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Gebiet der
Erfindung
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Diese Erfindung bezieht sich auf
Anwendungen rekombinanter DNA-Technologie im Gebiet der Neurobiologie.
Noch spezifischer bezieht sich die Erfindung auf die Klonierung
und Expression von DNA, die für exzitatorische-Aminosäuren(EAA)-Rezeptoren kodiert,
insbesondere für
humane EAA-Rezeptoren.
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Hintergrund
der Erfindung
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Im Zentralnervensystem (ZNS) der
Säugetiere
wird die Übertragung
von Nervenimpulsen durch Interaktion mit einer Neurotransmittersubstanz,
die vom "sendenden" Neuron freigesetzt
wird und welche an einen Oberflächenrezeptor
auf dem "empfangenden" Neuron bindet, wodurch
eine Erregung desselben bewirkt wird, kontrolliert. L-Glutamat ist
der am meisten verbreitete Neurotransmitter im ZNS und vermittelt
in Wirbeltieren den hauptsächlichen
exzitatorischen Signalweg. Glutamat wird daher als eine exzitatorische
Aminosäure (EAA)
bezeichnet und die Rezeptoren, die darauf antworten, werden vielfach
als Glutamatrezeptoren oder noch allgemeiner als EAA-Rezeptoren
bezeichnet.
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Durch Verwendung von Geweben, die
aus dem Säugetiergehirn
isoliert wurden, und verschiedener synthetischer EAA-Rezeptoragonisten
wurde das Wissen über
die EAA-Rezeptorpharmakologie etwas verfeinert. Mitglieder der EAA-Rezeptorfamilie
werden nun, basierend auf der differenziellen Bindung an solche
Agonisten, in 3 Haupttypen eingeteilt. Ein EAA-Rezeptor-Typ, der
zusätzlich
zu Glutamat auch den Agonisten NMDA (N-Methyl-D-aspartat) bindet,
wird als NMDA-Typ
des EAA-Rezeptors bezeichnet. Zwei weitere Glutamat-bindende Typen
von EAA-Rezeptoren, die nicht NMDA binden, werden nach ihrer Präferenz,
zwei andere EAA-Rezeptoragonisten zu binden, benannt, namentlich
AMPA (α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-isoxazol-4-propionat}
und Kainat (2-Carboxy-4-(1-methylethenyl)-3-pyrrolidinacetat).
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Insbesondere Rezeptoren, die Glutamat,
aber nicht NMDA binden und welche mit größerer Affinität an Kainat
als an AMPA binden, werden als Kainat-Typ EAA-Rezeptoren bezeichnet. In ähnlicher
Weise werden jene EAA-Rezeptoren, die Glutamat, aber nicht NMDA
binden und welche mit höherer
Affinität
AMPA als Kainat binden, als AMPA-Typ EAA-Rezeptoren bezeichnet.
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Die Glutamat-bindende EAA-Rezeptorfamilie
ist von großer
physiologischer und medizinischer Bedeutung. Glutamat ist in viele
Aspekte der Langzeitpotenzierung (engl. Yong-term potentiation)
(Lernen und Gedächtnis),
bei der Entwicklung von synaptischer Plastizität, bei epileptischen Anfällen, bei
neuronaler Schädigung
verursacht durch Ischämie
in Folge eines Schlaganfalls oder andere hypoxische Ereignisse als
auch in andere Formen von neurodegenerativen Prozessen involviert.
Allerdings war die Entwicklung von Therapeutika, die diese Prozesse
modulieren, auf Grund des Mangels an einer homogenen Quelle an Rezeptormaterial, mit
der selektiv bindende Arzneimittelmoleküle, die spezifisch mit dem
Interface des EAA-Rezeptors interagieren, zu entdecken wären, sehr
schwierig. Die gegenwärtig
zum Screening von Kandidatenarzneimitteln verwendeten, vom Gehirn
abgeleiteten Gewebe sind heterogene Rezeptorquellen, die auf ihrer
Oberfläche
viele Rezeptortypen aufweisen, welche mit Studien des interessierenden
EAA-Rezeptor-Liganden-Interface
interferieren. Die Suche nach humanen Therapeutika wird weiterhin
verkompliziert durch die begrenzte Verfügbarkeit von Gehirngewebe humanen
Ursprungs. Es wäre
daher wünschenswert,
Zellen zu erhalten, die gentechnisch so manipuliert sind, dass sie
nur den interessierenden Rezeptor produzieren. Mit Zelllinien, die
klonierte Rezeptorgene exprimieren, wird ein für den gewünschten Rezeptor homogenes
Substrat für
Arzneimittelscreening-Programme
bereitgestellt.
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Vor kurzem wurden Gene, die für Substituentenpolypeptide
von EAA-Rezeptoren aus nicht-humanen Quellen kodieren, hauptsächlich von
der Ratte, entdeckt. Hollmann et al., Nature 342: 643, 1989, beschreiben die
Isolierung von einem Gen aus der Ratte, das ursprünglich mit
GluR-K1 bezeichnet wurde (aber nun einfach GluR1 genannt wird).
Dieses Gen kodiert für
ein Mitglied der Ratten-EAA-Rezeptorfamilie
und es wurde ursprünglich
vermutet, dass es vom Kainat-Typ ist. Daran anschließende Studien
von Keinanen et al., Science 249: 556, 1990, zeigten, wieder in
der Ratte, dass ein GluR-A genanntes Gen, das tatsächlich identisch
mit dem vorher isolierten GluR1 war, tatsächlich einen Rezeptor kodiert,
der nicht vom Kainat-Typ, sondern vom AMPA-Typ ist. Diese zwei Gruppen
von Forschern haben seitdem über
bis zu fünf
verwandte Gene, die aus Rattenquellen isoliert wurden, berichtet.
Boulter et al., Science 249: 1033, 1990, entdeckten, dass die Ratte zusätzlich zu
GluR1 drei weitere verwandte Gene enthielt, welche sie GluR2, GluR3
und G1uR4 nannten, und Bettler et al., Neuron 5: 583, 1990, beschrieben
GluR5. Keinanen et al., supra, beschrieben GluR-A, GluR-B, GluR-C
und GluR-D genannte Gene, die präzise
GluR1, GluR2 und GluR3 bzw. GluR4 entsprechen. Sommer et al., Science
249: 1580, 1990, zeigten ferner für GluR-A, Glur-B, Glur-C und
GluR-D für
jedes Gen zwei alternative Spleißformen. Diese Autoren sowie
Monyer et al., Neuron 6: 799, 1991, waren in der Lage zu zeigen, dass
die differenziell gespleißten
Versionen dieser Gene im Rattenhirn differenziell exprimiert waren.
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Zusätzlich lehren Puckett et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7557-7561, 1991, dass Kainat-Rezeptoruntereinheiten
(GluR1) von Ratte und Mensch 97% Sequenzidentität haben. Sun et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89: 1443-1447, 1992 bestätigen die Ergebnisse von Puckett
et al., supra, und berichten bei Ratten und humanem GluR1 eine 90%-ige
Identität
auf dem Nukleotidniveau und 99%-ige Homologie auf dem Aminosäureniveau.
Sun et al., supra, berichten ferner die Isolierung eines partiellen
humanen cDNA-Klons von GluR2, der zwei Drittel der kodierenden Region
enthält.
McNamarra et al., J. Neurosci. 12(7): 2555-2562, 1992, beschreiben
die Isolierung von humanen genomischen DNA-Fragmenten der Gene für GluR1-GluR4.
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Aus den Fortschritten in der molekularen
Klonierung erwuchs ein besseres Verständnis der strukturellen Merkmale
der EAA-Rezeptoren und ihrer Untereinheiten, wie sie im Rattengehirn
existieren. Nach dem gegenwärtigen
Modell der EAA-Rezeptorstruktur ist jede in ihrer Struktur heteromer
und besteht aus individuellen membranverankerten Untereinheiten,
von denen jede 4 Transmembranregionen und extrazelluläre Domänen aufweist,
die die Ligandenbindungseigenschaften zu einem gewissen Grad diktieren
und zur vom Rezeptorkomplex bereitgestellten geregelten Ionenleitungsfunktion
(engl. ion-gating function), beitragen. Keinanen et al., supra,
haben z.B. gezeigt, dass jede Untereinheit des Ratten-GluR-Rezeptors, einschließlich der
als Glur-A, Glur-B, GluR-C und GluR-D bezeichneten, in ihrem einheitlichen
Zustand von Glutamat, AMPA und Kainat geregelte Kationkanalaktivität zeigen.
Wenn sie allerdings in Kombination exprimiert werden, z.B. GluR-A
in Kombination mit GluR-B, werden von den Säugetierwirtszellen geregelte
Ionenkanäle
mit deutlich größeren Strömen produziert.
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Bei der Suche nach Therapeutika,
die für
die Behandlung von ZNS-Störungen
im Menschen nützlich sind,
ist es natürlich
höchst
wünschenswert,
einen Screen für
Kandidatenverbindungen bereitzustellen, der für die menschliche Situation
repräsentativer
ist, als dies mit den bisher isolierten Ratten-Rezeptoren möglich ist. Es
ist insbesondere wünschenswert,
klonierte Gene bereitzustellen, die für humane Rezeptoren kodieren,
und Zelllinien, die diese Gene exprimieren, um einen angemessenen
Screen für
humane therapeutische Verbindungen zu erstellen. Dies sind entsprechend
die Aufgaben der vorliegenden Erfindung.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Gene, die für eine Familie von EAA-Rezeptoren,
die dem menschlichen Gehirn endogen sind, kodieren, wurden nun identifiziert,
charakterisiert und werden hierin als die GluR4-Rezeptorfamilie
bezeichnet. Ein repräsentatives
Mitglied dieser humanen EAA-Rezeptorfamilie, bezeichnet als humanes
GluR4B, kodiert für ein
Rezeptorprotein, das zusätzlich
zur Bindung von Glutamat mit einer Affinität, die typisch für EAA-Rezeptoren
ist, weiterhin Ligandenbindungseigenschaften zeigt, die charakteristisch
für EAA-Rezeptoren
vom AMPA-Typ sind. Durch Bereitstellen eines Polynukleotides, das
spezifisch für
einen dem Menschen nativen ZNS-Rezeptor kodiert, stellt die vorliegende
Erfindung Mittel zur Evaluierung des humanen Nervensystemes und
insbesondere zum Beurteilen von potenziellen therapeutischen Interaktionen
zwischen den AMPA-bindenden humanen EAA-Rezeptoren und ausgewählten natürlichen
und synthetischen Liganden bereit.
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In einem ihrer Aspekte stellt die
vorliegende Erfindung daher ein isoliertes Polynukleotid bereit,
das eine Region umfasst, die für
einen AMPA-bindenden humanen EAA-Rezeptor kodiert, der hierin als
AMPA-bindender humaner GluR4B-Rezeptor
bezeichnet wird. Alternativ könnte
das Polynukleotid für
ein AMPAbindendes Fragment des AMPA-bindenden humanen GluR4B-Rezeptors
oder eine AMPA-bindende Variante des humanen GluR4B-Rezeptors kodieren.
In verschiedenen spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung besteht das Polynukleotid aus DNA, z.B. cDNA oder aus
RNA, z.B. Boten-RNA. In anderen Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung kann das Polynukleotid an ein Rezeptormolekül gekoppelt
sein, wie ein radioaktiver Marker, zur Verwendung in autoradiographischen
Studien der Gewebeverteilung des AMPAbindenden humanen GluR4B-Rezeptors.
In weiteren Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung können Fragmente
der Polynukleotide der Erfindung, einschließlich radioaktiv markierter
Versionen davon, als Sonden zum Nachweis von Glutamatrezeptor-kodierenden
Polynukleotiden, als Primer, die für die Amplifikation solcher Polynukleotide,
die in biologischen Proben vorhanden sind, geeignet sind, oder als
Matrizen zur Expression des AMPA-bindenden humanen GluR4B-Rezeptors oder eines
AMPA-bindenden Fragments oder einer Variante des Rezeptors eingesetzt
werden.
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Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden
Erfindung wird ein zellulärer
Wirt bereitgestellt, der darin exprimierbar ein Polynukleotid der
vorliegenden Erfindung eingeschlossen hat. In Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung ist das Polynukleotid ein DNA-Molekül und wird
zur Expression und Sekretion in dem zellulären Wirt eingeschlossen, um
einen funktionalen, membrangebundenen AMPA-bindenden humanen GluR4B-Rezeptor
zu ergeben oder ein AMPAbindendes Fragment zu ergeben oder AMPA-bindende
Varianten des AMPAbindenden humanen GluR4B-Rezeptors zu ergeben.
In anderen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung ist das Polynukleotid ein RNA-Molekül, das in
dem zellulären
Wirt eingeschlossen ist, um den AMPA-bindenden humanen GluR4B-Rezeptor
als funktionales, membrangebundenes Translationsprodukt zu ergeben.
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Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung
wird ein Verfahren zum Erhalten einer homogenen Quelle eines AMPA-bindenden
humanen GluR4B-Rezeptors bereitgestellt, die für die Durchführung von
Ligandenbindungstests nützlich
ist, welches die Schritte des Kultivierens eines genetisch modifizierten
zellulären
Wirts der Erfindung zur Produktion des Rezeptors als ein heterologes
membrangebundenes Produkt, des Gewinnens der kultivierten Zellen
und des Erhaltens von Membranpräparationen
davon zur Verwendung in Ligandenbindungstests umfasst.
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Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden
Erfindung wird ein Verfahren zur Beurteilung der Interaktion zwischen
einem Testliganden und einem humanen ZNS-Rezeptor bereitgestellt,
welches die Schritte des Inkubierens eines Testliganden mit einer
AMPA-bindenden humanen GluR4B-Rezeptorquelle, d. h. einem zellulären Wirt
der Erfindung oder einer Membranpräparation, die davon stammt,
unter Bedingungen, die geeignet sind für die Rezeptorbindung und daraufhin
das Bestimmen des Ausmaßes
der Bindung zwischen dem Testliganden und der Rezeptorquelle oder
das Bestimmen des Liganden-induzierten elektrischen Stroms über die
Zellmembran hinweg, umfasst. Diese und andere Aspekte der Erfindung
werden nun detaillierter unter Bezug auf die begleitenden Zeichnungen
beschrieben.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 stellt
eine DNA-Sequenz bereit (SEQ ID NR: 1), die für den AMPAbindenden humanen GluR4B-Rezeptor
kodiert und die Aminosäuresequenz
(SEQ ID NR: 2) davon;
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2 stellt
die Strategie dar, die zur Klonierung der DNA-Sequenz, die in 1 bereitgestellt wurde, eingesetzt
wurde;
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3 stellt
die Strategie dar, die zum Erzeugen von rekombinanten DNA-Expressionskonstrukten,
die die für
den AMPA-bindenden humanen GluR4B-Rezeptor kodierende DNA aus 1 einschließen, verwendet wurde;
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4 veranschaulicht
die AMPA-Bindungseigenschaften des AMPA-bindenden humanen GluR4B-Rezeptors;
und
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5-6 veranschaulichen die Kanalaktivierungseigenschaften
des AMPAbindenden GluR4B-Rezeptors.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung und ihrer bevorzugten Ausführungsformen
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Die Erfindung bezieht sich auf humane
ZNS-Rezeptoren des AMPA-bindenden Typs und stellt isolierte Polynukleotide
bereit, die für
solche Rezeptoren kodieren, die zur GluR4-Familie der Rezeptoren
einschließlich des
GluR4B-Rezeptors gehören
sowie Fragmente und Varianten des GluR4B-Rezeptors. So wie hierin
verwendet, schließt
der Begriff „GluR4-Rezeptor" daher GluR4B und
Fragmente und Varianten davon mit ein. Der Begriff „isoliert" wird hierin mit
Bezug auf intakte Polynukleotide verwendet, die im Allgemeinen weniger
als ungefähr
4.000 Nukleotide Länge
haben und die ansonsten von DNA, die für andere humane Proteine kodiert, abgetrennt
sind.
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Im vorliegenden Zusammenhang zeigen
humane ZNS-Rezeptoren des AMPAbindenden Typs ein charakteristisches
Ligandenbindungsprofil, das Glutamat und AMPA-Bindung zeigt. Wie
hierin mit Bezug auf Fragmente und Varianten des GluR4B-Rezeptors
verwendet, bezieht sich der Begriff „AMPA-bindend" folglich auf solche
Fragmente und Varianten, die größere Bindungsaffinität gegenüber AMPA
als gegenüber
entweder Glutamat, Kainat oder NMDA oder nahe verwandte Analoga
davon zeigen, wie dies unter Verwendung von Tests gewöhnlicher
Gestalt, wie z.B. die hierin beschriebenen Tests, bestimmt wird.
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In der vorliegenden Beschreibung
wird ein AMPA-bindender Rezeptor als "funktional" bezeichnet, wenn ein zellulärer Wirt,
der ihn produziert, de novo Kanalaktivität zeigt, wenn er in geeigneter
Weise AMPA ausgesetzt wird, was durch etablierte elektrophysiologische
Tests bestimmt wird, die z.B. von Hollmann et al., supra beschrieben
wurden, oder durch andere Tests, die zum Nachweis der Leitfähigkeit über die
Zellmembran geeignet sind.
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Der AMPA-bindende GluR4B-Rezeptor
der Erfindung besitzt strukturelle Merkmale, die charakteristisch
für EAA-Rezeptoren
im Allgemeinen sind. Diese schließen sowohl extrazelluläre N- und
C-terminale Regionen als auch 4 interne hydrophobe Domänen ein,
welche zur Verankerung des Rezeptors innerhalb der Zelloberflächenmembran
dienen. Noch spezifischer ist ein AMPA-bindender GluR4B-Rezeptor
ein Protein, das durch eine einzelne Polypeptidkette strukturell
charakterisiert ist, die zunächst
in einer Vorläuferform,
die ein aus 21 Aminosäureresten
bestehende N-terminales Signalpeptid trägt, hergestellt wird und zur
Zelloberfläche in
reifer Form transportiert wird, wobei dieser das Signalpeptid fehlt
und sie aus 881 Aminosäuren
besteht, die in einer Sequenz angeordnet sind, wie sie im Einzelbuchstabencode
in 1 (SEQ ID NR: 1 und
2) veranschaulicht ist. Sofern nicht anders beschrieben, bezieht
sich der Begriff "humaner
GluR4B-Rezeptor" auf
die reife Form des Rezeptors und Aminosäurereste des AMPA-bindenden
humanen GluR4B-Rezeptors sind folglich mit Bezug auf die reife Proteinsequenz
nummeriert. In Bezug auf die strukturellen Domänen des Rezeptors zeigt eine
Hydropathie-Analyse 4 putative Transmembran-Domänen, wobei eine die Reste 526–545 einschließlich überspannt
(TM-1), eine weitere die Reste 572–590 überspannt (TM-2), eine dritte
die Reste 601–619
(TM-3) überspannt
und die vierte die Reste 793–813
(TM-4) überspannt.
Auf der Grundlage dieser Zuordnung ist es wahrscheinlich, dass die
Struktur des AMPA-bindenden humanen GluR4B-Rezeptors in ihrer natürlichen
membrangebundenen Form aus einer 525 Aminosäuren langen N-terminalen extrazellulären Domäne besteht,
gefolgt von einer hydrophoben Region enthaltend 4 Transmembran-Domänen und
einer extrazellulären,
68 Aminosäuren
langen C-terminalen Domäne.
Mit verschiedenen Liganden und mit Membranpräparationen, die aus gentechnisch
modifizierten Säugetierzellen
stammen, um humanen GluR4-Rezeptor in membrangebundener Form zu
produzieren, durchgeführte
Bindungstests deuten darauf hin, dass GluR4-Rezeptoren selektiv
an AMPA binden, insbesondere verglichen mit Kainat und NMDA. Dieses
Merkmal, verknüpft mit
der medizinisch signifikanten Verbindung zwischen Rezeptoren vom
AMPA-Typ und neurologischen Störungen
und Krankheiten deutet darauf hin, dass der vorliegende Rezeptor
und seine AMPA-bindenden Fragmente und AMPA-bindenden Varianten
als wertvolle Werkzeuge zum Screenen und bei der Entdeckung von Liganden,
die zur Modulation der in-vivo-Interaktionen zwischen solchen Rezeptoren
und ihrem natürlichen
Liganden, Glutamat, nützlich
sind, dienen können.
Ein Schlüsselaspekt
der vorliegenden Erfindung liegt daher in der Konstruktion von Zellen,
die genetisch so modifiziert wurden, dass sie AMPA-bindenden humanen GluR4-Rezeptor
produzieren, um als verfügbare
und homogene Quelle von Rezeptoren zur Verwendung in in-vitro-Ligandenbindungs-
und/oder Kanalaktiviefungstests zu dienen.
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Zur Verwendung in Ligandenbindungstests
ist es wünschenswert,
unter Anwendung gentechnischer Methoden eine Wirtszelle zu konstruieren,
die einen AMPAbindenden humanen GluR4-Rezeptor als ein heterologes,
membrangebundenes Produkt produziert. Die Konstruktion solcher konstruierter
Zellen wird erreicht durch Einführen
eines rekombinanten DNA-Sekretionskonstrukts in eine ausgewählte Zelle,
wobei die DNA für eine
sekretierbare Form des AMPA-bindenden humanen GluR4B-Rezeptors kodiert,
d. h. eine Form des Rezeptors, die sein natives Signalpeptid oder
ein funktionales, heterologes Äquivalent
davon trägt
und funktionsfähig
mit Expressionskontrollelementen verknüpft ist, die in dem ausgewählten Wirt
funktional sind, um die Expression der rezeptorkodierten DNA anzutreiben,
und so das Rezeptorprotein in seiner gewünschten reifen und membrangebundenen
Form auszudrücken.
Solche Zellen werden hierin als solche charakterisiert, die die rezeptorkodierende
DNA hierin "expressionsfähig" eingeschlossen haben.
Mit Bezug auf den gegebenen zellulären Wirt wird die rezeptorkodierende
DNA als "heterolog" bezeichnet, falls
solche DNA nicht natürlicherweise
in dem gegebenen Wirt zu finden ist. Der spezielle Zelltyp, der
ausgewählt
wurde, um als Wirt zur Produktion von AMPA-bindendem humanem GluR4-Rezeptor zu dienen,
kann ein beliebiger von verschiedenen Zelltypen sein, die gegenwärtig im
Stand der Technik erhältlich
sind, einschließlich
sowohl ein prokaryotischer als auch ein eukaryotischer, aber er
sollte natürlich
nicht ein Zelltyp sein, der in seinem natürlichen Zustand einen Oberflächenrezeptor
ausdrückt,
der exzitatorische Aminosäuren
binden kann und daher die Testergebnisse, die von der gentechnisch
veränderten
Zelllinie erstrebt werden, durcheinander bringt. Im Allgemeinen
werden solche Probleme vermieden, indem man als Wirt einen nicht-neuronalen
Zelltyp auswählt
und sie können
weiterhin durch Verwendung von nicht-humanen Zelllinien vermieden
werden, was üblich
ist. Man wird erkennen, dass neuronale und humane Zelltypen dennoch
als Expressionswirte dienen können,
vorausgesetzt dass "Hintergrund"-Bindung des Testliganden
in den Testergebnissen berücksichtigt
wird.
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Gemäß einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist die ausgewählte Zelllinie, die als Wirt für die Produktion
von AMPA-bindendem humanem GluR4B-Rezeptor dient, eine Säugetierzelle.
Verschiedene Typen solcher Zelllinien sind gegenwärtig für gentechnische
Arbeiten verfügbar
und diese schließen
die chinesischen-Hamsterovarien(CHO)-Zellen, z.B. der K1-Abstammungslinie (ATCC
CCL 61) einschließlich
der ProS-Variante (ATCC CRL 1281); die fibroblastenartigen Zellen,
die aus SV40-transformierten afrikanischen Grünaffennieren der CV-1 Abstammungslinie
abstammen (ATCC CCL 70), der COS-1 Abstammungslinie (ATCC CRL 1650)
und der COS-7 Abstammungslinie (ATCC CRL 1651); marine L-Zellen,
marine 3T3-Zellen (ATCC CRL 1658), marine C 127-Zellen, humane embryonische
Nierenzellen der 293-Abstammungslinie (ATCC CRL 1573), humane Karzinomzellen
einschließlich
solche der HeLa-Abstammungslinie
(ATCC CCL 2) und Neuroblastomzellen der Linien IMR-32 (ATCC CCL
127), SK-N-MC (ATCC HTB 10) und SK-N-SH (ATCC HTB 11) ein.
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Eine Vielzahl von Genexpressionssystemen
wurde zur Verwendung in diesen Wirten angepasst und ist nun kommerziell
erhältlich.
Ein beliebiges dieser Systeme kann ausgewählt werden, um die Expression
der rezeptorkodierenden DNA zu steuern. Diese Systeme, die typischerweise
in der Form von plasmidischen Vektoren erhältlich sind, schließen Expressionskassetten
ein, deren funktionale Komponenten DNA einschließen, welche expressionskontrollierende
Sequenzen, die vom Wirt erkannt sind und Expression der rezeptorkodierenden
DNA erlauben, wenn sie 5' davon
verknüpft
sind. Diese Systeme schließen
ferner DNA-Sequenzen ein, die die Expression beenden, wenn sie 3' an die rezeptorkodierende
Region verknüpft
werden. Zur Expression in dem ausgewählten Säugetierzellwirt wird daher
ein rekombinantes DNA-Expressionskonstrukt hergestellt, in der DNA,
die für
den Rezeptor in sekretierbarer Form kodiert, mit expressionskontrollierenden
DNA-Sequenzen verknüpft
wird, die in dem Wirt erkannt werden und welche eine Region 5' von der rezeptorkodierenden DNA
zur Kontrolle der Expression und eine 3'-Region zur Beendigung der Expression
einschließen.
Der plasmidische Vektor, der das rekombinante Expressionskonstrukt
enthält,
schließt
typischerweise andere funktionale Komponenten ein, wie einen Replikationsursprung, üblicherweise
aus Viren stammend, um die Replikation des Plasmids in dem Expressionswirt
zu gestatten und wünschenswerter
Weise auch die Plasmidamplifikation in einem bakteriellen Wirt,
wie z.B. E. coli. Um einen Marker bereitzustellen, der die Selektion
von stabil transformierten rekombinanten Zellen ermöglicht,
wird der Vektor ferner ein Gen, das Überlebensvorteile für die Transformanten
vermittelt, einschließen,
wie ein Gen, das für
Neomycinresistenz kodiert, in welchem Falle die Transformanten in
einem Medium, zu dem Neomycin zugesetzt wurde, ausplattiert werden.
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Unter den verschiedenen rekombinanten
Expressionssystemen, die verwendet werden können, um Säugetierzellexpression der rezeptorkodierenden
DNA zu erreichen, sind solche eingeschlossen, die Promotoren von
Viren ausnutzen, die Säugetierzellen
infizieren, wie der Promotor des Cytomegalovirus (CMV), des Rous
Sarcomavirus (RSV), Simian Virus (SV40), Murine Mammary Tumor Virus
(MMTV) und andere. Zur Steuerung der Expression sind ferner solche
Promotoren nützlich,
wie die LTR von Retroviren, Insektenzellenpromotoren wie solche,
die durch Temperatur reguliert werden, und solche, die aus Drosophila
isoliert wurden, sowie Säugetierzellpromotoren
wie solche, die durch Schwermetalle reguliert werden, d. h. der
Metallothionin-Genpromotor und andere Steroidinduzierbare Promotoren.
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Zum Einschluss in den rekombinanten
DNA-Expressionsvektor kann durch Anwenden ausgewählter Methoden der Genisolation
oder Gensynthese DNA, die für
den AMPA-bindenden humanen GluR4B-Rezeptor kodiert oder für ein AMPA-bindendes
Fragment oder für
eine AMPA-bindende Variante davon, erhalten werden. Wie in detaillierterer
Weise in den Beispielen hierin beschrieben, wird der AMPA-bindende
humane GluR4B-Rezeptor innerhalb des Genoms des humanen Gehirngewebes
kodiert und kann daher aus humanen DNA-Bibliotheken durch vorsichtige
Anwendung üblicher
Genisolations- und Klonierungsmethoden erhalten werden. Dies beinhaltet
typischerweise die Extraktion von Gesamt-Boten-RNA aus einer frischen Quelle
von humanem Hirngewebe, vorzugsweise Kleinhirn oder Hippocampusgewebe,
gefolgt von der Umwandlung der Botschaft (engl. message) in cDNA
und Bildung einer Bibliothek in z.B. bakteriellen Plasmiden, noch
typischer in einem Bakteriophagen. Solche Bakteriophagen, die Fragmente
von humaner DNA einschließen,
werden typischerweise durch Ausplattieren auf einem Rasen von empfänglichen
E. coli-Bakterien kultiviert, so dass einzelne Phagenplaques oder
-kolonien isoliert werden können.
Die DNA, die von der Phagenkolonie getragen wird, wird dann typischerweise
auf einer Nitrozellulose- oder Nylon-basierenden Hybridisierungsmembran
immobilisiert und dann unter sorgsam kontrollierten Bedingungen
und mit einer radioaktiv (oder anderweitig) markierten Nukleotidprobe
mit einer zur Identifizierung der gegebenen Phagenkolonie geeigneten
Sequenz, die die Rezeptor-kodierende DNA oder Fragmente davon trägt, hybridisiert.
Typischerweise wird das Gen oder ein Teil davon, das derartig identifiziert
wurde, für
eine Nukleinsäuresequenzanalyse
in einen plasmidischen Vektor subkloniert.
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In einer besonderen Ausführungsform
der Erfindung wird der AMPA-bindende GluR4B-Rezeptor von einer DNA-Sequenz
kodiert, die in 1 (SEQ
ID NR: 1) veranschaulicht ist. Alternativ können die DNA-Sequenzen, die
für den
ausgewählten
Rezeptor kodieren, degenerierte äquivalente
Kodons der veranschaulichten DNA-Sequenz einschließen.
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Die veranschaulichte DNA-Sequenz
bildet die DNA-Sequenz, die in humanen Gehirn-cDNA-Bibliotheken
in der hier beispielhaft erklärten
Weise identifiziert wurde. Nachdem hierin die Nukleatidsequenz des
AMPA-bindenden humanen GluR4B-Rezeptors bereitgestellt wurde, wird
man allerdings erkennen, dass Polynukleotide, die für den Rezeptor
kodieren, auch auf anderem Wege erhalten werden können.
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Automatisierte Methoden der Gensynthese
und/oder Amplifikation können
durchgeführt
werden, um dafür
kodierende DNA zu erzeugen. Auf Grund der Länge der DNA, die für den AMPA-bindenden
humanen GluR4B-Rezeptor kodiert, kann die Anwendung von automatisierten
Synthesen Genkonstruktion in Schritten erforderlich machen, wobei
Regionen bis zu ungefähr
300 Nukleotiden Länge
einzeln synthetisiert werden und dann in korrekter Abfolge mittels Über hang-Komplementarität zur abschließenden Zusammenfügung ligiert werden.
Einzeln synthetisierte Genregionen können vor der Zusammenfügung unter
Verwendung von etablierter Polymerasekettenreaktions-(PCR)-Technologie
amplifiziert werden.
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Die Anwendung von automatisierten
Gensynthesemethoden stellt eine Möglichkeit bereit, Polynukleotide
zu erzeugen, die für
Varianten des natürlich
vorkommenden AMPA-bindenden humanen GluR4B-Rezeptors kodieren. Man
wird erkennen, dass z.B. Polynukleotide, die für den Rezeptor kodieren, erzeugt
werden können,
indem man Kodons, die in der natürlichen
und hierin identifizierten Polynukleotidsequenz vorkommen, durch
synonyme Kodons ersetzt. Zusätzlich
können
Polynukleotide erzeugt werden, die für AMPA-bindende humane GluR4B-Rezeptorvarianten
kodieren, die z.B. ein oder mehrere, vorzugsweise 1 bis 10, Einzelaminosäuresubstitutionen,
-deletionen oder -additionen einschließen. Da es für den größten Teil
wünschenswert
sein wird, die natürlichen
Ligandenbindungsprofile des Rezeptors für die Zwecke des Screenens
zu erhalten, ist es wünschenswert
die Aminosäuresubstitutionen
zu beschränken,
z.B. auf so genannte konservative Austausche, bei denen Aminosäuren von
gleicher Ladung substituiert werden, und es wird wünschenswert
sein, die Substitutionen auf solche Stellen zu beschränken, die
weniger kritisch für
die Rezeptoraktivität
sind, z.B. innerhalb der ersten 20 N-terminalen Reste des reifen
Rezeptors, und solche anderen Regionen, die infolge der Rezeptordomänenkartierung
aufgeklärt
werden.
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Wenn geeignete Matrizen-DNA zur Verfügung steht,
kann auch die Methode der PCR-Amplifikation verwendet werden, um
direkt das gesamte oder Teile des endgültigen Gens zu erzeugen. In
diesem Falle werden Primer synthetisiert, die die PCR-Amplifikation
des Endproduktes primen werden, entweder in einem Stück oder
in mehreren Stücken,
die zusammen ligiert werden können.
Dies kann mittels einer schrittweisen Ligation der stumpfendigen,
amplifizierten DNA-Fragmente
erreicht werden oder vorzugsweise über eine schrittweise Ligation
der Fragmente, die natürlich
vorkommende Restriktionsendonukleasestellen enthal ten. In dieser
Anwendung ist es möglich,
entweder cDNA oder genomische DNA als Matrize für die DNA-Amplifikation zu
verwenden. Im ersten Fall kann die cDNA-Matrize aus kommerziell
erhältlichen
oder selbst konstruierten cDNA-Bibliotheken
von verschiedenen humanen Gehirngeweben, einschließlich Hippocampus
und Kleinhirn, erhalten werden.
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Wenn sie einmal erhalten wurde, wird
die rezeptorkodierende DNA zur Expression in einem beliebigen geeigneten
Expressionsvektor eingeschlossen und Wirtszellen werden damit transfiziert
unter Verwendung üblicher
Verfahren wie DNAvermittelter Transformation, Elektroporation oder
Teilchenkanonentransformation (engl. particle gun tansformation).
Expressionsvektoren können
ausgewählt
werden, um transformierte Zelllinien bereitzustellen, die rezeptorkodiernde
DNA entweder transient oder in einer stabilen Weise exprimieren. Für die transiente
Expression werden Wirtszellen typischerweise mit einem Expressionsvektor
transformiert, der einen Replikationsursprung enthält, der
in einer Säugetierzelle
funktional ist. Für
die stabile Expression sind solche Replikationsursprünge unnötig, aber
die Vektoren werden typischerweise ein Gen enthalten, das für ein Produkt
kodiert, das den Transformanten einen Überlebensvorteil vermittelt,
um ihre Selektion zu ermöglichen.
Gene, die für
solche selektierbaren Marker kodieren, schließen das E. coli gpt Gen ein,
das Resistenz gegenüber
Mycophenolsäure
vermittelt, das neo Gen aus dem Transposon Tn5, das Resistenz gegenüber dem
Antibiotikum G418 und Neomycin vermittelt, und die dhfr Sequenz
aus Mäusezellen
oder E. coli, die den Phenotyp von DHFR– Zellen
in DHFR+ Zellen ändert, und das tk Gen des Herpes
Simplex Virus, das TK– Zellen phenotypisch
zu TK+ Zellen macht. Sowohl transiente Expression
als auch stabile Expression kann transformierte Zelllinien bereitstellen
und daraus abgeleitete Membranpräparationen
zur Verwendung in Liganden-Screeningtests.
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Zellen, die rezeptorkodierende DNA
transient exprimieren, können
für die
spätere
Verwendung, d. h. in Screeningtests, gefroren gelagert werden, aber
da die hohe Plasmidreplikationsrate schließlich zum Zelltod führen wird, üblicherweise
in einigen wenigen Tagen, sollten die transformierten Zellen so
früh wie
möglich
verwendet werden. Screeningtests können entweder mit intakten
Zellen durchgeführt
werden oder mit Membranpräparationen,
die von solchen Zellen stammen. Die Membranpräparationen stellen üblicherweise
ein bequemeres Substrat für
Ligandenbindungsexperimente bereit und werden daher als Bindungssubstrate
bevorzugt. Um Membranpräparationen
für Screeningzwecke,
d. h. Ligandenbindungsexperimente, bereitzustellen, werden gefrorene
intakte Zellen, während
sie in einer kalten Wassersuspension sind, homogenisiert und ein
Membranpellet wird nach der Zentrifugation gesammelt. Das Pellet
wird dann in kaltem Wasser gewaschen und dialysiert, um endogene
EAA-Liganden wie Glutamat zu entfernen, die andernfalls um die Bindung
in diesen Tests kompetitieren würden.
Die dialysierten Membranen können
dann als solche in den Ligandenbindungstests verwendet werden oder
nachdem sie in lyophilisierter Form gelagert wurden. Al-ternativ können intakte, frische
und nach ungefähr
zwei Tagen nach transienter Transfektion oder nach ungefähr der gleichen
Zeitdauer nach frischer Plattierung der stabil transfizierten Zellen
geerntete Zellen für
Ligandenbindungstests mittels der gleichen Verfahren, die für die Membranpräparationen
verwendet wurden, verwendet werden. Wenn Zellen verwendet werden,
müssen
die Zellen durch noch behutsamere Zentrifugation geerntet werden,
um sie nicht zu schädigen,
und das gesamte Waschen muss in gepuffertem Medium erfolgen, z.B.
in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung, um osmotischen Schock
und Aufplatzen der Zellen zu vermeiden.
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Das Binden einer Substanz, d. h.
eines Kandidatenliganden an erfindungsgemäßen AMPA-bindenden humanen
GluR4B-Rezeptor wird typischerweise unter Verwendung einer vorher
bestimmten Menge aus von Zellen stammender Membran (gemessen z.B.
durch Proteinbestimmung), im Allgemeinen von ungefähr 25 μg bis 100 μg beurteilt.
Im Allgemeinen werden kompetitive Bindungstests für die Beurteilung
der Affinität
der Testsubstanz relativ zu AMPA nützlich sein. Diese kompetitiven
Bindungstests können
durchgeführt
werden, indem die Membranpräparation
mit radioaktiv markiertem AMPA, z.B. [3H]-AMPA, in Gegenwart von
unmarkierter Testverbindung, die bei unterschiedlichen Konzentrationen
zugesetzt wird, inkubiert wird. Im Anschluss an die Inkubation kann
entweder verdrängtes
oder gebundenes radioaktiv markiertes AMPA gewonnen und gemessen
werden, um die relativen Bindungsaffinitäten der Testverbindungen und
AMPA für
den gegebenen Rezeptor, der als Substrat verwendet wurde, zu bestimmen.
Auf diesem Weg können
die Affinitäten
verschiedener Verbindungen für
die AMPA-bindenden ZNS-Rezeptoren gemessen werden. Alternativ kann
ein radioaktiv markiertes Analog von Glutamat anstelle des radioaktiv
markierten AMPA als kompetitierender Ligand verwendet werden.
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Die AMPA-bindenden GluR4-Rezeptoren
der vorliegenden Erfindung sind per se in einem elektrophysiologischen
Kontext funktional und sind daher in der etablierten Weise nützlich,
um die Testliganden auf ihre Fähigkeit
zu screenen, die Ionenkanalaktivität zu modulieren. Die vorliegende
Erfindung stellt daher weiterhin als eine Ligandenscreeningmethode
ein Verfahren zum Nachweis der Interaktion zwischen einem Testliganden
und einem humanen ZNS-Rezeptor bereit, welches die Schritte des
Inkubierens des Testliganden mit einer erfindungsgemäßen Zelle,
die AMPA-bindenden humanen GluR4-Rezeptor produziert, oder mit davon
stammenden Membranpräparationen,
und dann das Messen des Ligandeninduzierten elektrischen Stromes über die
Zelle oder die Membran umfasst.
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Als Alternative zur Verwendung von
Zellen, die rezeptorkodierende DNA exprimieren, kann die Ligandencharakterisierung
entweder mittels Binden oder mittels Ionenkanalbildung auch durch
Verwendung von Zellen, z.B. Xenopus-Eizellen, die im Anschluss an
das Einführen
von Messenger-RNA die für
den GluR4-Rezeptor
kodiert, funktionalen membrangebundenen Rezeptor erzeugen, durchgeführt werden.
In diesem Fall wird das GluR4-Rezeptorgen der Erfindung typischerweise
in einer solchen Weise in einen plasmidischen Vektor subkloniert,
dass das eingeführte
Gen leicht über
einen benachbarten RNA-Transkriptionsprornotor, der von dem plasmidischen
Vektor bereitgestellt wird, z.B. die T3 oder T7 Bakteriophagenpromotoren,
in RNA transkribiert werden kann. Die RNA wird dann vom eingeführten Gen
in vitro transkribiert und kann dann in die Xenopus-Eizellen injiziert
werden. Im Anschluss an die Injektion von nL-Volumina einer RNA-Lösung werden
die Eizellen zur Inkubation bis zu mehrere Tage lang belassen und
dann auf ihre Fähigkeit
getestet, auf ein gegebenes Ligandenmolekül, das einer Inkubationslösung zugesetzt
wurde, zu reagieren. Da funktionale EAA-Rezeptoren teilweise durch Bedienen
eines Membrankanals wirken, durch den Ionen selektiv passieren können, kann
das Funktionieren des Rezeptors als Antwort auf ein gegebenes Ligandenmolekül in der
Inkubationslösung
typischerweise als ein elektrischer Strom unter Verwendung von Mikroelektroden,
die in die Zelle inseriert oder auf irgendeine der Seiten der zellabgeleiteten
Membranpräparationen
platziert wurden, unter Verwendung der so genannten "Patch-Clamp"-Methode gemessen werden. Wie im Detail
in den spezifischen Beispielen hierin beschrieben wird, können die
mit der DNA transfizierten Säugetierzellen,
die für
die vorliegenden AMPA-bindenden GluR4-Rezeptoren kodieren, auch
verwendet werden, um die Ionenkanalaktivität zu modulieren, die durch
einen gegebenen Liganden induziert wird.
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Zusätzlich zur Verwendung der rezeptorkodierenden
DNA zur Konstruktion von Zelllinien, die für das Ligandenscreening nützlich sind,
kann die Expression der DNA nach einem weiteren Aspekt der Erfindung durchgeführt werden,
um Fragmente des Rezeptors in löslicher
Form zur Strukturuntersuchung, zur Herstellung von Antikörpern und
für andere
experimentelle Zwecke herzustellen. Es wird erwartet, dass der Teil
des AMPA-bindenden humanen GluR4B-Rezeptors, der für die AMPA-Bindung
verantwortlich ist, sich auf der Zellaußenseite befindet, d. h. extrazellulär ist. Es
ist daher wünschenswert,
zunächst
die Charakterisierung der Rezeptor-Liganden-Interaktion durch Bereitstellen
dieser extrazellulären
ligandenbindenden Domäne
in einer Menge und in einer isolierten Form zu fördern, d. h. frei vom Rest
des Rezeptors. Um dies zu erreichen, kann die DNA, die für den AMPA-bindenden
humanen GluR-Rezeptor der vollen Länge kodiert, durch stellenspezifische
(engl. site directed) Mutagenese modifiziert werden, so dass ein
translationales Stopp-Kodon in der extrazellulären, N-terminalen Region eingeführt wird,
und zwar unmittelbar vor der Sequenz, die für die erste Transmembrandomäne (TM1)
kodiert, d. h. vor dem Rest 526, wie in 1 (SEQ ID NR: 1) gezeigt. Da keine Transmembrandomäne(n) mehr
produziert wird/werden, um den Rezeptor in der Membran zu "verankern", wird die Expression
des modifizierten Gens nur zur Sekretion der extrazellulären Ligandenbindungsdomäne in löslicher
Form führen.
Standard-Ligandenbindungstests können
dann durchgeführt
werden, um den Grad der Bindung einer Kandidatenverbindung an die
so hergestellte extrazelluläre
Domäne
zu bestimmen. Es kann natürlich
notwendig sein, unter Verwendung von stellenspezifischer Mutagenese
einige verschiedene Versionen der extrazellulären Regionen zu erzeugen, um
den Grad der Ligandenbindung der isolierten Domäne zu optimieren.
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Zur Verwendung in erfindungsgemäßen Ligandenbindungtests
werden die AMPA-bindenden Fragmente des Rezeptors zunächst auf
einem festen Träger
verankert unter Verwendung einer beliebigen unter verschiedenen
Methoden. In einem Verfahren kann das C-terminale Ende des Rezeptorpeptidfragmentes
an einen derivatisierten unlöslichen
Polymerträger,
z.B. kreuzvernetztes Polystyren oder Polyamidharz, gekoppelt werden.
Wenn es einmal an dem festen Träger
verankert ist, ist das Fragment nützlich, um Kandidatenliganden auf
Rezeptorbindungsaffinität
zu screenen. Für
diesen Zweck werden üblicherweise
Ligandenbindungstests des Kompetitionstyps, wie oben beschrieben
für die
Verwendung des Gesamtlängenrezeptors,
verwendet. Die an einem festen Träger gesicherten Fragmente werden
an einen natürlichen
Liganden, d. h. AMPA, in Gegenwart eines Kandidatenliganden gebunden.
Entweder AMPA oder der Kandidatenligand wird markiert, z.B. radioaktiv,
und im Anschluss an eine geeignete Inkubationszeit wird der Grad
der AMPA-Verdrängung
durch Messen der Menge des gebundenen oder ungebundenen Markers
bestimmt.
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Alternativ kann es wünschenswert
sein, eine extrazelluläre
Domäne
des Rezeptors herzustellen, die nicht vom Amino-Terminus des reifen
Proteins abstammt, sondern eher vom Carboxy-Terminus, z.B. von Domänen, die
unmittelbar an die vier te Transmembrandomäne (TM4) folgen, d. h. die
zwischen den Aminosäureresten
814 bis einschließlich
881 liegen (1 SEQ ID
NR: 1 und 2). In diesem Fall können
die stellenspezifische Mutagenese und/oder PCR-basierte Amplifikationsrnethoden
einfach verwendet werden, um ein definiertes Fragment des Gens,
das für
die Rezeptordomäne
von Interesse kodiert, bereitzustellen. Eine solche DNA-Sequenz
kann verwendet werden, um die Expression des gewünschten Rezeptorfragments entweder
intrazellulär
oder in sekretierter Form zu steuern, vorausgesetzt, dass die DNA,
die für
das Genfragment kodiert, in Nachbarschaft zu einem Translationsstartkodon,
das vom Expressionsvektor bereitgestellt wird, inseriert wird, wobei
der erforderliche Translationsleserahmen sorgfältig beibehalten wird.
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Man wird erkennen, dass die Herstellung
von solchen AMPA-bindenden Fragmenten des AMPA-bindenden humanen
GluR4B-Rezeptors in einer Vielzahl von Wirtszellen erreicht werden
kann. Säugetierzellen, wie
CHO-Zellen, können
für diesen
Zweck verwendet werden, wobei die Expression typischerweise von
einem Expressionspromotor gesteuert wird, der in der Lage ist, Expression
auf hohem Niveau zu steuern, z.B. der CMV(Cytomegalovirus)-Promotor.
Alternativ können
Nicht-Säugerzellen,
wie z.B. Sf9(Spodoptera frugiperda)-Insektenzellen, verwendet werden,
wobei die Expression typischerweise durch Expressionspromotoren von
Baculovirus gesteuert wird, zum Beispiel dem starken, späten Promotor
des Polyhedrinproteins. Zur Sekretion von großen Mengen an derartigen extrazellulären Domänen des
EAA-Rezeptors können
auch Expressionssysteme basierend auf filamentösen Pilzen verwendet werden.
Zum Beispiel würde
Aspergillus nidulans ein derartiges akzeptables System darstellen,
wobei die Expression durch den alcA-Promotor gesteuert wird. Man
wird erkennen, dass zusätzlich
zu derartigen Expressionswirten jedes beliebige prokaryotische oder
andere eukaryotische Expressionssystem, welches in der Lage ist,
heterologe Gene oder Genfragmente zu exprimieren, ob intrazellulär oder extrazellulär, gleichermaßen akzeptabel
wäre.
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In einem weiteren Aspekt stellt die
vorliegende Erfindung auch markierte Antikörper gegen den humanen AMPA-bindenden
Glu-R4B-Rezeptor zur Verwen dung insbesondere beim Nachweis der Anwesenheit und/oder
Lokalisation des humanen GluR4B-Rezeptors, zum Beispiel in Gehirngewebe,
bereit. Um derartige Antikörper
zu erzeugen, können
als Immunogen entweder der intakte, lösliche Rezeptor oder ein immunogenes
Fragement davon, d. h. ein Fragment, das in der Lage ist, eine Immunantwort
auszulösen,
verwendet werden, welche in einem mikrobiellen oder in einem Säugerzellwirt
wie oben beschrieben oder durch standardmäßige Peptidsyntheseverfahren
hergestellt wurden. Für
die Verwendung als immunogene Fragmente besonders geeignete Regionen
des humanen GluR4B-Rezeptors
schließen
diejenigen ein, die in ihrer Sequenz mit einer extrazellulären Region
des Rezeptors korrespondieren, oder einen Teil der extrazellulären Region,
wie Peptide bestehend aus den Resten 1–525, oder ein Fragment davon
umfassend zumindest etwa 10 Reste, einschließlich insbesondere Fragmente
enthaltend die Reste 173–188
oder 474–517;
und Peptide, die der Region zwischen den Transmembrandomänen TM-2
und TM-3 entsprechen, wie ein Peptid bestehend aus den Resten 591–600. Peptide
bestehend aus der C-terminalen Domäne (Reste 814–881) oder
Fragmente davon können
auch für
die Erzeugung von Antikörpern
verwendet werden.
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Die Erzeugung von Antikörpern gegen
den ausgewählten
humanen AMPAbindenden GluR4B-Rezeptor oder gegen immunogene Fragmente
kann für
die polyklonale Antikörperherstellung
erreicht werden unter Verwendung von Immunisierungsprotokollen von
herkömmlichem
Design und einem beliebigen aus einer Vielzahl von Säugetierwirten,
wie zum Beispiel Schafen, Ziegen und Kaninchen. Alternativ dazu
können
für die Herstellung
von monoklonalen Antikörpern
Immunozyten, wie z. B. Splenozyten aus dem immunisierten Tier gewonnen
werden und unter Verwendung von Hybridomatechnologie mit einer Myelomzelle
fusioniert werden. Die Fusionsprodukte werden dann durch Kultivierung
in einem Selektionsmedium gescreent und Zellen, die Antikörper herstellen,
werden für
kontinuierliches Wachstum und Antikörpergewinnung gewonnen. Gewonnene
Antikörper
können
dann kovalent an einen detektierbaren Marker gekoppelt werden, wie
z. B. einen Radiomarker, einen Enzymmarker, einen lumineszenten
Mar ker oder Ähnliche,
und zwar unter Verwendung von für diesen
Zweck etablierter Linker-Technologie.
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In einer detektierbar markierten
Form, z. B. in radiomarkierter Form, können gemäß einem weiteren Aspekt der
vorliegenden Erfindung, DNA oder RNA, welche für einen humanen AMPA-bindenden
GluR4B-Rezeptor kodieren, und für
ausgewählte
Regionen davon, als Hybridisierungsproben verwendet werden, zum Beispiel,
um im humanen oder im Genom eines anderen Säugers (oder in einer cDNA-Bibliothek)
vorhandene sequenzverwandte Gene zu identifizieren oder um DNA,
die für
den humanen AMPA-bindenden GluR4B kodiert, in einer Probe, wie z.
B. Gehirngewebe, zu lokalisieren. Dies kann man tun unter Verwendung
von entweder der intakten kodierenden Region, oder eines Fragments
davon, die/das radiomarkierte, z. B. 32P,
Nukleotide in sich eingebaut hat. Um die den AMPA-bindenden humanen
GluR4B kodierende DNA in einer Probe zu identifizieren, ist es wünschenswert,
entweder die dafür
kodierende Volllängen-cDNA
oder ein für
sie einzigartiges Fragment zu verwenden. Mit Bezug auf 1 (SEQ ID NO: 1) schließen derartige
Nukleotidfragmente diejenigen ein, welche zumindest etwa 17 Nukleinsäuren umfassen
und welche andererseits in ihrer Sequenz einer Region, die für die extrazelluläre N-terminale
oder C-terminale Region des Rezeptors kodiert, entsprechen oder
eine 5'-untranslatierte
oder 3'untranslatierte
Region davon darstellen. Derartige Oligonukleotidsequenzen, und
die intakten Gene selbst, können
natürlich
verwendet werden, um mit Standard-Hybridisierungstechniken human Gene,
die dem humanen AMPA-bindenden GluR4B verwandt sind, und insbesondere cDNA-Äquivalente
davon, zu klonieren. In den folgenden besonderen Beispielen werden
Ausführungsformen der
vorliegenden Erfindung beschrieben, wobei die Beispiele nicht als
limitierend ausgelegt werden sollen.
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Beispiel 1-Isolierung
von für
den humanen AMPA-bindenden GluR4B-Rezeptor kodierender DNA
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cDNA, die für den humanen AMPA-bindenden
GluR4B-Rezeptor kodiert, wurde identifiziert, indem man cDNA aus
humanem Fötusgehirn,
die als eine EcoRI basierende Lambdaphagenbibliothek (lambda ZAP) von
Strategene Cloning Systems (La Jolla, California, USA) erhalten
wurde, untersuchte. Die cDNA-Bibliothek wurde
unter Verwendung von zwei Oligonukleotidsonden, welche in der Lage
waren, sich an die Sequenz des GluR4-Rezeptors aus der Ratte, wie
von Keinanen et al., supra, berichtet, anzulagern, gescreent. Die
genauen Sequenzen der 32P-markierten Sonden
werden unten zur Verfügung
gestellt:
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Die cDNA-Bibliothek aus fötalem Gehirn
wurde unter Verwendung der folgenden Hybridisierungsbedingungen
gescreent; 6 × SSC,
25% Formamid, 5% Denhardt's
Lösung,
0,5% SDS, 100 μg/ml
denaturierte Lachssperma-DNA, 42°C.
Die Filter wurden mit 2 × SSC
enthaltend 0,5% SDS bei 25°C
5 Minuten lang gewaschen, gefolgt von einem 15-minütigen Waschschritt
bei 50°C
mit 2 × SSC
enthaltend 0,5% SDS. Der letzte Waschschritt erfolgte mit 1 × SSC enthaltend
0,5% SDS 15 Minuten lang bei 50°C.
Die Filter wurden über Nacht
auf einen Röntgenfilm
(Kodak) exponiert. Von 106 gescreenten Klonen
wurden 2 cDNA-Inserts identifiziert, eines etwa 2,4 kb lang, als
RKCSFG43 bezeichnet, und ein weiteres etwa 4,2 kb lang, als RKCSFG102 bezeichnet.
Für die
Sequenzierung wurden die '43er-
und die '102er-Phagen
Plaque-gereinigt, dann als Phagemide gemäß den Anweisungen des Vertreibers
ausgeschnitten, um Bluescript-SK-Varianten der Phagemid-Vektoren, die Insert
enthielten, zu erzeugen. Die Sequenzierung des '43er Klons über seine gesamte Sequenz hinweg
offenbarte ein mutmaßliches
ATG-Initiationskodon
zusammen mit etwas 43 Basen an 5'-nicht-kodierender
Region und 2,4 Kilobasen an kodierender Region. Sequenzierung über das '102er Insert hinweg
offenbarte einen signifikannten Überlapp
mit dem '43er Insert
sowie ein Terminationskodon sowie etwa 438 Basen an 3'-nicht-translatierter
Sequenz.
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Um die gesamte kodierende Region
in einem intakten Klon zur Verfügung
zu stellen, wurde die in 2 gezeigte
Strategie eingesetzt, um den Phagemid pBS/humGluR4B zu erzeugen,
der die für
humanes GluR4B kodierende DNA als ein 4,0 kb EcoRI/HindIII-Insert
in einem 3,0 kb Bluescript-SK-Phagemid-Hintergrund trägt. Die gesamte Sequenz des
EcoRUHindIII-Inserts ist in 1 (SEQ
ID NO: 1) zur Verfügung
gestellt.
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Dieser Phagemid, pBS/humGluR4B, wurde
unter den Maßgaben
des Budapester Vertrags bei der "American
Type Culture Collection" in
Rockville, Maryland, USA, am 21. Juli 1992 hinterlegt und ihm wurde
die Zugangsnummer ATCC 75279 zugeteilt.
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Beispiel 2 – Konstruktion
von genetisch modifizierten Zellen, die AMPAbindendes humanes GluR4B
herstellen
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Zur transienten Expression in Säugerzellen
wurde cDNA, die für
den AMPAbindenden humanen GluR4B-Rezeptor kodiert, in den Säugerexpressionsvektor
pcDNA1 eingeschlossen, welcher von Invitrogen Corporation (San Diego,
Kalifornien, USA; Katalognummer V490-20) im Handel erhältlich ist.
Dieser ist ein multifunktionaler 4,2 kb Plasmidvektor, der für die cDNA-Expression
in eukaryotischen Systemen und für
cDNA-Analyse in Prokaryoten ausgelegt ist. Auf dem Vektor eingebaut
sind der CMV-Promotor und -Enhancer, ein Splice-Segment und ein
Polyadenylierungssignal, ein SV40- und Polyomavirus-Replikationsursprung
und ein M13-Ursprung, um einzelsträngige DNA zur Sequenzierung
und Mutagenese gewinnen zu können,
Sp6- und T7-RNA-Promotoren für
die Herstellung von Sinn- und Gegensinn-(engl. "sense" und "antisense")-RNA-Transkripten und ein Col E1-artiger
Plasmid-Ursprung für
hohe Kopienzahl. Angemessen stromabwärts des CMV-Promotors (und
3' des T7-Promotors)
befindet sich ein Polylinker.
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Die in 3 dargestellte
Strategie wurde angewendet, um den Einbau der den AMPA-bindenden GluR4B-Rezeptor
kodierenden cDNA in einen Expressionsvektor zu erleichtern. Das
cDNA-Insert wurde zuerst aus pBS/humGluR4B als ein 2,9 kb langes
HindIII/Ec1136II-Fragment freigesetzt, welches dann an den HindIII/EcoRV-Stellen
in den pcDNAI-Polylinker eingebaut wurde. Eine Sequenzierung über die
Verbindungsstellen hinweg wurde durchgeführt, um die richtige Orientierung
des Inserts in pcDNAI zu bestätigen.
Das resultierende Plasmid, bezeichnet als pcDNAI/humGluR4B, wurde
dann zur transienten Expression in einen ausgewählten Säugerzellwirt, in diesem Fall
die vom Affen stammenden, Fibroblasten-artigen Zellen der COS-1-Abstammungslinie
(erhältlich
von der "American
Type Culture Collection",
Rockville, Maryland, als ATCC CRL 1650) eingeführt.
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Für
die transiente Expression der für
GluR4B kodierenden DNA wurden COS-1-Zellen mit etwa 8 μg DNA (als pcDNAl/humGluR4B)
pro 106 COS-Zellen transfiziert, und zwar
durch DEAE-vermittelte DNA-Transfektion, und mit Chloroquin gemäß dem von
Maniatis et al., supra, beschriebenen Verfahren behandelt. Kurz dargestellt
wurden COS-1-Zellen bei einer Dichte von 5 × 106 Zellen/Platte
ausplattiert und dann 24 Stunden lang in mit FBS supplementiertem
DMEM/F12-Medium wachsen gelassen. Das Medium wurde dann entfernt und
die Zellen wurden in PBS und dann in Medium gewaschen. Dann wurde
auf die Zellen 10 ml einer Transfektionslösung enthaltend DEAE Dextran
(0,4 mg/ml), 100 μM
Chloroquin, 10% NuSerum, DNA (0,4 mg/ml) in DMEM/F12-Medium appliziert.
Nach 3-stündiger
Inkubation bei 37°C
wurden Zellen in PBS und Medium wie gerade beschrieben gewaschen
und dann 1 Minute lang mit 10% DMSO in DMEM/F12-Medium geschockt. Man
ließ die
Zellen 2–3
Tage lang in mit 10% FBS supplementiertem Medium wachsen und am
Ende der Inkubation wurden die Platten auf Eis gestellt, mit eiskaltem
PBS gewaschen und dann durch Abkratzen entfernt. Die Zellen wurden
durch 10-minütige
Zentrifugation bei 1000 Upm geerntet und das zelluläre Pellet
wurde zur folgenden Verwendung in Ligandenbindungstests in flüssigem Stickstoff
eingefroren. Northern-Blot-Analyse eines aufgetauten Aliquots von
gefrorenen Zellen bestätigte
die Expression der für
den Rezeptor kodierenden cDNA in den gelagerten Zellen.
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In ähnlicher Weise können auch
stabil transfizierte Zelllinien unter Verwendung von zwei verschiedenen
Zelltypen als Wirt hergestellt werden: CHO K1 und CHO Pro5. Um diese
Zelllinien zu konstruieren, wird cDNA, die für AMPA-bindenden humanen GluR4B
kodiert, in den Säugerexpressionsvektor
pRC/CMV (Invitrogen), welcher stabile Expression ermöglicht,
eingebaut. Die Insertion an dieser Stelle platzierte die cDNA unter
die Expressionskontrolle des Cytomegalovirus- Promotors und stromaufwärts von
der Polyadenylierungsstelle und dem Terminator des bovinen Wachstumshormon-Gens,
und in einen Vektorhintergrund, welcher das Neomycin-Resistenzgen
(gesteuert vom SV40 frühen
Promotor) als selektierbaren Marker umfasst.
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Um die wie oben beschrieben konstruierten
Plasmide einzuführen,
werden die CHO-Wirtszellen zuerst bei einer Dichte von 5 × 105 in mit 10% FBS supplementiertem MEM-Medium
ausgesät.
Nach 24-stündigem Wachstum
wird frisches Medium den Platten zugegeben und drei Stunden später werden
die Zellen unter Verwendung des Calciumphosphat-DNA-Kopräzipitationsverfahrens
transfiziert (Maniatis et al., supra). Kurz dargestellt werden 3 μg DNA mit
gepufferter Calciumlösung
gemischt und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Ein gleiches
Volumen an gepufferter Phosphatlösung
wird zugegeben und die Suspension 15 Minuten lang bei Raumtemperatur
inkubiert. Als nächstes
wird die inkubierte Suspension 4 Stunden lang zu den Zellen gegeben,
entfernt und dann wurden Zellen mit Medium enthaltend 15% Glycerin
geschockt. Drei Minuten später
werden die Zellen mit Medium gewaschen und 24 Stunden lang bei normalen
Wachstumsbedingungen inkubiert. Zellen, die gegen Neomycin resistent
sind, werden in mit 10% FBS supplementiertem alpha-MEM-Medium enthaltend
G418 (1 mg/ml) selektioniert. Etwa 2–3 Wochen später werden
Einzelkolonien von G418-resistenten
Zellen isoliert, klonal selektioniert und dann für Testzwecke fortgepflanzt.
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Beispiel 3 – Ligandenbindungstests
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Transfizierte Zellen im gefrorenen
Zustand wurden in eiskaltem destilliertem Wasser unter Verwendung
eines Handhomogenisators resuspendiert, 5 Sekunden lang beschallt
und dann 20 Minuten lang bei 30.000 g zentrifugiert. Der Überstand
wurde verworfen und das Membranpellet gefroren bei –70°C gelagert.
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Pellets aus COS-Zellmembranen wurden
in eiskaltem 50 mM Tris-HCl (pH 7,55, 5°C) resuspendiert und nochmals
bei 50.000 g 10 Minuten lang zentrifugiert, um endogenes Glutamat
zu entfernen, welches um die Bindung kompetitieren würde. Die
Pellets wurden in eiskaltem 50 mM Tris-HCl (pH 7,55) Puffer resuspendiert und
die resultierende Membranzubereitung wurde als Gewebequelle für Bindungsexperimente
wie unten beschrieben verwendet. Proteine wurden unter Verwendung
des Pierce-Reagens bestimmt, mit BSA als Standard.
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Dann wurden die Bindungstests durchgeführt unter
Verwendung einer Menge an von COS stammenden Membranen, die äquivalent
war mit von 25–100 μg, wie durch
Proteinbestimmung beurteilt, und ausgewähltem und radiomarkiertem Liganden.
Insbesondere bestanden für
AMPA-Bindungstests die Inkubationsmischungen aus 25–100 μg Gewebeprotein
und D,L-alpha-[5-Methyl-3H]amino-3-hydroxy-5-methylisoxazol-4-propionsäure (3H-AMPA,
27,6 Ci/mMol, 10 nM Endkonzentration) mit 0,1 M KSCN und 2,5 mM
CaCl2 im 1 ml Endvolumen. Nicht-spezifische
Bindung wurde in Gegenwart von 1 mM L-Glutamat bestimmt. Die Proben wurden
60 Minuten lang auf Eis in Plastik-Minifläschchen inkubiert, und gebundener
und freier Ligand wurden voneinander durch 30-minütige Zentrifugation
bei 50.000 g getrennt. Die Pellets wurden zweimal in 4 ml kaltem Inkubationspuffer
gewaschen und dann wurde zur Zählung
5 ml Beckman-"Ready-Protein Plus"-Szintillationscocktail
zugegeben.
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Für
Kainat-Bindungstests bestanden die Inkubationsmischungen aus 25–100 μg Gewebeprotein
und [Vinyliden-3H] Kainsäure
(58 Ci/mMol, 5 nM Endkonzentration) im kalten Inkubationspuffer,
1 ml Endvolumen. Nicht-spezifische Bindung wurde in Gegenwart von
1 mM L-Glutamat bestimmt. Die Proben wurden wie im AMPA-Bindungstest
inkubiert, und gebundener und freier Ligand wurden durch schnelle
Filtration unter Verwendung eines Brandel-Zellernters und von GFB-Filtern,
die in eiskaltem 0,3% Polyethylenimin vorgetränkt worden waren, voneinander
getrennt. Die Filter wurden zwei Mal in 6 ml kaltem Inkubationspuffer
gewaschen und dann mit 5 ml Beckman-"Ready-Protein-Plus"-Szintillationscocktail für die Zählung in
Szintillationsfläschchen
gelegt.
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Die auf diese An durchgeführten Tests,
nämlich
unter Verwendung von Membranzubereitungen, die von den den AMPA-bindenden
humanen GluR4B-Rezeptor-produzierenden
COS-Zellen stammen, zeigten eine spezifische Bindung von etwa 92
fmol/mg Protein, bei 200 nM [3H]-AMPA (4). Scheintrans fizierte Zellen wiesen
keine spezifische Bindung irgendeines der getesteten Liganden auf.
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Scatchard-Analyse deutete darauf
hin, dass der rekombinant exprimierte AMPAbindende humane GluR4B-Rezeptor
eine einzige Klasse von Bindungsstellen für [3H]-markiertes
AMPA mit einer Dissoziationskonstante (Kd)
von etwa 56 ± 1,0
nM enthält
(5). Weiters fand man,
dass die maximale AMPA-Bindung (Bmax) des
AMPA-bindenden GluR4B-Rezeptors 533 ± 63 fmol/mg Protein beträgt.
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Diese Ergebnisse zeigen deutlich,
dass der humane GluR4B-Rezeptor AMPA mit Spezifität bindet. Diese
Aktivität,
zusammen mit der Tatsache, dass es geringe oder keine nachweisbare
Bindung von Kainat oder NMDA gibt, ordnet den AMPA-bindenden human
GluR4B-Rezeptor klar dem AMPA-Typ eines EAA-Rezeptors zu. Des Weiteren deutet dieses
Bindungsprofil darauf hin, dass der Rezeptor in einer authentischen Art
und Weise bindet und darum zuverlässig die Ligandbindungs-"Signatur" seines nicht-rekombinanten
Gegenstücks
aus dem humanen Gehirn vorhersagen kann. Diese Eigenschaften machen
den rekombinanten Rezeptor zur Selektion und Charakterisierung von
Ligandenverbindungen, die an den Rezeptor binden, besonders nützlich,
und/oder auch zur Selektion und Charakterisierung von Verbindungen,
die dadurch wirken können,
dass sie andere Liganden vom Rezeptor verdrängen. Die Isolierung der GluR4B-Rezeptorgene
in im Wesentlichen reiner Form und in der Lage, als eine einzige,
homogene Rezeptorspezies exprimiert zu werden, befreit darum den
Ligandenbindungstest von der mangelnden Präzision, welche eingeführt wird,
wenn komplexe, heterogene Rezeptorzubereitungen aus dem menschlichen
und anderen Säugergehirnen
verwendet werden, um derartige Charakterisierungen zu versuchen.
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Beispiel 4 – Kanalaktivitätstests
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Menschliche Nierenzellen (HEK293-Zellen,
ATCC CRL 1573) wurden vor der Transfizierung unter Verwendung von
Trypsin (GIBCO BRL) gesplittet. Die gesplitteten Zellen wurden auf
35 mm Platten bei einer Konzentration von etwa 25% Konfluenz ausplattiert
und 12–24
Stunden nach dem Ausplattieren wurden die Zellen 15 Minuten lang
gespült
unter Verwendung von MEM, das kein Serum enthielt.
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Zu 100 μl MEM ohne Serum wurden 2 μg Rezeptor-DNA
unter behutsamem Mischen zugegeben. Zu 100 μl MEM (kein Serum) wurden 5 μl Lipofektin-Reagens
(GIBCO BRL) unter behutsamem Mischen zugegeben, und gleiche Volumina
der DNA- und der Lipofektin-Mischungen wurden dann vereinigt und
man ließ sie 15
Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Während der letzten 5 Minuten
dieser Inkubation wurde die Lösung,
in der die Zellen suspendiert waren, entfernt und durch 1,5 ml frische
Lösung
ersetzt. Nachfolgend auf die 15-minütige Inkubation der DNA/Lipofektin-Mischung
wurden 200 μl
langsam zu den plattierten Zellen gegeben und die Zellen wurden
dann 24 Stunden lang bei 37°C
inkubiert. Die DNA/Lipofektin-Mischung wurde von den Zellen entfernt
und mit Serum enthaltendem MEM ersetzt. Die Zellen wurden bis zum
Gebrauch inkubiert, welcher innerhalb von 36–48 Stunden erfolgte.
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Ganz-Zellen-Spannungsklemmen-Aufzeichnungen
(engl. whole cell voltage clamp) wurden von den transfizierten Zellen
in der extrazellulären
Standard-Aufzeichnungslösung (140
mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,3 mM
CaCl2, 5 mM Hepes, Glucose bis zu einer
Osmolarität
von 300 mOsm, und pH mit Na-OH
eingestellt auf 7,2) erstellt. Die verwendeten Elektroden wurden
aus dünnwandigem
Borsilikatglas mit einer 1–2 μm Spitze
hergestellt und waren mit einer CsCl-basierten intrazellulären Lösung gefüllt. Die
Elektroden wurden mit den Zellmembranen verschmolzen, indem man
ein sanftes Saugen verwendete, so lange, bis sich eine Abdichtung
mit hohem Widerstand bildete. Unter Verwendung von weiterem negativem
Druck wurde die Membranstelle, die unter der Spitze der Elektrode
lag, entfernt und an die Elektrode unter Verwendung eines "Axopatch 1 B" geklemmt.
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Dosis-Response-Kurven wurden für Kainat,
L-Glutamat und AMPA bei einem Membranhaltepotenzial von –60 mV aufgezeichnet
(5). Der EC50 für sie wurde
als 145 μM,
32 μM bzw.
10 μM bestimmt.
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6 veranschaulicht
die elektrophysiologische Antwort der Zellen auf verschiedene Konzentrationen von
L-Glutamat. Das Haltepotenzial war in diesem Fall –60 mV.
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Die bei Verwendung der GluR4B-DNA-transfizierten
humanen Zellen beobachteten elektrophysiologischen Eigenschaften
sowie das beobachtete pharmakologische Ligandenbindungsprofil weisen
darauf hin, dass der GluR4B-Rezeptor per se genügt, um in Abwesenheit von anderen
Rezeptorkomplexkomponenten, die in der Natur existieren könnten, einen
aktiven Rezeptor/Ionenkanal-Komplex zu bilden.
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Diese elektrophysiologischen und
pharmakologischen Eigenschaften des AMPAbindenden humanen GluR4-Rezeptors
weisen darauf hin, dass der Rezeptor-Ionenkanalkomplex in einer authentischen
Art und Weise funktioniert und darum zuverlässig die elektrophysiologischen
Eigenschaften und die Ligandenbindungssignatur seines nicht-rekombinanten
Gegenstücks
aus dem intakten humanen Gehirn vorhersagen kann. Diese Eigenschaften
machen den rekombinanten Rezeptor für die Selektion und die Charakterisierung von
funktionalen Ligandenverbindungen, welche eine Ionenkanalantwort
dieser Rezeptoren modulieren oder bewirken können, besonders nützlich.
Zusätzlich
können
diese Rezeptor/ Ionenkanal-Komplexe verwendet werden, um Testliganden
zu identifizieren und zu charakterisieren, welche die Ionenkanalfunktion
blockieren können.
Die Isolierung des AMPA-bindenden humanen GluR4B-Rezeptorgens in
einer reinen Form, welche in der Lage ist, als einzelner, homogener
Rezeptor/Ionenkanal-Komplex exprimiert zu werden, befreit daher
den funktionalen Ligandentest von der mangelnden Präzision,
welche eingeführt
wird, wenn komplexe, heterogene Rezeptorzubereitungen aus humanem
Gehirn und aus Säugermodellsystemen,
zum Beispiel Ratte, verwendet werden, um derartige Charakterisierungen
zu versuchen.
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