DE69931178T2

DE69931178T2 - Ein dem vaskularen endothelen wachstumsfaktor verwandtes protein aus orf virus nz10 bindet und aktiviert den säuger vegf rezeptor-2

Info

Publication number: DE69931178T2
Application number: DE69931178T
Authority: DE
Inventors: M. Lyn WISE; A. Andrew MERCER; J. Loreen SAVORY; B. Stephen FLEMING; Angiogenesis Lab. Steven A. Parkville STACKER
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; University of Otago; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; University of Otago; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Priority date: 1998-11-02
Filing date: 1999-11-02
Publication date: 2007-02-22
Also published as: WO2000025805A1; JP2003517275A; US20030211101A1; AU1605300A; NZ511119A; EP1126863A4; EP1126863A1; DE69931178D1; DE69931178T8; ATE324902T1; WO2000025805A8; US6541008B1; EP1126863B1; AU775956B2

Description

Die Erfindung betrifft virale, vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren ähnliche Proteine, die an den VEGF-Rezeptor-2 von Säugern binden und diesen aktivieren und so Gefäßpermeabilität von Endothelzellen induzieren, und sie betrifft insbesondere pharmazeutische und diagnostische Zusammensetzungen und Verfahren, die den Faktor verwenden oder sich von diesem ableiten.
Hintergrund der Erfindung
Während der Entwicklung eines Embryos wird das primäre Gefäßnetz durch in situ-Differenzierung von Mesodermzellen in einem Vaskulogenese genannten Prozess etabliert. Es wird vermutet, dass alle nachfolgenden Prozesse, die die Entstehung neuer Gefäße im Embryo und die Neovaskularisation bei Erwachsenen umfassen, von der Sprossung oder Teilung neuer Kapillaren aus der bereits bestehenden Vaskulatur in einem Angiogenese genannten Prozess gesteuert werden (Pepper et al., Enzyme & Protein, 49: 138–162, 1996; Breier et al., Dev. Dyn., 204: 228–239, 1995; Risau, Nature, 386: 671–674, 1997). Angiogenese ist nicht nur an der embryonalen Entwicklung und dem normalem Wachstum, der normalen Reparatur und der normalen Regeneration von Gewebe beteiligt, sondern auch am weiblichen Reproduktionszyklus, an der Etablierung und am Erhalt einer Schwangerschaft und an der Heilung von Wunden und Brüchen. Neben der bei einem normalen Individuum stattfindenden Angiogenese, sind Angiogenesevorgänge an vielen pathologischen Prozessen beteiligt, insbesondere an Tumorwachstum und Metastasierung, und an anderen Zuständen, bei denen eine erhöhte Blutgefäßproliferation, insbesondere des mikrovaskulären Systems, vorliegt, beispielsweise bei diabetischer Retinopathie, Psoriasis und Arthropathien. Eine Inhibierung der Angiogenese ist nützlich, um diese pathologischen Prozesse zu verhindern oder zu lindern.
Andererseits ist die Förderung von Angiogenese in Situationen erwünscht, in denen die Vaskularisation etabliert oder ausgeweitet werden soll, beispielsweise nach Gewebe- oder Organtransplantationen, oder um die Etablierung des Kollateralkreislaufs bei Gewebeinfarkt oder Arterienstenose, beispielsweise bei koronarer Herzerkrankung und Thrombangiitis obliterans, zu stimulieren.
Der Angiogeneseprozess ist hochkomplex und umfasst die Erhaltung der Endothelzellen im Zellzyklus, den Abbau der extrazellulären Matrix, die Migration und Invasion in das umliegende Gewebe und schließlich Kanalbildung. Die molekularen Mechanismen, die dem komplexen Angiogeneseprozess zugrunde liegen, sind noch weitgehend unverstanden.
Wegen der entscheidenden Rolle der Angiogenese bei vielen physiologischen und pathologischen Prozessen wurden Faktoren, die an der Kontrolle der Angiogenese beteiligt sind, intensiv untersucht. Von einer Reihe von Wachstumsfaktoren wurde gezeigt, dass sie an der Regulation der Angiogenese beteiligt sind; diese umfassen Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGF), Plättchenwachstumsfaktor (Platelet-Derived Growth Factor, PDGF), transformierenden Wachstumsfaktor alpha (TGFα) und Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF). Für einen Überblick siehe beispielsweise Folkman et al., J. Biol. Chem., 267: 10931–10934, 1992.
Es wurde vermutet, dass in erster Linie eine bestimmte Familie endothelzellspezifischer Wachstumsfaktoren, die vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF) und ihre entsprechende Rezeptoren, für die Stimulierung von Endothelzellwachstum und -differenzierung und für bestimmte Funktionen der differenzierten Zellen verantwortlich sind. Diese Faktoren sind Mitglieder der PDGF-Familie und scheinen vorwiegend über endotheliale Rezeptortyrosinkinasen (RTK) zu wirken.
Neun verschiedene Proteine wurden in der PDGF-Familie identifiziert, nämlich zwei PDGF (A und B), VEGF und sechs Mitglieder, die mit VEGF eng verwandt sind. Die sechs eng mit VEGF verwandten Mitglieder sind: VEGF-B, beschrieben in der Internationalen Patentanmeldung PCT/US96/02957 (WO 96/26736) und in den US-Patenten 5,840,693 und 5,607,918 von Ludwig Institute for Cancer Research und The Universität of Helsinki; VEGF-C, beschrieben bei Joukov et al., EMBO J., 15: 290–298, 1996 und Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 1988–1992, 1996; VEGF-D, beschrieben in der Internationalen Patentanmeldung PCT/US97/14696 (WO 98/07832) und Achen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 548–553, 1998; der Plazentawachstumsfaktor (PlGF), beschrieben bei Maglione et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9267–9271, 1991; VEGF2, beschrieben in der Internationalen Patentanmeldung PCT/US94/05291 (WO 95/24473) von Human Genome Sciences, Inc.; und VEGF3, beschrieben in der Internationalen Patentanmeldung PCT/US95/07283 (WO 96/39421) von Human Genome Sciences, Inc. Jedes VEGF-Familienmitglied besitzt zwischen 30% und 45% Aminosäuresequenzidentität mit VEGF. Die VEGF-Familienmitglieder teilen eine VEGF-Homologiedomäne, die sechs Cysteinresten enthält, die das Cysteinknotenmotiv bilden. Funktionelle Eigenschaften der VEGF-Familie beinhalten unterschiedlich hohe Mitogenität für Endothelzellen, Induktion von Gefäßpermeabilität sowie angiogene und lymphangiogene Eigenschaften.
Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) ist ein homodimeres Glycoprotein, das aus verschiedenen Quellen isoliert wurde. VEGF zeigt hochspezifische mitogene Aktivität für Endothelzellen. VEGF hat wichtige regulatorische Funktionen bei der Bildung neuer Blutgefäße bei der embryonalen Vaskulogenese und bei der Angiogenese im Leben eines Erwachsenen (Carmeliet et al., Nature, 380: 435–439, 1996; Ferrara et al., Nature, 380: 439–442, 1996; Übersichtsartikel von Ferrara und Davis-Smyth, Endocrine Rev., 18: 4–25, 1997). Die Bedeutung der Rolle von VEGF wurde mit Untersuchungen gezeigt, die zeigen, dass die Inaktivierung eines einzigen VEGF-Allels aufgrund fehlerhafter Entwicklung des Gefäßsystems zum Absterben des Embryos führt (Carmeliet et al., Nature, 380: 435–439, 1996; Ferrara et al., Nature, 380: 439–442, 1996). Ferner hat VEGF eine starke chemoattraktive Wirkung auf Monozyten, kann Plasminogenaktivator und Plasminogenaktivatorinhibitor in Endothelzellen induzieren und kann ferner mikrovaskuläre Permeabilität induzieren. Wegen letztgenannter Aktivität wird er manchmal auch als vaskulärer Permeabilitätsfaktor (VPF) bezeichnet. Die Isolierung und die Eigenschaften von VEGF wurden in Übersichtsartikeln beschrieben; siehe Ferrara et al., J. Cellular Biochem., 47: 211–218; 1991 und Connolly, J. Cellular Biochem., 47: 219–223, 1991. Alteratives Spleissen von mRNA eines einzigen VEGF-Gens liefert fünf Isoformen von VEGF.
VEGF-B besitzt ähnliche angiogene und andere Eigenschaften wie VEGF, ist aber im Gewebe anders verteilt und wird anders exprimiert als VEGF. VEGF-B wird insbesondere im Herzen sehr stark und in der Lunge nur schwach exprimiert, während für VEGF das Gegenteil der Fall ist. Dies lässt vermuten, dass VEGF und VEGF-B trotz der Tatsache, dass sie in vielen Geweben co-exprimiert werden, viele verschiedene funktionelle Unterschiede aufweisen.
VEGF-B wurde mit einer Hefe-Cohybrid-Interaction-Trap-Screeningmethode isoliert, indem auf zelluläre Proteine gescreent wurde, die mit zellulärem Retinsäure-Bindungsprotein Typ I (CRABP-I) in Wechselwirkung treten können. Seine Isolierung und seine Eigenschaften sind in der PCT/US96/02957 und bei Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 2576–2581, 1996 ausführlich beschrieben.
VEGF-C wurde aus konditionierten Medien der PC-3-Prostataadenokarzinomzelllinie (CRL1435) isoliert, indem auf die Fähigkeit des Mediums gescreent wurde, eine Tyrosinphosphorylierung der endothelzellspezifischen Rezeptortyrosinkinase VEGFR-3 (Flt 4) herbeizuführen, wobei Zellen verwendet wurden, die so transfiziert waren, dass sie VEGFR-3 exprimierten. VEGF-C wurde mittels Affinitätschromatographie mit rekombinantem VEGFR-3 aufgereinigt und aus einer PC-3-cDNA-Bank kloniert. Seine Isolierung und seine Eigenschaften sind bei Joukov et al., EMBO J., 51: 290–298, 1996 ausführlich beschrieben.
VEGF-D wurde aus einer cDNA-Bank von humaner Brust, die kommerziell bei Clontech zu erhalten ist, durch Screenen mit einem Expressed Sequence Tag, das aus einer humanen cDNA-Bank mit der Bezeichnung „Soares Breast 3NbHBst" erhalten wurde, als Hybridisierungssonde isoliert (Achen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 548–553, 1998). Seine Isolierung und seine Eigenschaften sind in der Internationalen Patentanmeldung PCT/US97/14696 (WO 98/07832) ausführlich beschrieben.
Das VEGF-D-Gen wird beim erwachsenen Menschen breit exprimiert, aber sicherlich nicht ubiquitär. VEGF-D wird im Herz, in der Lunge und im Skelettmuskel stark exprimiert. VEGF-D wird in der Milz, den Eierstöcken, im Dünndarm und im Kolon mittelstark und in der Niere, im Pankreas, im Thymus, in der Prostata und in den Hoden schwach exprimiert. In RNA aus Hirn, Plazenta, Leber oder peripheren Blutleukozyten wurde keine VEGF-D-mRNA nachgewiesen.
PlGF wurde aus einer cDNA-Bank aus Plazenta nach termingerechter Geburt isoliert. Seine Isolierung und seine Eigenschaften sind bei Maglione et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9267–9271, 1991 ausführlich beschrieben. Seine biologische Funktion wird zurzeit noch nicht voll verstanden.
VEGF2 wurde aus einer hochtumorigen, östrogenunabhängigen humanen Brustkrebszelllinie isoliert. Obwohl von diesem Molekül eine 22%-ige Homologie zu PlGF und ein 30%-ige Homologie zu VEGF behauptet wird, ist das Verfahren zur Isolierung des für VEGF2 codierenden Gens unklar und es wird keine Charakterisierung der biologischen Aktivität offenbart.
VEGF3 wurde aus einer aus Kolongewebe stammenden cDNA-Bank isoliert. VEGF3 besitzt vermutlich 36% Identität und 66% Ähnlichkeit mit VEGF. Das Verfahren zur Isolierung des für VEGF3 codierenden Gens ist unklar und es wird keine Charakterisierung der biologischen Aktivität offenbart.
Ähnlichkeit zwischen zwei Proteinen wird durch Vergleich der Aminosäuresequenz und der konservativen Aminosäuresubstitutionen eines der beiden Proteine mit der Sequenz des zweiten Proteins bestimmt, wohingegen Identität ohne Einbeziehen der konservativen Aminosäuresubstitutionen bestimmt wird.
PDGF/VEGF-Familienmitglieder fungieren in erster Linie über Bindung an Rezeptortyrosinkinasen. Fünf endothelzellspezifische Rezeptortyrosinkinasen wurden identifiziert, nämlich VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR/Flk-1), VEGFR-3 (Flt4), Tie und Tek/Tie-2. Alle besitzen die zur Signaltransduktion notwendige intrinsische Tyrosinkinaseaktivität. Die wesentliche, spezifische Rolle von VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, Tie und Tek/Tie-2 bei Vaskulogenese und Angiogenese wurde durch gezielte Mutationen gezeigt, die diese Rezeptoren bei Mäuseembryos inaktivieren.
Die einzigen Rezeptortyrosinkinasen, die bekanntermaßen an VEGF binden, sind VEGFR-1, VEGFR-2 und VEGFR-3. VEGFR-1 und VEGFR-2 binden VEGF mit hoher Affinität und VEGFR-1 bindet auch VEGF-B und PlGF. Es wurde gezeigt, dass VEGF-C der Ligand für VEGFR-3 ist und auch VEGFR-2 aktiviert (Joukov et al., The EMBO Journal, 15: 290–298, 1996). VEGF-D bindet sowohl an VEGFR-2 als auch an VEGFR-3. Ein Ligand für Tek/Tie-2 wurde in der Internationalen Patentanmeldung PCT/US95/12935 (WO 96/11269) von Regeneron Pharmaceuticals, Inc. beschrieben. Der Ligand für Tie wurde noch nicht identifiziert.
Vor kurzem wurde ein neuer, für eine VEGF-Isoform spezifischer Rezeptor von 130–135 kDa gereinigt und kloniert (Soker et al., Cell, 92: 735–745, 1998). Es zeigte sich, dass der VEGF-Rezeptor die VEGF₁₆₅-Isoform spezifisch über die von Exon 7 codierte Sequenz bindet, die eine schwache Affinität für Heparin zeigt (Soker et al., Cell, 92: 735–745, 1998). Überraschenderweise zeigte sich, dass der Rezeptor mit humanem Neuropilin-1 (NP-1), einem Rezeptor, der an der frühen Neuromorphogenese beteiligt ist, identisch ist. PlGF-2 scheint auch mit NP-1 in Wechselwirkung zu treten (Migdal et al., J. Biol. Chem., 273: 22272–22278, 1998).
VEGFR-1, VEGFR-2 und VEGFR-3 werden von Endothelzellen unterschiedlich exprimiert. Sowohl VEGFR-1 als auch VEGFR-2 werden im Endothel von Blutgefäßen exprimiert (Oelrichs et al., Oncogene, 8: 11–18, 1992; Kaipainen et al., J. Exp. Med., 178: 2077–2088, 1993; Dumont et al., Dev. Dyn., 203: 80–92, 1995; Fong et al., Dev. Dyn., 207: 1–10, 1996) und VEGFR-3 wird hauptsächlich im Lymphendothel adulter Gewebe exprimiert (Kaipainen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9: 3566–3570, 1995). VEGFR-3 wird auch in den Blutgefäßen, die Tumore umgeben, exprimiert.
Eine Zerstörung der VEGFR-Gene resultiert in einer aberranten Entwicklung des Gefäßsystems, was zum Absterben des Embryos gegen Mitte der Schwangerschaft herum führt. Eine Analyse von Embryos, die ein vollständig inaktiviertes VEGFR-1-Gen tragen, lässt vermuten, dass dieser Rezeptor zur funktionellen Organisation des Endothels benötigt wird (Fong et al., Nature, 376: 66–70, 1995). Jedoch erzeugt eine Deletion der intrazellulären Tyrosinkinase-Domäne von VEGFR-1 lebensfähige Mäuse mit einem normalen Gefäßsystem (Hiratsuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 95: 9349–9354, 1998). Die Gründe für diese Unterschiede müssen noch geklärt werden, es ist jedoch zu vermuten, dass eine Signalgebung des Rezeptors über die Tyrosinkinase für eine korrekte Funktion von VEGFR-1 nicht erforderlich ist. Eine Analyse homozygoter Mäuse mit inaktivierten VEGFR-2-Allelen legt nahe, dass dieser Rezeptor zur Endothelzellproliferation, Hämatopoiese und Vaskulogenese benötigt wird (Shalaby et al., Nature, 376: 62–66, 1995; Shalaby et al., Cell, 89: 981–990, 1997). Aufgrund anomaler Organisation der großen Gefäße führt eine Inaktivierung von VEGFR-3 zu einem Herz-Kreislauf-Versagen (Dumont et al., Science, 282: 946–949, 1998).
Obwohl VEGFR-1 hauptsächlich während der Entwicklung in Endothelzellen exprimiert wird, ist er auch während den frühen Embryogenesestadien in hämatopoietischen Vorläuferzellen zu finden (Fong et al., Nature, 376: 66–70, 1995). Bei Erwachsenen exprimieren auch Monozyten und Makrophagen diesen Rezeptor (Barleon et al., Blood, 87: 3336–3343, 1995). Bei Embryos wird VEGFR-1 von den meisten, wenn auch nicht allen Gefäßen exprimiert (Breier et al., Dev. Dyn., 204: 228–239, 1995; Fong et al., Dev. Dyn., 207: 1–10, 1996).
Während der frühen Embryonalentwicklung wird der VEGFR-3-Rezeptor stark auf Endothelzellen exprimiert, mit fortschreitender Embryogenese wird dies jedoch auf das Venenendothel und später auf das Lymphendothel beschränkt (Kaipainen et al., Cancer Res., 54: 6571–6577, 1994; Kaipainen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 3566–3570, 1995). In adulten Geweben wird VEGFR-3 in Lymphendothelzellen exprimiert. Dieser Rezeptor ist für die Gefäßentwicklung während der Embryogenese wesentlich.
Eine gezielte Inaktivierung beider Kopien des VEGFR-3-Gens in Mäusen resultierte in fehlerhafter Blutgefäßbildung, die durch anormal organisierte große Gefäße mit defekten Lumina gekennzeichnet ist, was zu Flüssigkeitsakkumulation in der Perikardhöhle und zu Herz-Kreislauf-Versagen an Tag 9,5 postkoital führt. Auf Basis dieser Erkenntnisse wurde vorgeschlagen, dass VEGFR-3 für die Reifung primärer Gefäßnetze zu größeren Blutgefäßen erforderlich ist. Die Rolle von VEGFR-3 bei der Entwicklung der Lymphgefäße konnte bei diesen Mäusen jedoch nicht untersucht werden, da die Embryos vor der Entstehung des Lymphsystems starben. Angesichts seiner spezifischen Expression in Endothelzellen während der Embryogenese und im Erwachsenenleben nimmt man nichtsdestotrotz an, dass VEGFR-3 eine Rolle bei der Entwicklung der Lymphgefäße und bei der Lymphangiogenese spielt. Dies wird von der Beobachtung gestützt, dass eine ektopische Expression von VEGF-C, einem Liganden für VEGFR-3, in der Haut transgener Mäuse zu Lymphendothelzellproliferation und zu Gefäßvergrößerung in der Dermis führte. Dies lässt zudem vermuten, dass VEGF-C eine Primärfunktion im Lymphendothel und eine Sekundärfunktion bei Angiogenese und Permeabilitätsregulation besitzen könnte, die mit VEGF geteilt wird (Joukov et al., EMBO J., 15: 290–298, 1996).
Es wurde gezeigt, dass einige Inhibitoren des Systems VEGF/VEGF-Rezeptor Tumorwachstum über einen anti-angiogenen Mechanismus verhindern; siehe Kim et al., Nature, 362: 841–844, 1993 und Saleh et al., Cancer Res., 56: 393–401, 1996.
Daneben wurden VEGF-ähnliche Proteine identifiziert, die von vier verschiedenen Stämmen des ORF-Virus codiert werden. Dies ist der erste Virus, von dem berichtet wird, dass er für ein VEGF-ähnliches Protein codiert. Die ersten beiden Stämme sind NZ2 und NZ7 und sie sind bei Lyttle et al., J. Virol., 68: 84–92, 1994 beschrieben. Ein dritter ist D1701 und ist bei Meyer et al., The EMBO Journal, 18: 363–374, 1999 beschrieben. Der vierte Stamm ist NZ10 und er wird hierin beschrieben. Diese Proteine zeigen Aminosäuresequenzähnlichkeit zu VEGF und zu einander.
Das ORF-Virus ist eine Speziesart aus der Gattung der Parapoxviren, die eine hochansteckende pustuläre Dermatitis bei Schafen und Ziegen verursacht und leicht auf Menschen übertragen werden kann. Die Kennzeichen einer durch ORF-Virus-Infektion induzierten pustulären Dermatitis sind Dilatation der Blutgefäße, Anschwellen der lokalen Umgebung und merkliche Proliferation von Endothelzellen, die die Blutgefäße auskleiden. Diese Merkmale findet man bei allen mit ORF infizierten Spezies, und aufgrund der Virusreplikation in Epidermiszellen können sie zur Ausbildung eines tumorartigen Wachstums oder zur Bildung von Knötchen führen. In der Regel verschwinden ORF-Virus-Infektionen innerhalb von ein paar Wochen, bei immungeschwächten Individuen sind jedoch schwere Infektionen zu beobachten, die nicht ohne chirurgischen Eingriff verschwinden. Die Feststellung, dass die ORF-Virusstämme NZ2 und NZ7 für Moleküle mit VEGF-ähnlichen Sequenzen codieren, wirft die wichtige Frage auf, ob diese Proteine an VEGF-Rezeptoren von Säugern binden und charakteristische VEGF-ähnliche Wirkungen wie Mitogenese von Endothelzellen und Gefäßpermeabilität induzieren können.
Zusammenfassung der Erfindung
Der Erfindung liegt die Entdeckung zugrunde, dass ein virales, VEGF-ähnliches Protein aus dem ORF-Virus-Stamm NZ10 an die extrazelluläre Domäne des VEGF-Rezeptor-2 binden kann, so dass bioaktive Komplexe gebildet werden, die nützliche zelluläre Reaktionen vermitteln und/oder unerwünschte biologische Aktivitäten antagonisieren. Die Erfindung stellt allgemein Verfahren bereit, die diese biologischen Aktivitäten stimulieren oder inhibieren, Verfahren für therapeutische Anwendungen und zum Auffinden von Antagonisten von NZ10.
Gemäß einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes und gereinigtes Nukleinsäuremolekül bereit, das eine Polynukleotidsequenz mit wenigstens 95% Identität zu wenigstens der in 10 gezeigten Sequenz (SEQ ID: 10) umfasst und das für ein neues Polypeptid, das ORFV10-VEGF (im Folgenden NZ10) genannt wird und eine Strukturhomologie zu VEGF und NZ2 besitzt, codiert. Dieser Aspekt der Erfindung umfasst auch DNA-Moleküle mit einer solchen Sequenz, dass sie unter stringenten Bedingungen mit wenigstens Nukleotiden der in 10 (SEQ ID NO: 10) angegebenen Sequenz oder Fragmenten davon, hybridisieren.
Gemäß einem zweiten Aspekt besitzt das erfindungsgemäße Polypeptid die Fähigkeit, Endothelzellproliferation zu stimulieren und es umfasst eine Sequenz an Aminosäuren mit der in 11 angegebenen Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 11).
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Stimulation von Endothelzellproliferation, -differenzierung, -migration oder -überleben oder mehreren davon bereit, indem sie NZ10 oder einem Fragment oder Analogon davon, das die Fähigkeit dazu besitzt, ausgesetzt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Aktivierung von VEGF-Rezeptor-2 bereit, das den Schritt des Aussetzens der Zellen, die diesen Rezeptor tragen, gegen eine wirksame, den Rezeptor aktivierende Menge von NZ10 oder einem Fragment oder Analogon davon, das die Fähigkeit dazu besitzt, umfasst.
Da sowohl ORFV2-VEGF als auch NZ10 spezifisch den VEGF-Rezeptor-2 aktivieren, kann ORFV2-VEGF dazu verwendet werden, Endothelzellproliferation in einer Situation zu stimulieren, in der VEGF-Rezeptor 1 nicht aktiviert ist. Daher stellt die Erfindung ein Verfahren zur spezifischen Aktivierung von VEGF-Rezeptor-2 bereit, wenn VEGF-Rezeptor-1 nicht aktiviert ist.
Diese Fähigkeiten werden hier als „biologische Aktivitäten von NZ10" bezeichnet und können leicht mit im Stand der Technik gebräuchlichen Verfahren, beispielsweise dem in Beispiel 5 beschriebenen Mitogenitätstest, getestet werden. NZ10 besitzt insbesondere die Fähigkeit, Endothelzellproliferation oder -differenzierung, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Proliferation oder Differenzierung vaskulärer und/oder lymphatischer Endothelzellen zu stimulieren.
Besonders bevorzugt besitzt NZ10 die in 10 angegebene Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 11).
In einem weiteren bevorzugten Aspekt stellt die Erfindung Polpeptide bereit, die die charakteristische Aminosäuresequenz besitzen:
Pro-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys (SEQ ID NO: 11), die für die Mitglieder der PDGF/VEGF-Familie von Wachstumsfaktoren charakteristisch ist.
Der Begriff „NZ10", wie er hier verwendet wird, bezeichnet allgemein das Polypeptid mit der in 11 angegebenen Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 11) sowie Fragmente davon mit der biologischen Aktivität des Polypeptids mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 11, beispielsweise aus natürlichen Isolaten des ORF-Virus, welche die biologische Aktivität von NZ10 haben, wie sie hier definiert ist. Der Fachmann erkennt, dass es einen beachtlichen Spielraum für Aminosäuresequenzänderungen gibt, die natürlich auftreten oder durch gentechnische Veränderung entstehen können, ohne dass die biologische Aktivität des Polypeptids beeinträchtigt wird. Vorzugsweise sind die varianten Polypeptide zu wenigstens 95% mit der Aminosäuresequenz der 11 (SEQ ID NO: 11) identisch. Die prozentuale Sequenzidentität wird mit herkömmlichen Verfahren bestimmt. Siehe beispielsweise Altschul et al., Bull. Math. Bio., 48: 603–616, 1986 und Henikoff und Henikoff Proc. Natl. Acad., Sci. USA, 89: 10915–10919, 1992.
Solche varianten Formen von NZ10 können hergestellt werden, indem man nicht-essentielle Bereiche des NZ10-Polypeptids als Ziel für Modifikationen aussucht. Andere variante Formen können auf natürliche Weise von verwandten ORF-Virusstämmen produziert werden. Es ist zu erwarten, dass diese nicht-essentiellen Bereiche nicht in die hochkonservierten Bereiche fallen, die in 1 angegeben sind. Insbesondere sind die Wachstumsfaktoren der PDGF-Familie, einschließlich VEGF, dimer, und VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, ORFV2-VEGF, PlGF, PDGF-A und PDGF-B weisen vollständige Konservierung von acht Cysteinresten in den N-terminalen Domänen, d.h. den PDGF-ähnlichen Domänen, auf (Olofsson et al., 1996; Joukov et al., 1996). Es wird angenommen, dass diese Cysteine an intra- und intermolekularen Disulfidbrücken beteiligt sind. Außerdem gibt es weitere stark, aber nicht vollständig konservierte Cysteinreste in den C-terminalen Domänen. Loops 1, 2 und 3 jeder Untereinheit, die durch intramolekulare Disulfidbrücken gebildet werden, sind an der Bindung an Rezeptoren für die PDGF/VEGF-Familie von Wachstumsfaktoren beteiligt (Andersson et al., Growth Factors, 12: 159–164, 1995). Wie hier gezeigt, sind die Cysteine, die in bereits bekannten Mitgliedern der VEGF-Familie konserviert sind, auch in ORFV2-VEGF konserviert.
Ein Fachmann ist sich darüber im Klaren, dass diese Cysteinreste in jeder vorgeschlagenen varianten Form erhalten bleiben sollten und dass die aktiven Zentren, die in den Loops 1, 2 und 3 auftreten, ebenfalls erhalten bleiben sollten. Von anderen Bereichen des Moleküls ist zu erwarten, dass sie für die biologische Funktion von geringerer Bedeutung sind und dass sie daher geeignete Ziele für eine Modifikation bieten. Modifizierte Polypeptide können leicht mit Hilfe üblicher Aktivitätstests wie Zellproliferationstests auf ihre Fähigkeit getestet werden, die biologische Aktivität von ORFV2-VEGF zu zeigen.
Es wird in Betracht gezogen, dass einige modifizierte NZ10-Polypeptide die Fähigkeit besitzen werden, an Endothelzellen, z.B. an VEGF-Rezeptor-2, zu binden, aber nicht in der Lage sein werden, Endothelzellproliferation, -differenzierung, -migration oder -überleben zu stimulieren. Es ist zu erwarten, dass diese modifizierten Polypeptide dazu fähig sind, als kompetitive oder nicht-kompetitive Inhibitoren von NZ10-Polypeptiden und Wachstumsfaktoren der PDGF/VEGF-Familie zu fungieren und dass sie sich für Situationen eignen, in denen es wünschenswert ist, die Wirkung von ORFV2-VEGF- oder NZ10-Polypeptid oder von der PDGF/VEGF-Wachstumsfaktorfamilie zu verhindern oder zu reduzieren. Solche Rezeptor bindenden, aber nicht mitogenen, keine Differenzierung induzierenden, keine Migration induzierenden, keine Motilität induzierenden, kein Überleben fördernden, keine Entwicklung von Bindegewebe fördernden, keine Wundheilung oder keine Gefäßproliferation induzierenden Varianten des ORFV2-VEGF oder NZ10-Polypeptids werden hier als „Rezeptor bindende, aber ansonsten inaktive Variante" bezeichnet. Da ORFV2-VEGF oder NZ10 ein Dimer bildet, um seinen einzigen bekannten Rezeptor zu aktivieren, wird in Betracht gezogen, dass ein Monomer das Rezeptor bindende aber ansonsten inaktive variante modifizierte ORFV2-VEGF- oder NZ10-Polypeptid und ein zweites Monomer ein Wildtyp-ORFV2-VEGF oder NZ-10 oder einen Wildtyp-Wachstumsfaktor der PDGF/VEGF-Familie umfasst. Diese Dimere können an ihren entsprechenden Rezeptor binden, aber stromabwärts keine Signalgebung induzieren.
Es kommt auch in Betracht, dass es andere modifizierte NZ10-Polypeptide gibt, die die Bindung eines Wildtyp-NZ10 oder eines Wildtyp-Wachstumsfaktors der PDGF/VEGF-Familie an dessen entsprechenden Rezeptor auf Endothelzellen verhindern können. Daher werden diese Dimere nicht in der Lage sein, Endothelzellproliferation, -dfferenzierung, -migration oder -überleben zu stimulieren. Es ist zu erwarten, dass diese modifizierten Polypeptide dazu fähig sind, als kompetitive oder nicht-kompetitive Inhibitoren von NZ10-Polypeptiden und Wachstumsfaktoren der PDGF/VEGF-Familie zu fungieren und dass sie sich für Situationen eignen, in denen es wünschenswert ist, die Wirkung von ORFV2-VEGF- oder NZ10-Polypeptid oder von der PDGF/VEGF-Wachstumsfaktorfamilie zu verhindern oder zu reduzieren. Solche Situationen umfassen das Remodelling von Gewebe, das bei der Invasion von Tumorzellen in eine normale Zellpopulation durch Bildung von primären Tumoren oder metastatischen Tumoren stattfindet. Solche Varianten des NZ10-Polypeptids, die ORFV2-VEGF oder NZ10 oder Wachstumsfaktoren der PDGF/VEGF-Familie binden, aber nicht mitogen sind, keine Differenzierung induzieren, keine Migration induzieren, keine Motilität induzieren, das Überleben nicht verbessern, kein Bindegewebe fördern, keine Wundheilung oder keine Gefäßproliferation induzieren, werden hier als „NZ10-Polypeptiddimer bildende, aber ansonsten inaktive oder interferierende Varianten" bezeichnet.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist daher ein NZ10-Antagonist, wobei der Antagonist ein isoliertes Polypeptid ist, das eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 85% Identität zu der Aminosäuresequenz der 11 (SEQ ID NO: 11) umfasst und die Fähigkeit besitzt, an NZ10 zu binden und die biologische Aktivität von NZ10 zu verhindern.
Wie oben angegeben, verursacht das ORF-Virus bekanntermaßen eine pustuläre Dermatitis bei Schafen, Ziegen und Menschen. Die Läsionen, die nach der Infektion mit dem ORF-Virus induziert werden, zeigen eine extensive Proliferation von Gefäßendothelzellen, Dilatation von Blutgefäßen und Hautschwellungen. Die Expression eines zur Angiogenesestimulation fähigen ORF-Virus-Gens kann eine Erklärung für diese histologischen Befunde liefern.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt dementsprechend die Verwendung eines NZ10-Antagonisten, wie er hier definiert ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von pustulärer Dermatitis bereit.
Wenn NZ10 oder ein NZ10-Antagonist zu therapeutischen Zwecken verwendet werden sollen, hängen Dosis und Verabreichungsweg von dem zu behandelnden Zustand ab und liegen im Ermessen des behandelnden Arztes oder Tierarztes. Geeignete Verabreichungswege umfassen subcutane, intramuskuläre, intraperitoneale oder intravenöse Injektion, topische Applikation, Implantate usw. Topische Applikation von NZ10 kann in analoger Weise wie bei VEGF erfolgen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäße DNA oder ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül umfassen, sowie Wirtszellen, die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen oder Vektoren transformiert oder transfiziert sind, bereit. Die Vektoren umfassen auch eine Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen mit der Sequenz der 10 hybridisiert. Diese Zellen sind besonders zur Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids geeignet und sie umfassen Insektenzellen wie Sf9-Zellen, die bei der American Type Culture Collection (ATCC SRL-171) erhältlich sind und mit einem Baculovirusvektor transformiert sind, und die humane Embryo-Nierenzelllinie 293 EBNA, die mit einem geeigneten Expressionsplasmid transfiziert ist. Bevorzugte Vektoren der Erfindung sind Expressionsvektoren, in denen eine erfindungsgemäße Nukleinsäure funktionsfähig mit einem oder mehreren geeigneten Promotoren und/oder anderen Kontrollsequenzen verknüpft ist, so dass geeignete Wirtszellen, die mit den Vektoren transformiert oder transfiziert sind, zur Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids fähig sind. Andere bevorzugte Vektoren sind solche, die zur Transfektion von Säugerzellen oder für gentherapeutische Zwecke geeignet sind, wie beispielsweise adenovirale Vaccinia- oder auf Retroviren basierende Vektoren oder Liposome. Eine Vielzahl entsprechender Vektoren ist im Stand der Technik bekannt.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Vektors bereit, der in der Lage ist, ein von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure codiertes Polypeptid zu exprimieren, wobei das Verfahren den Schritt des funktionsfähigen Verknüpfens der Nukleinsäure mit einem oder mehreren geeigneten Promotoren und/oder anderen Kontrollsequenzen umfasst, wie oben angegeben ist.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids bereit, das die Schritte des Exprimierens einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder eines erfindungsgemäßen Vektors in einer Wirtszelle und das Isolieren des Polypeptids aus der Wirtszelle oder aus dem Kulturmedium der Wirtszelle umfasst.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen Antikörper bereit, der spezifisch mit NZ10 reagiert. Dieser Aspekt der Erfindung umfasst Antikörper, die spezifisch für die oben genannten varianten Formen, Fragmente und Analoga von NZ10 sind. Der Begriff „Analogon" oder „funktionelles Analogon" bezeichnet eine modifiziere Form von NZ10, in der wenigstens eine Aminosäuresubstitution vorgenommen wurde, so dass das Analogon im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das nicht-modifizierte NZ10 in vivo und/oder in vitro behält. Solche Antikörper sind als Inhibitoren oder Agonisten von NZ10 und als diagnostische Mittel zum Nachweis und zur Quantifizierung von NZ10 nützlich. Es können polyklonale oder monoklonale Antikörper verwendet werden. Monoklonale und polyklonale Antikörper können mit Hilfe im Stand der Technik gebräuchlicher Standardverfahren gegen erfindungsgemäße Polypeptide gerichtet werden. Für manche Zwecke, beispielsweise, wenn ein monoklonaler Antikörper klinisch eingesetzt werden soll, um die Wirkung von NZ10 zu inhibieren, kann der Einsatz humanisierter oder chimärer monoklonaler Antikörper erwünscht sein. Zudem kann das Polypeptid an Epitop-Tag, beispielsweise das FLAG^®-Octapeptid (Sigma, St. Louis, MO) gebunden werden, um eine Affinitätsreinigung zu erleichtern. Für manche Zwecke, beispielsweise, wenn der monoklonale Antikörper klinisch eingesetzt werden soll, um die Wirkung von PDGF-C zu inhibieren, kann der Einsatz humanisierter oder chimärer monoklonaler Antikörper erwünscht sein. Solche Antikörper können ferner durch Zugabe cytotoxischer oder cytostatischer Medikamente modifiziert sein. Verfahren zu deren Herstellung, einschließlich rekombinanter DNA-Verfahren, sind im Stand der Technik auch allgemein bekannt.
Erfindungsgemäße Polypeptide oder Antikörper können mit einem nachweisbaren Marker markiert sein und für diagnostische Zwecke eingesetzt werden. In ähnlicher Weise kann das so markierte Polypeptid der Erfindung dazu verwendet werden, seinen entsprechenden Rezeptor in situ zu identifizieren. Zur Bildgebung kann das Polypeptid oder der Antikörper kovalent oder nicht-kovalent an ein geeignetes supermagnetisches, paramagnetisches, elektronendichtes, echogenes oder radioaktives Mittel gekoppelt werden. Zur Verwendung in diagnostischen Tests können radioaktive oder nicht-radioaktive Marker verwendet werden. Beispiele für radioaktive Marker umfassen ein radioaktives Atom oder eine radioaktive Gruppe, wie ¹²⁵I oder ³²P. Beispiele für nicht-radioaktive Marker umfassen Enzymmarker, beispielsweise Meerrettich-Peroxidase, oder fluorimetrische Marker, beispielsweise Fluorescein-5-isothiocyanat (FITC). Die Markierung kann direkt oder indirekt, kovalent oder nicht-kovalent erfolgen.
Klinische Applikationen der Erfindungen umfassen diagnostische Applikationen, Beschleunigung von Angiogenese bei Wundheilung, Gewebe- oder Organtransplantationen oder Etablierung des Kollateralkreislaufs bei Gewebeinfarkt oder Arterienstenose, beispielsweise bei koronarer Herzerkrankung, und Inhibierung von Angiogenese bei der Behandlung von Krebs oder diabetischer Retinopathie.
Umgekehrt könnten NZ10-Antagonisten (z.B. Antikörper und/oder Inhibitoren) zur Behandlung von Zuständen, beispielsweise kongestive Herzinsuffizienz, verwendet werden, bei denen es aufgrund eines Anstiegs der Gefäßpermeabilität zu einer Flüssigkeitsakkumulation, beispielsweise in der Lunge, kommt, indem sie eine ausgleichende Wirkung auf die Gefäßpermeabilität ausüben, um der Flüssigkeitsakkumulation entgegenzuwirken. ORFV2-VEGF-Applikationen könnten infolge seiner die Blutzirkulation und Gefäßpermeabilität erhöhenden Aktivität dazu verwendet werden, Malabsorptionssyndrome im Verdauungstrakt zu behandeln.
Die Erfindung sieht daher die Ansprüche 32 bis 36 vor.
Der Antagonist kann jedes Mittel sein, das die Wirkung von NZ10 verhindert, indem es entweder die Bindung von NZ10 an seinen entsprechenden Rezeptor oder die Zielzelle verhindert, oder indem es die Aktivierung des Überträgers des Signals vom Rezeptor zu dessen zellulärem Wirkort verhindert. Geeignete Antagonisten umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, gegen NZ10 gerichtete Antikörper; und Antisense-Nukleotidsequenzen, die zu wenigstens einem Teil der für NZ10 codierenden DNA-Sequenz komplementär sind.
Es wird auch ein Verfahren zum Nachweis von NZ10 in einer biologischen Probe bereitgestellt, das den Schritt des In-Kontakt-Bringens der Probe mit einem zur Bindung von ORFV2-VEGF fähigen Reagenz und den Nachweis der Bindung umfasst. Vorzugsweise ist das zur Bindung von NZ10 fähige Reagenz ein gegen NZ10 gerichteter Antikörper, besonders bevorzugt ein monoklonaler Antikörper. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Bindung und/oder das Ausmaß der Bindung mit Hilfe eines nachweisbaren Markers nachgewiesen; geeignete Marker sind oben erörtert.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Mittel zur Diagnose, üblicherweise in Form von Testkits, bereit. In einer Ausführungsform der Erfindung wird beispielsweise ein diagnostisches Testkit bereitgestellt, das einen Antikörper gegen NZ10 und Mittel zum Nachweis, und besonders bevorzugt zur Abschätzung, der Bindung zwischen dem Antikörper und NZ10 umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Mittel zur Diagnose ist entweder der Antikörper oder NZ10 mit einem nachweisbaren Marker markiert und entweder der Antikörper oder NZ10 an ein Substrat gebunden, so dass die Wechselwirkung zwischen NZ10 und Antikörper durch Bestimmung der Markermenge ermittelt werden kann, die infolge der Bindung zwischen dem Antikörper und dem NZ10 an das Substrat gebunden hat. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können die Mittel zur Diagnose in Form eines üblichen ELISA-Kits bereitgestellt werden.
Es wird ein Verfahren zur Bestimmung von Mitteln beschrieben, die an NZ10 binden. Das Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen von NZ10 mit einem Testmittel und das Monitoring der Bindung mit Hilfe beliebiger geeigneter Mittel. Mittel können sowohl Verbindungen als auch andere Proteine umfassen.
Hier wird ein Screeningsystem zum Auffinden von Mitteln beschrieben, die NZ10 binden. Das Screeningsystem umfasst die Herstellung von NZ10, die Exposition von NZ10 gegenüber einem Testmittel und die Quantifizierung der Bindung dieses Mittels an NZ10 mit Hilfe beliebiger geeigneter Maßnahmen.
Die Verwendung dieses Screeningsystems stellt ein Mittel zur Bestimmung von Verbindungen bereit, die die biologische Funktion von NZ10 verändern können. Dieses Screeningverfahren kann für automatisierte Verfahren in großem Maßstab ausgelegt werden, beispielsweise ein PANDEX^®-System (Baxter-Dade Diagnostics), was ein effizientes Screening nach möglichen Therapeutika mit hohem Durchsatz ermöglicht.
Für dieses Screeningsystem wird NZ10 wie hier beschrieben, vorzugsweise mit rekombinanter DNA-Technologie, hergestellt. Ein Testmittel, z.B. eine Verbindung oder ein Protein, wird in ein NZ10 enthaltendes Reaktionsgefäß eingebracht. Die Bindung des Testmittels an NZ10 wird mit beliebigen geeigneten Mitteln bestimmt, welche radioaktives oder chemisches Markieren des Testmittels umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind. Die Bindung von NZ10 kann auch mit einem im U.S. Patent 5,585,277 offenbarten Verfahren durchgeführt werden. Bei diesem Verfahren wird die Bindung des Testmittels an NZ10 durch Monitoring des Verhältnisses von gefaltetem Protein zu ungefaltetem Protein bestimmt. Beispiele für dieses Monitoring können, ohne darauf beschränkt zu sein, umfassen: Zugänglichkeit für eine Bindung des Proteins durch einen spezifischen Antikörper gegen den gefalteten Zustand des Proteins.
Ein Fachmann ist sich darüber im Klaren, dass IC₅₀-Werte von der Selektivität des getesteten Mittels abhängen. Ein Mittel mit einem IC₅₀ von weniger als 10 nM wird beispielsweise in der Regel als ausgezeichneter Kandidat für medikamentöse Therapien betrachtet. Ein Mittel mit geringerer Affinität, das aber für ein bestimmtes Ziel selektiv ist, kann jedoch noch ein besserer Kandidat sein. Ein Fachmann ist sich darüber im Klaren, dass jede Information, die Bindungspotential, Inhibitorwirkung oder Selektivität eines bestimmten Mittels betrifft, für die Entwicklung pharmazeutischer Produkte von Nutzen ist.
Wo NZ10 oder ein NZ10-Antagonist zu therapeutischen Zwecken verwendet werden soll, werden die Dosis/Dosen und der Verabreichungsweg von der Natur des Patienten und dem zu behandelnden Zustand abhängen und werden vom behandelnden Arzt oder Tierarzt bestimmt werden. Geeignete Verabreichungswege umfassen orale, subkutane, intramuskuläre, intraperitoneale oder intravenöse Injektion, parenterale, topische Applikation, Implantate usw. Topische Applikation von NZ10 kann in analoger Weise wie bei VEGF erfolgen. Beispielsweise, wird eine wirksame Menge NZ10, wenn es zur Wundheilung oder anderer Verwendung, wo eine verstärkte Angiogenese von Vorteil ist, verwendet wird, einem Organismus mit entsprechendem Bedarf in einer Dosis zwischen etwa 0,1 und 1000 μg/kg Körpergewicht verabreicht.
Das NZ10 oder ein NZ10-Antagonist kann in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger verwendet werden. Die resultierenden Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge von NZ10 oder eines NZ10-Antagonisten, und ein pharmazeutisch verträgliches, nicht-toxisches Salz davon und einen pharmazeutisch verträglichen festen oder flüssigen Träger oder Hilfsstoff. Beispiele für solche Träger oder Hilfsstoffe umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Ringer-Lösung, Mineralöl, Talk, Maisstärke, Gelatine, Lactose, Sucrose, mikrokristalline Cellulose, Kaolin, Mannitol, Dicalciumphosphat, Natriumchlorid, Alginsäure, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol, Verdickungsmittel, Stabilisatoren, Suspensionsmittel und Kombinationen davon. Die Zusammensetzungen können in Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Kapseln, Cremes, Salben, Elixieren, Sirups, Oblaten, Salben oder anderen üblichen Formen vorliegen. Die Formulierung sollte für die Verabreichungsweise geeignet sein. Zusammensetzungen, die NZ10 umfassen, können ferner gegebenenfalls ein oder mehrere von PDGF-A, PDGF-B, VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PlGF und/oder Heparin umfassen. Zusammensetzungen, die ORFV2-VEGF oder NZ10 umfassen, werden zwischen etwa 0,1 und 90 Gew.-% Wirkstoff(e) und in der Regel am ehesten zwischen etwa 10 und 30% enthalten. Für intramuskuläre Präparationen kann eine eine sterile Formulierung, vorzugsweise eine geeignete, lösliche Salzformulierung von NZ10, beispielsweise Hydrochloridsalz, gelöst und in einem pharmazeutischen Verdünnungsmittel, beispielsweise pyrogenfreiem Wasser (destilliert), physiologischer Kochsalzlösung oder 5%-iger Glucoselösung, verabreicht werden. Eine geeignete unlösliche Form der Verbindung kann als Suspension in einer wässrigen Base oder einer pharmazeutisch verträglichen öligen Base, z.B. einem Ester einer langkettigen Fettsäure wie Ethyloleat, hergestellt und verabreicht werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die NZ10 oder ein Fragment oder Analogon davon, welches die Endothelzellproliferation fördert, oder einen Antagonisten, wie einen Antikörper dagegen umfasst. Zusammensetzungen, die NZ10 umfassen, können ferner gegebenenfalls ein oder mehrere von VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PlGF und/oder Heparin umfassen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Proteindimer, das NZ10 umfasst, insbesondere ein disulfidverbrücktes Dimer. Die erfindungsgemäßen Proteindimere umfassen sowohl Homodimere von NZ10 als auch Heterodimere NZ10 und VEGF, VEGF-B, VEGF-C VEGF-D, PlGF oder PDGF.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein NZ10-Antagonist bereitgestellt, der eine Antisense-Nukleotidsequenz sein kann, die zu wenigstens einem Teil einer DNA-Sequenz komplementär ist, die für NZ10 oder ein Fragment oder Analogon davon codiert, der verwendet werden kann, um die NZ10-Expression zu inhibieren oder wenigstens abzuschwächen. Außerdem kann eine Antisense-Nukleotidsequenz gegen die Promotorregion des ORFV10-VEGF-Gens oder zu einem anderen nicht-codierenden Bereich des Gens gerichtet sein, die zur Inhibierung oder wenigstens Abschwächung der NZ10-Expression verwendet werden kann. Die Verwendung eines derartigen Antagonisten zur Inhibierung der ORFV10-VEGF-Expression wird dann bevorzugt, wenn die Expression von ORFV10-VEGF mit einer Erkrankung, beispielsweise pustulärer Dermatitis, zusammenhängt. Die Transformation solcher Zellen mit einem Vektor, der eine Antisense-Nukleotidsequenz enthält, würde die Angiogenese unterdrücken oder verzögern und somit das Wachstum von Läsionen inhibieren oder verzögern.
Noch ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft einen isolierten NZ10- und VEGFR-2-Komplex. Isolierung und Aufreinigung von Komplexen könnte mit herkömmlichen Verfahren erfolgen, wie Immunaffinitätsreinigung mit monoklonalen Antikörpern gemäß den in Standardwerken wie Harlow et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 und/oder Marshak et al., Strategies for Protein Purification and Characterization, Cold Spring Harbor Laboratoty Press, 1986 beschriebenen Methoden.
Erfindungsgemäße Polynukleotide wie diejenigen, die oben beschrieben sind, Fragmente dieser Polynukleotide sowie Varianten dieser Polynukleotide, die ausreichende Ähnlichkeit zum nicht-codierenden Strang dieser Polynukleotide besitzen, um unter stringenten Bedingungen mit diesen zu hybridisieren, sind alle zur Indentifikation, Aufreinigung und Isolierung von Polynukleotiden, die für andere, virale Formen VEGF-ähnlicher Polypeptide codieren, nützlich. Daher werden solche Polynukleotidfragmente und -varianten als Aspekte der Erfindung angesehen. Beispielhafte stringente Hybridisierungsbedinungen sind folgende: Hybridisierung bei 42°C in 5 × SSC, 20 mM NaPO₄, pH 6,8, 50% Formamid; und Waschen bei 42°C in 0,2 × SSC. Fachleute verstehen, dass es wünschenswert ist, diese Bedingungen empirisch auf Basis der Länge und des Anteils an GC-Nukleotidbasen der zu hybridisierenden Sequenzen zu variieren und dass Formeln zur Bestimmung solcher Variationen existieren. Siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2. Ausgabe, S. 9.47–9.51, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory (1989).
Es versteht sich, dass erfindungsgemäße Nukleinsäuren und Polypeptide synthetisch oder rekombinant hergestellt oder aus natürlichen Quellen gereinigt werden können.
Es versteht sich, dass der Ausdruck „umfassend" für die Zwecke dieser Beschreibung „einschließlich, aber nicht beschränkt auf" bedeutet. Die entsprechende Bedeutung trifft auf das Wort „umfasst" zu.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 zeigt ein vergleichendes Sequenzalignment der Aminosäuresequenzen von ORFV2-VEGF mit anderen Mitgliedern der VEGF-Familie von Wachstumsfaktoren. Mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz von ORFV2-VEGF wurde ein Alignment mit den Sequenzen von VEGF₁₂₁ (SEQ ID NO: 3), VEGF₁₆₅ (SEQ ID NO: 4), PIGF (SEQ ID NO: 5), VEGF-B₁₆₇ (SEQ ID NO: 6) und trunkierten Sequenzen von VEGF-C (SEQ ID NO: 7) und VEGF-D (SEQ ID NO: 8) vorgenommen. Die Reste, die Identität mit ORFV2-VEGF (SEQ ID NO: 2) zeigen, sind eingerahmt. Die konservierten Cysteinreste des Cystinknotenmotivs sind mit einem Sternchen gekennzeichnet. Die Signalsequenz, wie sie durch N-terminale Sequenzierung bestimmt wurde, wird durch die Linie über der Sequenz angezeigt. Die potentiellen Stellen für N- und O-gebundene Glykosylierung sind durch eine Klammer bzw. eine gestrichelten Linie angegeben. Die VEGF-Homologie-Domäne ist mit Pfeilen gekennzeichnet.
2 zeigt die Analyse und Aufreinigung exprimierter ORFV2-VEGF-Polypeptide.

(A) Mit FLAG-Tag versehenes ORFV2-VEGF wurde mittels transienter Transfektion in COS-Zellen exprimiert. Die Zellen wurden 4 Stunden biosynthetisch mit ³⁵S-Cystein/Methionin markiert. Konditioniertes Medium dieser Zellen wurde entweder mit M2-Gel oder Kontrollkügelchen immunpräzipitiert und die gewaschenen Kügelchen mit SDS-PAGE-Probenpuffer unter reduzierenden (2% β-Mercaptoethanol) oder nicht-reduzierenden Bedingungen eluiert. Der einzelne Pfeil kennzeichnet die nicht-reduzierte Form von ORFV2-VEGF und die Doppelpfeile kennzeichnen die zwei Spezies der reduzierten Form.
(B) Konditioniertes Medium aus COS-Zellen, die mit FLAG-Tag versehener ORFV2-VEGF-DNA transfiziert waren, wurde auf M2-Gel gereinigt und mit freiem FLAG-Peptid eluiert. Die vom M2-Gel eluierten Fraktionen (1: Leervolumen; 2, 3 und 4; gereinigtes Protein) wurden gesammelt, mit 2 × SDS-PAGE-Probenpuffer (reduzierend) zusammengegeben, aufgekocht und mittels SDS-PAGE aufgetrennt (4–20%-iger Gradient). Die Proteine wurden mit Silberfärbung identifiziert. Molekulargewichtsmarker sind angegeben. Die gereinigten Proteine sind mit Pfeilen gekennzeichnet.

3 zeigt die Ergebnisse der Analyse des ORFV2-VEGF-Proteins mit dem VEGFR2-Bioassay. Gereinigtes ORFV2-VEGF wurde auf seine Fähigkeit getestet, die Proliferation von Ba/F3-Zellen zu induzieren, die einen chimären VEGFR-2 exprimieren. Die Zellen aus dem Bioassay wurden gewaschen, um IL-3 zu entfernen, und anschließend 48 Stunden bei 37°C in Feuchtatmosphäre mit 10% CO₂ in Verdünnungen von ORFV2-VEGF, von gereinigtem murinen VEGF₁₆₄ oder in Medium allein resuspendiert. DNA-Synthese wurde durch die Zugabe von 1 μCi ³H-Thymidin und Auszählen der in einem Zeitraum von 4 Stunden eingebauten Menge quantifiziert. Die Werte sind als Mittelwerte ± Standardabweichungen angegeben und geben 4 Versuche wieder.
4 zeigt die VEGFR-Bindungsspezifität von ORFV2-VEGF. Lösliche Fusionsproteine, die aus der extrazellulären Domäne von VEGFRs und dem Fc-Teil von humanem IgG1 bestehen, wurden zur Abschätzung der Rezeptorbindungsspezifität von ORFV2-VEGF verwendet. Biosynthetisch markiertes konditioniertes Medium, das von 293EBNA-Zellen stammte, die mit ORFV2-VEGF, murinem VEGF₁₆₄, humanem VEGF₁₆₅, humanem VEGF-DΔNΔC, humanem VEGF-CΔNΔC oder Vektor allein transfiziert waren, wurden mit an VEGFR-1-Ig, VEGFR-2-Ig, VEGFR-3-Ig oder Neuropilin-1-Ig gebundenem Protein A immunpräzipitiert, mit SDS-PAGE-Probenpuffer von den gewaschenen Kügelchen eluiert und mittels SDS-PAGE (4–20%) aufgetrennt. Nur das ORFV2-VEGF und das VEGF-DΔNΔC waren mit einem FLAG-Tag versehen. Getrocknete Gele wurden mittels Phosphorimager-Analyse sichtbar gemacht. Das bei der jeweiligen Fällung verwendete Fusionsprotein ist über jeder Abbildung angegeben.
5 zeigt die Autophosphorylierung des VEGFR-Rezeptors nach Stimulation durch rekombinanten ORFV2-VEGF. NIH3T3-Zellen, die entweder VEGFR-2 oder VEGFR-3 exprimierten, wurden ruhend gemacht, indem sie über Nacht in 0,2% Rinderserumalbumin enthaltendem Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) gehungert worden waren. Die Zellen wurden entweder mit ORFV2-VEGF (100 ng/ml), VEGF₁₆₅ (50 ng/ml), humanem VEGF-CΔNΔC (100 ng/ml) oder Mockmedium stimuliert, lysiert und mit rezeptorspezifischen Antikörpern immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden mittels Immunoblotting mit Phosphotyrosin analysiert. Die apparenten Molekulargewichte der tyrosylphosphorylierten VEGFR-2 und VEGFR-3 sind gezeigt. Ein Sternchen (*) markiert eine 200 kDa große intrazelluläre Form von VEGFR-2, die nicht in Reaktion auf die Rezeptorstimulation phosphoryliert wird.
6 zeigt die mitogene Wirkung von gereinigtem ORFV2-VEGF auf Endothelzellen der humanen Nabelvene (HUVECs). Die HUVECs wurden 3 Tage lang gereinigtem ORFV2-VEGF, murinem VEGF₁₆₄ oder humanem VEGF-DΔNΔC ausgesetzt. Nach 72 Stunden wurde das Ausmaß der Zellproliferation mit einem 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid-Assay (MTT, Sigma), der die Umwandlung eines MTT-Substrats misst, quantifiziert. Die gepunktete Linie zeigt die Stimulationshöhe an, die mit Medium alleine erreicht wurden. Die Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichungen angegeben und geben 3 Versuche wieder.
7 zeigt die Gefäßpermeabilitätsaktivität von gereinigtem ORFV2-VEGF im Miles-Assay. Betäubten Meerschweinchen wurden intrakardiale Injektionen des Farbstoffs Evans Blue verabreicht. Gereinigtes ORFV2-VEGF, murines VEGF₁₆₄ und geeignete Kontrollen wurden in Medium verdünnt und 150 μl wurden intradermal in die rasierten Bereiche auf dem Rücken der Tiere injiziert. Nach 30 Minuten wurden die Tiere getötet und die Haut exzidiert (7A) und anschließend in Formamid eluiert und (7B) die Extinktion bei 620 nm ausgelesen. Die Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichungen angegeben und geben 3 Versuche wieder.
8 zeigt die für ORFV2-VEGF codierende Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 1).
9 zeigt die von der Nukleotidsequenz in 8 codierte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2).
10 zeigt die für ORFV10-VEGF codierende Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 10).
11 zeigt die von der Nukleotidsequenz in 10 codierte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 11).
Ausführliche Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
1 zeigt ein vergleichendes Sequenzalignment der Aminosäuresequenzen von ORFV2-VEGF mit anderen Mitgliedern der VEGF-Familie von Wachstumsfaktoren. Mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz von ORFV2-VEGF wurde ein Alignment mit den Sequenzen von VEGF₁₂₁ (SEQ ID NO: 3), VEGF₁₆₅ (SEQ ID NO: 4), PlGF (SEQ ID NO: 5), VEGF-B₁₆₇ (SEQ ID NO: 6) und trunkierten Sequenzen von VEGF-C (SEQ ID NO: 7) und VEGF-D (SEQ ID NO: 8) vorgenommen. Alignment der vorhergesagten Aminosäuresequenz von ORFV2-VEGF (SEQ ID NO: 2) mit Mitgliedern der VEGF-Familie zeigt, dass ORFV2-VEGF einen hohen Grad an Sequenzhomologie mit der VEGF-Homologiedomäne (VHD) dieser Proteinfamilie aufweist. ORFV2-VEGF enthält alle sechs Cysteinreste des Cystinknotenmotivs, die bei allen Familienmitgliedern vollständig konserviert sind. Die konservierten Cysteinreste des Cystinknotenmotivs sind mit einem Sternchen (*) markiert. Verschiedene andere invariante oder hochkonservierte Aminosäuren sind angegeben. ORFV2-VEGF enthält nicht die bei VEGF-C und VEGF-D zu findenden erweiterten N- und C-terminalen Bereiche. Insgesamt ist ORFV2-VEGF zu 43,3%, 34,3%, 25,4%, 26,9% und 33,6% identisch mit humanem VEGF₁₆₅ (SEQ ID NO: 4), VEGF-B (SEQ ID NO: 6), VEGF-C (SEQ ID NO: 7), VEGF-D (SEQ ID NO: 8) bzw. PlGF (SEQ ID NO: 5). Die Aminosäuresequenz von ORFV2-VEGF ist zu 87% identisch mit NZ10. Diese Sequenzähnlichkeit von ORFV2-VEGF und NZ10 mit den Säuger-VEGFs wirft die Frage auf, ob sich die strukturelle Verwandtschaft auf Rezeptorbindung und biologische Funktion erstreckt.
Der Verwandtschaftsgrad von ORFV2-VEGF/NZ10 mit VEGF₁₆₅ legt die Möglichkeit nahe, dass sich ORFV2-VEGF/NZ10 vom VEGF₁₆₅-Gen ableitet, dass Sequenzdivergenz aber zu Änderungen führen kann, die die Rezeptorbindung und damit die biologische Funktion beeinträchtigen können. Es ist jedoch auch möglich, dass sich ORFV2-VEGF/NZ10 von einem anderen, noch nicht identifizierten Familienmitglied von Säuger-VEGFs ableitet, da ein anderes ORF-Virus-Gen (ein Homologes von IL-10) 80% Aminosäuresequenzidentität mit seinem Säuger-Gegenstück zeigt. Diese Vorhersagen werden durch das Vorliegen einer varianten Form des viralen VEGF im NZ7-Stamm des ORF-Virus kompliziert. Der NZ7-Stamm codiert für ein Protein, das nur 23% Aminosäureidentität mit humanem VEGF, 43% Identität mit ORFV2-VEGF und 40% Identität mit NZ10 besitzt.
Beispiel 1 Expression und Aufreinigung von ORFV2-VEGF und NZ10
Ein DNA-Fragment, das die Nukleotide 4 bis 401 der in 8 (SEQ ID NO: 1) gezeigten Sequenz des VEGF-ähnlichen Gens des ORF-Virusstamms NZ2 enthält, wurde mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) hergestellt, bei der pVU89 als Matrize verwendet wurde (Lyttle et al., J. Virol., 68: 84–92, 1994). Das Fragment wurde unmittelbar stromaufwärts von der für das FLAG-Octapeptid codierenden DNA-Sequenz in den pEFBOS-I-FLAG-Expressionsvektor inseriert. Daneben wurde die für NZ10 codierende cDNA (SEQ ID NO: 10) an ihrem C-Terminus mit der für das FLAG-Octapeptid codierenden Sequenz verknüpft. Bei der Proteinsynthese entstanden VEGF-ähnliche Polypeptide, die an ihrem C-Terminus mit dem FLAG-Octapeptid-Tag versehen sind. Diese Proteine wurde mit FLAG-Tag versehene ORFV2-VEGF oder mit FLAG-Tag versehenes NZ10 genannt. Das mit FLAG-Tag versehene NZ10-Konstrukt wurde in den pAPEX-3-Expressionsvektor subkloniert und anschließend über mittels Fugene vermittelter Transfektion transient in 293EBNA-1-Zellen exprimiert. Nach 24 bis 72 Stunden wurde das konditionierte Medium gesammelt und die mit FLAG-Tag versehenen Proteine wurden auf dem M2-Gel gereinigt, wie unten beschrieben ist. COS-Zellen wurden mit Hilfe des bei Aruffo und Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 8573–8577, 1987 beschriebenen DEAE-Dextranverfahrens transient mit dem Vektor, der mit einem FLAG-Tag versehenes ORFV2-VEGF enthält und für 4 Stunden biosynthetisch mit ³⁵S-Cystein/Methionin markiert wurde, transfiziert. Nach 3-tägiger Inkubation wurde ein Teil der transfizierten COS-Zellen, wie bei Joukov et al., EMBO Journal, 15: 290–298, 1996 beschrieben, metabolisch markiert. Die übrige Kultur wurde für insgesamt 7 Tage inkubiert. Konditioniertes Zellkulturmedium wurde gesammelt und mittels Zentrifugation geklärt, bevor die mit FLAG-Tag versehenen Proteine durch Immunpräzipitation mit entweder M2-Gel (anti-FLAG) oder Kontrollkügelchen wiedergewonnen wurden. Die konditionierten Medien wurden in dem Bioassay, wie unten beschrieben ist, getestet und die Ergebnisse zeigten, dass die COS-Zellen tatsächlich biologisch-aktives ORFV2-VEGF exprimierten und sekretierten.
SDS-PAGE und Immunoblotting
Gereinigte Proteine oder gewaschene Immunpräzipitate wurden unter reduzierenden (2% β-Mercaptoethanol) oder nicht-reduzierenden Bedingungen mit SDS-PAGE-Probenpuffer zusammengegeben, aufgekocht und mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Die Proteine wurden, falls erforderlich, auf Nitrozellulose transferiert und mit M2-Antikörper geblottet. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen ließ sich eine Bande mit einem M_r von etwa 44–48 kDa beobachten, während unter reduzierenden Bedingungen eine schneller wandernde Bande mit einem M_r von etwa 23–26 kDa zu sehen war (siehe 2A). Die nachgewiesenen Banden stimmen damit überein, dass ORFV2-VEGF ein disulfidverbrücktes Homodimer mit einem monomeren M_r von etwa 25 kDa ist. Dies ist größer als die vorhergesagte Größe von 13.456 Da für ORFV2-VEGF und lässt eine Modifikation durch Glykosylierung vermuten. Eine Untersuchung der ORFV2-VEGF-Sequenz offenbart eine mögliche N-gebundene Glykosylierungsstelle (Asn85-Thr87) und zwei mögliche O-gebundene Glykosylierungsstellen (Thr121–Thr125). Eine Behandlung mit N-Glycanase verminderte die Größe des ORFV2-VEGF-Monomers um etwa 5 kDa (nicht gezeigt). Man vermutet, dass die restliche Größendifferenz eine Folge der O-gebundenen Glykosylierung ist, für die Consensus-Sequenzen im Threonin/Prolin-reichen C-Terminus von ORFV2-VEGF vorliegen. In 2A gibt der einzelne Pfeil die nicht-reduzierte Form von ORFV2-VEGF und die Doppelpfeile geben die zwei Spezies der reduzierten Form an.
Unmarkiertes, mit FLAG-Tag versehenes ORFV2-VEGF wurde aus dem konditionierten Medium transfizierter COS-Zellen mittels Affinitätschromatographie mit M2-Harz und anschließender Elution mit FLAG-Peptid angereichert. Die Analyse dieses Materials mittels SDS-PAGE und Silberfärbung (2B) oder Western Blotting mit monoklonalen anti-FLAG-Antikörpern (nicht gezeigt) zeigte Spezies mit dem gleichen M_r wie dem, das nach biosynthetischer Markierung zu sehen ist. N-terminales Sequenzieren des sekretierten gereinigten Proteins zeigte eine einzige Sequenz, und diese war mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz von Rest 21 bis 43 der 9 (SEQ ID NO: 2) identisch und bestätigte die Vorhersage, dass ORFV2-VEGF ein Protein mit einer Signalsequenz von 20 Aminosäuren ist.
Für NZ10 wurde ebenfalls gefunden, dass die gereinigten VEGF-ähnlichen Polypeptide disulfidverbrückte Homodimere sind (nicht gezeigt). Unter reduzierenden Bedingungen wandern die Monomere von NZ10 bei einem M_r von etwa 30 K (nicht gezeigt).
Beispiel 2 Bioassay für ORFV2-VEGF/NZ10 auf Bindung an VEGF-Rezeptor-2
ORFV2-VEGF und NZ10 wurden in einem Bioassay getestet, der Liganden für VEGFR-2 nachweist. 3 zeigt die Ergebnisse der Analyse von ORFV2-VEGF-Protein mit dem VEGFR2-Bioassay. Die Ergebnisse von NZ10 sind nicht gezeigt. Der Bioassay wurde mit Ba/F3-Zellen durchgeführt, die einen chimären Rezeptor exprimieren, der aus der extrazellulären Domäne von murinem VEGFR-2 und der Transmembrandomäne und cytoplastischen Domäne des murinen Erythropoietinrezeptors (EpoR) besteht. Die Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) gehalten, das 10% fötales Rinderserum (FBS), 50 mM L-Glutamin, 50 μg/ml Gentamicin und 10% Walter und Eliza Hall Institute of Medical Research (WEHI)-3D-konditioniertes Medium als Quelle für Interleukin-3 (IL-3) enthielt. Zellen, die den chimären VEGFR-2-EpoR-Rezeptor exprimierten, wurden 3-mal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und einmal in Komplexmedium ohne IL-3. Zellen (10⁴) wurden in 96-Loch-Mikrotiterplatten, die Verdünnungen des Testreagens oder des Mediums alleine enthielten, aliquotiert. Zellen wurden 48 Stunden lang bei 37°C in befeuchteter Atmosphäre mit 5% CO₂ inkubiert. 4 Stunden vor der Ernte wurde die Zellproliferation durch Zugabe von 1 μCi ³H-Thymidin quantifiziert. Eingebautes ³H-Thymidin wurde mit Hilfe eines Zellernters und über β-Zählung bestimmt.
Die Aktivierung des chimären Rezeptors rettet die Zellen aus ihrer Abhängigkeit von IL-3 und bedingt, dass die Zellen in Abwesenheit von IL-3 proliferieren. VEGF, VEGF-CΔNΔC (die VEGF-Homologiedomäne von VEGF-C) und VEGF-DΔNΔC (die VEGF-Homologiedomäne von VEGF-D), welche alle Liganden für VEGFR-2 sind, stimulieren das Wachstum dieser Zelllinie in einer spezifischen und dosisabhängigen Art und Weise (Achen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 548–553, 1998). Mit einer Konzentration von 25 ng/ml konnte gereinigtes ORFV2-VEGF nachweisbare DNA-Synthese in der Zelllinie des Bioassays induzieren. Im Vergleich dazu konnte VEGF mit einer Konzentration von 5 ng/ml DNA-Synthese in der Zelllinie des Bioassays induzieren. Im Vergleich zu murinem VEGF war ORFV2-VEGF allgemein viermal geringer wirksam im Bioassay. Die Ergebnisse zeigen klar, dass ORFV2-VEGF an die extrazelluläre Domäne von VEGFR-2 binden und diese quervernetzen und eine Proliferationsreaktion induzieren kann. Ähnliche Ergebnisse fand man bei NZ10.
Beispiel 3 Bindung von ORFV2-VEGF an lösliche extrazelluläre Domänen von VEGF-Rezeptor-2
Um ferner die Wechselwirkungen zwischen ORFV2-VEGF und den VEGF-Rezeptoren näher zu bestimmen, wurde ORFV2-VEGF auf seine Fähigkeit getestet, an lösliche Ig-Fusionsproteine zu binden, die die extrazellulären Domänen von humanem VEGFR-1, VEGFR-2 und VEGFR-3 enthielten. Die Fusionsproteine, als VEGFR-1-Ig, VEGFR-2-Ig und VEGFR-3-Ig bezeichnet, wurden transient in 293EBNA-Zellen exprimiert. Alle Ig-Fusionsproteine waren humane VEGFRs. Die Zellen wurden nach der Transfektion 24 Stunden inkubiert, mit 0,2% Rinderserumalbumin enthaltendem DMEM gewaschen und 24 Stunden gehungert. Die Fusionsproteine wurden dann mit Protein A-Sepharose-Kügelchen aus dem geklärten konditionierten Medium ausgefällt. Die Kügelchen wurden mit 100 μl 10× Bindungspuffer (5% Rinderserumalbumin, 0,2% Tween 20 und 10 μg/ml Heparin) und 900 μl konditioniertem Medium aus 293-Zellen, die mit für VEGF, VEGF-DΔNΔC und ORFV2-VEGF codierenden Expressionsplasmiden oder Kontrollvektor transfiziert worden waren, zusammengegeben und anschließend 4 bis 16 Stunden metabolisch mit ³⁵S-Cystein/Methionin markiert. Nach 2,5 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Sepharose-Kügelchen 3-mal bei 4°C mit Bindungspuffer und einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und in SDS-PAGE-Puffer aufgekocht. An die Ig-Fusionsproteine gebundene, markierte Proteine wurden mittels SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen analysiert. Radiomarkierte Proteine wurden mit einem Phosphorimager-Analyzer nachgewiesen.
Wie in 4A zu sehen ist, wurden Polypeptide, die der Größe von ORFV2-VEGF entsprachen, mit VEGFR-2-Ig aus dem Medium von Zellen, die ORFV2-VEGF exprimierten, präzipitiert. Im Gegensatz dazu präzipitierten VEGFR-1-Ig oder VEGFR-3-Ig keine Proteine aus diesem Medium.
Wie erwartet wurde von VEGFR-1-Ig und VEGFR-2-Ig ein Polypeptid von etwa 24 kDa aus dem Medium von Zellen, die murines VEGF₁₆₄ exprimierten, präzipitiert, aber nicht von VEGR-3-Ig. Ebenfalls wie erwartet wurde ein Polypeptid von etwa 22 kDa von VEGFR-2-Ig und VEGFR-3-Ig aus dem Medium von Zellen, die VEGF-DΔNΔC exprimierten, präzipitiert, aber nicht von VEGR-1-Ig. Von den drei Fusionsproteinen wurden keine markierten Polypeptide aus dem Medium von Zellen präzipitiert, die mit dem Expressionsvektor transfiziert waren, dem die für VEGF codierenden Sequenzen fehlten. ORFV2-VEGF wurde auch auf seine Fähigkeit getestet, den Neuropilin-1-Rezeptor, einen kürzlich beschriebenen Liganden für VEGF, zu binden (4B). Das Neuropilin-1-Ig-Fusionsprotein konnte VEGF₁₆₄ präzipitieren, aber nicht ORFV2-VEGF. Insgesamt gesehen zeigen diese Daten an, dass das ORFV2-VEGF an VEGFR-2, aber nicht an VEGFR-1, VEGFR-3 oder Neuropilin-1 binden kann. Man fand auch, dass NZ10 nicht an VEGFR-1 bindet. Diese Rezeptorbindungsspezifität von ORFV2-VEGF und NZ10 ist in der VEGF-Familie von Wachstumsfaktoren einzigartig. Jüngere Strukturanalysen von humanem VEGF identifizierten Reste, die vermutlich für die Bindung an VEGFR-1 und VEGFR-2 wichtig sind. Im Hinblick auf die Rezeptorbindungseigenschaften von ORFV2-VEGF ist es verblüffend, dass die VEGF-Reste, denen eine entscheidende Rolle bei der Bindung an VEGFR-1 zugesprochen wird, in ORFV2-VEGF teilweise konserviert sind, nicht aber diejenigen, die an der Bindung von VEGFR-2 beteiligt sind. Versuche, die die Kristallstruktur von VEGF bestimmten, sagten als entscheidende Reste für die Bindung an VEGFR-2 Phe17, Ile46, Glu64, Gln79, und Ile83 und für die Bindung an VEGFR-1 Asp63 und Glu64 vorher. Der Mechanismus, über den ORFV2VEGF an VEGFR-2 bindet, ist offensichtlich von Interesse; die mangelnde Konservierung der Schlüsselreste lässt vermuten, dass sich die Bindungsstelle für ORFV2-VEGF von derjenigen von VEGF unterscheidet.
Beispiel 4 ORFV2-VEGF aktiviert VEGFR-2
Die Fähigkeit von ORFV2-VEGF, die Tyrosinphosphorylierung von humanem VEGFR-2 und humanem VEGFR-3 zu induzieren, wurde untersucht. ORFV2-VEGF, VEGF₁₆₅ und VEGF-CΔNΔC wurden in 0,2% Rinderserumalbumin enthaltendem DMEM verdünnt und zur Stimulation von VEGFR-2 oder VEGFR-3 exprimierenden NIH3T3-Zellen verwendet. Nach der Stimulation wurden die Zellen lysiert und VEGFR-2 oder VEGFR-3 wurden immunpräzipitiert und mittels Western Blot-Analyse mit phosphotyrosinspezifischen monoklonalen Antikörpern analysiert. Wie in 5 gezeigt, stimulierte ORFV2-VEGF die Tyrosinkinasephosphorylierung von VEGFR-2, aber nicht die von VEGFR-3. Wie erwartet, waren die Positivkontrollproteine VEGF₁₆₅ und VEGF-CΔNΔC dazu fähig, die Phosphorylierung von VEGFR-2 bzw. VEGFR-3 zu induzieren. Diese Daten zeigen, dass ORFV2-VEGF die Phosphorylierung von VEGFR-2 spezifisch induzieren kann.
Beispiel 5 Mitogenität von ORFV2-VEGF für Endothelzellen
Mitglieder der VEGF-Familie von Proteinen zeigen unterschiedlich hohe Mitogenität für Endothelzellen. Das mitogene Vermögen von ORFV2-VEGF wurde mit Endothelzellen der humanen Nabelvene (HUVECs) getestet. Zellen, die in Endothelzell-spezifischem Medium-2 (EBM-2, Clonetics), das ergänzend SingleQuots plus Wachstumsfaktoren und Serum enthielt, angezüchtet worden waren, wurden mit Trypsin entfernt, gewaschen und mit 10³ Zellen pro Vertiefung in eine 96-Loch-Platte aliquotiert. Die Zellen wurden sich in 6 bis 16 Stunden bei 37°C in EBM-2-Medium plus Serum ohne Wachstumsfaktoren anheften gelassen, bevor Wachstumsfaktorproben, die in dem gleichen Medium verdünnt waren, dazugegeben wurden. Die HUVEC wurden 3 Tage lang bei 37°C gereinigtem ORFV2-VEGF, murinem VEGF₁₆₄ oder humanem VEGF-DΔNΔC ausgesetzt und anschließend wurden die Zellen trypsiniert und ausgezählt. Das Ausmaß der Zellproliferation wurde mit einem 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid-(MTT)Assay quantifiziert, der die Umwandlung eines MTT-Substrats misst. Wie in 6 zu sehen ist, war ORFV2-VEGF (0,5–100 ng/ml) im Vergleich zu Medium, das keinen hinzugegeben Wachstumsfaktor enthielt, in der Lage, eine Erhöhung der Zellzahl nach 3 Tagen zu stimulieren. Die Kontrollproteine VEGF₁₆₄ und VEGF-CΔNΔC stimulierten die Endothelzellen ebenso. Das Proliferationsvermögen von HUVECs, die ORFV2-VEGF ausgesetzt waren, ließ sich mit denjenigen vergleichen, die mit murinem VEGF₁₆₄ angezüchtet worden waren.
Beispiel 6 Test auf Gefäßpermeabilität
Da Läsionen durch den ORF-Virus durch Schwellungen und Flüssigkeitsakkumulation gekennzeichnet sind, wurde das gereinigte ORFV2-VEGF auf seine Fähigkeit gettestet, Gefäßpermeabilität in einem Miles- Assay zu induzieren. Betäubten Meerschweinchen wurden intrakardial 500 μl 0,5% Evans Blue-Farbstoff in phosphatgepufferter Kochsalzlösung injiziert, um den Farbstoff in den Blutstrom einzuschleusen. Gereinigtes ORFV2-VEGF, murines VEGF₁₆₄ und geeignete Kontrollen wurden in Medium verdünnt und 150 μl wurden intradermal in die rasierten Bereiche auf dem Rücken der Tiere injiziert. Nach 30 Minuten wurden die Tiere getötet und die Haut exzidiert (7A) und anschließend in Formamid eluiert und (7B) die Extinktion bei 620 nm ausgelesen. Die Aliquote von ORFV2-VEGF enthielten 8 bis 66 ng Faktor. Im Vergleich zu Medium alleine ließ sich eine nachweisbare und dosisabhängige, von ORFV2-VEGF induzierte Permeabilität feststellen. ORFV2-VEGF ist als Gefäßpermeabilitätsfaktor etwa fünfmal weniger wirksam als murines VEGF₁₆₄.
8 zeigt die für ORFV2-VEGF codierende Nukleotidsequenz (SEQ ID NO:).
9 zeigt die von der Nukleotidsequenz in 8 codierte Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NO: 2).
Die obigen Beispiele lassen stark vermuten, dass ORFV2-VEGF die Aktivierung des VEGFR-2-Signalgebungswegs analog zur VEGF-Stimulation induzieren kann. ORFV2-VEGF ist auch dazu fähig, die Proliferation von Endothelzellen zu induzieren. VEGFR-2 scheint ein Hauptvermittler einer solchen Aktivität zu sein. Die Fähigkeit von ORFV2-VEGF zur Induktion von Gefäßpermeabilität in Kombination mit dessen eingeschränkter Rezeptorbindungsspezifität zeigt an, dass VEGFR-2 Gefäßpermeabilität in der VEGFR-Familie vermitteln kann, wie auch schon durch Analyse von VEGF-C-Mutanten nahe gelegt wurde. Die Anwesenheit eines neuartigen, Permeabilität vermittelnden Rezeptors kann dennoch nicht ausdrücklich ausgeschlossen werden.
Bioassays zur Bestimmung der Funktion von ORFV2-VEGF
Andere Tests werden durchgeführt, um abzuschätzen, ob ORFV2-VEGF oder NZ10 bezüglich Endothelzellfunktion, Angiogenese und Wundheilung ähnliche Aktivitäten wie VEGF, VEGF-D und/oder VEGF-D besitzen.
I. Tests der Endothelzellfunktion
a) Endothelzellproliferation
Tests des Endothelzellwachstums werden mit im Stand der Technik allgemein bekannten Verfahren durchgeführt, z.B. denjenigen von Ferrara & Henzel, Nature, 380: 439–443, 1989; Gospodarowicz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 7311–7315, 1989; und/oder Claffey et al., Biochim. Biophys. Acta; 1246: 1–9, 1995.
b) Zelladhäsionstest
Die Wirkung von ORFV2-VEGF oder NZ10 auf die Adhäsion polymorphkerniger Granulozyten an Endothelzellen wird getestet.
c) Chemotaxis
Der Standardtest auf Chemotyxis mit der Boyden-Kammer wird verwendet, um die Wirkung von ORFV2-VEGF oder NZ10 auf die Chemotaxis zu testen.
d) Plasminogenaktivatortest
Endothelzellen werden nach der Methode von Pepper et al., Biochim. Biophys. Res. Comm., 181: 902–906, 1991 auf die Wirkung von ORFV2-VEGF oder NZ10 auf die Produktion von Plasminogenaktivator und Plasminogenaktivatorinhibitor getestet.
e) Test der Endothelzellenmigration
Die Fähigkeit von ORFV2-VEGF oder NZ10, Endothelzellen zur Migration und zur Röhrenbildung zu stimulieren, wird, wie bei Montesano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7297–7301, 1986 beschrieben, getestet. Alternativ dazu kann der bei Joukov et al., (1996) beschriebene dreidimensionale Collagengel-Test oder eine mit Gelatine überzogene Membran in einer modifizierten Boyden-Kammer (Glaser et al., Nature, 288: 483–484, 1980) verwendet werden.
II Angiogenesetest
Die Fähigkeit von ORFV2-VEGF oder NZ10, eine angiogene Antwort in der Chorioallantoismembran von Küken zu induzieren, wird, wie bei Leung et al., Science, 246: 1306–1309, 1989 beschrieben, getestet. Alternativ dazu kann der Ratten-Corneatest von Rastinejad et al., Cell, 56: 345–355, 1989 verwendet werden; dies ist ein anerkanntes Verfahren zum Test von in vivo-Angiogenese, und die Ergebnisse sind leicht auf andere in vivo-Systeme übertragbar.
III Wundheilung
Die Fähigkeit von ORFV2-VEGF oder NZ10, die Wundheilung zu stimulieren, wird mit dem klinisch relevantesten zur Verfügung stehenden Modell getestet, wie es bei Schilling et al., Surgery, 46: 702–710, 1959 beschrieben und von Hunt et al., Surgery, 114: 302–307, 1967 eingesetzt wird.
IV Das Hämatopoietische System
Eine Vielzahl von in vitro- und in vivo-Tests, welche spezifische Zellpopulationen des hämatopoietischen Systems verwenden, sind im Stand der Technik bekannt und unten dargelegt. Insbesondere sind zahlreiche in vitro-Tests mit murinen Stammzellen besonders geeignet, bei denen Zellen verwendet werden, die im fluoreszenzaktivierten Zellsortierer gereinigt wurden.
a) Neu besiedelnde Stammzellen
Dies sind Zellen, die in der Lage sind, das Knochenmark letal bestrahlter Mäuse neu zu besiedeln und die den Lin^–, Rh^h1, Ly-6A/E⁺, c-kit⁺-Phänotyp aufweisen. ORFV2-VEGF oder NZ10 wird auf diesen Zellen entweder allein oder durch Co-Inkubation mit anderen Faktoren und anschließende Messung der Zellproliferation durch Einbau von ³H-Thymidin getestet.
b) Stammzellen im späten Stadium
Dies sind Zellen, die eine vergleichsweise geringe Fähigkeit besitzen, das Knochenmark neu zu besiedeln, die aber D13-CFU-S bilden können. Diese Zellen zeigen den Lin^–, Rh^h1, Ly-6A/E⁺, c-kit⁺-Phänotyp. ORFV2-VEGF oder NZ10 wird eine bestimmte Zeit mit diesen Zellen inkubiert, in letal bestrahlte Rezipienten injiziert, und es wird die Anzahl von D13-Milz-Kolonien ausgezählt.
c) Progenitor-angereicherte Zellen
Dies sind Zellen, die in vitro auf einzelne Wachstumsfaktoren ansprechen und den Lin^–, Rh^h1, Ly-6A/E⁺, c-kit⁺-Phänotyp aufweisen. Dieser Test zeigt, ob ORFV2-VEGF oder NZ10 direkt auf hämatopoietische Progenitorzellen wirken können. OFV2-VEGF oder NZ10 wird mit diesen Zellen in Agarkulturen inkubiert und die Anzahl an Kolonien nach 7 bis 14 Tagen wird ausgezählt.
V Arteriosklerose
Glatte Muskelzellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung oder Initiation von Arteriosklerose, bei der ein Phänotypwechsel von einem kontraktilen in einen alternden Zustand erforderlich ist. Makrophagen, Endothelzellen, T-Lymphozyten und Blutplättchen spielen alle eine Rolle bei der Entwicklung von arteriosklerotischen Plaques, indem sie das Wachstum und die phänotypischen Modulationen glatter Muskelzellen beeinflussen. Ein in vitro-Test mit einer modifizierten Rose-Kammer, in der verschiedene Zelltypen auf gegenüberliegenden Coverslips angesät werden, misst die Proliferationsgeschwindigkeit und die phänotypischen Modulationen glatter Muskelzellen in einer multizellulären Umgebung und wird dazu verwendet, die Wirkung von ORFV2-VEGF oder NZ10 auf glatte Muskelzellen festzustellen.
VI Metastasierung
Die Fähigkeit von ORFV2-VEGF oder NZ10, Metastasierung zu inhibieren, wird mit Hilfe des Lewis-Models eines Lungenkarzinoms, beispielsweise mit dem Verfahren von Cao et al., J. Exp. Med., 182: 2069–2077, 1995 untersucht.
VII ORFV2-VEGF oder NZ10 in anderen Zelltypen
Die Wirkungen von ORFV2-VEGF oder NZ10 auf die Proliferation, Differenzierung und Funktion anderer Zelltypen, wie beispielsweise Leberzellen, Herzmuskelzellen und anderen Zellen, endokrine Zellen und Osteoblasten, kann leicht mit im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie beispielsweise der Aufnahme von ³H-Thymidin durch in vitro-Kulturen, untersucht werden.
VIII Konstruktion von ORFV2-VEGF- oder NZ10-Varianten und Analoga
ORFV2-VEGF und NZ10 sind Mitglieder der VEGF-Familie von Wachstumsfaktoren, die einen hohen Grad an Homologie mit den anderen Mitgliedern der VEGF-Familie aufweisen. Sowohl ORFV2-VEGF als auch NZ10 enthalten acht konservierte Cysteinreste, die für diese Familie von Wachstumsfaktoren charakteristisch sind. Diese konservierten Cysteinreste bilden Disulfidbrücken innerhalb der Ketten, wodurch die Cysteinknotenstruktur entsteht, und Disulfidbrücken zwischen den Ketten, wodurch Proteindimere entstehen, die für Mitglieder der PDGF-Familie von Wachstumsfaktoren charakteristisch sind. ORFV2-VEGF und NZ10 werden mit den Rezeptoren der Proteintyrosinkinase-Wachstumsfaktoren in Wechselwirkung treten.
Im Gegensatz zu Proteinen, bei denen man wenig oder nichts über die Proteinstruktur und die aktiven Zentren weiß, die für die Rezeptorbindung und die daraus folgende Aktivität benötigt werden, wird die Konstruktion aktiver Mutanten von ORFV2-VEGF oder NZ10 dadurch stark erleichtert, dass sehr viel über die aktiven Zentren und die wichtigen Aminosäuren der Mitglieder der PDGD-Familie von Wachstumsfaktoren bekannt ist.
Veröffentlichte Artikel, die die Zusammenhänge zwischen Struktur/Aktivität der Mitglieder der PDGF-Familie von Wachstumsfaktoren beinhalten, umfassen für PDGF: Oestman et al., J. Biol. Chem., 266: 10073–10077, 1991; Andersson et al., J. Biol. Chem., 267: 11260–11266, 1992; Oefner et al., EMBO J., 11: 3921–3926, 1992; Flemming et al., Molecular and Cell Biol., 13: 4066–4076, 1993 und Andersson et al., Growth Factors, 12: 159–164, 1995; und für VEGF: Kim et al., Growth Factors, 7: 53–64, 1992; Pötgens et al., J. Biol. Chem., 269: 32879–32885, 1994 und Claffey et al., Biochim. Biophys. Acta, 1246: 1–9, 1995. Aus diesen Veröffentlichungen geht hervor, dass die Mitglieder der PDGF-Familie von Wachstumsfaktoren wegen der acht konservierten Cysteinreste eine charakteristisch geknotete Faltstruktur und Dimerisierung aufweisen, was zur Bildung drei exponierter Loop-Regionen an jedem Ende des dimerisierten Moleküls führt, von denen zu erwarten ist, dass dort die Rezeptorbindugsstellen lokalisiert sind.
Ausgehend von diesen Informationen kann eich Fachmann aus dem Bereich der Biotechnologie ORFV2-VEGF- oder NZ10-Mutanten konstruieren, die ein mit einer sehr hohen Wahrscheinlichkeit die ORFV2-VEGF- oder NZ10-Aktivität behalten, indem er die acht Cysteinreste, die für die geknotete Faltstruktur und die Dimerisierung verantwortlich sind, konserviert, und indem er auch die wahrscheinlichen Rezeptorsequenzen in den Loop 1-, Loop 2- und Loop 3-Regionen der Proteinstruktur konserviert oder dort nur konservative Aminosäuresubstitutionen vornimmt.
Die Bildung erwünschter Mutationen an spezifisch gezielten Stellen in einer Proteinstruktur ist als Standardmetode im Arsenal der Proteinchemiker anzusehen (Kunkel et al., Methods in Enzymol., 154: 367–382, 1987). Beispiele einer solchen auf eine Stelle gerichteten Mutagenese mit VEGF sind bei Pötgens et al., J. Biol. Chem., 269: 32879–32885, 1994 und Claffey et al., Biochim. Biophys. Acta, 1246: 1–9, 1995 zu finden. Eine auf eine Stelle gerichtete Mutagenese ist in der Tat so allgemein üblich, dass es kommerziell erhältliche Kits gibt, die solche Verfahren erleichtern (z.B. Promega-Katalog 1994–1995, S. 142–145).
Die Aktivität auf die Endothelzellproliferation von ORFV2-VEGF- oder NZ10-Mutanten kann leicht mit allgemein etablierten Screeningverfahren festgestellt werden. Beispielsweise kann ein Verfahren verwendet werden, das zu dem Endothelzellmitosetest, der bei Claffey et al., Biochim. Biophys. Acta, 1246: 1–9, 1995 beschrieben ist, analog ist. In ähnlicher Weise können die Wirkungen von ORFV2-VEGF oder NZ10 auf die Proliferation anderer Zelltypen, auf die Zelldifferenzierung und auf humane Metastasierung mit Verfahren, die im Stand der Technik allgemein bekannt sind, getestet werden.
Beitrag von ORFV2-VEGF oder NZ10 zu viralen Läsionen
Es erscheint wahrscheinlich, dass die biologischen Aktivitäten von ORFV2-VEGF oder NZ10 zum proliferativen und hochvaskulären Charakter von ORF-viralen Läsionen beitragen. Dies wird durch die kürzlich erfolgte Analyse eines rekombinanten ORF-Virus gestützt, in dem das für ORFV2-VEGF codierende Gen entfernt worden war. Vergleiche von Läsionen, die aus Infektionen bei Schafen durch Wildtyp- und rekombinanten ORFV2-VEGF-defizienten ORF-Virus resultieren, zeigen, dass bei Läsionen der Haut in Abwesenheit von ORFV2-VEGF signifikant weniger Gefäße gebildet werden.
Die Identifikation eines viralen VEGF-Proteins, das in der Lage ist, zur Unterstützung der viralen Infektion Säuger-VEGF-Rezeptoren zu zerrütten, zeigt auch die Möglichkeit auf, dass andere Viren auf gleiche Art und Weise arbeiten können.
Die obige Beschreibung und die obigen Beispiele dienen lediglich Demonstrationszwecken und sollen die Erfindung nicht beschränken. Da dem Fachmann Modifikationen der offenbarten erfindungsgemäßen Ausführungsformen geläufig sind, sollte die Erfindung breit ausgelegt werden und alle Variationen, die im Umfang der angehängten Ansprüche und Äquivalente enthalten sind, umfassen.
Sequenzprotokoll

Claims

In vitro-Verfahren zur Stimulation der Proliferation von Endothel- oder Mesodermzellen, welches den Schritt umfasst, diese Endothelzellen einer zur Stimulation der Proliferation von Endothel- oder Mesodermzellen wirksamen Menge eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11 auszusetzen.
In vitro-Verfahren zur Aktivierung des VEGF-Rezeptors 2, welches den Schritt umfasst, Zellen, die diesen Rezeptor tragen, einer zur Aktivierung des Rezeptors wirksamen Menge eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11 auszusetzen.
In vitro-Verfahren zur spezifischen Aktivierung des VEGF-Rezeptors 2, welches den Schritt umfasst, Zellen, die diesen Rezeptor tragen, einer zur Aktivierung des Rezeptors wirksamen Menge eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11 auszusetzen.
In vitro-Verfahren nach Anspruch 3, wobei der VEGF-Rezeptor 1 nicht aktiviert wird.
Wirtszelle, die mit einem Vektor transformiert oder transfiziert ist, welcher eine Nukleinsäuresequenz enthält, die funktionsfähig mit einer Promotorsequenz verknüpft ist, wobei diese Nukleinsäuresequenz aus der Sequenz der SEQ ID NO: 10 oder einem Polynukleotid, das wenigstens 95% Identität zur Sequenz der SEQ ID NO: 10 besitzt, besteht und wobei diese Nukleinsäuresequenz für ein Polypeptid codiert, welches die Eigenschaft besitzt, die Proliferation von Endothelzellen zu fördern.
Wirtszelle nach Anspruch 5, wobei diese Wirtszelle ein Polypeptid exprimiert, das die Eigenschaft besitzt, die Proliferation von Endothelzellen zu fördern, indem es spezifisch an einen VEGF-Rezeptor 2 bindet.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 5 oder 6, wobei diese Wirtszelle eine eukaryotische Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 7, wobei diese Wirtszelle eine COS-Zelle oder eine 293-EBNA-Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 5, wobei die Wirtszelle eine prokaryotische Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 5, wobei die Wirtszelle eine Insektenzelle ist.
Diagnostisches Testkit auf Infektion mit dem ORF-Virus in Schafen, Ziegen und Menschen, welches einen Antikörper gegen ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11 und Mittel zum Nachweis der Bindung an diesen Antikörper umfasst.
Isoliertes Polypeptiddimer, welches ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11 umfasst.
Isoliertes Polypeptiddimer nach Anspruch 12, wobei dieses Polypeptiddimer ein Homodimer dieses Polypeptids ist.
Isoliertes Polypeptiddimer nach Anspruch 12, wobei dieses Polypeptiddimer ein Heterodimer dieses Polypeptids und wenigstens eines weiteren Wachstumsfaktors ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PlGF und ORFV2-VEGF.
Isoliertes Polypeptiddimer nach irgendeinem der Ansprüche 12–14, wobei dieses Polypeptiddimer ein disulfid-verbrücktes Dimer ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11 und wenigstens einen weiteren Wachstumsfaktor umfasst, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus VEGF, VEGF-B, VEGF-C VEGF-D, PlGF, NZ10-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11 und ORFV2-VEGF.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 16, welche ferner Heparin umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine zur Förderung der Proliferation von Endothelzellen oder Mesodermzellen wirksame Menge eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11 und wenigstens einen pharmazeutischen Trägerstoff oder ein pharmazeutisches Verdünnungsmittel umfasst.
ORF-VEGF-ähnlicher Polypeptidantagonist mit der Fähigkeit, die Wirkung eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11 zu inhibieren, wobei der Antagonist ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) Antikörpern gegen dieses Polypeptid; ii) einem isolierten Polypeptid, das eine Sequenz von Aminosäuren umfasst, die wenigstens 85% Identität zur Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11 besitzt, wobei diese Polypeptide die Fähigkeit besitzen, an ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11 zu binden; und iii) antisense-Nukleotidsequenzen, die dazu fähig sind, die Expression dieses Polypeptids zu inhibieren.
ORF-VEGF-ähnlicher Polypeptidantagonist nach Anspruch 19, wobei dieser Antagonist ein Antikörper ist, der spezifisch mit einem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11 reagiert.
Antikörper nach Anspruch 20, wobei dieser Antikörper ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe: einem polyklonalen Antikörper; einem monoklonalen Antikörper; einem Antikörper, der mit einem nachweisbaren Marker markiert ist; einem Antikörper mit einem nachweisbarem Marker, welcher ein radioaktives Isotop ist.
ORF-VEGF-ähnlicher Polypeptidantagonist nach Anspruch 19, wobei dieser Antagonist eine antisense-Nukleotidsequenz ist, die zu wenigstens einem Teil der Nukleotidsequenz, die für das NZ10-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11 codiert, oder zu der Promotorregion von NZ10 komplementär ist und die Expression von NZ10 inhibieren oder abschwächen kann.
Isolierter Komplex aus einem NZ10-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11 und dem VEGF-Rezeptor 2.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: i) Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem Vektor transformiert oder transfiziert ist, welcher eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für dieses Polypeptid codiert und in einer Weise funktionsfähig mit einer Promotorsequenz verknüpft ist, so dass die Nukleinsäuresequenz, die für dieses Polypeptid codiert, exprimiert wird; und ii) Isolieren dieses Polypeptids aus dieser Wirtszelle oder aus einem Kulturmedium, in welchem diese Wirtszelle kultiviert wird.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches eine Polynukleotidsequenz umfasst, die wenigstens 95% Identität zur Sequenz der SEQ ID NO: 10 besitzt, und wobei dieses Nukleinsäuremolekül für ein Polypeptid codiert, welches die Eigenschaft besitzt, die Proliferation von Endothelzellen zu fördern.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptidmolekül codiert, welches eine Aminosäuresequenz, die wenigstens 95% Identität zur Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11 besitzt, oder ein Fragment davon, welches die biologische Aktivität des NZ10-Polypeptids mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11 besitzt, umfasst.
Vektor, welcher eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 25 oder 26 umfasst, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einer Promotorsequenz verknüpft ist.
Verfahren zur Herstellung eines Vektors, welcher ein Polypeptid exprimiert, das eine Aminosäuresäuresequenz, die wenigstens 95% Identität zur Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11 besitzt, oder ein Fragment davon, welches die biologisches Aktivität des NZ10-Polypeptids mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11 besitzt, umfasst, und wobei dieses Verfahren umfasst, eine isolierte Nukleinsäure gemäß Anspruch 26 oder 27 unter funktionsfähiger Verknüpfung mit einem Promotor in diesen Vektor einzubauen.
Isoliertes Polypeptid, welches wenigstens 95% Identität zur Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11 besitzt, oder ein Fragment davon, welches die biologische Aktivität des NZ10-Polypeptids mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11 besitzt.
Isoliertes Polypeptid, das durch Expression eines Polynukleotids hergestellt wurde, welches die Polynukleotidsequenz, die wenigstens 95% Identität zur SEQ ID NO: 10 besitzt, umfasst, wobei dieses Polypeptid die Eigenschaft besitzt, die Proliferation von Endothelzellen zu fördern.
Mittel zur Amplifikation eines Polynukleotids gemäß Anspruch 25 in einer Testprobe, wobei diese Mittel wenigstens ein Primerpaar umfassen, welches zu einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 26 komplementär ist.
Verwendung eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11 zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulation der Proliferation von Endothel- oder Mesodermzellen.
Verwendung eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11 und wenigstens eines weiteren Wachstumsfaktors, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PlGF, NZ10-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 11 und ORFV2-VEGF, zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulation der Proliferation von Endothel- oder Mesodermzellen.
Verwendung eines Antagonisten gemäß Anspruch 19 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von pustulärer Dermatitis.
Verwendung nach Anspruch 34, wobei der Antagonist wie in Anspruch 22 definiert ist.
Verwendung eines ORF-VEGF-ähnlichen Polypeptidantagonisten, wie er in irgendeinem der Ansprüche 19 bis 22 definiert ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung von Angiogenese und/oder Neovaskularisation in einem Säuger.