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Die
Erfindung betrifft Wachstumsfaktoren für Endothelzellen und insbesondere
einen Teil eines neuartigen, vaskuloendothelialen Wachstumsfaktors,
DNA, die für
den Faktor codiert, und pharmazeutische und diagnostische Zusammensetzungen
und Verfahren, die den Faktor verwenden oder sich davon ableitet.
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Hintergrund der Erfindung
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Angiogenese
ist ein fundamentaler Prozeß,
der für
normales Wachstum und normale Entwicklung von Gewebe notwendig ist
und die Proliferation neuer Kapillaren aus bereits bestehenden Blutgefäßen umfaßt. Angiogenese
ist nicht nur an der embryonalen Entwicklung und normalem Wachstum,
Reparatur und Regeneration von Gewebe beteiligt, sondern auch am
weiblichen Reproduktionszyklus, an der Etablierung und am Erhalt
einer Schwangerschaft und an der Heilung von Wunden und Brüchen. Neben
der bei einem normalen Individuum stattfindenden Angiogenese, sind
Angiogenesevorgänge
an vielen pathologischen Prozessen beteiligt, insbesondere an Tumorwachstum
und Metastasierung, und an anderen Zuständen, bei denen eine erhöhte Blutgefäßproliferation,
insbesondere des mikrovaskulären
Systems, vorliegt, beispielsweise bei diabetischer Retinopathie,
Psoriasis und Arthropathien. Eine Inhibierung der Angiogenese ist
nützlich,
um diese pathologischen Prozesse zu verhindern oder zu lindern.
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Andererseits
ist die Förderung
von Angiogenese in Situationen erwünscht, in denen die Vaskularisation
etabliert oder ausgeweitet werden soll, beispielsweise nach Gewebe-
oder Organtransplantationen, oder um die Etablierung des Kollateralkreislaufs
bei Gewebeinfarkt oder Arterienstenose, beispielsweise bei koronarer
Herzerkrankung und Thrombangitis obliterans, zu stimulieren.
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Wegen
der entscheidenden Rolle der Angiogenese bei so vielen physiologischen
und pathologischen Prozessen, wurden Faktoren, die an der Kontrolle
der Angiogenese beteiligt sind, intensiv untersucht. Von einer Reihe
von Wachstumsfaktoren wurde gezeigt, daß sie an der Regulation der
Angiogenese beteiligt sind; diese umfassen Fibroblastenwachstumsfaktoren
(FGFs), Plättchenwachstumsfaktor
(Platelet-Derived Growth Factor, PDGF), transformierenden Wachstumsfaktor α (TGF-α) und Hepatozytenwachstumsfaktor
(HGF). Für einen Überblick
siehe beispielsweise Folkman et al., „Angiogenesis", J. Biol. Chem.,
1992 267 10931–10934.
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Es
wurde vermutet, daß in
erster Linie eine bestimmte Familie endothelzellspezifischer Wachstumsfaktoren
und deren entsprechende Rezeptoren für die Stimulierung von Endothelzellwachstum
und -differenzierung und für
bestimmte Funktionen der differenzierten Zellen verantwortlich sind.
Diese Faktoren sind Mitglieder der PDGF-Familie und scheinen über endotheliale
Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) zu fungieren. Bisher wurden vier Subtypen
von vaskuloendothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF) identifiziert.
Vaskuloendothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), inzwischen als VEGF-A
bekannt, wurde aus verschiedenen Quellen isoliert. VEGF-A zeigt
eine hochspezifische mitogene Wirkung auf Endothelzellen und kann
die vollständige
Kette von Vorgängen
stimulieren, die zu Angiogenese führen. Ferner zeigt er eine
starke chemoattraktive Wirkung auf Monozyten, kann Plasminogenaktivator
und Plasminogenaktivator-Inhibitor in Endothelzellen induzieren
und kann ferner mikrovaskuläre
Permeabilität
induzieren. Wegen der letztgenannten [TEXT FEHLT]
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Aktivität wird er
manchmal auch als vaskulärer
Permeabilitätsfaktor
(VPF) bezeichnet. Die Isolierung und die Eigenschaften von VEGF
wurden in Übersichtsartikeln
beschrieben; siehe Ferrara et al, „The Vascular Endothelial
Growth Factor Family of Polypeptides", J. Cellular Biochem., 1991 47 211–218 und
Connolly, „Vascular
Permeability Factor: A Unique Regulator of Blood Vessel Function", J. Cellular Biochem.,
1991 47 219–223.
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Kürzlich wurden
drei weitere Mitglieder der VEGF-Familie identifiziert. Sie werden
als VEGF-B, beschrieben in der Internationalen Patentanmeldung PCT/US96/02957
(WO 96/26736) von Ludwig Institute for Cancer Research und The University
of Helsinki, VEGF-C, beschrieben bei Joukov et al, The EMBO Journal, 1996
15 290–298,
und VEGF2, beschrieben in der Internationalen Patentanmeldung PCT/US94/05291
(WO 95/24473) von Human Genome Sciences, Inc., bezeichnet. VEGF-B
besitzt sehr ähnliche
angiogene und andere Eigenschaften wie VEGF, ist aber im Gewebe
anders verteilt und wird anders exprimiert als VEGF. Insbesondere
wird VEGF-B im Herzen sehr stark und in der Lunge nur schwach exprimiert,
während
für VEGF das
Gegenteil der Fall ist. Dies läßt vermuten,
daß VEGF
und VEGF-B trotz der Tatsache, daß sie in vielen Geweben co-exprimiert
werden, funktionelle Unterschiede aufweisen könnten.
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VEGF-B
wurde mit einer Hefe-Cohybrid-Interaction-Trap-Screeningmethode
isoliert, indem auf zelluläre
Proteine gescreent wurde, die mit zellulärem Retinsäure-Bindungsprotein I (CRABP-I)
in Wechselwirkung treten könnten.
Seine Isolierung und seine Eigenschaften sind in der PCT/US96/02597
und bei Olofsson et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 1996 93 2576–2581 ausführlich beschrieben.
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VEGF-C
wurde aus konditionierten Medien der PC-3-Prostatataadenokarzinom-Zelllinie
(CRL1435) isoliert, indem auf die Fähigkeit des Mediums gescreent
wurde, eine Tyrosinphosphorylierung der endothelzellspezifischen
Rezeptortyrosinkinase Flt4 herbeizuführen, wobei Zellen verwendet
wurden, die so transfiziert waren, daß sie Flt4 exprimierten. VEGF-C
wurde durch Affinitätschromatographie
mit rekombinantem Flt4 gereinigt und wurde aus einer PC-3-cDNA-Genbank
kloniert. Seine Isolierung und seine Eigenschaften sind bei Joukov
et al, The EMBO Journal, 1996 15 290–298 ausführlich beschrieben.
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VEGF2
wurde aus einer stark tumorigenen, Östrogen-unabhängigen humanen
Brustkrebszelllinie isoliert. Wenngleich von bei diesem Molekül festgestellt
wurde, daß es
zu etwa 22% homolog zu PDGF und zu 30% homolog zu VEGF ist, ist
das Verfahren zur Isolierung des für VEGF2 codierenden Gens unklar
und es ist keine Charakterisierung der biologischen Aktivität offenbart.
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Vaskuloendotheliale
Wachstumsfaktoren scheinen durch Bindung an die Rezeptortyrosinkinasen
der PDGF-Rezeptorfamilie zu fungieren. Es wurden fünf endothelzellspezifische
Rezeptortyrosinkinasen identifiziert, nämlich Flt-1 (VEGFR-1), KDR/Flk-1
(VEGFR-2), Flt4 (VEGFR-3), Tie und Tek/Tie-2. Alle besitzen die intrinsische
Tyrosinkinaseaktivität,
die zur Signaltransduktion notwendig ist. Die wesentliche, spezifische
Rolle von Flt-1, Flk-1, Tie und Tek/tie-2 bei Vaskulogenese und
Angiogenese wurde durch gezielte Mutationen gezeigt, die diese Rezeptoren
in Mäuseembryos
inaktivieren. VEGFR-1 und VEGFR-2 binden VEGF mit hoher Affinität und VEGFR-1
bindet auch VEGF-B und den Placenta-Wachstumsfaktor (PlGF). Es wurde
gezeigt, daß VEGF-C
der Ligand für
Flt4 (VEGFR-3) ist und auch VEGFR-2 aktiviert (Joukov et al, 1996).
Ein Ligand für
Tek/Tie-2 wurde beschrieben (Internationale Patentanmeldung PCT/US95/12935
(WO 96/11269) von Regeneron Pharmaceuticals, Inc.); der Ligand für Tie wurde
jedoch noch nicht identifiziert.
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Der
Rezeptor Flt-4 wird im Fötus
im Venen- und Lymphendothel exprimiert und beim Erwachsenen überwiegend
im Lymphendothel (Kaipainen et al, Cancer Res, 1994 54 6571–6577; Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92 3566–3570). Es wurde vermutet,
daß VEGF-C
eine primäre
Funktion im Lymphendothel und eine sekundäre Funktion bei Angiogenese-
und Permeabilitätsregulation
haben könnte,
die mit VEGF geteilt wird (Joukov et al, 1996).
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Wir
haben nun humane cDNA isoliert, die für einen Teil eines neuartigen
Proteins der Familie der vaskuloendothelialen Wachstumsfaktoren
codiert. Das neue Polypeptid mit der Bezeichnung VEGF-DΔNΔC weist strukturelle Ähnlichkeiten
mit anderen Mitgliedern dieser Familie auf.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
Erfindung stellt allgemein ein isoliertes, neues Wachstumsfaktorpolypeptid
bereit, das die Fähigkeit
besitzt, Proliferation oder Differenzierung von Endothelzellen zu
stimulieren und/oder zu fördern,
isolierte DNA-Sequenzen, die für
den neuen Wachstumsfaktor codieren, und Zusammensetzungen, die sich
für diagnostische
und/oder therapeutische Anwendungen eignen.
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Gemäß einem
Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes und gereinigtes Nukleinsäuremolekül bereit, das
ein neues Polypeptid mit der Bezeichnung VEGF-DΔNΔC codiert, das zu VEGF, VEGF-B
und VEGF-C strukturhomolog ist. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Nukleinsäuremolekül eine cDNA,
die für
einen Teil von VEGF-D von Aminosäurerest
93 bis Aminosäurerest
201 der SEQ ID NO: 5 codiert, die gegebenenfalls funktionsfähig mit
einer DNA-Sequenz verknüpft
ist, die für
das FLAGTM-Peptid codiert.
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Gemäß einem
zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein VEGF-DΔNΔC-Polypeptid bereit, wobei das
Polypeptid die Fähigkeit
besitzt, die Proliferation von Endothelzellen zu stimulieren, und
wobei das Polypeptid aus einer Folge von Aminosäuren besteht, die der in SEQ
ID NO: 5 angegebenen Aminosäuresequenz
entspricht und aus den Aminosäuren
93–201
besteht, und die Fähigkeit
besitzt, Endothelzellproliferation, -differenzierung, -migration
oder -überleben
oder mehr davon zu stimulieren.
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Diese
Fähigkeiten
werden hier als „biologische
Aktivitäten
von VEGF-DΔNΔC" bezeichnet und können leicht
mit im Stand der Technik bekannten Verfahren getestet werden. Das
Polypeptid besitzt vorzugsweise die Fähigkeit, Endothelzellproliferation
oder -differenzierung zu stimulieren, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein,
Proliferation oder Differenzierung vaskulärer Endothelzellen und/oder
lymphatischer Endothelzellen.
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Das
Polypeptid hat besonders bevorzugt die in SEQ ID NO: 5 angegebene
Sequenz der Aminosäuren 93–201 und
ist gegebenenfalls mit dem FLAGTM-Peptid
gekoppelt. Wenn das Fragment mit FLAGTM gekoppelt ist,
wird das Fragment hier als VEGF-DΔNΔC definiert.
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Die
Wachstumsfaktoren der PDGF-Familie, einschließlich VEGF, sind dimer, und
VEGF-B, VEGF-C, PlGF, PDGF-A und PDGF-B weisen vollständige Konservierung
von 8 Cysteinresten in den N-terminalen Domänen, d.h. den PDGF-ähnlichen
Domänen,
auf (Olofsson et al, 1996; Joukov et al, 1996). Es wird angenommen,
daß diese
Cysteine an intra- und intermolekularen Disulfidbrücken beteiligt
sind. Außerdem
gibt es weitere stark, aber nicht vollständig konservierte Cysteinreste
in den C-terminalen Domänen.
Loops 1, 2 und 3 jeder Untereinheit, die durch intramolekulare Disulfidbrücken gebildet
werden, sind an der Bindung an die Rezeptoren für die PDGF/VEGF-Familie von
Wachstumsfaktoren beteiligt (Andersson et al: Growth Factors, 1995 12
159–164).
Wie hier gezeigt, sind die Cysteine, die in bereits bekannten Mitgliedern
der VEGF-Familie konserviert sind, auch in VEGF-DΔNΔC konserviert.
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Ein
Fachmann ist sich darüber
im Klaren, daß diese
Cysteinreste in jeder vorgeschlagenen varianten Form erhalten bleiben
sollten und daß die
aktiven Zentren in den Loops 1, 2 und 3 ebenfalls erhalten bleiben sollten.
Von anderen Regionen des Moleküls
ist jedoch zu erwarten, daß sie
für die
biologische Funktion von geringerer Bedeutung sind und daß sie daher
geeignete Ziele für
eine Modifikation bieten. Modifizierte Polypeptide können leicht
mit Hilfe üblicher
Aktivitätstests,
wie beispielsweise Zellproliferationstests, auf ihre Fähigkeit
getestet werden, die biologische Aktivität von VEGF-DΔNΔC zu zeigen.
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Es
wird in Betracht gezogen, daß einige
modifizierte VEGF-DΔNΔC-Polypeptide
die Fähigkeit
besitzen werden, an Endothelzellen, d.h. an VEGF-D-Rezeptoren, zu
binden, aber nicht in der Lage sind, Endothelzellproliferation,
-differenzierung, -migration oder -überleben zu stimulieren. Es
ist zu erwarten, daß diese
modifizierten Polypeptide dazu fähig
sind, als kompetitive oder nicht-kompetitive Inhibitoren von VEGF-D zu fungieren, und
daß sie
sich für
Situationen eignen, in denen es wünschenswert ist, die Wirkung
von VEGF-D zu verhindern
oder zu reduzieren.
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Gemäß einem
dritten Aspekt stellt die Erfindung eine gereinigte und isolierte
Nukleinsäure
bereit, die für
das erfindungsgemäße Polypeptidfragment
codiert. Die Nukleinsäure
kann DNA, genomische DNA, cDNA oder RNA sein und kann einzelsträngig oder
doppelsträngig
sein. Die Nukleinsäure
kann aus einer Zelle oder einem Gewebe als Quelle isoliert werden
oder rekombinanten oder synthetischen Ursprungs sein. Aufgrund der
Degeneration des genetischen Codes ist es für den Fachmann offensichtlich,
daß viele
solche codierenden Sequenzen möglich
sind, wobei jede Sequenz die in SEQ ID NO: 5, Aminosäurereste
93–201,
gezeigte Aminosäuresequenz
codiert.
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Ein
vierter Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, die die erfindungsgemäße cDNA
oder eine Nukleinsäure
gemäß dem dritten
Aspekt der Erfindung umfassen, sowie Wirtszellen, die mit den erfindungsgemäßen Vektoren
transformiert oder transfiziert sind. Diese Zellen sind besonders
zur Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids
geeignet und umfassen Insektenzellen, wie beispielsweise Sf9-Zellen,
die bei der American Type Culture Collection (ATCC SRL-171) erhältlich sind
und mit einem Baculovirus-Vektor transformiert sind, und die humane
Embryo-Nierenzelllinie 293EBNA, die mit einem geeigneten Expressionsplasmid
transfiziert ist. Bevorzugte Vektoren der Erfindung sind Expressionsvektoren,
in denen eine erfindungsgemäße Nukleinsäure funktionsfähig mit
einem oder mehreren geeigneten Promotoren und/oder anderen Kontrollsequenzen verknüpft ist,
so daß geeignete
Wirtszellen, die mit den Vektoren transformiert oder transfiziert
sind, in der Lage sind, das erfindungsgemäße Polypeptid zu exprimieren.
Andere bevorzugte Vektoren sind solche, die für die Transfektion von Säugerzellen
oder für
gentherapeutische Zwecke geeignet sind, wie beispielsweise Adenovirus-
oder Retrovirus-Vektoren oder Liposomen. Eine Vielzahl entsprechender
Vektoren ist im Stand der Technik bekannt.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Vektors
bereit, der in der Lage ist ein Polypeptid zu exprimieren, für das eine
erfindungsgemäße Nukleinsäure codiert,
wobei es die Schritte der funktionsfähigen Verknüpfung der Nukleinsäure mit
einem oder mehreren geeigneten Promotoren und/oder anderen Kontrollsequenzen
umfaßt,
wie oben beschrieben ist.
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Die
Erfindung stellt zudem ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids
bereit, welches die Schritte des Exprimierens eines erfindungsgemäßen Vektors
in einer Wirtszelle und des Isolierens des Polypeptids aus der Wirtszelle
oder aus dem Kulturmedium für
die Wirtszelle umfaßt.
In einer bevorzugten Ausführungsform
dieses Aspekts der Erfindung umfaßt der Expressionsvektor ferner
eine Sequenz, die für
ein Affinitäts-Tag,
wie beispielsweise FLAGTM oder Hexahistidin,
codiert, um die Reinigung des Polypeptids durch Affinitätschromatographie
zu erleichtern.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen Antikörper bereit,
der spezifisch mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid reagiert. Dieser
Aspekt der Erfindung umfaßt
Antikörper,
die für
den oben angegebenen VEGF-DΔNΔC spezifisch
sind. Solche Antikörper
eignen sich als Inhibitoren oder Agonisten von VEGF-DΔNΔC sowie als
diagnostische Mittel zum Nachweis und zur Quantifizierung von VEGF-DΔNΔC geeignet.
Es können
polyklonale oder monoklonale Antikörper verwendet werden. Monoklonale
und polyklonale Antikörper
gegen erfindungsgemäße Polypeptide
können
mittels auf diesem Gebiet üblicher
Standardverfahren erzeugt werden. Für manche Zwecke, beispielsweise
wenn bei einer klinischen Situation ein monoklonaler Antikörper zur
Inhibierung der Wirkungen von VEGF-DΔNΔC eingesetzt werden soll, kann
der Einsatz humanisierter oder chimärer monoklonaler Antikörper erwünscht sein.
Verfahren zu deren Herstellung, einschließlich rekombinanter DNA-Verfahren,
sind im Stand der Technik ebenfalls gut bekannt.
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Dieser
Aspekt der Erfindung umfaßt
auch einen Antikörper,
der VEGF-DΔNΔC erkennt
und der zweckmäßig markiert
ist.
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Erfindungsgemäße Polypeptide
oder Antikörper
können
mit einem nachweisbaren Marker markiert sein und für Diagnosezwecke
eingesetzt werden. Ähnlich
kann das so markierte erfindungsgemäße Polypeptid zur in situ-Identifizierung
seines entsprechenden Rezeptors verwendet werden. Zur Bildgebung
können
das Polypeptid oder der Antikörper
kovalent oder nicht-kovalent an ein geeignetes supermagnetisches,
paramagnetisches, elektronendichtes, echogenes oder radioaktives
Mittel gekuppelt werden. Für
den Einsatz bei diagnostischen Tests können radioaktive oder nicht-radioaktive
Marker verwendet werden, wobei letztere Enzymmarker oder Marker
des Biotin/Avidin-Systems umfassen.
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Klinische
Applikationen der Erfindung umfassen diagnostische Applikationen,
Beschleunigung der Angiogenese bei Wundheilung, Gewebe- oder Organtransplantation
oder Etablierung des Kollateralkreislaufs bei Gewebeinfarkt oder
Arterienstenose, wie beispielsweise bei koronarer Arterienerkrankung,
sowie Inhibierung der Angiogenese bei der Behandlung von Krebs oder
diabetischer Retinopathie. Quantifizierung von VEGF-DΔNΔC in Biopsieproben bei Krebs
kann als Indikator für
zukünftiges
Metastaserisiko nützlich
sein.
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Soweit
VEGF-DΔNΔC in der
Lunge stark exprimiert wird und auch die Gefäßpermeabilität erhöht, ist es
für verschiedene
Zustände
der Lunge von Bedeutung. VEGF-DΔNΔC-Tests könnten bei
der Diagnose verschiedener Lungenerkrankungen verwendet werden.
VEGF-DΔNΔC könnte auch
bei der Behandlung von Lungenerkrankungen verwendet werden, um die
Blutzirkulation in der Lunge und/oder den Gasaustausch zwischen
den Lungenflügeln
und dem Blutstrom zu verbessern. Ähnlich könnte VEGF-DΔNΔC dazu verwendet werden, die
Blutzirkulation zum Herzen und die Permeabilität für O2-Gas
im Falle von Herzinsuffizienz zu verbessern. In ähnlicher Weise könnte VEGF-DΔNΔC dazu verwendet
werden, die Blutzufuhr und den Gasaustausch bei chronisch obstruktiven
Luftwegserkrankungen zu verbessern.
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Umgekehrt
könnten
VEGF-DΔNΔC-Antagonisten
(z.B. Antikörper
und/oder Inhibitoren) zur Behandlung von Zuständen wie kongestiver Herzinsuffizienz
verwendet werden, bei denen es aufgrund eines Anstiegs der Gefäßpermeabilität zu einer
Flüssigkeitsakkumulation,
beispielsweise in der Lunge, kommt, indem eine ausgleichende Wirkung
auf die Gefäßpermeabilität ausgeübt wird,
um der Flüssigkeitsakkumulation
entgegenzuwirken.
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Die
Erfindung stellt daher Zusammensetzungen bereit, die die Angiogenese
und/oder die Neovaskularisation in einem Säuger stimulieren, was den Schritt
der Verabreichung einer wirksamen Dosis von VEGF-DΔNΔC umfaßt, die
die Fähigkeit
besitzt, die Endothelzellproliferation in dem Säuger zu stimulieren.
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VEGF-DΔNΔC kann gegebenenfalls
zusammen oder in Verbindung mit VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, PlGF, PDGF,
FGF und/oder Heparin oder mehreren davon verabreicht werden.
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Umgekehrt
stellt die Erfindung Zusammensetzungen zur Inhibierung von Angiogenese
und/oder Neovaskularisation in einem Säuger bereit, was den Schritt
der Verabreichung einer wirksamen Menge eines Antagonisten von VEGF-D
an einen Säuger
umfaßt.
Der Antagonist kann jedes Mittel sein, welches die Wirkung von VEGF-DΔNΔC verhindert,
indem es entweder die Bindung von VEGF-DΔNΔC an dessen entsprechenden Rezeptor
oder die Zielzelle verhindert, oder indem es die Aktivierung des
Signaltransduktors vom Rezeptor zum Wirkzentrum in der Zelle verhindert.
Geeignete Antagonisten umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, gegen
VEGF-DΔNΔC gerichtete
Antikörper;
kompetitive oder nicht-kompetitive Inhibitoren der Bindung von VEGF-DΔNΔC an den
VEGF-D-Rezeptor, wie beispielsweise die oben angegebenen rezeptorbindenden,
aber nicht-mitogenen VEGF-DΔNΔC-Varianten;
sowie Antisense-Nukleotidsequenzen, die zu wenigstens einem Teil
der für
VEGF-DΔNΔC codierenden
DNA-Sequenz komplementär
sind.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Nachweis von VEGF-DΔNΔC in einer
biologischen Probe bereit, welches den Schritt des In-Kontakt-bringens
der Probe mit einem zur Bindung von VEGF-DΔNΔC fähigen Reagens und den Nachweis
der Bindung umfaßt.
Das zur Bindung von VEGF-DΔNΔC fähige Reagens
ist vorzugsweise ein gegen VEGF-DΔNΔC gerichteter
Antikörper
und besonders bevorzugt ein monoklonaler Antikörper. In einer bevorzugten
Ausführungsform
werden die Bindung und/oder das Ausmaß der Bindung mit einem nachweisbaren
Marker nachgewiesen; geeignete Marker sind oben erörtert.
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Wenn
VEGF-DΔNΔC oder ein
Antagonist für
therapeutische Zwecke verwendet werden sollen, hängen Dosis und Verabreichungsweg
vom zu behandelnden Zustand ab und werden vom behandelnden Arzt oder
Veterinär
bestimmt. Geeignete Wege umfassen subkutane, intramuskuläre oder
intravenöse
Injektion, topische Applikation, Implantate usw. Die topische Applikation
von VEGF-DΔNΔC kann analog
zu VEGF erfolgen.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt stellt die Erfindung Mittel zur Diagnose/Prognose, üblicherweise
in Form von Testkits, bereit. In einer Ausführungsform der Erfindung wird
beispielsweise ein Testkit zur Diagnose/Prognose bereitgestellt,
der einen Antikörper
gegen VEGF-DΔNΔC sowie Mittel
zum Nachweis, und besonders bevorzugt zur Bestimmung, der Bindung
zwischen dem Antikörper
und VEGF-DΔNΔC umfaßt. In einer bevorzugten
Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Mittel
zur Diagnose/Prognose ist entweder der Antikörper oder das VEGF-DΔNΔC mit einem
nachweisbaren Marker markiert, und entweder ist der Antikörper oder das
VEGF-DΔNΔC substratgebunden,
so daß die
Wechselwirkung VEGF-DΔNΔC-Antikörper festgestellt
werden kann, indem die Menge an Marker bestimmt wird, die nach Bindung
zwischen dem Antikörper
und dem VEGF-DΔNΔC an das
Substrat gebunden ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung können
die Mittel zur Diagnose/Prognose in Form eines üblichen ELISA-Kits bereitgestellt
werden.
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In
einer weiteren alternativen Ausführungsform
können
die Mittel zur Diagnose/Prognose Mittel für eine Polymerasekettenreaktion
umfassen, um die genomische Sequenzstruktur eines VEGF-DΔNΔC-Gens eines
individuellen Tests zu ermitteln und um diese Sequenzstruktur mit
der in dieser Anmeldung offenbarten Struktur zu vergleichen, um
Anomalien aufzufinden und festzustellen, ob Aberrationen bei der VEGF-DΔNΔC-Expression mit einem
gegebenen Krankheitszustand in Zusammenhang stehen.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis
von Strukturaberrationen in der Struktur des VEGF-DΔNΔC-Gens bei
einem Testsubjekt, welche mit einem Krankheitszustand dieses Testsubjekts
zusammenhängen
könnten.
Das Verfahren umfaßt
das Bereitstellen einer DNA-Probe dieses Testsubjekts; das In-Kontakt-Bringen
der DNA-Probe mit einem für
VEGF-DΔNΔC spezifischen
Primersatz, der funktionsfähig
mit einer Polymerase gekoppelt ist, sowie das selektive Amplifizieren
der VEGF-DΔNΔC-DNA aus
der Probe durch Polymerasekettenreaktion, und den Vergleich der
Nukleotidsequenz der amplifizierten VEGF-DΔNΔC-DNA aus der Probe mit den
in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 4 angegebenen Nukleotidsequenzen.
Die Erfindung umfaßt
auch die Bereitstellung eines Testkits, welcher ein für VEGF-DΔNΔC-DNA spezifisches
Primerpaar umfasst, das funktionsfähig mit einer Polymerase gekoppelt
ist, wodurch die Polymerase zur selektiven Amplifikation von VEGF-DΔNΔC-DNA aus
einer DNA-Probe
fähig ist.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung einer
pharmazeutischen Zusammensetzung, welche entweder ein VEGF-DΔNΔC-Polypeptid
umfaßt,
das die Proliferation von Endothelzellen fördert, oder einen Antikörper dagegen.
Daneben können
Zusammensetzungen, die ein VEGF-DΔNΔC-Polypeptid umfassen,
gegebenenfalls VEGF, VEGF-B und VEGF-C und/oder Heparin oder mehrere
davon umfassen.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Proteindimer, das
VEGF-DΔNΔC-Polypeptid
umfaßt,
insbesondere ein disulfidverbrücktes
Dimer. Die erfindungsgemäßen Proteindimere
umfassen sowohl Homodimere des VEGF-DΔNΔC-Polypeptids als auch Heterodimere
aus VEGF-DΔNΔC und VEGF,
VEGF-B, VEGF-C, PlGF oder PDGF.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Isolierung
von VEGF-DΔNΔC bereitgestellt,
welches den Schritt des Aussetzens einer VEGF-DΔNΔC exprimierenden Zelle gegen
Heparin umfaßt,
um die Freisetzung von VEGF-DΔNΔC aus der
Zelle und die Reinigung des auf diese Weise freigesetzten VEGF-DΔNΔC zu erleichtern.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung beinhaltet die Bereitstellung eines
Vektors, welcher eine Antisense-Nukleotidsequenz
umfaßt,
die zu wenigstens einem Teil einer DNA-Sequenz komplementär ist, die
für VEGF-DΔNΔC codiert, das die Endothelzellproliferation
fördert.
Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung kann ein solcher Vektor, der eine
Antisense-Sequenz umfaßt,
dazu eingesetzt werden, die VEGF-DΔNΔC-Expression zu inhibieren oder
mindestens abzuschwächen.
Die Verwendung eines Vektors dieses Typs zur Inhibierung der VEGF-DΔNΔC-Expression
wird in Situationen bevorzugt, in denen die VEGF-DΔNΔC-Expression mit
einer Erkrankung zusammenhängt,
beispielsweise wenn Tumore VEGF-DΔNΔC produzieren,
um Angiogenese sicherzustellen. Eine Transformation solcher Tumorzellen
mit einem Vektor, der eine Antisense-Nukleotidsequenz enthält, würde eine
Angiogenese unterdrücken
oder verlangsamen und so das Tumorwachstum inhibieren oder verlangsamen.
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Kurze Beschreibung der
Figuren
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1 zeigt einen Vergleich zwischen den Sequenzen
von humanem VEGF-D und humanem VEGF165 (1a),
humanem VEGF-B (1b), humanem VEGF-C (1c)
und humanem PlGF (1d). Der Kasten zeigt die Reste
an, die mit den in humanem VEGF-D vorkommenden übereinstimmen;
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2 zeigt
Sequenz-Alignments zwischen den Sequenzen von humanem VEGF-D, humanem VEGF165, humanem VEGF-B, humanem VEGF-C und humanem
PlGF. Die Kästen
zeigen die Reste an, die mit der VEGF-D-Sequenz übereinstimmen; und
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3 zeigt
die Aminosäuresequenz
des humanen VEGF-D (SEQ ID NO: 3), wie sie aus der cDNA-Sequenz (SEQ ID NO:
1) vorhergesagt wird. Die Kästen
zeigen mögliche
Stellen für
eine N-verknüpfte
Glykosylierung;
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4 zeigt
die Nukleotidsequenz einer zweiten cDNA-Sequenz, welche für humanes
VEGF-D (SEQ ID NO: 4) codiert, die durch Hybridisierung aus einer
kommerziell erhältlichen
cDNA-Genbank von humaner Lunge isoliert wurde; diese DNA enthält die vollständige codierende
Region für
humanen VEGF-D;
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5 zeigt
die Aminosäuresequenz
für humanen
VEGF-D (SEQ ID NO: 5), die sich aus der cDNA-Sequenz der 4 ableitet;
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6 zeigt
Sequenz-Alignments zwischen den Aminosäuresequenzen von humanem VEGF-D,
humanem VEGF165, humanem VEGF-B, humanem
VEGF-C und humanem PlGF; und
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7 zeigt
die Ergebnisse eines Bioassays, bei dem konditioniertes Medium von
COS-Zellen, welche entweder VEGF-A oder VEGF-D exprimieren, auf
seine Fähigkeit
getestet wurde, an die extrazelluläre Domäne eines chimären Rezeptors,
der in Ba/F3-Zellen exprimiert wurde, zu binden.
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8 zeigt die Ergebnisse einer Immunpräzipitation
und Western-Blot-Analyse von VEGF-D-Peptiden
(A) pEFBOSVEGFDfullFLAG
und pCDNA-1VEGF-A wurden in COS-Zellen transfiziert und für 4 Stunden
biosynthetisch mit 35S-Cystein/Methionin
markiert. Die Überstände dieser
Kulturen wurden entweder mit M2-Gel oder
einem Antiserum, das gegen an Protein A gekoppeltes VEGF-A gerichtet
ist, immunpräzipitiert.
Gewaschene Kügelchen
wurden mit einem gleichen Volumen 2 × SDS-PAGE-Probenpuffer eluiert
und zum Sieden erhitzt. Die Proben wurden anschließend mit
12%iger SDS-PAGE aufgetrennt. Bahnen, die mit einem Stern (*) markiert
sind, zeigen an, wo Proben mit Dithiothreitol reduziert und mit
Iodacetamid alkyliert wurden. Die Molekulargewichtmarker sind angegeben.
fA und fB zeigen die 43 kD- und 25 kD-Spezies an, die im M2-Gel aus den pEFBOSVEGFDfullFLAG
exprimierenden COS-Zellen immunpräzipitiert wurden.
(B)
Western-Blot-Analyse von gereinigtem VEGF-DΔNΔC. Ein Aliquot Material, das
aus der M2-Affinitätssäule eluiert
wurde (Fraktion #3, VEGF-DΔNΔC) wurde
mit 2 × SDS-PAGE-Probenpuffer
gemischt und auf einem 15%igen SDS-PAGE-Gel aufgetrennt. Die Proteine
wurden anschließend
auf eine Nitrocellulosemembran überführt und
entweder mit monoklonalem Antikörper
M2 oder einem Isotyp-gematchten
Antikörper
als Kontrolle (Neg) ausgetestet. Die Blots wurden mit Hilfe eines
Ziege-anti-Maus-HRP-Sekundärantikörpers und
Chemilumineszenz (ECL, Amersham) entwickelt. Monomeres VEGF-DΔNΔC ist mit
einem Pfeil gekennzeichnet, ebenso wie die putative dimere Form
dieses Peptids (VEGF-DΔNΔC"). Die Molekulargewichtmarker
sind angegeben.
-
9 zeigt
die Ergebnisse der Analyse des VEGF-DΔNΔC-Proteins bei einem VEGFR2-Bioassay. Rekombinantes
VEGF-DΔNΔC, und durch
M2-Affinitätschromatographie
gereinigtes Material, wurde in einem VEGFR2-Bioassay untersucht.
Die Zellen des Bioassays (104), die gewaschen
wurden, um IL-3 zu entfernen, wurden mit Aliquots von konditioniertem
Medium von mit VEGF-D transfizierten COS-Zellen, Fraktion #1 von der
Affinitätssäule (Porenvolumen)
oder Fraktion #3 von der Affinitätssäule (mit
VEGF-DΔNΔC), inkubiert.
Alle Proben wurden bei einer anfänglichen
Konzentration von 20% (d.h. 1/5) und anschließend in doppelten Verdünnungen
untersucht. Die Zellen wurden 48 Stunden bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 10% CO2 inkubieren gelassen. Die Zellproliferation
wurde durch Zugabe von 1 μCi 3H-Thymidin und Zählung der in einer Zeitspanne
von 4 Stunden eingebauten Menge quantifiziert.
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10 zeigt
die Stimulierung der Tyrosinphosphorylierung des VEGFR3-Rezeptors
(Flt4) auf NIH3T3-Zellen
durch Kulturüberstand
von HF-Zellen, die mit einem mit VEGF-D transformierten, rekombinanten
Baculovirus-Vektor infiziert waren.
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11 zeigt
die Stimulierung der Tyrosinphosphorylierung des VEGFR2-Rezeptors
(KDR) in PAE-Zellen
durch Kulturüberstand,
der wie in 10 hergestellt wurde.
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12 zeigt
die mitogene Wirkung von VEGF-DΔNΔC auf Endothelzellen
der Rinderaorta (BAEs). Die BAEs wurden mit Fraktion #3, die VEGF-DΔNΔC und, als
positive Kontrolle, gereinigtes VEGF-A enthielt, wie im Text beschrieben
behandelt. Das Ergebnis, das man mit Medium erhält, dem kein Wachstumsfaktor
zugegeben worden war, wird als Mediumkontrolle bezeichnet.
-
Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
-
Die
Erfindung wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Figuren und
die folgenden, nicht einschränkenden
Beispiele ausführlich
beschrieben.
-
Beispiel 1
-
Es
wurde die Vermutung angestellt, daß keine weiteren Mitglieder
der VEGF-Familie zu finden seien, da es keine bekannten Orphanrezeptoren
in der VEGFR-Familie gibt. Zudem liegen uns keine Kenntnisse über Mutmaßungen im
Stand der Technik vor, daß weitere
derartige Familienmitglieder existieren würden.
-
Eine
Computerrecherche in Nukleinsäuredatenbanken
wurde zufällig
im Rahmen eines anderen Projekts durchgeführt, wobei die Aminosäuresequenzen
von VEGF, VEGF-B, VEGF-C und PlGF Gegenstand der Suche waren. Mehrere
cDNA-Sequenzen wurden bei dieser Suche identifiziert. Eine dieser
Sequenzen, GenBank-Zugriffsnummer
H24828, codiert für
ein Polypeptid, das der cysteinreichen C-terminalen Region von VEGF-C
in seiner Struktur ähnelte.
Diese Sequenz wurde aus der Datenbank von „Expressed Sequence Tags" (dbEST) erhalten
und wird im Rahmen dieser Beschreibung mit XPT bezeichnet. Die XPT-cDNA
war aus einer humanen cDNA-Genbank mit der Bezeichnung "Soares Breast 3NbHBst" isoliert worden,
die mit Hilfe von mRNA aus adultem humanem weiblichen Brustgewebe
konstruiert wurde. Soweit festgestellt werden konnte, war dies normales
Brustgewebe. Die Sequenzierung der XPT-DNA erfolgte nach Vorgaben
des Integrated Molecular Analysis of Genome Expression Consortium
(IMAGE Consortium), das cDNA-Genbanken von Laboratorien der ganzen
Welt erbittet, die cDNA-Klone sortiert und sie anderen Organisationen
zur Sequenzierung zur Verfügung
stellt.
-
Die
in der Datenbank gezeigte XPT-Sequenz war 419 Nukleotide lang und
codierte für
eine Aminosäuresequenz,
die den 100 C-terminalen Aminosäuren
von VEGF-C ähnlich
war, d.h. bei dem Nummerierungssystem von Joukov et al (1996) ungefähr den Resten
250 bis 350. Ähnlich
cysteinreiche Regionen sind in anderen Proteinen zu finden, die
in ihrer Funktionsweise in absolut keinem Zusammenhang mit der VEGF-Familie
stehen, wie beispielsweise das sekretierte seideähnliche Protein sp185, das
in den Speicheldrüsen
der Mücke
Chironomus tentans synthetisiert wurde. Dieses Protein wird vom
Gen BR3 codiert, das in einem Balbiani-Ring lokalisiert ist, einem
gewebespezifischen Chromosomen-„Puff", der sich auf Polytänchromosomen in den Speicheldrüsen der
Mücke findet
(Dignam und Chase; Gene, 1990 88 133–140; Paulsson et al J. Mol.
Biol., 1990 211 331–349).
Joukov et al (1996) stellen fest, daß sich das sp185-ähnliche
Strukturmotiv in VEGF-C zu einer unabhängigen Domäne falten kann, die vermutlich
nach der Biosynthese wenigstens teilweise abgespalten wird, und
daß es
wenigstens ein Cysteinmotiv vom Typ sp185 in der C-terminalen Region
von VEGF gibt.
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3 von
Joukov et al zeigt, daß die
letzten zwei Drittel der C-terminalen, cysteinreichen Region von VEGF-C
kein Alignment mit VEGF oder PlGF bilden und vielmehr als C-terminale
Verlängerung
von VEGF-C angesehen werden könnten,
die in VEGF oder PlGF nicht vorliegt. Die von XPT codierte Sequenz ähnelt dieser Verlängerung.
Da die XPT-cDNA an ihrem 5'-Ende
trunkiert war, war es nicht möglich,
Aminosäuresequenzen für die Regionen,
die N-terminal zur cysteinreichen Domäne liegen, abzuleiten oder
vorherzusagen. Daher erstreckt sich der Teil von VEGF-C, welcher
der von XPT abgeleiteten Sequenz ähnelt, nicht auf Regionen von VEGF-C,
die bei anderen Mitgliedern der VEGF-Familie konserviert sind.
-
Wie
oben beschrieben, war es nicht möglich
vorherzusagen, ob die N-terminale Region des Polypeptids, welches
von einer vollständigen
XPT-Nukleinsäure
codiert wird (im Unterschied zur trunkierten XPT-cDNA in dbEST),
weitere Homologie zu irgendeinem Mitglied der VEGF-Familie zeigen
könnte,
insbesondere zu VEGF-C,
das weitere 250 N-terminale Aminosäuren besitzt. Das natürlich vorkommende
Protein, das von einer vollständigen
XPT-Nukleinsäure
codiert wird, könnte
beispielsweise das humane Homologe des Proteins aus der Speicheldrüse der Mücke sein.
Alternativ dazu könnte
der Typ des cysteinreichen Motivs, das von trunkierter XPT-cDNA
codiert wird, bei anderen Proteinen weit verbreitet sein, wie es
bei vielen Strukturdomänen der
Fall ist. Cluster aus Cysteinresten könnten beispielsweise bei der
Bindung von Metallen, an der Bildung intramolekularer Disulfidbrücken zur
Förderung
exakter Proteinfaltung oder an der Bildung intermolekularer Disulfidbrücken zur
Anordnung von Proteinuntereinheiten in Komplexen beteiligt sein
(Dignam und Chase, 1990). Um festzustellen, ob die trunkierte XPT-cDNA
von Sequenzen abstammte, die für
ein mit VEGF verwandtes Molekül
codieren, war es notwendig, eine viel längere cDNA zu isolieren.
-
Beispiel 2 Klonierung
von cDNA, die für
VEGF-D codiert
-
Eine
Probe der XPT-cDNA, die in dbEST beschrieben ist, wurde von der
American Type Culture Collection erhalten, einem registrierten Anbieter
von cDNA-Klonen, die vom IMAGE Consortium erhalten wurden. Die Identität der XPT-cDNA
wurde durch Nukleotidsequenzierung bestätigt, wobei die Methode der
Didesoxy-Kettentermination verwendet wurde (Sanger et al, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1977 74 5463–5467).
-
Die
XPT-cDNA wurde als Hybridisierungssonde zum Screenen einer cDNA-Genbank
von humaner Brust eingesetzt, die kommerziell von Clontech erhalten
wurde. Ein positiver Klon wurde isoliert und dieser Klon wurde anschließend auf
beiden Strängen
sequenziert. Es wurde die Nukleotidsequenz erstellt und es wurde
ein offener Leserahmen identifiziert. Die Nukleinsäuresequenz
ist in SEQ ID NO: 1 angegeben. Das Polypeptid, das von dieser Sequenz
codiert wird, wurde als VEGF-D bezeichnet, und seine abgeleitete
Aminosäuresequenz,
die als SEQ ID NO: 3 bezeichnet wird, ist in 3 angegeben.
In 3 sind putative Stellen für eine N-verknüpfte Glykosylierung mit der
Konsensussequenz N-X-S/T, wobei X eine beliebige Aminosäure ist,
durch die Kästen
angezeigt.
-
Beispiel 3 Eigenschaften
von VEGF-D
-
Die
Aminosäuresequenz
von VEGF-D wurde mit den Sequenzen von VEGF-A165,
VEGF-B, VEGF-C und PlGF verglichen. Diese Vergleiche sind entsprechend
in den 1a bis d dargestellt. Der Grad
der Sequenzhomologie wurde berechnet, und falls für Alignmentzwecke
eingeführte
Sequenzlücken
(„Gaps") nicht in die Berechnung
miteinbezogen werden, ist VEGF-D zu 31% mit VEGF identisch, zu 48%
mit VEGF-B identisch und zu 32% mit PlGF identisch. Daher war das
am engsten verwandte identifizierte Protein VEGF-C.
-
Computerrecherchen
in den Nukleinsäuredatenbanken
GenBank, EMBL und SwissPot lieferten keine Proteinsequenzen, die
zu VEGF-D identisch waren. Wie aus dem oben angegebenen Sequenzalignment
zu erwarten war, war das Protein mit der größten Verwandtschaft, das in
diesen Datenbanken zu finden war, VEGF-C. Auch dbEST wurde durchsucht, man
fand aber keine Sequenz, die die ganze codierende Region von VEGF-D
umfaßte.
Die Sequenz von VEGF-D ist mit der vom Tie-2-Liganden 1, der in
der WO 96/11269 offenbart ist, nicht verwandt.
-
Es
ist wichtig nicht außer
Acht zu lassen, daß die
einzigen nachweisbaren Homologien auf der Ebene der Aminosäuresequenz
waren. Daher wäre
es nicht möglich
gewesen, die für
VEGF-D codierende cDNA oder gDNA mit Verfahren zu isolieren wie
einer Hybridisierung bei niedriger Stringenz mit einer Nukleinsäuresequenz,
die für
ein anderes Mitglied der VEGF-Familie codiert.
-
VEGF-D
scheint von allen Mitgliedern der VEGF-Familie mit VEGF-C am engsten
verwandt zu sein. Da die VEGF-D-Aminosäuresequenz das cysteinreiche
sp185-ähnliche
Motiv umfaßt,
das bei VEGF-C zu finden ist, könnte
das erfindungsgemäße Polypeptid
im Lymphendothel eine wichtige Funktion ausüben. Obwohl wir uns nicht auf
irgendeinen vorgeschlagenen Mechanismus festlegen möchten, denken
wird, daß VEGF-C und
VEGF-D eine seideähnliche
Matrix ausbilden könnten, über die
Endothelzellen wachsen können.
Lymphgefäße haben
keine Basismembran, und so kann die seideähnliche Matrix ein einer Basismembran ähnliches Material
bilden. Dies kann eine wichtige Rolle für die Förderung von Zellwachstum und/oder
Zelldifferenzierung spielen und bei Krebs, insbesondere Metastasierung,
Medikamententherapie, Krebsprognose usw. von Bedeutung sein.
-
Beispiel 4 Biologische
Eigenschaften von VEGF-D
-
Die
cDNA-Sequenz von VEGF-D wurde verwendet, um die abgeleitete Aminosäuresequenz
von VEGF-D, die
biochemischen Eigenschaften des codierten Polypeptids, einschließlich der
Anzahl stark basischer, stark saurer, hydrophober und polarer Aminosäuren, das
Molekulargewicht, den isoelektrischen Punkt, die Ladung bei pH 7
und die Analyse der Zusammensetzung des gesamten Proteins vorherzusagen.
Diese Analyse wurde mit Hilfe des Protean-Proteinanalyseprogramms,
Version 1.20 (DATASTAR) durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen 1 und 2 zusammengefaßt. Tabelle
1 zeigt zudem die Codon Usage.
-
Tabelle 1
-
Translatierte DNA-Sequenz
von VEGF-D Contig x (1,978) mit üblichem
Genetischen Code
-
- Molekulargewicht 37056,60 Dalton
- 425 Aminosäuren
- 46 stark basische (+) Aminosäuren
(K, R)
- 41 stark saure (–)
Aminosäuren
(D, E)
- 79 hydrophobe Aminosäuren
(A, I, L, F, W, V)
- 108 polare Aminosäuren
(N, C, Q, S, T, Y)
- 7,792 Isoelektrischer Punkt
- 6,371 Ladung bei pH 7,0
- Die Gesamtanzahl translatierter Basen beträgt 978
- % A = 28,73 [281]
- % G = 23,11 [226]
- % T = 23,21 [227]
- % C = 24,95 [244]
- % unsicher = 0,00 [0]
- % A + T = 51,94 [508]
- % C + G = 48,06 [470]
Davis,
Botstein, Roth-Schmelztemperatur °C | 84,09 |
Wallace-Temperatur °C | 3384,00 |
Tabelle
1 (Fortsetzung) Contig
2: Contig-Länge: | 2379
Basen |
Durchschnittliche
Länge/Sequenz: | 354
Basen |
Gesamtlänge der
Sequenz: | 4969
Basen |
-
Tabelle
2 Vorhergesagte
Strukturklasse des gesamten Proteins: Deléage & Roux-Modifikation von Nishikawa & Ooi 1987
-
Tabelle
2 (Fortsetzung) Analyse
der Zusammensetzung des gesamten Proteins
-
-
Diese
Analyse sagt für
das unprozessierte VEGF-D-Monomer ein Molekulargewicht von 37 Kilodalton (kD)
voraus, im Vergleich zu den experimentell ermittelten Werten (für die vollständig prozessierten
Peptide) von 20 bis 27 kD für
VEGF-A-Monomere, 21 kD für
das VEGF-B-Monomer und 23 kD für
das VEGF-C-Monomer.
-
Beispiel 5
-
Die
ursprüngliche
Isolierung einer cDNA für
VEGF-D, beschrieben in Beispiel 2, umfaßte ein Hybridisierungsscreening
einer cDNA-Genbank von humaner Brust. Da so nur ein einziger cDNA-Klon
für VEGF-D isoliert
wurde, war es nicht möglich,
die Struktur der cDNA durch Vergleich mit anderen unabhängig isolierten VEGF-D-cDNAs
zu bestätigen.
Die in diesem Beispiel beschriebene Arbeit, die die Isolierung zusätzlicher
humaner VEGF-D-cDNA-Klone umfaßte,
wurde durchgeführt,
um die Struktur der humanen VEGF-D-cDNA zu bestätigen.
-
Eine
cDNA-Genbank, die kommerziell von Stratagene erhalten wurde (Katalognummer
937210) wurde für
ein Hybridisierungsscreening mit einer VEGF-D-cDNA-Sonde eingesetzt.
Die Sonde, die die Nukleotide 1817 bis 2495 der in Beispiel 2 beschriebenen
cDNA für
humanes VEGF-D umspannte, wurde durch Polymerasekettenreaktion (PCR)
erzeugt, wobei ein Plasmid eingesetzt wurde, das die VEGF-D-cDNA
als Matrize und die folgenden zwei Oligonukleotide enthielt:
-
-
Mit
dieser Sonde wurden ungefähr
zwei Millionen rekombinante Bakteriophagen aus jeder der zwei cDNA-Genbanken
gescreent. Neun humane cDNA-Klone von VEGF-D wurden anschließend isoliert.
-
Zwei
der neun humanen cDNA-Klone für
VEGF-D wurden vollständig
sequenziert, wobei die Methode der Didesoxy-Kettentermination eingesetzt
wurde (Sanger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977 74 5463–5467).
Die zwei cDNAs enthielten die gesamte für humanen VEGF-D codierende
Region und waren bis auf die Ausnahme, daß einer der Klone am 5'-Terminus fünf Nukleotide
länger
als der andere war, identisch. Die Nukleotidsequenz der kürzeren cDNA
ist in 4 gezeigt und wird als SEQ ID NO: 4 bezeichnet.
Die Aminosäuresequenz
für humanen
VEGF-D (hVEGF-D), die sich aus dieser cDNA ableitet, war 354 Reste
lang und ist in 5 gezeigt; sie wird als SEQ
ID NO: 5 bezeichnet. Die Sequenzen der 5'-Regionen der fünf anderen humanen VEGF-D-cDNA-Klone
wurden ebenfalls bestimmt. Für
jeden Klon enthielt die Sequenz, die charakterisiert wurde, mehr
als 100 DNA-Nukleotide unmittelbar stromabwärts von der Startstelle der
Translation der Codierungsregion. In allen Fällen waren die Sequenzen dieser
Regionen mit den entsprechenden Regionen der humanen VEGF-D-cDNA,
die in 4 gezeigt ist, identisch.
-
Wie
oben beschrieben, wurde die ganze Sequenz des humanen VEGF-D-cDNA-Klons,
die in diesem Beispiel beschrieben wird, durch Vergleich mit der
Sequenz eines zweiten humanen Klons bestätigt. Daneben stellte man fest,
daß die
Sequenz des 5'-Endes
der codierenden Region mit fünf
anderen humanen VEGF-D-cDNA-Klonen
identisch war. Im Gegensatz dazu enthielt die in Beispiel 2 beschriebene
Sequenz den größten Teil
der für
VEGF-D codierenden Region, war aber in der Nähe des 5'-Endes dieser Region inkorrekt. Dies
rührt wahrscheinlich
daher, daß die
VEGF-D-cDNA in der Nähe
des 5'-Endes der
codierenden Region trunkiert war und an dieser Stelle mit einer
anderen nicht identifizierten cDNA ligiert war, und dementsprechend waren
die ersten 30 Codons der wahren codierenden Sequenz für VEGF-D
deletiert und durch einen Methioninrest ersetzt. Dieser Methioninrest
wurde als N-terminale Aminosäure
der in Beispiel 2 dargestellten VEGF-D-Sequenz definiert.
-
Die
25 N-terminalen Aminosäuren
von humanem VEGF-D bilden eine extrem hydrophobe Region, was mit
der Vorstellung konsistent ist, daß ein Teil dieser Region eine
Signalsequenz zur Proteinsekretion sein könnte. 6 zeigt
das Alignment der humanen VEGF-D-Sequenz mit den Sequenzen anderer
Mitglieder der VEGF-Familie von Wachstumsfaktoren, nämlich humanem
VEGF165 (hVEGF165),
humanem VEGF-B (hVEGF-B), humanem VEGF-C (hVEGF-C) und humanem Plazentawachstumsfaktor
(hPlGF). Wenn man die Lücken
in dem Alignment zu Berechnungszwecken außer Acht läßt, stellt man fest, daß humanes
VEGF-D in der Aminosäuresequenz
zu 31% identisch mit humanem VEGF165, zu
28% identisch mit humanem VEGF-B, zu 48% identisch zu VEGF-C und
zu 32% identisch mit humanem PlGF ist. Es ist offensichtlich, daß VEGF-C dasjenige
Mitglied dieser Familie ist, das mit VEGF-D am engsten verwandt
ist.
-
Beispiel 6 Expression
von VEGF-D in COS-Zellen
-
Ein
Fragment der humanen cDNA für
VEGF-D, das sich über
die Nukleotide 1 bis 1520 der in 4 gezeigten
Sequenz erstreckt und das die ganze codierende Region enthält, wurde
in den Expressionsvektor pCDNA1-amp für Säugerzellen inseriert. Der Vektor
wurde dazu verwendet, COS-Zellen transient zu transfizieren, wobei
das DEAE-Dextran-Verfahren, wie es bereits beschrieben wurde (Aruffo
und Seed, 1987), verwendet wurde, und die resultierenden konditionierten
Zellkulturmedien, die nach 7 Tagen Inkubation gesammelt wurden,
wurden mit Hilfe von Amicon-Konzentratoren (Centricon 10 mit einem
Molekulargewichts-Cut
off von 10.000) nach Angaben des Herstellers aufkonzentriert. Die
für Transfektionen
verwendeten Plasmide waren das Expressionskonstrukt für humanen
VEGF-D und, als positive Kontrolle, ein Konstrukt, das durch Insertion
muriner VEGF-A-cDNA in pCDNA1-amp hergestellt worden war. Die konditionierten
Medien wurden in zwei verschiedenen Bioassays, wie unten beschrieben,
getestet und die Ergebnisse zeigen, daß die COS-Zellen tatsächlich biologisch
aktives VEGF-D exprimierten und sekretierten.
-
Beispiel 7 Bioassay auf
die Fähigkeit
von VEGF-D, an VEGF-Rezeptor-2 zu binden
-
Wie
in Beispiel 5 gezeigt, ist VEGF-D in der Primärstruktur eng mit anderen Mitgliedern
der VEGF-Familie
verwandt. Die meisten Mitglieder dieser Proteinfamilie sind für Endothelzellen
mitogen und/oder chemotaktisch (Keck et al 1989; Leung et al, 1989;
Joukov et al, 1996; Olofsson et al, 1996). Daneben ist VEGF-A (früher als
VEGF bekannt), das erste Mitglied der VEGF-Familie, das in der Literatur
beschrieben wurde, ein wirkungsvoller Induktor der Gefäßpermeabilität (Keck
et al, 1989). Da die Proteinstruktur eine wichtige Determinante
der Proteinfunktion ist, schien es wahrscheinlich, daß VEGF-D
auch für
Endothelzellen mitogen sein könnte
oder Gefäßpermeabilität induzieren
könnte.
Daher wurde humanes VEGF-D in einem Bioassay auf seine Fähigkeit
getestet, an den VEGF-Rezeptor-2 (VEGFR2; auch als Flk-1 bekannt)
zu binden, einen endothelzellspezifischen Rezeptor, von dem man
annimmt, daß er,
wenn er von VEGF-A aktiviert wird, ein mitogenes Signal erzeugt
(Strawn et al, 1996).
-
Ein
Bioassay zum Nachweis von Wachstumsfaktoren, die an VEGFR2 binden
wurde in der faktorabhängigen
Zelllinie Ba/F3 entwickelt und ist in unserer früheren Patentanmeldung PCT/US95/16755
beschrieben. Diese Zellen wachsen in Gegenwart von Interleukin-3
(IL-3); die Entfernung dieses Faktors führt jedoch innerhalb von 48
Stunden zum Zelltod. Wenn ein anderer zur Abgabe eines Wachstumsstimulus
fähiger
Rezeptor in die Ba/F3-Zellen transfiziert wird, kann ein Rescue
der Zellen durch den spezifischen Wachstumsfaktor erfolgen, der
diesen Rezeptor aktiviert, wenn die Zellen in Medien ohne IL-3 kultiviert
werden. Im speziellen Fall des Typs von Rezeptortyrosinkinasen (z.B.
VEGFR2) können
chimäre
Rezeptoren verwendet werden, die die extrazelluläre Domäne der Rezeptortyrosinkinase
und die cytoplasmatischen Domänen
des Erythropoietinrezeptors (EpoR) enthalten. In diesem Fall führt die
Stimulation mit dem Liganden (z.B. VEGF), der an die extrazelluläre Domäne des chimären Rezeptors
bindet, zu einer Signalgebung über
die EpoR-Cytoplasmadomäne
und zum anschließenden
Rescue der Zelllinie im Wachstumsmedium, dem IL-3 fehlt. Die Konstruktion des
chimären
Rezeptors, der bei dieser Untersuchung verwendet wird und der aus
der extrazellulären
Domäne von
murinem VEGFR2 und der Transmembran- und Cytoplasmadomäne von murinem
EpoR besteht, und der Bioassay selbst sind unten beschrieben.
-
Plasmidkonstruktion
-
i) Konstruktion eines
Plasmids zur Erzeugung chimärer
VEGFR2-Rezeptoren
-
Um
ein Plasmidkonstrukt zu erhalten, mit dem DNA, die für die extrazelluläre Domäne von murinem VEGFR2
codiert, leicht mit DNA ligiert werden kann, die für andere
Proteindomänen
codiert, wurde sequenzspezifische Mutagenese benützt, um eine BglII-Restriktionsschnittstelle
an der Stelle der murinen VEGFR2-cDNA zu erzeugen, die für die Verbindung
zwischen der extrazellulären
Domäne
und der Transmembrandomäne
codiert. Der vollständige
Klon der murinen VEGFR2-cDNA, der bei Oelrichs et al (1993) beschrieben
ist, wurde in den Expressionsvektor pCDNA1-amp für Säugerzellen subkloniert, wobei
die BstXI-Restriktionsschnittstelle verwendet wurde. Einzelsträngige UTP+-DNA
wurde mit dem M13-Replikationsursprung
erzeugt, und diese wurde als Matrize zur Erzeugung muriner VEGFR2-cDNA
verwendet, die die BglII-Schnittstelle an der gewünschten
Stelle enthielt. Das Plasmid, das die veränderte VEGFR2-cDNA enthielt,
wurde als pVEGFR2Bgl bezeichnet. DNA-Fragmente, die für die Transmembran-
und Cytoplasmadomänen
eines beliebigen Rezeptors codieren, können in die BglII-Schnittstelle
von pVEGFR2Bgl inseriert werden, um chimäre VEFGR2-Rezeptoren zu erzeugen.
-
ii) Konstruktion von chimärem VEGFR2/EpoR-Rezeptor
-
Die
murine EpoR-cDNA wurde in den Expressionsvektor pCDNA1-amp subkloniert
und einzelsträngige
DNA wurde als Matrize zur Mutagenese erzeugt. Eine BglII-Restriktionsschnittstelle
wurde an der Stelle in die EpoR-cDNA eingebaut, die für die Verbindung
zwischen der Transmembrandomäne
und der extrazellulären
Domäne
des EpoR codiert, um eine direkte Ligation dieses DNA-Fragments
mit der modifizierten cDNA, die für die extrazelluläre Domäne von VEGFR2
in pVEGFR2Bgl codiert, zu ermöglichen.
Daneben wurde eine BglII-Schnittstelle
in der Cytoplasmadomäne
von EpoR durch eine stille Substitution eines einzelnen Nukleotids
entfernt. Das DNA-Fragment, das für die Transmembran- und die
Cytoplasmadomäne
von EpoR codiert, wurde anschließend dazu verwendet, den Teil
von pVEGFR2Bgl zu ersetzen, der für die Transmembran- und Cytoplasmadomänen von
VEGFR2 codiert. So wurde ein einziger Leserahmen erzeugt, der für den chimären Rezeptor
codierte, der aus der extrazellulären Domäne von VEGFR2 und den Transmembran-
und Cytoplasmadomänen
von EpoR bestand.
-
Das
DNA-Fragment, das für
den chimären
Rezeptor codiert, wurde in den Expressionsvektor pBOS subkloniert
und in die Ba/F3-Zelllinie mit dem Plasmid pgk-neo in einem Verhältnis von
1:20 cotransfiziert. Zellen, die das VEGFR2-EpoR-Protein exprimierten,
wurden durch durchflußzytometrische
Analyse mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers gegen die extrazelluläre Domäne von VEGFR2
(MAb 4H3) selektiert. Dieser monoklonale Antikörper ist in der Australischen
Patentanmeldung PM 3794, eingereicht am 10. Februar 1994, beschrieben.
Zelllinien, die größere Mengen
VEGFR2-EpoR exprimieren, wurden selektiert, indem man die Zellen
in 5 μg/ml
MAb 4H3 oder 25 ng/ml rekombinantem VEGF wachsen ließ. Eine
Zelllinie, die große
Menge VEGFR2-EpoR exprimierte, bezeichnet als Ba/F3-NYK-EpoR, wurde
für den
Bioassay verwendet.
-
Der Bioassay
-
Die
oben beschriebenen Ba/F3-NYK-EpoR-Zellen wurden dreimal in PBS gewaschen,
um IL-3 vollständig
zu entfernen, und in einer Konzentration von 1000 Zellen pro 13,5 μl Kulturmedium
resuspendiert, und 13,5 μl
wurden in jede Vertiefung einer Terasaki-Platte mit 60 Vertiefungen
aliquotiert. Konditionierte Medien von transfizierten COS-Zellen
wurden anschließend
in den Zellkulturmedien verdünnt.
Zellen, die einen chimären
Rezeptor exprimierten, der aus der extrazellulären Domäne des Endothelzellrezeptors
Tie-2 und den Transmembran- und Cytoplasmadomänen von EpoR bestand, wurden
als nicht ansprechende Kontroll-Zelllinie verwendet. Die Zellen
wurden 48–96
Stunden lang inkubiert, wonach die Zellen, die nur in Zellkulturmedium inkubiert
wurden, gestorben waren, und das Verhältnis von Überleben/Proliferation, das
in den anderen Vertiefungen zu sehen war (d.h. in Gegenwart von
COS-Zellen-konditionierten Medien) wurde durch Auszählen der
lebensfähigen
Zellen pro Vertiefung ausgewertet.
-
Das
konditionierte Medium von den COS-Zellen, die mit Expressionsplasmiden
transient transfiziert worden waren, wurde 30fach konzentriert und
im VEGFR2-Bioassay verwendet. Konzentriertes konditioniertes Medium
von COS-Zellen, die mit pCDNA1-amp transfiziert waren, wurde als
negative Kontrolle verwendet.
-
Die
Ergebnisse sind in 7 gezeigt, wobei der Prozentsatz
an 30fach konzentriertem, COS-Zellen-konditioniertem Medium im Inkubationsmedium
(Vol/Vol) gegen die Anzahl lebensfähiger Zellen in der Vertiefung
nach 48 Stunden Inkubation aufgetragen ist. Es ist offensichtlich,
daß das
konditionierte Medium, das entweder VEGF-A oder VEGF-D enthielt,
bei diesem Test in der Lage war, das Überleben der Zellen zu fördern, was
anzeigt, daß beide
Proteine an VEGFR2 binden können
und VEGFR2 aktivieren können.
-
Beispiel 8 Test auf Gefäßpermeabilität
-
Humaner
VEGF-D, der wie in Beispiel 6 hergestellt worden war und 30fach
konzentriert war, wurde im Miles-Test auf Gefäßpermeabilität getestet
(Miles und Miles, 1952), der an betäubten Meerschweinchen (Albino/weiß, 300–400 g)
durchgeführt
wurde. Konzentriertes konditioniertes Medium für COS-Zellen, die mit pCDNA1-amp
transfiziert waren, wurde erneut als negative Kontrolle verwendet.
Die Meerschweinchen wurden mit Chloralhydrat (3,6 g/100 ml; 0,1
ml pro 10 g Körpergewicht)
betäubt.
Der Rücken
der Tiere wurden anschließend
vorsichtig mit einem Haarschneider rasiert. Den Tieren wurde eine
intrakardiale Injektion des Farbstoffs Evans Blue (0,5% in MT PBS,
0,5 ml) verabreicht, wobei eine 23G-Nadel verwendet wurde, und anschließend wurden
ihnen intradermal 100–150 μl konzentriertes
COS-Zellen-konditioniertes Medium injiziert. Nach 15–20 min
wurden die Tiere getötet
und die Hautschicht auf dem Rücken
entfernt, um die darunterliegenden Blutgefäße freizulegen. Zur Quantifizierung
wurde jeder Injektionsbereich exzidiert und in 2–5 ml Formamid auf 45°C erhitzt.
Die resultierenden Überstände, die
extravasierten Farbstoff enthielten, wurden anschließend spektrophotometrisch
bei 620 nm untersucht.
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Für Tier 1
betrug die Extinktion bei 620 nm, die sich aus der Injektion des
30fach konzentrierten mit VEGF-A konditionierten Mediums ergab,
0,178, die bei 30fach konzentriertem, mit VEGF-D konditioniertem Medium
0,114 und die bei 30fach konzentriertem Medium von Zellen, die mit
pCDNA1-amp transfiziert waren, 0,004. Für Tier 2 wurden die 30fach
konzentrierten Medien vor der intradermalen Injektion 4fach in Zellkulturmedium
verdünnt.
Die Extinktion bei 620 nm für
die mit VEGF-A konditionierte Probe betrug 0,141, die für die mit
VEGF-D konditionierte Probe 0,116, und die für eine Probe, die als negative
Kontrolle in ihrem Serumgehalt angepaßt wurde, 0,017. Die verstärkte Farbstoffextravasation,
die bei beiden Tieren in Gegenwart von VEGF-A oder VEGF-D beobachtet
wurde, zeigte, daß beide
Proteine Gefäßpermeabilität stark
induzierten.
-
Die
hier beschrieben Daten zeigen an, daß VEGF-D ein sekretiertes Protein
ist, das wie VEGF-A an VEGFR2 bindet und VEGFR2 aktiviert und Gefäßpermeabilität induzieren
kann.
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Beispiel 9 Bioaktivitäten interner
VEGF-D-Polypeptide
-
Die
abgeleitete Aminosäuresequenz
für VEGF-D
umfaßt
eine zentrale Region, die in ihrer Sequenz allen anderen Mitgliedern
der VEGF-Familie ähnelt
(ungefähr
die Reste 101 bis 196 der Aminosäuresequenz von
humanem VEGF-D, wie sie im Alignment in 6 gezeigt
ist). Daher wurde vermutet, daß sich
der bioaktive Teil des VEGF-D in der konservierten Region befindet.
Um diese Hypothese zu testen, wurde die Biosynthese von VEGF-D untersucht,
und die konservierte Region von humanem VEGF-D wurde wie unten beschrieben
in Säugerzellen
exprimiert, gereinigt und in den Bioassays getestet.
-
Plasmidkonstruktion
-
Ein
DNA-Fragment, das für
den Teil des humanen VEGF-D von Rest 93 bis 201 codiert, d.h. wo
die N- und C-terminalen
Regionen entfernt wurden, wurde durch Polymerasekettenreaktion mit
Pfu-DNA-Polymerase amplifiziert, wobei ein Plasmid als Matrize verwendet
wurde, das die vollständige
humane VEGF-D-cDNA enthielt. Das amplifizierte DNA-Fragment, dessen
Sequenz durch Nukleotidsequenzierung bestätigt worden war, wurde anschließend in
den Expressionsvektor pEFBOSSFLAG inseriert, was ein als pEFBOSVEGFDΔNΔC bezeichnetes
Plasmid lieferte. Der pEFBOSSFLAG-Vektor enthält DNA, die für die Signalsequenz
zur Proteinsekretion aus dem Interleukin-3(IL-3)-Gen und für das FLAGTM-Octapeptid codiert. Das FLAGTM-Octapeptid kann von
kommerziell erhältlichen
Antikörpern,
wie dem monoklonalen Antikörper
M2 (IBI/Kodak), erkannt werden. Das VEGF-D-PCR-Fragment wurde so
in den Vektor inseriert, daß die
IL-3-Signalsequenz unmittelbar stromaufwärts von der FLAGTM-Sequenz
lag, welche sich wiederum unmittelbar stromaufwärts zur VEGF-D-Sequenz befand.
Alle drei Sequenzen befanden sich im gleichen Leserahmen, so daß eine Translation
der mRNA, die aus der Transfektion von pEFBOSVEGFDΔNΔC in Säugerzellen
resultierte, zu einem Protein führen
sollte, das die IL-3-Signalsequenz an seinem N-Terminus haben sollte,
gefolgt von dem FLAGTM-Octapeptid und der VEGF-D-Sequenz. Abspaltung
der Signalsequenz und anschließende
Sekretion des Proteins aus der Zelle sollte zu einem VEGF-D-Polypeptid
führen,
das mit dem FLAGTM-Octapeptid, das sich
in der Nähe
vom N-Terminus befindet, markiert ist. Dieses Protein wurde als
VEGFDΔNΔC bezeichnet.
-
Daneben
wurde ein zweites Plasmid konstruiert, bezeichnet als pEFBOSVEGFDfullFLAG,
in welches die vollständige
codierende Sequenz des humanen VEGF-D inseriert wurde, so daß die Sequenz
für das FLAGTM-Octapeptid unmittelbar stromabwärts von
der und im gleichen Leserahmen wie die Codierungsequenz von VEGF-D
lag. Dem Plasmid pEFBOSIFLAG fehlt die IL-3-Signalsequenz, daher
wurde die Sekretion des VEGF-D/FLAG-Fusionsproteins durch die Signalsequenz
von VEGF-D getrieben. pEFBOSVEGFDfullFLAG wurde konstruiert, um
die Expression von vollständigem
VEGF-D, der am C-Terminus mit dem FLAGTM-Octapeptid markiert
war, in Säugerzellen
zu erlauben. Dieses Protein wird als VEGFDfullFLAG bezeichnet und
ist für
die Untersuchung der VEGF-D-Biosynthese geeignet.
-
Analyse der
post-translationalen Prozessierung von VEGF-D
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Um
zu untersuchen, ob das VEGF-D-Polypeptid zu einem reifen und vollständig aktiven
Protein prozessiert wird, wurde pEFBISVEGFDfullFLAG transient in
COS-Zellen transfiziert (Aruffo und Seed, 1987). Die Expression
in COS-Zellen mit anschließender
biosynthetischer Markierung mit 35S-Methionin/Cystein
und Immunpräzipitation
mit M2-Gel zeigte Spezies von etwa 43 kD (fA) und 25 kD (fB) (8A).
Diese Banden stimmen mit der Vorstellung überein, daß VEGF-D zu einem C-terminalen
Fragment (mit FLAGTM markiert) und einem
internen Peptid (entsprechend ungefähr dem VEGFDΔNΔC-Protein)
gespalten wird. Eine Reduktion der Immunpräzipitate (M2*) führt zu einer
gewissen Reduktion der fA-Bande, was die Möglichkeit einer Disulfidbrücke zwischen
den zwei Fragmenten anzeigt.
-
Expression
und Reinigung des internen VEGF-D-Polypeptids
-
Plasmid
pEFBOSVEGFDΔNΔC wurde dazu
verwendet, COS-Zellen transient zu transfizieren, wobei das DEAE-Dextran-Verfahren,
wie es früher
beschrieben wurde (Aruffo und Seed, 1987), eingesetzt wurde. Das
resultierende konditionierte Zellkulturmedium (ungefähr 150 ml),
das nach 7 Tagen Inkubation gesammelt wurde, wurde einer Affinitätschromatographie
unterzogen, wobei ein Harz verwendet wurde, an welches der monoklonale
Antikörper
M2 gekoppelt worden war. Kurz gesagt wurde das Medium chargenweise
etwa 4 Stunden bei 4°C über eine
1 ml M2-Antikörpersäule laufen
gelassen. Die Säule
wurde anschließend
ausgiebig mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl gewaschen, bevor
mit freiem FLAGTM-Peptid bei 25 μg/ml im gleichen Puffer
eluiert wurde. Das resultierende Material wurde in den unten beschriebenen
Bioassays verwendet.
-
Um
den gereinigten VEGFDΔNΔC nachzuweisen,
wurden die von der M2-Affinitätssäule eluierten Fraktionen
einer Western-Blot-Analyse unterzogen. Aliquots der Säulenfraktionen
wurden mit 2 × SDS-PAGE-Probenpuffer gemischt,
zum Sieden erhitzt und auf ein 15%iges SDS-Polyacrylamidgel geladen.
Die aufgetrennten Fraktionen wurden auf eine Nitrocellulosemembran überführt und
nicht spezifische Bindungsstellen durch Inkubation in Tris/NaCl/Tween
20 (TST) und 10% Magermilchpulver (BLOTTO) blockiert. Die Membranen
wurden anschließend
mit dem monoklonalen Antikörper
M2 oder dem Kontrollantikörper
mit 3 μg/ml
für 2 Stunden
bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend ausgiebig mit TST gewaschen.
Die Membranen wurden anschließend
mit einem sekundären
Ziege-anti-Maus-HRP-konjugierten
Antiserum 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend mit
TST-Puffer gewaschen. Der Nachweis der Proteinspezies erfolgte mit
einem Chemilumineszenzreagens (ECL, Amersham) (8B).
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Unter
nicht-reduzierenden Bedingungen wurde durch den M2-Antikörper eine
Molekulargewichtsspezies von etwa 23 kD (VEGFDΔNΔC) nachgewiesen. Dies stimmt
mit dem vorhergesagten Molekulargewicht für dieses interne Fragment (12.800)
plus N-verknüpfte
Glykosylierung überein;
VEGFDΔNΔC enthält zwei
potentielle N-verknüpfte
Glykosylierungsstellen. Eine Spezies von etwa 40 kD wurde ebenfalls
nachgewiesen und könnte
ein nicht-kovalentes Dimer des 23 kD-Proteins (VEGFDΔNΔC) darstellen.
-
Bioassays
-
Der
Bioassay für
die Fähigkeit
von Polypeptiden, an VEGF-Rezeptor-2 zu binden, ist ausführlich in Beispiel
7 beschrieben. Aliquots von Fraktionen, die aus der M2-Affinitätssäule eluiert
worden waren und die das VEGFDΔNΔC-Protein
enthielten, wurden in Medium verdünnt und im VEGFR2-Bioassay
wie zuvor beschrieben getestet. Fraktion #3 von der Affinitätssäule, welche
nachweislich das gereinigte VEGFDΔNΔC- Protein enthielt
(8B), zeigt eine deutliche Fähigkeit, die Proliferation
der Zelllinie des Bioassays bis zu einer Verdünnung von 1/100 der gereinigten
Fraktion zu induzieren (9). Im Vergleich dazu zeigte
das Porenvolumen der Affinitätssäule (Fraktion
#1) keine Aktivität,
wohingegen das ursprünglich
mit VEGFDΔNΔC konditionierte
Medium eine nur schwache Aktivität
aufwies.
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Der
Test auf Gefäßpermeabilität (Miles
und Miles, 1952) ist kurz in Beispiel 8 beschrieben. Aliquots von
gereinigtem VEGFDΔNΔC und Proben
des Porenvolumens der M2-Affinitätssäule (negative
Kontrolle) wurden mit Medium vermischt und intradermal in die Haut
von Meerschweinchen injiziert. Die Hautbereiche an den Injektionsstellen
wurden exzidiert und extravasierter Farbstoff wurde eluiert. Die
Extinktion des extravasierten Farbstoffs bei 620 nm, die sich aus
der Injektion von gereinigtem VEGFDΔNΔC ergab, lag bei 0,131 ± 0,009.
Im Vergleich dazu liegt der Extinktionswert, der sich bei der Injektion
einer Probe des Porenvolumens ergibt, bei 0,092 ± 0,020. Daher induzierte
VEGFDΔNΔC Gefäßpermeabilität, aber
der Effekt war nur marginal.
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Aufgrund
seiner Fähigkeit,
an VEGFR2 zu binden, und seiner im Vergleich zu vollständigem VEGF-D geringeren
Induktion von Gefäßpermeabilität kann man
von VEGFDΔNΔC sagen,
daß er
die Induktion von Gefäßpermeabilität durch
VEGF-D durch kompetitive Inhibierung relativ erniedrigt. In diesem
Sinne könnte
man vermuten, daß das
VEGFDΔNΔC-Fragment,
was die Induktion der Gefäßpermeabilität betrifft,
ein Antagonist für
VEGF-D ist.
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Zusammenfassung
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Zwei
Faktoren haben dazu geführt,
daß wir
die internen Fragmente von VEGF-D auf verstärkte Aktivität untersuchten.
Erstens ist es die zentrale Region von VEGF-D, die eine Aminosäurehomologie
mit allen anderen Mitgliedern der VEGF-Familie zeigt. Und zweitens
erfolgt eine proteolytische Prozessierung, durch welche interne
bioaktive Polypeptide erzeugt werden, bei anderen Wachstumsfaktoren,
wie beispielsweise PDGF-BB, auf. Daneben war die Aktivität, die bei
dem vollständigen
VEGF-D-Protein in COS-Zellen zu sehen war, geringer als beim entsprechend
konditionierten Medium von mit VEGF-A transfizierten COS-Zellen.
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Es
wurde vorhergesagt, daß die
reife VEGF-D-Sequenz von einem Fragment stammen sollte, das in den
Resten 92–205
erhalten ist, wobei eine Spaltung an FAA^TFY und IIRR^SIQI erfolgt.
Eine Immunpräzipitationsanalyse
des in COS-Zellen exprimierten VEGF-DfullFLAG erzeugte Spezies,
die mit der internen proteolytischen Spaltung des VEGF-D-Polypeptids
an diesen Stellen mit konsistent waren. Daher wurde eine trunkierte
Form von VEGF-D, bei der die N- und C-terminalen Regionen entfernt
waren (VEGFDΔNΔC) hergestellt und
in COS-Zellen exprimiert. Dieses Protein wurde identifiziert und
mit Hilfe des Antikörpers
M2 gereinigt. Das VEGFDΔNΔC-Protein
wurde auch mit dem A2-Antikörper
nachgewiesen, welcher ein Peptid innerhalb des Fragments von 92–205 von
VEGF-D erkennt (nicht gezeigt). VEGFDΔNΔC wurde mit dem VEGFR2-Bioassay und
dem Test zur Gefäßpermeabilität von Miles
geprüft
und es wurde gezeigt, daß er
bei einem Bioassay, der zum Nachweis der Vernetzung der extrazellulären Domäne von VEGFR2
entwickelt worden war, an den VEGFR2-Rezeptor bindet und diesen
aktiviert. Die Induktion der Gefäßpermeabilität durch
dieses Polypeptid war bei einem Miles-Test bestenfalls marginal
und im Gegensatz zu dem Effekt von VEGF-A.
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Beispiel 10 VEGF-D bindet
und aktiviert VEGFR-3
-
Die
humane VEGF-D-cDNA wurde zur Produktion von rekombinantem VEGF-D
in Baculovirus-Shuttlevektoren
kloniert. Neben den baculoviralen Shuttlevektoren, die die nicht-modifizierte
VEGF-D-cDNA enthielten (als "vollständiger VEGF-D" bezeichnet), wurden
zwei baculovirale Shuttlevektoren zusammengebaut, bei denen die
VEGF-D-cDNA auf folgende Weise modifiziert war.
-
Bei
einem Konstrukt (als "vollständiger VEGF-D-H6" bezeichnet)
wurde ein C-terminales Histidin-Tag angefügt. Bei dem anderen Konstrukt
wurden die putativen N- und C-terminalen Propeptide entfernt, das
Melittin-Signalpeptid wurde in-frame an den N-Terminus fusioniert,
und an den C-Terminus der verbleibenden Domäne mit VEGF-Homologie wurde
ein Histidin-Tag angefügt
(als "ΔNΔC-MELsp-VEGF-D-H6" bezeichnet).
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Für jedes
der drei Konstrukte wurden baculovirale Klone aus zwei oder drei
unabhängigen
Transfektionen amplifiziert. Der Überstand von High Five-(HF)Zellen
wurde 48 h nach Infektion mit hochtitrigem Virus geerntet. Der Überstand
wurde mit NaOH auf pH 7 eingestellt und mit einem Volumen D-MEM verdünnt (0,2% FCS).
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Die
Proben wurden auf ihre Fähigkeit
getestet, die Tyrosinphosphorylierung von VEGFR-3 (Flt4-Rezeptor) in NIH3T3-Zellen
zu stimulieren, wie es bei Joukov et al, 1996, beschrieben ist.
Der Überstand
nicht-infizierter
Zellen und der Überstand
von Zellen, die mit der kurzen Spleißvariante von VEGF-C infiziert
waren, die die Tyrosinphosphorylierung von VEGFR3 nicht stimuliert,
wurden als negative Kontrollen verwendet. VEGF-C, der auf gleiche
Weise wie ΔNΔC-melSP-VEGF-D-H6 modifiziert worden war, wurde als positive
Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt.
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Das
Auftreten neuer Banden bei 125 und 195 kD zeigt die Phosphorylierung
und somit die Aktivierung des Rezeptors an.
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Beispiel 11 VEGF-D bindet
und aktiviert VEGFR-2
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Modifizierte
und nicht-modifizierte VEGF-D-cDNA wurde zur Produktion von rekombinantem
VEGF-D, wie in Beispiel 10 beschrieben, in Baculovirus-Shuttlevektoren
kloniert.
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Für jedes
der drei Konstrukte, vollständiger
VEGF-D, vollständiger
VEGF-D-H6 und ΔNΔC-melSP-VEGF-D-H6, wurden
Baculovirus-Klone aus zwei oder drei unabhängigen Transfektionen amplifiziert.
Der Überstand
von High Five-(HF)Zellen wurde 48 h Stunden nach Infektion mit hochtitrigem
Virus geerntet. Der Überstand
wurde mit NaOH auf pH 7 eingestellt und mit einem Volumen D-MEM
(0,2% FCS) verdünnt.
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Die Überstände, die
mit den mit Histidin markierten Proteinen konditioniert waren, wurden
gemäß Joukov
et al, 1996, auf ihre Fähigkeit
getestet, die Tyrosinphosphorylierung des KDR-Rezeptors zu stimulieren. KDR
ist das humane Homologe von flk1(VEGFR-2).
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Der Überstand
nicht-infizierter Zellen und der Überstand von Zellen, die mit
der VEGF-C-156 S-Mutante,
die KDR nicht stimuliert, infiziert waren, wurden als negative Kontrollen
verwendet. VEGF165 und VEGF-C, die in gleicher
Weise wie ΔNΔC-melSP-VEGF-D-H6 modifiziert waren, wurden als positive
Kontrollen verwendet. Die Ergebnisse sind in 11 gezeigt.
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Das
Auftreten einer neuen Bande bei etwa 210 kD zeigt Phosphorylierung
und somit Aktivierung des Rezeptors an.
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Beispiel 12 Analyse der
VEGF-D-Genexpression
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Um
das Muster der VEGF-D-Genexpression in Menschen- und Mäuseembryos
zu charakterisieren, wurden VEGF-D-cDNAs als Hybridisierungssonden
zur Northern-Blot-Analyse polyadenylierter humaner RNA und zur in
situ-Hybridisierungsanalyse mit Mäuseembryos verwendet.
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Genexpression
im adulten Menschen
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Ein
1,1 kb-Fragment der humanen VEGF-D-cDNA, die in 4 gezeigt
ist (SEQ ID NO: 4) und von der EcoRV-Schnittstelle bis zum 3'-Terminus (Nukleotide
911 bis 2029) reicht, wurde mit [α-32P]dATP markiert, wobei das Megaprime-DNA-Markierungssystem
(Amersham) nach den Angaben des Herstellers verwendet wurde. Diese
Sonde wurde dazu verwendet, um durch Hybridisierung humane „Multiple
Tissue Northern Blots" (Clontech)
zu screenen, wobei man sich ebenfalls an die Angaben des Herstellers
hielt. Diese Blots enthielten polyadenylierte RNA, die aus Geweben
adulter Menschen, die offensichtlich an keiner Erkrankung litten,
erhalten wurde. Eine Autoradiographie mit den markierten Blots zeigte,
daß die
VEGF-D-mRNA am häufigsten im
Herzen, in der Lunge und im Skelettmuskel vorkam. Die VEGF-D-mRNA
war in mittleren Mengen in Milz, Ovarien, Dünndarm und Kolon und in geringen
Mengen in Niere, Pankreas, Thymus, Prostata und Hoden zu finden.
Keine VEGF-D-mRNA wurde in RNA aus Hirn, Plazenta, Leber oder peripheren
Blutleukozyten nachgewiesen. In den meisten Geweben, in denen VEGF-D-mRNA
nachgewiesen wurde, hatte das Transkript eine Größe von 2,3 kb. Die einzige
Ausnahme bildete der Skelettmuskel, wo zwei VEGF-D-Transkripte mit
2,3 kb und 2,8 kb nachgewiesen wurden. Im Skelettmuskel kam das
2,3 kb-Transkript häufiger
vor als das 2,8 kb-Transkript.
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Zusammenfassung
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Das
VEGF-D-Gen wird im adulten Menschen weitverbreitet exprimiert, wird
aber sicherlich nicht ubiquitär
exprimiert. Die stärkste
Expression wurde im Herzen, in der Lunge und im Skelettmuskel nachgewiesen. Diese
Daten legen nahe, daß VEGF-D
bei der Entwicklung der Lunge eine Rolle spielen könnte und
daß die Expression
des VEGF-D-Gens in der Lunge bei einem adulten Menschen bestehen
bleibt. Die Expression des Gens in anderen Geweben beim adulten
Menschen legt nahe, daß VEGF-D
in anderen adulten Geweben andere Funktionen erfüllen könnte.
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Beispiel 13 VEGF-D ist
für Endothelzellen
mitogen
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Einige
Mitglieder der VEGF-Familie von Proteinen, nämlich VEGF-A (Leung et al,
1989) und VEGF-B (Oloffson et al, 1996) sind für Endothelzellen mitogen. Um
die mitogene Fähigkeit
von VEGFDΔNΔC auf Endothelzellen
zu testen, wurde dieses Protein wie in Beispiel 9 beschrieben exprimiert
und durch Affinitätschromatographie
gereinigt. Fraktion #3, die aus der M2-Affinitätssäule eluiert wurde und VEGFDΔNΔC enthielt, wurde
1 zu 10 in Zellkulturmedium verdünnt,
das 5% Serum enthielt, und auf Endothelzellen der Rinderaorta (BAEs)
appliziert, die in Medium mit 10% Serum vermehrt worden waren. Die
BAEs wurden am Tag vor Zugabe von VEGFDΔNΔC in Platten mit 24 Vertiefungen
mit einer Dichte von 10.000 Zellen pro Vertiefung ausgesät und 3
Tage nach der Zugabe dieses Polypeptids wurden die Zellen mit Trypsin
abgelöst
und ausgezählt.
Gereinigtes VEGF-A diente bei diesem Experiment als positive Kontrolle.
Die Ergebnisse sind in 12 gezeigt. Die Zugabe von Fraktion
#3 zum Zellkulturmedium führte
zu einem 2,4fachen Anstieg bei der Zahl der BAEs nach 3 Tagen Inkubation,
ein Ergebnis, das sich mit dem Ergebnis vergleichen lässt, das
mit VEGF-A erhalten wurde. Offensichtlich ist VEGFDΔNΔC für Endothelzellen
mitogen.
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Beispiel 14 Lokalisierung
des VEGF-D-Gens auf humanen Chromosomen
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Um
Hybridisierungssonden zur Lokalisierung des VEGF-D-Gens auf humanen
Chromosomen zu erzeugen, wurde ein humaner genomischer DNA-Klon
für VEGF-D
aus einer humanen genomischen DNA-Genbank (Clontech) isoliert. Die genomische
Genbank wurde durch Hybridisierung mit der in 4 gezeigten
humanen VEGF-D-cDNA mit Standardverfahren (Sambrook et al, 1989)
gescreent. Durch Hybridisierung an verschiedene Oligonukleotide,
die sich in ihrer Sequenz von der humanen VEGF-D-cDNA ableiteten,
wurde gezeigt, daß einer
der auf diese Weise isolierten Klone einen Teil des VEGF-D-Gens
enthielt. Eine Region des genomischen Klons, ungefähr 13 kb
groß,
wurde aus Agarosegel gereinigt, durch Nick-Translation mit Biotin-14-dATP markiert
und in situ bei einer Endkonzentration von 20 ng/μl an Metaphasen
von zwei normalen humanen Männern
hybridisiert. Die Methode der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungs-(FISH)
wurde im Unterschied zu dem bereits beschriebenen Verfahren (Callen
et al, 1990) so modifiziert, daß die
Chromosomen vor der Analyse mit Propidiumiodid (als Kontrastfärbung) und
DAPI (zur Identifizierung der Chromosomen) gefärbt wurden. Bilder der Metaphasepräparate wurden
mit einer gekühlten
CCD-Kamera aufgenommen, wobei die CytoVision Ultra-Bildersammlung
und das Verstärkungssystem
(Applied Imaging Int. Ltd.) verwendet wurden. FISH-Signale und die
DAPI-Bandenmuster wurden für
die Analyse zusammengeführt.
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Fünfzehn Metaphasen
vom ersten normalen Mann wurden auf Fluoreszenzsignale untersucht.
Zehn der Metaphasen zeigten ein Signal auf einem Chromatid (3 Zellen)
oder beiden Chromatiden (7 Zellen) des X-Chromosoms in Bande p22.1.
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Bei
diesen 15 Metaphasen wurden insgesamt 9 unspezifische Backgroundsignale
beobachtet. Ein ähnliches
Ergebnis wurde bei der Hybridisierung der Sonde an 15 Metaphasen
des zweiten normalen Mannes erhalten, wo ein Signal bei Xp22.1 auf
einem Chromatid in 7 Zellen und auf beiden Chromatiden in 4 Zellen beobachtet
wurde. Schlußfolgernd
läßt sich
sagen, daß das
humane VEGF-D-Gen auf dem X-Chromosom in Bande p22.1 lokalisiert
ist.
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Bioassays
zur Bestimmung der Funktion von VEGF-D
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Andere
Tests werden durchgeführt,
um nachzuweisen, ob VEGF-D bezüglich
Endothelzellfunktion, Angiogenese und Wundheilung ähnliche
Aktivität
wie VEGF aufweist. Abhängig
von den Ergebnisse der Untersuchungen zur Verteilung der Rezeptorbindung
können
noch weitere Tests durchgeführt
werden.
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I. Tests der Endothelzellfunktion
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a) Endothelzellproliferation
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Tests
des Endothelzellenwachstums werden mit im Stand der Technik allgemein
bekannten Verfahren durchgeführt,
z.B. denjenigen von Ferrara & Henzel
(1989), Gospodarowicz et al (1989) und/oder Claffey et al, Biochim.
Biophys. Acta, 1995, 1246 1–9.
-
b) Zelladhäsionstest
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Die
Wirkung von VEGF-D auf die Adhäsion
polymorphkerniger Granulozyten an Endothelzellen wird getestet.
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c) Chemotaxis
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Der
Standardtest auf Chemotaxis mit der Boyden-Kammer wird verwendet,
um die Wirkung von VEGF-D
auf die Chemotaxis zu testen.
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d) Plasminogenaktivatortest
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Endothelzellen
werden nach der Methode von Pepper et al (1991) auf die Wirkung
von VEGF-D auf die Produktion von Plasminogenaktivator und Plasminogenaktivator-Inhibitor
gestestet.
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e) Test der Endothelzellenmigration
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Die
Fähigkeit
von VEGF-D, Endothelzellen zur Migration und zur Röhren-Bildung
zu stimulieren, wird wie bei Montesano et al (1986) beschrieben
getestet. Alternativ dazu kann der bei Joukov et al (1986) beschriebene
dreidimensionale Collagengel-Test oder eine mit Gelatine überzogene
Membran in einer modifizierten Boyden-Kammer (Glaser et al, 1980)
verwendet werden.
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II Angiogenesetest
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Die
Fähigkeit
von VEGF-D, eine angiogene Antwort in der Chorioallantoismembran
von Küken
zu induzieren, wird wie bei Leung et al (1989) beschrieben getestet.
Alternativ dazu kann der Ratten-Corneatest von Rastinejad et al
(1989) verwendet werden; dies ist ein anerkanntes Verfahren zum
Test von in vivo-Angiogenese,
und die Ergebnisse sind leicht auf andere in vivo-Systeme übertragbar.
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III Wundheilung
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Die
Fähigkeit
von VEGF-D, die Wundheilung zu stimulieren, wird mit dem klinisch
relevantesten zur Verfügung
stehenden Modell getestet, wie es bei Schilling et al (1959) beschrieben
und von Hunt et al (1967) eingesetzt wird.
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IV Das Hämatopoietische
System
-
Eine
Vielzahl von in vitro- und in vivo-Tests, welche spezifische Zellpopulationen
des hämatopoietischen
Systems verwenden, sind im Stand der Technik bekannt und unten dargelegt.
Insbesondere sind zahlreiche in vitro-Tests mit murinen Stammzellen
besonders geeignet, bei denen Zellen verwendet werden, die im fluoreszenzaktivierten
Zellsortierer gereinigt wurden.
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a) Neu besiedelnde Stammzellen
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Dies
sind Zellen, die in der Lage sind, das Knochenmark letal bestrahlter
Mäuse neu
zu besiedeln und die den Lin–, Rhh1,
Ly-6A/E+, c-kit+-Phänotyp aufweisen.
VEGF-D wird auf diesen Zellen entweder allein oder durch Co-Inkubation
mit anderen Faktoren und anschließende Messung der Zellproliferation
durch Einbau von 3H-Thymidin getestet.
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b) Stammzellen im späten Stadium
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Dies
sind Zellen, die eine vergleichsweise geringe Fähigkeit besitzen, das Knochenmark
neu zu besiedeln, die aber D13-CFU-S bilden können. Diese Zellen zeigen den
Lin–,
Rhh1, Ly-6A/E+,
c-kit+-Phänotyp. VEGF-D wird eine bestimmte
Zeit mit diesen Zellen inkubiert, letal bestrahlten Rezipienten
injiziert, und es wird die Anzahl von D13-Milz-Kolonien ausgezählt.
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c) Progenitor-angereicherte
Zellen
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Dies
sind Zellen, die in vitro auf einzelne Wachstumsfaktoren ansprechen
und den Lin–,
Rhh1, Ly-6A-E+, c-kit+-Phänotyp
aufweisen. Dieser Test zeigt, ob VEGF-D direkt auf hämatopoietische
Progenitorzellen wirken kann. VEGF-D wird mit diesen Zellen in Agarkulturen
inkubiert und die Anzahl an Kolonien nach 7–14 Tagen wird ausgezählt.
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V Arteriosklerose
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Glatte
Muskelzellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung
oder Initiation von Arteriosklerose, bei der ein Phänotypwechsel
von einem kontraktilen in einen synthetischen Zustand erforderlich
ist. Makrophagen, Endothelzellen, T-Lymphozyten und Blutplättchen spielen
alle eine Rolle bei der Entwicklung von arteriosklerotischen Plaques,
indem sie das Wachstum und die phänotypischen Modulationen glatter
Muskelzellen beeinflussen. Ein in vitro-Test mit einer modifizierten
Rose-Kammer, in der verschiedene Zelltypen auf gegenüberliegenden
Coverslips angesät
werden, mißt
die Proliferationsgeschwindigkeit und die phänotypischen Modulationen glatter
Muskelzellen in einer multizellulären Umgebung und wird dazu
verwendet, die Wirkung von VEGF-D auf glatte Muskelzellen festzustellen.
-
VI Metastasierung
-
Die
Fähigkeit
von VEGF-D, Metastasierung zu inhibieren, wird mit Hilfe des Lewis-Modells
eines Lungenkarzinoms, beispielsweise mit dem Verfahren von Cao
et al (1995), untersucht.
-
VII VEGF-D
in anderen Zelltypen
-
Die
Wirkungen von VEGF-D auf die Proliferation, Differenzierung und
Funktion anderer Zelltypen, wie beispielsweise Leberzellen, Herzmuskelzellen
und anderen Zellen, endokrine Zellen und Osteoblasten, kann leicht
mit im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie beispielsweise
der Aufnahme von 3H-Thymidin durch in vitro-Kulturen,
untersucht werden. Die Expression von VEGF-D in diesen und anderen
Geweben kann mit Methoden wie Northern Blot und Hybridisierung oder
durch in situ-Hybridisierung, gemessen werden.
-
VIII Konstruktion
von VEGF-D-Varianten und -Analogen
-
VEGF-D
ist ein Mitglied der PDGF-Familie von Wachstumsfaktoren, der einen
hohen Grad an Homologie mit den anderen Mitgliedern der PDGF-Familie
aufweist. VEGF-D enthält
acht konservierte Cysteinreste, die für diese Familie von Wachstumsfaktoren
charakteristisch sind. Diese konservierten Cysteinreste bilden Disulfidbrücken innerhalb
der Ketten, wodurch die Cysteinknoten-Struktur entsteht, und Disulfidbrücken zwischen
den Ketten, wodurch Proteindimere entstehen, die für Mitglieder
der PDGF-Familie von Wachstumsfaktoren charakteristisch sind. VEGF-D
wird mit den Rezeptoren der Proteintyrosinkinase-Wachstumsfaktoren in Wechselwirkung
treten.
-
Im
Gegensatz zu Proteinen, bei denen man wenig oder nichts über die
Proteinstruktur und die aktiven Zentren weiß, die für die Rezeptorbindung und die
daraus folgende Aktivität
benötigt
werden, wird die Konstruktion aktiver Mutanten von VEGF-D dadurch
stark erleichtert, daß sehr
viel über
die aktiven Zentren und die wichtigen Aminosäuren der Mitglieder der PDGF-Familie
von Wachstumsfaktoren bekannt ist.
-
Veröffentlichte
Artikel, die die Zusammenhänge
zwischen Struktur/Aktivität
der Mitglieder der PDGF-Familie
von Wachstumsfaktoren beinhalten, umfassen für PDGF: Oestman et al, J. Biol.
Chem., 1991 266 10073–10077;
Andersson et al, J. Biol. Chem., 1992 267 11260–11266; Oefner et al, EMBO
J., 1992 11 3921–3926;
Flemming et al, Molecular and Cell Biol., 1993 13 4066–4076 und
Andersson et al, Growth Factors, 1995 12 159–164; und für VEGF: Kim et al, Growth Factors,
1992, 7 53–64;
Pötgens
et al, J. Biol. Chem., 1994 269 32879–32885 und Claffey et al, Biochem,
Biophys. Acta, 1995 1246 1–9.
Aus diesen Veröffentlichungen
geht hervor, daß die
Mitglieder der PDGF-Familie von Wachstumsfaktoren wegen der acht
konservierten Cysteinreste eine charakteristisch geknotete Faltstruktur
und Dimerisierung aufweisen, was zur Bildung drei exponierter Loop-Regionen
an jedem Ende des dimerisierten Moleküls führt, von denen zu erwarten
ist, daß dort
die Rezeptorbindungsstellen lokalisiert sind.
-
Ausgehend
von diesen Informationen kann ein Fachmann aus dem Bereich der Biotechnologie VEGF-D-Mutanten konstruieren,
die mit einer sehr hohen Wahrscheinlichkeit die VEGF-D-Aktivität behalten, indem
er die acht Cysteinreste, die für
die geknotete Faltstruktur und für
die Dimerisierung verantwortlich sind, konserviert, und indem er
auch die wahrscheinlichen Rezeptorsequenzen in den Loop 1-, Loop
2- und Loop 3-Regionen
der Proteinstruktur konserviert oder dort nur konservative Aminosäuresubstitutionen
vornimmt.
-
Die
Bildung erwünschter
Mutationen an spezifisch gezielten Stellen in einer Proteinstruktur
ist als Standardmethode im Arsenal der Proteinchemiker anzusehen
(Kunkel et al, Methods in Enzymol., 1987 154 367–382). Beispiele einer solchen
sequenzspezifischen Mutagenese mit VEGF sind bei Pötgens et
al, J. Biol. Chem., 1994 269 32879–32885 und Claffey et al, Biochim.
Biophys. Acta, 1995 1246 1–9
zu finden. Eine sequenzspezifische Mutagenese ist in der Tat so
allgemein üblich,
daß es
kommerziell erhältliche
Kits gibt, die solche Verfahren erleichtern (z.B. Promega-Katalog
1994–1995,
Seiten 142–145).
-
Die
Aktivität
auf die Endothelzellproliferation von VEGF-D-Mutanten kann leicht
mit allgemein etablierten Screening-Verfahren festgestellt werden.
Beispielsweise kann ein Verfahren verwendet werden, das zu dem Endothelzellmitosetest,
der bei Claffey et al (Biochim. Biophys. Acta, 1995 1246 1–9) beschrieben
ist, analog ist. In ähnlicher
Weise können
die Wirkungen von VEGF-D auf die Proliferation anderer Zelltypen,
auf die Zelldifferenzierung und auf humane Metastasierung mit Verfahren,
die im Stand der Technik gut bekannt sind, getestet werden.
-
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