CN109021103A - 抗人血管内皮生长因子的抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗人血管内皮生长因子(VEGFA)的抗体及其制备方法和应用。该VEGFA抗体的重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3中的一种或多种，其氨基酸序列和核酸序列分别如本发明中所述。VEGFA抗体具有高亲和力和高生物学活性，与VEGF能很好地结合，并抑制或阻断VEGF与VEGFR的结合，从而影响其后续的信号通路以及相应的生物学功能，其在抗肿瘤、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、干癣、类风湿关节炎和慢性炎症中可以有很好的应用。

Description

抗人血管内皮生长因子的抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗人血管内皮生长因子的抗体及其制备方法和应用。

背景技术

血管发生是指通过内皮细胞的生长、分化和转移，从既存的血管形成新的血管的机制。众所周知，血管发生在创伤治愈以及女性的生理周期等正常生长过程中起重要作用(Risau,Nature,1997,386:671)，非正常的过度血管发生在肿瘤的生长和转移，以及年龄相关性黄斑变性(ARMD)、糖尿病性视网膜病变、干癣、类风湿关节炎、慢性炎症等疾病的发作中起关键作用(Carmeliet and Jain,Nature,2000,407:249)。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)，亦称作血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor a，即VEGFA)，在血管生成过程的多个步骤中有重要作用，其在肿瘤区域的缺氧部位广泛分泌。VEGF已知有4个同种型VEGF121、VEGF165、VEGF189和VEGF206。报道指出VEGF165在除胎盘外的全部人类组织中大量存在(Tisher et al.,J Biol Chem,1991,266:11947)。已知VEGF以极高的亲和性与其受体VEGFR-1和VEGFR-2结合，但也通过VEGFR-2传递信号，诱导血管内皮细胞的增殖和转移等与血管发生相关的机制。因此，VEGF和VEGFR-2被当作抑制由VEGF诱导的血管发生机制的主要靶标(Ellis et al.,Nature Rev Cancer,2008(8):579-591；Youssoufian et al.,ClinCancer Res,2007,(13):5544-5548)。Genentech公司的Avastin是一种针对VEGF的人源化抗体(Ferrara et al.,Biochem.Biophy Res Comm,2005,333(2):328-335)已被美国食品与药品管理局(FDA)分别在2004年批准用于转移性结肠癌、在2006年批准用于非小细胞性肺癌和在2008年批准用于Her-2阴性转移性乳腺癌，并进入市场。近年，进行了大量对各种实体肿瘤的临床试验以扩大其适应症。此外，该公司购得的Lucentis是一种通过消化Avastin的仅一个Fab片断而产生的抗体，能提高当Lucentis被注射入视网膜时的渗透性，从而作为抑制老年性黄斑变性的主要症状的黄斑下过度血管发生(Eter et al.，Biodrugs,2006,(20):167-179)，其在2006年被美国FDA批准作为治疗湿性年龄相关性黄斑变性(湿性-ARMD)的治疗剂。另一个靶向VEGF的治疗用抗体是Regeneron公司的VEGF-trap(Holash et al.,PNAS,2002,(99):11393-11398)。这是一种将VEGFR-1的第二免疫球蛋白域和VEGFR-2的第三免疫球蛋白域融合于人类Fc获得的水溶性“诱饵受体”，在2011年获得美国FDA批准，用于治疗湿性黄斑变性。

抗体药物由于其针对相应抗原具有高特异性和高亲和力的特性，因而在疾病的诊断和治疗中有明显的专一性优势，并且毒副作用较低。单克隆抗体药物已成功应用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等。2012年全球销售额前10名的药物中有6个为抗体药物并占据销售额最大的前3位。目前的单克隆抗体大多来自于小鼠，因此抗体作为异源蛋白在人体内具有抗原性，极大地限制了它在临床治疗上的使用。为了克服这一缺点，人们提出了很多解决方案，包括人/人或人/鼠杂交瘤技术、嵌合抗体技术、噬菌体展示技术。人/人或人/鼠杂交瘤技术由于其技术难度已退出市场，现在主要是运用体外抗体工程方法制备人源化抗体，但是这类方法得到的抗体往往亲和力不佳，易聚集，而从体内制备人源化或全人源抗体具有高亲和力，良好的水溶性以及不易发生聚集的优点，因此从全人源化抗体转基因小鼠制备人源化抗体最具有研发优势，也是今后抗体开发的主流。

治疗用单克隆抗体可由多种技术和途径进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等。但是通过杂交瘤技术制备单抗，仍然是目前治疗用单抗制备方法的主流。传统的杂交瘤制备技术由Kohlerand Milstein在40年前建立(Kohlerand Milstein,Nature,1975,256:495)，现在已广泛应用于科研、诊断、治疗等许多相关的单克隆抗体的制备和生产之中。其基本方法虽然延用至今，但在许多方面都有所变化、改进和创新，包括不同品系动物如转基因动物的使用、电融合技术的引入、高效筛选技术设备的应用如ClonePix设备等，使杂交瘤技术的应用更多样化和更加高效。从常规动物如小鼠等制备的单抗，可以通过常规分子生物学方法克隆抗体重链可变区和轻链可变区基因，可变区基因可以嫁接到人源抗体恒定区基因从而形成人鼠嵌合抗体(Cabilly et al.,U.S.Pat.No.4,816,567)，以大大降低人体使用时的免疫原性。更进一步，鼠源抗体可变区的CDR结构域可以嫁接到人源抗体架构上，从而使鼠源抗体成分降低到5％以下，大大增加了抗体在人体内使用的安全性。这一途径得到抗体称为人源化抗体，并且是目前抗体药物市场的主要产品(Winter,U.S.Pat.No.5,225,539to 55,and Queen et al,U.S.Pat.Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762and 6,180,370)。

重链抗体是去除两条轻链的抗体，相比传统抗体，它更容易穿过血管壁和进入实体瘤内部，在研发抗肿瘤单抗药物方面更具优势，另外从重链抗体衍生而来的单域抗体是迄今为止发现的最小抗体分子，在肿瘤影像，治疗和诊断方面可得到广泛应用。基于重链抗体的模块化性质，更进一步的应用是制备同时针对两个不同靶抗原的双特异抗体。通过杂交瘤技术得到的抗体或抗原结合区均含有一条重链可变区，每一可变区均含有CDR1、CDR2、CDR3三个结构域。用于鉴定抗体分子内重链可变区，及抗体可变区氨基酸序列内的CDR的方法和技术是本领域熟知的，并且可以用于识别在此公开的特定抗体可变区氨基酸序列内的CDR。可用于识别的CDR的边界示例约定包括，例如，Kabat定义，Chothia定义，和AbM定义。概括地说，所述的Kabat定义基于序列多样性，所述Chothia定义基于结构环区域的位置，AbM定义是Kabat定义和Chothia方法之间的折衷(Bethesda Md,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,National Institutes of Health,1991；Al-Lazikani et al.,J Mo Biol,1997,273:927-948；and Martin et al.,Proc Natl Acad Sci USA,1989,86:9268-9272)。其它公共数据库如IMGT/V-Quest也可用于鉴定抗体中的CDR序列。

VEGFA抗体开发的难点在于筛选出具有生物活性功能的抗体。常规的结合实验，比如细胞流式法(FACS)和酶联免疫法(ELISA)只能筛选出有亲和力的抗体，但是这些抗体与VEGFA结合后，不一定会影响后续的信号通路以及相应的生物学功能，因此不具备生物活性。目前国内没有VEGFA重链抗体，其开发的难点在于难以得到较好的重链抗体转基因小鼠免疫反应以及血清滴度，造成融合后阳性克隆数目少。

发明内容

本发明要解决的问题是，为了克服现有技术缺少VEGFA抗体、特别是重链抗体的不足，利用转基因小鼠以更为方便的方法，提供一种人VEGFA单克隆抗体，特别是重链抗体。该抗体能很好地与VEGF结合，并抑制或阻断VEGF与VEGFR的结合，从而影响后续的信号通路以及相应的生物学功能。

本发明解决上述技术问题的技术方案之一是：提供一种抗人血管内皮生长因子的抗体，其包含重链可变区，其中所述重链可变区包括CDR1、CDR2和/或CDR3，其中重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示、编码其的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5的第76～99位所示，重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示、编码其的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5的第151～174位所示，重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示、编码其的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5的第289～345位所示。

优选地，血管内皮生长因子的抗体重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3；更优选地，其中重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；进一步更优选地，编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

该抗体还可以包含重链恒定区，所述的重链恒定区为本领域常规，优选地为小鼠源抗体重链恒定区或人源抗体重链恒定区；更优选地为人源抗体重链恒定区。

根据本发明，所述抗体是指本领域常规的抗体，单克隆重链抗体、抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chainantibody fragment，scFv)、单域抗体(single-domain antibody，sdAb)和单区抗体(Signle-domain antibody)中的一种或多种。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。

抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。优选地，抗体的重链可变区和轻链可变区与小鼠源重链恒定区和小鼠源轻链恒定区构成抗体全长蛋白。或者，更优选地，抗体的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。最优选地，抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。

抗原抗体结合域蛋白质片段为本领域常规的抗原抗体结合域蛋白质片段，其包括轻链可变区、轻链恒定区和重链恒定区的Fd段。优选地，抗原抗体结合域蛋白质片段为Fab和F(ab’)₂。

单域抗体为本领域常规的单域抗体，其包括重链可变区和重链恒定区。

单区抗体为本领域常规的单区抗体，其仅包括重链可变区。

普通抗体为两条重链两条轻链的形式，而重链抗体是一种缺失轻链的新型抗体形式，制备重链抗体的方法有免疫骆驼通过噬菌体展示筛选得到抗体，成本较高，后期仍需进行人源化才能得到全人源的重链抗体，目前国内没有抗VEGFA的重链抗体。VEGFA重链抗体开发的难点在于难以得到较好的重链抗体转基因小鼠免疫反应以及血清滴度，造成融合后阳性克隆数目少，同时也很难难筛选出具有生物活性功能的抗体。常规的结合实验，比如细胞流式法(FACS)和酶联免疫法(ELISA)只能筛选出有亲和力的抗体，但是这些抗体与VEGFA结合后，不一定会影响后续的信号通路以及相应的生物学功能。因此本申请人需要建立相关生物学功能的检测方法。经过诸多研究，本申请人建立了血管内皮细胞增殖实验方法以筛选出能够抑制信号通路的候选抗体。

本发明利用重链抗体转基因小鼠单克隆抗体技术，综合运用多种免疫方法，利用有效的细胞水平功能性实验开发出了一个高亲和力和高生物学活性的重链抗体。这个抗体显示出优异的性质，能够与人VEGFA的胞外区相结合，并能够高效地抑制或阻断VEGFA与VEGFR的结合，从而下调或切断相应的信号通路，抑制由VEGF165引起的血管内皮细胞增殖。该抗体的用途，包括但不仅限于，抑制VEGFA介导的信号通路并治疗由VEGFA信号通路引发的或与之相关的疾病等。

在本发明一较佳实施例中，所述抗体为包括人源重链可变区和小鼠源重链恒定区的重链抗体。

根据本发明，一较佳实施例中VEGFA是指VEGFA165。

其中，抗体的制备方法为本领域常规的制备方法。制备方法优选地为：从重组表达血管内皮生长因子抗体的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。从重组表达该抗体的表达转化体中分离获得优选如下方法：将编码所述蛋白质并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，即可分离纯化获得该抗体。

本发明解决上述技术问题的技术方案之一是：还提供一种核酸，其编码上述的抗血管内皮生长因子的抗体。

优选地，编码重链可变区的核酸如序列表SEQ ID No.5所示。

本领域技术人员知晓，编码上述抗体的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该抗体序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。

本发明解决上述技术问题的技术方案之一是：还提供一种包含所述核酸的重组表达载体。

其中重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。表达载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载前述核酸分子即可。载体优选地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。

本发明解决上述技术问题的技术方案之一是：还提供一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。

其中，上述重组表达转化体的制备方法为本领域常规的制备方法，优选地为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。上述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。优选地，是述宿主细胞为E.coli TG1或BL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体)，或者CHO-K1细胞(表达全长IgG抗体)。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中上述转化方法为本领域常规转化方法，优选地为化学转化法，热激法或电转法。

本发明解决上述技术问题的技术方案之一是：提供一种抗人血管内皮生长因子的抗体的制备方法，其包括如下步骤：培养上述的重组表达转化体，从培养物中获得抗人血管内皮生长因子的抗体。

本发明解决上述技术问题的技术方案之一是：本发明提供上述抗体在制备药物中的应用。

优选地，上述的药物是用于预防或治疗抗肿瘤、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、干癣、类风湿关节炎和慢性炎症的药物。

本发明解决上述技术问题的技术方案之一是：还提供一种药物组合物，其活性成分包括上述的抗体。

优选地，上述的药物组合物是用于预防或治疗抗肿瘤、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、干癣、类风湿关节炎和慢性炎症的药物组合物。

本发明上述的药物组合物的给药途径较佳地为注射给药或口服给药。上述注射给药较佳地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。上述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳地为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。

优选地，本发明前述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。前述的药用载体为本领域常规药用载体，前述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。前述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，优选地包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更优选地，上述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述抗体和0.01～99.99％的药用载体，其中百分比为占所述药物组合物的质量百分比。

优选地，上述的药物组合物的施用量为有效量，上述有效量为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。上述有效量可以以个体基础来测定，并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。本领域技术人员可以通过使用个体基础等上述因素和使用不超过常规的实验来确定有效量。

本发明解决上述技术问题的技术方案之一是：提供上述抗体或药物组合物在制备预防或治疗血管内皮生长因子表达或功能异常相关疾病的药物中的应用。

本发明中，上述血管内皮生长因子表达或功能异常相关疾病为本领域常规的血管内皮生长因子表达或功能异常相关疾病。优选地，为抗肿瘤、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、干癣、类风湿关节炎和慢性炎症。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明利用重链抗体转基因小鼠单克隆抗体技术，综合运用多种免疫方法，利用有效的细胞水平功能性实验开发出了高亲和力和高生物学活性的重链抗体。这个抗体显示出优异的性质，能够与人VEGF的胞外区相结合，并能够高效地抑制或阻断VEGF与VEGFR的结合，从而下调或切断相应的信号通路，抑制由VEGF165引起的血管内皮细胞增殖。具体特性包括：

1)经ELISA检测，可以与人VEGF结合；

2)在血管内皮细胞增殖实验中，能显著降低血管内皮细胞的增殖。

这些抗体的用途，包括但不仅限于，抑制VEGF介导的信号通路并治疗由VEGF信号通路引发的或与之相关的疾病，如抗肿瘤、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、干癣、类风湿关节炎和慢性炎症等。

附图说明

图1为两只重链抗体转基因小鼠9996和9998在4次免疫结束后的血清效价。

图2为重链抗体与包被在ELISA板子上的抗原反应曲线，对照为普通mIgG。

图3为重链抗体抑制由40ng/ml VEGFA诱导的血管内皮细胞增殖曲线，而对照则不能抑制细胞增殖。

具体实施方式

本发明采用杂交瘤技术，综合运用多种免疫方法，利用有效的蛋白水平功能性实验进行筛选，开发出了高亲和力和高生物学活性的VEGFA重链抗体。然后通过分子生物学方法测序获知VEGFA抗体的重链可变区氨基酸序列。下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1VEGFA抗体的制备

(一)免疫原(hVEGFA165-hFc蛋白)和hVEGFA165-his蛋白的制备

VEGFA是一个可溶性配体，我们设计了VEGFA与人恒定区的产物，

具体序列见表1。

表1免疫原序列

编号	序列(5’→3’)
		hVEGFA165-hFc	VEGFA165(P15692-4)
hVEGFA165-his	VEGFA165(P15692-4)-6×his

将含有编码人源VEGFA165蛋白胞外区氨基酸序列如上表所示的第1位-191位(蛋氨酸1～精氨酸191)的核苷酸序列(在Genebank的编号为NM_001171626)克隆到带有人IgGFc片段(hFc)的pCpC载体(购自Invitrogen，V044-50)，或将含有上述编码人源VEGFA165蛋白胞外区氨基酸序列第1位-191位(蛋氨酸1～精氨酸191)的核苷酸序列克隆到带有his标签(6×His)的pCpC载体(hFc以及His标签均通过PCR技术克隆到pCpC载体)，并按已建立的标准分子生物学方法制备两种质粒。具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,andManiatis,T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)。使用上述两种质粒分别对HEK293细胞(购自ATCC)进行瞬时转染(聚醚酰亚胺PEI，购自Polysciences)并使用FreeStyle TM 293(购自Invitrogen)在37℃下进行扩大培养。2周后分别收集细胞培养液，离心去除细胞成分，得分别含蛋白hVEGFA165-hFc和hVEGFA165-his胞外区的培养上清液。将上述培养上清液上样到蛋白A亲和层析柱(10ml Mabselect Sure，购自GE Healthcare，货号17-5438)，同时用紫外(UV)检测仪监测紫外吸收值(A280nm)的变化。上样后用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.4)清洗蛋白A亲和层析柱直到紫外吸收值回到基线，然后用50mM柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0)洗脱，分别收集从蛋白A亲和层析柱上洗脱下来的人源hVEGFA165-hFc和hVEGFA165-his蛋白。用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.2)在4℃冰箱透析过夜。透析后的蛋白经0.22微米无菌过滤后分装于-80℃保存，分别获得纯化的人源VEGFA165-hFc和hVEGFA165-his蛋白。

(二)杂交瘤细胞的制备

1、免疫原免疫小鼠

采用上述第(一)部分制得的免疫原hVEGFA165-hFc蛋白免疫采用6～8周龄重链抗体转基因小鼠(HCAb小鼠，购自荷兰harbour公司)，小鼠在无特定病原体(Specificpathogen Free,SPF)条件下饲养。初次免疫时，免疫原用弗氏完全佐剂乳化后尾静脉端注射0.25ml，即每只小鼠注射50μg免疫原。加强免疫时，免疫原用弗氏不完全佐剂乳化后尾静脉端注射0.25ml，即每只小鼠注射50μg免疫原。初次免疫与第一次加强免疫之间间隔2周，以后每次加强免疫之间间隔3周。

2、间接ELISA法检测免疫血清效价

ELISA是酶联免疫吸附性试验的简称，是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术，该技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。每次加强免疫1周后采血，用ELISA检测血清中免疫原的抗体效价和特异性。

具体操作如下：

取1μg/mL“第(一)部分”中制备得到的hVEGFA-hFc溶解于磷酸盐缓冲液，包被于酶标板，100μL/孔，4℃过夜。次日，使用PBS缓冲液(含有0.1％(V/V)Tween-20)洗板三次，用0.5％明胶封闭液200μL/孔，37℃封闭1小时，使用PBS缓冲液洗板三次，小鼠于第三次加强免疫后第七天脸颊采血，鼠免疫血清用含2％新生牛血清10mM PBS缓冲液稀释，加入酶标板，100μL/孔37℃1小时，洗板三次后加入1:10⁴倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG，100μL/孔37℃1小时，洗板后100μL/孔加入TMB显色，室温避光20min，加50μL/孔2M HCl终止反应，测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值得比≥2.1为阳性来判断免疫血清的效价。结果如图1和表2所示。表2说明，经hVEGFA-hFc免疫后的小鼠血清对免疫原均有不同程度的结合，呈现抗原抗体反应，其中最高稀释度在一千左右。其中空白对照为1％(w/w)BSA，其中批次指第三次加强免疫后第七天的小鼠血清，表中的数据为OD_450nm值。

表2 ELISA检测VEGFA-hFc免疫后小鼠血清抗体效价

3.细胞融合和杂交瘤细胞鉴定

将所选择的每只小鼠最后一次免疫腹腔注射100μg VEGFA-hFc，3天后处死小鼠，收集脾细胞。加入NH₄OH至终浓度1％(w/w)，裂解脾细胞中参杂的红细胞，获得脾细胞悬液。用DMEM基础培养基1000转每分钟离心清洗细胞3次，然后按活细胞数目5:1比率与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(购自ATCC)混合，采用高效电融合方法(参见METHODS IN ENZYMOLOGY,VOL.220)进行细胞融合。

融合后的细胞稀释到含20％胎牛血清、1×HAT的DMEM培养基中，所述百分比为质量百分比。然后按1×10⁵/200μl每孔加入到96孔细胞培养板中，放入5％CO₂、37℃培养箱中，所述百分比为体积百分比。融合后的细胞稀释到含20％胎牛血清、1×HAT的DMEM培养基中，所述百分比为质量百分比。然后按1×10⁵/200μl每孔加入到96孔细胞培养板中，放入5％CO₂、37℃培养箱中，所述百分比为体积百分比。14天后分别用包被抗原hVEGFA165-his的ELISA(微孔板蛋白检测法)板筛选细胞融合板上清，将ELISA结果中比值大于2的阳性克隆扩增到24孔板，在含10％(w/w)HT胎牛血清，DMEM(Thermo&Fisher,Life technologies)在37℃，5％(v/v)CO₂条件下扩大培养。培养3天后取24孔板中扩大培养的培养液进行离心，收集上清液，对上清液进行抗体亚型分析，用ELISA确定对抗原的结合活性[结合活性的检测方法请分别参见实施例3(一)和实施例3(二)]。

根据24孔板筛选结果，挑选ELISA实验中OD值>2的杂交瘤细胞，用有限稀释法在96孔板进行亚克隆，在含10％(w/w)FBS的DMEM培养基中37℃，5％(v/v)CO₂条件下培养。亚克隆后10天用ELISA进行初步筛选，挑选单个阳性单克隆扩增到24孔板继续培养。3天后用ELISA确定抗原结合阳性并用VEGFR受体配体结合实验评估生物活性(评估标准为ELISA实验中OD值>2)。

根据24孔板样品检测结果，挑选出最优的克隆，并于含10％(w/w)FBS的DMEM培养基中在37℃，5％(v/v)CO₂条件下将该最优的克隆进行扩大培养，液氮冻存即得本发明杂交瘤细胞，并可用于后续的抗体生产和纯化。

实施例2抗体的生产和纯化

杂交瘤细胞产生的抗体浓度较低，大约仅1-10μg/ml，浓度变化较大。且培养基中细胞培养所产生的多种蛋白和培养基所含胎牛血清成分对很多生物活性分析方法都有不同程度的干扰，因此需要进行小规模(1-5mg)抗体生产纯化。

将实施例1所得的杂交瘤细胞接种到T-75细胞培养瓶并用生产培养基(Hybridomaserum free medium，购自Thermo&Fisher,Life technologies公司)驯化传代3代。待其生长状态良好，接种细胞培养转瓶。每个2升的培养转瓶中加入500ml生产培养基，接种细胞密度为1.0×10⁵/ml。盖紧瓶盖，将转瓶置于37℃培养箱中的转瓶机上，转速3转/分钟。连续旋转培养14天后，收集细胞培养液，过滤去除细胞，并用0.45μm的滤膜过滤至培养上清液澄清。澄清的培养上清液可马上进行纯化或-30℃冻存。

澄清的杂交瘤细胞的培养上清液(300ml)中的单克隆抗体用2mL蛋白A柱(购自GEHealthcare)纯化。蛋白A柱先用平衡缓冲液(PBS磷酸缓冲液，pH7.2)平衡，然后将澄清的培养上清液上样到蛋白A柱，控制流速在3mL/分钟。上样完毕后用平衡缓冲液清洗蛋白A柱，平衡缓冲液的体积为4倍蛋白A柱柱床体积。用洗脱液(0.1M甘氨盐酸缓冲液，pH2.5)洗脱结合在蛋白A柱上的VEGFA抗体，用紫外检测器监测洗脱情况(A₂₈₀紫外吸收峰)。收集洗脱的抗体，加入10％1.0M Tris-HCl缓冲液中和pH，所述百分比为体积百分比，然后立即用PBS磷酸缓冲液透析过夜，第二天换液1次并继续透析3小时。收集透析后的VEGFA抗体，用0.22μm的滤器进行无菌过滤，无菌保存，即得纯化的重链VEGFA抗体。

将纯化的VEGFA抗体进行蛋白浓度(A280/1.4)、纯度、等检测分析，结果如表3所示。

表3纯化的VEGFA抗体检测分析

克隆号	抗体纯度	蛋白浓度(mg/ml)
			410D2D9	>90％	0.246

实施例3抗体的检定

(一)酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗原抗体结合位点

对实施例2所得的纯化的VEGFA抗体进行与hVEGFA165-his进行结合反应。

将实施例1制备的hVEGFA165-his用PBS稀释到终浓度5.0μg/mL，然后以100μl每孔加到96孔ELISA板。用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用洗板液[PBS+0.01％(v/v)Tween20]洗板2次，加入封闭液[PBS+0.01％(v/v)Tween20+1％(w/w)BSA]室温封闭2小时。倒掉封闭液，加入实施例2所得的纯化的VEGFA抗体100μl每孔。37℃孵育2小时后，用洗板液[PBS+0.01％(v/v)Tween20]洗板3次。加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗(购自Sigma)，37℃孵育2小时后，用洗板液[PBS+0.01％(v/v)Tween20]洗板3次。加入TMB底物100μl每孔，室温孵育30分钟后，加入终止液(1.0NHCl)100μl每孔。用ELISA读板机(SpectraMax384plus，购自MolecularDevice)读取OD_450nm数值，结果如图2和表4所示，其中IgG对照为小鼠IgG(mIgG)，表中的数据为OD_450nm值。

表4 ELISA检测VEGFA抗体与VEGFA的结合

(二)抗体抑制血管内皮细胞增殖实验

Luminescent Cell Viability Assay试剂盒(Product G7573)购自Promega,具体实验步骤按照试剂盒说明书进行。

HUVECs(Sciencell,美国)细胞接入96孔板，密度为每孔4000个细胞左右，于EGM完全培养基中37℃培养24小时，之后洗去含有小牛血清的培养液，再加入含有40ng/ml VEGFA(实施例1制备的hVEGFA165-his)和抗体(实施例2制备)的基础培养基进行37℃培养3天。72之后在培养基内加入cell-titer glow(Promega,美国)，室温放置10分钟后用发光值检测细胞存活率，每个抗体浓度各检测三次。结果请见图3和表5。下表5为用cell-titer glow法检测VEGF抗体抑制由VEGF诱导的血管内皮细胞增殖。当抗体浓度大于等于11.111nM时，410D2D9的发光值明显低于对照组mIgG的发光值，说明血管内皮细胞的增殖被抗体抑制了。

表5 VEGF抗体抑制由VEGF诱导的血管内皮细胞增殖

实施例4重链可变区氨基酸序列测定

总RNA分离：将实施例1亚克隆培养所得的上清液检验过抗原结合后(即经过实施例2～3的检定和活性测定后)，通过离心搜集5×10⁷个杂交瘤细胞，加入1mL Trizol混匀并转移到1.5mL离心管中，室温静置5分钟；加0.2mL氯仿，振荡15秒，静置2分钟后于4℃，12000g离心5分钟，取上清转移到新的1.5mL离心管中；加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟后于4℃，12000g离心15分钟，弃上清；加入1mL 75％乙醇(所述百分比为体积百分比)，轻轻洗涤沉淀，4℃，12000g离心5分钟后弃上清，将沉淀物晾干，加入DEPC处理过的H₂O溶解(55℃水浴促进溶剂10分钟)，即得总RNA。

逆转录与PCR：取1μg总RNA，配置20μl体系，加入逆转录酶后于42℃反应60分钟，于7℃反应10分钟终止反应。配置50μl PCR体系，包括1μl cDNA、每种引物25pmol、1μl DNA聚合酶以及相配的缓冲体系、250μMdNTPs；设置PCR程序，预变性95℃3分钟，变性95℃30秒，退火55℃30秒，延伸72℃35秒，35个循环后再额外于72℃延伸5分钟，得PCR产物。其中逆转录所用的试剂盒为PrimeScript RT Master Mix，购自Takara，货号RR036；PCR所用的试剂盒包括Q5超保真酶，购自NEB，货号M0492。

克隆与测序：取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将检测阳性样品使用柱回收试剂盒纯化，其中回收试剂盒为 Gel&PCR Clean-up，购自MACHEREY-NAGEL，货号740609。进行连接反应：样品50ng，T载体50ng，连接酶0.5μl，缓冲液1μl，反应体系10μl，于16℃反应半小时得连接产物，其中连接的试剂盒为T4DNA连接酶，购自NEB，货号M0402；取5μl连接产物加入100μl的感受态细胞(Ecos 101competent cells,购自Yeastern，货号FYE607)中，冰浴5分钟，而后于42℃水浴热激1分钟，放回冰上1分钟后加入650μl无抗生素SOC培养基，于37℃摇床上以200RPM/分钟的速度复苏30分钟，取出200μl涂布于含抗生素的LB固体培养基上于37℃孵箱过夜培养；次日，使用T载体(购自Takara，货号6011)上通用引物M13F(GTAAAACGACGGCCAGT)和M13R(CAGGAAACAGCTATGAC)配置30μl PCR体系，进行菌落PCR，用移液器枪头蘸取菌落于PCR反应体系中吹吸，并吸出0.5μl点于另一块含100nM氨苄青霉素的LB固体培养皿上以保存菌株；PCR反应结束后，取出5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性样品进行测序和分析(参见Kabat,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,Md,1991)。测序结果如表6～7所示。

表6 VEGFA抗体蛋白氨基酸序列编号

其中，表6中的数字即为序列表中序列号，如410D2D9的重链蛋白可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.1，而410D2D9的重链蛋白可变区中CDR1的氨基酸序列为SEQ ID No.2。

表7 VEGFA抗体基因(DNA)序列编号

克隆号	重链蛋白可变区
		410D2D9	5

其中，表7中的数字即为序列表中序列号，如编码410D2D9的重链蛋白可变区的核苷酸序列为SEQ ID No.5。编码410D2D9的重链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.5中的第76位至第99位；编码410D2D9的重链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.5中的第151位至第174位；编码410D2D9的重链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.5中的第289位至第345位。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海睿智化学研究有限公司；凯惠睿智生物科技（上海）有限公司

<120> 抗人血管内皮生长因子的抗体及其制备方法和应用

<130> P1710590C

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 126

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ala Ile Trp Phe Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Ser Gly Ile Thr Met Leu Arg Gly Val Ile Ile Gly Tyr

100 105 110

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Ile Trp Phe Asp Gly Asn Asn Lys

1 5

<210> 4

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Ala Lys Asp Ser Gly Ile Thr Met Leu Arg Gly Val Ile Ile Gly Tyr

1 5 10 15

Phe Asp Tyr

<210> 5

<211> 378

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggccagg ggctggagtg ggtggcagct atatggtttg atggaaataa taaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attctaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctatgt attactgtgc gaaagattcg 300

ggtattacta tgcttcgggg agttattata gggtactttg actactgggg ccagggaacc 360

ctggtcaccg tctcttca 378

Claims (10)

1.一种抗人血管内皮生长因子的抗体，其包含重链可变区，其特征在于，所述重链可变区包括CDR1、CDR2和/或CDR3，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示、编码其的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5的第76～99位所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示、编码其的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5的第151～174位所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示、编码其的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5的第289～345位所示。

2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3；较佳地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；更佳地，编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

3.如权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述重链可变区为人源的；和/或，所述抗体还包括重链恒定区；较佳地，所述重链恒定区为人源或者小鼠源的。

4.如权利要求1～3任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体、抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体、单域抗体或单区抗体；较佳地是重链抗体；更佳地，抗人血管内皮生长因子为抗人血管内皮生长因子165。

5.一种核酸，其特征在于，其编码如权利要求1～4任一项所述的抗体；较佳地，所述核酸编码的抗体的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1所示的序列；更佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.5所示。

6.一种包含如权利要求5所述的核酸的重组表达载体。

7.一种包含如权利要求6所述的重组表达载体的重组表达转化体。

8.一种抗人血管内皮生长因子的抗体的制备方法，其包括如下步骤：培养如权利要求7所述的重组表达转化体，从培养物中获得抗人血管内皮生长因子的抗体。

9.一种药物组合物，其特征在于，其包括如权利要求1～4中任一项所述的抗体作为活性成分和药学可接受的载体；较佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的如权利要求1～4中任一项所述的抗体和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。

10.一种如权利要求1～4中任一项所述的抗体或者一种如权利要求9所述的药物组合物在制备预防或治疗与人血管内皮生长因子或其受体相关的疾病的药物中的应用；较佳地，所述的疾病为肿瘤、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、干癣、类风湿关节炎或慢性炎症。