CN103739710B

CN103739710B - 一种抗vegf抗体及其应用

Info

Publication number: CN103739710B
Application number: CN201410036335.9A
Authority: CN
Inventors: 吕明; 冯健男; 乔春霞; 林周; 杨静; 王群; 黎燕; 沈倍奋
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Priority date: 2014-01-26
Filing date: 2014-01-26
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2034-01-26
Also published as: CN103739710A

Abstract

本发明公开了属于生物技术和免疫学领域的一种抗VEGF抗体及其应用。所述抗体的重链可变区的3个CDR区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示；所述轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。本发明的抗VEGF人源抗体，特异性靶向结合VEGF抗原，抗体亲和力为3.11×10^-10，抗体抗原结合能力强；所述抗VEGF人源抗体生物活性良好，可抑制血管内皮细胞增殖、显著抑制肿瘤生长、有效抑制角膜新生血管的生长；可用于制备特异性靶向VEGF抗原的靶向药物或抑制血管新生药物。

Description

一种抗VEGF抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和免疫学领域，涉及一种抗VEGF抗体及其应用，具体涉及一种抗VEGF人源抗体及其应用。

技术背景

血管新生在人体正常生长和发育过程中起重要作用，例如在胎儿生长发育、伤口愈合、女性经期、断肢接合等。然而，在一些非正常生理过程中出现异常的新生血管，则会引发特定的疾病，如癌症、类风湿性关节炎、退行性关节炎、糖尿病性视网膜病变等。例如，肿瘤组织中的血管新生会促使肿瘤恶性发展、侵袭、转移。因此，靶向VEGF调节血管新生成为这一类疾病治疗的重要策略。1971年，Folkman就提出可以通过阻断肿瘤内部的血管生成来抑制肿瘤生长和转移。

血管新生是一个涉及内皮细胞增殖、迁移和成管的复杂过程，需要多种生长因子和信号通路的参与。目前已证实与血管生成有关的生长因子有30多种因子中，如VEGF、成纤维细胞生长因子、内皮抑素、血小板衍生生长因子等。其中血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是最重要的血管生成正性调节因子。VEGF又名血管通透性因子(vascularpermeabilityfactor，VPF)或血管调理素（Vasculotropin），具有促进内皮细胞增殖与分化、促进细胞内钙聚集、增加微血管的通透性并诱导血管生成等作用。

人类VEGF是多功能糖蛋白，人的VEGF基因位于染色体的6p21，3，该基因全长为28kb，编码VEGF的基因长约14kb，由8个外显子、7个内含子交替组成。NH2末端有特异的6个极性氨基酸组成疏水基团，是分泌信号的标志，分子量约34～45kD。编码产物为同源二聚体糖蛋白，由分子量为17～22kD的相同亚基通过二硫键相连，等电点为8.5，有很强的耐热和耐酸能力。VEGF不同的亚型由该基因不同的剪接方式形成，目前已发现的VEGF家族成员包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子(placentagrowthfactor，PLGF)，由于mRNA的剪切方式的不同，可以得到7种不同的VEGF异构体，在人类细胞中其氨基酸残基数分别为121、145、148、165、183、189、206。最近研究VEGF家族又增加了一个新成员：脊髓源性生长因子(spinalcordderivedgrowthfactor，SCDGF)。人SCDGF在体外对ThllTh2细胞表现出促进有丝分裂活性，虽然它在人体内的功能尚不清楚，但其中一个可能的功能是在胚胎发育中对特殊类型的脊髓细胞起有丝分裂的作用，而其对血管内皮细胞的作用尚无报道。

VEGF家族促新生血管生成作用是由靶细胞上的受体所介导的。目前较肯定的VEGF家族受体共有：VEGFR-1(flt-1)，VEGFR-2(KDR/flk-1)，VEGFR-3(flt-4)，神经纤维网蛋白-1(neuropilin-1，np-1)，神经纤维网蛋白-2(neuropilin-2，np-2)。VEGF的特异性受体均属酪氨酸激酶c-fms家族中的成员，与相应配体结合后激活，并催化胞内区酪氨酸残基自身磷酸化，磷酸化的酪氨酸激酶受体被胞内信息物质识别，通过级联反应向细胞内进行信号转导。

近年来，针对VEGF-VEGFR相关信号通路研发激动剂或抑制剂为相关疾病的治疗提供了一种可行的方法，并取得了一些成果；应用领域逐步从最初的肿瘤治疗向眼底病、心血管病、外科创伤治疗、血液病等领域进军。目前，在这一研究领域研究的药物有20余种，如诺华/先灵公司研制的小分子VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂vatalani；阿斯利康的AZD646；Genentech公司的bevacizumab(Avastin)；Novartis和ScheringAG公司合作开发的PTK78；Bayer和OnyxPharmaceuticals公司的索拉非尼(sorafenib，BAY43-9006)；Eyetech制药公司和辉瑞公司合作开发的Pegaptanibsodium(哌加他尼钠)，商品名Macugen；Genentech公司开发的Ranibizumab，商品名为Lucentis，等等。这些药物有的是通过加强VEGF家族的正性治疗作用，促进血流灌注，达到治疗的目的，比如在冠脉缺血和肢体缺血等疾病中；有的则是通过抑制VEGF家族的负性治疗作用，减少新生血管生成，抑制疾病的发展，比如在肿瘤、增殖性糖尿病视网膜病变、视网膜中央静脉组塞等疾病。

抗人血管内皮生长因子（VEGF）人源化抗体--阿瓦斯汀（Avastin，化学名：贝伐单抗）是美国生物科技公司Genentech研制的一种人源化的单克隆抗体，其用于治疗癌症的基本原理在于能够抑制刺激新血管形成的血管内皮生长因子的生物活性，从而使肿瘤组织无法获得血液，氧和其它养分，最终达到抑制肿瘤生长的抗癌作用。2004年2月26日，Avastin因疗效显著，被FDA正式批准为结直肠癌治疗药品。随后Avastin被FDA批准的适应症还包括非小细胞肺癌，转移性乳腺癌，胶质母细胞瘤，转移性肾癌。2008年，Avastin在欧洲获得批准。作为第一个商品化的新生血管抑制剂也是目前世界上最畅销的抗肿瘤药物，Avastin的2010年全球销售额高达68亿美元。Avastin对眼部新生血管的治疗也具有较好的疗效，能有效抑制角膜、脉络膜、视网膜等部位的新生血管、减轻黄斑水肿、提高视力。Lucentis(Ranibizumab)是抗VEGF单克隆抗体Avastin的Fab片断，已于2006年经FDA批准为治疗黄斑变性的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗VEGF人源抗体。

一种抗VEGF人源抗体，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的3个CDR区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示；所述轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。

本发明的目的也在于提供编码所述的抗VEGF人源抗体的基因。

本发明的目的还在于提供所述抗VEGF人源抗体的应用。

所述应用为：

所述抗VEGF人源抗体在制备特异性靶向VEGF抗原的靶向药物的应用。

所述抗VEGF人源抗体在制备抑制血管生成的药物的应用。

所述抗VEGF人源抗体在制备抗肿瘤药物的应用，所述肿瘤的一种为结肠癌。

所述抗VEGF人源抗体在制备抑制角膜血管生成的药物的应用。

本发明的抗VEGF人源抗体，可以特异性靶向结合VEGF抗原，其抗体亲和力为3.11×10^-10，抗体抗原结合能力强；所述抗VEGF人源抗体生物活性良好，可以抗体抑制血管内皮细胞增殖、显著抑制肿瘤生长、有效抑制角膜新生血管的生长；可以作为制备特异性靶向VEGF抗原的靶向药物。体内外实验结果显示，该抗体具有良好的抑制血管新生的生物学活性，在制备血管新生相关疾病诊治药物中具有良好的应用前景。

附图说明

图1为表达载体pCMV-163的物理图谱。

图2为ELISA分析抗VEGF人源抗体识别靶抗原VEGF的活性。

图3为抗VEGF人源抗体抑制血管内皮细胞增殖活性。

图4为抗VEGF人源抗体抑制肿瘤生长的活性。

图5为抗VEGF人源抗体抑制角膜新生血管生成。

图6为抗VEGF人源抗体抑制角膜新生血管的长度。

图7为抗VEGF人源抗体抑制角膜新生血管的面积。

具体实施方式

下面将结合附图和具体实例对本发明作进一步的说明。

实施方法：

具体实验如下：

实施例1抗体筛选

为了避免个体免疫背景的偏向性，尽可能保证抗体库的多样性，利用淋巴细胞分离液分离162名成年健康人外周血及10例新生儿脐带血淋巴细胞，共收集2×10⁹个细胞。Trizol法提取总RNA，反转录为cDNA，常规PCR方法扩增不同抗体亚型的可变区基因。根据抗体库载体pDF信息，引入酶切位点BssHII、NheI和带有Loxp511序列的连接肽，通过重叠PCR方法拼接成ScFv（单链抗体：VL-Linker（含Loxp511序列）-VH，上下游分别引入BssHII、NheI位点）形式（具体方法见《生物文库技术》，邵宁生等主编，军事医学科学出版社，2011年第一版）。电泳分离后，将所获得的scFv用BssHII、NheI酶切后克隆入同样酶切处理的pDF载体中，电穿孔转化大肠杆菌XL1-Blue。经SB培养液扩大培养后，加辅助病毒1×10¹³pfuVCSM13感染，获得初级噬菌体抗体库，测定效价为8×10¹²cfu/mL。按比例（感染复数MOI>200）混合初级抗体库和BS165菌（基因型：F’kanrecA1endA1gryA96thi21ΔlacU169supE44hsdR17（λimm434X12cre)），借助BS165菌表达的Cre重组酶介导loxp/loxp511重组，得到大容量重组抗体库。

利用市售的（义翘神州公司产品，catalognumber：11066-HNAB）VEGF为靶点，筛选靶抗体。5%脱脂奶粉封闭VEGF包被的免疫管后，加入噬菌体抗体库，37℃孵育2h；弃去未结合的噬菌体，TBS-T洗液洗涤5遍，充分洗去非特异吸附噬菌体；加入洗脱缓冲液洗脱噬菌体并以Tris中和；加入对数期XL1-Blue菌、SB培养基及辅助噬菌体VCSM13进行扩增富集；重复该过程3-4轮，将洗脱下来的噬菌体感染新鲜制备的对数期XL1-Blue菌涂培养板，37℃过夜培养后，随机挑取单克隆至96孔板，扩大培养后进行phage-ELISA，检测与抗原的结合特性；共鉴定165克隆，48个阳性克隆，特异性结合VEGF的克隆中，4D3结合活性最好。

将4D3克隆送测序，所获得的可变区基因经IMGT（http://imgt.cines.fr/imgtvquest/vquest）在线分析，获得的4D3克隆中，重链可变区序列如序列表SEQIDNO.7所示，其中三个CDR区的氨基酸序列分别为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3所示；轻链可变区序列为SEQIDNO.8所示，其中三个CDR区氨基酸序列分别为SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示。所述重链可变区基因核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；轻链可变区基因核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。

实施例2抗体表达纯化

将获得的4D3克隆可变区基因克隆入含有人IgG恒定区基因的真核表达载体中，构建全抗体表达载体pCMV-163，其物理图谱如图1所示。全抗体称为FD006抗体。将获得真核表达载体，通过脂质体介导的方法转染至CHO细胞中，经过ELISA试验（利用羊抗人IgG以及辣根酶标记的羊抗人IgG进行双夹心ELISA法检测上清中抗体的含量，以未转染上清作为阴性对照，人IgG纯品作为标准品），检测培养上清中抗体表达量，筛选获得表达量较高的单克隆细胞株。

ELISA实验结果显示，表达上清中均有抗体表达，表达量约为15.3±1.83μg/mL。收集足够上清，利用常规的ProteinA亲和纯化目标抗体。非还原的形式进行SDS-PAGE分离，结果显示获得目标抗体分子量与人IgG一致，均为155KDa。

实施例3抗体亲和力测定

利用Fortibio测定抗体结合及解离常数。

利用OctetRED(Fortebio,USA)仪器，测定抗VEGF抗体亲和力。PBS稀释抗体浓度为10μg/mL，包被AHC传感器；PBS为对照，稀释VEGF浓度为1μg/mL、3μg/mL、10μg/mL、测定抗VEGF抗体与VEGF相互作用的结合、解离曲线；利用GlobeFitting拟合曲线，计算两者相互作用的结合常数、解离常数以及亲和常数。结果见表1，FD006抗体亲和力为3.11×10^-10，略高于Avastin的6.50×10^-10。

表1.Avastin抗体与FD006抗体与VEGF相互作用亲和力分析

实施例4抗体识别靶抗原分析

将靶抗原VEGF包被ELISA板条，0.5μg/ml，4℃过夜；PBST洗涤后，加入1.5%的酪蛋白，4℃封闭过夜；加入不同浓度的FD006抗体或Avastin阳性抗体，37℃反应2小时；PBST洗涤后，加入羊抗人IgG-HRP，室温反应45分钟；PBST洗涤后，OPD法显色，测定OD492，分析抗体与靶抗原VEGF结合能力。FD006抗体或Avastin阳性抗体均能特异性识别靶抗原VEGF；该识别活性成显著的剂量依赖性；并且FD006抗体结合能力略高于Avastin阳性对照，结果如图2所示。

实施例5抗体抑制血管内皮细胞增殖

取人脐带分离血管内皮细胞培养，在VEGF刺激作用下，血管内皮细胞可以正常增殖生长。在此基础上，加入FD006抗体或Avastin阳性抗体阻断VEGF作用后，血管内皮细胞增殖受到抑制；该抑制作用呈显著的剂量依赖性；并且FD006抗体抑制血管内皮细胞增殖的活性略优于Avastin阳性抗体，具体见图3。

实施例6抗体抑制肿瘤生长

将人结肠癌细胞系接种于裸鼠皮下建立荷瘤动物模型。

分别在建立模型后1周、2周、3周、4周时给予FD006抗体或Avastin阳性抗体进行治疗，给药剂量为5mg/kg，给药方式为尾静脉注射；观察肿瘤生长速度。结果显示，抗体治疗可以显著抑制肿瘤生长，并且FD006抗体或Avastin阳性抗体治疗效果等效，见图4。

实施例7抗体在眼科模型中的应用

SD大鼠随机分组，将3毫米Whatman滤纸在lmol/L氢氧化钠溶液中浸泡60秒后放置于每只大鼠左眼角膜中央40秒建立碱烧伤角膜新生血管动物模型。造模成功后于碱烧伤术后第二天各组分别给予结膜下注射0.05ml生理盐水，溶剂（10mmol组氨酸盐酸缓冲液，2.5%海藻糖，0.01%吐温20，PH5.5），0.1%地塞米松，25mg/mL贝伐单抗和25mg/mLFD006。定期在裂隙灯显微镜（苏州六六医用设备公司）下观察角膜新生血管生长情况及角膜组织的完整性；利用眼前节照相系统（Canon）进行眼前节照相见图5，并测量各试验组角膜新生血管的长度及分布钟点位数以计算角膜新生血管面积。如图5所示，结膜下注射地塞米松、贝伐单抗和FD006和对照组相比均能有效抑制角膜新生血管的生长，图中虚线所示位置为新生血管生成边缘。图6为抗VEGF抗体FD006抑制角膜新生血管长度。结膜下注射地塞米松、贝伐单抗和FD006和对照组相比均能有效抑制角膜新生血管长度，**表示P<0.01。图7为抗VEGF抗体FD006抑制角膜新生血管面积。结膜下注射地塞米松、贝伐单抗和FD006和对照组相比均能有效抑制角膜新生血管面积，**表示P<0.01。

以上结果显示，结膜下注射地塞米松、贝伐单抗和FD006和对照组相比均能有效抑制角膜新生血管的生长。

Claims

1.一种抗VEGF人源抗体，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的3个CDR区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示；所述轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。

2.编码权利要求1所述的抗VEGF人源抗体的基因。

3.权利要求1所述的抗VEGF人源抗体在制备特异性靶向VEGF抗原的靶向药物的应用。

4.权利要求1所述的抗VEGF人源抗体在制备抑制血管生成的药物的应用。

5.权利要求1所述的抗VEGF人源抗体在制备抗肿瘤药物的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为结肠癌。

7.权利要求1所述的抗VEGF人源抗体在制备抑制角膜血管生成的药物的应用。