KR20020080461A - 혈관 내피 성장인자 ｄ를 발현하는 암의 치료, 스크리닝,및 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

종양에 의한 VEGF-D의 발현을 특징으로 하는 흑색종 및 여러 가지 암을 치료 및 완화하는 방법으로서, 스크리닝하여 VEGF-D를 발현하는 종양세포를 가지는 유기체를 발견하는 단계 및 VEGF-D 길항제의 유효량을 투여하여 VEGF-D의 결합을 방지하는 단계를 포함하는 방법; 종양성 질환을 스크리닝하는 방법으로서, 여기에서 종양세포, 혈관 내피세포, 림프관 내피세포 및/또는 잠재적 종양 성장을 가지는 세포 와 같은 세포 위 또는 내에서 VEGF-D의 검출이 종양성 질환을 표시하는 방법; VEGF -D 또는 그것의 단편 또는 유사체를 투여함에 의해 유기체에서 정상 조직의 혈관화를 촉진 및 유지하는 방법; 전이의 위험에 대해 종양을 스크리닝하는 방법으로서, 여기에서 종양에 의한 VEGF-D의 발현이 전이의 위험을 표시하는 방법; 및 종양성 질환의 미세-전이를 검출하는 방법으로서, 여기에서 조직 샘플 위 또는 내에서 VEG F-D의 검출이 종양성 질환의 전이에 대한 표시인 방법이다.

Description

혈관 내피 성장인자 Ｄ를 발현하는 암의 치료, 스크리닝, 및 검출 방법{METHODS FOR TREATING, SCREENING FOR, AND DETECTING CANCERS EXPRESSING VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR D}
포유류 혈관 시스템의 2가지 주요 성분은 내피 및 평활근 세포이다. 내피세포는 포유류에 있는 모든 혈관 및 림프관의 내부 표면의 내막을 형성한다. 새로운 혈관의 형성은 2개의 상이한 과정인 혈관형성(vasculogenesis) 또는 맥관형성(ang-iogenesis)에 의해 발생할 수 있다(Risau W. Nature 386:671-674, 1997 참조). 혈관형성은, 초기 배아에서 일차 혈관총의 형성시 발생하는 것과 같이, 내피세포 전구체의 성숙한 내피세포로의 제자리 분화 및 맥관을 형성하기 위한 이들 세포의 회힙을 특징으로 한다. 반대로, 이미 존재하고 있는 맥관의 성장 및 분기에 의한 혈관의 형성인 맥관형성은 나중의 배발생(embryogenesis)시 중요하며, 성인에서 발생하는 혈관 성장의 원인이다. 맥관형성은 내피세포의 증식, 세포외 매트릭스의 퇴화, 맥관의 분기, 및 이어지는 세포 유착 사건을 포함하는 생리학적으로 복잡한 과정이다. 성인에서 맥관형성은 엄격하게 제어되며, 정상 환경하에서 여성 생식 시스템에 제한된다. 그러나, 맥관형성은 조직 손상에 반응하여 스위치온될 수 있다. 중요하게도, 고상 종양은 주변 조직에서 맥관형성을 유도할 수 있으며, 이로써 종양 성장이 지속되고 메타스타제의 형성을 용이하게 한다(Folman J. Nature Med. 1:27-31, 1995). 복잡한 맥관형성 과정의 근원적인 분자 메카니즘은 조금도 이해되지 않고 있다.
또한, 맥관형성은 다수의 병리학적 상태에 연루되며, 이 경우 그것은 질환의 상이한 후유증에 어떤 역할을 하거나 또는 직접적으로 연루된다. 일부 예들은 다양한 간질환에 관련된 신혈관화, 당뇨병의 신혈관 후유증, 고혈압의 신혈관 후유증, 외상후 신혈관화, 두부외상으로 인한 신혈관화, 만성 간감염(예를 들어, 만성 간염)의 신혈관화, 화상 또는 동상으로 인한 신혈관화, 호르몬 과잉에 관련된 기능장애, 혈관종 생성, 및 혈관형성술후 재협착을 포함한다.
너무나 많은 생리학적 및 병리학적 과정에서 맥관형성의 결정적인 역할 때문에, 맥관형성의 제어에 연루된 인자들이 집중적으로 조사되었다. 다수의 성장인자가 맥관형성의 조절에 연루된다고 알려졌으며, 이것들은 섬유아세포 성장인자(FGF) , 혈소판-유래 성장인자(PDGF), 형질전환 성장인자 알파(TGFα), 및 간세포 성장인자(HGF)를 포함한다. 예를 들어, Folkman 등, J. Biol. Chem., 267:10931-10934, 1992 참조.
내피세포-특이적 성장인자의 특정 패밀리인 혈관 내피 성장인자(VEGF), 및 그것들의 상응하는 수용체가 내피세포 성장 및 분화의 자극 및 분화된 세포의 어떤기능에 대한 일차적 원인이라고 제안되었다. 이들 인자는 PDGF/VEGF 패밀리의 멤버이며, 내피 수용체 티로신 키나제(RTK)에 의하여 일차적으로 작용하는 것 같다. 성장인자의 PDGF/VEGF 패밀리는 성장인자의 시스틴-knot 수퍼패밀리에 속하며, 또한 이것은 뉴로트로핀 및 형질전환 성장인자-β를 포함한다.
8개의 상이한 단백질이 PDGF/VEGF 패밀리에서 확인되었는데, 즉 2개의 PDGF (A 및 B), VEGF, 및 VEGF에 밀접하게 관련된 5개 멤버이다. VEGF에 밀접하게 관련된 5개 멤버는 국제특허출원 PCT/US96/02957(WO 96/26736) 및 루드빅 암연구소 및 헬싱키 대학에 의한 미국특허 5,840,693 및 5,607,918에 설명된 VEGF-B; Joukov 등 EMBO J., 15:290-298, 1996, Lee 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:1988-1992, 1996, 및 휴먼 게놈 사이언스사에 의한 미국특허 5,932,540 및 5,935,540에 설명된 VEGF-C 또는 VEGF2; 국제특허출원 번호 PCT/US97/14696(WO 98/07832) 및 Achen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:548-553, 1998에 설명된 VEGF-D; Maglione 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9267-9271, 1991에 설명된 태반 성장인자(PlGF); 및 휴먼 게놈 사이언스사에 의한 국제특허출원 번호 PCT/US95/07283(WO 96/39421)에 설명된 VEGF3이다. 각 VEGF 패밀리 멤버는 VEGF와 30% 내지 45%의 아미노산 서열 동일성을 가진다. VEGF 패밀리 멤버는 시스틴-knot 모티프를 형성하는 6개의 시스테인 잔기를 함유하는 VEGF 상동성 도메인을 공유한다. VEGF 패밀리의 기능적 특징으로는 계속 변화하는 내피세포에 대한 분열촉진성도, 혈관 투과성의 유도, 및 맥관형성 및 림프관형성 특성이 있다.
혈관 내피 성장인자(VEGF)는 몇몇 공급원으로부터 분리된 호모다이머 당단백이다. 단일 VEGF 유전자의 교대 mRNA 스플라이싱은 5개의 VEGF 동형을 발생시킨다. VEGF는 내피세포에 대해 매우 특이적인 분열촉진 활성을 보인다. VEGF는 배혈관형성 동안 새로운 혈관의 형성에 있어서, 그리고 성인의 일생 동안 맥관형성에서 중요한 조절 기능을 가진다(Carmeliet 등, Nature, 380:435-439, 1996; Ferrara 등, Nature, 380:439-442, 1996; Ferrara 및 Davis-Smyth, Endocrine Rev., 18:4-25, 1997). VEGF에 의해 수행되는 역할의 의의는 단일 VEGF 대립유전자의 비활성화가 맥관구조의 발생의 실패로 인해 배치사성을 초래한다는 것을 나타낸 연구에서 증명되었다(Carmeliet 등 Nature 380:435-439, 1996; Ferrara 등 Nature, 380:439-442, 1996). VEGF의 분리 및 특성이 검토되었다. Ferrara 등, J. Cellular Bioch em., 47:211-218, 1991 및 Connolly, J. Cellular Biochem., 47:219-223, 1991 참조.
게다가, VEGF는 단구를 향한 강한 화학유인성 활성을 가지며, 내피세포에서 플라스미노겐 활성인자 및 플라스미노겐 활성인자 저해인자를 유도할 수 있고, 또한 미세혈관 투과성을 유도할 수 있다. 후자의 활성 때문에, 그것은 때로 혈관투과인자(VPF)로 언급된다. 또한, VEGF는 어떤 조혈세포에 대해 주화성이다. 최근의 문헌은 VEGF가 수지상세포의 성숙을 차단함으로써 종양에 대한 면역반응의 유효성을 감소시킨다는 것을 나타낸다(Gabrilovich 등, Blood 92:4150-4166, 1998; Ga-brilovich 등, Clinical Cancer Research 5:2963-2970, 1999).
VEGF-B는 VEGF와 유사한 맥관형성 특성 및 다른 특성을 가지지만, VEGF와는 상이한 조직에 분포되어 발현된다. 특히, VEGF-B는 심장에서 매우 강하게 발현되고 폐에서는 단지 약하게 발현되지만, VEGF의 경우는 그 반대이다. 이것은 VEGF 및 VEGF-B가 많은 조직에서 함께 발현된다는 사실에도 불구하고, 그것들이 기능적 차이를 가질 수 있다는 것을 시사한다.
VEGF-B는 세포 레티노산-결합 단백질 제 I형(CRABP-I)과 상호작용하는 세포 단백질의 스크리닝에 의한 이스트 공동-혼성 상호작용 트랩 스크리닝 기술을 사용하여 분리되었다. 그것의 분리 및 특징은 PCT/US96/02957(WO 96/26736), 루드빅 암연구소 및 헬싱키 대학에 의한 미국특허 5,840,693 및 5,607,918, 및 Olofsson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:2576-2581, 1996에 상세히 설명된다.
VEGF-C는 VEGFR-3을 발현하도록 트랜스펙트된 세포를 사용하여, 내피세포-특이적 수용체 티로신 키나제 VEGFR-3(Flt4)의 티로신 인산화를 야기하는 배지의 능력을 스크리닝함에 의해, PC-3 전립선 선암종 셀라인(CRL1435)의 콘디셔닝 배지로부터 분리되었다. VEGF-C는 재조합 VEGFR-3을 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었고, PC-3 cDNA 라이브러리로부터 클론되었다. 그것의 분리 및 특징이 Joukov 등, EMBO J., 15:290-298, 1996에 상세히 설명된다.
VEGF-D는 혼성화 프로브인 "Soares Breast 3NbHBst"로 지정된 사람 cDNA 라이브러리로부터 얻어진 발현된 서열 태그를 사용한 스크리닝에 의해, 클론테크로부터 상업적으로 입수가능한 사람 유방 cDNA 라이브러리로부터 분리되었다(Achen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:548-553, 1998). 그것의 분리 및 특징은 국제특허출원 번호 PCT/US97/14696(WO 98/07832)에 상세히 설명된다.
또한, PCT/US97/14696에는 VEGF-DΔNΔC로 지정된 VEGF-D의 생물학적 활성단편의 분리가 설명된다. 이 단편은 친화성 태그 펩티드 FLAG에 연결된 VEGF-D 아미노산 잔기 93에서 201로 구성된다. 국제특허출원 PCT/US97/14696(WO 98/07832 )의 명세서 전체가 참고자료로서 본원에 포함된다.
VEGF-D 유전자는 성인 사람에서 광범위하게 발현되지만, 물론 어디에서나 발현되지는 않는다. VEGF-D는 심장, 폐 및 골격근에서 강하게 발현된다. 비장, 난소, 소장 및 결장에서는 VEGF-D가 중간 수준으로 발현되고, 신장, 췌장, 흉선, 전립선 및 고환에서는 더 낮은 수준으로 발현된다. VEGF-D mRNA는 뇌, 태반, 간 또는 말초혈 백혈구로부터의 RNA에서는 검출되지 않았다.
PlGF는 만기 태반 cDNA 라이브러리로부터 분리되었다. 그것의 분리 및 특징은 Maglione 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9267-9271, 1991에 상세히 설명된다. 그것의 생물학적 기능은 현재 잘 이해되지 않고 있다.
VEGF3은 결장조직으로부터 유래된 cDNA 라이브러리로부터 분리되었다. VEGF3은 VEGF와 약 36%의 동일성 및 66%의 유사성을 가진다고 한다. VEGF3를 코드하는 유전자의 분리 방법은 명백하지 않으며, 생물학적 활성의 특성화도 개시되지 않고 있다.
2개 단백질의 유사성은 아미노산 서열을 비교함에 의해 측정되며, 단백질 중 1개의 아미노산 치환은 제 2 단백질의 서열로 전환되지만, 동일성은 전환된 아미노산 치환을 포함하지 않고 측정된다.
림프 시스템의 주요 기능은 조직으로부터의 체액 반환을 제공하는 것과 많은 혈관외 물질을 혈액으로 다시 수송하는 것이다. 게다가, 성숙 과정 동안, 림프구는 혈액을 떠나 림프양 기관 및 다른 조직을 통해 이동하여 림프관으로 들어가며, 흉관을 통해 혈액으로 되돌아온다. 특수화된 소정맥인 고내피 소정맥(HEV)은 림프구와 다시 결합하며, 그것들이 조직으로 혈관외 유출되는 원인이 된다. 따라서, 림프관, 특히 림프절은 면역학 및 상이한 종양의 전이의 발생에서 중요한 역할을 한다. 혈관과는 달리, 림프 시스템의 배기원은 명백하지 않으며, 적어도 3가지의 상이한 이론이 그것의 기원에 관해 존재한다. 림프관은 그것들을 위해 이용가능한 공지된 특이적 마커가 존재하지 않기 때문에 확인하기 어렵다.
림프관은 림프절조영술의 도움으로 가장 통상적으로 연구된다. 림프절조영술에서는 X-선 대비매체가 림프관에 직접 주사된다. 대비매체는 림프 시스템의 수출 배액관을 따라 분포되어 림프절에 수집된다. 대비매체는 림프절에 반년까지 머물 수 있으며, 이 기간 동안의 X-선 분석은 림프절의 크기 및 구축구조의 추적을 허용한다. 이 진단법은 림프절로 전이된 암환자 및 림프종과 같은 림프성 악성종양에서 특히 중요하다. 그러나, 림프 조직을 영상화하기 위한 재료 및 방법의 개선이 본 분야에 필요하다.
상기 주지된 바와 같이, PCGF/VEGF 패밀리 멤버는 수용체 티로신 키나제와의 결합에 의해 주로 작용한다. 일반적으로, 수용체 티로신 키나제는 당단백이며, 특이적 성장인자(들)과 결합할 수 있는 세포외 도메인, 통상 단백질의 알파-헬릭스 부분인 트랜스멤브레인 도메인, 예를 들어 단백질 인산화에 의해 수용체가 조절될 수 있는 경우의 근접멤브레인, 수용체의 효소 성분인 티로신 키나제 도메인, 및 많은 수용체에서 티로신 키나제에 대한 기질의 인식 및 결합에 연루된 카르복시-말단꼬리로 구성된다.
5개의 내피세포-특이적 수용체 티로신 키나제가 확인되었는데, 즉 VEGFR-1(Flt-1), VEGFR-2(KDR/Flt-1), VEGFR-3(Flt4), Tie 및 Tek/Tie-2이다. 이들 수용체는 그것들의 특이성 및 친화성에 차이가 있다. 이들 모두는 신호 변환에 필요한 고유한 티로신 키나제 활성을 가진다.
VEGF와 결합한다고 알려진 유일한 수용체 티로신 키나제는 VEGFR-1, VEGFR-2 및 VEGFR-3이다. VEGFR-1 및 VEGFR-2는 높은 친화성으로 VEGF와 결합하며, VEGFR-1은 또한 VEGF-B 및 PlGF와 결합한다. VEGF-C는 VEGFR-3에 대한 리간드라고 알려졌으며, 또한 VEGFR-2를 활성화시킨다(Joukov 등, The EMBO Journal, 15:290-298, 1996). VEGF-D는 VEGFR-2 및 VEGFR-3 모두와 결합한다(Achen 등 Proc. Natl. Acad Sci. USA, 95:548-553, 1998). Tek/Tie-2에 대한 리간드는 리제너론 파마슈티칼스사에 의한 국제특허출원 번호 PCT/US95/12935(WO 96/11269)에 설명되었다. Tie에 대한 리간드는 아직 확인되지 않았다.
최근에 신규한 130-135kDa VEGF 동형 특이적 수용체가 정제되어 클론되었다 (Soker 등, Cell, 92:735-745, 1998). VEGF 수용체는 엑손 7 코드된 서열에 의하여 VEGF165동형과 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀졌으며, 이것은 헤파린에 대한 약한 친화성을 나타낸다(Soker 등, Cell, 92:735-745, 1998). 놀랍게도, 이 수용체는 초기 단계 신경형태형성에 연루된 수용체인 사람 뉴로필린-1(NP-1)과 동일한 것으로 나타났다. 또한, PlGF-2는 NP-1과 상호작용하는 것 같다(Migdal 등 J BiolChem, 273:22272-22278, 1998).
VEGFR-1, VEGFR-2 및 VEGRF-3은 내피세포에 의해 상이하게 발현된다. 일반적으로, VEGFR-1 및 VEGFR-2는 모두 혈관 내피에서 발현되고(Oelrichs 등 Oncogene 8:11-18, 1992; Kaipainen 등, J. Exp. Med., 178:2077-2088, 1993; Dumont 등, Dev. Dyn., 203:80-92, 1995; Fong 등, Dev. Dyn., 207:1-10, 1996), VEGFR-3은 성인 조직의 림프 내피에서 대부분 발현된다(Kaipainen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9:3566-3570, 1995). 또한, VEGFR-3은 종양을 둘러싼 혈관구조에서도 발현된다.
VEGFR-1은 주로 발생 동안 내피 세포에서 발현되지만, 그것은 또한 배발생의 초기 단계 동안 조혈 전구체 세포에서도 발견될 수 있다(Fong 등, Nature, 376:66-70, 1995). 성인에서는 또한 단구 및 마크로파지가 이 수용체를 발현한다(Barleon 등, Blood, 87:3336-3343, 1995). 배아에서 VEGFR-1은 전부는 아지니만 대부분 맥관에 의해 발현된다(Breier 등, Dev. Dyn., 204:228-239, 1995; Fong 등, Dev. Dyn., 207:1-10, 1996).
수용체 VEGFR-3은 초기 배발생 동안 내피 세포 상에서 광범위하게 발현되지만, 배발생 진행은 소정맥 내피로, 이어서 림프 내피로 제한된다(Kaipainen 등, Cancer Res., 54:6571-6577, 1994; Kaipainen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:3566-3570, 1995). VEGFR-3은 성인 조직의 림프 내피세포 상에서 발현된다. 이 수용체는 배발생 동안의 혈관 발생에 필수적이다.
VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, Tie 및 Tek/Tie-2의 혈관형성, 맥관형성 및/또는 림프관형성(lymphangiogenesis)에서의 필수적이고 특이적인 역할은 마우스 배아에서 이들 수용체를 비활성화시키는 목표한 돌연변이에 의해 입증되었다. VEGFR 유전자의 파괴는 임신중기 근처에 배치사성을 가져오는 맥관구조의 이상 발생을 초래한다. 완전히 비활성화된 VEGFR-1 유전자를 지니는 배아의 분석은 이 수용체가 내피의 기능적 조직화에 필요하다는 것을 시사한다(Fong 등 Nature 376:66-70, 1995). 그러나, VEGFR -1의 세포내 티로신 키나제 도메인의 결실은 정상 맥관구조를 가지는 생존가능한 마우스를 발생시킨다(Hiratsuka 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:9349-9354, 1998). 이들 차이의 근원적인 이유는 여전히 설명되어야 하지만, 티로신 키나제에 의하여 신호화하는 수용체는 VEGFR-1의 적절한 기능에 필요하지 않다. VEGFR-2의 비활성화된 대립유전자를 가지는 동형접합 마우스의 분석은 이 수용체가 내피세포 증식, 조혈작용 및 혈관형성에 필요하다는 것을 시사한다(Shalaby 등, Nature, 376:62-66, 1995; Shalaby 등, Cell, 89:981-990, 1997). 마우스에 있는 VEGFR-3 유전자의 양쪽 카피의 목표한 비활성화는 결함 있는 루멘을 가지는 비정상적으로 조직된 대맥관을 특징으로 하는 결함 있는 혈관의 형성을 초래하여, 심낭강에 체액을 축적시키고 교미후 9.5일에 심혈관 부전을 가져온다(Dumont 등, Science, 282: 946-949, 1998). 이들 발견을 기초로 하여, VEGFR-3이 일차 혈관 망조직의 더 큰 혈관으로의 성숙에 필요하다고 제안되었다. 그러나, 림프 맥관구조의 발생에서 VEGFR-3의 역할은 림프 시스템이 나타나기 전에 배아가 죽었기 때문에 이들 마우스에서 연구될 수 없었다. 그럼에도 불구하고, VEGFR-3은 림프 맥관구조의 발생 및 림프관형성에서 어떤 역할을 한다고 추측되며,배발생 및 성인의 일생 동안 림프 내피세포에 그것의 특이적 발현을 제공한다. 이것은 트랜스제닉 마우스의 피부에서 VEGFR-3에 대한 리간드인 VEGF-C의 변위 발현이 진피에서 림프 내피세포 증식 및 맥관확대를 가져온다는 발견에 의해 지지된다. 더욱이, 이것은 VEGF-C가 림프 내피에서 일차적 기능을, 그리고 VEGF와 공유된 맥관형성 및 투과성 조절에서 이차적 기능을 가질 수 있다는 것을 시사한다(Joukov 등, EMBO J., 15:290-298, 1996).
게다가, VEGF-유사 단백질은 orf 바이러스의 4개의 상이한 균주에 의해 코드된다고 확인되었다. 이것은 VEGF-유사 단백질을 코드한다고 보고된 최초의 바이러스이다. 처음의 2개 균주는 NZ2 및 NZ7이며 Lyttle 등, J. Virol., 68:84-92, 1994에 설명된다. 세번째는 D1701이며 Meyer 등, EMBO J., 18:363-374, 1999에 설명된다. 네번째 균주는 NZ10이며 국제특허출원 PCT/US99/25869에 설명된다. 이들 바이러스 VEGF-유사 단백질은 숙주(양/염소/사람)의 내피 상에서 VEGFR-2와 결합하며, 이 결합은 감염의 발생에 중요하다고 나타났다(Meyer 등, EMBO J., 18:363-374, 1999; Ogawa 등, J. Biol. Chem., 273:31273-31282, 1988; 및 국제특허출원 PCT/US99/25869). 이들 단백질은 VEGF와 그리고 서로 아미노산 서열 유사성을 나타낸다.
orf 바이러스는 양 및 염소에서 전염성이 높은 농포성 피부염을 일으키며 사람에게 쉽게 전파될 수 있는 파라폭스바이러스 속 종의 종류이다. orf 바이러스 감염에 의해 유발된 농포성 피부염은 혈관 확장, 국소 영역의 팽화, 및 혈관 내막의 내피세포의 현저한 증식을 특징으로 한다. 이들 특징은 orf에 의해 감염된 모든 종에서 보여지며, 상피세포에 바이러스 복제로 인한 종양-유사 성장 또는 소결절의 형성을 초래할 수 있다. 일반적으로, orf 바이러스 감염은 몇주 내에 해결되지만, 면역 손상 개체에서는 외과적 개입 없이 해결할 수 없는 심한 감염이 나타난다.
VEGF의 수용체-매개 작용을 길항할 수 있는 제약학적 제제의 개발에 지대한 관심이 있다(Martiny-Baron 및 Marme, Curr. Opin. Biotechnol. 6:675-680, 1995). VEGF에 대한 단일클론 항체는 종양-관련 맥관형성을 저해함에 의해 생체내에서 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났다(Kim 등, Nature 362:841-844, 1993). 종양 성장에 대한 유사한 저해 효과가 VEGF의 안티센스 RNA(Saleh 등, Cancer Res. 56:393-401, 1996) 또는 우성-음성 VEGFR-2 돌연변이(Millauer 등, Nature 367:576 -579, 1994)의 발현으로부터 생긴 모델 시스템에서 관찰되었다.
그러나, 중화 항체를 사용한 종양 저해 연구는 VEGF 이외의 다른 맥관형성인자가 연루될 수 있다는 것을 시사했다(Kim, K. 등, Nature 362:841-844, 1993). 더욱이, 포유류 흑색종에서 VEGF 이외의 다른 맥관형성인자의 활성은 모든 흑색종이 VEGF를 발현하지 않는다는 발견에 의해 시사된다(Issa, R. 등, Lab Invest 79: 417-425, 1999).
VEGF 패밀리의 상이한 멤버들의 생물학적 기능이 현재 해명되고 있다. 특히 흥미로운 것은 VEGF-D 및 VEGF-C의 특성이다. 이들 단백질은 VEGFR-2 및 VEGFR-3(각각 혈관 및 림프 내피세포 상에 위치한) 모두와 결합하며, 일차 구조에 밀접하게 관련된다(48% 아미노산 동일성). 이 2개 인자는 시험관내에서 내피세포에 대해 분열촉진성이다. 최근, VEGF-C는 마우스 각막 모델 및 조류 장뇨막에서 맥관형성성인 것으로 나타났으며(Cao 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14389-14394, 1998), 조직허혈을 되게 하는 중에 맥관형성을 유도할 수 있었다(Witzenbichler 등, Am. J. Pathol. 153:381-394, 1998). 더욱이, VEGF-C는 조류 장뇨막(Oh 등 Dev. Biol. 188:96-109, 1997) 및 트랜스제닉 마우스 모델(Jeltsch 등 Science 276:1423-1425, 1997)에서 림프관형성을 자극했다. VEGF-D는 토끼 각막에서 맥관형성성인 것으로 나타났다(Marconcini 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9671-9676, 1999). VEGF-D의 림프관형성 능력은 아직 보고되지 않았지만, VEGF-D는 VEGF-C처럼 림프관형성에 대한 신호로 생각되는 수용체인 VEGFR-3과 결합하여 이것을 활성화시킨다고 하며(Taipale 등, Cur. Topics Micro. Immunol. 237:85-96, 1999), VEGF-D가 림프관형성성일 가능성은 매우 높은 것 같다. VEGF-D 및 VEGF-C는 메타스타제가 혈관 또는 림프관에 의해 전파될 수 있으므로 악성의 종양에 특히 중요할 수 있으며, 따라서 맥관형성 또는 림프관형성을 자극하는 분자는 악성에 기여할 수 있다. 이것은 이미 VEGF의 경우에 나타났다. VEGF-D 유전자 발현이 악성에 중요하다고 알려진 전사 인자인 c-Fos에 의해 유도된다는 것이 주목할 만하다(Orlandini 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11675-11680, 1996). c-Fos가 악성에 기여하는 메카니즘은 맥광형성인자를 코드하는 유전자의 상향조절이라고 추측된다. c-Fos에 결함이 있는 종양 세포는 아마도 맥관형성을 유도할 수 없기 때문에 악성으로의 진행을 격지 않는다(Saez, E. 등, Cell 82:721-732, 1995). 이것은 종양 진행 동안 c-Fos에 의해 상향조절되는 맥관형성인자의 존재를 나타낸다.
도 1에 나타낸 바와 같이, VEGF-D의 지배적인 세포내 형태는 VEGF/PDGF 상동성 도메인(VHD) 및 N- 및 C-말단 프로펩티드로 구성된 호모다이머 프로펩티드이며, SEQ ID NO:2의 서열을 가진다. 분비 후 이 폴리펩티드는 단백질 가수분해적으로 절단된다(Stacker, S. A. 등, J. Biol. Chem. 274:32127-32136, 1999). 단백질 가수분해 프로세싱(검은색 화살표로 표시된 위치)은 부분적으로 프로세스된 형태 및 완전히 프로세스된 성숙한 형태를 발생시키며, 성숙한 형태는 VHD의 다이머로 구성된다. SEQ ID NO:3(즉, 전길이 VEGF-D의 잔기 93에서 201)의 서열을 가지는 VHD는 VEGFR-2 및 VEGFR-3 모두에 대한 결합 부위를 함유한다. 성숙한 형태는 프로세스되지 않은 형태보다 훨씬 더 높은 친화성으로 VEGFR-2 및 VEGFR-3 모두와 결합한다 (Stacker, S. A. 등, J. Biol. Chem. 274:32127-32136, 1999).
사람 암에서 VEGF-D 단백질의 국소화는 VEGF-D의 VHD에 대해 특이적인 항체의 결여로 인해 연구되지 않았다. N- 또는 C-말단 프로펩티드에 대한 항체는 이들 영역이 생물활성 VHD로부터 절단되어 VHD와는 다르게 국소화하기 때문에 부적당하다.
본 발명은 일반적으로 흑색종 및 여러 가지 암을 치료 및 완화하는 방법, 종양성 질환을 스크리닝하는 방법, 및 정상 조직의 혈관화를 촉진 및 유지하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 VEGF-D 프로세싱의 도식적 표현이다.
도 2는 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가된 사람 VEGF-D의 VEGF/PDGF 상동성 도메인(VHD)에 대한 MAb 4A5의 특이성을 나타낸다.
도 3은 VEGF-D 안티센스 및 센스 RNA와 혼성화된 교미후 15.5일 된 마우스 조직 절편에 대한 노출 2일 후 찍은 방사능 사진을 나타낸다.
도 4A-4D는 제자리 혼성화에 의한 교미후 15.5일 된 마우스 배아에서 VEGF-D mRNA의 분포에 대한 분석 결과를 나타낸다.
도 5A-5H는 상이한 반응 패턴을 예시하는 2가지 악성 흑색종으로부터의 면역조직화학 분석 결과를 나타낸다.
도 6A-6F는 폐의 편평세포암종에서 VEGF-D의 국소화를 나타낸다.
도 7A-7F는 제자리 유방관암종에서 VEGF-D의 국소화를 나타낸다.
도 8은 제자리 자궁내막 선암종에서 VEGF-D의 국소화를 나타낸다.
도 9A-9F는 정상 결장조직에서 VEGF-D의 국소화를 나타낸다.
도 10은 트랜스펙트되지 않은 모 293 세포("293"으로 지정) 및 VEGF-D-FULL-N-FLAG를 코드하는 발현 벡터로 트랜스펙션된 293 세포("VEGF-D-293"으로 지정)의주사로부터 생긴 SCID 마우스의 종양 분석 결과를 나타낸다.
도 11은 VEGF-DΔN 세포에 의해 생성된 종양을 나타낸다.
도 12는 정상 종양을 나타낸다.
본 발명은 일반적으로 흑색종 및 여러 가지 암을 치료 및 완화하는 방법, 종양성 질환을 스크리닝하는 방법, 및 정상 조직의 혈관화를 유지하는 방법에 관한 것이다.
제 1 양태에 따라서, 본 발명은 제한은 없지만 흑색종, 유방관암종, 편평세포암종, 전립선종양 및 자궁내막암을 포함하는 종양에 의한 VEGF-D의 발현을 특징으로 하는 종양성 질환으로 고통받는 유기체를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 유기체를 스크리닝하여 VEGF-D-발현 종양세포의 존재 또는 부재를 측정하는 단계; 스크리닝에서 VEGF-D를 발현하는 종양을 가지는 것으로 측정된 유기체를 선택하는 단계; 및 상기 종양 부근에 유효량의 VEGF-D 길항제를 투여하여 VEGF-D와 그것의 상응하는 수용체의 결합을 방지하는 단계를 포함한다.
VEGF-D 길항제는 안티센스 핵산 또는 VEGF-D를 코드하는 삼중가닥 DNA를 포함하는 조성물의 사용과 마찬가지로 VEGF-D 발현을 저해할 수 있다.
또한, VEGF-D 길항제는 항체 및/또는 다이머 형성 및 수용체 결합에서 VEGF-D의 결합에 대한 경쟁적 또는 비경쟁적 저해제를 포함하는 화합물의 사용과 마찬가지로 VEGF-D 활성을 저해할 수 있다. 이들 VEGF-D 길항제는 하기 설명된 VEGF-D 변형 폴리펩티드를 포함하며, 이것은 VEGF-D와 결합할 수 있는 능력을 가지고 VEGF -D 수용체와의 결합을 방지하거나 또는 VEGF-D 수용체와 결합할 수 있는 능력을 가지지만, 내피세포 증식, 분화, 이동 또는 생존을 자극할 수 없다. VEGF-D, VEGFR-2 또는 VEGFR-3에 대한 소분자 저해제 및 VEGF-D, VEGFR-2 또는 VEGFR-3에 관한 항체도 또한 사용될 수 있다.
어떤 변형된 VEGF-D 폴리펩티드는 제한은 없지만 내피세포, 결합조직세포, 근섬유아세포 및/또는 중간엽세포를 포함하는 세포 상에서 VEGF-D 수용체와 결합할 수 있는 능력을 가질 수 있지만, 세포 증식, 분화, 이동, 운동성 또는 생존을 자극하거나, 또는 혈관 증식, 결합조직 발생 또는 상처 치유를 유도할 수는 없을 것으로 사료된다. 이들 변형된 폴리펩티드는 VEGF-D 폴리펩티드 및 PDGF/VEGF 패밀리성장인자의 경쟁적 또는 비경쟁적 저해제로서 작용할 수 있으며, VEGF-D 폴리펩티드 또는 PDGF/VEGF 패밀리 성장인자 작용의 방지 또는 감소가 바람직한 상황에서 유용할 것으로 예상된다. 따라서, 또한, 그러한 수용체-결합성이지만, 비-미토겐성, 비-분화 유도성, 비-이동 유도성, 비-운동성 유도성, 비-생존 촉진성, 비-결합조직 발생성, 비-상처 치유성, 또는 비-혈관 증식 유도성인 VEGF-D 폴리펩티드의 변이체도 본 발명의 범위 내이며, 본원에서 "수용체-결합성이지만 다른 점에서는 비활성인 변이체"로 언급된다. VEGF-D는 그것의 수용체를 활성화시키기 위해 다이머를 형성하기 때문에, 한 모노머는 상기 언급된 "수용체-결합성이지만 다른 점에서는 비활성인 변이체" VEGF-D 폴리펩티드를 포함하고, 제 2 모노머는 야생형 VEGF -D 또는 PDGF/VEGF 패밀리의 야생형 성장인자를 포함할 것으로 사료된다. 따라서, 이들 다이머는 그것의 상응하는 수용체와 결합할 수는 있지만 하류 신호화를 유도할 수는 없다.
또한, 제한은 없지만 내피세포, 결합조직세포(섬유아세포와 같은), 근섬유아세포 및/또는 중간엽세포를 포함하는 세포 상에서 야생형 VEGF-D 또는 PDGF/VEGF 패밀리의 야생형 성장인자와 그것의 상응하는 수용체의 결합을 방지할 수 있는 다른 변형된 VEGF-D 폴리펩티드가 있을 것으로 사료된다. 따라서, 이들 다이머는 내피세포 증식, 분화, 이동, 생존을 자극하거나, 또는 혈관 투과성을 유도할 수 없으며, 및/또는 결합조직세포, 근섬유아세포 또는 중간엽세포의 증식 및/또는 분화 및 /또는 운동성을 자극할 수 없다. 이들 변형된 폴리펩티드는 VEGF-D 성장인자 또는 PDGF/VEGF 패밀리 성장인자의 경쟁적 또는 비경쟁적 저해제로서 작용할 수 있으며,VEGF-D 성장인자 또는 PDGF/VEGF 패밀리 성장인자 작용의 방지 또는 감소가 바람직한 상황에서 유용할 것으로 예상된다. 그러한 상황은 일차 또는 전이성 종양 형성에 의해 정상 세포 집단으로 종양세포가 칩입하는 동안 일어나는 조직 리모델링을 포함한다. 따라서, 또한, 그러한 VEGF-D 또는 PDGF/VEGF 패밀리 성장인자-결합성이지만, 비-미토겐성, 비-분화 유도성, 비-이동 유도성, 비-운동성 유도성, 비-생존 촉진성, 비-결합조직 촉진성, 비-상처 치유성, 또는 비-혈관 증식 유도성인 VEGF-D 성장인자의 변이체도 본 발명의 범위 내이며, 본원에서 "VEGF-D 성장인자-다이머 형성성이지만 다른 점에서는 비활성 또는 방해성인 변이체"로서 언급된다.
VEGF-D 폴리펩티드의 가능한 변형 형태는 변형에 필수적인 VEGF-D 폴리펩티드의 영역을 표적화함에 의해 제조될 수 있다. 이들 필수적인 영역은 강하게 보존된 PDGF/VEGF 상동성 도메인(VDH) 내에 있을 것으로 예상된다. 특히, VEGF를 포함하여 PDGF/VEGF 패밀리의 성장인자는 다이머이며, VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PlGF, PDGF-A 및 PDGF-B는 VHD에 있는 8개 시스테인 잔기의 완전한 보존을 나타낸다(Olofsson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 93 2576-2581; Joukov 등, EMBO J., 1996 15 290-298). 이들 시스테인은 분자내 및 분자간 이황화 결합에 연루된다고 생각된다. 게다가, 완전하지는 않지만 더 강하게 보존된 시스테인 잔기가 C-말단 도메인에 있다. 분자내 이황화 결합에 의해 형성된 각 VHD 서브유닛의 루프 1, 2 및 3은 PDGF/VEGF 패밀리의 성장인자의 수용체와의 결합에 연루된다(Anderss-on 등, Growth Factors, 1995 12 159-164). 변형된 폴리펩티드는 내피세포 증식 분석과 같은 통상적인 활성 분석 과정에 의해 VEGF-D의 생물학적 활성을 저해할 수있는 능력에 대해 쉽게 시험될 수 있다.
또한, 본 발명에 유용한 VEGF-D 길항제는 VEGFR-2(Flk1) 또는 VEGFR-3(Flt4)의 VEGF-D 결합 도메인에 해당하는 폴리펩티드를 포함하는 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, Achen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:548-553, 1998에 설명된, 사람 VEGFR-2 및 사람 VEGFR-3의 세포외 도메인을 함유하고, VEGF-DΔNΔC와 결합하는 가용성 Ig 융합 단백질이 VEGF-D 길항제로서 적합하게 사용될 수 있다.
또한, 흑색종 및 여러 가지 암을 치료 및 완화하는 방법은 사망에 이르게 하는 VEGF-D, VEGFR-2 및/또는 VEGFR-3을 발현하는 종양을 표적화함에 의해 발생할 수 있다. 이것은 본 발명의 폴리펩티드, VEGF-D, VEGFR-2 또는 VEGFR-3에 관한 항체, 또는 VEGF-D, VEGFR-2 또는 VEGFR-3에 관한 소분자와 세포독성제를 커플링하는 것을 포함하며, 이로써 VEGF-D, VEGFR-2 및/또는 VEGFR-3을 발현하는 종양을 죽인다. 그러한 세포독성제는 제한은 없지만 식물 독소(예를 들어, 리신 A 사슬, 사포린), 박테리아 또는 진균 독소(예를 들어, 디프테리아 독소) 또는 방사성뉴클레오티드(예를 들어 211-아스타틴, 212-비스무스, 90-이트륨, 131-요딘, 99-테크니튬), 알킬화제(예를 들어, 클로람부실), 항-유사분열제(예를 들어, 빈카 알칼로이드), 및 DNA 개재화제(예를 들어, 아드리아마이신)를 포함한다.
또한, VEGF-D의 생물학적 활성을 저해하는 폴리펩티드, VEGF-D 길항제 또는 항체가 제약학적으로 허용되는 그것들의 비독성염 및 제약학적으로 허용되는 고체 또는 액체 담체 또는 보조제와 조합하여 사용될 수 있다. 바람직한 제약학적 조성물은 적어도 VEGF-D에 의해 유도된 생물학적 활성을 저해하거나 또는 방해할 것이다.
그러한 담체 또는 보조제의 예는 제한은 없지만 살린, 완충살린, 링거액, 미네랄오일, 활석, 콘스타치, 젤라틴, 락토스, 수크로스, 미세결정 셀룰로스, 카올린, 만니톨, 인산이칼슘, 염화나트륨, 알긴산, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 비후제, 안정제, 현탁제, 및 그것들의 조합을 포함한다. 그러한 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 크림, 고약, 엘리시르, 시럽, 웨이퍼, 연고, 또는 다른 종래 형태의 형태일 수 있다. 조제물은 물론 투여 방식에 맞춰지도록 공지된 원리에 따라서 적합하게 될 수 있다. 본 발명의 펩티드를 포함하는 조성물은 활성 화합물(들)을 약 0.1중량% 내지 90중량%, 가장 일반적으로 약 10% 내지 30% 함유한다.
투여의 용량(들) 및 경로는 환자의 성질 및 치료될 상태에 의존하며, 주치의 또는 수의사의 자유재량이다. 적합한 경로는 경구, 피하, 근육내, 복강내 또는 정맥내 주사, 비경구, 국부 도포, 이식 등을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드 또는 항체의 유효량이 그것을 필요로 하는 유기체에 0.1 내지 100mg/체중kg, 더 바람직하게 1 내지 10mg/체중kg의 용량으로 투여된다. 전형적으로 긴 계산상의 반감기를 나타내는 사람화된 항체에 있어서, 매일에서 매월까지의 범위, 더 바람직하게 매주, 또는 격주, 또는 3주마다의 간격으로 투약하는 것이 구체적으로 고려된다. 치료법의 진행, 환자 부작용 및 계산상의 항체 수준을 모니터링하는 것은 최적 투약 섭생을 위한 추가의 지침을 제공한다. 또한, 다른 항체-기제 암치료법에 대한 공개되고 진행중인 임상시험으로부터의 자료가 유용한 투약 섭생 지침을 제공한다. VEGF-D의 국부 도포는 VEGF와 유사한 방식으로 사용될 수 있다.
제 2 양태에 따라서, 본 발명은 종양성 성장물 또는 그 주위에서 혈관의 혈관 내피세포의 증가를 특징으로 하는 종양성 질환을 스크리닝 및/또는 진단하는 방법을 제공한다. 이 방법은 종양성 성장물 또는 그 주위에서 혈관의 혈관 내피세포의 증가를 특징으로 하는 종양성 질환 상태로 의심되는 유기체로부터 샘플을 얻는 단계; 상기 샘플을 VEGF-D와 특이적으로 결합하는 화합물을 포함하는 조성물에 노출하는 단계; 상기 샘플을 세척하는 단계; 및 상기 샘플에서 상기 화합물의 존재, 양 또는 분포를 검출함에 의해 상기 질환을 스크리닝하는 단계를 포함하며, 여기에서 잠재적 종양성 성장물 및 그 주위에 있는 혈관의 혈관 내피세포 내 또는 위에서 VEGF-D의 검출이 종양성 질환에 대한 표시이다. 이 방법은 샘플을 VEGFR-2 및/또는 VEGFR-3과 특이적으로 결합하는 제 2 화합물에 노출하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 여기에서 스크리닝 단계는 VEGF-D와 결합하는 화합물 및 혈관의 혈관 내피세포와 결합된 제 2 화합물을 검출하여, 잠재적 종양성 성장물 및 그 주위에서 VEGF-D 및 VEGFR-2 및/또는 VEGFR-3을 모두 가지는 혈관의 혈관 내피세포의 존재, 양 또는 분포를 측정하는 것을 포함한다.
본 명세서의 취지를 위하여, 용어 "샘플"이 제한은 없지만 조직 샘플, 혈액, 혈청, 혈장, 오줌, 복수액 또는 흉막유출을 얻는 것을 포함한다는 것이 명백히 이해될 것이다. 조직은 바람직하게 사람 조직이고, 화합물은 바람직하게 단일클론 항체이다. 종양 또는 그 근처에 있는 맥관에서 발견된 VEGF-D가 수용체-매개 업테이크로 인해 비롯된다는 것을 의사가 확인하는데 제 2 화합물의 사용이 도움이 된다는 것이 높이 평가되며, 이것은 종양세포에 의해 분비된 VEGF-D가 표적 내피세포와 결합하여 거기에 축척됨으로써 종양 맥관형성을 조절하는 측분비 메카니즘을 확립한다는 가설을 지지한다.
제 3 양태에 따라서, 본 발명은 VEGF-D의 발현 증가를 특징으로 하는 종양성 질환을 스크리닝 및/또는 진단하는 방법을 제공한다. 이 방법은 VEGF-D의 발현 증가를 특징으로 하는 질환 상태로 의심되는 유기체로부터 샘플을 얻는 단계; 상기 샘플을 VEGF-D와 특이적으로 결합하는 화합물을 포함하는 조성물에 노출하는 단계; 상기 샘플을 세척하는 단계; 및 상기 샘플에서 상기 화합물의 존재, 양 또는 분포를 검출함에 의해 상기 질환을 스크리닝하는 단계를 포함하며, 여기에서 잠재적 종양성 성장물 및 그 주위에 있는 세포에서 VEGF-D의 검출이 종양성 질환에 대한 표시이거나, 또는 잠재적 종양성 성장물 및 그 주위에 있는 혈관 내피세포 내 또는 위에서 VEGF-D의 검출이 종양성 질환에 대한 표시이다.
제 4 양태에 따라서, 본 발명은 림프관 내피세포의 변화를 특징으로 하는 종양성 질환을 스크리닝 및/또는 진단하는 방법을 제공한다. 이 방법은 림프관 내피세포의 증가를 특징으로 하는 질환 상태로 의심되는 유기체로부터 샘플을 얻는 단계; 상기 샘플을 VEGF-D와 특이적으로 결합하는 화합물을 포함하는 조성물에 노출하는 단계; 상기 샘플을 세척하는 단계; 및 상기 조직 샘플에서 상기 화합물의 존재, 양 또는 분포를 검출함에 의해 상기 질환을 스크리닝하는 단계를 포함하며, 여기에서 잠재적 종양성 성장물 및 그 주위에 있는 림프 내피세포 내 또는 위에서 VEGF-D의 검출이 종양성 질환에 대한 표시이다. 이 방법은 조직 샘플을 VEGFR-3과 특이적으로 결합하는 제 2 화합물에 노출하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 여기에서 스크리닝 단계는 VEGF-D와 결합하는 화합물 및 림프관 내피세포와 결합된 제 2 화합물을 검출하여, 잠재적 종양성 성장물 및 그 주위에서 VEGF-D 및 VEGFR-3을 모두 가지는 림프관 내피세포의 존재, 양 또는 분포를 측정하는 것을 포함한다.
종양 또는 그 근처에 있는 림프관에서 발견된 VEGF-D가 수용체-매개 업테이크로 인해 비롯된다는 것을 의사가 확인하는데 제 2 화합물의 사용이 도움이 된다는 것이 높이 평가되며, 이것은 종양세포에 의해 분비된 VEGF-D가 표적 림프 내피세포와 결합하여 거기에 축척됨으로써 종양 림프관형성을 조절하는 측분비 메카니즘을 확립한다는 가설을 지지한다.
제 5 양태에 따라서, 본 발명은 유기체에서 조직의 혈관화을 유지하는 방법을 제공하며, 이 방법은 VEGF-D, 또는 VEGF-D의 생물학적 활성을 가지는 그것의 단편 또는 유사체의 유효량을 그러한 치료를 필요로 하는 상기 유기체에 투여하는 단계를 포함한다.
특히 말초 맥관이 위축된 상태일 수 있는 노인 환자에서, VEGF-D/VEGF가 환자의 조직 내에 제한되어 있는 경우 제 5 양태가 중요할 것으로 사료된다. 유효량의 VEGF-D를 사용한 치료는 노화/손상된 맥관에서 내피세포 증식을 자극함에 의해 맥관구조의 완전성을 유지하는데 도움이 될 수 있다.
바람직하게, VEGF-D는 전길이의 프로세스되지 않은 VEGF-D 또는 충분히 프로세스된 성숙한 형태의 VEGF-D로서 뿐만 아니라, 본원에 규정된 VEGF-D의 생물학적 활성을 가지는 전길이의 VEGF-D 및 성숙한 형태의 VEGF-D 모두의 단편 또는 유사체로서 발현된다.
본 명세의 취지를 위하여, 문단 "충분히 프로세스된 VEGF-D"가 N- 및 C-말단 프로펩티드를 가지지 않는 SEQ ID NO:3의 서열을 가지는 성숙한 형태의 VEGF-D 폴리펩티드, 즉 VEGF 상동성 도메인(VHD)을 의미한다는 것이 명백히 이해될 것이다. 문단 "단백질 가수분해적으로 프로세스된 형태의 VEGF-D"는 N- 및/또는 C-말단 프로펩티드를 가지지 않는 VEGF-D 폴리펩티드를 의미하며, 문단 "프로세스되지 않은 VEGF-D"는 N- 및 C-말단 프로펩티드를 모두 가지는 SEQ ID NO:2의 서열을 가지는 전길이 VEGF-D 폴리펩티드를 의미한다.
SEQ ID NO:2의 서열을 가지는 전길이 VEGF-D 폴리펩티드는 선택적으로 FLAG펩티드에 연결될 수 있다. 전길이 VEGF-D 폴리펩티드가 FLAG에 연결되는 경우, 이 단편은 본원에서 VEGF-D-FULL-N-FLAG로 언급된다. VEGF-D의 바람직한 단편은 선택적으로 FLAG펩티드에 연결된 아미노산 잔기 93에서 아미노산 잔기 201까지의 VEGF-D의 부분(즉, VHD(SEQ ID NO:3))이다. 이 단편이 FLAG에 연결된 경우, 단편은 본원에서 VEGF-DΔNΔC로 언급된다.
표현 "VEGF-D의 생물학적 활성"은 내피세포 증식, 분화, 이동, 생존 또는 혈관 투과성 중 1가지 이상을 자극할 수 있는 능력을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
보존성 치환, 삽입 또는 결실을 포함하지만, 여전히 VEGF-D의 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩티드가 본 발명의 범위 내임이 명백히 이해되어야 한다. 당업자는 그러한 폴리펩티드를 생성하는데 쉽게 사용될 수 있는 방법, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발, 또는 특이적 효소 절단 및 리게이션의 사용을 잘 알고 있을 것이다. 또한, 당업자는 펩티드의태성 화합물 또는 1개 이상의 아미노산 잔기가 비-천연발생 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해 대체된 화합물이 VEGF-D의 생물학적 활성의 필요한 양태를 보유할 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 그러한 화합물은 쉽게 만들어져 본 분야에 공지된 방법에 의해 시험될 수 있으며, 또한 본 발명의 범위 내이다.
바람직하게, 아미노산 치환이 사용된 경우, 이 치환은 보존성이며, 즉 아미노산이 유사한 크기 및 유사한 하전 특성을 가지는 아미노산에 의해 대체된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "보존성 치환"은 다른 생물학적으로 유사한 잔기에 의한 아미노산 잔기의 대체를 표시한다. 보존성 치환의 예는 이소로이신, 발린, 로이신, 알라닌, 시스테인, 글리신, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신, 노르로이신 또는 메티오닌과 같은 한 소수성 잔기의 다른 소수성 잔기로의 치환, 또는 한 극성 잔기의 다른 극성 잔기로의 치환, 예를 들어 알기닌의 리신으로의 치환, 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환, 또는 글루타민의 아스파라긴으로의 치환 등을 포함한다. 서로 치환될 수 있는 중성 친수성 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌을 포함한다. 또한, 용어 "보존성 치환"은 치환되지 않은 모 아미노산 대신 치환된 아미노산의 사용을 포함한다.
그러한 바, 본 발명의 내용에 있어서, 보존성 치환은 한 아미노산의 유사한 특성을 가지는 다른 아미노산으로의 치환으로 본 분야에서 인지된다는 것이 이해되어야 한다. 전형적인 보존성 치환이 WO 97/09433의 다음 표 A에 제시된다.
또는 달리, 보존성 아미노산은 다음 표 B에 제시된 Lehninger(Biochemistry, 2판; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp. 71-77)에 설명된 대로 분류될 수 있다.
전형적인 보존성 치환이 다음 표 C에 제시된다.
VEGF 및 VEGF-B를 사용하여 발생한다고 알려진 대로, 교대 스플라이싱으로부터 생길 수 있는 VEGF-D 폴리펩티드의 가능한 변이체 형태, 및 VEGF-D를 코드하는 핵산 서열의 천연발생 대립유전자 변이체가 본 발명의 범위 내이다. 대립유전자 변이체는 본 분야에 잘 알려져 있으며, 1개 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 부가를 포함하지만, 코드된 폴리펩티드의 어떤 실질적인 기능적 변경은 초래하지 않는 핵산 서열의 다른 형태를 표시한다.
VEGF-D의 그러한 변이체 형태는 변형에 비필수적인 VEGF-D 폴리펩티드의 영역을 표적화함에 의해 제조될 수 있다. 이들 비필수적인 영역은 강하게 보존된 영역의 외부에 있을 것으로 예상된다. 특히, VEGF를 포함하여 PDGF/VEGF 패밀리의 성장인자는 다이머이며, VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PlGF, PDGF-A 및 PDGF-B는 N-말단 도메인, 즉 PDGF/VEGF-유사 도메인에 있는 8개 시스테인 잔기의 완전한 보존을 나타낸다(Olofsson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 93 2576-2581; Jou-kov 등, EMBO J. 1996 15 290-298). 이들 시스테인은 분자내 및 분자간 이황화 결합에 연루된다고 생각된다. 게다가, 완전하지는 않지만 더 강하게 보존된 시스테인 잔기가 C-말단 도메인에 있다. 분자내 이황화 결합에 의해 형성된 각 VHD 서브유닛의 루프 1, 2 및 3은 PDGF/VEGF 패밀리의 성장인자의 수용체와의 결합에 연루된다(Andersson 등, Growth Factors, 1995 12 159-164).
따라서, 당업자는 이들 시스테인 잔기가 어떤 제안된 변이체 형태에서 보존되어야 하며, 또한 루프 1, 2 및 3에 존재하는 활성 부위도 보존되어야 한다는 것을 잘 알고 있다. 그러나, 분자의 다른 영역은 생물학적 기능에 있어 좀 덜 중요할 것으로 예상되며, 따라서 변형을 위한 적합한 표적을 제공할 수 있다. 변형된 폴리펩티드는 내피세포 증식 분석과 같은 통상적인 활성 분석 과정에 의해 VEGF-D의 생물학적 활성을 나타낼 수 있는 능력에 대해 쉽게 시험될 수 있다.
VEGF-D의 강한 신호가 조혈세포의 서브세트에 존재한다는 것이 알려졌다. 이들 세포는 어떤 종류의 염증반응에서 어떤 종양의 말초 영역으로 몰려든다. 따라서, 이 과정의 저해가 이런 염증반응을 방지하는 것이 바람직한 경우 유용하다.
따라서, 본 발명의 제 6 양태는 이들 종양의 조혈세포의 이런 서브세트에 기인하는 염증반응을 저해하는 방법을 제공하며, 이 방법은 조혈세포의 이런 서브세트에 의한 VEGF-D의 발현 또는 활성을 저해하는 단계를 포함한다. 이런 종류의 염증반응을 저해하는 것은 자가면역질환, 예를 들어 관절염의 치료에 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
또한, 본 발명에 따르는 항체는 검출가능한 표지로 표지될 수 있으며, 진단의 목적으로 이용된다. 항체는 영상화를 위해 적합한 초자성, 상자성, 고전자밀도, 생태성(ecogenic) 또는 방사성 제제와 공유적으로 또는 비공유적으로 커플링될 수 있다. 진단 분석에서의 사용을 위해, 방사성 또는 비-방사성 표지가 사용될 수 있다. 방사성 표지의 예는125I 또는32P와 같은 방사성 원자 또는 기를 포함한다. 비-방사성 표지의 예는 양고추냉이 퍼옥시다제와 같은 효소 표지, 또는 플루오레세인-5-이소티오시아네이트(FITC)와 같은 형광 표지를 포함한다. 표지화는 직접적 또는 간접적, 공유적 또는 비공유적일 수 있다.
본 발명의 더 이상의 양태에 따라서, 본 발명은 악성 흑색종, 유방관암종, 편평세포암종, 전립선암 또는 자궁내막암과 같은 종양에 의한 VEGF-D의 발현을 특징으로 하는 종양성 질환으로 고통받는 유기체, 예를 들어 포유류를 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 상기 종양 부근에 유효량의 VEGF-D 길항제를 투여하여 VEGF-D와 그것의 상응하는 수용체의 결합을 방지하는 단계를 포함한다. 바람직하다면, 세포독성제가 VEGF-D 길항제와 함께 공동-투여될 수 있다. 바람직한 VEGF-D길항제는 VEGF-D와 특이적으로 결합하여 VEGF-D와 VEGF 수용체-2 또는 VEGF 수용체 -3의 결합을 차단하는 단일클론 항체, 특히 VEGF-D의 VEGF 상동성 도메인과 결합하는 항체이다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 전이의 위험에 대해 종양을 스크리닝하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 종양 샘플을 VEGF-D와 특이적으로 결합하는 화합물을 포함하는 조성물에 노출하는 단계; 샘플을 세척하는 단계; 및 상기 샘플에서 상기 화합물의 존재, 양 또는 분포를 검출함에 의해 전이의 위험을 스크리닝하는 단계를 포함하며, 종양에 의한 VEGF-D의 발현이 전이의 위험에 대한 표시이다. 본 발명의 이 양태에 사용되는 바람직한 화합물은 VEGF-D와 특이적으로 결합하는 단일클론 항체, 특히 VEGF-D의 VEGF 상동성 도메인과 결합하는 항체이며, 검출가능한 표지로 표지된다.
본 발명의 더 이상의 양태는 VEGF-D의 발현 증가를 특징으로 하는 종양성 질환 상태의 미세-전이를 검출하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 종양성 질환 상태의 유기체에서, 종양성 성장물을 둘러싼 조직으로부터 림프절을 얻는 것과 같이, 종양성 성장물에서 떨어져 있는 부위로부터 조직 샘플을 얻는 단계; 샘플을 VEGF-D와 특이적으로 결합하는 화합물을 포함하는 조성물에 노출하는 단계; 샘플을 세척하는 단계; 및 조직 샘플에서 상기 화합물의 존재, 양 또는 분포를 검출함에 의해 상기 종양성 질환의 상기 전이를 스크리닝하는 단계를 포함하며, 조직 샘플에서 VEGF-D의 검출이 상기 종양성 질환의 전이에 대한 표시이다. 다시, 바람직한 화합물은 VEGF-D와 특이적으로 결합하는 단일클론 항체, 특히 VEGF-D의 VEGF 상동성 도메인과 결합하는 항체를 포함하며, 검출가능한 표지로 표지된다.
본 명세서의 취지를 위하여, 단어 "포함하는"이 "포함하지만 제한은 없는"을 의미한다는 것이 명백히 이해될 것이다. 상응하는 의미가 단어 "포함하다"에도 적용된다.
실시예 1
사람 VEGF-D와 결합하는 단일클론 항체의 생성
N- 및 C-말단 특성 보다는 오히려 VEGF/PDGF 상동성 도메인(VHD)을 검출하기 위해서, 성숙한 형태의 사람 VEGF-D(전길이 VEGF-D(SEQ ID NO:2)의 잔기 93에서 201, 즉 N- 및 C-말단 영역이 제거됨)를 마우스에서 조달했다. 잔기 93에서 201을 코드하는 DNA 단편을 Pfu DNA 중합효소를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 증폭했다. 전길이 사람 VEGF-D cDNA(SEQ ID NO:1)를 주형으로 사용했다. 다음에,뉴클레오티드 서열화에 의해 정확함을 확인한 증폭된 DNA 단편을 발현 벡터 pEFBOS SFLAG(Clare McFarlane 박사로부터, Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research(WEHI), 호주 멜버른)에 삽입하여 pEFBOSVEGF-DΔNΔC로 지정된 플라스미드를 발생시켰다. pEFBOSSFLAG 벡터는 인터류킨-3(IL-3) 유전자로부터의 단백질 분비에 대한 신호 서열을 코드하는 DNA 및 FLAG옥타펩티드(시그마-알드리치)를 함유한다. FLAG옥타펩티드는 M2 단일클론 항체(시그마-알드리치)와 같은 상업적으로 입수가능한 항체로 인정될 수 있다. VEGF-D PCR 단편을 벡터에 삽입하여, IL-3 신호 서열을 FLAG옥타펩티드로부터의 상류 바로 가까이에 있게 했고, 이것을 차례로 절형된 VEGF-D 서열로부터의 상류 바로 가까이에 있게 했다. 3개 서열은 모두 동일한 리딩 프레임 안에 있었으며, 그래서 pEFBOSVEGF-DΔNΔC를 포유류 세포에 트랜스펙션한 결과인 mRNA의 번역은 N-말단에 IL-3 신호 서열을 가지는 단백질을 발생시킨 후, FLAG옥타펩티드 및 절형된 VEGF-D 서열을 발생시켰다. 신호 서열의 절단 및 이어진 세포로부터 단백질의 분비는 N-말단에 인접한 FLAG옥타펩티드로 태그를 붙인 VEGF-D 폴리펩티드를 발생시켰다. VEGF-DΔNΔC를 플라스미드 pEFBOSVE GF-DΔNΔC로 일시적으로 트랜스펙트된 COS 세포의 배지로부터 항-FLAG친화성 크로마토그래피에 의해 정제했다(국제특허출원 번호 PCT/US97/14696의 실시예 9 참조)
정제된 VEGF-DΔNΔC를 사용하여, 면역화된 마우스로부터 비장세포를 수집하기 전 85일(복강내), 71일(복강내) 및 4일(정맥내)에 암컷 Balb/C 마우스를 면역화하고, 이어서 이들 비장세포와 마우스 골수종 P3X63Ag8.653(NS-1) 세포를 융합시켰다. 처음 2번의 면역화를 위해 PBS와 TiterMax 보조제(#R-1 연구 보조제; CytRx Corp., 조지아 노르크로스)의 1:1 혼합물 중의 대략 10㎍의 VEGF-DΔNΔC를 주사했고, 3번째 면역화를 위해 PBS 중의 35㎍의 VEGF-DΔNΔC를 사용했다.
VEGF-DΔNΔC에 대한 단일클론 항체를 효소 면역분석법을 사용하여 정제된 VEGF-DΔNΔC 상의 혼성세포를 스크리닝함에 의해 선택했다. 간단히 말해서, 96-웰 마이크로플레이트를 VEGF-DΔNΔC로 코팅했고, 혼성세포 상청액을 첨가하여 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 0.02% Tween 20을 가지는 PBS 중에서 6번 세척했다. 이어서, 양고추냉이 퍼옥시다제 콘쥬게이트 항-마우스 Ig(Bio-Rad, 캘리포니아 허큘레스)와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 세척한 후 이 분석을 2,2'-아지노-디-(3-에틸벤즈-티아졸린 술폰산)(ABTS) 기질 시스템을 사용하여 전개시켰고, 멀티-웰 플레이트 리더(Flow Laboratories MCC/340, 버지니아 맥린)에서 405nm에서의 흡광도를 판독하여 정량했다. 6개 항체를 더 이상의 분석을 위해 선택했고, 제한 희석에 의해 2번 서브클론했다. 이들 항체를 2F8, 3C10, 4A5, 4E10, 4H4 및 5F12로 지정했다. 이 항체들의 부기준표본을 IsotripTM부기준표본 키트(뵈링거 만하임, 인디애나 인디애나폴리스)을 사용하여 측정했다. 6개 항체는 모두 kappa 경쇄를 함유했다.
혼성세포 셀라인을 5%v/v IgG-고갈 혈청(Gibco BRL, 매릴랜드 게티스버그), 5mM L-글루타민, 50㎍/ml 겐타마이신 및 10㎍/ml 재조합 IL-6을 함유하는 DMEM 중에서 성장시켰다. 항체 2F8, 4A5, 4E10 및 5F12를 Darby 등, J. Immunol. Methods 159:125-129, 1993의 기술에 따라서 단백질 G-세파로스를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 정제했고, 280nm에서의 흡광도를 측정하여 수율을 평가했다.
실시예 2
4A5의 특이성
사람 VEGF-D의 VHD에 대한 MAb 4A5(VD1로 개명)의 특이성을 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가했다. 사용된 VEGF-D의 유도체는 FLAG옥타펩티드로 N-말단에 태그를 붙인 사람 VEGF-D의 아미노산 잔기 593에서 201로 구성된 VEGF-DΔNΔC(실시예 1), FLAG로 N-말단에 태그를 붙인 전길이 VEGF-D로 구성된 VEGF-D-FULL-N-FLAG(Stacker, S. A. 등, J. Biol. Chem. 274:32127-32136, 1999), 및 N-말단에 FLAG로 태그를 붙인 아미노산 잔기 206에서 354까지의 C-말단 프로펩티드로 구성된 VEGF-D-CPRO였다. 이들 단백질을 293-EBNA-1 세포에서 발현시켰고, Achen M. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:548-553, 1998에 제시된 과정을 사용하여 M2(항-FLAG) MAb(IBI/코닥, 코네티컷 뉴헤븐)를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 정제했다. 정제된 VEGF-D-FULL-N-FLAG(FN), VEGF-DΔNΔC(ΔΔ), 및 VEGF-D-CPRO(CP) 50ng을 대조표준으로서 VD1 MAb 및 바이오틴화된 M2 MAb를 사용하여 SDS-PAGE(환원) 및 웨스턴 블롯에 의해 분석했다(블롯팅에 사용된 항체는 도 2의 패널 아래에 나타낸다). SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석은 Stacker, S. A. 등, J. Biol. Chem. 274:32127-32136, 1999에 설명된 대로 수행했다.
도 2에 나타낸 바와 같이, VEGF-D-FULL-N-FLAG의 샘플에서 지배적인 종은 프로세스되지 않은 VEGF-D(Mr ~53K), N-말단 프로펩티드 및 VHD(~31K)를 모두 함유하는 부분적으로 프로세스된 VEGF-D, 및 N-말단 프로펩티드(~10K)로 구성되며(Stack-er, S. A. 등, J. Biol. Chem. 274:32127-32136, 1999), 이것들은 모두 FLAG옥타펩티드로 태그를 붙였기 때문에 M2 MAb와 함께 검출된다(왼쪽 화살표, 숫자는 K의 Mr을 표시하며, 하첨자는 밴드가 검출된 샘플을 나타낸다). 마찬가지로, VEGF-DΔNΔC(~21K) 및 VEGF-D-CPRO(상이한 글리코실화로 인해 생긴 ~31 및 ~29K의 2개 밴드)가 이들 폴리펩티드도 FLAG로 태그를 붙였기 때문에 M2(왼쪽 화살표)와 함께 검출된다. VD1는 프로세스되지 않은 VEGF-D, 부분적으로 프로세스된 VEGF-D 및 VEGF-DΔNΔC를 검출하지만, VEGF-D-FULL-N-FLAG 제조물의 N-말단 프로펩티드(~10K ) 및 VEGF-D-CPRO 샘플(~31 및 ~29K)의 C-말단 프로펩티드를 검출하지는 않는다. VEGF-D-FULL-N-FLAG의 결과를 장(L) 및 단(S) 노출을 사용하여 분석했다. 분자량 마커의 위치는 도 2의 오른쪽에 나타낸다.
따라서, MAb VD1은 프로세스되지 않은 VEGF-D, VHD를 함유하는 부분적으로 프로세스된 형태, 및 충분히 프로세스된 VEGF-D와 결합하지만, N- 또는 C-말단 프로펩티드와는 결합하지 않는다. 더욱이, MAb VD1은 효소 면역분석법에서 자생 사람 VEGF-DΔNΔC를 면역침전시킬 수 있었지만, 사람 VEGF-C(VEGF-DΔNΔC)의 VHD를 그렇게 하지는 못했으며(Joukov, V. 등, EMBO J 16:3898-3911, 1997), 이것은 VD1이 VEGF-D에 특이적이라는 것을 나타낸다.
실시예 3
마우스 배아에서의 VEGF-D 유전자 발현에 대한 제자리 혼성화 연구
VEGF-D 유전자 발현의 패턴을 마우스 VEGF-D1 cDNA(SEQ ID NO:4)의 뉴클레오티드 1에서 340에 해당하는 방사성 표지된 안티센스 RNA 프로브를 사용하여 제자리 혼성화에 의해 연구했다. 안티센스 RNA를 T3 RNA 중합효소 및 [35S]UTPαs를 사용하여 시험관내 전사에 의해 합성했다. 마우스 VEGF-D는 국제특허출원 PCT/US97/14 696(WO 98/07832)에 충분히 설명된다. 이 안티센스 RNA 프로브를 교미후 15.5일 된 마우스 배아의 파라핀-포매된 조직 절편과 혼성화시켰다. 표지된 절편에 2일간방사능 사진술을 행했다. 안티센스 RNA 및 상보성 센스 RNA(음성 대조표준)와 혼성화된 절편에 대한 결과의 방사능 사진을 도 3에 나타낸다. 도 3에서, "L"은 폐를 표시하고 "Sk"는 피부를 표시하며, 나타낸 이 2개의 조직 절편은 연속하는 절편이다. VEGF-D mRNA의 강한 신호가 발생중인 폐에서 검출되었고, 피부에 관련되었다. 대조표준 센스 RNA를 사용한 것은 신호가 검출되지 않았다.
도 4A-4D에서, 시상조직 절편을 VEGF-D 안티센스 RNA 프로브와 혼성화했고, 이어서 포토그래픽 에멀젼과 함께 인큐베이션하고 현상하고 염색했다. 도 4A 및 4D의 확대는 x40이고, 도 4B는 x200, 도 4C는 x500이다.
도 4A에서, 현미경 사진의 어두운 부분은 폐(Lu)에서 VEGF-D mRNA의 강한 신호를 나타낸다. 또한, 간(Li) 및 늑골(R)도 나타난다. 도 4B는 더 높게 확대한 폐를 나타낸다. 사진의 밝은 부분은 기관지(BR) 및 기관지동맥(BA)을 나타낸다. 직사각형의 검은 윤곽선은 더 높게 확대하여 도 4C에 나타낸 절편의 영역을 표시한다. 도 4C는 기관지 내피세포(Ep), 내피세포층을 둘러싼 발생중인 평활근세포(SM) 및 중간엽세포(Mes)를 나타낸다. 중간엽세포에 관련된 풍부한 은색 과립이 외견상 보인다. 따라서, 현미경 분석은 VEGF-D mRNA가 발생중인 폐의 중간엽세포에 풍부하다는 것을 드러낸다(도 4A-4C). 반대로, 기관지 및 세기관지의 내피세포는 기관지를 둘러싼 발생중인 평활근세포가 그랬던 것처럼 음성이다. 또한, 기관지동맥의 내피세포도 음성이다.
도 4D에서, 사진의 어두운 부분은 지아를 나타낸다. 강한 신호가 섬유아세포 및 발생중인 멜라닌세포로 부화된 조직 영역의 피부 바로 아래에 위치했다.
이들 결과는 VEGF-D가 발생중인 폐 및 피부 바로 아래의 영역에서 혈관 및 림프관의 성장을 끌어낼 수 있다는 것을 지적한다. 배피부에 인접한 VEGF-D 유전자의 발현으로 인해, VEGF-D가 악성 흑색종에 관련된 맥관형성을 유도하는데 있어 어떤 역할을 할 수 있을 것으로 사료된다. 악성 흑색종은 매우 고도로 혈관화된 종양이다. 이것은 예를 들어 VEGF-D 또는 VEGF 수용체-2 또는 VEGF 수용체-3 항체를 사용한 VEGF-D 발현의 국소적 저해가 악성 흑색종의 치료에 유용하다는 것을 시사한다. 또한, 안티센스 핵산 또는 삼중가닥 DNA와 같은 VEGF-D 활성의 다른 적합한 저해제도 사용될 수 있다.
실시예 4
사람 종양의 면역조직화학 분석을 위한 사람 VEGF-D에 대한 단일클론 항체의 사용
종양 맥관형성에서 VEGF-D의 역할을 평가하기 위하여, VEGF-D MAb, 4A5, 5F12 및 2F8(각각 VD1, VD2 및 VD3로 개명)을 15개의 무작위적으로 선택된 칩입성 악성 흑색종의 면역조직화학 분석에 사용했다. 또 분석에 사용된 것은 사람 VEGFR -2에 대한 MAb(시그마, 미주리 세인트루이스) 및 VEGFR-3에 대한 다중클론 항체(친화성 정제된 항-사람 Flt-4 항체; R & D 시스템, 미네소타 미네아폴리스)였다. LMM774(Layton 등, Growth Factors 14:117-130, 1997)로 지정된 과립구 콜로니-자극인자의 수용체에서 비롯된 MAb를 음성 대조표준으로 사용했다. VEGF-D MAb와 같이 LMM774도 마우스 IgG1 부기준표본이었고, 따라서 부기준표본-매치된 대조표준 항체로서 사용했다. 피부 악성 흑색종의 포르말린 고정 및 파라핀 포매된 조직으로부터의 5㎛ 두께의 절편을 시험 조직으로 사용했다. 이 절편을 탈랍 및 재수화시킨 후 PBS로 세척했다. 일차 항체를 인큐베이션 시간에 따라 5 내지 40㎍/ml의 농도에서 조직 절편과 함께 인큐베이션했다. 항-VEGF-D MAb를 조직 절편과 함께 인큐베이션하기 전에 40배몰 과잉의 VEGF-DΔNΔC와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했던 흡수 대조표준과 마찬가지로, 일차 항체가 생략된 단계 생략 대조표준을 병행하여 수행했다. LMM744 항체를 가지는 부기준표본-매치된 대조표준을 또한 수행했다. 알칼리성 포스파타제-콘쥬게이트된 이차 항체의 검출을 패스트 레드 기질(시그마, 미주리 세인트루이스)을 사용하여 달성했다. 어떤 경우, 면역조직화학 전에 0.25% 과망간산칼륨 중에서 3시간 인큐베이션한 후 1% 옥살산 중에서 6분간 인큐베이션하여 조직 절편에서 멜라닌을 표백시켰다. 이들 경우, 퍼옥시다제-콘쥬게이트된 이차 항체의 검출은 3,3'-디아미노벤자딘(DAB)(Dako Corp., 캘리포니아 카핀테리아)을 사용했다.
양성 반응이 본질적으로 동일한 염색 패턴을 가지는 모든 3개 VEGF-D MAb에서 보였다. VEGF-D 면역반응성이 시험된 15개 흑색종 중 13개에서 검출되었다. 흑색종은 병소 전체가 염색된 균질성에서부터 병소의 침입성 말초에서 반응하는 국소화까지의 범위의 반응 패턴을 나타냈다.
도 5A-5H는 상이한 반응 패턴을 예시하는 2개 종양으로부터의 면역조직화학 분석의 결과를 나타낸다. 도 5A 및 5B에서 항체 검출은 패스트 레드 기질(빨간색이 양성 신호를 표시한다)을 사용했고, 도 5C-5H에서는 DAB(갈색이 양성 신호를 표시한다)를 사용했다. 도 5C-5H에 나타낸 조직 절편은 항체와 함께 인큐베이션하기전에 멜라닌을 표백시켰다. 도 5E 및 5G를 제외한 모든 패널에 사용된 VEGF-D 항체는 VD1(4A5)였다. 도 5A의 스케일바는 150㎛를 표시하고, 도 5B-5D에서는 20㎛, 도 5E-5H에서는 10㎛를 표시한다.
도 5A 및 5B에 나타낸 바와 같이, 불균일한 염색이 제 1 흑색종의 벌크를 통해 외견상 보였다. 이 종양에서, 검출된 VEGF-D 염색은 종양의 주된 벌크의 칩입성 부분의 말초에 있는 종양세포의 피내 둥지(흰색 화살촉)에서 더욱 두드러지며, 중앙 부분에서는 좀 덜 강하거나 또는 검출불가능하다. 또한, VEGF-D는 양성 반응 종양세포(도 5B)에 인접한 젖꼭지 및 그물 모양의 진피에 있는 작은 모세관 크기의 맥관(흰색 화살표) 및 전-모세관 및 후-모세관 세정맥 크기의 비후해진 벽이 있는 혈관에서 검출된다.
도 5C에 보여진 바와 같이, 제 2 흑색종에서, VEGF-D는 종양 덩어리 전체에 더욱 균일하게 분포되며, 종양에 있는 혈관에서 뿐만 아니라 종양세포에서도 검출되었다. 음성으로 염색된 스트로마의 영역을 검은 별표로 표시한다.
상기 언급된 2개 종양에 있어서, 종양에서 좀 떨어져 있는, 그리고 종양 및 한선에서 멀리 떨어진 그물 모양의 진피 가운데 및 이 깊숙이 있는 상부 진피 모세관 맥관 및 다른 혈관은 매우 약한 혈관벽 염색을 보였거나 또는 혈관벽 염색을 보이지 않았으며, 면역반응성 종양세포에 인접한 소맥관에서 보여진 과립 세포질 내피세포 염색을 나타내지 않았다. 또한, 비-종양성 접합성 멜라닌세포가 음성이었으며, 이것은 VEGF-D가 성인 피부에서 이 세포에 의해 발현되지 않는다는 것을 나타낸다. 도 5C의 조직에 대한 연속하는 대조표준 절편인 도 5D는 흡수 대조표준이음성이었음을 나타낸다. 또한, 단계 생략 및 부기준표본-매치된 대조표준도 음성이었다.
악성 흑색종의 절편을 성인 조직에 있는 림프관의 내피세포 상에서 발현되는 VEGF-D에 대한 수용체인 VEGFR-3의 국소화에 대해 분석했다(Lymboussaki, A. 등, Am. J. Pathol. 153:395-403, 1998). 도 5E에 보여진 바와 같이, VEGFR-3은 흑색종에 있는 얇은벽 맥관의 내피세포(흰색 화살표)에서 검출되었다. 또한, 연속하는 절편에 대한 면역조직화학 분석에 의해 평가된 바, 종양세포에 인접한 VEGFR-3 양성 맥관이 VEGF-D(도 5F)에 대해 양성이었으며, 이것은 이들 맥관의 VEGF-D 면역반응성이 내피세포로의 수용체-매개 업테이크로 인해 비롯될 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 면역조직화학에 의해 절편들을 VEGFR-2의 국소화에 대해 분석했다. VEGFR-2는 종양에 있는 혈관의 내피에서 상향조절된다고 알려져 있다(Plate K. 등, Cancer Res, 53:5822-5827, 1993). 도 5G에 보여진 바와 같이, VEGFR-2는 혈관의 내피(흰색 화살표) 및 가까운 종양에서 검출되었다. 또한, VEGFR-2에 대해 면역양성인 맥관 중 일부는 VEGF-D(도 5H의 흰색 화살표)에 대해서도 양성이었으며, 이것은 종양 맥관으로의 VEGF-D 업테이크도 이 수용체에 의해 매개될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 5
폐암에서의 VEGF-D
신맥관형성은 비-소세포 폐암종(NSCLC)에 대한 유용한 예후의 표식이라고 생각된다(Fontanini, G. 등, Clin Cancer Res. 3:861-865, 1997). 따라서, 면역조직화학에 의해 VEGF-D의 국소화를 편평세포암종의 케이스에서 분석했다(도 6A-6F). 면역조직화학을 실시예 4에서와 같이 수행했으며, 단 알파-평활근 액틴에 대한 항체(DAKO Corp., 캘리포니아 카핀테리아)를 또한 면역염색에 사용했다. 도 6A 및 6D에서 면역염색에 사용된 항-VEGF-D MAb는 VD1(4A5)였다. 도 6A는 VEGF-D가 현미경 사진의 중앙에 있는 섬을 형성하는 종양세포, 인접한 대맥관의 내막세포, 및 결합조직형성 스트로마 내의 세포에서 검출된다는 것을 나타낸다. 결합조직형성 스트로마를 검은색 괄호로 나타내며, 점선 상자는 도 6D에서 더 높은 위력으로 나타낸 영역을 표시한다. 스트로마에 있는 면역양성 세포는 근섬유아세포일 수 있다.
도 6B는 VEGFR-2가 대맥관의 내막세포에서 검출된다는 것을 나타낸다. 그러나, 이들 맥관은 이 종양에 있는 VEGFR-3에 대해 음성이었다. 점선 상자는 도 6E에서 더 높은 위력으로 나타낸 영역을 표시한다. VEGF-D MAb를 40배몰 과잉의 사람 VEGF-D의 VHD와 예비 인큐베이션했던, 동일한 케이스로부터의 조직 절편의 대조표준 염색은 신호를 제공하지 않았다(도 6C).
상기 언급된 바와 같이, 결합조직형성 스트로마에 있는 면역양성 세포는 근섬유아세포일 수 있다. 따라서, 결합조직형성 스트로마를 근섬유아세포를 검출하는 알파-평활근 액틴에 특이적인 MAb를 사용하여 면역염색했다. 도 6F에 보여진 바와 같이, 스트로마는 양성으로 염색되었으며, 이것은 근섬유아세포의 존재를 나타낸다. 스트로마 성분에 의한 맥관형성인자의 분비는 종양에 의해 발생된 맥관형성 자극을 증폭시키는데 이바지할 수 있다.
실시예 6
유방암에서의 VEGF-D
또한, 제자리 면역조직화학에 의해 VEGF-D의 국소화를 유방관암종에서 분석했으며, 이 결과를 도 7A-7F에 나타낸다. 면역조직화학을 실시예 4에서와 같이 수행했으며, 단 알파-평활근 액틴에 특이적인 MAb(DAKO Corp., 캘리포니아 카핀테리아) 및 혈소판/내피 유착 분자(PECAM)(DAKO Corp., 캘리포니아 카핀테리아)를 또한 면역염색에 사용했다. 도 7A에서 면역염색에 사용된 항-VEGF-D MAb는 VD1(4A5)였다.
도 7A에 보여진 바와 같이, VEGF-D는 도관에 있는 종양세포 및 종양으로 채워진 도관의 기저판에 바로 인접한 소위 "네크리스"라 하는 소맥관(검은색 화살촉)에서 검출되었다. 또한, 네크리스 맥관은 검은색 화살촉으로 나타낸 VEGFR-2(도 7C), VEGFR-3(도 7D) 및 PECAM(도 7E)에 대해서도 양성이었다. PECAM은 내피에 대한 고전적인 마커이며, 또한 혈소판 및 백혈구 상에서 발견된다. PECAM은 염증 부위로 백혈구가 이주하는데 어떤 역할을 한다(Muller 등, J. Exp. Med. 178:449-460). "네크리스" 맥관에 대한 PECAM 항체 염색은 이들 구조가 맥관이라는 것을 확인하는데 도움이 된다. 도관의 가장자리를 근섬유아세포를 검출하는 알파-평활근 액틴(도 7B)에 대해 염색함에 의해 확인한다. VEGF-D MAb를 40배몰 과잉의 사람 VEGF-D의 VHD와 예비 인큐베이션한 도 7A에 나타낸 것과 시리즈인 조직 절편의 대조표준 염색은 신호를 제공하지 않았다(도 7F). 이들 발견은 종양세포에 의해 분비된 VEGF-D가 부근에 있는 맥관 상에서 그것의 수용체를 활성화시킴으로써, 네크리스 맥관의 성장을 도관에 매우 가까운 위치로 끌어내는데 어떤 역할을 한다는것을 나타낸다. 이것은 고상 종양 성장 및 전이성 전파 모두에 중요할 수 있다.
실시예 7
자궁내막암에서의 VEGF-D
또한, VEGF-D는 자궁내막 선암종에서 검출되었다(도 8). 면역조직화학을 항-VEGF-D MAb VD1(4A5)를 사용하여 실시예 4에서와 같이 수행했다. VEGF-D의 온건한 염색이 선(腺)종양세포(GL)에서 보였고, 매우 강한 반응성이 종양의 전진성 칩입성 가장자리에 있는 결합조직형성 스트로마(DM)의 근섬유아세포성 세포에서 보였고, 강한 반응성이 자궁근층(Myo)에 있는 인접한 혈관(검은색 화살표)의 내피 및 벽에서 보였다. 흥미롭게도, VEGF-D 반응성은 결합조직형성 스트로마의 근섬유아세포에서 특히 강했으며, 이것은 선종양세포가 이들 섬유아세포에서 VEGF-D의 발현을 유도하여 종양의 맥관형성 잠재성을 증폭시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 결합조직형성 스트로마의 세포에서의 VEGF-D의 발현이 폐암종에서도 검출되었기 때문에 (도 6A), 종양의 범위가 스트로마 성분에서 VEGF-D를 유도할 가능성이 있다. 이것은 발생중인 폐와 유사하며, 이 경우 아마도 섬유아세포의 전구체일 중간엽세포가 VEGF-D 유전자를 강하게 발현하는 것 같다. 따라서, 배아 및 종양 조직으로부터의 신호는 섬유아세포에서 VEGF-D의 발현을 유도할 수 있다.
실시예 8
비-종양형성 조직에서의 VEGF-D
결장과 같은 높은 세포 턴오버 및/또는 대사부담을 가지는 조직은 광범한 혈관 망구조를 필요로 한다. 따라서, 면역조직화학에 의해 사람 결장을 VEGF-D의 국소화에 대해 분석했고, 이 결과를 도 9A-9F에 나타낸다. 면역조직화학은 실시예 4에서와 같이 수행했으며, 단 알파-평활근 액틴에 특이적인 항체(DAKO Corp., 캘리포니아 카핀테리아)를 또한 면역염색에 사용했다. 나타낸 모든 조직 절편에 대해서, 검출은 DAB(갈색이 양성 신호를 표시한다)를 사용했고, 도 9A, 9B, 9C 및 9F에서 사용된 VEGF-D 항체는 VD1(4A5)였다. 명료하게 하기 위해서, 도 9A, 9B, 9D 및 9F에서는 대조염색을 생략했다. 도 9A에서 스케일바는 120㎛를 표시하며, 도 9B, 9D 및 9F에서는 40㎛를 표시하고, 도 9C 및 9F에서는 6㎛를 표시한다.
VEGF-D를 점막하의 혈관에 국소화시켰다(도 9A). 더 높은 위력의 분석은 혈관 평활근(흰색 화살촉)의 염색을 드러냈지만, 세동맥의 내피세포(검은색 화살촉)는 염색되지 않았다(도 9B 및 9C). 알파-평활근 액틴에 특이적인 항체를 가지는 도 9A-9C에 나타낸 것과 시리즈인 절편의 염색은 혈관 평활근(흰색 화살촉)을 검출하지만, 내피(검은색 화살촉)를 검출하지는 않는다(도 9D 및 9E). 이 염색은 VEGF-D 반응성이 세동맥의 혈관 평활근세포에서 있었음을 입증한다. 더욱이, 이들 내피세포는 VEGFR-2 또는 VEGFR-3에 대한 면역반응성을 나타내지 않았으며, 이것은 이들 세포가 수용체-매개 방식으로 VEGF-D를 축적하지 않는다는 것을 나타낸다. 40배몰 과잉의 사람 VEGF-D의 VHD와 함께 VEGF-D MAb를 예비 인큐베이션하는 것은 혈관 평활근의 염색을 완전히 차단한다(도 9F).
결장에 다양한 상해를 가하면 어떤 상해는 혈관 손상을 일으키며, 점막하의 VEGF-D가 혈관 재생에 대비하여 혈관 평활근세포에 의해 생성될 수 있다. 혈관 손상에 반응하여 내피가 활성화된 때, 이들 맥관의 내피세포 상에서 VEGFR-2의 상향조절은 혈관 평활근에 의해 생성된 VEGF-D가 내피세포 증식 및 혈관 수선을 유도하도록 한다. 동맥 손상에 반응하여 소세동맥 및 미세맥관의 내피에 의한 VEGFR-2의 상향조절이 허혈성 뇌졸중과 관련하여 이전에 보고되었다(Issa, R. 등, Lab Invest 79:417-425, 1999)
실시예 9
종양 발생에서 VEGF-D의 역할
VEGF-D의 유도체를 구성성으로 과발현하는 셀라인을 생성하기 위해서, 사람 VEGF-D cDNA의 영역을 포유류 발현 벡터 Apex-3에 삽입했다(Evans 등, Mol Immunol 1995 32 1183-1195). 이 벡터는 293-EBNA 사람 배아 신장세포에 트랜스펙션되었을 때 에피솜적으로 유지된다. 성숙한 VEGF-D의 발현을 위해서, IL-3 신호 서열을 코드하는 서열을 함유하는 pEFBOSVEGF-DΔNΔC의 영역, FLAG옥타펩티드 및 성숙한 VEGF-D를 Apex-3의 XbaI 부위에 삽입했다(국제특허출원 PCT/US97/14696(WO 98/0783 2)의 실시예 9 참조). 결과의 플라스미드를 pVDApexDΔNΔC로 지정한다(Stacker, S. A. 등, J Biol Chem 274:32127-32136, 1999 및 국제특허출원 PCT/US98/27373의 실시예 1 참조). 국제특허출원 PCT/US98/27373의 명세서 전체가 참고자료로서 본원에 포함된다. 유사한 구성물을 FLAG로 N-말단에 태그를 붙인 프로세스되지 않은 전길이 VEGF-D의 발현을 위해 만들었다. 이 구성물에서, 단백질 분비에 대한 VEGF-D 신호 서열을 코드하는 DNA를 결실시켰고, IL-3 신호 서열을 코드하는 DNA로 치환한 후, 상류 바로 가까이에서, 그리고 VEGF-D의 잔기 24에서 354를 코드하는DNA와 동일한 리딩 프레임 내에서 FLAG옥타펩티드 및 2개 아미노산(Thr-Arg)로 치환했다. 이 구성물을 pVDApexFULL-N-Flag로 지정했다(Stacker, S. A. 등 J Biol Chem 274:32127-32136, 1999 및 국제 특허 공보 PCT/US98/27373의 실시예 1 참조). 이들 벡터를 인산칼슘법에 의하거나 또는 제조자의 지시에 따라 Fugene(로체 몰리큘라 바이오케미칼스, 독일 만하임)을 사용하여 사람 배아 신장 셀라인 293EBNA-1의 세포에 트랜스펙트했고, 안정한 트랜스펙턴트를 100㎍/ml 히그로마이신 보충된 DMEM의 존재하에 선택했다. 높은 수준의 VEGF-D-FULL-N-Flag 및 VEGF-DΔNΔC을 발현하는 셀라인을 대사성 표지화, 면역침전 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 연속적으로 확인했다(Stacker, S. A. 등, J Biol Chem 274:32127-32136, 1999 및 국제특허출원 PCT/US98/27373의 실시예 1 참조).
6 내지 8주 된 SCID 마우스(ARC, 호주 퍼스)의 유방 지방층에 PBS 중의 트랜스펙트된 293 세포 또는 트랜스펙트되지 않은 모 293 세포 2x107을 피하주사했다. 종양이 성장하도록 허용했고, 3주에 걸쳐 디지탈 캘리퍼스로 측정했다. 첫번째 동물이 국제윤리위원회에 의해 허용된 최대 크기에 도달했을 때인 3주 후에 실험을 종결했다. 종양 크기를 너비x길이x0.6x(너비x길이)/2로 계산했다.
도 10은 트랜스펙트되지 않은 모 293 세포("293"로 지정) 또는 VEGF-D-FULL-N-FLAG("VEGF-D-293"으로 지정)를 코드하는 구성물로 트랜스펙트된 293 세포의 주사로부터 생긴 SCID 마우스의 종양에 대한 분석 결과를 나타낸다. 293-VEGF-D-FULL-N-FLAG 세포로부터 유래된 종양과 트랜스펙트되지 않은 293 세포로부터 유래된 종양 사이에는 유의한 차이가 있다. 3주 후 293-VEGF-D-FULL-N-FLAG 군의 평균 종양 크기는 937±555mm3(평균±SD, n=8)이었고, 비교하여 트랜스펙트되지 않은 293 세포에 대해서는 136±230mm3이었다(n=8). 흥미롭게도, VEGF-DΔNΔC를 코드하는 구성물로 트랜스펙트된 293 세포로부터 발생된 종양은 트랜스펙트되지 않은 293 세포로부터의 종양과 크기 50±76mm3(n=7)에 있어 유의한 차이가 없었다.
게다가, 트랜스펙트되지 않은 293 세포로부터 유래된 종양의 현미경 양상은 희미한 흰색 표면의 것이었고, 비교하여 293-VEGF-D-FULL-N-FLAG 세포로부터 유래된 종양은 종양 전체에 분명한 혈관의 존재와 함께 피빛의 양상을 가졌다.
또한, 내피세포에 대한 마커인 항-PECAM 단일클론 항체(파밍겐, 캘리포니아 샌디에고)를 사용하여 면역조직화학에 의해 절편들을 분석했다. 293-VEGF-D-FULL-N-FLAG 세포를 사용하여 발생된 종양의 절편은 트랜스펙트되지 않은 모 293 세포를 사용하여 발생된 종양과 비교하여 PECAM 발현의 현저한 증가를 보였다. 이 분석으로 프로세스되지 않은 전길이 VEGF-D를 발현하는 종양에 혈관이 훨씬 더 풍부하다는 것을 확인한다.
이 실험은 프로세스되지 않은 형태의 VEGF-D가 생체내에서 종양 맥관형성 및 고상종양의 성장을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다. 흥미롭게도, 성숙한 충분히 프로세스된 형태의 VEGF-D를 발현하는 세포로부터 유래된 종양은 트랜스펙트되지 않은 293 모세포와 비교하여 성장의 증가를 나타내지 않았다. 이것은 VEGF-D의 VHD의 정확한 국소화 또는 기능을 위한 VEGF-D의 프로펩티드(N-pro 및 C-pro)의 중요성을 나타낸다. 이 결과에 대한 해석은 프로펩티드가 매트릭스 회합에 연루되며, VEGF-D가 세포외 매트릭스 또는 세포 표면에 정확히 위치할 때만 헤파린 술페이트 프로테오글리칸이 맥관형성 및/또는 림프관형성을 유도할 수 있는 성장인자라는 것이다. 다른 해석은 프로펩티드가 생체내에서 VEGF-D VHD의 반감기를 증가시킨다는 것이다.
실시예 10
종양 맥관형성의 VEGF-D 유도
VEGF-D가 종양 맥관형성에서 역할을 하는지의 여부를 측정하기 위해서, VEGF 또는 VEGF-D를 발현하는 293EBNA 셀라인을 생성했다. 293EBNA 셀라인은 정상적으로는 VEGFR-2 및/또는 VEGFR-3을 활성화시키는 리간드인 VEGF, VEGF-C 또는 VEGF-D를 검출가능한 수준으로 발현하지 않는다(Stacker, S. A. 등, Growth Factors 17: 1-11 (1999)). 293EBNA 세포는 면역결핍 마우스에서 느리게 성장하고 불충분하게 혈관화되는 유상피-유사 종양을 생성한다. 시험관내에서 발생된 293EBNA 셀라인으로부터의 콘디셔닝 배지의 웨스턴 블롯 분석은 성숙한 형태의 활성 성장인자가 분비되었다는 것을 나타냈다.
6 내지 21주 된 암컷 SCID 또는 SCID/nod 마우스(동물자원센터, 호주 커닝베일; Austin Research Institute, 호주; 및 Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research, 호주)를 6 내지 10마리 마우스의 군에 두고, VEGF-293, VEGF-D-293, 또는 대조표준 293 셀라인을 발현하는 셀라인을 사용하여 배양배지 중의 2.0내지 2.5x107의 농도로 유방 지방층에 피하주사했다. 종양 성장 및 형태를 35일에 걸쳐 분석했다. 종양을 디지탈 캘리퍼스로 측정했고, 종양 부피를 공식: 부피=길이x너비2x0.52으로 계산했다. 셀라인 주사후 3 내지 5주에 마우스를 안락사시켰고, 종양을 시험용으로 떼어냈다. VEGF-D-293 종양 및 293 종양을 사후 25일에 절제하여 칭량했다.
VEGF-293 세포는 대조표준 293 세포와 비교하여 증가된 성장 속도를 가지는 종양을 생성했다. VEGF-293 종양은 광범한 부종과 함께 고도로 혈관화되었으며, 이것은 강력한 종양 맥관형성인자 및 혈관 투과성 유도제인 VEGF와 일치한다. 또한, VEGF-D-293 세포는 생체내에서 증진된 성장을 나타냈고, 종양은 대조표준 293 종양과 비교하여 고도로 혈관화됐지만, 부종에 대한 명백한 또는 현미경적인 증거는 나타나지 않았다.
VEGF-D-293 세포의 주사로부터 비롯된 종양 성장은 VEGF-D와 VEGFR-2 및 VEG FR-3의 결합을 차단하는 VEGF-D의 생물활성 영역에 특이적인 항체인 단일클론 항체 VD1를 매주 2번 복강내 주사함에 의해 차단되었다. 그러나, 종양 성장은 부기준표본-매치된 항체인 대조표준을 사용한 치료에 의해서는 영향 받지 않았다.
내피세포 마커 PECAM-1의 면역조직화학에 의해 평가된 바, VD1 항체를 사용한 치료는 종양에서 맥관의 풍부함을 감소시켰다. 웨스턴 블롯팅은 VEGF-D-293 및 VEGF-293 종양에서 VEGF-D 및 VEGF 각각의 발현을 증명했고, 또한 VEGF가 VEGF-D-293 종양에서 상향조절되지 않았다는 것을 증명했다. 사후 종양 중량의 분석은 VEGF-D-293 종양((0.49±0.22g, n=7; 평균±SD)와 대조표준 293 종양(0.123±0.118g, n=9, p=0.01) 사이의 유의한 차이를 보였다.
실시예 11
종양 림프관형성의 VEGF-D 유도
림프관을 통한 국소 림프절로의 전이가 고상 종양의 전파에서 흔한 단계이기 때문에, VEGF-D가 종양 림프관형성을 유도했는지나 또는 종양세포에서 VEGF-D의 발현이 림프절로의 종양의 전파를 가져왔는지의 여부를 측정하기 위한 실험을 수행했다.
종양 전파에서 VEGF-D의 역할을 분석하기 위해, VEGF-D-293 종양을 SCID/NOD 마우스(동물자원센터, 호주 커닝베일; Austin Research Institute 호주; 및 Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research, 호주)에서 유도했다. 사후 분석으로 VEGF-D-293 종양을 가지는 동물에서는 23마리의 동물 중 14마리의 외측 액와 림프절 및/또는 천서혜부 절에서 전이성 병소가 발생했다는 것이 드러났으며, 비교하여 VEGF-293 종양에 대해서는 16마리 동물 중 0마리, 293 종양에 대해서는 14마리 동물 중 0마리가 그랬다. 어떤 경우, SCID/NOD 마우스에서 일차 종양으로부터 전이성 종양세포의 전파는 일차 종양과 외측 액와 절 사이의 피부의 림프관에 있는 종양세포의 흔적으로서 분명했다.
VD1 단일클론 항체를 사용한 VEGF-D-293 종양을 품고 있는 마우스의 치료(표 1)는 림프절로의 전이성 전파를 차단했다. VD1으로 25일에 걸쳐 치료된 7마리 마우스는 모두 림프관 전파를 나타내지 않은 반면, 대조표준 부기준표본-매치된 단일클론 항체로 치료된 10마리 마우스 중 6마리가 림프관 전파를 나타냈다. 이들 결과는 VEGF-D가 림프관에 의해 이들 종양의 전이성 전파를 촉진할 수 있다는 것을 나타낸다.
a정제된 단일클론 항체를 종양세포의 주사 후 1일째부터 시작하여 실험 과정 동안 매주 2번 주사했다. VD1은 VEGF-D에 대한 중화 단일클론 항체이다.
bLMM774는 VEGF-D와 결합하지 않는 부기준표본-매치된 대조표준 단일클론 항체이다.
이 자료는 VEGF-D의 발현이 림프 망구조를 통해 종양세포의 전이성 전파를 촉진할 수 있다는 것을 나타낸다. 림프-특이적 마커 LYVE-1에 대한 면역조직화학에 의해 측정된 바, VEGFR-3-VEGFR-2-헤테로다이머의 활성화를 배제할 수는 없지만, VEGF-D는 생각컨대 림프 수용체 VEGFR-3을 통해 종양에서 림프관의 형성을 유도했다. 림프관형성 인자만의 발현이 종양의 중심에서 림프관의 형성을 유도하고, 림프절로의 전이성 전파를 촉진하기에 충분하다.
VEGF-D를 악성 흑색종, 폐 및 유방암에서 종양세포 및 맥관의 내피에 국소화시켰다(실시예 4 내지 6 참조).
실시예 12
상이한 형태의 VEGF-D에 의해 유도된 종양 특징의 변화
종양 맥관형성 및 림프관형성에서 VEGF-D의 역할의 측정에 더하여, 실시예 10 및 11의 방법을 사용하여 N, C, 및 N 및 C 양쪽 말단 프로펩티드의 절단을 나타내는 상이한 형태의 VEGF-D를 발현하는 종양을 생성하고 평가했다. 마우스에 주사된 셀라인은 293EBNA, VEGF-D-293, VEGF-DΔNΔC-293, VEGF-DΔC-293(C-말단 프로펩티드가 없는 VEGF-D를 발현하는 세포), 및 VEGF-DΔN-293(N-말단 프로펩티드가 없는 VEGF-D를 발현하는 세포)였다.
VEGF-DΔN 세포에 의해 생성된 종양은 대조표준 세포에 의해 생성된 종양보다 더욱 빠르게 성장했다. 형태학적 시험에 있어 종양은 붉은색의 외관이었고 충분한 혈관 반응을 함유했으며, 대조표준 종양에서는 보이지 않은 실질적인 체액 성분을 포함했다. VEGF-DΔN 세포에 의해 생성된 종양은 성장 및 형태학적 특징에 있어 대조표준 종양과 유의한 차이를 가졌다.
도 11의 그래프는 VEGF-DΔN 세포로부터의 종양에서 증가된 성장 속도를 나타낸다. VEGF-DΔN 세포에 의해 생성된 종양에서 체액 축적의 경향을 그러한 종양의 사진인 도 12에서 볼 수 있다. 이것은 대조표준 세포에 의해 생성된 것과 같은 정상 종양을 나타낸 도 13의 사진과 대조될 수 있다.
VEGF-DΔC 세포에 의해 생성된 종양은 대조표준 세포와 유사한 방식으로 성장했고, 과잉의 체액 형성을 나타내지 않았다.
VEGF-DΔNΔC 세포에 의해 생성된 종양은 대조표준 종양과 비교하여 매우 느리게 성장했다. 대조표준 종양에 대해 평균 30-35일 그리고 VEGF-DΔN 종양에 대해 20-25일과 비교하여, VEGF-DΔNΔC 종양은 약 70일에 형성되었다. 이들 종양의 시험은 그것들이 감소된 혈관 반응을 가졌다는 것을 나타냈으며, PECAM-1 염색에 의해 대조표준 종양보다 더 적은 혈관을 가진다. 이 종양은 LYVE-1 염색에 의해 나타낸 림프 망구조를 발생시켰고, 림프 메타스타제의 형성을 유도했다. 도 14의 그래프는 VEGF-DΔNΔC 세포로부터의 종양에서 감소된 성장 속도를 나타낸다.
VEGF-D의 강한 신호가 면역양성 종양세포 근처의 혈관의 내피세포에서 검출되었지만 종양세포에서 떨어진 맥관에서는 검출되지 않았으므로, 악성 흑색종에서 VEGF-D의 국소화는 종양 맥관형성에서 이 분자의 역할과 일치한다. 이것은 종양 또는 그 근처의 맥관에서 발견된 VEGF-D가 수용체-매개 업테이크로 인해 비롯될 수 있다는 것을 나타내며, 이것은 종양세포에 의해 분비된 VEGF-D가 표적 내피세포와 결합하여 거기에 축척됨으로써 종양 맥관형성을 조절하는 측분비 메카니즘을 확립한다는 가설을 지지한다. 종양세포 및 종양혈관에서 VEGF 국소화의 유사한 패턴이 이전에 보고되었다(Plate, K. 등, Brain Pathology 4:207-218, 1994). VEGF-D가 종양 맥관형성에서 어떤 역할을 한다는 가설과 일치하는 것은 VEGF-D에 대한 수용체인 VEGFR-2가 종양에 있는 혈관의 내피세포에서 상향조절된다는 발견이다(Plate, K. 등, Cancer Res 53:5822-5827, 1993). 실제로, 여기 연구된 흑색종에서 검출된 VEGF-D 면역양성 맥관 중 일부는 또한 VEGFR-2에 대해 양성이었다. VEGFR-2에 의한 신호화는 종양 맥관형성을 지속하는데 중요했고(Millauer B. 등 Cancer Res 56: 1615-1620, 1996), 생체내에서 VEGF-D의 맥관형성 활성(Marconcini. L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9671-9676, 1999)은 대부분 이 수용체에 의해 매개되는 것 같다. VEGF-D가 종양세포 및 근처의 맥관에서 검출됨에 따라, 흑색종에서 보여진 것과 유사한 염색 패턴이 폐의 편평세포암종 및 제자리 유방관암종(BDCIS)에서 관찰되었다. 또한, BDCIS에 있는 종양으로 채워진 도관 근처의 맥관 및 폐암종에 있는 종양세포의 섬 근처의 맥관이 VEGFR-2에 대해 양성이었으며, 이것은 다시 이 리간드 및 수용체가 측분비 방식으로 종양 맥관형성의 제어에 기여할 수 있다는 것을 시사한다.
또한, 정상 성인 조직의 림프 내피 상에서 발현된 VEGF-D의 수용체인 VEGFR-3에 대해 양성인 맥관이 VEGF-D에 대해서도 양성이었으므로, 이들 결과는 VEGF-D가 악성 흑색종 부근에서 림프관의 성장을 자극하는데 어떤 역할을 할 수 있다는 것을 나타낸다. 종양으로 채워진 도관을 둘러싼 VEGF-D 양성 맥관 중 일부가 VEGFR-3에 대해서도 양성임에 따라, 유사한 염색 패턴이 BDCIS에서도 보여졌다. VEGFR-3에 의한 신호화는 림프관형성에 중요하다고 생각되지만(Taipale, J. 등, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 237:85-96, 1999), 이 수용체는 암의 혈관 모세관에서 상향조절될 수 없다(Valtola, R. 등 Am. J. Path. 154:1381-1390, 1999). 따라서, VEGF-D 및 VEGFR-3으로 구성된 측분비 조절 메카니즘은 암에서 림프관형성 및 맥관형성을 모두 자극할 수 있다. 따라서, 종양이 전이되는 경로는 맥관형성 및/또는 림프관형성을 유도할 수 있는 종양의 능력에 의해 일부 결정될 수 있다. 만일 그렇다면, 림프관형성도 유도할 수 있는 성장인자(예를 들어, VEGF-D)와는 반대인 순수하게 맥관형성성인 가용성 성장인자(예를 들어, VEGF)의 종양세포에 의한 발현은 전이성 전파의 경로에 대한 중요한 결정자일 수 있다.
또한, VEGF-D는 비-종양형성 조직에서 혈관 유지에 어떤 역할을 할 수 있다. 결장의 점막하의 소동맥에서, VEGF-D는 혈관 평활근에 국소화되었지만 내피에는 그렇지 않았다. 내피에서 VEGF-D의 부재는 아마 내피세포에서 VEGF-D 수용체 VEGFR-2 및 VEGFR-3의 발현의 결여의 결과인 것 같다. 혈관 손상에 반응한 내피의 활성화는 내피세포에 의한 VEGFR-2의 발현을 유도하는데 충분한 것 같으며(Issa R. 등, Lab. Invest. 79:417-425, 1999), 이것은 차례로 혈관 평활근에 의해 생성된 VEGF-D가 내피세포 증식을 유도할 수 있게 함으로써 혈관 수선에 영향을 미친다.
전술한 설명 및 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위해 제시되었으며 제한하려는 의도는 아니다. 본 발명의 정신 및 요지를 결합한 개시된 구체예의 변형이 당업자에게 발생할 수 있으므로, 본 발명은 첨부된 청구항 및 그것의 동등물의 범위 내에 있는 모든 변형을 포함하도록 광범위하게 구성되어야 한다.

Claims (44)

  1. 종양에 의한 VEGF-D의 발현을 특징으로 하는 종양성 질환으로 고통받는 유기체의 치료 방법으로서,
    유기체를 스크리닝하여 VEGF-D-발현 종양세포의 존재 또는 부재를 측정하는 단계;
    스크리닝에서 VEGF-D를 발현하는 종양을 가지는 것으로 측정된 상기 유기체를 선택하는 단계; 및
    상기 종양 부근에 유효량의 VEGF-D 길항제를 투여하여 VEGF-D와 그것의 상응하는 수용체의 결합을 방지하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 유기체가 포유류인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 VEGF-D 길항제를 세포독성제와 함께 공동-투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 길항제를 적어도 1가지의 제약학적 담체 또는 보조제를 더 포함하는 조성물로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 종양성 질환이 악성 흑색종, 유방관암종, 편평세포암종, 전립선암 및 자궁내막암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 길항제가 VEGF-D와 특이적으로 결합하여 VEGF-D와 VEGF 수용체-2 또는 VEGF 수용체-3의 결합을 차단하는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 항체가 VEGF-D의 VEGF 상동성 도메인과 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. VEGF-D의 발현 증가를 특징으로 하는 종양성 질환의 스크리닝 방법으로서,
    VEGF-D의 발현 증가를 특징으로 하는 종양성 질환 상태로 의심되는 유기체로부터 샘플을 얻는 단계;
    상기 샘플을 VEGF-D와 특이적으로 결합하는 화합물을 포함하는 조성물에 노출하는 단계;
    상기 샘플을 세척하는 단계; 및
    상기 조직 샘플에서 상기 화합물의 존재, 양 또는 분포를 검출함에 의해 상기 질환을 스크리닝하는 단계
    를 포함하며, 여기에서 잠재적 종양성 성장물 또는 그 주위에 있는 세포에서VEGF-D의 검출이 종양성 질환에 대한 표시인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 화합물이 VEGF-D와 특이적으로 결합하는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 항체가 VEGF-D의 VEGF 상동성 도메인과 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 화합물이 검출가능한 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 8 항에 있어서, 상기 종양성 질환이 악성 흑색종, 유방관암종, 편평세포암종, 전립선암 및 자궁내막암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 8 항에 있어서, 상기 샘플이 사람 조직 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. VEGF-D의 발현 증가를 특징으로 하는 종양성 질환의 스크리닝 방법으로서,
    VEGF-D의 발현 증가를 특징으로 하는 종양성 질환 상태로 의심되는 유기체로부터 샘플을 얻는 단계;
    상기 샘플을 VEGF-D와 특이적으로 결합하는 화합물을 포함하는 조성물에 노출하는 단계;
    상기 샘플을 세척하는 단계; 및
    상기 샘플에서 상기 화합물의 존재, 양 또는 분포를 검출함에 의해 상기 질환을 스크리닝하는 단계
    를 포함하며, 여기에서 잠재적 종양성 성장물 또는 그 주위에 있는 혈관 내피세포 내 또는 위에서 VEGF-D의 검출이 종양성 질환에 대한 표시인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 화합물이 VEGF-D와 특이적으로 결합하는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 항체가 VEGF-D의 VEGF 상동성 도메인과 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 14 항에 있어서, 상기 화합물이 검출가능한 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 혈관의 혈관 내피세포의 증가를 특징으로 하는 종양성 질환의 스크리닝 방법으로서,
    혈관의 혈관 내피세포의 증가를 특징으로 하는 종양성 질환 상태로 의심되는 유기체로부터 샘플을 얻는 단계;
    상기 샘플을 VEGF-D와 특이적으로 결합하는 화합물을 포함하는 조성물에 노출하는 단계;
    상기 샘플을 세척하는 단계; 및
    상기 샘플에서 상기 화합물의 존재, 양 또는 분포를 검출함에 의해 질환을 스크리닝하는 단계
    를 포함하며, 여기에서 잠재적 종양성 성장물 또는 그 주위에 있는 혈관 내피세포 내 또는 위에서 VEGF-D의 검출이 종양성 질환에 대한 표시인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 화합물이 VEGF-D와 특이적으로 결합하는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 항체가 VEGF-D의 VEGF 상동성 도메인과 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 18 항에 있어서, 상기 화합물이 검출가능한 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 18 항에 있어서, 샘플을 VEGFR-2 및 VEGFR-3 중 적어도 1개와 특이적으로 결합하는 제 2 화합물에 노출하는 단계를 더 포함하며, 여기에서 스크리닝 단계는 VEGF-D와 결합하는 화합물 및 혈관의 혈관 내피세포와 결합된 제 2 화합물을 검출하여, 잠재적 종양성 성장물 또는 그 주위에서 VEGF-D 및 VEGFR-2 및 VEGFR-3 중 적어도 1개를 모두 가지는 혈관 내피세포의 존재, 양 또는 분포를 측정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 림프관 내피세포의 증가를 특징으로 하는 종양성 질환의 스크리닝 방법으로서,
    림프관 내피세포의 증가를 특징으로 하는 종양성 질환 상태로 의심되는 유기체로부터 샘플을 얻는 단계;
    상기 샘플을 VEGF-D와 특이적으로 결합하는 화합물을 포함하는 조성물에 노출하는 단계;
    상기 샘플을 세척하는 단계; 및
    상기 샘플에서 상기 화합물의 존재, 양 또는 분포를 검출함에 의해 상기 질환을 스크리닝하는 단계
    를 포함하며, 여기에서 잠재적 종양성 성장물 또는 그 주위에 있는 림프관 내피세포 내 또는 위에서 VEGF-D의 검출이 종양성 질환에 대한 표시인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 화합물이 VEGF-D와 특이적으로 결합하는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 항체가 VEGF-D의 VEGF 상동성 도메인과 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 23 항에 있어서, 상기 화합물이 검출가능한 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 23 항에 있어서, 샘플을 VEGFR-3과 특이적으로 결합하는 제 2 화합물에 노출하는 단계를 더 포함하며, 여기에서 스크리닝 단계는 VEGF-D와 결합하는 화합물 및 림프관 내피세포와 결합된 제 2 화합물을 검출하여, 잠재적 종양성 성장물 또는 그 주위에서 VEGF-D 및 VEGFR-3을 모두 가지는 림프관 내피세포의 존재, 양 또는 분포를 측정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 유기체에서 조직의 혈관화을 유지하는 방법으로서, VEGF-D, 또는 VEGF-D의 생물학적 활성을 가지는 그것의 단편 또는 유사체의 유효량을 그러한 치료를 필요로 하는 상기 유기체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  29. 종양에 의한 VEGF-D의 발현을 특징으로 하는 종양성 질환으로 고통받는 유기체의 치료 방법으로서, 상기 종양 부근에 유효량의 VEGF-D 길항제를 투여하여 VEGF -D와 그것의 상응하는 수용체의 결합을 방지하는 단계를 포함하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 유기체가 포유류인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 29 항에 있어서, 상기 VEGF-D 길항제를 세포독성제와 함께 공동-투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 29 항에 있어서, 상기 길항제를 적어도 1가지의 제약학적 담체 또는 보조제를 더 포함하는 조성물로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 29 항에 있어서, 상기 종양성 질환이 악성 흑색종, 유방관암종, 편평세포암종, 전립선암 및 자궁내막암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 29 항에 있어서, 상기 길항제가 VEGF-D와 특이적으로 결합하여 VEGF-D와 VEGF 수용체-2 또는 VEGF 수용체-3의 결합을 차단하는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 항체가 VEGF-D의 VEGF 상동성 도메인과 결합하는것을 특징으로 하는 방법.
  36. 전이의 위험에 대해 종양을 스크리닝하는 방법으로서,
    종양 샘플을 VEGF-D와 특이적으로 결합하는 화합물을 포함하는 조성물에 노출하는 단계;
    상기 샘플을 세척하는 단계; 및
    상기 샘플에서 상기 화합물의 존재, 양 또는 분포를 검출함에 의해 전이의 위험을 스크리닝하는 단계
    를 포함하며, 여기에서 상기 종양에 의한 VEGF-D의 발현이 전이의 위험에 대한 표시인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 화합물이 VEGF-D와 특이적으로 결합하는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 항체가 VEGF-D의 VEGF 상동성 도메인과 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 36 항에 있어서, 상기 화합물이 검출가능한 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. VEGF-D의 발현 증가를 특징으로 하는 종양성 질환 상태의 미세-전이를 검출하는 방법으로서,
    상기 종양성 질환 상태의 유기체에서 종양성 성장물에서 떨어져 있는 부위로부터 조직 샘플을 얻는 단계;
    상기 샘플을 VEGF-D와 특이적으로 결합하는 화합물을 포함하는 조성물에 노출하는 단계;
    상기 샘플을 세척하는 단계; 및
    상기 조직 샘플에서 상기 화합물의 존재, 양 또는 분포를 검출함에 의해 상기 종양성 질환의 상기 전이를 스크리닝하는 단계
    를 포함하며, 여기에서 상기 조직 샘플에서 VEGF-D의 검출이 상기 종양성 질환의 전이에 대한 표시인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 조직 샘플이 상기 종양성 성장물을 둘러싼 조직으로부터의 림프절인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 40 항에 있어서, 상기 화합물이 VEGF-D와 특이적으로 결합하는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 42 항에 있어서, 상기 항체가 VEGF-D의 VEGF 상동성 도메인과 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 40 항에 있어서, 상기 화합물이 검출가능한 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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