren für die rekombinante Erzeugung.
Demgemäß kann eine Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung wegen seiner Fähigkeit, in selektiver Weise Duplexmoleküle mit komplementären Abschnitten des Gens zu bilden, verwendet werden. Je nach der beabsichtigten Anwendung werden verschiedene Hybridisierungsbedingungen verwendet, um verschiedene Selektivitätsgrade der Sonde bezüglich der Zielsequenz zu erhalten. Für Anwendungen, die einen hohen Selektivitätsgrad erfordern, werden gewöhnlich relativ strenge Bedingungen verwendet, um die Hybride zu bilden. Zum Beispiel wählt man Bedingungen mit relativ niedrigem Salzgehalt und/oder hoher Temperatur aus, wie sie bei 0,02 M–0,15 M NaCl bei Temperaturen von 50°C bis 70°C gegeben sind. Solche Bedingungen sind besonders selektiv und tolerieren wenig oder gar keinen Mismatch zwischen der Sonde und der Matrize oder dem Zielstrang.
Für einige Anwendungen, zum Beispiel, wenn man wünscht, Mutanten unter Verwendung eines an eine darunter liegende Matrize hybridisierten Mutantenprimerstrangs herzustellen, oder wenn man versucht, opioidrezeptor-codierende Sequenzen von verwandten Spezies, funktionalen Äquivalenten oder dergleichen zu isolieren, werden natürlich gewöhnlich weniger strenge Hybridisierungsbedingungen benötigt, um die Bildung des Heteroduplex zu ermöglichen. Unter solchen Umständen verwendet man Bedingungen, wie 0,15 M–0,9 M Salzgehalt bei Temperaturen zwischen 20°C und 70°C. Kreuzhybridisierende Spezies können dadurch leicht als positiv hybridisierende Signale bezüglich Kontrollhybridisierungen identifiziert werden. In jedem Fall wird im allgemeinen klar erkannt, daß die Bedingungen durch die Zugabe von zunehmenden Mengen Formamid strenger gemacht werden können, welches dazu dient, das Hybridduplex auf die gleiche Weise wie eine erhöhte Temperatur zu destabilisieren. Folglich können die Hybridisierungsbedingungen leicht manipuliert werden, und folglich wird dies im allgemeinen eine Methode der Wahl sein, je nach den gewünschten Ergebnissen.
Bei gewissen Ausführungsformen ist es vorteilhaft, eine Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem geeigneten Mittel, wie einem Marke r, zu verwenden, um Hybridisierung nachzuweisen. Eine große Vielfalt von geeigneten Indikatormitteln ist auf diesem Gebiet bekannt, einschließlich radioaktiver, enzymatischer oder anderer Liganden, wie Avidin/Biotin, die fähig sind, ein nachweisbares Signal zu geben. Bei bevorzugten Ausführungsformen verwendet man voraussichtlich einen Enzymmarker, wie Urease, alkalische Phosphatase, oder Peroxidase, anstelle von radioaktiven oder anderen hinsichtlich der Umweltverschmutzung unerwünschten Reagenzien. Für den Fall von Enzymmarkern sind kalorische Indikatorsubstrate bekannt, die verwendet werden können, um ein Mittel zu erzeugen, das für das menschliche Auge oder spektrophotometrisch sichtbar ist, um eine spezifische Hybridisierung mit komplementären, Nukleinsäure enthaltenden Proben zu identifizieren.
Im allgemeinen wird angenommen, daß die hier beschriebenen Hybridisierungssonden sowohl als Reagenzien bei der Lösungshybridisierung, als auch bei Ausführungsformen, bei denen eine feste Phase verwendet wird, nützlich sind. Bei Ausführungsformen, die eine feste Phase umfassen, wird die Test-DNA (oder Test-RNA) enthaltende Probe auf einer ausgewählten Matrize oder Oberfläche adsorbiert oder auf andere Weise fixiert. Diese fixierte, einzelsträngige Nukleinsäure wird dann einer spezifischen Hybridisierung mit ausgewählten Sonden unter gewünschten Bedingungen unterworfen. Die ausgewählten Bedingungen hängen inter alia von den auf den erforderlichen speziellen Kriterien basierenden, besonderen Umständen ab (zum Beispiel von dem G + C-Gehalt, dem Typ der Ziel-Nukleinsäure, der Quelle der Nukleinsäure, der Größe der Hybridisierungssonde, usw.). Nach dem Waschen der hybridisierten Oberfläche, um nicht-spezifisch gebundene Sondenmoleküle zu entfernen, wird die spezifische Hybridisierung mittels des Markers nachgewiesen, oder sogar quantitativ bestimmt.
D. Screening bezüglich Agonisten und Antagonisten
Epsilon-Rezeptoren sind einer der hauptsächlichen Subtypen der Opioidrezeptoren. Daher sind hochselektive Epsilon-Opioidrezeptor-Agonisten klinisch nützlich.
Die Entwicklung von hochselektiven, klinisch nützlichen Epsilon-Opioidrezeptor-Agonisten wird erleichtert, wenn man die für die Agonistbindung notwendigen, spezifischen Stellen innerhalb des Epsilon-Rezeptors versteht. Das vor kurzem ausgeführte Klonieren der Epsilon-Opioidrezeptor-cDNA hat die Möglichkeit geschaffen, die strukturellen Bereiche dieses Rezeptorsubtyps, die seine Funktionsweise bewirken, zu untersuchen.
X. Testausrüstungen
Bei einem anderen Aspekt werden bei der vorliegenden Erfindung diagnostische Testausrüstungen zum Nachweisen der Anwesenheit von Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptiden in biologischen Proben betrachtet, wobei die Testausrüstungen einen ersten Behälter aufweisen, der einen ersten Antikörper enthält, der mit Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptiden eine Immunreaktion ausführen kann, wobei der erste Antikörper in einer Menge vorhanden ist, die ausreicht, um mindestens einen Test auszuführen. Vorzugsweise weisen die Testausrüstungen der Erfindung weiterhin einen zweiten Behälter auf, der einen zweiten Antikörper enthält, der mit dem ersten Antikörper eine Immunreaktion ausführt. Noch besser sind die Antikörper, die bei den Testausrüstungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, monoklonale Antikörper. Sogar noch besser ist der erste Antikörper auf einer festen Unterlage fixiert. Ebenfalls noch besser weisen der erste und zweite Antikörper einen Indikator auf, und vorzugsweise ist der Indikator ein radioaktiver Marker oder ein Enzym.
Bei der vorliegenden Erfindung wird auch eine diagnostische Ausrüstung für das Screening von Wirkstoffen betrachtet. Eine solche Ausrüstung weist einen Epsilon-Opioidrezeptor der vorliegenden Erfindung auf. Die Ausrüstung kann weiterhin Reagenzien zum Nachweisen einer Wechselwirkung zwischen einem Wirkstoff und einem Rezeptor der vorliegenden Erfindung enthalten. Das vorgesehene Reagens kann radioaktiv markiert sein. Die Ausrüstung kann einen bekannten radioaktiv markierten Wirkstoff enthalten, der fähig ist, einen Rezeptor der vorliegenden Erfindung zu binden oder mit diesem Rezeptor zu interagieren.
Weiterhin ist vorgesehen, daß die Ausrüstung ein sekundäres Polypeptid enthalten kann. Das sekundäre Polypeptid kann ein G-Protein sein. Das sekundäre Polypeptid kann auch ein Effektorprotein sein. Wenn ein sekundäres Polypeptid in einer Ausrüstung enthalten ist, können Reagenzien zum Nachweisen einer Wechselwirkung zwischen dem Rezeptor und dem sekundären Polypeptid vorgesehen werden. Als ein spezifisches Beispiel kann ein Antikörper, der fähig ist, einen Rezeptor/G-Protein-Komplex nachzuweisen, vorgesehen werden. Als ein weiteres spezifisches Beispiel kann ein Antikörper, der fähig ist, einen G-Protein/Effektor-Komplex nachzuweisen, vorgesehen werden. Reagenzien für den Nachweis des Effektors können vorgesehen werden. Wenn zum Beispiel der vorgesehene Effektor Adenylylcyclase ist, können Reagenzien zum Nachweisen der Aktivität von Adenylylcyclase vorgesehen werden. Die Identität solcher Agenzien ist Fachleuten auf dem betreffenden Gebiet bekannt.
Gemäß einem alternativen Aspekt werden bei der vorliegenden Erfindung diagnostische Testausrüstungen verwirklicht zum Nachweisen der Anwesenheit, in biologischen Proben, eines Polynukleotids, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert, wobei die Testausrüstungen einen ersten Behälter aufweisen, der ein zweites Polynukleotid enthält, das identisch mit, oder komplementär zu einem Segment, mit mindestens 10 aneinandergrenzenden Nukleotidbasen von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 ist.
Bei einer weiteren Ausführungsform werden bei der vorliegenden Erfindung diagnostische Testausrüstungen betrachtet zum Nachweisen der Anwesenheit, in einer biologischen Probe, von Antikörpern, die immunoreaktiv mit Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptiden sind, wobei die Testausrüstungen einen ersten Behälter aufweisen, der ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid aufweist, das eine Immunreaktion mit den Antikörpern ausführt, wobei die Polypeptide in einer Menge vorhanden sind, die ausreicht, um mindestens einen Test auszuführen. Die Reagenzien der Testausrüstung können als eine auf einer festen Unterlage fixierte, flüssige Lösung, oder als ein getrocknetes Pulver vorgesehen werden. Wenn das Reagens in einer flüssigen Lösung vorgesehen wird, ist die flüssige Lösung vorzugsweise eine wässerige Lösung. Wenn das vorgesehene Reagens auf einer festen Unterlage fixiert ist, kann die feste Unterlage vorzugsweise aus chromatographischen Medien oder einem Objektträger bestehen. Wenn das vorgesehene Reagens ein trockenes Pulver ist, kann es durch Zugabe eines geeigneten Lösungsmittels rekonstituiert werden. Das Lösungsmittel kann vorgesehen werden.
BEISPIELE
Die Beispiele sind wiedergegeben, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zu veranschaulichen. Gewisse Aspekte der folgenden Beispiele werden als Techniken und Verfahren beschrieben, bei denen die Erfinder der vorliegenden Erfindung festgestellt haben oder annehmen, daß sie bei der Verwirklichung der Erfindung gut funktionieren. Diese Beispiele werden durch die Verwendung von Standard-Labormethoden des Erfinders illustriert.
BEISPIEL 1: Allgemeine Methoden
A. Klonierung und Amplifizierung
Menschliche genomische DNA wurde einer Amplifizierung mittels der PCR unter Verwendung eines Satzes degenerierter Primer, OR-1 und OR-2, unterworfen.

OR-1 5'CCTCACCA/GTGATG/CAGCG/A/TTC/GGAC/TCGA/CTA3' (SEQ ID NO: 5).
OR-2 5'GAAGGCG/ATAG/T/CAGA/GAC/TA/G/CGGA/GTT3' (SEQ ID NO: 6).

Diese degenerierten Oligonukleotide wurden von der Zusammenstellung von Sequenzen abgeleitet, die der dritten und siebten TM-Region (TM3 und TM7) des Maus-Delta-Opioid-Rezeptors und der verwandten Somatostatin-Rezeptoren entsprechen (Breder et al., 1992). Jeder Primer bestand aus einem Gemisch von Oligonukleotiden mit einer gewissen Anzahl von Degenerationen.
Die Zeit der PCR war 1,5 min bei 93°C, 2 min bei 55°C, und 4 min bei 72°C (Hemmick and Bidlack, 1987). Nach 30 Zyklen wurde diese DNA mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Äthanol ausgefällt. Die DNA wurde mit T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert, und die Enden wurden mittels des Klenow-Enzyms ausgeglichen.
Diese amplifizierte DNA wurde in die EcoRV-Stelle des Bluescript-Plasmids wie folgt subkloniert: Die DNA wurde in weicher Agarose elektrophoresiert, und sechs aufeinanderfolgende Gelscheiben, die Größen zwischen 150 bp und 3 kbp entsprechen, wurden abgeschnitten, und über Nacht bei Raumtemperatur in dem Gel mit dem Bluescript (SK)-Plasmid (Stratagen) ligiert. Das Ligationsgemisch jeder Fraktion wurde in DH5α-F'-Bakterien (BRL) transformiert, um die Bluecolor-Selektion zu ermöglichen, und auf LB-Platten, die Ampicillin enthielten, plattiert. Eine menschliche λEMBL-Genombibliothek (Clonetech) wurde gescreent unter Verwendung des 0,54 kb-Fragments von Klon Nr. 12 mit den gleichen Prähybridisierungs- und Hybridisierungslösungen, wie unten beschrieben. Achtzehn positive Duplikat-Klone wurden ausgewählt und danach durch sekundäres und tertiäres Screening gereinigt. Die DNA wurde aus den gereinigten Plaques hergestellt und durch PCR-Analyse identifiziert.
Dieser Phage wurde mit verschiedenen Enzymen geschnitten, um ein Sondenbindungsinsert auszuschneiden, auf 1% Agarose-Gel ausgebreitet, auf eine Nylonmembran (Gelman Sciences) vakuum-transferiert, UV-gekoppelt und an das 6,5 × 10⁶ cpm/ml nick-translatierte, ³²P-markierte 0,54 kb-BamHI/Xhol-Fragment des Klons Nr. 12 hybridisiert, unter Verwendung der gleichen Prähybridisierungs- und Hybridisierungslösungen wie unten, außer daß 1% SDS hinzugefügt wurde, um den Untergrund zu verringern. Ein Sondenbindungsband, ein 4,5 kb-Fragment, wurde mit BamHI erhalten. Dieses 4,5 kb-Band wurde in Bluescript subkloniert, und beide Stränge der Nukleinsäuresequenz wurden bestimmt.
B. Lokalisierung von ε-mRNA
Ein Fragment wurde von dem Klon Nr. 12 gereinigt, und nach der Random-Primer-Methode mit [α-³⁵S] dCTP mit einer hohen spezifischen Aktivität (10⁹ dmp/μg) radioaktiv markiert. Kryostatschnitte von 8μm Dicke wurden in 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatbuffer fixiert, und in 15% Sucrose in 0,1 M Phosphatpuffer eingetaucht. Die Schnitte wurden. in 2 × SSC während 10 Minuten gespült, und in dem gleichen Puffer, der 0,5% Trition X-100 enthielt, während 15 Minuten permeabilisiert, zweimal in 2 × SSC gespült, und während 1 Stunde bei 42°C prähybridisiert in dem folgenden Puffer: 5 × SSC, der 5 × Denhardt-Lösung (0,2% Ficoll/0,2% Rinderserumalbumin/0,02 Polyvinylpyrrolidin), 200 μg Hefe-tRNA/ml, 200μg denaturierte Lachssperma-DNA/ml, und 50% Formamid.
Die Hybridisierung wurde während 24 Stunden bei 42°C in dem Prähybridisierungspuffer ausgeführt, der 4% Dextransulfat und 10⁶ cpm wärme-denaturierten, ³⁵S-markierten Klon Nr. 12 pro Schnitt enthielt. Nach der Hybridisierung wurden die Objektträger bei Raumtemperatur in 2 × SSC während 2 Stunden, 1 × SSC während 1 Stunde, 0,5 × SSC während 1 Stunden, und bei 42°C in 0,5 × SSC während 1 Stunde gewaschen. Die Objektträger wurden in Äthanol dehydratisiert und luftgetrocknet. Der autoradiographische Nachweis der Hybride wurde mittels eines Röntgenstrahlen-Autoradiogramms und durch Eintauchen des Objektträgers in 1 : 1 mit destilliertem Wasser verdünnte Kodak NTB2-Emulsion ausgeführt. Sie wurden während 1 Stunde luftgetrocknet, und während 7 Tagen in eine ausgetrocknete Kammer mit 4°C gelegt. Danach wurden sie während 4 Minuten in Kodak D-19-Entwickler entwickelt, während 1 Minute in Wasser gewaschen, und während 5 Minuten in Kodak-Fixierbad fixiert. Nach dem Waschen während 1 Stunde wurden sie mit Hämatoxylin und Cosin (H und E) gefärbt und abgedeckt. Die Kontrollen bestanden aus der vorherigen Digestion von Hypophysengeweben mit 300 μg/l RNase (Sigma) bei 37°C während 45 Minuten. Die RNase-Kontrollen wurden bei allen Proben durchgeführt.
C. Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung
Sonden wurden mit dATP biotinylisiert unter Verwendung der BRL-Bionick-Markierausrüstung. In-Situ-Hybridisierung und FISH-Nachweis: Lymphozyten wurden in einem minimalen essentiellen Medium (MEM), dem 10% fötales Kalbsserum und Phytohämagglutinin (PHA) zugegeben wurden, bei 37°C während 68–72 h gezüchtet. Die Lymphozytenkulturen wurden während weiteren 16 h mit BrdU (18 mg/ml Sigma) behandelt, um die Zellpopulation zu synchronisieren. Die synchronisierten Zellen wurden mit einem serumfreien Medium dreimal gewaschen, und bei 37°C während 6 Stunden in α-MEM mit Thymidin (2,5 μg/l: Sigma) inkubiert. Die Zellen wurden geerntet, und Objektträger wurden nach Busing-Verfahren gemacht. Das Verfahren für die Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH) wurde gemäß Heng et al., 1992, und Heng and Tsui, 1993 ausgeführt. Kurz gesagt, die 7 Tage alten Objektträger wurden bei 55°C während 1 Stunde im Ofen getrocknet. Nach der RNase A-Behandlung wurden die Objektträger in 70% Formamid in 2 × SSC während 1 Minute bei 70°C denaturiert, worauf eine Dehydratation mit Äthanol erfolgte. Die Sonde wurde in einem Hybridisierungsgemisch, das aus 50% Formamid und 10% Dextransulfat bestand, bei 75°C während 5 Minuten denaturiert. Nach Hybridisierung, Nachweis und Amplifizierung wurden die FISH-Signale und das DAPI-Bandenmuster in einem einzigen Vorgang durch einfaches Umschalten der Filter des Mikroskops sichtbar gemacht (Heng and Tsui, 1993).
BEISPIEL 2: Isolierung von cDNA-Klonen
Mehrere der Nager-Opioidrezeptoren (OR), nämlich der δ-, κ- und μ-Rezeptor, wurden jetzt kloniert (Yasuda et al., 199, und Chen et al., 1993). Zwei degenerierte Oligonukleotide, die auf der Nukleotidsequenz basieren, die die dritte und siebte Transmembran (TM)-Region des Maus-δ-Opioidrezeptors codieren, wurden hergestellt. Da viele früher G-Protein-gekoppelte Klonrezeptoren auf einzelnen Exons codiert sind, wurden diese Oligonukleotide verwendet, um bei der Polymerasekettenreaktion (PCR) die menschliche genomische DNA zu amplifizieren (Hazum et al., 1979). Die amplifizierte DNA (in dem Größenbereich 500 bis 1000 bp) wurde in das Bluescript-Plasmid subkloniert, und 150 der sich ergebenden Klone wurden sequenziert.
Aus den erhaltenen Nukleotidsequenzen war ersichtlich, daß keiner der genomischen PCR-Klone die menschlichen Orthologen des Nager-ORs codierte. Zwei Klone, Nr. 11 und Nr. 12, waren identisch mit dem δ-, μ- und π-OR. Um zu erreichen, daß das Gen über die volle Länge durch diese PCR-abgeleiteten Fragmente (540 bp) codiert wird, wurde eine menschliche Genbibliothek gescreent, und bei dem Screening wurden 18 positive Klone erhalten. Bei einer raschen PCR-Analyse dieser Phagenklone mit. den ursprünglichen PCR-Oligonukleotiden gelang es, jeweils einen Phagen zu identifizieren, der die Sequenz des Klons Nr. 11 oder Nr. 12 enthielt. Diese Phagen wurden gereinigt, und ein Fragment (4,5 kb) von den Klonen Nr. 11 und Nr. 12 wurde in das Bluescript-Plasmid subkloniert und sequenziert.
Diese genomischen Klone, die HG-11 und HG-12 genannt werden, enthielten intronlose Leseraster mit ungefähr 980 bis ungefähr 1000 Nukleotiden, die ein Protein mit 333 oder 327 Aminosäuren codieren (siehe die 1 und 2). Bei der PCR-Analyse, bei der zwei für die Klon Nr. 12-Sequenz spezifische Oligonukleotide verwendet wurden, wurden gleichgroße DNA-Fragmente bei der genomischen DNA von Schimpanse, Affe, Ratte und Maus identifiziert.
BEISPIEL 3: Pharmakologie des Epsilonrezeptor-Polypeptids
Um nachzuweisen, daß HG-12 einen Opioidrezeptor codierte, wurde ein 2 kb-Fragment aus der untranslatierten 5'-Region des Gens herausgenommen, und der gekürzte Insert (2,5 kb) wurde in die multiple Kloningstelle des eukaryotischen Expressionsvektors (pRC/CMV) subkloniert. Die Fähigkeit von selektiven Opioidrezeptor-Agonisten und – Antagonisten, die Membranen von transfizierten COS- und BHK-Zellen zu binden, wurde beurteilt. Mit diesem Konstrukt transfizierte Zellen banden [³H]-Bremazocin, einen Benzomorphan-Liganden mit hoher Affinität für alle bekannten Opioidrezeptor-Subtypen, mit einem K_d von 10 nM. Die spezifische [³H]-Bremazocin-Bindung wurde bei Anwesenheit des Opiatalkaloids Levorphanol definiert, und sie wurde durch β-Funaltrexamin mit einem IC₅₀ 100 nM und durch IC₅₀ 1000 nM wirksam verschoben, wie in der 4 und der 5 gezeigt ist. Die aus untransfizierten Kontrollzellen hergestellten Membranen zeigten keine verschiebbare [³H]-Bremazocin-Bindung. Die [³H]-Bremazocin-Bindung wurde durch (Leu⁵)β-Endorphin, und in einem geringeren Maße durch DADLE verschoben, aber nicht durch die für μ-, δ- und κ-Opioidrezeptoren selektiven Liganden DAMGO, DPDPE und U-50.488.
BEISPIEL 4: Southern- und Northern-Blot-Analyse
Als menschliche genomische DNA mit verschiedenen Restriktionsenzymen digeriert wurde und der Southern-Hybridisierungsanalyse mit einer aus der codierenden Region von HG-12 isolierten DNA-Sonde unterworfen wurde, wurde bei jedem Enzym nur eine einzige Hybridisierungsbande beobachtet. HG-12 kreuzhybridisierte nicht mit anderen verwandten Genen, und die einzige beobachtete Hybridisierungsbande war konsistent mit einer intronlosen Genstruktur. Die Northern-Blot-Analyse verschiedener Regionen und Gewebe des menschlichen Gehirns ließ ein einziges mRNA-Transkript in dem Zerebellum und dem frontalen Kortex erkennen, während in der Hypophyse und dem Hypothalamus zwei Transkripte sichtbar waren. In der Niere und der Leber wurde keine spezifische mRNA nachgewiesen. Die In-Situ-Hybridisierungs-Histochemie bei der Hypophyse ließ ein starkes Signal erkennen, das eine beschränkte Verteilung von HG-12 in einer Subpopulation von Zellen zeigte. Die Signalverteilung war vorzugsweise in den seitlichen Flügeln der Hypophyse lokalisiert, wobei der zentrale Bereich und die hintere Hypophyse frei von Markierung waren. Die Daten von dem Southern-Blot und dem Northern-Blot sind in den 6 bzw. 7 wiedergegeben.
BEISPIEL 5: Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung
Die Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH)⁹ wurde verwendet, um die spezifische chromosomale Lokalisierung des HG-12-Gens zu identifizieren. Sechzig mitotische Chromosomenstrukturen wurden geprüft, und 42 von ihnen (70%) zeigten doppelte Hybridisierungssignale bei dem Banden aufweisenden Chromosom 10, eines bei jedem der zwei Schwester-Chromatide. Insgesamt 11 miotische Figuren wurden photographiert, und die Daten sind in der 8 zusammengefaßt. Verschiedene Grade von verdichteten Chromosomen wurden für die detaillierte Lokalisierung verwendet, und alle erhaltenen Signale waren innerhalb der Bänder von 10q11.2 bis 10q21.1 gelegen (8). Unter den verwendeten FISH-Nachweisbedingungen gab es keine Kreuzhybridisierung von anderen Loci des menschlichen Genoms.
Der Opioidrezeptor, den wir kloniert haben, hat eine für die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren typische Struktur, und er interagiert spezifisch mit den 6,7-Benzomorphan-Arzneimitteln und dem endogenen Peptid β-Endorphin, aber nicht mit den selektiven μ-, δ- und κ-Opioid-Liganden. Insgesamt ergeben diese Daten einen direkten Nachweis für die Klonierung und Identifizierung des ε-Opioidrezeptors aus dem menschlichen Gehirn.
3A

Klon 12
DELTA-OPIOIDREZEPTOR (Maus)
KAPPA-OPIOIDREZEPTOR (Maus)
MY-OPIOIDREZEPTOR (Ratte)
SOMATOSTATIN-REZEPTOR SSTR3 (Mensch)
Klon 12
DELTA
KAPPA
MY
SSTR3
Klon 12
DELTA
KAPPA
MY
SSTR3
Klon 12
DELTA
KAPPA
MY
SSTR3
TRANSMEMBRAN 1
TRANSMEMBRAN 2

3B

Klon 12
DELTA
KAPPA
MY
SSTR3
Klon 12
DELTA
KAPPA
MY
SSTR3
Klon 12
DELTA
KAPPA
MY
SSTR3
TRANSMEMBRAN 3
TRANSMEMBRAN 4
TRANSMEMBRAN 5

3C

Klon 12
DELTA
KAPPA
MY
SSTR3
Klon 12
DELTA
KAPPA
MY
SSTR3
Klon 12
DELTA
KAPPA
MY
SSTR3
TRANSMEMBRAN 6
TRANSMEMBRAN 7

4A

Spezifische Bindung (fmol/mg)
³H-Bremazocin (nM)

4B

B/F
Gebunden

4C

³H-Bremazocin-Bindung
(% spezifisch)
LIGAND-KONZENTRATION (M)
BFNA
β-Endorphin
Levorphanol
Naltrindol
DADLE
DPDPE
DAMGO

5

cAMP-erzeugt
(% Kontrolle)
[Levorphanol] (nM)

Claims

Isoliertes und gereinigtes DNA-Molekül, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert, wobei das Polypeptid die Aminosäurerestsequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 aufweist.
Isoliertes und gereinigtes DNA-Molekül von Anspruch 1, wobei das DNA-Molekül die Nukleotidbasensequenz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 aufweist.
Isoliertes und gereinigtes Polynukleotid, das eine Basensequenz aufweist, die identisch mit, oder komplementär zu einem Segment mit mindestens 25 aneinandergrenzenden Basen von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 ist, wobei das Polynukleotid an ein Polynukleotid hybridisiert, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert.
Isoliertes und gereinigtes Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid, das die Aminosäurerestsequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 aufweist.
Opioidrezeptor-Polypeptid von Anspruch 4, wobei das Polypeptid ein rekombinantes Polypeptid ist.
Expressionsvektor, der ein Polynukleotid aufweist, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert, wobei das Polypeptid die Aminosäurerestsequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 aufweist.
Rekombinante Wirtszelle, die mit einem Polynukleotid transfiziert ist, das ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid codiert, wobei das Polypeptid die Aminosäurerestsequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 aufweist.
Prozeß zum Herstellen eines Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptids, das die Schritte aufweist; bei denen: – eine Zelle mit einem Polynukleotid transfiziert wird, das die Aminosäurerestsequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 aufweist, um eine transformierte Wirtszelle zu erzeugen; und – die transformierte Wirtszelle unter für die Expression des Polypeptids ausreichenden biologischen Bedingungen gehalten wird.
Prozeß zum Herstellen eines Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptids, der die Schritte aufweist, bei denen: – eine Zelle mit einem Polynukleotid transfiziert wird, das die Nukleotidbasensequenz von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 aufweist, die dieses Polypeptid codiert, um eine transformierte Wirtszelle zu erzeugen; und – die transformierte Wirtszelle unter für die Expression des Polypeptids ausreichenden biologischen Bedingungen gehalten wird.
Antikörper, der immunoreaktiv mit einem Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid ist, wobei das Polypeptid die Aminosäurerestsequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 aufweist, der Antikörper nicht immunoreaktiv mit Homologen ist, die Bereichen des Delta-Opioid-, Kappa-Opioid-, My-Opioid- und des Somatostatin-SSTR3-Rezeptors entsprechen.
Prozeß zum Nachweisen eines Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptids, wobei der Prozeß die Schritte aufweist, bei denen: – das Polypeptid eine Immunreaktion mit dem Antikörper von Anspruch 10 ausführt, um ein Antikörper-Polypeptid-Konjugat zu bilden; und – das Konjugat nachgewiesen wird.
Prozeß zum Screenen einer Substanz bezüglich ihrer Fähigkeit, mit einem Epsilon-Opioidrezeptor zu interagieren, wobei der Prozeß die Schritte aufweist, bei denen: – ein Epsilon-Opioidrezeptor-Polypeptid vorgesehen wird, das die Aminosäurerestsequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 aufweist; – die Fähigkeit dieser Substanz, mit dem Opioidrezeptor zu interagieren, getestet wird.