DE69737561T2

DE69737561T2 - Klonierte rezeptoren des glukagon-ähnlichen peptids-2

Info

Publication number: DE69737561T2
Application number: DE69737561T
Authority: DE
Inventors: Donald G. Waterdown MUNROE; Ashwani K. Mississauga GUPTA; Tejal B. Mississauga VYAS; Kirk Mississauga McCALLUM; Ermi Toronto FAN
Original assignee: NPS Allelix Corp Canada
Current assignee: NPS Allelix Corp Canada
Priority date: 1996-12-13
Filing date: 1997-12-15
Publication date: 2008-03-06
Anticipated expiration: 2017-12-16
Also published as: DK0946591T3; JP2001507571A; ATE358682T1; EP0946591A2; WO1998025955A2; WO1998025955A3; EP0946591B1; AU5471298A; DK177593B1; CA2274989C; JP4106094B2; ES2287959T3; AU722821B2; DK199900825A; DE69737561D1; CA2274989A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie. Die Erfindung betrifft spezieller klonierte glucagon-ähnliche Peptid-2-Rezeptoren und deren Verwendung beim Medikamenten-Screening und verwandte Anwendungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das glucagon-ähnliche Peptid-2 (GLP-2) ist ein 33 Aminosäurepeptid, das in einer gewebebestimmten Weise aus dem pleiotrophen Glucagon-Gen exprimiert wird und in Bezug auf Aminosäuresequenz große Ähnlichkeit zu Glucagon und glucagon-ähnliches Peptid-1 (GLP-1) hat. Mammalia-Formen von GLP-2 sind in hohem Maße geschützt: beispielsweise unterscheiden sich die Human- und Degu-(ein Nagetier in Südamerika)Formen durch eine beziehungsweise drei Aminosäuren von Ratten-GLP-2. In neuerer Zeit wurde nachgewiesen, dass GLP-2 ein intestinotrophes Peptidhormon ist; wenn es exogen gegeben wird, kann GLP-2 eine ausgeprägte Erhöhung in der Proliferation vom kleinen Dünndarmepithel der Testmaus (Drucker et al, (1996) PNAS, 93:7911-7961) erzeugen. Vor kurzem ist gezeigt worden, dass GLP-2 die Deglucose-Maximaltransportrate durch die intestinale basolaterale Membran erhöht (Cheeseman and Tseng: American Journal of Physiology (1996) 271:GA77-G482). In der WO 93/19175 wird das Klonieren eines Ratten- und Human-GLP-1-Rezeptors offenbart.
Zur Beschleunigung der Forschung auf dem Gebiet der gastrointestinalen Biologie und der Entwicklung von Medikamenten, die bei der Behandlung verschiedener Krankheitszustände nützlich sind und einschließlich bei gastrointestinalen Erkrankungen, wäre es vorteilhaft, den Rezeptor bereitzustellen, durch den die Wirkungen von GLP-2 vermittelt werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Der GLP-2-Rezeptor ist jetzt kloniert und charakterisiert worden. Dementsprechend gewährt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynucleotid, welches einen GLP-2-Rezeptor kodiert und speziell Mammalia-Formen und Homologa davon einschließt, wie beispielsweise in speziellen Ausführungsformen die Ratten- und Human-Formen. In Aspekten der Erfindung wird ein Polynucleotid, welches einen GLP-2-Rezeptor kodiert, zur Expression genutzt, um ein funktionelles Rezeptorprotein zu erhalten und in wahlweise markierter Form für ein weiteres Gen-Klonieren, um die strukturell verwandten Rezeptorproteine zu identifizieren. In verwandten Aspekten der Erfindung werden Antisense-Versionen vom GLP-2-Rezeptor kodierenden Polynucleotiden und Fragmenten davon erhalten und zur Regulierung der GLP-2-Rezeptorexpression genutzt.
In einem der anderen Aspekte der Erfindung wird ein GLP-2-Rezeptor als ein Produkt der Rekombinationserzeugung in einem zellulären Wirt bereitgestellt. In verwandten Aspekten werden rekombinante Wirtszellen bereitgestellt, die einen GLP-2-Rezeptor exprimieren, sowie Rezeptor tragende Membranen, die von derartigen Zellen deriviert sind und Expressionskonstrukte, in denen ein auf dem GLP-2-Rezeptor kodierendes Polynucleotid, verknüpft ist mit Expressionskontrollen, die in den ausgewählten Wirtszellen funktionell sind.
In anderen Aspekten der Erfindung wird der GLP-2-Rezeptor in einen Screening-Programm auf Chemikalien genutzt, um GLP-2-Rezeptorliganden zu identifizieren. Diese Methode umfasst die Schritte des Inkubierens des Kandidatenliganden mit einer GLP-2-Rezeptor erzeugenden Zelle der vorliegenden Erfindung oder mit einem Membranpräparat, das daraus abgeleitet ist, und umfasst das anschließende Messen, ob ein Binden aufgetreten ist, bzw. das Maß in dem dieses erfolgte. Unter Verwendung von Zellen, die einen GLP-2-Rezeptor exprimieren, der funktionell mit einem zweiten Messengersystem gekoppelt ist, kann ein derartiges Binden indirekt bestimmt werden, um einen Liganden gegenüber einer Aktivität offen zu legen, indem ein entsprechender Reporter nachgewiesen wird.
In anderen Aspekten der Erfindung werden Antikörper bereitgestellt, die auf den GLP-2-Rezeptor gerichtet sind, und zwar beispielsweise zur Anwendung in diagnostischen Prozeduren.
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen eingehender beschrieben, worin sind:
KURZE BEZUGNAHME AUF DIE FIGUREN
1 offenbart eine cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 1), deren Nucleotide 137-1786 den Ratten-GLP-2-Rezeptor kodieren, worin mehrdeutige Basenpaare angegeben sind, indem die IUB-Standardnomenklatur zur Anwendung kommt (R: A oder G, Y: C oder T, M: A oder C, K: G oder T, S: G oder C, W: A oder T).
2 offenbart die Aminosäuresequenz des Expressionsproduktes (SEQ ID NO: 2) aus der cDNA von 1.
3 veranschaulicht die relativen Leistungsfähigkeiten von GLP-2-Peptid und GLP-1-Peptiden für den durch die SEQ ID NO: 1 kodierten Rezeptor.
4 offenbart eine cDNA-Sequenz von 667 Nucleotiden (SEQ ID NO: 9), die ein 222 Aminosäure-Fragment (SEQ ID NO: 10) eines Human-GLP-2-Rezeptor kodiert.
5 offenbart die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 10), die aus der cDNA von 4 exprimiert ist.
6 offenbart eine cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 11), deren Nucleotide 122-1780 einen Human-GLP-2-Rezeptor kodieren.
7 offenbart die Aminosäuresequenz des Expressionsproduktes (SEQ ID NO: 12) aus der cDNA von 6.
8 veranschaulicht die funktionelle Aktivierung durch GLP-2-Peptid des durch SEQ ID NO: 11 (8) kodierten Human-Rezeptors.
9 vergleicht die Aminosäuresequenzen des Ratten-GLP-2-Rezeptors und des Human-GLP-2-Rezeptors.
10 vergleicht die Aminosäuresequenzen des Ratten-GLP-2-Rezeptors und des Human-GLP-2-Rezeptors mit Ratten-GLP-1-Rezeptor.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG UND BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Erfindung betrifft in einem der Aspekte Polynucleotide und ihre isolierte Form, die auf GLP-2-Rezeptoren kodiert. Wie hierin verwendet, bedeutet "isoliert" abgetrennt von Polynucleotiden, welche andere Proteine kodieren. Im Zusammenhang mit Polynucleotid-Bibliotheken, wie beispielsweise das GLP- 2-Rezeptor kodierende Polynucleotid, wird "isoliert" dann angegeben, wenn es ausgewählt worden ist und damit aus dem Zusammenhang mit anderen Polynucleotiden innerhalb der Bibliothek herausgenommen ist. Derartige Polynucleotide können in Form einer RNA vorliegen oder in Form einer DNA und einschließlich cDNA, als genomische DNA und synthetische DNA. Die GLP-2-Rezeptoren sind durch strukturelle Merkmale charakterisiert, die sie mit der G-Protein-gekoppelten Rezeptorklasse gemein haben, einschließlich sieben Transmembranregionen, sowie durch die funktionellen Eigenschaften des selektiven Bindens von GLP-2-Peptid, das heißt überwiegend an GLP-1-Peptid. Ein solches selektives Binden zeigt sich mit einer deutlich größeren Bindungsaffinität an GLP-2 als an GLP-1 im Zusammenhang mit dem zur Messung einer solchen Affinität gewählten Assay. Wenn in einer Wirtszelle funktionell exprimiert, d.h. in funktionsfähiger Verknüpfung mit einem ansprechbaren zweiten Messengersystem, sind die GLP-2-Rezeptoren weiter fähig, auf ein GLP-2-Binden durch Signaltransduction zu reagieren. In diesem Zusammenhang lässt sich die Aktivität eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors, wie beispielsweise ein GLP-2-Rezeptor, unter Anwendung einer beliebigen Vielzahl geeigneter funktioneller Assays messen, in denen die Aktivierung des Rezeptors zu einer detektierbaren Änderung in der Größe eines bestimmen zweiten Messengersystems resultiert, wie beispielsweise Adenylatcyclase, Calcium-Mobilisierung, Inosit-Phospholipid-Hydrolyseprodukte oder Guanylyl-Cyclase.
Bezugnehmend auf 9 und 10, die Homologien über Aminosäuresequenzen darstellen, welche Human- und Ratten-GLP-2-Rezeptoren repräsentieren, sind Regionen mit einer Identität von 100% durch ausgefüllte vertikale Balken dargestellt. In Ausführungsformen der Erfindung sind die GLP-2-Rezeptoren strukturell als Rezeptoren definiert, die diese Regionen der Aminosäuresequenz inkorporieren und die ebenfalls die funktionelle Charakteristik des selektiven bindenden GLP-2-Peptids in Bezug auf GLP-1-Peptid zeigen. In spezielleren Ausführungsformen sind in die GLP-2-Rezeptorstruktur ferner solche Aminosäuren eingebaut, die über die Human- und Ratten-Rezeptorspezies stark geschützt sind (angegeben durch ":"). An diesen Stellen nimmt man an, dass die Sequenz eine beliebige Aminosäure im Inneren der stark geschützten Aminosäurefamilie enthalten kann, zu der die identifizierte Aminosäure gehört. In noch spezielleren Ausführungsformen haben die GLP-2-Rezeptoren eine Struktur, die noch weiter die mäßig geschützten Aminosäuren (angegeben durch ".") einbaut, was an diesen Stellen diejenigen Aminosäuren meint, die sich innerhalb der mäßig geschützten Familie befinden, zu der sie gehören. Außerhalb dieser Sequenzen kann die GLP-2-Rezeptorstruktur in den Ausführungsformen der Erfindung stark variieren, insofern nichtkonservative Aminosäure-Substitutionen möglich sind.
In einer der Ausführungsformen der Erfindung ist der GLP-2-Rezeptor ein Ratten-GLP-2-Rezeptor mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung ist dieser Ratten-GLP-2-Rezeptor durch die Polynucleotid-Sequenz SEQ ID NO: 1 kodiert. Dieses spezielle, den GLP-2-Rezeptor kodierende Polynucleotid wird auch als das WBR-Gen bezeichnet und ist eine cDNA mit Herkunft von der Ratte. Das Expressionsprodukt diese Polynucleotids baut die reife Form des GLP-2-Rezeptors ein und baut zusätzlich ein Sekretionssignal ein, das vor der Membranintegration des reifen GLP-2-Rezeptorsproduktes entfernt wird. Eine solche Signalsequenz kann von der Natur her an den Polypeptiden vorhanden sein oder ersetzt sein durch ein funktionell gleichwertiges Sekretionssignal, das zu dem GLP-2-Rezeptor heterolog ist. Das gewählte Austausch-Sekretionssignal wird von dem Expressionssystem abhängen, das zur Anwendung gelangt und wird im typischen Fall, jedoch nicht wesentlich zu dem gewählten Wirt endogen sein und ebenfalls im typischen Fall, jedoch nicht wesentlich, zu den gewählten Expression-kontrollierenden Sequenzen homolog sein.
Das exprimierte Ratten-GLP-2-Rezeptorprodukt (2, SEQ ID NO: 2) ist strukturell gekennzeichnet als eine einzelne 550 Aminosäuren-Polypeptidkette mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 72 kDa. Es sind zwei funktionelle Translationsstartstellen des Ratten-GLP-2-Rezeptors identifiziert worden, bei denen es sich um die Codons handelt, die Methionin 1 und Methionin 42 der SEQ ID NO: 2 kodieren. Ohne durch eine Analogie mit dem GLP-1-Rezeptor eingeschränkt sein zu wollen, wird angenommen, dass Reste 1-66 von SEQ ID NO: 2 abgespalten sind, um ein reifes Protein (d.h. die Aminosäuresequenz des Rezeptors, wie sie in der Zellenmembran auftritt) von 484 Aminosäuren bereitzustellen. In Bezug auf die Strukturdomänen dieses GLP-2-Rezeptors zeigt die Hydropathieanalyse und Sequenzanordnung mit verwandten Vertretern dieser Unterfamilie von G-Protein gekoppelten Rezeptoren sieben vermutliche Transmembrandomänen, von denen eine die Reste 181-203 einschließlich (TM I) überspannt und eine andere die Reste 211-230 (TM II) überspannt, eine dritte die Reste 262-285 (TM III) überspannt, eine vierte die Reste 300-321 (TM IV) überspannt, eine fünfte 339-362 (TM V) überspannt, eine sechste 386-405 (TM VI) überspannt und eine siebente 422-441 (TM VII) überspannt. Auf der Grundlage dieser Anordnung ist es wahrscheinlich, dass dieser GLP-2-Rezeptor in seiner natürlichen membrangebundenen Form aus einer N-terminalen extrazellulären Domäne besteht, gefolgt von einer hydrophoben Region, die sieben Transmembrandomänen enthält und eine intrazellulare 442-550-Aminosaure-C-terminale Domäne. Das Protein zeigt den höchsten Grad der Homologie zu dem Ratten-GLP-1-Rezeptor mit 49% Identität des Aminosäure-Niveaus.
In einer verwandten Ausführungsform ist der GLP-2-Rezeptor von humaner Herkunft (SEQ ID NO: 9) und baut das Human-GLP-2-Rezeptorfragment mit den Aminosäuren SEQ ID NO: 10 ein. Dieses Polynucleotid wurde unter Verwendung der Ratten-cDNA-Sequenz isoliert, wie nachfolgend verallgemeinert beschrieben wurde und in Beispiel 3 detailliert wird. In einer weiteren verwandten Ausführungsform der Erfindung ist die cDNA von humaner Herkunft (SEQ ID NO: 11) und kodiert die volle Länge des Human-GLP-2-Rezeptors mit den Resten 67-533 der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 12. Das Human-GLP-2-Rezeptor-Präkursorprodukt (7, SEQ ID NO: 12) ist strukturell als eine einzelne 553 Aminosäure-Polypeptidkette mit einen vorhergesagten Molekulargewicht von 72 kDa gekennzeichnet. Es wird angenommen, dass bei dem Ratten-GLP-2-Rezeptor diese Sequenz die Präkursorform des Human-GLP-2-Rezeptors ist, der eine N-terminale Signalsequenz einbaut, die durch funktionell gleichwertige heterologe Signalsequenzen ersetzt werden kann. Ohne eingeschränkt sein zu wollen, wird angenommen, dass die reife Form des Human-GLP-2-Rezeptors nach der Abspaltung der Reste 1-66 der SEQ ID NO: 12 (7) resultiert. In Bezug auf die strukturellen Domänen dieses GLP-2-Rezeptors zeigt die Hydropathie-Analyse und die Sequenzausrichtung mit verwandten Vertretern dieser Unterfamilie von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren sieben vermutliche Transmembrandomänen, von denen eine die Reste 181-203 einschließlich (TM I) überspannt, eine andere die Reste 211-230 (TM II) überspannt, eine dritte die Reste 262-285 (TM III) überspannt, eine vierte die Reste 300-321 (TM IV) überspannt, eine fünfte die Reste 339-362 (TM V) überspannt, eine sechste die Reste 386-405 (TM VI) überspannt und eine siebente die Reste 422-441 (TM VII) überspannt. Auf der Grundlage dieser Anordnung ist es wahrscheinlich, dass dieser GLP-2-Rezeptor in seiner natürlichen membrangebundenen Form aus einer N-terminalen extrazellulären Domäne besteht, gefolgt von einer hydrophoben Region, die sieben Transmembrandomänen enthält mit dazwischen angeordneten sechs kurzen hydrophilen Domänen und eine intrazelluläre Domäne, von der vorhergesagt wird, dass sie die Reste 442-553 überspannt. Eine zweite Form dieses GLP-2-Rezeptors hat erfindungsgemäß eine translationale Startstelle an dem Methionin-Codon in den Positionen 26 der Aminosäuresequenz, die in 7 mit SEQ ID NO: 12 dargestellt wird. Die resultierenden 528 Aminosäure-Polypeptidkette besteht auch aus einer extrazellulären Domäne, aus sieben Transmembrandomänen und einer C-terminalen intrazellulären Domäne und ist mit mindestens 95% identisch in der Sequenz zu den Resten 26-553 der Sequenz, die in 7 mit SEQ ID NO: 12 dargestellt wird.
In einer anderen Ausführungsform gewährt die Erfindung GLP-2-Rezeptor-Polynucleotidsequenzen und deren einmalige Sequenzfragmente als ein Instrument, das zur Identifikation und Isolation strukturell verwandter Polynucleotide verwendbar ist. Zur Erleichterung der Isolation von Ratten-GLP-2-Rezeptor-Genhomologa, die auch GLP-2-Rezeptor kodieren, sind Stringenzbedingungen nach Möglichkeit verschärft, um Homologa zu identifizieren, die über mindestens 80% (mittlere Stringenz) Sequenzidentiät-Homologie an dem Polynucleotid-Level zum Rezeptorgen verfügen. Noch wünschenswerter ist, wenn die WBR-Gen-Homologa 90% identisch sind (hohe Stringenz) und noch wünschenswerter, wenn sie mindestens 95% Sequenzidentität (hohe Stringenz) im Vergleich zu WBR haben. Vorzugsweise sind die isolierten WBR-Homologa dadurch gekennzeichnet, dass sie (1) unter Verwendung von PCR-Primern der SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 amplifiziert werden können und dass sie (2) an der Sonde der SEQ ID NO: 5 unter hohen Stringenzbedingungen binden.
Noch mehr bevorzugt sind die isolierten Homologa solche, die unter den Bedingungen einer hohen Stringenz mit Consensusregionen der GLP-2-Rezepor-kodierenden Polynucleotide binden, d.h. solche Regionen der Ratten- und Human-GLP-2-Rezeptor kodierenden Polynucleotide, die identisch sind und in Bezug auf GLP-1-Rezeptor kodierende Sequenzen auch zu den GLP-2-Rezeptor kodierenden Polynucleotiden einmalig sind. Die Ausrichtung dieser Art zeigt eine Reihe von Consensusregionen für GLP-2: beispielsweise Nucleotide, die 1460-1786 überspannen. In einer der Ausführungsformen der Erfindung stellen diese Sequenzen und ihre Komplimente Polynucleotid-Fragmente dar, die, wie grade für das intakte Gen beschrieben wurde, zur Identifikation von Polynucleotiden verwendbar sind, die strukturell mit dem Human- und Ratten-GLP-2-Rezeptor in den Ausführungsformen der Erfindung verwandt sind.
In einer ähnlichen Ausführungsform kann die cDNA-Sequenz oder die einmaligen Fragmente des GLP-2-Rezeptors und am meisten bevorzugt des Human-GLP-2-Rezeptors in geeignet markierter Form, zum Beispiel p³²-markiert, zur Diagnose von Erkrankungen in Verbindung mit einer fehlerhaften Expression des GLP-2-Rezeptors verwendet werden. Dieses gilt beispielsweise für eine Über- oder Unterexpression oder Expression in einem ungeeigneten Gewebe. In einer der Ausführungsformen können geeignete PCR-Primer (zum Beispiel Regionen, die für den GLP-2-Rezeptor einmalig sind, zwischen den Spezies jedoch erhalten bleiben) diagnostisch zur Identifikation von einer abweichenden Struktur oder Menge von GLP-2-Rezeptor-mRNA verwendet werden, zum Beispiel in Verbindung mit vererbten oder erworbenen Erkrankungszuständen.
Es ist festgestellt worden, dass der GLP-2-Rezeptor sich am Chromosom 17P13 befindet. Damit gewährt die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform Expressionsprodukte von diesem Locus, der mit dem Human-GLP-2-Rezeptor-Polynucleotid (6; SEQ ID NO: 11) unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
Als Ausgangsmaterial zur Isolierung von GLP-2-Rezeptor kodierenden Homologa des Ratten-GLP-2-Rezeptor kodierenden Polynucleotid-Gens ist es wünschenswert, wenn auch nicht erforderlich, Bibliotheken von fötalen oder reifen Hypothalamos; jejunalen Rautenhirn oder Magengewebe zu verwenden, das aus der Spezies der Vertebraten mit dem Ziel zur Rezeptorisolation erhalten wurde. Dementsprechend ist in die Erfindung nicht nur das Ratten-GLP-2-Rezeptor kodierende Polynucleotid der SEQ ID NO: 1 einbezogen, sondern auch strukturelle Homologa davon und speziell solche, die auf Proteine kodieren, die über GLP-2-Rezeptor-Eigenschaften verfügen. Wie nachfolgend exemplifiziert werden wird, ist das WBR-Gen erfolgreich als Ausgangsmaterial zum Klonieren des Humanhomolog des Ratten-GLP-2-Rezeptors verwendet worden. Damit gewährt die Erfindung Polynucleotide, die GLP-2-Rezeptoren kodieren und einschließlich Ratten-GLP-2-Rezeptor und Homologa der Vertebraten und speziell Homologa der Mammalia davon und einschließlich Humanhomologa, sowie synthetische Varianten von diesen.
Wie bereits ausgeführt, gilt als offensichtlich, dass derartige Homologa auch in Bibliotheken mit Hilfe eines Screenings mit Fragmenten des Ratten-Rezeptorgens oder des Human-Homologs identifiziert werden können, die mindestens 15 Nucleotide eingebaut haben und bevorzugt mindestens 25 Nucleotide. In Verbindung mit der SEQ ID NO: 1 und der Nucleotid-Nummerierung, die darauf erscheint, schließen geeignete Nucleotidfragmente zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Konsensus-Nucleotidfragmenten solche ein, die in der Sequenz mit der extrazellulären GLP-2-bindenen Domäne in Übereinstimmung stehen, sowie den geforderten Transmembranregionen und dem C-terminalen Abschnitt des Rezeptors.
Technisch lässt sich die Identifikation des GLP-2-Rezeptors dadurch erzielen, dass Standardmethoden der Hybridisierung und Amplifikation auf eine gewebederivierte Nucleotid-Bibliothek angewendet werden. Es steht eine große Vielzahl derartiger Bibliotheken kommerziell zur Verfügung. Wo ein Aufbau einer cDNA-Bibliothek erforderlich ist, lassen sich etablierte Methoden anwenden. Beispielsweise wird die Isolation eines solchen WBR-Homologs im typischen Fall die Extraktion der gesamten Messenger-RNA von einer frischen Gewebequelle umfassen, wie beispielsweise hypothalamisches, jejunales Magen- oder Rautenhirngewebe, und bevorzugt hypothalamisches Gewebe oder Zelllinien, die von diesen Geweben deriviert sind, gefolgt von einer Umwandlung der Information zur cDNA und Erzeugung einer Bibliothek in beispielsweise einem bakteriellen Plasmid und noch typischer einer Bakteriophage. Eine solche Fragmente der DNA aufnehmende Bakteriophage wird im typischen Fall durch Ausstreichen auf einem Rasen von empfänglichen E-Coli-Bakterien aufgezogen, sodass die einzelnen Phagenplaques oder Kolonien isoliert werden können. Die von der Phagenkolonie mitgeführte DNA wird sodann im typischen Fall auf einer Nitrocellulose- oder einer Hybridisierungsmembrane auf Nylonbasis immobilisiert und anschließend hybridisiert unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen, und zwar auf eine radioaktiv (oder auf andere Weise) markierte Sondensequenz, um die spezielle Phagenkolonie zu identifizieren, die das Fragment der DNA mitführt, das von speziellem Interesse ist, wobei in diesem Fall es sich um ein Ratten- oder Human-GLP-2-Homolog handelt. Das Phagen-Mitführen des speziellen Gens, das von Interesse ist, wird sodann von allen anderen Phagen aus der Bibliothek gereinigt, damit sich das Fremdgen leichter charakterisieren lässt. Im typischen Fall wird das Gen oder ein Abschnitt davon anschließend der Einfachheit halber durch Subklonieren in einem Plasmidvektor isoliert und speziell in Bezug auf die volle Bestimmung seiner DNA-Sequenz.
Als eine Alternative, eine GLP-2-kodierende DNA direkt als ein DNA-Insert von einer verfügbaren oder aufgebauten cDNA-Bibliothek zu erhalten, kann diese angesichts der erfindungsgemäßen Offenbarung de novo unter Anwendung etablierter Methoden der Gensynthese synthetisch dargestellt werden. Aufgrund der Länge der GLP-2-Rezeptor kodierenden DNAs der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 11, kann die Anwendung der automatischen Synthese den stufenweisen Genaufbau erfordern, wobei Regionen des Gens mit einer Länge von bis zu etwa 300 Nucleotiden einzeln synthetisch dargestellt werden und anschließend in der korrekten Reihenfolge für den abschließenden Zusammenbau ligiert werden. Einzeln synthetisierte Genregionen lassen sich mit Hilfe der PCR amplifizieren. Die Anwendung einer automatischen Synthese kann im typischen Fall mit Hilfe von einer synthetischen Darstellung spezifischer Regionen oder Fragmente des Gens erfolgen, die in der Regel über vorbestimmte Überlappungen in der korrekten Reihenfolge unter Erzeugung der endgültigen Gensequenz ligiert werden. In diesem Fall sind umso weniger Ligierungen erforderlich, um so länger die Oligonucleotid-aufbauenden Blöcke sind, woraus sich ein leichterer Zusammenbau ergibt.
Die Anwendung von Methoden der automatischen Gensynthese gewährt eine Gelegenheit zur Erzeugung von Sequenzvarianten des natürlich auftretenden GLP-2-Rezeptorgens. Beispielsweise gilt als anerkannt, dass die Polynucleotide, die auf den GLP-2-Rezeptor kodieren und hierin beschrieben sind, durch Substituieren von 16 bis 20 Codons für solche erzeugt werden können, die in den hierin gewährten, natürlich auftretenden Polynucleotidsequenzen dargestellt sind, und dass derartige "Varianten" innerhalb des Schutzumfanges der Erfindung liegen. Darüber hinaus können die hierin bereitgestellten Polynucleotide, die auf synthetische Varianten des GLP-2-Rezeptors kodieren, erzeugt werden, die von 1 bis 20 und zum Beispiel von 1 bis 5 Aminosäure-Substitutionen oder -Deletionen oder -Hinzufügungen eingebaut haben. Bevorzugte Stellen für eine solche Modifikation schließen Bereiche einer Nicht-Homologie zwischen der Ratten- und Humansequenz ein, wie beispielsweise Aminosäuren im Bereich von 70 bis 92, 328 bis 350 und 475 bis 504. Da im typischen Fall angestrebt werden wird, das natürliche, ligandenbindende Profil des Rezeptors für Zwecke des Screenings zu bewahren, ist es wünschenswert, die Aminosäure-Substitutionen beispielsweise auf die so genannten konservativen Ersetzungen zu beschränken, in denen Aminosäuren mit ähnlicher Ladung substituiert werden (9), und die Substitutionen auf solche Stellen zu beschränken, die für die Rezeptoraktivität weniger kritisch sind. Beispielsweise liefert einen funktionellen Rezeptor die Substitution von Nucleotiden "G" und "A" für Nucleotide "A" bzw. "G" an den Positionen 374 und 375 der Human-cDNA-Sequenz SEQ ID NO: 11, was zu der Auswechslung des natürlich auftretenden Arginin-Restes an Position 85 der SEQ ID NO: 12 durch einen Glutaminsäure-Rest führt. Dieser funktionelle Rezeptor wird hierin bezeichnet als der Glu⁸⁵-variante Human-GLP-2-Rezeptor.
Nachdem man ein GLP-2-Rezeptor kodierendes Polynucleotid erhalten hat, kann der GLP-2-Rezeptor auf einer Reihe von Wegen erzeugt werden, einschließlich einer in vitro-Transkription und über den Einbau der DNA in einen geeigneten Expressionsvektor und Expression in den geeigneten Wirt, wie beispielsweise in ein Bakterium wie E.coli in Hefe oder in eine Insekten- oder Mammalia-Zelle. Es ist eine Mannigfaltigkeit von Genexpressionssystemen zur Verwendung mit diesen Wirten ausgelegt worden und es steht jetzt kommerziell zur Verfügung, sodass jedes beliebige dieser Systeme zur Steuerung der Expression von der GLP-2-Rezeptor kodierender DNA ausgewählt werden kann. Es können Expressionsvektoren ausgewählt werden, um transformierte Zelllinien zu schaffen, welche die rezeptorkodierende DNA entweder kurzzeitig oder in einer stabilen Form kodieren. Bei einer kurzzeitigen Expression werden Wirtszellen im typischen Fall mit einem Expressionsvektor transformiert, der einen Ursprung der Replikation funktionell in einer Mammalia-Zelle aufnimmt. Bei einer stabilen Expression sind derartige Replikationsursprünge unnötig, jedoch werden die Vektoren im typischen Fall ein Gen aufnehmen, das auf ein Produkt kodiert, welches den Transformanten einen Überlebensvorteil verschafft, um deren Selektion zu ermöglichen, wie beispielsweise ein Gen, das auf Neomycin-Beständigkeit kodiert, in welchem Fall die Transformanten in einem mit Neomycin angereicherten Medium auf Platten gezogen werden.
Diese Expressionssysteme sind im typischen Fall, aber nicht ausschließlich, in Form von Plasmidvektoren verfügbar und haben Expressionskassetten eingebaut, deren funktionelle Komponenten DNA einschließen, die Expression kontrollierende Sequenzen darstellen und wahlweise auch Signalpeptide, die Sequenzen kodieren, die wirtserkannt sind und zur Expression der Rezeptor kodierenden DNA in der Lage sind, wenn deren 5' gekoppelt ist. In die Systeme sind ferner DNA-Sequenzen eingebaut, welche die Expression terminieren, wenn 3' der Rezeptor kodierenden Region gekoppelt ist. Damit wird für die Expression in dem ausgewählten Mammalia-Zellwirt ein rekombinantes DNA-Expressionskonstrukt erzeugt, in welchem die Rezeptor kodierende DNA mit expressionskontrollierender DNA-Sequenzen gekoppelt ist, die von dem Wirt erkannt werden und in die eine Region 5' der Rezeptor kodierenden DNA einbezogen ist, um die Expression zu steuern, sowie eine 3'-Region zum Terminieren der Expression.
Einbezogen unter den zahlreichen rekombinanten DNA-Expressionssystemen, die verwendet werden können, um eine Mammalia-Zellexpression der Rezeptor kodierenden DNA zu erzielen, sind solche, bei denen Promotoren von Viren genutzt werden, welche Mammalia-Zellen infizieren, wie beispielsweise der Promotor des Cytomegalovirus (CMV), des Rous sarcoma-Virus (RSV), des Simian-Virus (SV40), den murinen Mamma-Tumorvirus (MMTV) und andere. Ebenfalls sind zur Steuerung der Expression Promotoren verwendbar, wie beispielsweise die LTR von Retroviren, Insektenzellen-Promotoren, wie beispielsweise solche, die durch Temperatur reguliert werden und von Drosophila isoliert wurden, sowie Mammalia-Genpromotoren, wie solche, die durch Schwermetalle reguliert werden, d.h. Metallothionein-Genpromotoren und andere steriod-induzierbare Promotoren.
In einem anderen der Aspekte der Erfindung werden Zellen oder davon abgeleitete Membranen gewährt, die durch genetische Veränderung zum Gebrauch, beispielsweise für die Identifikation von GLP-2-Rezeptorliganden, angepasst sind. In einer bevorzugten Ausführungsform sind solche Zellen genetisch durch Insertion eines Polynucleotids angepasst, welches auf einen GLP-2-Rezeptor kodiert. In besonders bevorzugten Ausführungsformen haben diese Zellen ein rekombinantes DNA-Molekül eingebaut, zum Beispiel ein Expressionskonstrukt/Vektor, worin DNA, die auf den GLP-2-Rezeptor kodiert und auf expressionskontrollierende Elemente funktionell in dem Wirt gekoppelt sind, um die Expression der DNA zu steuern. Zum Einbau eines Rezeptors in Zellplasma-Membranen kann der Vektor nach Erfordernis so ausgelegt sein, dass er eine geeignete heterologe Signalpeptidsequenz zum Austausch des Signalpeptids gewährt, das auf natürlichem Wege im Inneren der Rezeptor-DNA kodiert wird. Geeignete GLP-2-produzierende Zellen schließen die Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) zum Beispiel der K1-Verknüpfung (ATCC CCL 61) ein, einschließlich die Pro5-Variante (ATCC CRL 1281); die fibroblast ähnlichen Zellen, die von SV40-transformierter Niere des African-Green-Affen der CV-1-Linie (ATCC CCL 70) deriviert sind, der COS-1-Linie (ATCC CRL 1650) und der COS-7-Linie (ATCC CRL 1651); den Mäuse-L-Zellen, den Mäuse-3T3-Zellen (ATCC CRL 1658), Mäuse-C127-Zellen, embryonischen Human-Nierenzellen der 293-Linie (ATCC CRL 1573), Human-Carcinomzellen, einschließlich solche der HeLa-Linie (ATCC CCL 2) und Neuroblastomzellen der Linien IMR-32 (ATCC CCL 127), SK-N-MC (ATCC HTB 10) und SK-N-SH (ATCC HTB 11).
Zur Verwendung in Liganden-Screening-Assays können Zelllinien, die die rezeptorkodierende DNA exprimieren tiefgefroren für die spätere Verwendung aufbewahrt werden. Derartige Assays lassen sich entweder mit intakten Zellen ausführen oder mit Membranpräperaten, die von derartigen Zellen deriviert sind. Die Membranpräperate gewähren im typischen Fall ein bequemeres Substrat für die Ligandenbindungsexperimente und sind daher als bindende Substrate bevorzugt. Zur Herstellung von Membranpräperaten für Screeningzwecke, d.h. für Experimente des Ligandenbindens, werden tiefgefrorene intakte Zellen homogenisiert, während sie sich in einer Suspension von kaltem Wasser befinden, und ein Membranpellet nach der Zentrifugation aufgenommen. Das Pellet wird sodann in kaltem Wasser gewaschen und zur Entfernung etwaiger endogener GLP-2-Rezeptorliganden, die andernfalls mit dem Binden in den Assays konkurrieren würden, dialysiert. Die dialysierten Membranen lassen sich sodann in der bloßen Form verwenden oder können nach Aufbewahrung in lyophilisierter Form in den Ligandenbindungsassays verwendet werden.
Das Binden eines Kandidatliganden an einen ausgewählten GLP-2-Rezeptor der Erfindung lässt sich im typischen Fall unter Verwendung einer vorbestimmten Menge von zellderivierter Membran (gemessen zum Beispiel durch Proteinbestimmung) in der Regel mit etwa 25 μg bis 100 μg verwenden. Im Allgemeinen werden kompetitive Bindungsassays zur Bewertung der Affinität einer Testverbindung in Bezug auf GLP-2 nützlich sein. Diese kompetitiven Bindungsassays werden ausgeführt, indem das Membranpräperat mit radiomarkiertem GLP-2-Peptid, zum Beispiel (H³) oder ein radioiodiertes GLP-2-Analog in Gegenwart einer unmarkierten Testverbindung inkubiert wird, die in variierenden Konzentrationen zugegeben wird. Nach der Inkubation kann das entweder verdrängte oder gebundene, radiomarkierte GLP-2 gewonnen und gemessen werden, um die relativen Bindungsaffinitäten der Testverbindung und des GLP-2 für den als Substrat verwendeten GLP-2-Rezeptor zu bestimmen. Auf diese Weise lassen sich die Affinitäten zahlreicher Verbindungen für den GLP-2-Rezeptor messen.
Alternativ lässt sich das Binden eines Kandidatliganden an einen GLP-2-Rezeptor unter Anwendung eines funktionellen Assays einschätzen. Unter Anwendung dieser Vorgehensweise werden beispielsweise intakte Zellen von etwa zwei Tagen nach einer kurzzeitigen Transfektion oder nach etwa der gleichen Zeitdauer, gefolgt von einem Aufziehen auf Platten von stabil transfizieren Zellen geerntet, die zur Bewertung der Ligandenbindung verwendet werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform werden 293 EBNA-Zellen (Invitrogen Cat. R620-07) stabil mit dem pREP7-Vektor (Invitrogen Cat. V007-50), in welchem expressibel ein GLP-2-Rezeptor eingebaut ist, stabil transformiert. Danach kann das Binden eines Agonisten (oder unter Verwendung eines Kompetitionsbasenformats eines Antagonisten) an den Rezeptor durch Messung der Menge an intrazellulärer cAMP unterschieden werden. Am bequemsten wird intrazelluläres cAMP indirekt unter Verwendung eines Reportersystems gemessen, worin ein leicht messbarer und vorzugsweise leicht quantifizierbarer Downstream-Event die Menge an intrazellulärer cAMP anzeigt. Beispielsweise das Messen der Menge der Expression eines Reportergenkonstruktes mit Polynucleotidsequenz unter der Kontrolle eines Promotors, der auf cAMP anspricht. Alternativ kann die Messung von intrazellulärem Calcium, das aus intrazellulären Speichern in Reaktion auf eine Erhöhung in intrazellulärer cAMP freigesetzt wird, als ein Indikator für die Menge an intrazellulärer cAMP verwendet werden, indem beispielsweise in die transformierte Zelle ein Protein eingebaut wird, dass beim Binden an Calcium Fluoreszenz zeigt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden intrazelluläre cAMP-Mengen unter Anwendung des kommerziell verfügbaren EIA-Kits gemessen. Ein zusätzlicher Vorteil des funktionell basierenden Vorgehens zur Bewertung des Ligandenbindens besteht darin, dass das System automatisiert werden kann und einen hohen Durchsatz und ein ultrahohes Screening besonders großer chemischer Bibliotheken ermöglicht.
Als eine Alternative zur Verwendung von Zellen, die rezeptorkodierende DNA exprimieren, kann eine Liganden-Charakterisierung auch unter Verwendung von Zellen von beispielsweise Xenopus-Oocyten ausgeführt werden, die den funktionellen, membrangebundenen Rezeptor liefern, gefolgt von einer Einführung von Messenger-RNA, die auf den GLP-2-Rezeptor kodiert. In diesem Fall wird das GLP-2-Rezeptor kodierende Polynucleotid der Erfindung typischerweise in einen Plasmidvektor derart subkloniert, dass das eingeführte Gen mühelos in die RNA über einen benachbarten RNA-Transkriptionspromotor transkribiert werden kann, der durch den Plasmidvektor zugeführt wird, beispielsweise die T3- oder T7-Bakteriophagen-Promotoren. Anschließend wird die RNA von dem insertierten Gen in vitro transkribiert und kann sodann in die Xenopus-Oocyten injiziert werden. Jedes Oocytum ist eine Einzelzelle, ist jedoch groß genug, um von einer Mikronadel mit feiner Spitze penetriert zu werden, ohne eine irreparable Schädigung hervorzurufen. Nach der Injektion von nl-Volumina einer RNA-Lösung lässt man die Oocyten bis zu mehrere Tage inkubieren, wonach die Oocyten auf Fähigkeit zur Reaktion auf ein spezielles Ligandenmolekül getestet werden, das in einer Badlösung zugeführt wird.
Kandidaten-GLP-2-Rezeptorliganden können in der Struktur stark variieren und schließen, was am besten geeignet ist, Proteine ein, die besonders verwandt sind zu GLP-2 selbst, was die Aminosäuresequenz betrifft. Beispielsweise können die in den gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldungen WO97/39031 und WO96/32414 offenbarten Peptide nützlich sein, um auf GLP-2-Rezeptor-Bindungsaktiviät einem Screening unterworfen zu werden.
Zusätzlich zu den natürlich auftretenden GLP-2-Rezeptorsequenzen sind funktionelle chimäre Rezeptoren, die in die Abschnitte der GLP-2-Rezeptorsequenz eingebaut sind, und Polynucleotide, die diese kodieren ebenfalls Ausführungsformen der Erfindung. Funktionelle chimäre GLP-2-Rezeptoren werden aufgebaut, indem die extrazellulären aufnahmefähigen Sequenzen eines GLP-2-Rezeptors mit einer oder mehreren der Transmembran- und intrazellulären Segmente von bekannten sieben Transmembran-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren für Testzwecke kombiniert werden. Dieses Konzept wurde von Kobilka et al. (1988, Science 240; 1310-1316) demonstriert, die eine Reihe von chimären α2-β2-adrenergen Rezeptoren (AR) durch Insertieren von zunehmend größeren Mengen an α2-AR-Transmembransequenz in β2-AR erzeugten. Die Bindungsaktivität bekannter Agonisten ändert sich in dem Maße, wie das Molekül verschoben wird, indem es mehr α2- als β2-Konformation hat, sowie Intermediatkonstrukte, die eine gemischte Spezifität zeigten. Die Spezifität für bindende Antagonisten steht jedoch in Korrelation mit dem Ursprung der Transmembrandomäne VII. Die Bedeutung der Transmembrandomäne VII für Ligandenerkennung wurde auch in Chimären unter Nutzung zweier Hefe-α-Faktor-Rezeptoren festgestellt und ist deshalb signifikant, weil die Hefe-Rezeptoren als gemischte Rezeptoren klassifiziert werden. Damit hat es den Anschein, dass unabhängig von der Kategorie die funktionelle Rolle spezifischer Domänen durch die sieben Transmebran-G-Protein-gekoppelte Rezeptorfamilie hinweg erhalten bleibt.
In paralleler Weise werden innere Segmente oder Cytoplasmadomänen von einem speziellen GLP-2-Rezeptor mit den Analogdomänen eines bekannten sieben Transmembran-G-Protein-gekoppelten Rezeptor ausgetauscht und zur Identifikation der strukturellen Determinanten verwendet, die für das Koppeln der Rezeptoren an trimären G-Proteinen zuständig sind (Dohlman et al. (1991) Annu Rev Biochem 60;653-688). Ein chimärer Rezeptor, in welchem Domänen V, VI und die intrazelluläre verbindende Schleife von β2-AR in α2-AR substituiert sind, zeigte ein Binden von Liganden mit α2-AR Spezifität, stimulierte jedoch die Adenylat-Cyclase in der Form von β2-AR. Dieses demonstriert, dass bei Rezeptoren vom adrenergen Typ die G-Proteinerkennung in den Domänen V und VI und deren verbindende Schleife vorhanden sind. Die entgegengesetzte Situation wurde bei einer Chimäre vorherbestimmt und festgestellt, in der die V → VI-Schleife von α1-AR die entsprechende Domäne an β2-AR ersetzte und der resultierende Rezeptor Liganden mit β2-AR-Spezifität band und G-Protein vermittelte Phosphatidylinosit-Umschlag in Form α1-AR aktivierte. Schließlich demonstrierten Chimären, die sich aus Muscarin-Rezeptoren aufbauten, dass die V → VI-Schleife die Hauptdeterminante für die Spezifität der G-Protein-Aktivität ist.
Chimäre oder modifizierte sieben-Transmembran-G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, die in den extrazellulären und Transmembranregionen Substitutionen enthalten, haben gezeigt, dass diese Abschnitte des Rezeptors die Spezifität des Ligandenbindens bestimmen. Beispielsweise sind für eine leistungsstarke Aktivität des Agonisten zwei Ser-Reste, die in Domäne V der adrenergen und D-Catecholamin-Rezeptoren erhalten sind, erforderlich. Man nimmt an, dass diese Serine Wasserstoffbindungen mit dem Catechol-Teil der Agonisten im Inneren der Bindungsstelle bilden. Ähnlich wird angenommen, dass ein in der Domäne III aller sieben Transmembran-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren vorhandene Asp-Rest, der biogene Amine bindet, ein Ionenpaar mit der Liganden-Amingruppe in der Bindungsstelle bildet.
Funktionale, geklonte sieben-Transmembran-G-Protein-gekoppelte Rezeptoren wurden in heterologen Expressionssystemen exprimiert und deren biologische Aktivität bewertet (zum Beispiel Marullo et al. (1988) Proc Natl Acad Sci 85:7551-7555; King et al (1990) Science 250:121-123). Eines der heterologen Systeme führt Gene für sieben-Transmembran-G-Protein-gekoppelte Rezeptoren von Mammalia und ein Mammalia-G-Protein in Hefezellen ein. Der sieben-Transmembran-G-Protein-gekoppelte Rezeptor hat gezeigt, dass er eine geeignete Ligandenspezifität und Affinität hat und entsprechende biologische Aktivierung-Wachstum-Hemmung triggert, sowie morphologische Änderungen der Hefezellen.
Eine alternative Prozedur zum Testen von chimären Rezeptoren beruht auf der Prozedur unter Nutzung des P_2u-purinergen Rezeptors (P_2u) entsprechend der Veröffentlichung von Erb et al. (1993, Proc Natl Acad Sci 90:104411-104453). Die Funktion ist leicht in aufgezogenen K562-Human-Leukämiezellen zu testen, da diesen Zellen P_2u-Rezeptoren fehlen. K562-Zellen werden mit Expressionsvektoren transfektiert, die entweder normale oder chimäre P_2u enthalten und werden mit einer fura-a, Fluoreszenz-Sonde für Ca⁺⁺, geladen. Die Aktivierung entsprechend zusammengesetzter und funktioneller P_2u-Rezeptoren mit extrazellulärer UTP oder ATP mobilisiert intrazelluläres CA⁺⁺, das mit fura-a reagiert und spektrofluorometrisch gemessen wird. Wie bei den vorgenannten sieben-Transmembran-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren werden chimäre Gene durch Kombinieren von Sequenzen für extrazelluläre rezeptive Segmente irgendwelcher neu entdeckter sieben-Transmembran-G-Protein-gekoppelter Rezeptoren-Polypeptid mit den Nucleotiden für die Transmembran- und intrazellulären Segmente des bekannten P_2u-Moleküls erzeugt. Ein Baden transfektierter K562-Zellen in Mikrowellen, mit einen Gehalt entsprechender Liganden triggert das Binden und die Fluoreszenzaktivität, die die Effektoren des sieben-Transmembran-G-Protein-gekoppelten Rezeptormoleküls festlegt. Sobald Ligand und Funktion eingerichtet sind, ist das P_2u-System zur Festlegung von Antagonisten oder Inhibitoren verwendbar, die blockbindend sind und derartige Fluoreszenzreaktionen verhindern.
Zusätzlich zur Anwendung der Rezeptor kodierenden DNA auf Konstrukt-Zelllinien, die für das Ligand-Screening verwendbar sind, kann eine Expression der DNA entsprechend einem anderen Aspekt der Erfindung ausgeführt werden, um Fragmente des Rezeptors in löslicher Form für die Strukturuntersuchung zu erzeugen und Antikörper aufzuziehen, oder für andere experimentelle Anwendungen. Es wird erwartet, dass der extrazelluläre Abschnitt des GLP-2-Rezeptors wesentlich zum Binden des Ligandenmoleküls beiträgt. Es ist daher in der ersten Instanz wünschenswert, die Charakterisierung der Rezeptor/Liganden-Wechselwirkung zu erleichtern, indem diese extrazelluläre ligandenbindende Domäne in Menge und in isolierter Form bereitgestellt wird, d.h. frei von dem Rest des Rezeptors. Ein derartiges Konstrukt ist für den Ratten-GLP-1-Rezeptor hergestellt worden und hat ein Binden an GLP-1 gezeigt (Wilmen et al. (1996) FEBS LETTS, 398:43-47).
Um dieses zu Erzielen, kann die volle Länge der GLP-2-Rezeptor kodierenden DNA durch ortsspezifische Mutagenese modifiziert werden, um so ein translationelles Stopcodon in die extrazelluläre, N-terminale Region unmittelbar vor der Sequenz einzuführen, welche die erste Transmembrandomäne kodiert (TMI), d.h. vor dem Rest 181 der SEQ ID NO: 2 und vor dem Rest 181 der SEQ ID NO: 12. Damit werden nicht mehr länger irgendwelche Transmembrandomäne(n) erzeugt, um den Rezeptor in der Membran zu "verankern", die Expression des modifizierten Gens wird eine Sekretion zur Folge haben und zwar in löslicher Form von lediglich der extrazellulären, ligandenbindenden Domäne. Sodann können Standard-Assays des Ligandenbindens ausgeführt werden, um den Grad des Bindens einer Kandidatverbindung an der auf diese Weise erzeugten extrazellulären Domäne zu ermitteln. Es kann selbstverständlich notwendig sein, eine ortsspezifische Mutagenese zu verwenden, um mehrere verschiedene Versionen der extrazellulären Regionen zu erzeugen, um den Grad des Ligandenbindens an den isolierten Domänen zu optimieren.
Es wird als selbstverständlich gelten, dass die Erzeugung derartiger extrazellulärer, ligandenbindender Domänen in einer Vielzahl von Wirtszellen erreicht werden kann. Mammaliazellen, wie beispielsweise CHO-Zellen, können für diese Aufgabe zur Anwendung gelangen, wobei die Expression im typischen Fall von einem Expressionspromotor gesteuert wird, der zu einer hochgradigen Expression in der Lage ist, wie beispielsweise der CMV(Cytomegalovirus)-Promotor. Alternativ können Nicht-Mamaliazellen, wie beispielsweise Insekt Sf9 (Spodoptera frugiperda)-Zellen verwendet werden, wobei die Expression im typischen Fall durch Expressionspromotoren für den Baculovirus gesteuert wird, wie beispielsweise der starke, späte Polyheder-Proteinpromotor. Filamentöse fungale Expressionssysteme können ebenfalls zur Absonderung großer Mengen derartiger extrazellulärer Domänen des GLP-2- Rezeptors verwendet werden. Beispielsweise wurde ein derartiges akzeptables System Aspergillus nidulans darstellen, dessen Expression durch den alcA-Promotor gesteuert wird. Zusätzlich zu derartigen Expressionswirten gilt ferner als selbstverständlich, dass jedes prokaryotische oder andere eukaryotische Expressionssystem in der Lage ist, heterologe Gene oder Genfragmente zu exprimieren, unabhängig davon, ob sie intrazellulär oder extrazellulär ähnlich akzeptabel sein würden.
Die Verfügbarkeit isolierter, extrazellulärer, ligandenbindender Domänen des Rezeptorproteins macht die Bestimmung der dreidimensionalen Strukturen dieser ligandenbindenden Regionen mit oder ohne Kandidatenliganden-Komplex daran möglich, und zwar durch eine Kombination von röntgenkristallographischen und fortgeschrittenen 2D-NMR-Methoden. Auf diese Weise lassen sich speziell zusätzliche neue Kandidatenverbindungen schaffen und testen, von denen vorhergesagt wird, dass sie über die erforderlichen Wechselwirkungen mit der dreidimensionalen Rezeptorstruktur verfügen.
Bei großen Domänen ist die Methode der Wahl zur Strukturbestimmung sowohl der Domäne in Isolation, als auch der Co-Komplex mit dem natürlichen Liganden (oder ein geeigneter Antagonist oder Agonistmolekül) die Kristallographie. Wenn eine spezielle Domäne klein genug gemacht werden kann, wie beispielsweise mit einer Länge von näherungsweise 100 bis 130 Aminosäuren, kann für die Strukturbestimmung auch die leistungsstarke 2-D-NMR-Methode angewendet werden. Dieses ermöglicht nicht nur die Bestimmung der Domänenstruktur, sondern gewährt auch eine dynamische Information über die Medikament/Rezeptor-Wechselwirkung.
Für die spezielle Anwendung beim Nachweis des Vorhandenseins und/oder der Stelle, zum Beispiel im intestinalen Gewebe, gewährt die vorliegende Erfindung auch in anderen ihrer Aspekte einen markierten Antikörper auf einen GLP-2-Rezeptor. Zum Aufziehen derartiger Antikörper kann als Immunogen entweder der intakte, lösliche Rezeptor oder ein immunogenes Fragment von ihm verwendet werden, die in einer mikrobiellen oder einem Mammalia-Zellwirt entsprechend der vorstehenden Beschreibung oder mit Hilfe von Standardmethoden der Peptidsynthese erzeugt werden. Regionen des GLP-2-Rezeptors sind besonders geeignet zur Verwendung als immunogene Fragmente, einschließlich solche, die in der Sequenz mit einem extrazellulären Bereich des Rezeptors übereinstimmen, oder ein Abschnitt der extrazellulären Region, wie beispielsweise Peptide, die aus 10 oder mehr Aminosäuren der 401-509 Region der SEQ ID NO: 2 bestehen. Hinsichtlich des Human-GLP-2-Rezeptors (SEQ ID NO: 12) weisen Peptide die reife extrazelluläre Domäne auf (Reste 65-180); intrazelluläre Schleife 3 (Reste 363-385) und die intrazelluläre, C-tenninale Domäne (Reste 442-533) die nützlicherweise als Immunogene für die Erzeugung von Antikörpern zu dem Human-GLP-2-Rezptor verwendet werden können.
Antikörper zu dem gewünschten GLP-2-Rezeptor oder Fragment-Immunogen sind für die polyklonale Antikörpererzeugung aus dem Blut eines Tiers verfügbar, das mit dem Immunogen immunisiert wurde. Alternativ können für die monoklonale Antikörpererzeugung Immunozyten gewonnen werden, wie beispielsweise Splenozyten aus dem immunisierten Tier und können unter Anwendung der Hybridoma-Technologie mit Myelom-Zellen fusioniert werden. Die Fusionsprodukte werden sodann durch Aufziehen in einem Selektionsmedium einem Screening unterworfen und Zellen, die Antikörper produzieren, für ein kontinuierliches Wachstum und Antikörper-Gewinnung gewonnen. Der gewonnene Antikörper kann sodann kovalent mit einem detektierbaren Marker gekoppelt werden, wie beispielsweise ein Radiomarker, Enzym-Marker, Lumineszenz-Marker oder dergleichen, indem für diesen Zweck die etablierte Linka-Technologie eingesetzt wird.
Tiermodell-Systeme, mit denen die physiologischen und Verhaltensrollen des GLP-2-Rezeptors erläutert werden, werden hergestellt, indem man transgene Tiere erzeugt, in denen die Aktivität des GLP-2-Rezeptors entweder erhöht oder vermindert ist oder die Aminosäuresequenz des exprimierten GLP-2-Rezeptors mit Hilfe einer Vielzahl von Methoden verändert wurde. Beispiele für diese Methoden schließen die folgende ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: 1) Insertion normaler oder mutanter Versionen von DNA kodierendem GLP-2-Rezeptor durch Mikroinjektion, Elektroporation, retrovirale Transfektion oder andere Hilfsmittel, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind, und zwar in geeignete fertilisierte Embryos, um ein transgenes Tier zu erzeugen, oder 2) homologe Rekombination von mutanten oder normalen Human- oder Tierversionen dieser Gene mit dem nativen Genlocus in transgenen Tieren, um die Regulierung der Expression oder die Struktur dieser GLP-2-Rezeptorsequenzen zu verändern. Die Methode der homologen Rekombination ist auf dem Fachgebiet gut bekannt. Hierbei wird das native Gen durch das insertierte Gen ersetzt und ist so für die Erzeugung eines Tiers verwendbar, welches native GLP-2-Rezeptoren nicht exprimieren kann, sehr wohl jedoch beispielsweise einen insertierten, mutanten GLP-2-Rezeptor exprimiert, der den nativen GLP-2-Rezeptor in dem Genom des Tiers durch Rekombination ersetzt hat, was zu einer Unterexpression des Transporters führt. Durch Mikroinjektion werden dem Genom Gene hinzugefügt, jedoch keine von ihm entfernt, sodass er für die Erzeugung eines Tiers verwendbar ist, das seine eigenen und zugefügten GLP-2-Rezeptoren exprimiert und so zu einer Überexpression der GLP-2-Rezeptoren führt.
Eine verfügbare Möglichkeit zum Erzeugen eines transgenen Tiers, nimmt man eine Maus als Beispiel, ist die folgende: Eine weibliche Maus wird zur Reifung gebracht und die resultierenden befruchteten Eier aus ihren Eileitern entnommen. Die Eier werden in einem geeigneten Medium aufbewahrt, wie beispielsweise in M2-Medium. Der DNA- oder cDNA kodierende GLP-2-Rezeptor ist Cäsiumchlorid, der von einem Vektor mit Hilfe von Methoden gereinigt ist, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Induzierbar Promotoren können mit der kodierenden Region der DNA fusioniert werden, um ein experimentelles Mittel zur Regulierung der Expression des Transgens bereitzustellen. Alternativ oder zusätzlich können gewebespezifische, regulatorische Elemente mit der kodierenden Region fusioniert werden, um eine gewebespezifische Expression des Transgens zu ermöglichen. Die DNA wird in einer entsprechend gepufferten Lösung in eine Mikroinjektionsnadel gegeben (die aus Kapillarrohr unter Verwendung eines Rohrziehers hergestellt ist) und die Eier, die injiziert werden sollen, in ein Depressions-Objektglas gegeben. Die Nadel wird in den Pronucleus des Eis eingesetzt und die DNA-Lösung injiziert. Das injizierte Ei wird sodann in den Eileiter einer pseudoprägnanten Maus übertragen (ein Ei auf eine Maus, die stimuliert wurde durch entsprechende Hormone, um eine Schwangerschaft aufrechtzuerhalten, die jedoch nicht wirklich schwanger war), von wo es in den Uterus gelangt, einwächst und sich fristgemäß entwickelt. Wie vorstehend ausgeführt, ist die Mikroinjektion nicht die einzige Methode zum Insertieren von DNA in die Eizelle und wird hierin lediglich für exemplarische Zwecke angewendet.
Nachdem die Erfindung vorstehend beschrieben wurde, kann eine Bezugnahme auf die folgenden Beispiele zum besseren Verständnis führen. Die folgenden Beispiele sind für die Zwecke der Veranschaulichung der Erfindung geboten und nicht als eine Einschränkung der Erfindung zu interpretieren.
BEISPIEL 1
ISOLATION DES GLP-2-REZEPTORS
PCR-GESTÜTZTES KLONIEREN VON PARTIELLEN RATTEN- UND MAUS-GLP-2-REZEPTOR-cDNAS
Es wurden "Rat Neonate Intestine cDNA"-Bibliothek (Stratagene, La Jolla, CA; Cat. 936508) und Maus-Jejunum, erster Strang-cDNA, hergestellt. Degenerierte Primer M-2F/S (SEQ ID NO: 3) und M-7R/S (SEQ ID NO: 4) wurden zum Amplifizieren eines Teilfragmentes des Ratten-GLP-2-Rezeptors von der "Rat Neonate Intestine cDNA"-Bibliothek verwendet, sowie der Maus-GLP-2-Rezeptor vom Maus Jejunum template. Das Protokoll wird nachfolgend beschrieben:
Degenerierte PCR:
6 μl 10fach VENT-Puffer von New England Biolabs
6 μl 2,5μM jeweils Stamm-dATP, dCTP, dGTP und dTTP
4 μl Ratten-Neonate-Darm-cDNA (1:10 Verdünnung)
3 μl 25 μM M2F/S-Primer
[5'-TTTTTCTAGAASRTSATSTACACNGTSGGCTAC-3'] (SEQ ID NO: 3)
3 μl 25 μM M7R/S-Primer
[5'-TTTTCTCGAGCCARCARCCASSWRTARTTGGC-3'] (SEQ ID NO: 4)
2 μl (10 Einheiten) Amplitaq DNA-Polymerase (Perkin Elmer)
36 μl ddH₂O.
Reaktionsbedingungen: 35 Zyklen bei 94°C, 2 min; 94°C, 1 min.; 53°C, 30 sek.; 72°C, 1 min.
Das überwiegende PCR-Produkt war ein 303-Basenpaar(bp)-DNA-Fragment. Es wurden 30μl-Proben der vorgenannten PCR unter Verwendung des QIAGEN PCR-Reinigungskits gereinigt und in 30 μl ddH₂O eluiert. Das resultierende Produkt wurde sodann unter Anwendung dergleichen Degenerat-PCR-Bedingungen reamplifiziert mit lediglich der Ausnahme von 31 Zyklen bei 94°C.
Das überwiegende Produkt bei 303 Basenpaaren (bp) wurde herausgeschnitten und unter Anwendung des Gelreinigungsprotokolls von QIAGEN QIAquick in 30 μl ddH₂O gereinigt. Das resultierende Produkt wurde sodann unter Anwendung dergleichen Degenerat-PCR-Bedingungen amplifiziert mit der Ausnahme von lediglich 31 Zyklen bei 94°C.
Anschließend erfolgte eine zweifach Digerierung (Xba I und Xho I) auf der gesamten reamplifizierten PCR-Reaktion wie folgt: 28 μl DNA; 16 μl 10X One-Phor-All Puffer (Pharmacia); 2 μl (40 Einheiten) Xba I Enzym (Pharmacia); 2 μl (40 Einheiten) Xho I Enzym (Pharmacia) und 30 μl ddH₂O.
Die Proben wurden vier Stunden in 37°C in einem Wasserblock-Erhitzer digeriert, die auf 100 μl Volumen mit ddH₂O (steril) gebracht wurden, und wurden gereinigt durch (1) eine gleiche Menge (100 μl) Chloroform-Extraktion; (2) Ausfällung über das Wochenende mit 2 Volumina Ethanol/10 Volumina 3M Natriumacetat; (3) 1 × Wäsche mit 70% EtOH und (4) Resuspension in 10 μl 1 × TE (pH 8,0).
Als nächstes wurde wurde pBluescript-Klon 5HT1F#9 mit Xba I und Xho I wie folgt digeriert:
10 μl DNA (pBluescript-Klon 5HT1F#9)
5 μl 10 × NEBuffer 2 (New England Biolabs)
3 μl (1:20 Verdünnung = 3 Einheiten) Xba I (New England Biolabs)
3 μl (1:20 Verdünnung = 3 Einheiten) Xho I (New England Biolabs)
5 μl (10×) BSA (New England Biolabs)
24 μl ddH₂O.
Die Probe wurde für 3 Stunden in einem Wasserblockerhitzer bei 37°C digeriert, wärmeinaktiviert bei 65°C für 20 Minuten und unter Verwendung des GeneCleanII-Kit von BIO 101 gereinigt. Es wurden Aliquots der PCR-Reaktionen in den vorgenannten pBluescript-Plasmidvektor hineingeklont, indem ein T4 DNA-Ligasekit verwendet wurde (New England Biolabs), und transformiert in Epicurean Coli XL-2 Blue MRF' Ultracompetent-Zellen (Stratagene). Die Transformation wurde auf 2 × YT + AMP-Platten aufgezogen und einzelne Kolonien herausgenommen. Die DNA-Minipreps wurden hergestellt unter Anwendung des QIAGEN QIA-prep-8-Miniprep-Kit und die Sequenzen der Fragmente unter Anwendung des ABI-Systems bestimmt. Es wurden neuartige Sequenzen identifiziert, die ein Partialfragment der Ratten- und Maus-GLP-2-Rezeptorsequenz enthielten.
Das Klonieren von cDNA mit komplettem GLP-2-Rezeptor kodierender Region wurde wie folgt erzielt:
Zunächst wurden zum Screening cDNA-Bibliotheken der folgenden drei Gewebe verwendet:

1. Ratten-Hypothalamus ((RHT)
2. Ratten-Rautenhirn (RHB)
3. Ratten-Duodenum und -Jejunum (RDJ)

Die drei cDNA-Bibliotheken wurden hergestellt, durch Priming mit Random-Primer und Subklonieren unidirektional in Hind III und NotI-Stellen von pcDNA3.
Anschließend wurden die drei cDNA-Bibliotheken einem Homologie-Screening durch ein degeneriertes Oligo C4-4 [5'-AACTACATCCACMKGMAYCTGTTYVYGTCBTTCATSCT-3'] (SEQ ID NO: 5) unterzogen durch Kolonie-Lifts und Filter-Hybridisierung. Es gelangten die folgenden Bedingungen der Hybridisierung zum Einsatz: 5 × SSPE (1 × SSPE ist 0,18 M NaCl, 10 mM NaH₂PO₄ (pH 7,4), 10 mM EDTA (ph 7,4)) und 5 × Denharts-Lösung (1% Ficoll, 1% Polyvinylpyrrolidon, 1% BSA); 25 mg/ml Lachssperma-DNA.
Die Filter wurden über Nacht bei 50°C hybridisiert. Sodann wurden die Filter zweimal in zweifachem SSPE und 1%iger SDS bei Raumtemperatur für 30 Minuten, zweimal in 2 × SSPE und 1%iger SDS bei 50°C für 20 Minuten pro Wäsche gewaschen und abschließend zweimal in 1 × SSPE und 0,5% SDS. Positive Klone wurden mit Hilfe der Autoradiographie identifiziert. Von der Platte wurde ein Pfropfen von 1 cm² entfernt, der den positiven Klon umgab, und in 1 ml 2 × YT + 20% Glycerin gegeben, vortexiert und bei –80°C tiefgefroren.
Plasmid-DNA als positiven Pfropfen wurden wie folgt hergestellt:
Es wurde auf einer Agar-Platte 100 ml bakterielle Kultur jedes positiven Pfropfens aufgezogen. Die Bakterienzellen wurden abgekratzt und in 1 ml 2 × YT-Medium + 20% Glycerin resuspendiert. Bakterienpellets von der 250 ml Bakterien-Resuspension wurden in 150 ml Lösung I (50 mM Glukose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) resuspendiert, Lyse in Lösung II (0,2 M NAOH, 1% SDS), neutralisiert mit eiskalter Lösung III (Kaliumacetat; 4 Volumina von 5 M Kaliumacetat + 1 Vol. 10 M Essigsäure). Nach dem Pelletisieren der Bakterien-DNA wurden 340 ml Isopropanol dem Überstand zugegeben. Dieser wurde mit max. 15 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in TE + 20 mg/ml RNase resuspendiert, für 30 Minuten bei 37°C inkubiert, mit Isopropanol + 0,2 M Kaliumacetat ausgefällt. Nach dem Zentrifugieren wurde das Pellet mit 70% Alkohol gewaschen und lufttrocknen gelassen und TE resuspendiert.
Als nächstes wurde Plasmid-DNA von 2777-Klon-Pools von Ratten Hypothalamus-cDNA-Bibliothek RHT cDNA/Bibliothek wie folgt genutzt: Es wurden zwei Primer aus einem Bereich der PCR geklonten GLP-2-Rezeptor-cDNA-Sequenz konzipiert, die keine Identität auf bekannte Rezeptoren der Genfamilie hatten. Die zwei Primer P23-R1 und P23-F1 amplifizierten ein 196bp-Fragment lediglich von neuartigem Klon DNA, nicht jedoch mit GLP-1-Rezeptor-cDNA oder PACAP-Rezeptor-cDNA. Das Expand^TM-PCR-System von Boehringer Mannheim (Katalog Nr. 1681-842) wurde unter den folgenden Bedingungen angewendet:
2 μl 10 × Expand^TM-Puffer 1
2,8 μl 2,5 mM dNTP-Mischung
0,6 μl Primer P23-R1 [5'-TCATCTCCCTCTTCTTGGCTCTTAC-3'] (SEQ ID NO: 6)
0,6 μl Primer P23-F1 [5'-TCTGACAGATATGACATCCATCCAC-3'] (SEQ ID NO: 7)
0,3 μl Expand PCR-Enzym (1 Einheit)
12,7 μl Wasser
1 μl DNA
Reaktionsbedingungen: 32 Zyklen bei 93°C, 40 sek.; (Zyklen) 58°C, 40 sek.; (Zyklen) 68°C, 40 sek.
Die DNAs aus dem jeweiligen positiven Pfropfen oder Pool von 2777-Klonpools wurde mit spezifischen Primern P23-F1 und P23-R1 unter den vorstehend angegebenen Bedingungen amplifiziert. Von den 1057 C4-4-hybridisations-positiven Pfropfen und 884 2777-Klonpools amplifizierten lediglich fünf Template-Quellen ein 196bp-PCR-Produkt. Diese waren: (1) Pfropfen 334, (2) Pfropfen 780, (3) RHT-Pool 233, (4) RHT-Pool 440 und (5) RHT-Pool 587.
Sodann wurde eine Amplifikation von GLP-2R-cDNA von den fünf positiven Templates ausgeführt. Unter Verwendung eines der spezifischen Primer (P23-R1 oder P23-F1) und einem Primer auf Basis von pcDNA3-Vekor (Invitrogen)-Sequenz (830F oder 1186R), wurde das GLP-2R-cDNA Insert direkt von klonal unreinen Pfropfen oder 2777-Klonpools amplifiziert. Die Sequenzen der Vektorprimer waren folgende:
830F: [5'-AACCCACTGCTTAC-3'] (SEQ ID NO:14)
1186R: [5'-CCCAGAATAGAATGACACC-3'] (SEQ ID NO:15)
Die PCR wurde unter den folgenden, gerade angegebenen Bedingungen unter Anwendung des Expand^TM-PCR-Systems ausgeführt.
Das ausgeprägteste Band wurde reamplifiziert, gereinigt und sequenziert. Auf der Grundlage der erhaltenen, amplifizierten Sequenz wurden zusätzliche Primer konzipiert und ein neues Sequenzieren ausgeführt. Auf diese Weise wurden die vollständigen Sequenzen der GLP-2R-cDNA-Inserts in allen fünf Quellen von Klonen bestimmt. Die Sequenzanalyse zeigte, dass lediglich Pool RHT 440 und Pool RHT 587 Klone mit vollständiger, kodierender Sequenz von GLP-2R enthielten, und dass die zwei Klone identisch waren (deriviert von dem gleichen cDNA-Klon).
Aufgrund der Schwierigkeit des klonalen Reinigens des GLP-2-Rezeptor-cDNA-Klons von den RHT440- oder RHT587-cDNA-Bibliothek-Pools wurde die cDNA amplifiziert und in pcDNA3 rekloniert. Auf der Basis der von RHT 440 und RHT 587 erhaltenen Sequenz, wurden zwei Primer konzipiert, von denen der eine 4bp Upstream zum Startcodon und ein anderer beginnend bei 8bp Downstream des Stop-Codons anlagerte.
WBR-C5: [5'-CAGGGGCCGGTACCTCTCCACTCC-3'] (SEQ ID NO:16)
WBR-C3: [5'-TTGGGTCCTCGAGTGGCCAAGCTGCG-3'] (SEQ ID NO:17)
Die zwei Primer wurden zum Amplifizieren eines DNA-Fragmentes von näherungsweise 1.525bp-Fragment unter den folgenden PCR-Bedingungen und unter Anwendung des Expand^TM PCR-Systems von Boehringer Mannheim (Katalog Nr. 1681-842) verwendet.
10 μl 10 × Expand^TM PCR-Puffer 1
14 μl 2,5 mM dNTP-Mischung
3,0 μl Primer 1 (10 μM) (WBR-C5)
3,0 μl Primer 2 (10 μM) (WBR-C3)
1,5 μl Enzym (5 Einheiten)
63,5 μl Wasser
5 μl DNA
Reaktionsbedingungen: 5 Zyklen (93°C, 1 min.; 72°C, 40 sek.; 60°C, 45 sek.; 68°C, 2 min.) und 25 Zyklen (93°C, 1 min.; 72°C, 1 min.; 68°C, 2 min.)
Das amplifizierte Produkt wurde in Kpn I und XhoI-Stellen des pcDNA3-Vektors (Invitrogen) subkloniert. Die Plasmid-DNA wurde unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Methode hergestellt.
BEISPIEL 2
FUNKTIONELLER ASSAY
Cos-1-Zellen wurden entsprechend der Beschreibung in Analytical Biochemistry, 218:460-463(1994) mit Ratten-Klon 587-GLP-2-Rezeptor, geklontem Human-GLP-2-Rezeptor (pC3/HuGL2R-2) oder geklontem Rest 85 von variantem Human-GLP-2-Rezeptor (pC3/HuGL2R-MH4), pcDNA3 transfiziert. Als ein Kontrollpeptid wurde Ratten-GLP-1 (7-36)-Amid verwendet. Es wurden die folgenden Lösungen verwendet: RSC in RPMI 1640 (49 ml RPMI + 1 ml FCS + 50 μl Chloroquin, 100 mM); DEAE/RSC-Lösung: 18,4 ml RSC + 1,6 ml DEAE/Dextran (10 mg/ml).
Die Assay-Prozedur umfasste das Folgende:

a) 50 mg entweder Rattenklon 587 GLP-2-Rezeptor oder klonierter Human-GLP-2-Rezeptor oder klonierter Rest 85 von variantem Human-GLP-2-Rezeptor, zugegeben (als Plasmid-pcDNA3) zu einem 50ml-Röhrchen, das sechs ml RSC enthielt und bei 37°C inkubiert wurde.
b) Sechs ml DEAE/RSC-Lösung wurden in jedes Röhrchen zugegeben und dieses für 2 min. bei 37°C inkubiert.
c) 1,5 ml einer COS-1-Zellsuspension (5,5 Millionen Zellen) wurden in jedes Röhrchen zugegeben und für 1 Stunde und 45 min. bei 37°C inkubiert.
d) Nach der Inkubation wurde die Probe für 5 Minuten bei geringer Drehzahl geschleudert, mit DMEM/F12 + 10% FBS zweimal gewaschen und das Pellet in 12,5 ml DMEM/F12 + 10% FBS-Medium resuspendiert.
e) 1 ml der Zellsuspension (Schritt d) wurde in einer jeweiligen Mulde von 6-Mulden-Platten gegeben, die mit Poly-D-Lysin (von Collaborative Biomedical) beschichtet waren und 3 ml Medium (0,45 Millionen Zellen/Mulde) enthielten.
f) Die Platten wurden für drei Tage bei 37°C inkubiert.

Die Behandlung von transfizierten Cos-1-Zellen mit GLP-1/GLP-2-Analog erfolgte folgendermaßen:
Lösungen: DMEM/F12 (SFM) + IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthin) 0,85 mM + 0,1%ige Ascorbinsäure und 10 μM Pargylin (alle Lösungen erworben von Signa). Die Medien wurden frisch am Tage des Gebrauchs angesetzt.
Assay-Prozedur: Das Kulturmedium der jeweiligen Mulde (transfizierte 6-Mulden-Platten, Zellen) wurde entnommen und die Mulden einmal mit SFM-Medium gewaschen. Sodann wurden 2 ml SFM + IBMX-Medium zu jeder Mulde zugegeben und die Platten für 10 min. bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde das SFM + IBMX aus der jeweiligen Mulde entfernt und frisches SFM + IBMX-Medium mit einem Gehalt von GLP-1/GLP-2 (GLP-1,7-36,Amid von Signa, [Gly2]hGLP-2 von Allelix) Konzentration 1, 3, 10 und 30 nM den entsprechenden Mulden zugegeben. Die Platten wurden für 30 min. bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Medium aus der jeweiligen Mulde entfernt. Die Mulden wurden einmal mit 1 ml PBS (phosphatgepufferte Salzlösung) gewaschen. Jede Mulde wurde sodann mit 1 ml kaltem 95%igem Ethanol: 5 mM EDTA (2:1) für 1 Stunde bei 4°C behandelt. Die Zellen jeder Mulde wurden abgekratzt und in einzelne Eppendorf-Röhrchen übertragen. Die Röhrchen wurden für 5 min. bei 4°C zentrifugiert und die Überstände in neue Eppendorf-Röhrchen übertragen und in Hochvakuum getrocknet. Nach dem Trocknen wurden die Röhrchen in 100 μl Natriumacetat auf die alte Konzentration gebracht und bei 4°C gehalten und 25 μl dieser Lösung für den cAMP-Assay verwendet.
Das funktionelle Assay wurde wie folgt ausgeführt: cAMP-Gehalt des jeweiligen Extraktes wurde zweifach mit Hilfe der EIA (Enzyme Immuno Assay) unter Verwendung des Amersham Biotrak cAMP EIA-Kit (Amersham 225) bestimmt. Die Ergebnisse der Assays, die in 3 und 8 veranschaulicht sind, demonstrieren die GLP-2-Selektivität, die die klonierten Ratten- und Humanrezeptoren zeigten. In einem ähnlichen funktionellen Assay, der zum Binden des GLP-1-Rezeptors verwendet wurde, wurde die erwartete Spezifität auf GLP-1 festgestellt.
BEISPIEL 3
ISOLATION VON HUMAN GLP-2-REZEPTOR cDNA
MEDIUM-STRINGENTES HYBRIDISATIONS-SCREENING EINER HUMAN-HYPOTHALAMUS-cDNA-BIBLIOTHEK
Es wurden eine Million Klone einer λgt10 cDNA-Bibliothek von Human-Hypothalamus (Clontech; Katalog Nr. 1172a) mit Hilfe von Plaque-Lifts auf Nitrocellulosefiltern (Amersham; Katalog Nr. RPN137E) einem Screening unterzogen. Die Sonde wurde durch Randomprimer-Markieren eines DNA-Fragments hergestellt, das eine vollständig kodierende Region von Ratten-GLP-2-Rezeptor hatte. Das DNA-Fragment wurde aus Klon 587-C1 isoliert, welches die komplette kodierende Region von SEQ ID NO: 2 enthielt.
Die Vorhybridisierung und Hybridisierung wurden jeweils über Nacht in einer Hybridisierungslösung ausgeführt, die aus 50% Formamid bestand, 5 × SSPE, 5 × Denhart's-Lösung, 0,5% SDS und Lachssperma-DNA (200 mg/ml). Nach der Hybridisierung wurden die Filter unter den folgenden Bedingungen gewaschen (Mediumstringenz):
zweimal bei Raumtemperatur in 2 × SSPE und 0,01% SDS
zweimal bei 42°C in 2 × SSPE und 0,01% SDS
zweimal bei 42°C in 0,2 × SSPE und 0,01% SDS
Die Filter wurden autoradiographiert und Agar-Pfropfen, die jeweils zahlreiche Bakteriophagenplaques enthielten, aus den Regionen auf den Platten genommen, die den Positivsignalen auf dem Filter entsprachen. Von einer Million cDNA-Klone, die in einen Sampling in dem ersten Screening-Durchgang entnommen wurden, wurden zwei positive Klone identifiziert (HHP6-1 und HHP13). Bei einem zweiten Screening erwies sich lediglich HHP13 als positiv. Es wurden mehrere positive Plaques (HHS13) von der HHP13-Platte gepoolt und für das tertiäre Screening genommen. Die drei einzelnen Positivplaques von diesem Screening-Durchlauf wurden aufgenommen (HHT13-1, HHT13-2, HHT13-3).
Sodann wurde für das partielle Sequenzieren der Positivklone eine PCR-Amplifikation angewendet. Auf einem Rasen von Bakterienzellen (E.coli C600Hfl) wurden an markierten Stellen 10 μl Phagen-Suspension von jedem Klon aufgebracht. Nach einer Inkubation für 5 Stunden bei 37°C waren die Pagenplaques eindeutig sichtbar und bedeckten etwa 1 cm². Ein Teil des jeweiligen Plaque wurde in 200 μl Wasser übertragen. Die Proben wurden in einem siedenden Wasserbad für 5 Min. inkubiert und bei Raumtemperatur für 10 Min. zentrifugiert. Für die PCR-Amplifikation mit zwei Reihen von degenerierten Primern wurde 1 ml Probe verwendet:
M2FS[5'-TTTTTCTAGAASRTSATSTACACNGTSGGCTAC-3'] (SEQ ID NO: 3) und
M7RS[5'-TTTTCTCGAGCCARCARCCASSWRTARTTGGC-3'] (SEQ ID NO: 4); oder
C4-4 [5'-AACTACATCCACMKGMAYCTGTTYVYGTCBTTCATSCT-3'] (SEQ ID NO: 5) und
C9-2R [5'-TCYRNCTGSACCTCMYYRTTGASRAARCAGTA-3'] (SEQ ID NO: 8).
Das Expand^TM PCR-System von Boehringer Mannheim (Katalog Nr. 1681-842) wurde unter den folgenden Bedingungen angewendet:
5 μl 10 × Expand^TM Puffer 3
7 μl 2,5 mM dNTP-Mischung
1,5 μl Primer M2FS oder C4-4
1,5 μl Primer M7RS (mit M2FS) oder C9-2R (mit C4-4)
0,75 μl Expand-PCR-Enzym (1 Einheit)
33,25 μl Wasser und
1 μl DNA.
Die Reaktionsbedingungen waren: 32 Zyklen bei 93°C, 1 min.; Zyklen 50°C, 1 min.; Zyklen 45°C, 1 Min.; Zyklen 68°C, 2 Min.
M2F/S und M7R/S amplifizierten ein DNA-Fragment von etwa 300 bp und C4-4 und C92-R amplifizierten ein DNA-Fragment von etwa 700 bp. Die PCR-Produkte wurden unter Anwendung des QIAGEN QIAquick PCR-Reinigungskits (Katalog Nr. 28104) gereinigt und in 50 μl 10 mM Tris, pH 8,0, eluiert. Die Sequenzanalyse der Produkte ergab keine Unterschiede zwischen den Templates, was anhand der Tatsache zu erwarten war, dass sie mehrfach Kopien eines einzelnen cDNA-Klons (HHT13) darstellten.
Eine Reihe von Faktoren zeigt, dass dieser Klon eine kodierende Sequenz des Human-GLP-2-Rezeptors enthielt. Einer der Faktoren ist der Ähnlichkeitsgrad der Sequenz. Die Glucagon-Rezeptor-cDNA kann zur Vorhersage des zu erwartenden Erhaltungsgrades der Sequenz verwendet werden, die zwischen Ratten- und Humanrezeptoren ermittelt wird. Auf dem Nucleotid-Level gibt es 82,6% Identität innerhalb der kodierenden Regionen der Ratten- und Human-Glucagon-Rezeptoren. Auf dem Aminosäure-Level gibt es 80,9 Identität und 89,1% Aminosäure-Ähnlichkeit zwischen den Glucagonrezeptoren der zwei Spezies.
Im Fall des hierin geklonten Human-GLP-2-Rezeptors ist die Sequenz des partiellen Human-GLP-2-Rezeptors cDNA (HHT13) stark homolog zur Ratten-GLP-2-Rezeptor-cDNA sowohl auf der Höhe des Nucleotids, als auch der Aminosäure. Die SEQ ID NO: 9 zeigt 87,1% Identiät mit der Ratten-GLP-2-Rezeptor-cDNA-Sequenz. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz dieser cDNA-Region hat 87,4% Identiät und 93,2% Ähnlichkeit mit der vorhergesagten Aminosäuresequenz des Ratten-GLP-2-Rezeptors. Die vorhergesagte Gesamtlänge des Ratten-Rezeptor-Präproteins sind 550 Aminosäuren, was nahelegt, dass etwa 44% der kodierenden Region des Human-Rezeptors identifiziert worden waren.

Ein weiter Nachweis, der diese Schlußfolgerung stützt, kommt aus einem Vergleich der partiellen Human-GLP-2-Rezeptor-Aminosäuresequenz mit dem Ratten-GLP-2-Rezeptor und den drei nächsten Familienvertretern, wie nachfolgend gezeigt wird:

Rezeptor-Sequenz (Aminosäure)	Prozentidentität mit HHT13	Prozentähnlichkeit
GLP-2-Rezeptor (Ratte)	87,4	93,2
GLP-1-Rezeptor (Ratte)	50,0	74,1
Glucagon-Rezeptor (Ratte)	51,4	73,9
GIP-Rezeptor (Ratte)	50,7	70,3

Diese Vergleiche zusammen mit dem Benchmark, die durch Sequenzähnlichkeiten zwischen den Ratten- und Human-Glucagon-Rezeptoren gewährt werden, liefern einen definitiven Nachweis dafür, dass die cDNA-designierte HHT13 ein Fragment des Human-Gegenstückes des Ratten-GLP-2-Rezeptors darstellt.
Die volle Aminosäuresequenz des Human-GLP-2-Rezeptors kann erhalten werden, indem man zuerst die Sequenz der vollständigen cDNA-Inserts in HHT13-1, HHT13-2 und HHT13-3 bestimmt. Unter Anwendung von Degenerat-Primern für PCR-Amplifikation und nachfolgendem Sequenzieren erhielten wir eine Sequenz von lediglich einem Teil jedes Inserts. Es ist möglich, dass diese identischen Klone ein Insert enthalten, welches die komplette kodierende Sequenz des Human-GLP-2-Rezeptor-Präproteins überspannt. Zur Bestimmung der vollständigen Sequenz des cDNA-Inserts wurden Klone in großer Menge zur Herstellung von näherungsweise 20 mg jedes äquivalenten Klons aufgezogen. Das komplette cDNA-Insert wurde durch Restriktion mit Eco RI und Subklonieren in pcDNA3 (Invitrogen) excisiert. Alternativ wurden zwei Primer von der Vektorsequenz, welche das Insert flankiert, verwendet, um das vollständige cDNA-Insert unter Anwendung des Expand^TM PCR-Systems von Boehringer Mannheim (Katalog Nr. 1681-842) zu amplifizieren. Die amplifizierte cDNA wurde mit entsprechenden Restrikionsenzymen aufgetrennt und in pcDNA3 (Invitrogen) subkloniert.
Sofern in den HHT13-Klonen keine vollständig kodierende Sequenz vorhanden ist, werden cDNA-Bibliotheken für zusätzliche Klone einem Screening unterworfen, um die kodierende Region von Human-GLP-2-Rezeptor-cDNA zu vervollständigen. Zum Screening wurden bevorzugt Human-cDNA-Bibliotheken (von Stratagene oder Clontech), die die folgenden Gewebe repräsentierten, verwendet: Human-Hypothalamus; Human-Fötalhirn; Human-Duodenum und -Jejunum; Human-Magen und Human-Fötaldarm.
Aus der Sequenz der bereits bestimmten Human-GLP-2-Rezeptor-cDNA wurden zwei PCR-Primer bezeichnet. Diese Primer wurden so konzipiert, dass sie keine Vertreter einer verwandten Genfamilie außer der GLP-2-Rezeptor-cDNA selbst amplifizieren konnten. Eine Verdünnung des cDNA-Bibliothekstammes wurde verwendet, um Bibliothek-Subpools zu erzeugen, sodass 50.000 Klone in jedem Pool vorhanden waren. Die PCR wurde mit den GLP-2-Rezeptor-spezifischen Primern zu Diagnosepools ausgeführt, die ein GLP-2-Rezeptor-cDNA-Klon enthielten, indem das Expand^TM PCR-System von Boehringer Mannheim (Katalog Nr. 1681-842) unter den folgenden Bedingungen angewendet wurde:
2 μl 10 × Expand^TM Puffer 1
2,8 μl 2,5 mM dNTP-Mischung
0,6 μl Primer P1
0,6 μl Primer P2
0,3 μl Expand PCR-Enzym (1 Einheit)
12,7 μl Wasser
1 μl Bibliothek-Pool, der 50.000 Klone enthielt
Reaktionsbedingungen: 32 Zyklen bei 93°C, 40 Sek.; 50-58°C, 40 Sek.; 68°C, 40 Sek.
Die Sequenz wird sodann aus dem vollständigen GLP-2-Rezeptor cDNA-Insert aus einem Positiv-Pool erhalten. Unter Verwendung eines der spezifischen Primer und eines Primers, der auf einer Vektorsequenz nahe der Klonierungsstelle beruhte, wurde das GLP-2-Rezeptor cDNA-Insert direkt von klonal uneinigen Klonpools unter Anwendung des Expand^TM Systems von Boehringer Mannheim (Katalog Nr. 1681-842) amplifiziert, das unter den folgenden Bedingungen am besten geeignet war:
2 μl 10 × Expand^TM Puffer 1
2,8 μl 2,5 mM dNTP-Mischung
0,6 μl Primer 1
0,6 μl Primer 2
0,3 μl Enzym (1 Einheit)
12,7 μl Wasser
1 μl Bibliothek-Poolstamm
Reaktionsbedingungen: 32 Zyklen bei 93°C, 45 Sek.; 50°C, 45 Sek.; 68°C, 1 Min.
Die Reaktion wurde auf einem präparativen Agarosegel ausgeführt und das am stärksten ausgeprägte Band gereinigt und sequenziert. Auf der Gundlage der erhaltenen amplifizierten Sequenz wurden zusätzlich Primer konzipiert, um Sequenz und Klone von vollständig kodierender Region und ein Klon der vollständigen cDNA zu erhalten.
Um eine vollständig kodierende Sequenz der Human-GLP-2-Rezeptor-cDNA zu erhalten, wurden 5' RACE und 3' RACE verwendet. Die schnelle Amplifikation von cDNA-Enden (RACE) ist eine Prozedur, die routinemäßig zur Amplifikation von DNA-Sequenzen von einem ersten cDNA-Strang(leicht hergestellt aus mRNA)-Template zwischen einer festgelegten inneren Stelle und entweder dem 3'- oder dem 5'-Ende der mRNA verwendet wird. Die gesamte oder mRNA von unterschiedlichen Humangeweben sind kommerziell verfügbar bei Clontech. Das 3'-RACE-System (Gibco-BRL Life Technologies; Katalog Nr. 18373-019) und 5'-RACE-System(Katalog Nr. 18374-058)-Kits wurden verwendet. Die Handbücher dieser zwei Produkte liefern die detaillierten Protokolle. Verkürzt werden die Protokolle nachfolgend beschrieben.
Für die 3'-RACE-Prozedur wird eine cDNA-Synthese des ersten Stranges an dem Poly(A)-Schwanz der mRNA gestartet, indem der Adapter-Primer (mit dem System mitgeliefert), der eine einzigartige Sequenz für eine universelle PCR-Amplifikation der RACE-Produkte eingebaut enthält, verwendet. Nach der Synthese des ersten Stranges der cDNA aus diesem Primer wird das ursprüngliche mRNA-Template mit RNase H zerstört. Sodann wird die Amplifikation unter Verwendung von zwei Primer ausgeführt: Der eine ist ein genspezifischer Primer (der aus der verfügbaren partiellen cDNA- Sequenz von HHT13 aufgebaut wird); der andere ist der Universal-Amplifikations-Primer, der mit dem Kit bereitgestellt wird. Das amplifizierte Produkt wird in einen Plasmidvektor zum Sequenzieren subkloniert.
Bei dem 5'-RACE-System wird die cDNA des ersten Stranges aus mRNA unter Verwendung eines genspezifischen Primers synthetisch dargestellt (der auf der verfügbaren partiellen cDNA-Sequenz von HHT13 beruht), sowie der SuperScript II-Reverse-Transkriptase. Das ursprüngliche mRNA-Template wird durch Behandlung mit RNase H entfernt. Unter Verwendung einer Schleuderpatrone werden die uninkorporierten dNTP's, Primer und Proteine von der cDNA abgetrennt. Sodann wird ein homopolymerer dCTP-Schwanz dem 3' Ende der cDNA des ersten Stranges unter Verwendung von TdT-Enzyms und dCTP-Nucleotiden hinzugefügt. Die PCR-Amplifikation wird unter Verwendung zweier Primer ausgeführt: Der eine ist ein verschachtelter genspezifischer Primer, der aus der verfügbaren partiellen DNA-Sequenz von HHT13 aufgebaut wird; und der andere ist ein "Ankerprimer", der mit dem System mitgeliefert wird. Beide Primer inkorporieren Restriktionsstellen zum Subklonieren in Plasmide und nachfolgendes Sequenzieren.
SUBKLONIEREN VON HHT13 πgt10-KLONEN IN pcdna3, DEREN SEQUENZIEREN UND EXPRESSION
A. AMPLIFIKATION VON cDNA-INSERTS MIT πgt10 PRIMERN.
Auf einem Rasen von Bakterienzellen (E.coli C600Hfl) wurden 10 μl Phagen-Resuspension von jedem Klon auf markierte Stellen gegeben. Nach einer Inkubation von 5 Stunden bei 37°C wurden die Phagenplaques klar sichtbar. Die Oberfläche jedes Plaques wurde in 200 μl Wasser gegeben. Die Proben wurden in einem siedenden Wasserbad für 5 Minuten gehalten und bei Raumtemperatur für 10 Minuten zentrifugiert. Es wurden 1 μl-Proben verwendet, um mit einer Reihe von πgt 10-Primern zu amplifizieren:
GT10-5KXb [5'-GGGTAGTCGGTACCTCTAGAGCAAGTTCAGCC-3'] (SEQ ID NO:18)
vs
GT10-3BXh [5'-ATAACAGAGGATCCTCGAGTATTTCTTCCAG-3'] (SEQ ID NO:19)
Unter den folgenden Bedingungen wurde das Expand^TM System von Boehringer Mannheim (Katalog Nr. 1681-842) angewendet:
5 μl 10 × Expand^TM Puffer 3
7 μl 2,5 mM dNTP-Mischung
1,5 μl Primer GT10-5KXb
1,5 μl Primer GT10-3BXh
0,75 μl Expand PCR-Enzym (1 Einheit)
33,25 μl Wasser
1 μl DNA
Reaktionsbedingungen: 5 Zyklen von 93°C, 40 Sek.; 50°C, 1 Min.; 68°C, 2 Min. und 30 Zyklen von 93°C, 40 Sek.; Rampe bis 68°C, 1 Min.; 68°C, 2 Min.
Ein amplifiziertes DNA-Fragment von einer Länge von etwa 2.200 bp war von allen drei Klonen auf dem Agarose-Gel zu sehen. Das PCR-Produkt wurde unter Anwendung des QIAGEN's QIAquick PCR-Reinigungs-Kits (Katalog Nr. 28104) gereinigt und in 50 μl 10 mM Tris, pH 8,0, eluiert. Die Templates wurden sequenziert.
B. SUBKLONIEREN IN pcDNA3-VEKTOR
Die amplifizierte und gereinigte DNA von den drei Klonen wurde mit Kpn I und Xho I restringiert und in ein pcDNA3 subkloniert, die mit ähnlichen Restriktionsenzymen restringiert ist. Die Plasmide wurden bezeichnet als pHHT13-1, pHHT13-2 und pHHT13-3. Plasmid-DNAs wurden hergestellt unter Anwendung etweder der bloßen Methode (alkalische Behandlung, bakterielle DNA-Ausfällung mit 3M KOAc, Isopropanol-Ausfällung, gefolgt von einer RNAse Behandlung und zweiten Durchlauf einer Isopropanol-Ausfällung) oder mit Plasmid-DNA-Kits von Qiagen Inc. Die unter Anwendung der Qiagen-Kits hergestellten Templates wurden sequenziert.
C. FUNKTIONELLER ASSAY
Es wurden mit jedem Klon unter Verwendung des Ratten-GLP-2-R, 587-Klons als eine positive Kontrolle für das cAMP-Ansprechen auf GLP-2-Peptid Transfektionen ausgeführt. Die Methoden zur Transfektion, der Zellkultur und des cAMP Assays waren mit denen identisch, die für den funktionellen Assay von Ratten 587-Klon beschrieben wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass, obgleich die positive Kontrolle ein gutes cAMP-Ansprechen in COS-Zellen gab, keines der HHT13-Klone irgendeine cAMP-Reaktion zeigte. Wie mit Hilfe des Sequenzierens bestätigt wurde, bei dem sich eine Rasterverschiebungsmutation zeigte, legen die funktionellen Daten nahe, dass von diesen cDNA-Klonen kein funktionelles GLP-2R-Protein exprimiert wurde.
D. VERGLEICH VON DNA-SEQUENZEN ZWISCHEN RATTEN-GLP-2R UND EEHT13-SUBKLONEN
Der Vergleich zeigte eine 2bp-Deletion an einer Stelle, die den Nucleotiden 389-390 der Ratten-GLP-2R-cDNA entsprach, was zu einem Verlust der Nucleotide 374-375 der hierin dargestellten Human-GLP-2R-cDNA-Sequenz führt.
Die PCR wurde verwendet, um zwei bp der Ratten-GLP-2R-DNA-Sequenz in HHT13-1 DNA an der Stelle der 2 bp Rasterverschiebungsdeletion einzubauen, die in Bezug auf die Ratten-GLP-2R-kodierende Sequenz identifiziert wurde. Die folgenden Primer wurden aus HHT13 DNA-Sequenz aufgebaut, um zwei bp zu insertieren:
HWBR/2BPI-475F
[5'-ACAGGCATGTCTGGAAGACTTACTCAAGGAACCTTCTGGCAT-3'] (SEQ ID NO:20) HWBR/2BPI-506R
[5'-ATGCCAGAAGGTTCCT1TGAGTAAGTCTTCCAGACATGCCTGT-3'] (SEQ ID NO:21)
HWBR-F7 [5'-TTCCTCTGTGGTACCAAGAGGAATGC-3'] (SEQ ID NO:22) und HWBR-1910R:
[5'-GGTGGACTCGAGGTACCGATCTCACTCTCTTCCAGAATC-3'] (SEQ ID NO:23)
PCR 1: 1 ng pHHT13-1-DNA wurde als Template für die Ausführung zweier PCR mit den Primer HWBR-F7 gegenüber HWBR/2BPI-506R und HWBR/2BPI-475 F gegenüber HWBR-1910R verwendet.
Das Expand^TM PCR-System von Boehringer Mannheim (Katalog Nr. 1681-842) wurde unter den folgenden Bedingungen angewendet:
5 μl Lox-Expand^TM Puffer 3
7 μl 2,5 mM dNTP-Mischung
1,5 μ Primer HWBR-F7 oder HWBR/2BPI-475F
1,5 μ Primer HWBR-2BPI-506R oder HWBR-1910R
0,75 μl Expand PCR-Enzym (1 Einheit)
33,25 μl Wasser und
1 μl DNA.
Reaktionsbedingungen: 10 Zyklen von 92°C, 40 Sek.; 48°C, 1 mm; 68°C, 3 mm und 30 Zyklen von 92°C, 40 Sek.; 55°C, 40 Sek.; 68°C, 2 mm.
Die Primer HWBR-F7 und HWBR/2BPI-506R amplifizierten ein DNA-Fragment von 400 bp und HWBR/2BPI-475F und HWBR-1910R amplifizierten ein DNA-Fragment von näherungsweise 1,4 kb auf einem Agarose-Gel. Die zwei Bänder wurden aus dem Agarose-Gel herausgeschnitten und mit dem Qiaquick-Gel Extraktions-Kit von Qiagen Inc. (Katalog Nr. 28706) gereinigt und die DNAs in 50 μl von 10 mM Tris (pH 8,5) eluiert.
PCR 2 (Extension ohne Primer): Es wurden näherungsweise 75 ng zweier amplifizierter Produkte aus der vorgenannten PCR 1 gemischt und anschließend ohne Primer durch Ausdehnen unter den folgenden Bedingungen rekombiniert:
2 μl 10 × Expand^TM Puffer 1
2,8 μl 2,5 mM dNTP-Mischung
0,3 μl Expand PCR-Enzym (1 Einheit)
8,9 μl Wasser
6 μl von vereinten PCR1-Produkten
Reaktionsbedingungen: 15 Zyklen von 92°C, 1 Min.; 60°C, 5 Min.; 68°C, 3 Min.
PCR 3: 1 μl amplifizierte Mischung von PCR 2 wurde als Template zum Amplifizieren mit HWBR-F7 und HWBR-1910R-Primer unter Anwendung der folgenden Bedingungen verwendet:
10 μl 10 × Expand^TM Puffer 1
14 μl 2,5 mM dNTP-Mischung
3,0 μl Primer HWBR-F7 oder HWBR/2BPI-475F
3,0 μl Primer HWBR/2BPI-506R oder HWBR-1910R
1,5 μl Expand PCR-Enzym (1 Einheit)
67,5 μl Wasser und
1 μl DNA.
Reaktionsbedingungen: 30 Zyklen von 92°C, 1 Min.; 60°C, 1 Min.; 68°C, 2 Min.
Es wurde ein DNA-Fragment von näherungsweise 1,7 kb amplifiziert, wie es auf einem Agarose-Gel zu erkennen ist. Das PCR-Produkt wurde unter Anwendung des QIAGEN QIAquick PCR-Reinigungs-Kits (Katalog Nr. 28104) gereinigt und in 50 μl 10 mM Tris, pH 8,0, eluiert. Das gereinigte Produkt wurde mit Kpn I restringiert und in Kpn 1-restringierte pcDNA3.1(–)/Myc-His A (Invitrogen, Katalog Nr. V855-20) subkloniert. Einer der Klone mit der Bezeichnung pc.3.1/HuGL2R/MH6 (pHuMH6) hatte das 1,7kb-Insert in korrekter Orientierung, wie mit Hilfe der PCR unter Verwendung eines Vektors gegenüber mehrerer Insertprimer kontrolliert wurde.
Funktionelle Assay:
Dieser Hybrid-Klon wurde mit Ratten-GLP-2R unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Assays verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass der 2 bp "GA"-Austausch in die vermutliche Deletionsstelle ein Klon lieferte, der ein funktionelles GLP-2R-Protein kodiert, wie mit Hilfe der CAMP-Reaktion auf GLP-2-Behandlung gezeigt wird.
BEISPIEL 6
ISOLATION VON HUMAN-GLP-2-REZEPTOR-cDNA VOLLER LÄNGE
Es wurden zwanzigtausend Klone aus einer πgt10-cDNA-Bibliothek von Human-Magen (Clontech; Katalog Nr. HL3017a) auf jeweils 100 Agar-150mm-Platten aufgezogen. Jeder Platte wurde SM-Puffer (0,1 M NaCl, 10 mM Mg₂So₄, 35 mM Tris, pH-7,5, 0,01% Gelatine) zugegeben, um 100 Phagen-Lysate zu erhalten, die jeweils 20.000 (20K) gepoolte Klone enthielten. Die ersten fünfzig der 20K Phagen-Lysate (20K-Pools) wurden mit Hilfe der PCR unter Verwendung zweier Primer, die aus der HHT13 DNA-Sequenz aufgebaut waren, einem Screening unterzogen. Die Template-DNA von jedem Pool wurde hergestellt durch Sieden von Phagen-Lysat für 10 Minuten und Zentrifugieren für 10 Minuten.
HWBR-113F [5'-GTGGAGAGGATTTGTGCAAACATTTC-3'] (SEQ ID NO:24)
HWBR-578R [5'-AGAGACATTTCCAGGAGAAGAATGAG-3'] (SEQ ID NO:25)
Es wurde jeweils 1 μl jeder 20K-Pool-DNA mit Hilfe der PCR mit HWBR-113F- und HWBR578R-Primern unter Anwendung der folgenden Bedingungen einer Diagnose unterzogen:
2 μl 10 × Expand^TM-Puffer 1
2,8 μl 2,5 mM dNTP-Mischung
0,6 μl Primer HWBR-113F
0,6 μl Primer HWBR-578R
0,3 μl Expand PCR-Enzym (1 Einheit)
12,7 μl Wasser
1 μl 20K Pool-DNA
Reaktionsbedingungen: 35 Zyklen von 92°C, 40 Sek.; 60°C, 40 Sek.; 68°C, 1 Min.
Bei der Amplifikation von Templates aus zwei Poolen (HST 19 und HST 38) war ein DNA-Fragment von näherungsweise 450 bp zu erkennen.
B. SCREENING VON KLONEN AUS ZWEI POSITIVEN POOLS: HST 19 UND HST 38.
Es wurden 40.000 Klone von jeweils zwei positiven 20K Pools aufgezogen mit Hilfe von Plaque-Lifts auf Nitrocellulose-Filtern (Amersham; Katalog Nr. RPN137E) einem Screening unterzogen. Die Sonde wurde durch Random-Primermarkieren eines DNA-Fragmentes aus pHHT13-1 hergestellt.

1. Die Filter wurden vorhybridisiert und über Nacht bei 42°C hybridisiert. Die Hybridisierungslösung bestand aus 50% Formamid, 5 × SSPE, 5 × Denhart's Lösung, 0,5% SDS und Lachssperma-DNA (200 mg/ml).
2. Nach der Hybridisierung wurden die Filter unter den folgenden Bedingungen gewaschen: • zweimal bei Raumtemperatur in 2 × SSPE und 0,01% SDS; • zweimal bei 42°C in 2 × SSPE und 0,01% SDS; und • zweimal bei 50°C in 0,1 × SSPE und 0,01% SDS.
3. Die Filter wurden autoradiographiert und die Regionen auf den Platten, die mit den positiven Signalen übereinstimmten, isoliert. Einer der positiven Klone (HST 38-4-30) wurde aus dem HST 38-Pool isoliert. Das 450 bp DNA-Fragment wurde von dem positiven Klon unter Verwendung der Primer HWBR-113F und HWBR-578R amplifiziert und sequenziert. Die Sequenz zeigte deutlich, dass das Plasmid 2 bp (AG) an der Stelle 373-374 der HHT13 DNA-Sequenz enthielt.

Das vollständige Insert des Klons HST 38-4-30 wurde unter Verwendung von λgt10-Primern entsprechend der Beschreibung in Beispiel 1 amplifiziert. Mit der PCR wurde ein DNA-Fragment von näherungsweise 1,4 kb amplifiziert. Die amplifizierte DNA wurde gereinigt und sequenziert.
BEISPIEL 7
REKONSTRUKTION EINES KLONS FUNKTIONELLER HUMAN-GLP-2R-cDNA VOLLER LÄNGE UND FUNKTIONELLER ASSAY
Ein 700 bp-Fragment, das erhalten wurde durch Kpn I und Pvu II-Restriktionsdigerierung der amplifizierten DNA aus dem Klon UST 38-4-30 und 1,4 kb DNA-Fragment aus Xho I und Pvu II restringierter pHHT13-1 DNA, wurde in Kpn I und XHO I-restringierter pcDNA3 in einer Dreiwege-Ligation subkloniert. Das neuartige Plasmid-Konstrukt wurde bezeichnet als pc3/HuGL2R-2. Auf diese Weise wurde die Sequenz des Human-GLP-2-Rezeptors in der vollen Länge erhalten.
Funktioneller Assay:
Der neuartige Klon wurde mit dem Ratten-GLP-2R-Kon 587 entsprechend der vorstehend ausgeführten Beschreibung verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass der Klon ein funktionelles Human-GLP-2R-Protein kodierte, was zu einer cAMP-Erzeugung in COS-Zellen in Reaktion auf eine GLP-2-Behandlung führte (8).
BEISPIEL 8: ANTIKÖRPER, GERICHTET AUF DEN GLP-2-REZEPTOR
1. ANTIPEPTID-ANTIKÖRPER
Es wurden Antipeptid-Antikörper in Kaninchen gegen N-terminales Peptid (QTRENTTDIWQDESE) (SEQ ID NO: 26) aufgezogen, ein C-terminales Peptid (SEGDGSETLQKLR) (SEQ ID NO: 27) und eine extrazelluläre Schleife 1(SHNSUSKRPDDESG) (SEQ ID NO: 28) des Ratten-GLP-2-Rezeptos.
2. ANTIKÖRPER IN BEZUG AUF GEGEN EIN FUSIONSPROTEIN AUFGEZOGENEN GLP-2-REZEPTOR
Es wurde Polynucleotid, welches die C-terminale Region von Ratten-GLP-2-Rezeptor (Aminosäuren 444-550) kodiert, in den C-Terminus von Glutathion-5-Transferase (GST) in pGEX-2T gespleißt und in den E.col-Stamm SUREI exprimiert. Das Protein wurde unter Anwendung der Affinitätschromatographie gereinigt, indem das vorgenannt GLP-2-C-terminale Fragment fusioniert mit dem C-Terminus von maltosebindenem Protein verwendet wurde. Der Protease-Abbau wurde unter Verwendung eines Cocktails oder unter Verwendung von Protease-Hemmern (Boehringer Mannheim) auf ein Minimum herabgesetzt.
Antikörper wurden im Allgemeinen gemäß der Methode aufgezogen, die offenbart wurde in: "Antibodies: Laboratoriumshandbuch, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laborstory, 1988". Verkürzt gesagt, wurde das GLP-2-GST-Fusionsprotein zum Aufziehen von Antikörpern in Ratten wie folgt verwendet. Die erste Injektion erfolgte mit 100 μg Fusionsprotein in kompletten Freundscher Adjuvants an mehrfachen Stellen, intramuskulär und subkutan. Booster-Injektionen wurden an mehrfachen Stellen intramuskulär mit 100 μg Fusionsproteinen in kompletter Freundscher Adjuvants an den Tagen 14, 21, 42 und 56 vorgenommen.
Antiseren wurden über die Affinität unter Verwendung einer GLP-2-MBP-Fusionsprotein-Affinitätssäule gereinigt. Die immunocytochemische Analyse bestätigte, dass diese Antikörper spezifisch den GLP-2-Rezeptor erkennen.
ÄQUIVALENTE
Die vorstehend ausgeführte Beschreibung wird als ausreichend angesehen, um einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet die Ausführung der Erfindung zu ermöglichen. So sind faktisch zahlreiche Modifikationen an den vorstehenden Darlegungen zur Ausführung der Erfindung für den Fachmann auf dem Gebiet der Biochemie, Molekularbiologie und verwandten Gebieten offensichtlich und sind als innerhalb des Geltungsbereichs der beigefügten Ansprüche befindlich zu betrachten.
SEQUENCE LISTING

Claims

Isoliertes Polynucleotid, welches einen GLP-2-Rezeptor kodiert, ausgewählt aus: (a) einem Human-GLP-2-Rezeptor, aufweisend die Aminosäuresequenz von Aminosäuren 67-553 der SEQ ID Nr.: 12; (b) einen Ratten-GLP-2-Rezeptor, aufweisend die Aminosäuresequenz von Aminosäuren 67-550 der SEQ ID Nr.: 2; (c) ein Mammalia-Homolog mit mindestens 80% Sequenzidentität zu (a) oder (b), das das funktionelle Merkmal des selektiven Bindens von GLP-2 zeigt, und (d) eine Variante von (a), (b) oder (c), die das funktionelle Merkmal des selektiven Bindens von GLP-2 zeigt, wobei die Variante von 1 bis 20 Aminosäuren-Substitution(en) aufweist, worin der/die Substitution(en) ist/sind: (i) eine konservative Substitution(en), wenn dieses sich an einer über den Rezeptoren (a) und (b) konservierten Position befinden, und/oder (ii) eine/mehrere konservative oder nichtkonservative Substitution(en), wenn diese sich an einer nichtkonservierten Position über den Rezeptoren (a) und (b) befinden.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, welches einen GLP-2-Rezeptor kodiert, wobei der GLP-2-Rezeptor ein Human-GLP-2-Rezeptor ist, aufweisend die Aminosäuresequenz von Aminosäuren 67-553 der SEQ ID Nr.: 12.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, welches einen GLP-2-Rezeptor kodiert, wobei der GLP-2-Rezeptor ein Ratten-GLP-2-Rezeptor ist, aufweisend die Aminosäuresequenz von Aminosäuren 67-550 der SEQ ID Nr.: 2.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, aufweisend die Nucleotide 320 bis 1780 der SEQ ID Nr.: 11.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1 mit den Nucleotiden 335 bis 1786 der SEQ ID Nr.: 1.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid eine Glu85-Variante des Human-GLP-2-Rezeptors kodiert, wie er in SEQ ID Nr.: 12 gezeigt ist.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid für den Human-GLP-2-Rezeptor kodiert und das Polynucleotid für die Aminosäuresequenz von Aminosäuren 1-553 der SEQ ID Nr.: 12 kodiert.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid für den Human-GLP-2-Rezeptor kodiert und das Polynucleotid für die Aminosäuresequenz von Aminosäuren 26-553 der SEQ ID Nr.: 12 kodiert.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid für den Human-GLP-2-Rezeptor kodiert und das Polynucleotid für die Aminosäuresequenz kodiert, die zu mindestens 95% mit den Aminosäuren 26-553 der SEQ ID Nr.: 12 identisch ist.
Isoliertes Polynucleotid, welches unter Bedingungen hoher Stringenz mit einen Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 9 hybridisiert oder mit dem Komplement des Polynucleotids.
Oligonucleotid, aufweisend mindestens 15 Nucleotide und mit einer Polynucleotidsequenz, welche unter Bedingungen hoher Stringens mit einem Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 10 hybridisiert oder mit dem Komplement des Polynucleotids.
Oligonucleotid nach Anspruch 11, wobei die Nucleotidsequenz des Oligonucleotids mit einer Region des Polynucleotids identisch ist, das in Ansprüchen 4 oder 5 festgelegt ist, oder mit dem Komplement des Polynucleotids.
Oligonucleotid nach Anspruch 11, wobei die Nucleotidsequenz des Oligonucleotids mit einer Region identisch ist, die mit dem Polynucleotiden gemeinsam ist, die in Ansprüchen 4 oder 5 festgelegt sind, oder mit dem Komplement des Polynucleotids.
Markierte Foren eines Polynucleotids, ausgewählt aus einem Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
Rekombinantes Polynucleotid, aufweisend ein GLP-2-Rezeptor kodierendes Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 10 sowie die Expression kontrollierende Elemente, die funktionsfähig damit verknüpft sind, um deren Expression zu steuern.
Zelle, die genetisch bearbeitet ist, indem exprimierbar darin ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 10 eingebaut ist.
Zelle nach Anspruch 16, die eine Mammalia-Zelle ist.
Antikörper, der selektiv an einen GLP-2-Rezeptor bindet, kodiert durch das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, 7 bis 10.
Rekombinanter GLP-2-Rezeptor, ausgewählt aus: (a) einem Human-GLP-2-Rezeptor, aufweisend die Aminosäuresequenz von Aminosäuren 67-553 der SEQ ID Nr.: 12; (b) einem Ratten-GLP-2-Rezeptor, aufweisend die Aminosäuresequenz von Aminosäuren 67-550 der SEQ ID Nr.: 2; (c) ein Mammalia-Homolog mit mindestens 80% Sequenzidentität zu (a) oder (b), welches das funktionelle Merkmal des selektiven Bindens von GLP-2 zeigt; (d) eine Variante von (a), (b) oder (c), die das funktionelle Merkmal des selektiven Bindens von GLP-2 zeigt, wobei die Variante von 1 bis 20 Aminosäure-Substitution(en) aufweist, worin die Substitution(en) ist/sind: (i) eine konservative Substitution, wenn sie sich an einer Position befindet, die über den Rezeptoren (a) und (b) erhalten ist, und/oder (ii) eine/mehrere konservative oder nichtkonservative Substitution(en), wenn sie sich an einer Position befindet, die nicht über den Rezeptoren (a) und (b) erhalten ist, und (e) eine chimäre Foren von (a), (b), (c) oder (d), aufweisend eine oder mehrere Domänen von einem G-Protein-gekoppelten Rezeptor außer dem GLP-2-Rezeptor, worin die Domänen eine Transmembran-Domäne sind oder eine interzelluläre Domäne sind.
Rekombinanter GLP-2-Rezeptor nach Anspruch 19, wobei der GLP-2-Rezeptor ein Human-GLP-2-Rezeptor ist, aufweisend die Aminosäuresequenz von Aminosäuren 67-553 der SEQ ID Nr.: 12.
Rekombinanter GLP-2-Rezeptor nach Anspruch 19, wobei der GLP-2-Rezeptor ein Ratten-GLP-2-Rezeptor ist, aufweisend die Aminosäuresequenz von Aminosäuren 67-550 der SEQ ID Nr.: 2.
Rekombinanter GLP-2-Rezeptor nach Anspruch 19, wobei der GLP-2-Rezeptor eine Glu85-Variante des Human-GLP-2-Rezeptors ist, wie in SEQ ID Nr.: 12 gezeigt ist.
Fragment eines GLP-2-Rezeptors nach Anspruch 19 bis 22, wobei das Fragment eine Aminosäuresequenz aufweist, die eine interzelluläre C-Terminal-Domäne eines GLP-2-Rezeptors darstellt.
Fragment eines GLP-2-Rezeptors nach Anspruch 23, aufweisend mindestens 10 Aminosäure-Reste in der Region der SEQ ID Nr.: 12 entsprechend den Aminosäuren, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Aminosäuren 65-180, 363-385 und 442-533.
Antikörper, der selektiv an einen GLP-2-Rezeptor nach einem der Ansprüche 19 bis 21 bindet.
Zellmembranpräparat, deriviert von einer Zelle nach Anspruch 16 oder Anspruch 17.
Verfahren zum Identifizieren von GLP-2-Rezeptorliganden, welches Verfahren die Schritte umfasst: (1) Inkubieren eines Ligandenkandidaten mit einer Zelle nach Anspruch 16 oder 17 oder mit einem daraus erhaltenen Membranpräparat und anschließend (2) Bestimmen, ob ein Binden zwischen dem GLP-2-Rezeptor und dem Ligandenkandidaten erfolgt ist.
Verfahren zum Identifizieren von GLP-2-Rezeptorliganden, umfassend die Schritte: a. Identifizieren einer Zelle, die einen funktionellen GLP-2-Rezeptor exprimiert, wobei die Zelle, die ein rekombinantes DNA-Molekül enthält, für den GLP-2-Rezeptor kodiert, b. Inkubieren eines Ligandenkandidaten mit der Zelle, die einen funktionellen GLP-2-Rezeptor exprimiert, oder mit einem Membranpräparat, das von dieser Zelle deriviert ist, und c. Bestimmen, ob ein Binden des GLP-2-Rezeptors und des Liganden erfolgt ist.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei der Ligandenkandidat mit einer Zelle inkubiert ist, die einen funktionellen GLP-2-Rezeptor erzeugt und die Bestimmung, ob ein Binden zwischen dem GLP-2-Rezeptor und den Ligandenkadidaten erreicht worden ist, indem die Änderung in der interzellulären cAMP-Menge gemessen wird, wobei eine Zunahme der cAMP-Menge zeigt, dass der Ligandenkandidat ein GLP-2-Agonist ist.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, aufweisend eine Nucleotidsequenz mit mindestens 80% Sequenz-Identität zur SEQ ID Nr.: 1, wobei das Polynucleotid einen Mammalia-GLP-2-Rezeptor kodiert, der die funktionellen Merkmale des selektiven Bindens von GLP-2 zeigt.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei die Nucleotidsequenz mindestens eine Sequenzidentität zur SEQ ID Nr. 1 von 90% hat, wobei das Polynucleotid einen Mammalia-GLP-2-Rezeptor kodiert, der die funktionellen Merkmale des selektiven Bindens von GLP-2 zeigt.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei die Nucleotidsequenz mindestens 95% Sequenzidentität zur SEQ ID Nr.: 1 hat, wobei das Polynucleotid einen Mammalia-GLP-2-Rezeptor kodiert, der die funktionellen Merkmale des selektiven Bindens von GLP-2 zeigt.