DE60107815T2

DE60107815T2 - Methode zur behandlung von tumoren welche den vaskulären endothelialen wachstumsfaktor d exprimieren

Info

Publication number: DE60107815T2
Application number: DE60107815T
Authority: DE
Inventors: Marc Achen; Steven Stacker
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Priority date: 2000-03-02
Filing date: 2001-03-02
Publication date: 2005-12-08
Anticipated expiration: 2021-03-03
Also published as: WO2001064235A1; PT1259248E; KR20020080461A; ATE284701T1; CA2401665A1; US20010038842A1; NZ520546A; EP1259248A4; JP2003525248A; ES2377119T3; ES2234818T3; DE60107815D1; EP1259248A1; EP1259248B1; AU4194601A; ATE533056T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft allgemein Medikamente zur Behandlung und Linderung verschiedener Krebsarten.
Die zwei Hauptkomponenten des Gefäßsystems von Säugern sind die Endothelzellen und die glatten Muskelzellen. Die Endothelzellen bilden die Auskleidung der Innenseite aller Blutgefäße und Lymphgefäße im Säuger. Die Bildung neuer Blutgefäße kann nach zwei unterschiedlichen Prozessen erfolgen, Vaskulogenese oder Angiogenese (für einen Überblick siehe Risau, W., Nature 386: 671–674, 1997). Vaskulogenese ist durch die in situ-Differenzierung von Endothelzellvorläufern zu reifen Endothelzellen und durch Assoziation dieser Zellen unter Bildung von Gefäßen gekennzeichnet, wie sie bei der Bildung des primären Gefäßplexus im frühen Embryo erfolgt. Im Gegensatz dazu ist die Angiogenese, die Bildung von Blutgefäßen durch Wachstum und Verzweigung bereits existierender Gefäße, bei der späteren Embryogenese von Bedeutung und ist verantwortlich für das Wachstum der Blutgefäße beim Erwachsenen. Angiogenese ist ein physiologisch komplexer Prozess, der Proliferation von Endothelzellen, Abbau extrazellulärer Matrix, Verzweigung von Gefäßen und anschließende Vorgänge bei der Zelladhäsion beinhaltet. Beim Erwachsenen ist die Angiogenese streng reguliert und unter normalen Umständen auf das weibliche Fortpflanzungssystem beschränkt. Angiogenese kann jedoch auch als Antwort auf Gewebeschädigung angeschaltet werden. Von Bedeutung ist, daß solide Tumore in der Lage sind, im umliegenden Gewebe Angiogenese zu induzieren, so daß das Tumorwachstum unterhalten und die Bildung von Metastasen erleichtert wird (Folkman, J., Nature Med. 1: 27–31, 1995). Die molekularen Mechanismen, die den komplexen angiogenen Prozessen zugrunde liegen, sind bei weitem noch nicht verstanden.
Angiogenese ist auch bei einer Reihe pathologischer Zustände beteiligt, bei denen sie eine Rolle spielt oder direkt an verschiedenen Folgezuständen der Erkrankung beteiligt ist. Einige Beispiele umfassen die mit verschiedenen Lebererkrankungen assoziierte Neovaskularisation, neovaskuläre Folgeerscheinungen von Diabetes, neovaskuläre Folgezustände von Bluthochdruck, Posttrauma-Neovaskularisation, Neovaskularisation als Folge von Kopftrauma, Neovaskularisation bei chronischer Leberinfektion (z. B. chronischer Hepatitis), Neovaskularisation als Folge von Hitze- oder Kältetrauma, Dysfunktion in Verbindung mit Hormonüberschuß, Bildung von Hämangiomen und Restenose nach Angioplastie.
Wegen der entscheidenden Rolle der Angiogenese bei so vielen physiologischen und pathologischen Prozessen wurden Faktoren, die an der Regulation der Angiogenese beteiligt sind, intensiv untersucht. Von einer Reihe von Wachstumsfaktoren wurde gezeigt, daß sie an der Regulation der Angiogenese beteiligt sind; diese umfassen Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGFs), Plättchenwachstumsfaktor (Platelet-Derived Growth Factor, PDGF), transformierenden Wachstumsfaktor alpha (TGFα) und Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF). Für einen Überblick siehe beispielsweise Folkman et al., J. Biol. Chem., 267: 10931-10934, 1992.
Es wurde vermutet, daß in erster Linie eine bestimmte Familie endothelzellspezifischer Wachstumsfaktoren, die vaskuloendothelialen Wachstumsfaktoren (VEGFs) und ihre entsprechenden Rezeptoren, für die Stimulierung von Endothelzellwachstum und -differenzierung und für bestimmte Funktionen der differenzierten Zellen verantwortlich sind. Diese Faktoren sind Mitglieder der PDGF/VEGF-Familie und scheinen in erster Linie über endotheliale Rezeptor-tyrosinkinasen (RTKs) zu wirken. Die PDGF/VEGF-Familie der Wachstumsfaktoren gehört zur Cystinknoten-Superfamilie von Wachstumsfaktoren, die auch die Neurotrophine und den transformierenden Wachstumsfaktor β umfaßt.
In der PDGF/VEGF-Familie wurden acht verschiedene Proteine identifiziert, nämlich zwei PDGFs (A und B), VEGF und fünf Mitglieder, die mit VEGF eng verwandt sind. Diese fünf eng mit VEGF verwandten Mitglieder sind: VEGF-B, beschrieben in der Internationalen Patentanmeldung PCT/US96/02957 (WO 96/26736) und in den US-Patenten 5,840,693 und 5,607,918 von Ludwig Institute for Cancer Research und The University of Helsinki; VEGF-C oder VEGF2, beschrieben bei Joukov et al., EMBO J., 15: 290–298, 1996, Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 1988–1992, 1996 und in den US-Patenten 5,932,540 und 5,935,540 von Human Genome Sciences, Inc; VEGF-D, beschrieben in der Internationalen Patentanmeldung PCT/US97/14696 (WO 98/07832) und bei Achen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 548–553, 1998; der Plazentawachstumsfaktor (PlGF), beschrieben bei Maglione et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9267–9271, 1991; und VEGF3, beschrieben in der Internationalen Patentanmeldung PCT/US95/07283 (WO 96/39421) von Human Genome Sciences, Inc. Jedes Mitglied der VEGF-Familie weist zwischen 30 und 45 % Aminosäuresequenzidentität mit VEGF auf. Die Mitglieder der VEGF-Familie haben eine VEGF-Homologiedomäne gemeinsam, die die sechs Cysteinreste enthält, die das Cystinknotenmotiv bilden. Funktionelle Eigenschaften der VEGF-Familie beinhalten verschiedene Mitogenitätsgrade für Endothelzellen, Induktion vaskulärer Permeabilität und angiogene und lymphangiogene Eigenschaften.
Der vaskuloendotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) ist ein homodimeres Glykoprotein, das aus verschiedenen Quellen isoliert wurde. Alternatives mRNA-Splicing eines einzigen VEGF-Gens führt zu fünf VEGF-Isoformen. VEGF zeigt hochspezifische mitogene Aktivität für Endothelzellen. VEGF hat wichtige Regulationsfunktionen bei der Bildung neuer Blutgefäße bei der embryonalen Vaskulogenese und bei der Angiogenese im Erwachsenenalter (Carmeliet et al., Nature, 380: 435–439, 1996; Ferrara et al., Nature, 380: 439–442, 1996; Übersichtsartikel von Ferrara und Davis-Smyth, Endocrine Rev., 18: 4–25, 1997). Die Bedeutung der Rolle von VEGF wurde in Studien demonstriert, die zeigen, daß die Inaktivierung eines einzigen VEGF-Allels wegen der fehlenden Entwicklung des Gefäßsystems zu embryonaler Letalität führt (Carmeliet et al., Nature, 380: 435–439, 1996; Ferrara et al., Nature, 380: 439–442, 1996). Die Isolierung und die Eigenschaften von VEGF wurden in Übersichtsartikeln beschrieben; siehe Ferrara et al., J. Cellular Biochem., 47: 211–218, 1991 und Connolly, J. Cellular Biochem., 47: 219–223, 1991.
Ferner zeigt VEGF eine starke chemoattraktive Wirkung auf Monozyten, kann den Plasminogenaktivator und den Plasminogenaktivator-Inhibitor in Endothelzellen induzieren und kann ferner mikrovaskuläre Permeabilität induzieren. Wegen der letztgenannten Aktivität wird er manchmal als vaskulärer Permeabilitätsfaktor (VPF) bezeichnet. VEGF ist auch für bestimmte hämatopoetische Zellen chemotaktisch. Die jüngere Literatur zeigt, daß VEGF die Reifung dendritischer Zellen blockiert und dadurch die Wirksamkeit der Immunantwort auf Tumoren reduziert (viele Tumore sekretieren VEGF) (Gabrilovich et al., Blood, 92: 4150–4166, 1998; Gabrilovich et al., Clinical Cancer Research, 5: 2963–2970, 1999).
VEGF-B hat ähnliche angiogene und andere Eigenschaften wie VEGF, ist aber in den Geweben anders als VEGF verteilt und wird anders exprimiert. Insbesondere wird VEGF-B im Herz sehr stark und in der Lunge nur schwach exprimiert, während für VEGF das Gegenteil der Fall ist. Dies läßt vermuten, daß VEGF und VEGF-B trotz der Tatsache, daß sie in vielen Geweben gemeinsam exprimiert werden, funktionelle Unterschiede haben könnten.
VEGF-B wurde mit einer Hefe-Cohybrid-Interaction-Trap-Screeningmethode isoliert, indem auf zelluläre Proteine gescreent wurde, die mit zellulärem Retinsäure-Bindungsprotein I (CRABP-I) in Wechselwirkung treten könnten. Seine Isolierung und seine Eigenschaften sind in der PCT/US96/02957 (WO 96/26736) und in den US-Patenten 5,840,693 und 5,607,918 von Ludwig Institute for Cancer Research und The University of Helsinki und bei Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 2576–2581, 1996 ausführlich beschrieben.
VEGF-C wurde aus konditionierten Medien der PC-3-Prostataadenokarzinom-Zellinie (CRL1435) isoliert, indem auf die Fähigkeit des Mediums gescreent wurde, eine Tyrosinphosphorylierung der endothelzellspezifischen Rezeptortyrosinkinase VEGFR-3 (Flt4) zu herbeizuführen, wobei zellen verwendet wurden, die so transfiziert waren, daß sie VEGFR-3 exprimierten. VEGF-C wurde durch Affinitätschromatographie mit rekombinantem VEGFR-3 gereinigt und wurde aus einer PC-3-cDNA-Genbank kloniert. Seine Isolierung und seine Eigenschaften sind bei Joukov et al., EMBO J., 15: 290–298, 1996 ausführlich beschrieben.
VEGF-D wurde aus einer von Clontech kommerziell erhältlichen cDNA-Genbank humaner Brust isoliert, indem mit einem "Expressed Sequence Tag" als Hybridisierungssonde gescreent wurde, das aus einer humanen cDNA-Genbank mit der Bezeichnung "Soares Breast 3NbHBst" erhalten worden war (Achen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 548–553, 1998). Seine Isolierung und seine Eigenschaften sind in der Internationalen Patentanmeldung PCT/US97/14696 (WO98/07832) ausführlich beschrieben.
In der PCT/US97/14696 wird auch die Isolierung eines biologisch aktiven VEGF-D-Fragments mit der Bezeichnung VEGF-D ΔNΔC beschrieben. Dieses Fragment besteht aus den Aminosäureresten 93 bis 201 von VEGF-D, die an das Affinitäts-Tag-Peptid FLAG^® gekoppelt sind. Auf die gesamte Offenbarung der Internationalen Patentanmeldung PCT/US97/14696 (WO 98/07832) wird hier vollinhaltlich Bezug genommen.
Das VEGF-D-Gen wird im adulten Menschen weitverbreitet exprimiert, wird aber sicherlich nicht ubiquitär exprimiert. VEGF-D wird stark im Herz, in der Lunge und im Skelettmuskel exprimiert. Intermediäre VEGF-D-Spiegel werden in der Milz, den Ovarien, im Dünndarm und im Kolon exprimiert, und eine geringere Expression erfolgt in Niere, Pankreas, Thymus, Prostata und Hoden. Keine VEGF-D-mRNA wurde in RNA aus Hirn, Plazenta, Leber oder peripheren Blutleukozyten nachgewiesen.
PlGF wurde aus einer cDNA-Genbank von Plazenta zum Geburtstermin isoliert. Seine Isolierung und seine Eigenschaften sind bei Maglione et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9267–9271, 1991 ausführlich beschrieben. Seine biologische Funktion wird zur Zeit noch nicht richtig verstanden.
VEGF3 wurde aus einer cDNA-Genbank isoliert, die aus Kolongewebe stammte. Von VEGF3 wird festgestellt, er habe etwa 36 % Identität und 66 % Ähnlichkeit mit VEGF. Das Verfahren der Isolierung des für VEGF3 codierenden Gens bleibt unklar und es wird keine Charakterisierung der biologischen Aktivität offenbart.
Die Ähnlichkeit zwischen zwei Proteinen wird bestimmt, indem die Aminosäuresequenz und die konservierten Aminosäuresubstitutionen des einen Proteins mit der Sequenz des zweiten Proteins verglichen werden, wogegen die Identität bestimmt wird, ohne die konservierten Aminosäuresubstitutionen einzuschließen.
Eine Hauptfunktion des lymphatischen Systems ist es, für einen Flüssigkeitsrückfluß aus den Geweben zu sorgen und viele extravaskuläre Substanzen zurück ins Blut zu transportieren. Während des Reifeprozesses verlassen Lymphozyten ferner das Blut, wandern durch lymphoide Organe und andere Gewebe und treten in die Lymphgefäße ein und kehren durch den Milchbrustgang ins Blut zurück. Spezialisierte Venolen, "High Endothelial Venules" (HEVs), binden Lymphozyten wieder und veranlassen ihre Extravasation ins Gewebe. Die Lymphgefäße, und insbesondere die Lymphknoten, spielen also eine wichtige Rolle bei der Immunologie und bei der Entwicklung von Metastasen verschiedener Tumore. Anders als bei Blutgefäßen ist der embryonale Ursprung des lymphatischen Systems nicht so klar und für seinen Ursprung gibt es wenigstens drei verschiedene Theorien. Lymphgefäße sind wegen des Fehlens bekannter spezifischer Marker für sie schwer zu identifizieren.
Lymphgefäße werden in aller Regel mit Hilfe einer Lymphographie untersucht. Bei der Lymphographie wird Röntgenkontrastmittel direkt in ein Lymphgefäß injiziert. Das Kontrastmittel verteilt sich über die nach außen führenden Drainagegefäße des lymphatischen Systems und sammelt sich in den Lymphknoten. Das Kontrastmittel kann bis zu einem halben Jahr in den Lymphknoten bleiben, und während dieser Zeit ermöglichen Röntgenanalysen das Follow-up von Lymphknotengröße und -architektur. Diese Diagnostik ist besonders bei Krebspatienten mit Metastasen in den Lymphknoten und bei malignen lymphatischen Erkrankungen wie Lymphomen von Bedeutung. Zur Abbildung lymphatischer Gewebe benötigt die Fachwelt jedoch noch bessere Materialien und Verfahren.
Wie oben angemerkt funguieren die Mitglieder der PDGF/VEGF-Familie in erster Linie durch Bindung an Rezeptortyrosinkinasen. Im allgemeinen sind Rezeptortyrosinkinasen Glykoproteine, die aus einer extrazellulären Domäne, die in der Lage ist, (einen) spezifische(n) Wachstumsfaktor(en) zu binden, einer Transmembrandomäne, bei der es sich üblicherweise um einen alpha-helikalen Teil des Proteins handelt, einer Juxtamembrandomäne, wo der Rezeptor, z. B. durch Proteinphosphorylierung, reguliert werden kann, einer Tyrosinkinasedomäne, die die Enzymkomponente des Rezeptors ist, und einem carboxyterminalen Schwanz, der bei vielen Rezeptoren an der Erkennung und Bindung der Substrate für die Tyrosinkinase beteiligt ist, bestehen.
Es wurden fünf endothelzellspezifische Rezeptortyrosinkinasen identifiziert, nämlich VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR/Flk-1), VEGFR-3 (Flt4), Tie und Tek/Tie-2. Diese Rezeptoren unterscheiden sich in ihrer Spezifität und Affinität. Sie haben alle die intrinsische Tyrosinkinaseaktivität, die zur Signaltransduktion notwendig ist.
Die einzigen Rezeptortyrosinkinasen, von denen bekannt ist, daß sie VEGFs binden, sind VEGFR-1, VEGFR-2 und VEGFR-3. VEGFR-1 und VEGFR-2 binden VEGF mit hoher Affinität und VEGFR-1 bindet auch VEGF-B und PlGF. Es wurde gezeigt, daß VEGF-C der Ligand für VEGFR-3 ist, und er aktiviert auch VEGFR-2 (Joukov et al., The Embo Journal, 15: 290–298, 1996). VEGF-D bindet sowohl an VEGFR-2 als auch an VEGFR-3 (Achen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 548–553, 1998). Ein Ligand für Tek/Tie-2 wurde in der Internationalen Patentanmeldung PCT/US95/12935 (WO 96/11269) von Regeneron Pharmaceuticals, Inc. beschrieben. Der Ligand für Tie wurde noch nicht identifiziert.
Kürzlich wurde ein neuer, für eine VEGF-Isoform spezifischer 130–135 kDa-Rezeptor gereinigt und kloniert (Soker et al., Cell, 92: 735–745, 1998). Es wurde gefunden, daß der VEGF-Rezeptor über die von Exon 7 codierte Sequenz, die schwache Affinität für Heparin zeigt, spezifisch die VEGF₁₆₅-Isoform bindet (Soker et al., Cell, 92: 735–745, 1998). Überraschend wurde gezeigt, daß der Rezeptor mit humanem Neuropilin-1 (NP-1) identisch ist, einem Rezeptor, der an der Neuromorphogenese im frühen Stadium beteiligt ist. PlGF-2 scheint ebenfalls mit NP-1 in Wechselwirkung zu treten (Migdal et al., J. Biol. Chem., 273: 22272–22278, 1998).
VEGFR-1, VEGFR-2 und VEGFR-3 werden von Endothelzellen unterschiedlich exprimiert. Allgemein werden sowohl VEGFR-1 als auch VEGFR-2 im Blutgefäßendothel exprimiert (Oelrichs et al., Oncogene, 8: 11–18, 1992; Kaipainen et al., J. Exp. Med., 178: 2077–2088, 1993; Dumont et al., Dev. Dyn., 203: 80–92, 1995; Fong et al., Dev. Dyn., 207: 1–10, 1996) und VEGFR-3 wird hauptsächlich im Lymphendothel adulter Gewebe exprimiert (Kaipainen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9: 3566–3570, 1995). VEGFR-3 wird auch im Blutgefäßsystem exprimiert, das Tumoren umgibt.
Obwohl VEGFR-1 hauptsächlich in Endothelzellen während der Entwicklung exprimiert wird, ist es auch in hämatopoetischen Precursorzellen in den frühen Stadien der Embryogenese zu finden (Fong et al., Nature, 376: 66–70, 1995). Bei Erwachsenen exprimieren auch Monozyten und Makrophagen diesen Rezeptor (Barleon et al., Blood, 87: 3336–3343, 1995). Bei Embryos wird VEGFR-1 von den meisten, wenn nicht sogar allen Gefäßen exprimiert (Breier et al., Dev. Dyn., 204: 228–239, 1995; Fong et al., Dev. Dyn., 207: 1–10, 1996).
Der Rezeptor VEGFR-3 wird während der frühen embryonalen Entwicklung weitverbreitet auf Endothelzellen exprimiert, beschränkt sich aber bei fortschreitender Embryogenese auf Venenendothel und dann auf Lymphendothel (Kaipainen et al., Cancer Res., 54: 6571–6577, 1994; Kaipainen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 3566–3570, 1995). VEGFR-3 wird in adulten Geweben auf Lymphendothelzellen exprimiert. Dieser Rezeptor ist für die Gefäßentwicklung während der Embryogenese wesentlich.
Die wesentliche, spezifische Rolle von VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, Tie und Tek/Tie-2 bei Vaskulogenese, Angiogenese und/oder Lymphangiogenese wurde durch gezielte Mutationen demonstriert, die diese Rezeptoren in Mäuseembryos inaktivieren. Zerstörung der VEGFR-Gene führt zu einer aberranten Entwicklung des Gefäßsystems, was zu embryonaler Letalität etwa im mittleren Abschnitt der Trächtigkeit führt. Die Analyse von Embryos, die ein vollständig inaktiviertes VEGFR-1-Gen tragen, läßt vermuten, daß dieser Rezeptor zur funktionellen Organisation des Endothels erforderlich ist (Fong et al., Nature, 376: 66–70, 1995). Deletion der intrazellulären Tyrosinkinasedomäne von VEGFR-1 führt jedoch zu lebensfähigen Mäusen mit einer normalen Gefäßstruktur (Hiratsuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 9349–9354, 1998). Die Gründe für diese Unterschiede sind noch aufzuklären, zu vermuten ist aber, daß eine Rezeptorsignalgebung über die Tyrosinkinase für die korrekte Funktion von VEGFR-1 nicht erforderlich ist. Die Analyse von homozygoten Mäusen mit inaktivierten Allelen von VEGFR-2 läßt vermuten, daß dieser Rezeptor zur Proliferation von Endothelzellen, zur Hämatopoese und zur Vaskulogense erforderlich ist (Shalaby et al., Nature, 376: 62–66, 1995; Shalaby et al., Cell, 89: 981–990, 1997). Gezielte Inaktivierung beider Kopien des VEGFR-3-Gens in Mäusen führte zu einer fehlerhaften Bildung von Blutgefäßen, die durch anomal organisierte große Gefäße mit defekten Lumina gekennzeichnet ist, was zu Flüssigkeitsakkumulation in der Herzbeutelhöhle und zu Herzgefäßversagen an Tag 9,5 postkoital führt (Dumont et al., Science, 282: 946–949, 1998). Auf Grundlage dieser Beobachtungen wurde vorgeschlagen, daß VEGFR-3 für die Reifung des primären Gefäßnetzes zu größeren Blutgefäßen erforderlich ist. Die Rolle von VEGFR-3 bei der Entwicklung des lymphatischen Gefäßsystems konnte bei diesen Mäusen jedoch nicht untersucht werden, weil die Embryos starben, bevor sich das lymphatische System ausgebildet hatte. Angesichts seiner spezifischen Expression in Lymphendothelzellen bei der Embryogenese und im Erwachsenenalter wird nichtsdestoweniger angenommen, daß VEGFR-3 eine Rolle bei der Entwicklung des lymphatischen Gefäßsystems und der Lymphangiogenese spielt. Dies wird durch die Beobachtung gestützt, daß ektopische Expression von VEGF-C, einem Liganden für VEGFR-3, in der Haut transgener Mäuse zur Proliferation von Lymphendothelzellen und zur Gefäßvergrößerung in der Dermis führte. Außerdem läßt dies vermuten, daß VEGF-C im Lymphendothel eine Primärfunktion und bei Angiogenese und Permeabilitätsregulation eine Sekundärfunktion haben könnte, die mit VEGF geteilt wird (Joukov et al., EMBO J., 15: 290–298, 1996).
Ferner wurden VEGF-ähnliche Proteine identifiziert, die von vier verschiedenen Stämmen des Orf-Virus codiert werden. Dies ist das erste Virus, von dem beschrieben wird, daß es für ein VEGF-ähnliches Protein codiert. Die ersten beiden Stämme sind NZ2 und NZ7, die bei Lyttle et al., J. Virol., 68: 84–92, 1994 beschrieben werden. Ein dritter ist D1701, der bei Meyer et al., EMBO J., 18: 363–374, 1999 beschrieben wird. Der vierte Stamm ist NZ10, der in der Internationalen Patentanmeldung PCT/US99/25869 beschrieben wird. Es wurde gezeigt, daß diese viralen VEGF-ähnlichen Proteine an VEGFR-2 auf dem Endothel des Wirts bindet (Schaf/Ziege/Mensch), und diese Bindung ist für die Entwicklung der Infektion wichtig (Meyer et al., EMBO J., 18: 363–374, 1999; Ogawa et al., J. Biol. Chem., 273: 31273-31282, 1988; und Internationale Patentanmeldung PCT/US99/25869). Diese Proteine zeigen eine Ähnlichkeit in der Aminosäuresequenz gegenüber VEGF und untereinander.
Das Orf-Virus ist eine Speziesart der Gattung Parapoxvirus, die bei Schafen und Ziegen eine hochansteckende pustuläre Dermatitis verursacht und leicht auf Menschen übertragbar ist. Die durch eine Orf-Virus-Infektion induzierte pustuläre Dermatitis ist durch eine Erweiterung der Blutgefäße, ein Anschwellen des lokalen Bereichs und eine deutliche Proliferation von Endothelzellen gekennzeichnet, die die Blutgefäße auskleiden. Diese Merkmale sind bei allen Spezies zu sehen, die mit Orf infiziert sind, und können aufgrund der Virusreplikation in Epidermiszellen zur Bildung eines tumorähnlichen Wachstums oder Knötchen führen. Im allgemeinen heilen Orf-Virus-Infektionen innerhalb weniger Wochen ab, aber bei immunbeeinträchtigten Individuen sind schwere Infektionen zu beobachten, die ohne chirurgischen Eingriff nicht abheilen.
Es besteht ein enormes Interesse an der Entwicklung von pharmakologischen Mitteln, die die rezeptorvermittelten Wirkungen von VEGFs antagonisieren könnten (Martiny-Baron und Marme, Curr. Opin. Biotechnol., 6: 675–680, 1995). Es wurde gezeigt, daß monoklonale Antikörper gegen VEGF das Tumorwachstum in vivo supprimieren, indem sie die tumorassoziierte Angiogenese inhibieren (Kim et al., Nature, 362: 841–844, 1993). Ähnliche inhibitorische Wirkungen auf das Tumorwachstum, die entweder von der Expression einer Antisense-RNA für VEGF (Saleh et al., Cancer Res., 56: 393–401, 1996) oder einer dominant-negativen VEGFR-2-Mutante (Millauer et al., Nature, 367: 576–579, 1994) herrührten, wurden in Modellsystemen beobachtet.
Tumorinhibierungsstudien mit neutralisierenden Antikörpern ließen jedoch vermuten, daß außer VEGF noch andere angiogene Faktoren beteiligt sein könnten (Kim, K. et al., Nature, 362: 841–844, 1993). Außerdem wird die Aktivität anderer angiogener Faktoren als VEGF bei malignem Melanom durch die Beobachtung nahegelegt, daß nicht alle Melanome VEGF exprimieren (Issa, R. et al., Lab. Invest., 79: 417–425, 1999).
Die biologischen Funktionen der verschiedenen Mitglieder der VEGF-Familie werden zur Zeit untersucht. Von besonderem Interesse sind die Eigenschaften von VEGF-D und VEGF-C. Diese Proteine binden sowohl VEGFR-2 als auch VEGFR-3 – lokalisiert auf vaskulären bzw. Lymphendothelzellen – und sind in ihrer Primärstruktur eng verwandt (48 % Aminosäureidentität). Beide Faktoren sind in vitro für Endothelzellen mitogen. Kürzlich wurde gezeigt, daß VEGF-C im Mäuse-Corneamodell und bei der Chorioallantoismembran von Vögeln angiogen ist (Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 14389–14394, 1998) und in der Lage war, beim Setting von Gewebeischämie Angiogenese zu induzieren (Witzenbichler et al., Am. J. Pathol., 153: 381–394, 1998). Außerdem stimulierte VEGF-C Lymphangiogenese in der Chorioallantoismembran von Vögeln (Oh et al., Dev. Biol., 188: 96–109, 1997) und in einem Modell einer transgenen Maus (Jeltsch et al., Science, 276: 1423–1425, 1997). Es wurde gezeigt, daß VEGF-D in der Kaninchencornea angiogen ist (Marconcini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 9671–7976). Die lymphangiogene Kapazität von VEGF-D wurde noch nicht berichtet, in Anbetracht dessen, daß VEGF-D, wie VEGF-C, VEGFR-3, einen Rezeptor, von dem man annimmt, daß er ein Signal für die Lymphangiogenese gibt (Taipale et al., Cur. Topics Micro. Immunol., 237: 85–96, 1999), bindet und aktiviert, ist es sehr wahrscheinlich, daß VEGF-D lymphangiogen ist. VEGF-D und VEGF-C können für die Malignität von Tumoren von besonderer Bedeutung sein, da sich Metastasen entweder über Blutgefäße oder Lymphgefäße ausbreiten können; daher könnten Moleküle, die Angiogenese oder Lymphangiogenese stimulieren, zur Malignität beitragen. Es wurde bereits gezeigt, daß dies für VEGF der Fall ist. Es ist bemerkenswert, daß die Expression des VEGF-D-Gens durch c-Fos induziert wird, einen Transkriptionsfaktor, von dem bekannt ist, daß er für die Malignität von Bedeutung ist (Orlandini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 11675–11680, 1996). Es wird spekuliert, daß der Mechanismus, nach dem c-Fos zur Malignität beiträgt, die Hochregulation von Genen ist, die angiogene Faktoren codieren. Tumorzellen, denen c-Fos fehlt, können keine maligne Progression durchlaufen, möglicherweise weil sie nicht in der Lage sind, Angiogenese zu induzieren (Saez, E. et al., Cell, 82: 721–732, 1995). Dies weist auf die Existenz eines während der Tumorprogression durch c-Fos hochregulierten angiogenen Faktors hin.
Wie in 1 gezeigt, ist die überwiegende intrazelluläre Form von VEGF-D ein homodimeres Propeptid, das aus der VEGF/PDGF-Homologiedomäne (VHD) und den N- und C-terminalen Propeptiden besteht und die Sequenz der SEQ ID NO: 2 besitzt. Nach Sekretion wird dieses Polypeptid proteolytisch gespalten (Stacker, S.A. et al., J. Biol. Chem., 274: 32127–32136, 1999). Proteolytische Prozessierung (an den durch schwarze Pfeilspitzen gekennzeichneten Positionen) führt zu partiell prozessierten Formen und einer vollständig prozessierten reifen Form, die aus Dimeren der VHD besteht. Die VHD, die die Sequenz der SEQ ID NO: 3 besitzt (d. h. Reste 93 bis 201 des vollständigen VEGF-D), enthält die Bindungsstellen sowohl für VEGFR-2 als auch für VEGFR-3. Die reife Form bindet sowohl VEGFR-2 als auch VEGFR-3 mit viel höherer Affinität als die unprozessierte Form (Stacker, S.A. et al., J. Biol. Chem., 274: 32127–32136, 1999).
Die Lokalisierung des VEGF-D-Proteins bei menschlichem Krebs wurde wegen des Fehlens von Antikörpern, die für die VHD von VEGF-D spezifisch sind, nicht untersucht. Antikörper gegen die N- oder C-terminalen Propeptide sind nicht geeignet, da diese Regionen von der bioaktiven VHD abgespalten werden und anders als die VHD lokalisiert wären (Stacker, S.A. et al., J. Biol. Chem., 274: 32127–32136, 1999).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft allgemein Medikamente zur Behandlung und Linderung verschiedener Krebsarten.
Gemäß einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Medikament zur Behandlung eines Organismus bereit, der an einer neoplastischen Erkrankung leidet, die durch die Expression von VEGF-D durch einen Tumor gekennzeichnet ist, der ausgewählt ist aus duktalem Karzinom der Brust (Milchgangkarzinom), Plattenepithelkarzinom (squamöses Zellkarzinom), Prostatatumoren und Endometriumkrebs.
VEGF-D-Antagonisten können die VEGF-D-Expression inhibieren, wie es beispielsweise bei Verwendung einer Zusammensetzung der Fall ist, die eine Antisense-Nucleinsäure oder dreisträngige DNA umfaßt, die für VEGF-D codiert.
VEGF-D-Antagonisten können auch die VEGF-D-Aktivität inhibieren, beispielsweise bei Verwendung von Verbindungen, die Antikörper und/oder kompetitive oder nicht-kompetitive Inhibitoren für die Bindung von VEGF-D sowohl bei der Dimerbildung als auch bei der Rezeptorbindung umfassen. Diese VEGF-D-Antagonisten umfassen ein wie nachfolgend beschriebenes modifiziertes VEGF-D-Polypeptid, das die Fähigkeit besitzt, an VEGF-D zu binden und die Bindung an die VEGF-D-Rezeptoren zu verhindern, oder das die Fähigkeit besitzt, die VEGF-D-Rezeptoren zu binden, das aber nicht in der Lage ist, Endothelzellproliferation, -differenzierung, -migration oder – überleben zu stimulieren. Niedermolekulare Inhibitoren für VEGF-D, VEGFR-2 oder VEGFR-3 und Antikörper, die gegen VEGF-D, VEGFR-2 oder VEGFR-3 gerichtet sind, können ebenfalls verwendet werden.
Es kommt in Betracht, daß einige modifizierte VEGF-D-Polypeptide die Fähigkeit besitzen, an VEGF-D-Rezeptoren auf Zellen zu binden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Endothelzellen, Bindegewebszellen, Myofibroblasten und/oder Mesenchymzellen, die aber unfähig sind, Zellproliferation, -differenzierung, -migration, -motilität und -überleben zu stimulieren oder vaskuläre Proliferation, Bindegewebsentwicklung oder Wundheilung zu induzieren. Von diesen modifizierten Polypeptiden ist zu erwarten, daß sie in der Lage sind, als kompetitive oder nicht-kompetitive Inhibitoren der VEGF-D-Polypeptide und der Wachstumsfaktoren der PDGF/VEGF-Familie zu fungieren, und sich für Situationen eignen, in denen eine Verhinderung oder Reduzierung der Wirkung des VEGF-D-Polypeptids oder des Wachstumsfaktors der PDGF/VEGF-Familie erwünscht ist. Solche rezeptorbindenden Varianten des VEGF-D-Polypeptids, die aber nicht mitogen sind, keine Differenzierung induzieren, keine Migration induzieren, keine Motilität induzieren, das Überleben nicht begünstigen, die Entwicklung von Bindegewebe nicht begünstigen, keine Wundheilung oder keine vaskuläre Proliferation induzieren, sind ebenfalls von der Erfindung umfaßt und werden hier als "rezeptorbindende, aber ansonsten inaktive Varianten" bezeichnet. Weil VEGF-D zur Aktivierung seiner Rezeptoren ein Dimer bildet, kommt auch in Betracht, daß ein Monomer die oben erwähnte "rezeptorbindende, aber ansonsten inaktive Variante" des VEGF-D-Polypeptids umfaßt und ein zweites Monomer einen Wildtyp-VEGF-D oder einen Wildtyp-Wachstumsfaktor der PDGF/VEGF-Familie umfaßt. Diese Dimere können also an ihren entsprechenden Rezeptor binden, können aber kein "Downstream-Signaling" induzieren.
In Betracht kommen auch andere modifizierte VEGF-D-Polypeptide, die eine Bindung eines Wildtyp-VEGF-D oder eines Wildtyp-Wachstumsfaktors der PDGF/VEGF-Familie an seinen entsprechenden Rezeptor auf Zellen verhindern können, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Endothelzellen, Bindegewebszellen (wie Fibroblasten), Myofibroblasten und/oder Mesenchymzellen. Diese Dimere sind also nicht in der Lage, Proliferation, Differenzierung, Migration und Überleben von Endothelzellen zu stimulieren und vaskuläre Permeabilität zu induzieren und/oder Proliferation und/oder Differenzierung und/oder Motilität von Bindegewebszellen, Myofibroblasten oder Mesenchymzellen zu stimulieren. Von diesen modifizierten Polypeptiden ist zu erwarten, daß sie in der Lage sind, als kompetitive oder nicht-kompetitive Inhibitoren des VEGF-D-Wachstumsfaktors oder eines Wachstumsfaktors der PDGF/VEGF-Familie zu fungieren, und sich für Situationen eignen, in denen eine Verhinderung oder Reduzierung der Wirkung des VEGF-D-Wachstumsfaktors oder eines Wachstumsfaktors der PDGF/VEGF-Familie erwünscht ist. Solche Situationen umfassen den Gewebeumbau, der während der Invasion von Tumorzellen in eine normale Zellpopulation durch Bildung von primären oder metastatischen Tumoren stattfindet. Solche Varianten des VEGF-D-Wachstumsfaktors, die VEGF-D oder einen Wachstumsfaktor der PDGF/VEGF-Familie binden, aber nicht mitogen sind, keine Differenzierung induzieren, keine Migration induzieren, keine Motilität induzieren, das Überleben nicht begünstigen, kein Bindegewebe fördern und keine Wundheilung oder Gefäßproliferation induzieren, sind daher ebenfalls von der Erfindung umfaßt und werden hier als "Varianten, die das Dimer des VEGF-D-Wachstumsfaktors bilden, aber ansonsten inaktiv oder nicht störend sind" bezeichnet.
Mögliche modifizierte Formen des VEGF-D-Polypeptids können hergestellt werden, indem man essentielle Regionen des VEGF-D-Polypeptids gezielt modifiziert. Es ist zu erwarten, daß diese essentiellen Regionen innerhalb der stark konservierten PDGF/VEGF-Homologiedomäne (VDH) liegen. Insbesondere sind die Wachstumsfaktoren der PDGF/VEGF-Familie, einschließlich VEGF, dimer, und VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PlGF, PDGF-A und PDGF-B zeigen eine vollständige Konservierung von acht Cysteinresten in der VHD (Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 93: 2576–2581, 1996; Joukov et al., EMBO J., 15: 290–298, 1996). Es wird angenommen, daß diese Cysteine an intra- und intermolekularen Disulfidbrücken beteiligt sind. Außerdem gibt es weitere stark, aber nicht vollständig konservierte Cysteinreste in den C-terminalen Domänen. Loops 1, 2 und 3 jeder VHD-Untereinheit, die durch intramolekulare Disulfidbrücken gebildet werden, sind an der Bindung an die Rezeptoren für die Wachstumsfaktoren der PDGF/VEGF-Familie beteiligt (Andersson et al., Growth Factors, 12: 159–164, 1995). Modifizierte Polypeptide können mit üblichen Aktivitätstest, wie dem Test auf Endothelzellproliferation, leicht auf ihre Fähigkeit getestet werden, die biologische Aktivität von VEGF-D zu inhibieren.
VEGF-D-Antagonisten, die sich für die Erfindung eignen, können auch Moleküle beinhalten, die Polypeptide umfassen, die den VEGF-D-Bindungsdomänen von VEGFR-2 (Flk1) oder VEGFR-3 (Flt4) entsprechen. Beispielsweise könnten die bei Achen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 548–553, 1998 beschriebenen Ig-Fusionsproteine, die die extrazellulären Domänen von humanem VEGFR-2 und humanem VEGFR-3 enthalten und an VEGF-DΔNΔ C binden, zweckmäßig als VEGF-D-Antagonisten verwendet werden.
Die Medikamente zur Behandlung und Linderung verschiedener Krebsarten können auch durch tödliches Targeting eines Tumors wirken, der VEGF-D, VEGFR-2 und/oder VEGFR-3 exprimiert. Dies würde die Kopplung eines zytotoxischen Mittels an ein erfindungsgemäßes Polypeptid, einen gegen VEGF-D, VEGFR-2 oder VEGFR-3 gerichteten Antikörper oder ein kleines, gegen VEGF-D, VEGFR-2 oder VEGFR-3 gerichtetes Molekül beinhalten, um einen Tumor zu töten, der VEGF-D, VEGFR-2 und/oder VEGFR-3 exprimiert. Solche zytotoxischen Mittel umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Pflanzentoxine (z. B. die Ricin A-Kette, Saporin), Bakterien- oder Pilztoxine (z. B. Diphtherietoxin) oder Radionuclide (z. B. 211-Astatin, 212-Bismuth, 90-Yttrium, 131-Iod, 99-Technetium), Alkylierungsmittel (z. B. Chlor ambucil), Antimitotika (z. B. Vinca-Alkaloide) und DNA-interkalierende Mittel (z. B. Adriamycin).
Die Polypeptide, VEGF-D-Antagonisten oder -Antikörper, die die biologische Aktivität von VEGF-D inhibieren, können auch in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen nichttoxischen Salz davon und einem pharmazeutisch verträglichen festen oder flüssigen Träger oder Adjuvans eingesetzt werden. Eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung inhibiert oder stört eine von wenigstens VEGF-D induzierte biologische Aktivität.
Beispiele für solche Träger oder Adjuvanzien umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Ringer-Lösung, Mineralöl, Talk, Maisstärke, Gelatine, Lactose, Sucrose, mikrokristalline Cellulose, Kaolin, Mannitol, Dicalciumphosphat, Natriumchlorid, Alginsäure, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol, Verdickungsmittel, Stabilisatoren, Suspendiermittel und Kombinationen davon. Derartige Zusammensetzungen können in Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Kapseln, Cremes, Salben, Elixieren, Sirupen, Oblaten, Pasten oder anderen üblichen Formen vorliegen. Die Formulierung kann der Verabreichungsart natürlich entsprechend bekannten Regeln angepaßt werden. Zusammensetzungen, die ein erfindungsgemäßes Peptid umfassen, enthalten etwa 0,1 bis 90 Gew.-% der aktiven Verbindungen) und üblicherweise etwa 10 bis 30 %.
Die Dosis und der Verabreichungsweg hängen von der Natur des Patienten und dem zu behandelnden Zustand ab und werden vom behandelnden Arzt oder Veterinär bestimmt. Geeignete Wege beinhalten orale Verabreichung, subkutane, intramuskuläre, intraperitoneale oder intravenöse Injektion, parenterale Verabreichung, topische Anwendung, Implantate usw. Eine wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Peptids oder Antikörpers wird einem bedürften Organismus beispielsweise in einer Dosis zwischen etwa 0,1 und 100 mg/kg Körpergewicht und besonders bevorzugt zwischen 1 und 10 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Für humanisierte Antikörper, die üblicherweise eine lange Halbwertszeit im Kreislauf zeigen, kommen insbesondere Dosierungen in Abständen von täglich bis jeden Monat und besonders bevorzugt jede Woche oder alle zwei Wochen oder jede dritte Woche in Betracht. Eine Überwachung des Fortschritts der Therapie, der Nebenwirkungen beim Patienten und der Spiegel der zirkulierenden Antikörper liefern zusätzlich Hinweise für ein optimales Dosierungsschema. Daten von veröffentlichten und laufenden klinischen Versuchen für andere Krebstherapeutika auf Antikörperbasis (z. B. Anti-HER2, Anti-EGF-Rezeptor) geben ebenfalls nützliche Hinweise für das Dosierungsschema. Die topische Anwendung von VEGF-D kann analog zu VEGF erfolgen.
Es versteht sich, daß der Ausdruck "vollständig prozessiertes VEGF-D" für die Zwecke dieser Beschreibung die reife Form des VEGF-Polypeptids bedeutet, d. h. die VEGF-Homologiedomäne (VHD) mit der Sequenz der SEQ ID NO: 3, die keine N- und C-terminalen Propeptide aufweist. Der Ausdruck "proteolytisch prozessierte Form von VEGF-D" bedeutet ein VEGF-D-Polypeptid ohne das N- und/oder C-terminale Propeptid, und der Ausdruck "unprozessiertes VEGF-D" bedeutet ein vollständiges VEGF-D-Polypeptid mit der Sequenz der SEQ ID NO: 2 mit sowohl dem N- als auch dem C-terminalen Propeptid.
Das vollständige VEGF-D-Polypeptid mit der Sequenz der SEQ ID NO: 2 kann gegebenenfalls an das FLAG^®-Peptid gekoppelt werden sein. Wenn das vollständige VEGF-D-Polypeptid an FLAG^® gekoppelt ist, wird das Fragment hier als VEGF-D-FULL-N-FLAG bezeichnet. Ein bevorzugtes Fragment von VEGF-D ist der VEGF-D-Teil von Aminosäurerest 93 bis Aminosäurerest 201 (d. h. die VHD (SEQ ID NO: 3)), gegebenenfalls gekoppelt an das FLAG^®-Peptid. Wenn das Fragment an FLAG^® gekoppelt ist, wird das Fragment hier als VEGF-DΔNΔC bezeichnet.
Der Ausdruck "biologische Aktivität von VEGF-D" soll die Fähigkeit bedeutet, eines oder mehreres von Endothelzell proliferation, -differenzierung, -migration, -überleben oder vaskulärer Permeabilität zu stimulieren.
Polypeptide, die konservative Substitutionen, Insertionen oder Deletionen umfassen, die aber noch die biologische Aktivität von VEGF-D haben, werden selbstverständlich von der Erfindung umfaßt. Der Fachmann ist allgemein mit Verfahren vertraut, die leicht eingesetzt werden können, um solche Polypeptide zu erzeugen, beispielsweise mittels sequenzspezifischer Mutagenese oder spezifischer Enzymspaltung und Ligation. Dem Fachmann ist auch klar, daß peptidomimetische Verbindungen oder Verbindungen, bei denen ein oder mehrere Aminosäurereste durch eine nicht natürlich vorkommende Aminosäure oder ein Aminosäureanaloges ersetzt sind, die geforderten Aspekte der biologischen Aktivität von VEGF-D aufrecht erhalten können. Solche Verbindungen können leicht nach fachmännisch bekannten Verfahren hergestellt und getestet werden und werden ebenfalls von der Erfindung umfaßt.
Sofern eine Aminosäuresubstitution erfolgt, so ist die Substitution vorzugsweise konservativ, d. h. eine Aminosäure wird durch eine andere mit ähnlicher Größe und mit ähnlichen Ladungseigenschaften ersetzt.
Der Ausdruck "konservative Substitution", wie er hier verwendet wird, bezeichnet den Austausch eines Aminosäurerests gegen einen anderen, biologisch ähnlichen Rest. Beispiele für konservative Substitutionen umfassen die Substitution eines hydrophoben Rests wie Isoleucin, Valin, Leucin, Alanin, Cystein, Glycin, Phenylalanin, Prolin, Tryptophan, Tyrosin, Norleucin oder Methionin durch einen anderen oder die Substitution eines polaren Rests durch einen anderen, wie die Substitution von Arginin durch Lysin, Glutaminsäure durch Asparaginsäure oder Glutamin durch Asparagin und dergleichen. Neutrale hydrophile Aminosäuren, die durch eine andere substituiert werden können, umfassen Asparagin, Glutamin, Serin und Threonin. Der Ausdruck "konservative Substitution" beinhaltet auch die Verwendung einer substituierten Aminosäure anstelle einer unsubstituierten parentalen Aminosäure.
Als solches versteht sich im Kontext der vorliegenden Erfindung, daß eine konservative Substitution vom Fachmann als Substitution einer Aminosäure gegen eine andere Aminosäure mit ähnlichen Eigenschaften angesehen wird. Beispielhafte konservative Substitutionen sind in der folgenden Tabelle A aus der WO 97/09433 aufgeführt. Tabelle A Konservative Substitutionen I

SEITENKETTENCHARAKTERISTIK AMINOSÄURE

Aliphatisch

Unpolar G A P

I L V

Polar – ungeladen C S T M

N Q

Polar – geladen D E

K R

Aromatisch H F W Y

Andere N Q D E

Alternativ können konservative Aminosäuren wie bei Lehninger [Biochemistry, Zweite Auflage; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), S. 71–77] beschrieben klassifiziert werden, wie in der folgenden Tabelle B angegeben. Tabelle B Konservative Substitutionen II

SEITENKETTENCHARAKTERISTIK	AMINOSÄURE
Unpolar (hydrophob)
A. Aliphatisch:	A L I V P
B. Aromatisch:	F W

C. Schwefelhaltig:	M
D. Grenzfall:	G
Ungeladen-polar
A. Hydroxy:	S T Y
B. Amide:	N Q
C. Sulfhydryl:	C
D. Grenzfall:	G
Positiv geladen (basisch):	K R H
Negativ geladen (sauer):	D E

Beispielhafte konservative Substitutionen sind in der folgenden Tabelle C aufgeführt. Tabelle C Konservative Substitutionen III

Ursprünglicher Rest	Beispielhafte Substitution
Ala (A)	Val, Leu, Ile
Arg (R)	Lys, Gln, Asn
Asn (N)	Gln, His, Lys, Arg
Asp (D)	Glu
Cys (C)	Ser
Gln (Q)	Asn
Glu (E)	Asp
His (H)	Asn, Gln, Lys, Arg
Ile (I)	Leu, Val, Met, Ala, Phe,
Leu (L)	Ile, Val, Met, Ala, Phe
Lys (K)	Arg, Gln, Asn
Met (M)	Leu, Phe, Ile
Phe (F)	Leu, Val, Ile, Ala
Pro (P)	Gly
Ser (S)	Thr
Thr (T)	Ser
Trp (W)	Tyr, Phe
Tyr (Y)	Trp, Phe, Thr, Ser
Val (V)	Ile, Leu, Met, Phe, Ala

Mögliche variante Formen des VEGF-D-Polypeptids, die aus alternativem Splicing resultieren könnten und bekanntermaßen bei VEGF und VEGF-B vorkommen, und natürlich vorkommende Allelvarianten der für VEGF-D codierenden Nucleinsäuresequenz werden von der Erfindung umfaßt. Allelvarianten sind dem Fachmann allgemein bekannt und stellen alternative Formen einer Nucleinsäuresequenz dar, die Substitutionen, Deletionen oder Additionen ein oder mehrerer Nucleotide umfassen, aber zu keiner wesentlichen funktionellen Veränderung des codierten Polypeptids führen.
Solche varianten Formen von VEGF-D können durch gezielte Modifikation nicht essentieller Regionen des VEGF-D-Polypeptids hergestellt werden. Es ist zu erwarten, daß diese nichtessentiellen Regionen außerhalb der stark konservierten Regionen liegen. Insbesondere sind die Wachstumsfaktoren der PDGF/VEGF-Familie, einschließlich VEGF, dimer, und VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PlGF, PDGF-A und PDGF-B zeigen eine vollständige Konservierung von acht Cysteinresten in den N-terminalen Domänen, d. h. den PDGF/VEGF-ähnlichen Domänen (Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 2576–2581, 1996; Joukov et al., EMBO J., 15: 290–298, 1996). Man nimmt an, daß diese Cysteine an intra- und intermolekularen Disulfidbrücken beteiligt sind. Ferner gibt es weitere stark, aber nicht vollständig konservierte Cysteinreste in den C-terminalen Domänen. Loops 1, 2 und 3 jeder VHD-Untereinheit, die durch intramolekulare Disulfidbrücken gebildet werden, sind an der Bindung an die Rezeptoren für die Wachstumsfaktoren der PDGF/VEGF-Familie beteiligt (Andersson et al., Grows Factors, 12: 159–164, 1995).
Dem Fachmann ist daher bewußt, daß diese Cysteinreste in jeder vorgeschlagenen varianten Form erhalten bleiben sollten und daß die aktiven Zentren in den Loops 1, 2 und 3 ebenfalls erhalten bleiben sollten. Von anderen Regionen des Moleküls ist jedoch zu erwarten, daß sie für die biologische Funktion von geringerer Bedeutung sind und daß sie daher geeignete Ziele für eine Modifikation bieten. Modifizierte Polypeptide können leicht mittels üblicher Aktivitätstests, wie dem Test auf Endothelzellproliferation, auf ihre Fähigkeit getestet werden, die biologische Aktivität von VEGF-E zu zeigen.
Es wurde gezeigt, daß in einer Untergruppe hämapoetischer Zellen ein starkes Signal für VEGF-D vorhanden ist. Diese Zellen strömen in einer Art entzündlicher Reaktion in die peripheren Regionen einiger Tumore. Eine Inhibierung dieses Prozesses wäre daher dort nützlich, wo es wünschenswert wäre, diese entzündliche Reaktion zu verhindern.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung betrifft die Erfindung Medikamente zur Behandlung eines Organismus, z. B. eines Säugers, der an einer nepolastischen Erkrankung leidet, die durch die Expression von VEGF-D durch einen Tumor gekennzeichnet ist, der ausgewählt ist aus duktalem Karzinom der Brust, Plattenepithelkarzinom, Prostatakrebs oder Endometriumkrebs, wobei eine wirksame Menge eines VEGF-D-Antagonisten in der Nähe dieses Tumors verabreicht wird, um ein Binden von VEGF-D an seinen entsprechenden Rezeptor zu verhindern. Falls gewünscht, kann zusammen mit dem VEGF-D-Antagonisten ein zytotoxisches Mittel verabreicht werden. Ein bevorzugter VEGF-D-Antagonist ist ein monoklonaler Antikörper, der VEGF-D spezifisch bindet und eine VEGF-D-Bindung an den VEGF-Rezeptor-2 oder den VEGF-Rezeptor 3 blockiert, insbesondere ein Antikörper, der an die VEGF-Homologiedomäne von VEGF-D bindet.
Es versteht sich, daß das Wort "umfassend" für die Zwecke dieser Beschreibung "einschließlich, aber nicht darauf beschränkt" bedeutet. Die entsprechende Bedeutung gilt für das Wort "umfaßt".
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung der Prozessierung von VEGF-D;
2 zeigt die Spezifität von MAb 4A5 für die VEGF/PDGF-Homologiedomäne (VHD) von humanem VEGF-D, bestimmt durch Western-Blot-Analyse;
3 zeigt Autoradiographien, aufgenommen nach zwei Tagen Exposition mit Gewebeschnitten einer Maus von Tag 15,5 postkoital, die mit VEGF-D-Antisense- und -Sense-RNAs hybridisiert waren;
4A–4D zeigen die Ergebnisse einer Analyse der Verteilung von VEGF-D-mRNA in dem Mäuseembryo von Tag 15,5 Tage postkoital durch in situ-Hybridisierung;
5A–5F zeigen die Lokalisierung von VEGF-D beim Plattenepithelkarzinom der Lunge;
6A–6F zeigen die Lokalisierung von VEGF-D bei duktalem Karzinom der Brust in situ;
7 zeigt die Lokalisierung von VEGF-D bei Endometriumadenokarzinom in situ;
8 zeigt die Ergebnisse der Analyse von Tumoren in SCID-Mäusen, die aus der Injektion von untransfizierten parentalen 293-Zellen (als "293" bezeichnet) und von mit einem für VEGF-D-FULL-N-FLAG codierenden Expressionsvektor transfizierten 293-Zellen (als "VEGF-D-293" bezeichnet) resultierten.
9 zeigt die erhöhte Wachstumsrate bei Tumoren aus VEGF-DΔN-Zellen.
10 zeigt einen durch VEGF-DΔN-Zellen gebildeten Tumor.
11 zeigt einen normalen Tumor.
12 zeigt die verminderte Wachstumsrate bei Tumoren aus VEGF-DΔNΔC-Zellen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Beispiel 1 Produktion monoklonaler Antikörper, die an humanen VEGF-D binden
Um die VEGF/PDGF-Homologiedomäne (VHD) anstelle der N- und C-terminalen Propeptide nachzuweisen, wurden monoklonale Antikörper gegen die reife Form von humanem VEGF-D (Reste 93 bis 201 des vollständigen VEGF-D (SEQ ID NO: 2), d. h. mit abgespaltenen N- und C-terminalen Regionen) in Mäusen gezüchtet. Ein DNA-Fragment, das für die Reste 93 bis 201 codierte, wurde mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) mit Pfu-DNA-Polymerase amplifiziert, wobei als Matrize ein Plasmid verwendet wurde, das die vollständige cDNA für humanen VEGF-D umfaßte (SEQ ID NO: 1). Das amplifizierte DNA-Fragment, dessen Korrektheit durch Nucleotidsequenzierung bestätigt wurde, wurde dann in den Expressionsvektor pEFBOSSFLAG (ein Geschenk von Dr. Clare McFarlane am Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research (WEHI), Melbourne, Australien) inseriert, was zu einem Plasmid mit der Bezeichnung pEFBOSVEGF-DΔNΔC führte. Der pEFBOSSFLAG-Vektor enthält DNA, die für die Signalsequenz zur Proteinsekretion aus dem Interleukin-3 (IL-3)-Gen und das FLAG ^®-Octapeptid (Sigma-Aldrich) codiert. Das FLAG^®-Octapeptid kann durch kommerziell erhältliche Antikörper wie den monoklonalen Antikörper M2 (Sigma-Aldrich) erkannt werden. Das VEGF-D-PCR-Fragment wurde so in den Vektor inseriert, daß die IL-3-Signalsequenz unmittelbar stromaufwärts vom FLAG^®-Octapeptid lag, welches sich wiederum unmittelbar stromaufwärts von der trunkierten VEGF-D-Sequenz befand. Alle drei Sequenzen befanden sich im gleichen Leserahmen, so daß eine Translation der mRNA, die aus der Transfektion von pEFBOSVEGF-DΔNΔC in Säugerzellen resultierte, zu einem Protein führen sollte, das die IL-3-Signalsequenz an seinem N-Terminus haben sollte, gefolgt von dem FLAG^®-Octapeptid und der trunkierten VEGF-D-Sequenz. Abspaltung der Signalsequenz und anschließende Sekretion des Proteins aus der Zelle sollte zu einem VEGF-D-Polypeptid führen, das mit dem FLAG^®-Octapeptid in Nachbarschaft zum N-Terminus markiert ist. VEGF-DΔNΔC wurde aus dem Medium von COS-Zellen, die transient mit dem Plasmid pEFBOSVEGF-DΔNΔC transfiziert worden waren, mittels Anti-FLAG^®-Affinitätschromatographie gereinigt (siehe Beispiel 9 der Internationalen Patentanmeldung PCT/US97/14696).
Gereinigtes VEGF-DΔNΔC wurde verwendet, um weibliche Balb/C-Mäuse an Tag 85 (intraperitoneal), 71 (intraperitoneal) und 4 (intravenös) vor dem Ernten der Milzzellen aus den immunisierten Mäusen und der anschließenden Fusion dieser Milzzellen mit Mausmyelomzellen P3X63Ag8.653 (NS-1) zu immunisieren. Für die ersten beiden Immunisierungen wurden etwa 10 μg VEGF-DΔNΔC in einer 1:1-Mischung aus PBS und TiterMax-Adjuvans (#R-1 Research-Adjuvans; CytRx Corp. Norcross, GA) injiziert, während für die dritte Immunisierung 35 μg VEGF-DΔN ΔC in PBS verwendet wurden.
Monoklonale Antikörper gegen VEGF-DΔNΔC wurden durch Screening der Hybridome auf gereinigtem VEGF-DΔNΔC mit einem Enzymimmunoassay selektioniert. Kurz gesagt wurden 96-Loch-Mikrotiterplatten mit VEGF-DΔNΔC beschichtet und Hybridomaüberstände wurden zugegeben und es wurde 2 Stunden bei 4 °C inkubiert, gefolgt von sechsmaligem Waschen in PBS mit 0,02 Tween 20. Inkubation mit einem mit Meerrettichperoxidase konjugiertem Anti-Maus-Ig (Bio-Rad, Hercules, CA) folgte 1 Stunde bei 4 °C. Nach dem Waschen wurde der Assay mit einem 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure) (ABTS)-Substratsystem (Zymed, San Francisco, CA) entwickelt und der Assay wurde durch Ablesen der Extinktion bei 405 nm in einem Multiwell-Plattenlesegerät (Flow Laboratories MCC/340, McLean, VA) quantifiziert. Sechs Antikörper wurden zur weiteren Analyse ausgewählt und zweimal durch limitierte Verdünnung subkloniert. Diese Antikörper wurden als 2F8, 3C10, 4A5, 4E10, 4H4 und 5F12 bezeichnet. Die Isotypen der Antikörper wurden mit einem Isostrip^TM-Isotypisierungs-Kit (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) bestimmt. Die Antikörper 2F8, 4A5, 4E10 und 5F12 gehörten zur IgG₁-Klasse, wogegen 4H4 und 3C10 zur IgM-Klasse gehörten. Alle sechs Antikörper enthielten die leichte Kappakette.
Hybridoma-Zellinien wurden in DMEM gezüchtet, das 5 % V/V IgG-verarmtes Serum (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5 mM L-Glutamin, 50 μg/ml Gentamicin und 10 μg/ml rekombinantes IL-6 enthielt. Die Antikörper 2F8, 4A5, 4E10 und 5F12 wurden durch Affinitätschromatographie mit Protein G-Sepharose gemäß der Methode von Darby et al., J. Immunol. Methods, 159: 125–129, 1993 gereinigt und die Ausbeute wurde durch Messung der Absorption bei 280 nm bestimmt.
Beispiel 2 Spezifität von 4A5
Die Spezifität von MAb 4A5 (umbenannt in VD1) für die VHD von humanem VEGF-D wurde durch Western-Blot-Analyse bestimmt. Die eingesetzten Derivate von VEGF-D waren VEGF-DΔNΔC, das aus den am N-Terminus mit dem FLAG^®-Octapeptid markierten Aminosäureresten 93 bis 201 von humanem VEGF besteht (Beispiel 1), VEGF-D-FULL-N-FLAG, das aus am N-Terminus mit FLAG^® markiertem vollständigem VEGF-D besteht (Stacker, S.A. et al., J. Biol. Chem., 274: 32127–32136) und VEGF-D-CPRO, das aus dem C-terminalen Propeptid von Aminosäurerest 206 bis 354 besteht, das ebenfalls am N-Terminus mit FLAG^® markiert war. Diese Proteine wurden in 293-EBNA-1-Zellen exprimiert, gereinigt durch Affinitätschromatographie mit M2 (Anti-FLAG^®)-MAb (IBI/Kodak, New Haven, CT) nach dem bei Achen, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 548–553, 1998 angegebenen Verfahren.
Fünfzig Nanogramm gereinigter VEGF-D-FULL-N-FLAG (FN), VEGF-DΔ NΔC (ΔΔ) und VEGF-D-CPRO (CP) wurden mittels SDS-PAGE (reduzierend) und durch Western-Blot mit dem VD1-MAb und einem biotinylierten M2-MAb als Kontrolle gereinigt (der zum Blotting verwendete Antikörper ist am unteren Ende des Bilds von 2 angegeben). SDS-Page und Western-Blot-Analysen wurden wie bei Stacker, S.A. et al., J. Biol. Chem., 274: 32127–32136, 1999 beschrieben durchgeführt.
Wie in 2 gezeigt, besteht die überweigende Spezies in der Probe von VEGF-D-FULL-N-FLAG aus unprozessiertem VEGF-D (Mr ~53 K), teilweise prozessiertem VEGF-D, der sowohl das N-terminale Propeptid als auch die VHD enthält (~31 K), und dem N-terminalen Propeptid (~10 K) (Stacker, S.A. et al., J. Biol. Chem., 274: 32127–32136, 1999), die alle mit dem M2-MAb nachgewiesen werden, da sie mit dem FLAG^®-Octapeptid markiert sind (Pfeile links, Zahlen stellen Mr in K dar und Indizes geben die Probe an, in der die Bande nachgewiesen wird). Ähnlich werden VEGF-DΔNΔC (~21 K) und VEGF-D-CPRO (zwei Banden von ~31 und ~29 K, die sich aufgrund differentieller Glykosyhierung ergeben), mit M2 nachgewiesen (Pfeile links), da diese Polypeptide ebenfalls mit FLAG^® markiert sind. VD1 weist unprozessierten VEGF-D, partiell prozessierten VEGF-D und VEGF-DΔNΔC nach, aber nicht das N-terminale Propeptid (~10 K) im VEGF-D-FULL-N-FLAG-Präparat und auch nicht das C-terminale Propeptid in der VEGF-D-CPRO-Probe (~31 und ~29 K). Die Ergebnisse mit VEGF-D-FULL-N-FLAG wurden mit langen (L) und kurzen (S) Expositionen analysiert. Die Positionen der Molekulargewichtsmarker sind rechts in 2 gezeigt.
MAb VD1 bindet also unprozessierten VEGF-D, partiell prozessierte Formen, die die VHD enthalten, und vollständig prozessierten VEGF-D, aber nicht die N- oder C-terminalen Propeptide. Außerdem war MAb VD1 in einem Enzymimmunoassay zur Immunpräzipitation von nativem humanem VEGF-DΔNΔC aber nicht von der VHD von humanem VEGF-C (VEGF-CΔNΔC) (Joukov, V. et al., EMBO J., 16: 3898–3911, 1997) in der Lage, was zeigt, daß VD1 für VEGF-D spezifisch ist.
Beispiel 3 In Situ-Hybridisierungsstudien der VEGF-D-Gen-Expression in Mäuseembryos
Das Expressionsmuster des VEGF-D-Gens wurde durch in situ-Hybridisierung unter Verwendung einer radiomarkierten Antisense-RNA-Sonde untersucht, die den Nucleotiden 1 bis 340 der cDNA von Maus-VEGF-D1 (SEQ ID NO: 4) entsprach. Die Antisense-RNA wurde durch in vitro-Transkription mit T3-RNA-Polymerase und [³⁵S]UTPαs synthetisiert. Maus-VEGF-D wird in der Internationalen Patentanmeldung PCT/US97/14696 (WO 98/07832) vollständig beschrieben. Diese Antisense-RNA-Sonde wurde mit in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten von Mäuseembryos von Tag 15,5 postkoital hybridisiert. Die markierten Schnitte wurden 2 Tage lang autoradiographiert. Die resultierenden Autoradiographien für Schnitte, die mit der Antisense-RNA und mit komplementärer Sense-RNA (als negativer Kontrolle) hybridisiert worden waren, sind in 3 gezeigt. In 3 bezeichnet "L" Lunge und "Sk" bezeichnet Haut, und die zwei gezeigten Gewebeschnitte sind Serienschnitte. Starke Signale für VEGF-D-mRNA wurden in der sich entwickelnden Lunge und assoziiert mit der Haut nachgewiesen. Bei der Sense-RNA als Kontrolle wurden keine Signale nachgewiesen.
In den 4A–4D wurden sagittale Gewebeschnitte mit der VEGF-D-Antisense-RNA-Sonde hybridisiert und anschließend mit photographischer Emulsion inkubiert, entwickelt und gefärbt. Die Vergrößerung für die 4A und 4D ist ×40, für 4B ist sie ×200 und für 4C ist sie ×500.
In 4A zeigt die mikroskopische Dunkelfeldaufnahme ein starkes Signal für VEGF-D-mRNA in der Lunge (Lu). Leber (Li) und Rippen (R) sind ebenfalls gezeigt. 4B zeigt eine stärkere Vergrößerung der Lunge. Diese mikroskopische Hellfeldaufnahme zeigt einen Bronchus (Br) und die Bronchialarterie (BA). Der schwarze Rechteckrahmen kennzeichnet die in 4C mit stärkerer Vergrößerung gezeigte Schnittregion. 4C zeigt die Epithelzellen des Bronchus (Ep), die sich entwickelnden glatten Muskelzellen (SM), die die Epithelzellschicht umgeben, und die Mesenchymzellen (Mes). Die Fülle von mit Mesenchymzellen assoziierten Silberkörnchen ist offensichtlich. Eine mikroskopische Analyse zeigt also, daß VEGF-D-mRNA in den Mesenchymzellen der sich entwickelnden Lunge reichlich vorhanden ist (4A–4C). Im Gegensatz dazu sind die Epithelzellen der Bronchien und Bronchiolen ebenso negativ, wie es die sich entwickelnden glatten Muskelzellen waren, die die Bronchien umgeben. Die Endothelzellen von Bronchialarterien sind ebenfalls negativ.
In 4D zeigt eine mikroskopische Dunkelfeldaufnahme eine Extremitätenknospe. Ein starkes Signal befand sich unmittelbar unter der Haut in einer Geweberegion, die reich an Fibroblasten und sich entwickelnden Melanozyten war.
Diese Ergebnisse zeigen an, daß VEGF-D das Wachstum von Blut- und Lymphgefäßen in die sich entwickelnde Lunge und in die Region unmittelbar unter der Haut anlocken könnte.
Beispiel 4 VEGF-D bei Lungenkrebs
Es wird angenommen, daß Neoangiogenese ein nützlicher prognostischer Indikator für nicht-kleinzelligen Lungenkrebs (Non-Small Cell Lung Carcinoma, NSCLC) ist (Fontanini, G. et al., Clin. Cancer Res., 3: 861–865, 1997). Daher wurde die Lokalisierung von VEGF-D in einem Fall von Plattenepithelkarzinom der Lunge durch Immunhistochemie analysiert (5A–5F). Die Immunhistochemie erfolgte mit Antikörpern gegen alpha-Actin von glattem Muskel (DAKO Corp., Carpinteria, CA) zur Immunfärbung. Der Anti-VEGF-D-MAb, der in den 5A und 5D zur Immunfärbung verwendet wurde, war VD1 (4A5). 5A zeigt, daß VEGF-D in Tumorzellen, die eine Insel im Zentrum der Mikrophotographie bilden, in Zellen, die das benachbarte große Gefäß auskleiden, und in Zellen im desmoplastischen Stroma nachgewiesen wird. Das desmoplastische Stroma wird durch eine schwarze Klammer angezeigt und der gestrichelte Kasten bezeichnet die in 5D mit höherer Auflösung gezeigte Region. Die immunpositiven Zellen im Stroma könnten Myofibroblasten sein.
5B zeigt, daß VEGFR-2 in Zellen nachgewiesen wird, die das große Gefäß auskleiden. Diese Gefäße waren bei diesem Tumor jedoch für VEGFR-3 negativ. Der gestrichelte Kasten bezeichnet die in 5E mit höherer Auflösung gezeigte Region. Kontrollfärbung eines Gewebeschnitts des gleichen Falls, bei dem VEGF-D-MAb mit einem 40fachen molaren Überschuß der VHD von humanem VEGF-D vorinkubiert worden war, lieferte kein Signal (5C).
Wie oben erwähnt könnten die immunpositiven Zellen im desmoplastischen Stroma Myofibroblasten sein. Daher wurde das desmoplastische Stroma mit für alpha-Actin von glattem Muskel spezifischen MAbs immungefärbt, die Myofibroblasten nachweisen. Wie in 5F zu sehen war das Stroma positiv, was die Anwesenheit von Myofibroblasten zeigt. Die Sekretion eines angiogenen Faktors durch Stromakomponenten könnte dazu dienen, den von dem Tumor generierten angiogenen Stimulus zu verstärken.
Beispiel 5 VEGF-D bei Brustkrebs
Die Lokalisierung von VEGF-D wurde auch bei duktalem Karzinom der Brust in situ durch Immunhistochemie analysiert und die Ergebnisse sind in den 6A–6F gezeigt. Die Immunhistochemie wurde mit für alpha-Actin von glattem Muskel spezifischen MAbs (DAKO Corp., Carpinteria, CA) durchgeführt, und das Plättchen/Endothelzellen-Adhäsionsmolekül (PECAM) (DAKO Corp. Carpinteria, CA) wurde auch zur Immunfärbung verwendet. Der zur Immunfärbung in 6A verwendete Anti-VEGF-D-MAb war VD1 (4A5).
Wie in 6A zu sehen, wurde VEGF-D in Tumorzellen in den Milchgängen und in kleinen sogenannten "Necklace"-Gefäßen (durch schwarze Pfeilspitzen gezeigt) unmittelbar benachbart zu den Basallamina der tumorgefüllten Milchgänge nachgewiesen. Die "Necklace"-Gefäße waren auch für VEGFR-2 (6C), VEGFR-3 (6D) und PECAM (6E) positiv, wie durch die schwarzen Pfeilspitzen angezeigt. PECAM ist ein klassischer Marker für Endothel und findet sich auch auf Blutplättchen und Leukozyten. PECAM spielt eine Rolle bei der Leukozytenauswanderung zu entzündlichen Stellen (Muller et al., J. Exp. Med., 178: 449–460). PECAM-Antikörper-Färbung auf den "Necklace"-Gefäßen hilft zur Bestätigung, daß diese Strukturen Gefäße sind. Der Rand des Milchgangs wird durch Färbung auf alpha-Actin von glattem Muskel identifiziert (6B), das Myofibroblasten nachweist. Kontrollfärbung eines Gewebeschnitts seriell zu dem in 6A gezeigten, bei dem VEGF-D-MAb mit einem 40fachen molaren Überschuß der VHD von humanem VEGF-D vorinkubiert worden war, lieferte kein Signal (6F). Diese Beobachtungen zeigen, daß VEGF-D, sekretiert von den Tumorzellen, seine Rezeptoren auf Gefäßen in der Nachbarschaft aktivieren konnte und dadurch eine Rolle beim Anlocken des Wachstums der "Necklace"-Gefäße" an ihre Positionen nahe den Milchgängen spielen konnte. Dies könnte sowohl für solides Tumorwachstum als auch metastatische Ausbreitung von Bedeutung sein.
Beispiel 6 VEGF-D bei Endometriumkrebs
VEGF-D wurde auch in Endometriumadenokarzinom nachgewiesen (7). Die Immunhistochemie wurde mit dem Anti-VEGF-D-MAb VD1 (4A5) durchgeführt. Moderate Färbung für VEGF-D wurde in den glandulären Tumorzellen (GL) beobachtet, sehr starke Reaktivität war in den Myofibroblastenzellen des desmoplastischen Stroma (DM) am fortschreitenden invasiven Rand des Tumors zu sehen und starke Reaktivität im Endothel und den Wänden benachbarter Blutgefäße (schwarze Pfeile) im Myometrium (Myo). Interessanterweise war die VEGF-D-Reaktivität in den Myofibroblasten des desmoplastischen Stroma besonders stark, was anzeigt, daß die glandulären Tumorzellen eine VEGF-D-Expression in diesen Fibroblasten induzieren können, was das angiogene Potential des Tumors verstärken würde. Da Expression von VEGF-D in Zellen des desmoplastischen Stroma auch bei Lungenkarzinom nachgewiesen wurde (5A), könnte es sein, daß eine Reihe von Tumoren VEGF-D in Stromakomponenten induzieren können. Dies ist analog zur sich entwickelnden Lunge, wo die Mesenchymzellen, vermutlich Fibroblastenvorläufer, das VEGF-D-Gen stark exprimieren. Daher können Signale sowohl von Embryo- als auch von Tumorgewebe die Expression von VEGF-D in Fibroblasten induzieren.
Beispiel 7 Rolle von VEGF-D bei der Tumorentwicklung
Um Zellinien zu generieren, die Derivate von VEGF-D konstitutiv überexprimieren, wurden Regionen der cDNA von humanem VEGF-D in den Säugerexpressionsvektor Apex-3 (Evans et al., Mol. Immunol., 32: 1183–1195, 1995) inseriert. Dieser Vektor wird episomal gehalten, wenn er in humane embryonale 293-EBNA-Nierenzellen transfiziert wird. Zur Expression von reifem VEGF-D wurde die Region von pEFBOSVEGF-DΔNΔC, die die Sequenzen enthält, die für die IL-3-Signalsequenz, das FLAG^®-Octapeptid und den reifen VEGF-D codieren, in die XbaI-Stelle von Apex-3 inseriert (siehe Beispiel 9 der Internationalen Patentanmeldung PCT/US97/14696 (WO98/07832)). Das resultierende Plasmid wurde als pVDApexDΔNΔC bezeichnet (Stacker, S.A. et al., J. Biol. Chem., 274: 32127–32136, 1999, siehe auch Beispiel 1 der Internationalen Patentanmeldung PCT/US98/27373). Ein ähnliches Konstrukt wurde zur Expression des unprozessierten vollständigen VEGF-D, der am N-Terminus mit FLAG^® markiert war, hergestellt. Bei diesem Konstrukt wurde die DNA, die für die VEGF-D-Signalsequenz zur Proteinsekretion codiert, deletiert und durch DNA substituiert, die für die IL-3-Signalsequenz codiert, gefolgt von dem FLAG^®-Octapeptid und den zwei Aminosäuren (Thr-Arg) unmittelbar stromaufwärts und im gleichen Leserahmen wie die für die Reste 24–354 von VEGF-D codiere DNA. Dieses Konstrukt wurde als pVDApexFull-N-Flag bezeichnet (Stacker, S.A. et al., J. Biol. Chem., 274: 32127-32136, 1999, siehe auch Beispiel 1 der Internationalen Patentanmeldung PCT/US98/27373). Diese Vektoren wurden mit der Calciumphosphatmethode oder mit Fugene^® entsprechend den Angaben des Herstellers (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland) in Zellen der humanen Embryonierenzellinie 293EBNA-1 transfiziert, und stabile Transfektanten wurden in Gegenwart von mit 100 μg/ml Hygromycin supplementiertem DMEM selektioniert. Zellinien, die hohe Spiegel an VEGF-D-Full-N-Flag und VEGF-DΔNΔC exprimierten, wurden anschließend durch metabolische Markierung, Immunpräzipitation und Western-Blot-Analyse identifiziert (Stacker, S.A. et al., J. Biol. Chem., 274: 32127–32136, 1999, siehe auch Beispiel 1 der Internationalen Patentanmeldung PCT/US98/27373).
Sechs bis acht Wochen alte SCID-Mäuse (ARC, Perth, Australien) wurden mit 2 × 107 der transfizierten 293-Zellen oder untransfizierten parentalen 293-Zellen in PBS in das Mammafettpolster injiziert. Die Tumore wurden wachsen gelassen und wurden mit Digitaltastern über einen Zeitraum von drei Wochen gemessen. Die Versuche wurden nach drei Wochen beendet, sobald beim ersten Tier die vom Institutional Ethics Committee maximal zugelassene Größe erreicht war. Die Tumorgröße wurde berechnet als Breite × Länge × 0,6 × (Breite × Länge)/2.
8 zeigt die Ergebnisse der Analyse von Tumoren in SCID-Mäusen, die aus der Injektion von untransfizierten parentalen 293-Zellen (als "293" bezeichnet) oder von mit dem für VEGF-D-FULL-N-FLAG codierenden Konstrukt transfizierten 293-Zellen (als "VEGF-D-293" bezeichnet) resultierten. Zwischen den Tumoren, die von den 293-VEGF-D-FULL-N-FLAG-Zellen abstammten, und denjenigen, die von den untransfizierten 293-Zellen abstammten, gibt es einen signifikanten Unterschied. Nach drei Wochen betrug die mittlere Tumorgröße der 293-VEGF-D-FULL-N-FLAG-Gruppe 937 ± 55 mm³ (Mittelwert ± SD, n = 8), verglichen mit 136 ± 230 mm³ für die untransfizierten 293- Zellen (n = 8). Interessanterweise unterschieden sich Tumore, die mit 293-Zellen erzeugt worden waren, die mit einem für VEGF-DΔNΔC codierenden Konstrukt transfiziert waren, nicht signifikant in der Größe, 50 ± 76 mm³ (n = 7), von denen aus den untransfizierten 293-Zellen.
Außerdem war das makroskopische Aussehen von Tumoren, die von den untransfizierten 293-Zellen abstammten, eines mit blaßweißer Oberfläche, verglichen mit den Tumoren, die von den 293-VEGF-D-FULL-N-FLAG-Zellen abstammten, die ein blutiges Aussehen hatten, wobei die Anwesenheit von Blutgefäßen über den ganzen Tumor hinweg offensichtlich war.
Ferner wurden Schnitte durch Immunhistochemie mit einem monoklonalen Anti-PECAM-Antikörper (Pharmingen, San Diego, CA), einem Marker für Endothelzellen, analysiert. Schnitte von Tumoren, die mit 293-VEGF-D-FULL-N-FLAG-Zellen erzeugt worden waren, zeigten eine deutliche Zunahme der PECAM-Expression im Vergleich mit den Tumoren, die mit untransfizierten parentalen 293-Zellen erzeugt worden waren. Die Analyse bestätigt die viel größere Fülle an Blutgefäßen bei den Tumoren, die unprozessierten vollständigen VEGF-D exprimieren.
Dieser Versuch zeigt, daß die unprozessierte Form von VEGF-D in der Lage ist, in vivo Tumorangiogenese und das Wachstum eines soliden Tumors zu induzieren. Interessanterweise zeigten die Tumore, die von Zellen abstammten, die die reife, vollständig prozessierte Form von VEGF-D exprimierten, keine Zunahme im Wachstum, verglichen mit den untransfizierten parentalen 293-Zellen. Dies zeigt die Bedeutung der Propeptide (N-pro und C-pro) in VEGF-D für die korrekte Lokalisierung oder Funktion der VHD von VEGF-D. Eine Erklärung für dieses Ergebnis ist, daß die Propeptide an der Matrixassoziation beteiligt sind, und nur wenn VEGF-D korrekt auf der extrazellulären Matrix oder Heparinsulfatproteoglycanen der Zelloberfläche positioniert ist, ist der Wachstumsfaktor in der Lage, Angiogenese und/oder Lymphangiogenese zu induzieren. Eine alternative Erklärung ist, daß die Propeptide die Halbwertszeit der VEGF-D-VHD in vivo erhöhen.
Beispiel 8 VEGF-D-Induktion der Tumorangiogenese
Um festzustellen, ob VEGF-D eine Rolle bei der Tumorangiogenese spielt, wurden 293EBNA-Zellinien generiert, die VEGF oder VEGF-D exprimieren. 293EBNA-Zellen exprimieren normalerweise keine nachweisbaren Mengen an VEGF, VEGF-C oder VEGF-D, den Liganden, die VEGFR-2 und/oder VEGFR-3 aktivieren (Stacker, S.A. et al., Growth Factors, 17: 1–11, (1999)). 293EBNA-Zellen bilden in immundefizierten Mäusen langsam wachsende und schlecht vaskularisierte epithelioidartige Tumore. Western-Blot-Analyse von konditioniertem Medium von den generierten 293EBNA-Zellinien in vitro zeigte, daß die reifen Formen der aktiven Wachstumsfaktoren sekretiert wurden.
Sechs bis einundzwanzig Wochen alte weibliche SCID- oder SCID/NOD-Mäuse (Animal Resources Center, Canning Vale, Australien; Austin Research Institute, Australien; und Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research, Australien) wurden in Gruppen aus 6 bis 10 Mäusen aufgeteilt und es wurden subkutan Zellinien, die VEGF-293, VEGF-D-293 exprimierten, oder 293-Kontrollzellinien in einer Konzentration von 2,0–2,5 × 10⁷ in Kulturmedium in das Mammafettpolster injiziert. Tumorwachstum und Morphologie wurden über 35 Tage analysiert. Tumore wurden mit Digitaltastern gemessen und das Tumorvolumen wurde nach der Formel berechnet: Volumen = Länge × Breite² × 0,52. Drei bis fünf Wochen nach Injektion mit Zellinien wurden die Mäuse euthanisiert und die Tumore wurden zur Prüfung entnommen. VEGF-D-293-Tumore und 293-Tumore wurden an Tag 25 post mortem exzidiert und gewogen.
VEGF-293-Zellen bildeten Tumore mit einer im Vergleich mit 293-Kontrollzellen erhöhten Wachstumsrate. Die VEGF-293-Tumore waren hochvaskularisiert mit ausgedehntem Ödem, konsistent mit VEGF, der ein sehr wirksamer Tumorangiogenesefaktor und ein Induktor vaskulärer Permeabilität ist. VEGF-D-293-Zellen zeigten auch in vivo erhöhtes Wachstum und die Tumore waren im Vergleich mit 293-Kontrolltumoren hochvaskularisiert, zeigten aber keinen Hinweis, offen oder mikroskopisch, auf Ödeme.
Das Tumorwachstum, das aus einer Injektion von VEGF-D-293-Zellen resultierte, wurde durch zweimal wöchentliche intraperitoneale Injektion von monoklonalem Antikörper VD1 blockiert, einen für die bioaktive Region von VEGF-D spezifischen Antikörper, der die Bindung von VEGF-D an VEGFR-2 und VEGFR-3 blockiert. Durch Behandlung mit einem Isotypengematchten Antikörper als Kontrolle wurde das Tumorwachstum jedoch nicht beeinträchtigt.
Behandlung mit VD1-Antikörper reduzierte die Gefäßfülle in den Tumoren, wie durch Immunhistochemie auf den Endothelzellmarker PECAM-1 festgestellt wurde. Western-Blotting demonstrierte die Expression von VEGF-D und VEGF in VEGF-D-293- bzw. VEGF-293-Tumoren und auch, daß VEGF in VEGF-D-293-Tumoren nicht hochreguliert war. Analyse des Tumorgewichts post mortem zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen den VEGF-D-293-Tumoren (0,39 ± 0,22 g, n = 7; Mittelwert ± SD) und den 293-Kontrolltumoren (0,123 ± 0,118 g, n = 9, p = 0,01).
Beispiel 9 VEGF-D-Induktion von Tumorlymphangiogenese
Da Metastasierung zu lokalen Lymphknoten über die Lymphgefäße ein gängiger Schritt bei der Ausbreitung solider Tumore ist, wurden Versuche durchgeführt, um festzustellen, ob VEGF-D Tumorlymphangiogenese induzierte oder ob Expression von VEGF-D in Tumorzellen zur Ausbreitung des Tumors in Lymphknoten führte.
Um die Rolle von VEGF-D bei der Tumorausbreitung zu analysieren, wurden VEGF-D-293-Tumore in SCID/NOD-Mäusen (Animal Resources Center, Canning Vale, Australien; Austin Research Institute, Australien; und Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research, Australien) induziert. Eine post mortem-Analyse ergab, daß Tiere mit VEGF-D-293-Tumoren in 14 von 23 Tieren metastatische Läsionen entweder in den lateralen axillären Lymphknoten und/oder den oberflächlichen Leistenknoten entwickelten, verglichen mit 0 von 16 Tieren bei VEGF-293-Tumoren und 0 von 14 Tieren bei 293-Tumoren. In einigen Fällen war die Ausbreitung von metastatischen Tumorzellen aus dem Primärtumor in SCID/NOD-Mäusen als eine Spur von Tumorzellen in die Lymphgefäße der Haut zwischen den Primärtumoren und dem lateralen axillären Knoten evident.
Behandlung von Mäusen, die VEGF-D-293-Tumoren trugen, mit dem monoklonalen VD1-Antikörper (Tabelle 1) blockierte die metastatische Ausbreitung zu Lymphknoten. Keine der 25 Tage lang mit VD1 behandelten 7 Mäuse zeigte eine lymphatische Ausbreitung, wogegen 6 von 10 Mäusen, die mit einem Isotypengematchten monoklonalen Kontrollantikörper gehandelt worden waren, eine lymphatische Ausbreitung zeigten. Diese Ergebnisse zeigen, daß VEGF-D die metastatische Ausbreitung dieser Tumore über die Lymphgefäße begünstigen kann.
Tabelle 1: Metastatische Ausbreitung von Tumoren in SCID/NOD-Mäusen
Die Daten zeigen, daß die Expression von VEGF-D die metastatische Ausbreitung von Tumorzellen durch das Lymphgefäßnetz begünstigen kann. VEGF-D induzierte die Bildung von Lymphgefäßen in den Tumoren, wie durch Immunhistochemie auf den Lymphgefäß-spezifischen Marker LYVE-1 nachgewiesen wurde, vermutlich durch den lymphatischen Rezeptor VEGFR-3, obwohl eine Aktivierung von VEGFR-3-VEGFR-2-Heterodimeren nicht ausgeschlossen werden kann. Die Expression von lymphangiogenen Faktoren allein ist ausreichend, um die Bildung von Lymphgefäßen im Zentrum eines Tumors zu induzieren und die metastatische Ausbreitung zu den Lymphknoten zu erleichtern.
VEGF-D wurde in Tumorzellen und Gefäßendothel bei Lungen- und Brustkrebs lokalisiert (siehe Beispiele 5–6).
Beispiel 10 Varianz bei durch verschiedene Formen von VEGF-D induzierten Tumoreigenschaften
Zusätzlich zur Bestimmung der Rolle von VEGF-D bei Tumorangiogenese und Lymphangiogenese wurden die Verfahren der Beispiele 10 und 11 verwendet, um Tumore zu bilden und auszuwerten, die unterschiedliche Formen von VEGF-D exprimieren, die die Abspaltung der N-terminalen, C-terminalen und sowohl der N- und C-terminalen Propeptide zeigen. Die in die Mäuse injizierten Zellinien waren 293EBNA, VEGF-D-293, VEGF-DΔ NΔC-293, VEGF-DΔC-293 (Zellen, die VEGF-D exprimieren, dem das C-terminale Propeptid fehlt) und VEGF-DΔN-293 (Zellen, die VEGF-D exprimieren, dem das N-terminale Propeptid fehlt).
Die durch die VEGF-DΔN-Zellen gebildeten Tumore wuchsen schneller als die durch Kontrollzellen gebildeten Tumore. Bei morphologischer Untersuchung hatten die Tumore ein rotes Aussehen und hatten eine signifikante Gefäßreaktion einschließlich einer deutlichen Flüssigkeitskomponente, die bei den Kontrolltumoren nicht zu sehen war. Die durch die VEGF-DΔN-Zellen gebildeten Tumore zeigten gegenüber den Kontrolltumoren signifikante Unterschiede im Wachstum und in den morphologischen Eigenschaften.
Der Graph der 9 zeigt die erhöhte Wachstumsrate bei Tumoren aus den VEGF-DΔN-Zellen. Die Tendenz zur Flüssigkeitsakkumulation in den durch die VEGF-DΔN-Zellen gebildeten Tumoren ist in 10 zu sehen, einer Photographie eines solchen Tumors. Dem steht die Photographie von 11 entgegen, die einen normalen Tumor zeigt, wie er durch die Kontrollzellen gebildet wird.
Die durch die VEGF-DΔC-Zellen gebildeten Tumore wuchsen ähnlich wie die Kontrollzellen und zeigten keine Flüssigkeitsbildung im Überschuß.
Die durch die VEGF-DΔNΔC-Zellen gebildeten Tumore wuchsen im Vergleich mit den Kontrolltumoren sehr langsam. Die VEGF-DΔ NΔC-Tumore bildeten sich in etwa 70 Tagen, verglichen mit durchschnittlich 30–35 Tagen für die Kontrolltumore und 20–25 Tagen für die VEGF-DΔN-Tumore. Eine Untersuchung dieser Tumore zeigte, daß sie eine verminderte Gefäßantwort hatten, indem sie gemäß PECAM-1-Färbung weniger Blutgefäße als die Kontrolltumore besaßen. Wie durch LYVE-1-Färbung gezeigt, entwickelten die Tumore Lymphgefäßnetze und induzierten die Bildung von Lymphmetastasen. Der Graph der 12 zeigt die verminderte Wachstumsrate bei Tumoren aus den VEGF-DΔNΔC-Zellen.
Ähnliche Färbemuster, wie sie in den Melanomen zu sehen waren, wurden beim Plattenepithelkarzinom der Lunge und bei duktalem Karzinom der Brust in situ (BDCIS) beobachtet, da VEGF-D in Tumorzellen und auf naheliegenden Gefäßen nachgewiesen wurde. Gefäße nahe den tumorgefüllten Milchgängen bei BDCIS und nahe den Inseln von Tumorzellen bei Lungenkarzinom waren ebenfalls positiv für VEGFR-2, was wiederum nahelegt, daß dieser Ligand und Rezeptor parakrin zur Regulation der Tumorangiogenese beitragen kann.
Diese Ergebnisse zeigen auch, daß VEGF-D eine Rolle bei der Stimulierung des Wachstums von Lymphgefäßen in Nachbarschaft zu malignem Melanom spielen könnte, da Gefäße, die positiv für VEGFR-3 waren, einen auf Lymphendothel in normalem adultem Gewebe exprimierten Rezeptor für VEGF-D, auch positiv für VEGF-D waren. Ähnliche Färbemuster waren bei BDCIS zu sehen, da einige der VEGF-D-positiven Gefäße, die die tumorgefüllten Milchgänge umgaben, auch für VEGFR-3 positiv waren. Man nimmt an, daß Signalgebung über VEGFR-3 für die Lymphangiogenese wichtig ist (Taipale, J. et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 237: 85–96, 1999), obwohl dieser Rezeptor bei Krebs auf Blutgefäßkapillaren hochreguliert sein kann (Valtola, R. et al., Am. J. Path., 154: 1381–1390, 1999). Daher könnte das parakrine Regulationssystem, das aus VEGF-D und VEGFR-3 besteht, sowohl Lymphangiogenese als auch Angiogenese bei Krebs stimulieren. Dementsprechend könnte der Weg, über den ein Tumor metastasiert, zum Teil nach seiner Fähigkeit festgestellt werden, Angiogenese und/oder Lymphangiogenese zu induzieren. In diesem Fall könnte die Expression von löslichen Wachstumsfaktoren, die im Gegensatz zu denen, die auch Lymphangiogenese induzieren könnten (z. B. VEGF-D), rein angingen sind (z. B. VEGF), durch Tumorzellen ein wichtiger Bestimmungsfaktor für den Weg der metastatischen Ausbreitung sein.

Claims

Verwendung eines VEGF-D-Antagonisten, der die Bindung von VEGF-D an seinen entsprechenden Rezeptor verhindert, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung einer neoplastischen Erkrankung, dadurch gekennzeichnet, daß die neoplastische Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: duktalem Karzinom der Brust, Plattenepithelkarzinom, Prostatakrebs und Endometriumkrebs.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der VEGF-D-Antagonist zusammen mit einem zytotoxischen Mittel verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Antagonist ferner wenigstens einen pharmazeutischen Träger- oder Hilfsstoff umfaßt.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1–3, wobei der Antagonist ein monoklonaler Antikörper ist, der VEGF-D spezifisch bindet und die Bindung von VEGF-D an VEGF-Rezeptor 2 oder VEGF-Rezeptor 3 blockiert.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei der Antikörper an die VEGF-Homologiedomäne von VEGF-D bindet.