CN107400165A

CN107400165A - 一种il‑13抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107400165A
Application number: CN201710344790.9A
Authority: CN
Inventors: 杨沂蓁; 宫世勇; 郝丽娟; 吴建; 杨欣秀; 钟勤; 胡少平; 梁绍勤; 段请; 刘礼乐
Original assignee: Shanghai Pioneer Biological Medicine Co Ltd
Current assignee: Shanghai Pioneer Biological Medicine Co Ltd
Priority date: 2016-05-18
Filing date: 2017-05-16
Publication date: 2017-11-28
Also published as: WO2017198148A1; EP3459972A4; US20190309059A1; EP3459972A1; US11136387B2; JP2019527535A

Abstract

本发明公开了一种IL‑13抗体及其制备方法和应用。所述IL‑13抗体包括IL‑13抗体的重链可变区重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3中的一种或多种，和/或，IL‑13抗体的轻链可变区轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3中的一种或多种，其氨基酸序列分别如本发明中所述。所述IL‑13抗体具有高亲和力，能明显抑制IL‑13诱导的胸腺活化调节趋化因子和骨膜蛋白的分泌以及血管细胞粘附分子‑1的表达，明显抑制IL‑13诱导的小鼠气道高反应性，因此运用于预防或治疗IL‑13表达或功能异常相关疾病的药物的制备中。

Description

一种IL-13抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及抗体领域，具体涉及一种IL-13抗体及其制备方法和应用。

背景技术

支气管哮喘(简称哮喘)是一种常见的慢性气道性炎症疾病，通常伴随气道反应性增高，出现反复发作的喘息、气促、胸闷和/或咳嗽等症状。20世纪70年代以后，哮喘病广泛流行。到2011年，全球约有2.35亿至3亿人受到影响，大约有25万人因此失去生命。临床上，哮喘通常是以吸入类固醇等糖皮质激素并辅助长效β-肾上腺素能受体激动剂等方式来治疗。但是，约有10％的病人不能通过常规的气道吸入的方法加以缓解，这些病人往往需要口服副作用很大的类固醇类药物来控制病情，而且仍然伴随着较高的死亡率。患者不仅生活质量受到巨大影响，而产生的直接医疗费用和间接成本会造成个人和社会经济的巨大负担。

近年来，随着对哮喘的深入研究，发现很大部分哮喘患者是由于Th2细胞过度释放可溶性细胞因子诱导IgE的产生，导致肥大细胞、嗜酸性粒细胞脱颗粒增多，从而引起多种炎症细胞参与的气道过敏反应和慢性气道炎症。其中白细胞介素13(以下简称IL-13)和白细胞介素4(以下简称IL-4)在这个过程中起着非常重要的作用。IL-13是一种主要由Th2细胞分泌的多效应细胞因子，分子量约为10KDa，其基因位于第5号染色体上，与IL-4基因紧密连接。IL-4和IL-13都由Th2细胞产生，他们共享同一条受体链，在功能上有很多相似之处。近年来，多项动物实验已经证实IL-4和IL-13均可导致气道反应性增高，嗜酸性粒细胞浸润和粘液分泌的增加。哮喘患者中普遍出现的血浆IgE水平的升高，也已经被证实是IL-13刺激B细胞增殖、分化的结果。近年来随着对IL-13基因单核苷酸的多态性的深入研究，还发现IL-13存在一个天然变体R130Q。人群中约25％的染色体上均出现这种变体的编码，但在哮喘患者中，这个比例可以提高到大约50％。文献报道指出R130Q变体与哮喘的发病直接相关，而且更容易出现过敏症状。深入的研究发现，表达IL-13变体R130Q的患者体内IL-13浓度更高，且效果更强，更易引发哮喘等症状(参见May and Fung 2015,Cytokine75:89)。

传统的杂交瘤制备技术由Kohler and Milstein在40年前建立(Kohler andMilstein1975，Nature 256:495)，现在已广泛应用于科研、诊断、治疗等许多单克隆抗体相关的制备和生产之中。其基本方法虽然延用至今，但在许多方面都有所变化、改进和创新，包括不同品系动物如转基因动物的使用、电融合技术的引入、高效筛选技术设备的应用如ClonePix设备等。从而使杂交瘤技术的应用更多样化和高效化。常规动物如小鼠等制备的单抗，可以通过常规分子生物学方法克隆抗体重链可变区和轻链可变区基因，可变区基因可以嫁接到人源抗体恒定区基因从而形成人鼠嵌合抗体(参见美国专利文献U.S.Pat.No.4,816,567)，以大大降低人体使用时的免疫原性。此外，鼠源抗体可变区的CDR结构域可以嫁接到人源抗体架构上，从而使鼠源抗体成分降低到5％以下，大大增加了抗体在人体内使用的安全性。这一途径得到抗体称为人源化抗体，并且是目前抗体药物市场的主要产品(参见美国专利文献U.S.Pat.No.5,225,539等)。

噬菌体展示技术最早出现是在1985年，Smith G P[参见Smith GP 1985，Science228(4705):1315–7]第一次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而创建了噬菌体展示技术。同年，GeorgePieczenik发表的专利(参见美国专利文献U.S.Pat.No.58663635等)中，介绍了利用噬菌体展示技术建立肽库的方法。之后，该技术经过多年的改进与发展，已经成为发现具有新功能多肽和改变已有多肽性质的强大工具。

因此，迫切需要可抑制IL-13的药物，如IL-13抗体用于预防或治疗支气管哮喘。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术目前缺少IL-13抗体的不足，提供了一种亲和力高、特异性强的IL-13抗体及其制备方法和应用。所述的IL-13抗体具有高亲和力，能明显抑制IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子的分泌和骨膜蛋白的分泌以及血管细胞粘附分子-1的表达，明显抑制IL-13诱导的小鼠气道高反应性。因此能够运用于预防或治疗支气管哮喘等疾病的药物的制备中。

本发明以重组人IL-13蛋白作为免疫原，采用传统的杂交瘤制备技术(参见Kohlerand Milstein，Nature，1975，256:495)或噬菌体展示技术，通过一系列的调整和改进获得IL-13抗体的先导抗体。再通过对先导抗体的初步生产、纯化和检定，获得具备与人IL-13蛋白等蛋白具有高度亲和力的IL-13抗体。并且通过分子生物学方法测序获知所得的IL-13抗体的重链可变区和IL-13抗体的轻链可变区的氨基酸序列，得到鼠-人嵌合抗体分子或人源抗体分子。

本发明提供一种分离的蛋白质，其包括：IL-13抗体的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3中的一种或多种，和/或，IL-13抗体的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3中的一种或多种；其中，

所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.18、SEQ ID No.26、SEQ ID No.34或SEQ ID No.42所示，

所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.19、SEQ ID No.27、SEQ ID No.35或SEQ ID No.43所示，

所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.20、SEQ ID No.28、SEQ ID No.36或SEQ ID No.44所示，

所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.6、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.22、SEQ ID No.30、SEQ ID No.38或SEQ ID No.46所示，

所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.7、SEQ ID No.15、SEQ IDNo.23、SEQ ID No.31、SEQ ID No.39或SEQ ID No.47所示，

所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.8、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.24、SEQ ID No.32、SEQ ID No.40或SEQ ID No.48所示；

或者，

所述重链CDR1的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.18、SEQ ID No.26、SEQ ID No.34或SEQ ID No.42所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示，

所述重链CDR2的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.3、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.19、SEQ ID No.27、SEQ ID No.35或SEQ ID No.43所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示，

所述重链CDR3的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.20、SEQ ID No.28、SEQ ID No.36或SEQ ID No.44所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示，

所述轻链CDR1的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.6、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.22、SEQ ID No.30、SEQ ID No.38或SEQ ID No.46所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示，

所述轻链CDR2的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.7、SEQ ID No.15、SEQ IDNo.23、SEQ ID No.31、SEQ ID No.39或SEQ ID No.47所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示，

所述轻链CDR3的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.8、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.24、SEQ ID No.32、SEQ ID No.40或SEQ ID No.48所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示。

较佳地，所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.4所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.10所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.11所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.12所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.18所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.19所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.20所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.26所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.27所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.28所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.34所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.35所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.36所示；或，所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.42所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.43所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.44所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.6所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQID No.7所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.8所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.14所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.15所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.16所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.22所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.23所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.24所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.30所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.31所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.32所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.38所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.39所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.40所示；或，所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.46所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.47所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.48所示。

较佳地，所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.4所示；和，所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.6所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.7所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.8所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.10所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.11所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.12所示；和，所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.14所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.15所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.16所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.18所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.19所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.20所示；和，所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.22所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.23所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.24所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.26所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQID No.27所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.28所示；和，所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.30所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQID No.31所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.32所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.34所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.35所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.36所示；和，所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.38所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.39所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.40所示；或者，所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.42所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.43所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.44所示；和，所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.46所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.47所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.48所示。

本发明提供一种分离的蛋白质，其包括IL-13抗体的重链可变区和/或IL-13抗体的轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.9、SEQID No.17、SEQ ID No.25、SEQ ID No.33或SEQ ID No.41所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.5、SEQ ID No.13、SEQ ID No.21、SEQ ID No.29、SEQ ID No.37或SEQ ID No.45所示。

较佳地，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.5所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQID No.9所示且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.13所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.17所示且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQID No.21所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.25所示且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.29所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQID No.33所示且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.37所示；或，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.41所示且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.45所示。

综上所述，上述氨基酸序列的编号如表1所示：

表1 IL-13抗体的氨基酸序列编号

其中，表1中的数字即为序列表“SEQ ID No.”编号，如P4_4H12的重链蛋白可变区的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.1，而P4_4H12的重链蛋白可变区中CDR1域的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。

较佳地，所述的蛋白质还包括抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区，所述的抗体重链恒定区为本领域常规，较佳地为小鼠源抗体重链恒定区或人源抗体重链恒定区，更佳地为人源抗体重链恒定区。所述的抗体轻链恒定区为本领域常规，较佳地为小鼠源轻链抗体恒定区或人源抗体轻链恒定区，更佳地为人源抗体轻链恒定区。

所述的蛋白质为本领域常规的蛋白质，较佳地为IL-13抗体，更佳地为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chainantibody fragment，scFv)、单域抗体(single-domain antibody，sdAb)和单区抗体(Signle-domain antibody)中的一种或多种，以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。

所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。较佳地，所述的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。或者，较佳地，所述的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与小鼠源重链恒定区和小鼠源轻链恒定区构成抗体全长蛋白。较佳地，所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。

所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为本领域常规的抗原抗体结合域蛋白质片段，其包括轻链可变区、轻链恒定区和重链恒定区的Fd段。较佳地，所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为Fab和F(ab’)2。

所述的单域抗体为本领域常规的单域抗体，其包括重链可变区和重链恒定区。

所述的单区抗体为本领域常规的单区抗体，其仅包括重链可变区。

其中，所述蛋白质的制备方法为本领域常规的制备方法。所述制备方法较佳地为：从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。所述的从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得优选如下方法：将编码所述蛋白质并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，即可分离纯化获得所述蛋白质。

本发明还提供一种核酸，其编码上述的蛋白质。

较佳地，编码所述重链可变区的核酸如序列表SEQ ID No.49、SEQ ID No.51、SEQID No.53、SEQ ID No.55、SEQ ID No.57或SEQ ID No.59所示；和/或，编码所述轻链可变区的核酸如序列表SEQ ID No.50、SEQ ID No.52、SEQ ID No.54、SEQ ID No.56、SEQ IDNo.58或SEQ ID No.60所示。

更佳地，编码所述重链可变区的核酸如序列表SEQ ID No.49所示且编码所述轻链可变区的核酸如序列表SEQ ID No.50所示；编码所述重链可变区的核酸如序列表SEQ IDNo.51所示且编码所述轻链可变区的核酸如序列表SEQ ID No.52所示；编码所述重链可变区的核酸如序列表SEQ ID No.53所示且编码所述轻链可变区的核酸如序列表SEQ IDNo.54所示；编码所述重链可变区的核酸如序列表SEQ ID No.55所示且编码所述轻链可变区的核酸如序列表SEQ ID No.56所示；编码所述重链可变区的核酸如序列表SEQ ID No.57所示且编码所述轻链可变区的核酸如序列表SEQ ID No.58所示；或，编码所述重链可变区的核酸如序列表SEQ ID No.59所示且编码所述轻链可变区的核酸如序列表SEQ ID No.60所示。

上述核苷酸序列的编号如表2所示：

表2 IL-13抗体的核苷酸序列编号

其中，表2中的数字即为序列表“SEQ ID No.”编号，如编码P4_4H12的重链蛋白可变区的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.49，而编码P4_4H12的轻链蛋白可变区的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.50。

编码P4_4H12的重链蛋白可变区中CDR1域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.49中的第91位至第105位；

编码P4_4H12的重链蛋白可变区中CDR2域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.49中的第148位至第198位；

编码P4_4H12的重链蛋白可变区中CDR3域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.49中的第295位至第348位；

编码P4_4H12的轻链蛋白可变区中CDR1域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.50中的第70位至第105位；

编码P4_4H12的轻链蛋白可变区中CDR2域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.50中的第151位至第171位；

编码P4_4H12的轻链蛋白可变区中CDR3域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.50中的第268位至第294位；

编码29D9H8的重链蛋白可变区中CDR1域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.51中的第91位至第105位；

编码29D9H8的重链蛋白可变区中CDR2域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.51中的第148位至第198位；

编码29D9H8的重链蛋白可变区中CDR3域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.51中的第295位至第327位；

编码29D9H8的轻链蛋白可变区中CDR1域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.52中的第70位至第102位；

编码29D9H8的轻链蛋白可变区中CDR2域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.52中的第148位至第168位；

编码29D9H8的轻链蛋白可变区中CDR3域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.52中的第265位至第291位；

编码28A2E11的重链蛋白可变区中CDR1域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.53中的第91位至第105位；

编码28A2E11的重链蛋白可变区中CDR2域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.53中的第148位至第198位；

编码28A2E11的重链蛋白可变区中CDR3域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.53中的第295位至第321位；

编码28A2E11的轻链蛋白可变区中CDR1域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.54中的第67位至第108位；

编码28A2E11的轻链蛋白可变区中CDR2域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.54中的第154位至第174位；

编码28A2E11的轻链蛋白可变区中CDR3域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.54中的第271位至第297位；

编码35E2C3的重链蛋白可变区中CDR1域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.55中的第91位至第105位；

编码35E2C3的重链蛋白可变区中CDR2域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.55中的第148位至第195位；

编码35E2C3的重链蛋白可变区中CDR3域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.55中的第292位至第321位；

编码35E2C3的轻链蛋白可变区中CDR1域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.56中的第70位至第102位；

编码35E2C3的轻链蛋白可变区中CDR2域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.56中的第148位至第168位；

编码35E2C3的轻链蛋白可变区中CDR3域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.56中的第265位至第291位；

编码70F10A10的重链蛋白可变区中CDR1域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.57中的第91位至第105位；

编码70F10A10的重链蛋白可变区中CDR2域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.57中的第148位至第198位；

编码70F10A10的重链蛋白可变区中CDR3域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.57中的第295位至第330位；

编码70F10A10的轻链蛋白可变区中CDR1域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.58中的第70位至第120位；

编码70F10A10的轻链蛋白可变区中CDR2域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.58中的第166位至第186位；

编码70F10A10的轻链蛋白可变区中CDR3域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.58中的第283位至第309位；

编码35H6E1的重链蛋白可变区中CDR1域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.59中的第91位至第111位；

编码35H6E1的重链蛋白可变区中CDR2域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.59中的第154位至第201位；

编码35H6E1的重链蛋白可变区中CDR3域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.59中的第298位至第336位；

编码35H6E1的轻链蛋白可变区中CDR1域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.60中的第70位至第102位；

编码35H6E1的轻链蛋白可变区中CDR2域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.60中的第148位至第168位；

编码35H6E1的轻链蛋白可变区中CDR3域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.60中的第265位至第291位。所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地，包括以下的步骤：通过基因克隆技术获得编码上述蛋白质的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述蛋白质的核酸分子。

本领域技术人员知晓，编码上述蛋白质的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。

本发明还提供一种包含所述核酸的重组表达载体。

其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载前述核酸分子即可。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。

本发明还提供一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。

其中，所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。较佳地，所述宿主细胞为E.coli TG1或BL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体)，或者CHO-K1细胞(表达全长IgG抗体)。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。

本发明提供一种IL-13抗体的制备方法，其包括如下步骤：培养上述的重组表达转化体，从培养物中获得IL-13抗体。

本发明还提供一种检测过表达IL-13蛋白的细胞的方法，包括如下的步骤：上述的蛋白质与待检样品在体外接触，检测上述的蛋白质与所述待检样品的结合即可。

所述的过表达的含义为本领域常规，指IL-13蛋白在待检样品中的RNA或蛋白质的过表达(由于转录增加、转录后加工、翻译、翻译后加工以及蛋白质降解改变)，以及由于蛋白质运送模式改变(核定位增加)而导致的局部过表达和功能活性提高(如在底物的酶水解作用增加的情况下)。

所述结合的检测方式是本领域常规的检测方式，较佳地为FACS检测。

本发明提供一种检测过表达IL-13蛋白的细胞的组合物，其包括上述的蛋白质作为活性成分。较佳地，其还包括上述的蛋白质的功能片段组成的化合物作为活性成分。

本发明提供上述蛋白质在制备药物中的应用。

较佳地，所述的药物是用于预防或治疗支气管哮喘的药物。

本发明还提供一种药物组合物，其活性成分包括上述的蛋白质。

较佳地，所述的药物组合物是用于预防或治疗支气管哮喘的药物组合物。

本发明所述的药物组合物的给药途径较佳地为注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳地为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。

较佳地，本发明所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。所述的药用载体为本领域常规药用载体，所述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳的包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述蛋白质和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。

较佳地，所述的药物组合物的施用量为有效量，所述有效量为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定，并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。本领域技术人员可以通过使用个体基础等上述因素和使用不超过常规的实验来确定有效量。

本发明提供上述蛋白质在制备预防或治疗IL-13表达或功能异常相关疾病的药物中的应用。

本发明中，所述IL-13表达或功能异常相关疾病为本领域常规的IL-13表达或功能异常相关疾病。较佳地，为支气管哮喘。

本发明提供上述药物组合物在制备预防或治疗IL-13表达或功能异常相关疾病的药物中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明所述的蛋白质，即提供的IL-13抗体亲和力高，与人IL-13的亲和力达到KD<1×10-⁸M；在IL-13诱导胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌试验中，能明显抑制IL-13诱导的分泌；在IL-13诱导的骨膜蛋白(Periostin)分泌试验中，能明显抑制IL-13诱导的分泌；在IL-13诱导的人脐带静脉内皮细胞表达血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)，能明显抑制IL-13诱导的表达；在以流式细胞分析建立的受体-配体结合阻滞实验中，抑制IL-13与其配体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合；在以流式细胞分析建立的受体-配体结合阻滞实验中，抑制IL-13与其配体IL-13Ra2的结合。在IL-13诱导的小鼠气道炎症的动物模型中，能明显抑制小鼠气道呼吸炎症，抑制IL-13诱导的小鼠气道高反应性。可见本发明所述的蛋白质，即提供的IL-13抗体能够应用于制备预防或治疗支气管哮喘的药物。

附图说明

图1为TARC分泌试验检验IL-13蛋白的生物学活性的结果。

图2为ELISA检测免疫原A免疫后小鼠血清抗体效价的结果。

图3-1、3-2和3-3分别为ELISA检测先导抗体、嵌合抗体和全人源抗体与免疫原A的反应活性的结果。

图4为ELISA检测嵌合抗体与IL-13R130Q变体的反应活性的结果，其中横坐标0代表1％(w/w)BSA的空白对照。

图5-1和5-2分别为ELISA检测先导抗体、嵌合抗体与猴IL-13的反应活性的结果。

图6为ELISA检测先导抗体与鼠IL-13的反应活性的结果。

图7为流式细胞分析方法检测过表达全长人IL-13Ra1的HEK293细胞株中hIL-13Ra1蛋白的表达水平的结果。其中，抗体指羊抗人IL-13Ra1抗体(购自RnD systems)；阴性对照指羊IgG对照。

图8为流式细胞分析方法检测过表达全长人IL-4Ra的HEK293细胞株中hIL-4Ra蛋白的表达水平的结果。其中，抗体指鼠抗人IL-4Ra抗体(购自RnD systems)；阴性对照指鼠IgG对照。

图9为流式细胞分析方法检测过表达全长人IL-13Ra2的HEK293细胞株中hIL-13Ra2蛋白的表达水平的结果。其中，抗体指羊抗人IL-13Ra2抗体(购自RnD systems)；阴性对照指羊IgG对照。

图10-1、10-2和10-3分别为FACS检测先导抗体、嵌合抗体和全人源抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合的结果。

图11-1、11-2和11-3分别为为FACS检测先导抗体、嵌合抗体和全人源抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合的结果。

图12-1、12-2和12-3分别为先导抗体、嵌合抗体和全人源抗体中和IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子分泌的结果。

图13为嵌合抗体中和IL-13诱导的骨膜蛋白分泌的结果。

图14为嵌合抗体中和IL-13诱导的血管细胞粘附分子-1表达的结果。

图15为嵌合抗体抑制人IL-13诱导的小鼠呼吸炎症实验的结果。

图16-1为嵌合抗体c29D9H8与人IL-13亲和力检测实验的结果，每条曲线由上至下IL-13浓度分别是12.5nM,6.25nM,3.125nM,1.5625nM,0.78125nM,0.390625nM；图16-2为嵌合抗体c35E2C3与人IL-13亲和力检测实验的结果，每条曲线由上至下IL-13浓度分别是100nM,50nM,25nM,12.5nM,6.25nM,3.125nM。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例中所述的室温为本领域常规的室温，一般为20-25℃。

实施例中若无特别说明，所述的PBS缓冲液为PBS磷酸缓冲液，pH7.4。

实施例1

人IL-13和人IL-13R130Q变体的表达与纯化

将编码人IL-13蛋白氨基酸序列(参见GenBank数据库，登录号：AAK53823.1)中Met1-Asn132的核苷酸序列的3’端加入编码六个组氨酸的核苷酸，得编码his标签重组人IL-13蛋白的核苷酸序列(如序列表SEQ ID No.61所示)。

或者，将编码人IL-13蛋白变体IL-13R130Q氨基酸序列中Met1-Asn132的核苷酸序列的3’端加入编码六个组氨酸的核苷酸，得编码his标签的重组人IL-13R130Q变体的核苷酸序列(如序列表SEQ ID No.62所示)。

将编码his标签重组人IL-13蛋白的核苷酸序列和编码his标签的重组人IL-13R130Q变体的核苷酸序列分别克隆到PCP载体(购自Invitrogen)并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒，具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press)。对FreeStyle 293F细胞(购自Invitrogen)进行瞬时转染(PEI，Polysciences)并使用FreeStyle ^TM 293(Invitrogen)在37℃下进行扩大培养。5-7天后收集细胞培养液，离心去除细胞成分，得含his标签的人IL-13的培养上清液，或含his标签的人IL-13R130Q变体的培养上清液。将上述培养上清液分别上样到Ni-NTA亲和层析柱(购自GE)，纯化上清液中his标签的人IL-13(即免疫原A)和含his标签的人IL-13R130Q变体，再使用分子筛柱(购自GE)进行进一步纯化，除去大分子聚合体等杂质。纯化后的免疫原A和含his标签的人IL-13R130Q变体保存在PBS磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，经0.22μm无菌滤膜过滤后分装于-80℃保存。

将纯化的免疫原A进行TARC分泌试验。TARC分泌试验的具体方法参照Miller etal.2008,J Immunol Methods 334(1-2):134-41。

将A549细胞(购自ATCC)培养在含有10％(w/w)胎牛血清F-12k培养基(购自Gibco)中，待其在T-175细胞培养瓶中扩大培养至75-90％汇合度时，弃去培养基，用PBS缓冲液洗涤1-2次，然后用胰蛋白酶溶液(Trypsin-EDTA，购自Life technology)消化并收集细胞。将收集到的细胞重悬与培养基中，计数后将细胞稀释至2×10⁶个细胞/mL，按照每孔细胞100μL加到96孔细胞培养板中(每孔2×10⁵个细胞)，将培养板置于37℃，5％(v/v)CO₂培养箱培养过夜。第二日，将梯度稀释的免疫原A与重组人TNFα(购自Peprotech)混合得混合物Ⅰ(其中，TNFα占混合物Ⅰ的终浓度为200ng/mL)。将过夜培养的细胞培养板弃去培养上清，加入上述混合物Ⅰ，将细胞培养板放在37℃、5％(v/v)CO₂培养箱培养过夜。20小时后，吸出板中的培养上清液，离心去除细胞，用TARC ELISA试剂盒(购自RnD systems)检定培养上清液中TARC的浓度。实验操作按照试剂盒说明书要求进行。

具体实验简述如下：将鼠抗人TARC抗体用PBS稀释至2μg/mL，然后按照100μL每孔加到96孔酶标板。4℃孵育过夜；第二天用洗板液[含有0.05％(w/w)Tween20的PBS缓冲液]洗板2次后，加入样品稀释液[含有1％(w/w)BSA的PBS缓冲液]300μL每孔室温封闭1小时；弃去封闭液，将标准品用样品稀释液稀释至500pg/mL，再倍比稀释六个点，用样品稀释液作为空白对照，同时将培养上清液用样品稀释液稀释8倍。按照每孔100μL将标准品和样品加入酶标板，室温孵育2小时。用洗板液洗板2-3次。将生物素标记的羊抗人TARC抗体用样品稀释液稀释至终浓度0.5ng/mL，按照每孔100微升加入酶标板。室温孵育2小时；将辣根过氧化物酶标记(HRP)的链霉亲和素用样品稀释液稀释至体积比为1:200后按照每孔100μL加入酶标板，室温孵育30分钟后，用洗板液洗板2-3次。加入TMB底物(购自湖州英创)每孔100μL，室温孵育15分钟后，每孔加入50μL终止液(1.0N HCl)。用ELISA读板机(SpectraMax M5e，购自Molecular Device)读取OD_450nm值，并以OD_540nm值作为背景计算光吸值，计算出培养上清液中的TARC浓度。部分实验结果见图1和表3。表3说明，免疫原A可以刺激A549细胞分泌胞胸腺活化调节趋化因子(TARC)，且免疫原A所具有的生物学活性与商业化蛋白的生物学活性基本一致。

表3 TARC分泌试验检验IL-13蛋白的生物学活性

其中，IL-13(Sino生物)指商业化的IL-13蛋白，购自Sino biological，作为阳性对照；IL-13(批次1)即为上述免疫原A。

实施例2

利用噬菌体技术获得先导抗体

1.免疫原A的生物素标记

将Biotin-X-X-NHS(购自SIGMA-ALDRICH)和实施例1制备的纯化的免疫原A按摩尔比3:1的比例混合，室温下振荡反应30分钟后，加入终浓度为50mM的NH₄Cl终止反应，得生物素标记的免疫原A。然后将生物素标记的免疫原A透析到PBS缓冲液(pH7.4)中，用Broadford试剂(购自Pierce)，以BSA作为标准品测定浓度(具体操作方法参见Bradford，1976，AnalBiochem 72:248-54)。实验结果见表4。利用标准品拟合曲线，生物素标记的免疫原A测定的OD_595nm值为0.49。经计算，生物素标记的免疫原A的浓度为0.319mg/mL。

表4生物素标记的免疫原A的浓度的测定

将生物素标记的免疫原A用0.22μm无菌滤膜过滤后无菌分装，再置于-80℃保存。

2.通过噬菌体文库筛选IL-13的抗体

(1)用链霉亲和素处理免疫管。将链霉亲和素(购自SIGMA-ALDRICH)用PBS缓冲液稀释至12.5μg/mL，以1mL每管加入到免疫管中，4℃孵育过夜。过夜后用PBS缓冲液清洗3次，得处理好的免疫管。

(2)在处理好的免疫管中加入步骤1.所得的生物素标记的免疫原A，室温振荡1小时后，用PBS缓冲液洗涤，再用封闭液[封闭液为含有2％(w/v)脱脂奶粉的PBS缓冲液]室温封闭2小时，得样品管。同时，在处理好的免疫管中加入噬菌体ScFv抗体库(滴度约10¹³pfu/ml，购自上海睿智化学研究有限公司；也可以参考文献McCafferty J et al.,Phageantibodies:flamentous phage displaying antibody variable domains,Nature,1990,348:552-54；Smith GP,Filamentous fusion phage:novel expression vectors thatdisplay cloned antigens on the virion surface,Science,1985,228:1315–1317；Scott J K et al.,Searching for peptide ligands with an epitope library,Science,1990,249:386.自行制备：由正常人抗体可变区基因克隆至phagemid载体，再在辅助噬菌体帮助下，由大肠杆菌包装成噬菌体)，室温振荡1小时后，用PBS缓冲液洗涤，再用封闭液室温封闭2小时，得已封闭的噬菌体ScFv抗体库。并且设置仅加入与样品管中封闭液等体积的封闭液的对照管。弃去样品管和对照管中的封闭液，加入已封闭的噬菌体ScFv抗体库，室温振荡2小时。用PBST[含有0.1％(v/v)Tween20的PBS缓冲液]洗涤5次，用PBS缓冲液洗涤5次，以除去未与生物素标记的免疫原A结合的噬菌体，再在每个样品管和每个对照管内分别加入1mL10μg/mL胰酶，于37℃孵育30分钟，以洗脱与生物素标记的免疫原A结合的噬菌体，得胰酶洗脱液。

(3)取1mL胰酶洗脱液加入到4mL处于对数生长期的大肠杆菌TG1(购自LUCIGEN)中，37℃孵育30分钟后，梯度稀释并涂布平板，将平板置于37℃培养过夜，计算与生物素标记的免疫原A结合的克隆数及对照管的克隆数，并分别挑选20-30个克隆进行测序，获得结合免疫原A的噬菌体克隆。

(4)将上述结合免疫原A的噬菌体克隆用新鲜2YT培养基(其中，新鲜2YT培养基的配制方法为：将10g酵母提取物、16g胰蛋白胨和5g NaCl加入1L水中，再用NaOH调pH至7.0，高压灭菌)洗涤、收集，并于37℃振荡培养至对数期。加入辅助噬菌体M13KO7(购自NEB，货号N0315S)，37℃静置30分钟，然后37℃振荡培养30分钟，4000rpm离心10分钟后收集细菌沉淀。将细菌沉淀用新鲜培养基重悬，30℃振荡培养4小时，4000rpm离心30分钟弃去沉淀，收集含有噬菌体的上清。在上清中加入1/4上清体积的含有5×PEG的NaCl溶液(2.5M NaCl)，放置冰上过夜，得处理后的上清A。次日，将处理后的上清A 4000rpm离心10分钟，除去残留的细胞、碎片等杂质，得处理后的噬菌体A，收集噬菌体A用于第二轮的选择。

重复以上步骤(3)～(4)三到四轮，从第三轮或第四轮选择得到的平板中挑选结合免疫原A的噬菌体克隆，用新鲜培养基培养至对数生长期。用ELISA筛选处理后的上清A中与免疫原A结合的噬菌体克隆，并将噬菌体克隆进行测序。将有较强结合能力(OD_450nm>1.0)且包含唯一的单链抗体序列的噬菌体克隆用受体配体阻滞试验进一步选择。即选择有较强结合能力(OD_450nm>1.0)、在受体配体结合阻滞实验中对人IL-13与hIL-13Ra/hIL-4R异源二聚体和/或人IL-13与hIL-13Ra2受体结合的阻滞率达到60％的噬菌体克隆作为阳性，再进行氨基酸序列的测定。选出氨基酸序列唯一的阳性克隆，根据之前测定的核苷酸序列和对应的氨基酸序列，制备全人源抗体(具体操作步骤及结果参见实施例5、6和7)。其中，受体配体结合阻滞实验的部分结果参见表5。表5中1:5等比例的含义是样品稀释度，如1:5即指将待测的样品(即含有免疫原A结合的噬菌体克隆的上清A)稀释至5倍于原体积的体积。表5的结果说明，克隆号为P4_4H12的先导抗体能够阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合，但是不能阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合，具有独特的特性。

表5 FACS检测噬菌体克隆阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合和阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合

实施例3

利用杂交瘤技术获得先导抗体

1.小鼠免疫

使用免疫原A免疫。采用的是6-8周龄的Balb/c，SJL/J小鼠(上海斯莱克提供)。小鼠接收后在Specific pathogen Free(SPF)条件下饲养。初次免疫剂量为每只小鼠50μg免疫原A。将蛋白用弗氏完全佐剂乳化后尾部皮下注射0.25mL。初次免疫2周后，加强免疫。免疫原A(每只小鼠25μg)用弗氏不完全佐剂乳化后腹腔注射0.25mL。以后每次加强免疫间隔3周。每次加强免疫一周后采集血清样品，用ELISA检测血清中抗体效价并用受体配体结合阻滞实验检测血清中抗体的活性。血清效价较高且可以更好阻滞免疫原A与受体结合的小鼠将优先选择用于细胞融合和杂交瘤细胞制备，剩余小鼠继续加强免疫备用。部分实验结果见图2和表6所示。表6说明，经免疫原A免疫的小鼠的血清对免疫原A均有不同程度的结合，呈现抗原抗体反应。其中，血清的最高稀释度(即稀释倍数)在十万左右。表6中空白对照指1％(w/w)BSA，批次TB2指第二次加强免疫后第七天的小鼠血清，表中的数据为OD_450nm值。

表6 ELISA检测免疫原A免疫后小鼠血清抗体效价

使用基因免疫。将将实施例1中构建的表达重组人IL-13蛋白的PCP表达载体包被到1.0μm金胶体子弹上，用Helios基因枪(Bio-rad)免疫。金胶体子弹制备和免疫程序根据Helios基因枪说明书进行制定。6-8周龄雌性SJL/J小鼠(上海斯莱克提供)接收后在SPF条件下饲养。所有小鼠经腹部用基因枪免疫3-4次，每次3-4枪，每枪1.0μg质粒。初次免疫与第一次加强免疫之间隔2周，以后每次加强免疫间隔3周。每次加强免疫7天后采集血清样品，用ELISA检测血清中抗体效价并用受体配体结合阻滞实验检测血清中抗体的活性。血清效价较高且可以更好阻滞重组人IL-13蛋白与受体结合的小鼠将优先选择用于细胞融合和杂交瘤细胞制备，剩余小鼠继续加强免疫备用。

2.杂交瘤细胞的制备和先导抗体筛选

通常大部分使用免疫原A免疫的小鼠经2-3次免疫后效价可达到1:1000以上，即可用于收集淋巴细胞进行细胞融合和杂交瘤制备。

细胞融合前，小鼠最后一次免疫用每只50-100μg免疫原A腹腔注射。3-5天后处死小鼠，收集脾细胞。加入NH₄OH至终浓度1％(w/w)以裂解脾细胞悬液中的红细胞，用DMEM基础培养基离心清洗细胞2-3次，然后按细胞数5:1的比率与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合(购自ATCC)，采用传统的PEG细胞融合方法或高效电融合方法进行细胞融合(参见METHODS INENZYMOLOGY,VOL.220)，得融合后的细胞，即为杂交瘤细胞。

将融合后的细胞稀释到含20％(w/w)胎牛血清、1×HAT的DMEM选择性培养基中，按1×10⁵/20μL每孔加入到96孔细胞培养板中，放入5％(v/v)CO₂、37℃培养箱中。10-14天后用ELISA筛选细胞融合板上清，将ELISA中OD_450nm>1.0的阳性克隆扩增到24孔板扩大培养，2-3天后对24孔板上清复检，包括利用ELISA检测上清中的抗体对免疫原A的结合活性、利用流式细胞技术检测上清中的抗体阻滞人IL-13与受体结合活性以及利用A549胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌试验检验上清中的抗体中和免疫原A的生物学活性。挑选ELISA实验中OD_450nm>1.0、受体配体结合阻滞实验中杂交瘤细胞培养上清对人IL-13与hIL-13Ra/hIL-4R异源二聚体和/或人IL-13与hIL-13Ra2受体结合的阻滞率达到60％，和/或A549胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌试验中杂交瘤上清中和人IL-13诱导TARC分泌，抑制率达到60％的杂交瘤细胞为符合条件的阳性克隆。

根据24孔板样品的筛选结果，选择符合条件的阳性克隆用有限稀释法在96孔板进行亚克隆，即在含10％(w/w)FBS的DMEM培养基中(购自invitrogen)37℃，5％(v/v)CO₂的条件下培养上述阳性克隆。亚克隆后7-10天用ELISA进行初步筛选，挑选3-4个阳性单克隆扩增到24孔板继续培养。2-3天后对上清按照亚克隆之间的检验方法进行复检，包括ELISA，受体配体结合阻滞实验，胸腺活化调节趋化因子分泌试验。根据24孔板样品检测结果，挑选最优亚克隆进行扩大培养、液氮冻存、抗体生产和纯化，作为先导抗体。这些先导抗体的克隆号分别为29D9H8、28A2E11、35E2C3、70F10A10和35H6E1。

实施例4

小鼠杂交瘤细胞单克隆抗体的生产和纯化

将实施例3制备的杂交瘤细胞扩增到T-75细胞培养瓶并用生产培养基(Hybridomaserum free medium，购自Invitrogen)驯化传代2-3代。待杂交瘤细胞生长状态良好，接种细胞培养转瓶。每个2升的培养转瓶中加入200-500mL生产培养基，接种细胞密度为0.5-1.0×10⁵个/mL。盖紧瓶盖，将转瓶置于37℃培养箱中的转瓶机上，调到转速3转/分钟。连续旋转培养10-14天后，收集细胞培养液，离心或过滤去除细胞，并用0.22-0.45μm的滤膜过滤。处理后的细胞培养上清可马上进行纯化或-30℃冻存。

杂交瘤细胞培养上清中的单克隆抗体可用蛋白G亲和层析(Protein G，蛋白G柱)柱进行纯化。根据样品量的大小，准备相应的体积的层析柱。对于200-300mL的小体积纯化，需要1-2mL的蛋白G柱。蛋白G柱先用平衡缓冲液(PBS缓冲液，pH7.4)平衡，然后将培养上清上样至蛋白G柱，控制流速在3-4mL/分钟。上样完毕，用平衡缓冲液清洗层析柱3-5柱床体积。用洗脱液(0.1M甘氨盐酸缓冲液，pH2.5)洗脱结合在柱上的抗体，用紫外检测器监测洗脱情况。收集洗脱的抗体(根据A280紫外吸收峰)，加入10％(v/v)的1.0M Tris-HCl缓冲液中和pH，然后立即用PBS缓冲液透析过夜，第二天换液一次，并继续透析2-3小时。收集透析后的抗体，用0.22μm的滤器进行无菌过滤，即得IL-13单克隆抗体，将其无菌保存。分装小样进行蛋白浓度、纯度、内毒等检测分析。检测发现，IL-13单克隆抗体的内毒素浓度小于3.0EU/mg。它们的部分检测分析结果参见表7。

表7抗体检测分析

实施例5

先导抗体的检定

将实施例2和实施例3分别用噬菌体技术和杂交瘤技术获得的先导抗体分别进行如下的检定试验。

A、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测先导抗体与免疫原A、IL-13R130Q变体、猴IL-13以及鼠IL-13的结合

将链霉亲和素用PBS稀释到终浓度1.0μg/mL，然后按照100微升每孔加到96孔酶标板。4℃孵育过夜；第二天用洗板液[含有0.05％(w/w)Tween20的PBS缓冲液]洗板2次，加入封闭液[含有0.05％(w/w)Tween20和2％(w/w)BSA的PBS缓冲液]37℃封闭1-2小时。弃去封闭液，将实施例2制备的生物素标记的免疫原A、IL-13R130Q变体(实施例1制备)、猴IL-13(购自sino biological)和鼠IL-13(购自sino biological)分别用样品稀释液[含有0.05％(w/w)Tween20和0.2％(w/w)BSA的PBS缓冲液]稀释至0.5μg/mL，按照每孔50-100μL加入酶标板，37℃孵育1小时。用洗板液[含有0.01％(w/w)Tween20的PBS缓冲液]洗板2-3次。分别加入梯度稀释的实施例2和实施例3制备的先导抗体每孔50-100μL，37℃孵育1小时后，用洗板液洗板2-3次。加入辣根过氧化物酶标记(HRP)的人或小鼠IgG二抗(购自Sigma)，37℃孵育1小时后，再用洗板液[含有0.05％(w/w)Tween20的PBS缓冲液]洗板2-3次。加入100μL/孔TMB底物，室温孵育15分钟后，每孔加入50μL 1.0N HCl终止。用ELISA读板机(SpectraMax M5e，购自Molecular Device)读取OD_450nm值。部分实验结果见图3、5～6和表8～10所示。表8～10说明，先导抗体与重组人IL-13蛋白，重组人IL-13R130Q变体，重组猴IL-13在ELISA水平结合。但与小鼠IL-13没有结合。其中IgG对照为鼠IgG，表中的数据为OD_450nm值。

表8 ELISA检测先导抗体与免疫原A的反应活性

表9 ELISA检测先导抗体与猴IL-13变体的反应活性

表10 ELISA检测先导抗体与鼠IL-13变体的反应活性

B、受体配体结合阻滞实验

1.稳定表达细胞株的构建：

将人IL-13Ra1、人IL-13Ra2和人IL-4Ra全长基因的核苷酸序列(如序列表SEQ IDNo.63～65所示)分别克隆到pIRES表达载体上，并包装成慢病毒(pIRES表达载体和慢病毒均购自上海吉玛制药技术有限公司，并按照说明书进行操作)。同时使用包含人IL-13Ra1和人IL-4Ra基因的慢病毒感染HEK293细胞，感染后将细胞在含100μg/mL Hygromycin B(购自MILLIPORE)和0.25μg/mL Puromycin(购自Invitrogen)中的一种或两种和10％(w/w)胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5％(v/v)CO₂下选择培养2周。2周后用有限稀释法将感染后的细胞亚克隆到96孔培养板中。待克隆长大后，将单克隆孔细胞扩增到6孔板中或培养瓶中，得过表达全长人IL-13Ra1的HEK293细胞株和人IL-4Ra的HEK293细胞株。对扩增后的克隆用抗每种受体对应的特异性抗体(hIL-13Ra1抗体、hIL-4Ra抗体、hIL-13Ra2抗体均购自RnDsystems)经流式细胞分析法检测受体表达水平，及与配体IL-13蛋白的结合能力。选择长势较好、表达水平较高、结合强的单克隆的细胞系继续扩大培养并液氮冻存。用包含人IL-13Ra2基因的慢病毒颗粒感染HEK293细胞，按照同样的方法筛选选择长势较好、表达水平较高、结合强的单克隆的细胞系扩大培养并于液氮中保存，得过表达全长人IL-13Ra2的HEK293细胞株。部分实验结果见图7～9和表11～13。表11～13的结果说明，HEK293细胞克隆4C1表面同时表达hIL-13Ra1和hIL-4Ra两个受体，HEK293细胞克隆1A1表达hIL-13Ra2受体，且细胞表面受体表达量均较高，可以用作后续试验使用。

表11流式细胞分析方法检测过表达全长人IL-13Ra1的HEK293细胞株中hIL-13Ra1蛋白的表达水平

表12流式细胞分析方法检测过表达全长人IL-4Ra的HEK293细胞株中hIL-4Ra蛋白的表达水平

表13流式细胞分析方法检测过表达全长人IL-13Ra2的HEK293细胞株中hIL-13Ra2蛋白的表达水平

2.利用流式细胞技术的受体配体结合阻滞实验

将实施例5实验B中步骤1.所得的过表达全长人IL-13Ra1和人IL-4Ra的HEK293细胞株克隆4C1和过表达全长人IL-13Ra2的HEK293细胞株克隆1A1在T-175细胞培养瓶中扩大培养至75-90％汇合度弃去培养基。其中，扩大培养的培养基为含100μg/mL Hygromycin B(购自MILLIPORE)和0.25μg/mL Puromycin(购自Invitrogen)中的一种或两种和10％(w/w)胎牛血清的DMEM培养基。扩大培养的条件为37℃、5％(v/v)CO₂下培养。用PBS缓冲液洗涤1-2次，然后用重组酶细胞解离液(TrypLE，购自Life technology)消化并收集细胞；用PBS缓冲液洗涤细胞1-2次，进行细胞计数后将细胞用封闭液[含有2％(w/w)胎牛血清的PBS缓冲液]稀释至1-2×10⁶个细胞/mL，冰上孵育20-30分钟，然后用封闭液[含有2％(w/w)胎牛血清的PBS缓冲液]洗涤2次。将收集的细胞用封闭液悬浮至1×10⁶个细胞/mL，按每孔100μL加入到96孔FACS反应板中(即每孔1×10⁵个细胞)。

将梯度稀释的实施例2和实施例3制备的先导抗体(以下统称“先导抗体”)与实施例2制备的生物素标记的免疫原A混合后，按照每孔100μL加入细胞中，冰上孵育1-2小时。其中，对实施例5试验B步骤1.所得的过表达全长人IL-13Ra1和人IL-4Ra的HEK293细胞株，加入梯度稀释的先导抗体和终浓度为30ng/mL的生物素标记的免疫原A；对过表达全长人IL-13Ra2的HEK293细胞株，加入梯度稀释的先导抗体和终浓度为20ng/mL的生物素标记的免疫原A。用封闭液离心洗涤2次，加入每孔100μL荧光(Alexa488)标记的链霉亲和素(购自Lifetechnology，货号S11223)，冰上孵育0.5-1.0小时。用封闭液离心洗涤2-3次，加入每孔100μL PBS缓冲液悬浮细胞，用FACS(FACS Verse，购自BD)检测和分析结果。部分实验结果见图10～11和表14～15，表14～15说明，IL-13抗体与人IL-13结合后，能阻滞人IL-13与细胞表面的受体人IL-13Ra1/hIL-4Ra异源二聚体的结合，或者能阻滞IL-13与细胞表面人IL-13Ra2受体的结合。其中IgG对照为鼠IgG，表格中数据为平均荧光强度。

表14 FACS检测检测先导抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合

表15 FACS检测检测先导抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合

C、胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌试验

将A549细胞(购自ATCC)培养在含有10％(w/w)胎牛血清F-12k培养基(购自Gibco)中于37℃、5％(v/v)CO₂培养，待其在T-175细胞培养瓶中扩大培养至75-90％汇合度时，弃去培养基，用PBS缓冲液洗涤1-2次，然后用胰蛋白酶溶液(Trypsin-EDTA，购自Lifetechnology)消化并收集细胞。将收集到的细胞重悬于培养基中，计数后将细胞稀释至2×10⁶个细胞/mL，按照每孔细胞100μL加到96孔细胞培养板中(每孔2×10⁵个细胞)，将培养板置于37℃、5％(v/v)CO₂培养箱培养过夜。第二日，将梯度稀释的实施例2和实施例3制备的先导抗体与实施例1制备的免疫原A混合得混合物A；将重组人TNFα(购自Peprotech)用含有10％(w/w)胎牛血清F-12k培养基等体积混合得混合物B于培养基中。其中，混合后的重组人TNFα在混合物B的终浓度为200ng/mL。弃去培养过夜的细胞培养板的培养上清后，向该细胞培养板中按照1:1体积比例加入上述混合物A和混合物B。其中，免疫原A占混合物A与混合物B的总体积的终浓度为5ng/mL，重组人TNFα占混合物A和混合物B的总体积的终浓度为200ng/mL。将细胞培养板放在37℃、5％(v/v)CO₂培养箱培养过夜。20小时后，吸出板中的培养上清液，离心去除细胞，用TARC ELISA试剂盒(购自RnD systems)检定培养上清液中TARC的浓度。实验操作按照试剂盒说明书要求进行(详见实施例1)。部分实验结果见图12和表16。表16说明，先导抗体通过与人IL-13的结合，能够中和由IL-13和TNFα共同刺激条件下诱导产生的549细胞分泌TARC。表16的数据为培养上清中TARC的浓度(pg/ml)，其中IgG对照为鼠IgG。

表16先导抗体中和IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子分泌

实施例6

轻重链可变区氨基酸序列测定

总RNA分离：将实施例3制得的先导抗体所对应的杂交瘤细胞复苏，培养，离心收集1-5×10⁷个细胞，加入1mL Trizol混匀并转移到1.5mL离心管中，室温静置5分钟。加0.2mL氯仿，振荡15秒，静置2分钟后于4℃，12000g离心5分钟，取上清转移到新的1.5mL离心管中。加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟后于4℃，12000g离心15分钟，弃上清。加入1mL 75％(v/v)乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，12000g离心5分钟后弃上清，将沉淀物晾干，加入DEPC处理过的H₂O溶解(55℃水浴促溶10分钟)，即得总RNA。

逆转录与PCR：取1μg总RNA，配置20μL体系，加入逆转录酶后于42℃反应60分钟，于7℃反应10分钟终止反应。配置50μL PCR体系，包括1μL cDNA、每种引物25pmol、1μL DNA聚合酶以及相配的缓冲体系、250μmol dNTPs。设置PCR程序，预变性95℃3分钟，变性95℃30秒，退火55℃30秒，延伸72℃35秒，35个循环后再额外于72℃延伸5分钟，得PCR产物。其中逆转录所用的试剂盒为PrimeScript RT Master Mix，购自Takara，货号RR036；PCR所用的试剂盒为Q5超保真酶，购自NEB，货号M0492。

克隆与测序：取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将检测阳性样品使用柱回收试剂盒纯化，其中回收试剂盒为Gel&PCR Clean-up，购自MACHEREY-NAGEL，货号740609。进行连接反应：样品50ng，T载体50ng，连接酶0.5μL，缓冲液1μL，反应体系10μL，于16℃反应半小时得连接产物，其中连接的试剂盒为T4DNA连接酶，购自NEB，货号M0402；取5μL连接产物加入100μL的感受态细胞(Ecos 101competent cells，购自Yeastern，货号FYE607)中，冰浴5分钟。而后于42℃水浴热激1分钟，放回冰上1分钟后加入650μL无抗生素SOC培养基，于37℃摇床上以200RPM的速度复苏30分钟，取出200μL涂布于含抗生素的LB固体培养基上于37℃孵箱过夜培养。次日，使用T载体上引物M13F和M13R配置30μL PCR体系，进行菌落PCR，用移液器枪头蘸取菌落于PCR反应体系中吹吸，并吸出0.5μL点于另一块含100nM氨苄青霉素的LB固体培养皿上以保存菌株。PCR反应结束后，取出5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性样品进行测序。其中，测序的步骤参见Kabat，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)。

测序的结果如表17～18所示。表17～18还包括了实施例2所得的克隆号为P4_4H12的IL-13抗体的测序结果。

表17 IL-13抗体氨基酸序列编号

其中，表17中的数字即为序列表“SEQ ID No.”编号，如P4_4H12的重链蛋白可变区的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.1，而P4_4H12的重链蛋白可变区中CDR1域的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。

表18 IL-13抗体核苷酸序列编号

克隆号	重链蛋白可变区	轻链蛋白可变区
			P4_4H12	49	50
29D9H8	51	52
			28A2E11	53	54
35E2C3	55	56
			70F10A10	57	58
35H6E1	59	60

其中，表18中的数字即为序列表“SEQ ID No.”编号，如编码P4_4H12的重链蛋白可变区的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.49，而编码P4_4H12的轻链蛋白可变区的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.50。

编码35H6E1的轻链蛋白可变区中CDR3域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.60中的第265位至第291位。

实施例7

小鼠-人嵌合IL-13抗体或全人源IL-13抗体的制备

实施例2已从噬菌体文库中得到了阳性克隆、实施例3已从杂交瘤细胞的培养上清液中获得了纯化的IL-13抗体(先导抗体)。其中，按照本实施例记载的步骤进行操作，能够从实施例3所得的先导抗体制备出小鼠-人嵌合IL-13抗体；而从实施例2所得的阳性克隆制备出全人源IL-13抗体。

1、质粒构建与准备：

根据实施例6的测序结果明确了IL-13抗体重链可变区和轻链可变区序列。将实施例2和实施例3所得的先导抗体的重链可变区序列重组到包含信号肽和人源重链抗体IgG1恒定区的表达载体(其中表达载体购买自Invitrogen，重组步骤也由上海睿智化学完成)中，将IL-13抗体的轻链可变区序列重组到包含信号肽和人源抗体轻链kappa恒定区的表达载体(其中表达载体购买自Invitrogen，重组步骤也由上海睿智化学完成)当中，得重组质粒(上述质粒重组的实验原理及步骤的出处见《分子克隆实验指南(第三版)》，(美)J.萨姆布鲁克等著)并经测序验证(测序方法与实施例6中测序方法相同)。使用碱裂解法试剂盒(购自MACHEREY-NAGEL)中量抽提高纯度的重组质粒，质量为500μg以上，经0.22μm滤膜(购自Millopore)过滤，供转染使用。

2、细胞转染：

在培养基Freestyle 293expression medium(购自Invitrogen)培养293E细胞(购自Invitrogen)。摇床设置为37℃、130RPM和8％CO₂(v/v)。Freestyle 293expressionmedium在转染时添加10％(v/v)F68(购自Invitrogen)至F68终浓度为0.1％(v/v)，得含0.1％(v/v)F68的Freestyle 293表达培养基，即培养基A。取5mL培养基A和200μg/mL PEI(购自Sigma)混匀，得培养基B。取5mL培养基A和100μg/mL步骤(1)所得的重组质粒(即重链重组质粒和轻链重组质粒按常规等比例混合的混合重组质粒)混匀，得培养基C。5分钟后将培养基B和培养基C合并混匀，静置15分钟，得混合液D。将10mL混合液D缓缓加入100mL含293E细胞的培养基Freestyle 293expression medium中至293E的细胞密度为1.5×10⁶个/mL，边加边振荡，避免PEI过度集中，放入摇床培养。第二天加入蛋白胨至终浓度为0.5％(w/v)。第5～7天，测培养液抗体效价。第6～7天，离心(3500RPM，30分钟)收集上清，经0.22μm滤膜过滤，得滤好的细胞上清液，以供纯化。

3、抗体纯化：

对于连续生产的无内毒素的层析柱和Protein A填料(购自GE)，使用5个柱体积的0.5M NaOH冲洗。然后用5个柱体积的PBS(PBS缓冲液，pH7.4)进行平衡至中性后，将步骤(2)所得过滤好的细胞上清液上柱，必要时收集流穿液。上柱完成后，使用5倍柱体积的PBS清洗。用5倍柱体积的0.1M pH 3.0的Glycine-HCl进行洗脱，收集洗脱液，并立刻在洗脱液中加入0.1倍体积的pH 8.5的1M Tris-HCl(1.5M NaCl)中和IL-13抗体。上述所用溶液均需要新配置。收获IL-13抗体后，在1╳PBS中透析4小时，避免内毒素污染。透析结束后，使用分光光度或试剂盒测定浓度，使用HPLC-SEC测定抗体纯度，使用内毒素检测试剂盒(购自Lonza)检测抗体内毒素含量。并对所获IL-13抗体进行特性鉴定。用P4_4H12、29D9H8、28A2E11、35E2C3、70F10A10和35H6E1先导抗体分别制得全人源抗体hP4_4H12和嵌合抗体c29D9H8、c28A2E11、c35E2C3、c70F10A10和c35H6E1，克隆号前端字母h(human)表示全人源抗体，c(chimera)表示小鼠-人嵌合抗体(以下简称嵌合抗体)。

实施例8

嵌合抗体和全人源抗体的检定

将实施例7获得的小鼠-人嵌合IL-13抗体或全人源IL-13抗体分别进行如下的检定试验(操作步骤同实施例5)。

A、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体与免疫原A、IL-13R130Q变体以及猴IL-13的结合

具体操作步骤同实施例5试验A。部分实验结果见图3～5和表19～21所示。表19～21说明，上述抗体与重组人IL-13蛋白，重组人IL-13R130Q变体，重组猴IL-13在ELISA水平结合。其中IgG对照为鼠IgG，表中的数据为OD_450nm值。

表19-1 ELISA检测嵌合抗体与免疫原A的反应活性

表19-2 ELISA检测全人源抗体与免疫原A的反应活性

表20 ELISA检测嵌合抗体与IL-13R130Q变体的反应活性

表21 ELISA检测嵌合抗体与猴IL-13变体的反应活性

B、受体配体结合阻滞实验

具体试验步骤请参见实施例5试验B部分。部分实验结果见图10～11和表22～23，表22～23说明，IL-13全人源抗体和嵌合抗体与人IL-13结合后，能阻滞人IL-13与细胞表面的受体人IL-13Ra1/hIL-4Ra异源二聚体的结合，或者能阻滞IL-13与细胞表面人IL-13Ra2受体的结合。其中IgG对照为鼠IgG，表格中数据为平均荧光强度。

表22-1 FACS检测检测嵌合抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合

表22-2 FACS检测检测全人源抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合

表23-1 FACS检测检测嵌合抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合

表23-2 FACS检测检测全人源抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合

C、胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌试验

具体操作步骤请参见实施例C试验部分。部分实验结果见图12和表24。表24说明，嵌合抗体和全人源抗体通过与人IL-13的结合，能够中和由IL-13和TNFα共同刺激条件下诱导产生的549细胞分泌TARC。表24的数据为培养上清中TARC的浓度(pg/ml)，其中IgG对照为鼠IgG。

表24-1 嵌合抗体中和IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子分泌

表24-2 全人源抗体中和IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子分泌

D、骨膜蛋白(periostin)分泌试验

将MRC5细胞(购自ATCC)培养在含有10％(w/w)胎牛血清EMEM培养基(购自Gibco)中，于37℃、5％(v/v)CO₂条件下培养。待其在T-175细胞培养瓶中扩大培养至75-90％汇合度，弃去培养基，用PBS缓冲液洗涤1-2次，然后用胰蛋白酶溶液(Trypsin-EDTA，购自Lifetechnology)消化并收集细胞。计数后将细胞用培养液稀释至1×10⁵个细胞/mL，按照每孔细胞100μL加到96孔细胞培养板中(每孔1×10⁴个细胞)，将培养板置于37℃、5％(v/v)CO₂培养箱培养过夜；第二天，弃去培养上清，将梯度稀释的实施例7制备的嵌合抗体与实施例1制备的免疫原A混合得混合物C(免疫原A在混合物C中的终浓度为5ng/mL)，加入混合物C于培养板中，将细胞培养板放在37℃、5％(v/v)CO₂培养箱培养过夜。20小时后，用骨膜蛋白ELISA试剂盒(购自RnD systems)检定上清中骨膜蛋白的浓度。实验操作按照试剂盒说明书要求进行。部分实验结果见图13和表25。表25说明，嵌合抗体与人IL-13结合，能够中和由人IL-13诱导下MRC5细胞分泌骨膜蛋白。表25中数据为培养上清中骨膜蛋白的浓度(pg/ml)，IgG对照为鼠IgG。

表25嵌合抗体中和IL-13诱导的骨膜蛋白分泌

E、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)表达实验

将人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)(购自AllCells)培养在HUVEC完全培养基中，置于37℃、5％(v/v)CO₂条件下培养。待其在T-175扩大培养至75-90％汇合度，弃去培养基，用PBS缓冲液洗涤1-2次，然后用胰蛋白酶溶液(Trypsin-EDTA，购自Life technology)消化并收集细胞。计数后将细胞用培养液稀释至1.5×10⁵个细胞/mL，按照每孔HUVEC细胞3000个细胞(20μL)加到384孔细胞培养板中；将梯度稀释的实施例7制备的抗体与实施例1制备的免疫原A以及重组人TNFα按体积比1:1:2混合得混合物D。将混合物D按照每孔20μL的添加量添加到培养板中得混合物D’，使混合物D与培养板中HUVEC细胞的体积比为1:1。此时重组人TNFα占混合物D’的终浓度为25ng/mL，免疫原A占混合物D’的终浓度为0.5ng/mL)。

将细胞培养板放在37℃、5％(v/v)CO₂培养箱培养过夜。20小时后，弃去培养液上清，将鼠抗人VCAM-1(CD106)抗体(购自Biolegend)用培养基稀释至终浓度为2μg/mL，按照每孔20μL加入培养板中，冰上孵育2小时。用FACS缓冲液[含有2％(w/w)BSA的PBS缓冲液]洗涤3次，加入每孔20μL荧光(Alexa 488)标记的驴抗鼠二抗(购自invitrogen)，冰上孵育0.5-1.0小时。再加入每孔20μL固定液[4％(w/w)多聚甲醛]，5-10分钟后用PBS缓冲液洗涤3次。用PBS缓冲液将PI(购自invitrogen)和RNAseA(购自Qiagen)稀释至PI和RNAseA的终浓度分别为9nM和200ng/mL，按照每孔20μL加入384孔板中，在37℃孵育30分钟后，用Acumen(微孔板细胞检测法)检验并分析细胞表面上血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)的表达水平。部分实验结果见图14和表26。表26说明，嵌合抗体与人IL-13结合，能够中和由人IL-13和TNFα共同刺激条件下诱导产生的HUVEC细胞表面表达血管粘附因子-1。表26中数据为平均荧光强度；IgG对照为鼠IgG；TNFα为单独用TNFα刺激，而无IL-13情况下的背景值。

表26嵌合抗体中和IL-13诱导的血管细胞粘附分子-1表达

实施例9

IL-13抗体抑制人IL-13诱导的小鼠呼吸炎症实验

雌性Balb/c小鼠(8-12周龄，购自上海灵畅生物科技有限公司)接收后在SPF级饲养，适应1周后，开始实验。小鼠在第一天及第三天腹腔注射实施例7制备的嵌合抗体，克隆号分别为c29D9H8、c28A2E11和c35E2C3，每只动物200μL(3mg抗体每公斤体重)。第二天及第四天用实施例1制备的免疫原A进行刺激诱导，剂量为1mg/mL，每只动物给予气道喷雾25μL。第五天将所有动物用FinePointe全身体积描记系统(即DSIFinePointe WBP系统，购自DSI)进行肺功能检测。动物在清醒无约束状态下通过雾化给药方式给予甲基乙酰胆碱，同时通过仪器自带软件记录气道缩窄指数Penh(增强呼气间歇)。(检测的具体操作步骤按照仪器的说明手册中记载的方法进行)

部分实验结果见图15和表27。表27说明，小鼠在人IL-13，或者说免疫原A的刺激之下会诱发气道的高反应性，使其对甲基乙酰胆碱的刺激更为敏感，使penh读数增大。嵌合抗体会与人IL-13结合，并中和由人IL-13诱导产生的气道高反应性。表中数据为气道缩窄指数Penh，代表气道高反应性；IgG对照为人IgG。

表27抑制人IL-13诱导的小鼠呼吸炎症实验

实施例10

抗体亲和力检测试验

用氨基偶联方法将抗人Fc IgG(购自Geneway)偶联固定在CM5芯片(购自GE)表面至6000-10000RU，FC1作为参比通道。偶联固定过程如下：用新鲜配置的摩尔比为1:1的50mMN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和200mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的混合物活化芯片7分钟。然后注入10-50μg/mL稀释在10mM醋酸纳缓冲液(pH5.0)中的抗人FcIgG。剩余的活化位点用1M乙醇胺封闭。然后，用含HBS-EP缓冲液将实施例7制备的嵌合抗体稀释至5μg/mL(可根据捕获水平适当调整)。以10μL/分钟的流速捕获到芯片上，得到大约100～300RU的响应值。接着将实施例1制备的纯化的免疫原A稀释至100nM(即最高浓度暂定100nM)，以30μL/分钟的流速流经芯片表面。若得到足够的信号值，就将实施例1制备的纯化的免疫原A倍比稀释几个浓度梯度，分别流经芯片表面。在每个循环结束后，芯片表面用10mM，pH 1.5的甘氨酸进行再生。动力学速率常数需减去空白对照，用global fit分析方法1：1结合模型进行数据拟合(参照Biacore操作手册进行操作)。解离平衡速率常数(KD)用以下公式计算：KD＝kd/ka，其中，Kd为解离常数，Ka为结合常数。部分实验结果见图16和表28。表28说明，实施例7制备的嵌合抗体与人IL-13的亲和力KD<9×10^-8M。

表28嵌合抗体与人IL-13亲和力检测结果

克隆号	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
				c29D9H8	2.51×10⁷	8.13×10^-4	3.24×10^-11
c28A2E11	5.49×10⁵	4.38×10^-3	7.98×10^-9
				c35E2C3	3.00×10⁵	2.60×10^-4	8.63×10^-10
c70F10A10	2.67×10⁵	2.71×10^-4	1.02×10^-9
				c35H6E1	1.33×10⁶	4.45×10^-4	3.36×10^-10

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海开拓者生物医药有限公司

<120> 一种IL-13抗体及其制备方法和应用

<130> P1710432C

<150> CN201610333020.X

<151> 2016-05-18

<150> CN201610474103.0

<151> 2016-06-24

<160> 65

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P4_4H12重链可变区

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Asp Pro Val Gly Tyr Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P4_4H12重链CDR1

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Ser Tyr Ala Met His

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P4_4H12重链CDR2

<400> 3

Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

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<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P4_4H12重链CDR3

<400> 4

Asp Pro Val Gly Tyr Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Tyr Tyr Gly Met

1 5 10 15

Asp Val

<210> 5

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P4_4H12轻链可变区

<400> 5

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Tyr

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Thr Thr Phe Gly Leu Gly Thr Lys Val Val Ile Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P4_4H12轻链CDR2

<400> 7

Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P4_4H12轻链CDR3

<400> 8

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Thr Thr

1 5

<210> 9

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 29D9H8重链可变区

<400> 9

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

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Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Gly Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Ser Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

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Thr Ser Gly Asp Tyr Phe Gly Gly Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 29D9H8重链CDR1

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Asp Tyr Glu Met His

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 29D9H8重链CDR2

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Gly Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Ser Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 29D9H8重链CDR3

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<210> 13

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 29D9H8轻链可变区

<400> 13

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Asp Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 29D9H8轻链CDR1

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Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 29D9H8轻链CDR2

<400> 15

Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 29D9H8轻链CDR3

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Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28A2E11重链可变区

<400> 17

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Thr Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

His Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Phe Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Tyr Asp Tyr Tyr Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

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<212> PRT

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe His

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Asp

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<213> 人工序列

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<220>

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<400> 21

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1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ile Asn

85 90 95

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<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28A2E11轻链CDR2

<400> 23

Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro

1 5

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 28A2E11轻链CDR3

<400> 24

Ala Leu Trp Tyr Ile Asn His Phe Ile

1 5

<210> 25

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 35E2C3重链可变区

<400> 25

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Ala Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Gln Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Leu Lys Ser Ala Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Leu Ala Lys Trp Thr Trp Tyr Phe Asp Ile Trp Gly Thr Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Ser Asp Tyr Trp Asn

1 5

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<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 35E2C3重链CDR2

<400> 27

Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

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<210> 28

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 35E2C3重链CDR3

<400> 28

Leu Ala Lys Trp Thr Trp Tyr Phe Asp Ile

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<210> 29

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 35E2C3轻链可变区

<400> 29

Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Leu Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Asp Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 35E2C3轻链CDR1

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 35E2C3轻链CDR2

<400> 31

Lys Ala Ser Asp Leu His Thr

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 35E2C3轻链CDR3

<400> 32

Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

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<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 70F10A10重链可变区

<400> 33

Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Asp Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ser Ser Phe Thr Thr Leu Val Pro Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

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<210> 34

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 34

Ser Tyr Gly Ile Ser

1 5

<210> 35

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 70F10A10重链CDR2

<400> 35

Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

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<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 70F10A10重链CDR3

<400> 36

Phe Thr Thr Leu Val Pro Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr

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<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 70F10A10轻链可变区

<400> 37

Asp Ile Met Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Ser Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Met Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Thr Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Met Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln

85 90 95

Tyr Phe Thr Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Val

100 105 110

Lys

<210> 38

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 70F10A10轻链CDR1

<400> 38

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 39

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 70F10A10轻链CDR2

<400> 39

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Thr

1 5

<210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 70F10A10轻链CDR3

<400> 40

His Gln Tyr Phe Thr Tyr Pro Arg Thr

1 5

<210> 41

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 35H6E1重链可变区

<400> 41

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Asn Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Glu Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Thr Asn Tyr Phe Ser Thr Arg Asp Tyr Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 42

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 35H6E1重链CDR1

<400> 42

Thr Ser Asn Met Gly Val Ser

1 5

<210> 43

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 35H6E1重链CDR2

<400> 43

His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser

1 5 10 15

<210> 44

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 35H6E1重链CDR3

<400> 44

Arg Thr Asn Tyr Phe Ser Thr Arg Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 45

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 35H6E1轻链可变区

<400> 45

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn

20 25 30

Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Lys Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Phe Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 46

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 35H6E1轻链CDR1

<400> 46

Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Val

1 5 10

<210> 47

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 35H6E1轻链CDR2

<400> 47

Ala Ala Thr Lys Leu Ala Asp

1 5

<210> 48

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 35H6E1轻链CDR3

<400> 48

Gln His Phe Trp Gly Phe Pro Trp Thr

1 5

<210> 49

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P4_4H12重链可变区

<400> 49

gaggtgcagc tggtggagac cgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagcaa taaatactac 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatccg 300

gtaggatatt gtagtggtgg tagctgctac tactacggta tggacgtctg gggccaaggg 360

accacggtca ccgtctcctc a 381

<210> 50

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P4_4H12轻链可变区

<400> 50

gaaattgtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120

cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca acagggccac tggcataccg 180

gacaggttct atggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag caggctggag 240

cctgaggatt ttgcagtgta ttattgtcag caatatggta gctcacctac gacgttcggc 300

ctagggacca aggtggtaat caaa 324

<210> 51

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 29D9H8重链可变区

<400> 51

caggttcaac tacagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg 60

tcctgcaagg cttcgggcta cacatttact gactatgaaa tgcactgggt gaagcagaca 120

cctgtgcatg gcctggaatg gattggaggt attgatcctg aaactggtgg cactgcctcc 180

aatcagaagt tcaagggcaa ggccatactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtac aagtggggat 300

tacttcggtg gtggcccttt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360

<210> 52

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 29D9H8轻链可变区

<400> 52

gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60

atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agctatttaa gctggttcca gcagaaacca 120

gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggattat 240

gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaataaa a 321

<210> 53

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 28A2E11重链可变区

<400> 53

gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc cgggggcctc agtcaagttg 60

tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gactactata tgcactgggt gaagcagagg 120

actgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg aggatggtga aactaaatat 180

gccccgaaat tccacgacaa ggccacttta acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240

ctgcagttca gcagcctggc atctgaggac actgccgtct attactgtac tagatacgat 300

tactacggtc cttttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354

<210> 54

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 28A2E11轻链可变区

<400> 54

caagctgttg tgactcagga atctgtactc accacatcac ctggtgaaac agtcacactc 60

acttgtcgct caagtactgg ggctgttaca actagtaact atgccaactg ggtccaagaa 120

aaaccagatc atttattcac tggtctaata ggtggtacca acaaccgagc tccaggtgtt 180

cctgccagat tctcaggctc cctgattgga gacaaggctg ccctcaccat cacaggggca 240

cagactgagg atgaggcaat atatttctgt gctctatggt acatcaacca ttttattttc 300

ggcagtggaa ccaaggtcac tgtccta 327

<210> 55

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 35E2C3重链可变区

<400> 55

gaggtgcagc ttcaggagtc aggacctggc ctggcaaaac cttctcagac tctgtccctc 60

acctgttctg tcactggcta ctccatcacc agtgattact ggaactggat ccggaagttc 120

ccagggaata aacttgagta catggggtat ataagttaca atggtaacac ttactacaat 180

ccatctctca aaagtcaaat ctccataact cgagacactt ccaagaacca actttacctg 240

cagttgaaat ctgcgacgac tgaggacaca gccacatatt actgtgcaag acttgctaag 300

tggacctggt acttcgatat ctggggcaca gggaccacgg tcaccgtctc ctca 354

<210> 56

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 35E2C3轻链可变区

<400> 56

gacatccaga tgaaccagtc tccatccagt ctgtctgcat cccttggaga cacaattacc 60

attacttgcc atgccagtca gaacattaat gtttggttaa gctggtacca gcagaaacca 120

ggaagtcttc ctaagctatt gatctataag gcttccgact tgcacacagg cgtcccatca 180

aggtttagtg gcagtggatc tggaacaggt ttcacattaa ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagacattg ccacttacta ctgtcaacag ggtcaaagtt atccatacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaataaa a 321

<210> 57

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 70F10A10重链可变区

<400> 57

cagatccagc tgcagcagtc tggagctgaa ctggcgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60

tcctgcaagg cttctggcta tacattcaca agttatggta taagctgggt gaagcagaga 120

gatggacagg gccttgagtg gattggagag atttatccta gaagtggtaa tactgactac 180

aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcgtac 240

atggagctcc gcagtctgac atctgaggac tctgcggtct acttctgttc aagttttact 300

acgctggttc caacggacta ctttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 360

tca 363

<210> 58

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 70F10A10轻链可变区

<400> 58

gacattatga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttagt 60

atgacctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ttatttggcc 120

tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaaatgctga tttactgggc atccactagg 180

gaaactgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagtg tgatggctga agacctggca gtttattact gtcaccaata ttttacctat 300

cctcggacgt tcggtgacgg caccaagttg gaagtcaaa 339

<210> 59

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 35H6E1重链可变区

<400> 59

caggttactc tgaaagagtc tggccctggg attttgcagt cctcccagac cctcagtctg 60

acttgttctt tttctgggtt ttcactgagc acttctaata tgggtgtgag ctggattcgt 120

cagccttcag gaaagggtct ggagtggctg gcacacattt attgggatga tgacaagcgc 180

tataacccat ccctggagag ccggctcaca atctccaagg atacctccag aaaccaggtt 240

ttcctcaaga tcaccagtgt agacactgca gattctgcca catactactg cgctcgaaga 300

actaattact tcagtactag ggactatttt gactactggg gccaaggcac cactctcaca 360

gtctcctca 369

<210> 60

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 35H6E1轻链可变区

<400> 60

gacatccaga tgacgcagtc tccagcctcc ctatctgtgt ctgtgggaga aactgtcacc 60

atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag tttggtatca gcagaaacag 120

gggaaatctc ctcaactcct ggtctatgct gcaacaaagt tagcagatgg tgtgccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc aggcacacaa tattccctca agatcaacag cctgcagtct 240

gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggtt ttccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 61

<211> 414

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 61

atggcgcttt tgttgaccac ggtcattgct ctcacttgcc ttggcggctt tgcctcccca 60

ggccctgtgc ctccctctac agccctcagg gagctcattg aggagctggt caacatcacc 120

cagaaccaga aggctccgct ctgcaatggc agcatggtat ggagcatcaa cctgacagct 180

ggcatgtact gtgcagccct ggaatccctg atcaacgtgt caggctgcag tgccatcgag 240

aagacccaga ggatgctgag cggattctgc ccgcacaagg tctcagctgg gcagttttcc 300

agcttgcatg tccgagacac caaaatcgag gtggcccagt ttgtaaagga cctgctctta 360

catttaaaga aactttttcg cgagggacgg ttcaaccatc atcaccatca ccat 414

<210> 62

<211> 414

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 62

atggcgcttt tgttgaccac ggtcattgct ctcacttgcc ttggcggctt tgcctcccca 60

ggccctgtgc ctccctctac agccctcagg gagctcattg aggagctggt caacatcacc 120

cagaaccaga aggctccgct ctgcaatggc agcatggtat ggagcatcaa cctgacagct 180

ggcatgtact gtgcagccct ggaatccctg atcaacgtgt caggctgcag tgccatcgag 240

aagacccaga ggatgctgag cggattctgc ccgcacaagg tctcagctgg gcagttttcc 300

agcttgcatg tccgagacac caaaatcgag gtggcccagt ttgtaaagga cctgctctta 360

catttaaaga aactttttcg cgagggacag ttcaaccatc atcaccatca ccat 414

<210> 63

<211> 1284

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 63

atggagtggc cggcgcggct ctgcgggctg tgggcgctgc tgctctgcgc cggcggcggg 60

ggcgggggcg ggggcgccgc gcctacggaa actcagccac ctgtgacaaa tttgagtgtc 120

tctgttgaaa acctctgcac agtaatatgg acatggaatc cacccgaggg agccagctca 180

aattgtagtc tatggtattt tagtcatttt ggcgacaaac aagataagaa aatagctccg 240

gaaactcgtc gttcaataga agtacccctg aatgagagga tttgtctgca agtggggtcc 300

cagtgtagca ccaatgagag tgagaagcct agcattttgg ttgaaaaatg catctcaccc 360

ccagaaggtg atcctgagtc tgctgtgact gagcttcaat gcatttggca caacctgagc 420

tacatgaagt gttcttggct ccctggaagg aataccagtc ccgacactaa ctatactctc 480

tactattggc acagaagcct ggaaaaaatt catcaatgtg aaaacatctt tagagaaggc 540

caatactttg gttgttcctt tgatctgacc aaagtgaagg attccagttt tgaacaacac 600

agtgtccaaa taatggtcaa ggataatgca ggaaaaatta aaccatcctt caatatagtg 660

cctttaactt cccgtgtgaa acctgatcct ccacatatta aaaacctctc cttccacaat 720

gatgacctat atgtgcaatg ggagaatcca cagaatttta ttagcagatg cctattttat 780

gaagtagaag tcaataacag ccaaactgag acacataatg ttttctacgt ccaagaggct 840

aaatgtgaga atccagaatt tgagagaaat gtggagaata catcttgttt catggtccct 900

ggtgttcttc ctgatacttt gaacacagtc agaataagag tcaaaacaaa taagttatgc 960

tatgaggatg acaaactctg gagtaattgg agccaagaaa tgagtatagg taagaagcgc 1020

aattccacac tctacataac catgttactc attgttccag tcatcgtcgc aggtgcaatc 1080

atagtactcc tgctttacct aaaaaggctc aagattatta tattccctcc aattcctgat 1140

cctggcaaga tttttaaaga aatgtttgga gaccagaatg atgatactct gcactggaag 1200

aagtacgaca tctatgagaa gcaaaccaag gaggaaaccg actctgtagt gctgatagaa 1260

aacctgaaga aagcctctca gtga 1284

<210> 64

<211> 1143

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 64

atggctttcg tttgcttggc tatcggatgc ttatatacct ttctgataag cacaacattt 60

ggctgtactt catcttcaga caccgagata aaagttaacc ctcctcagga ttttgagata 120

gtggatcccg gatacttagg ttatctctat ttgcaatggc aacccccact gtctctggat 180

cattttaagg aatgcacagt ggaatatgaa ctaaaatacc gaaacattgg tagtgaaaca 240

tggaagacca tcattaccaa gaatctacat tacaaagatg ggtttgatct taacaagggc 300

attgaagcga agatacacac gcttttacca tggcaatgca caaatggatc agaagttcaa 360

agttcctggg cagaaactac ttattggata tcaccacaag gaattccaga aactaaagtt 420

caggatatgg attgcgtata ttacaattgg caatatttac tctgttcttg gaaacctggc 480

ataggtgtac ttcttgatac caattacaac ttgttttact ggtatgaggg cttggatcat 540

gcattacagt gtgttgatta catcaaggct gatggacaaa atataggatg cagatttccc 600

tatttggagg catcagacta taaagatttc tatatttgtg ttaatggatc atcagagaac 660

aagcctatca gatccagtta tttcactttt cagcttcaaa atatagttaa acctttgccg 720

ccagtctatc ttacttttac tcgggagagt tcatgtgaaa ttaagctgaa atggagcata 780

cctttgggac ctattccagc aaggtgtttt gattatgaaa ttgagatcag agaagatgat 840

actaccttgg tgactgctac agttgaaaat gaaacataca ccttgaaaac aacaaatgaa 900

acccgacaat tatgctttgt agtaagaagc aaagtgaata tttattgctc agatgacgga 960

atttggagtg agtggagtga taaacaatgc tgggaaggtg aagacctatc gaagaaaact 1020

ttgctacgtt tctggctacc atttggtttc atcttaatat tagttatatt tgtaaccggt 1080

ctgcttttgc gtaagccaaa cacctaccca aaaatgattc cagaattttt ctgtgataca 1140

tga 1143

<210> 65

<211> 2478

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 65

atggggtggc tttgctctgg gctcctgttc cctgtgagct gcctggtcct gctgcaggtg 60

gcaagctctg ggaacatgaa ggtcttgcag gagcccacct gcgtctccga ctacatgagc 120

atctctactt gcgagtggaa gatgaatggt cccaccaatt gcagcaccga gctccgcctg 180

ttgtaccagc tggtttttct gctctccgaa gcccacacgt gtatccctga gaacaacgga 240

ggcgcggggt gcgtgtgcca cctgctcatg gatgacgtgg tcagtgcgga taactataca 300

ctggacctgt gggctgggca gcagctgctg tggaagggct ccttcaagcc cagcgagcat 360

gtgaaaccca gggccccagg aaacctgaca gttcacacca atgtctccga cactctgctg 420

ctgacctgga gcaacccgta tccccctgac aattacctgt ataatcatct cacctatgca 480

gtcaacattt ggagtgaaaa cgacccggca gatttcagaa tctataacgt gacctaccta 540

gaaccctccc tccgcatcgc agccagcacc ctgaagtctg ggatttccta cagggcacgg 600

gtgagggcct gggctcagtg ctataacacc acctggagtg agtggagccc cagcaccaag 660

tggcacaact cctacaggga gcccttcgag cagcacctcc tgctgggcgt cagcgtttcc 720

tgcattgtca tcctggccgt ctgcctgttg tgctatgtca gcatcaccaa gattaagaaa 780

gaatggtggg atcagattcc caacccagcc cgcagccgcc tcgtggctat aataatccag 840

gatgctcagg ggtcacagtg ggagaagcgg tcccgaggcc aggaaccagc caagtgccca 900

cactggaaga attgtcttac caagctcttg ccctgttttc tggagcacaa catgaaaagg 960

gatgaagatc ctcacaaggc tgccaaagag atgcctttcc agggctctgg aaaatcagca 1020

tggtgcccag tggagatcag caagacagtc ctctggccag agagcatcag cgtggtgcga 1080

tgtgtggagt tgtttgaggc cccggtggag tgtgaggagg aggaggaggt agaggaagaa 1140

aaagggagct tctgtgcatc gcctgagagc agcagggatg acttccagga gggaagggag 1200

ggcattgtgg cccggctaac agagagcctg ttcctggacc tgctcggaga ggagaatggg 1260

ggcttttgcc agcaggacat gggggagtca tgccttcttc caccttcggg aagtacgagt 1320

gctcacatgc cctgggatga gttcccaagt gcagggccca aggaggcacc tccctggggc 1380

aaggagcagc ctctccacct ggagccaagt cctcctgcca gcccgaccca gagtccagac 1440

aacctgactt gcacagagac gcccctcgtc atcgcaggca accctgctta ccgcagcttc 1500

agcaactccc tgagccagtc accgtgtccc agagagctgg gtccagaccc actgctggcc 1560

agacacctgg aggaagtaga acccgagatg ccctgtgtcc cccagctctc tgagccaacc 1620

actgtgcccc aacctgagcc agaaacctgg gagcagatcc tccgccgaaa tgtcctccag 1680

catggggcag ctgcagcccc cgtctcggcc cccaccagtg gctatcagga gtttgtacat 1740

gcggtggagc agggtggcac ccaggccagt gcggtggtgg gcttgggtcc cccaggagag 1800

gctggttaca aggccttctc aagcctgctt gccagcagtg ctgtgtcccc agagaaatgt 1860

gggtttgggg ctagcagtgg ggaagagggg tataagcctt tccaagacct cattcctggc 1920

tgccctgggg accctgcccc agtccctgtc cccttgttca cctttggact ggacagggag 1980

ccacctcgca gtccgcagag ctcacatctc ccaagcagct ccccagagca cctgggtctg 2040

gagccggggg aaaaggtaga ggacatgcca aagcccccac ttccccagga gcaggccaca 2100

gacccccttg tggacagcct gggcagtggc attgtctact cagcccttac ctgccacctg 2160

tgcggccacc tgaaacagtg tcatggccag gaggatggtg gccagacccc tgtcatggcc 2220

agtccttgct gtggctgctg ctgtggagac aggtcctcgc cccctacaac ccccctgagg 2280

gccccagacc cctctccagg tggggttcca ctggaggcca gtctgtgtcc ggcctccctg 2340

gcaccctcgg gcatctcaga gaagagtaaa tcctcatcat ccttccatcc tgcccctggc 2400

aatgctcaga gctcaagcca gacccccaaa atcgtgaact ttgtctccgt gggacccaca 2460

tacatgaggg tctcttag 2478

Claims

1.一种分离的蛋白质，其特征在于，其包括：

IL-13抗体的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3中的一种或多种，和/或，

IL-13抗体的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3中的一种或多种；其中，

所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.10、SEQ ID No.18、SEQ ID No.26、SEQ ID No.34或SEQ ID No.42所示，

所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3、SEQ ID No.11、SEQ ID No.19、SEQID No.27、SEQ ID No.35或SEQ ID No.43所示，

所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.28、SEQ ID No.36或SEQ ID No.44所示，

所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.6、SEQ ID No.14、SEQ ID No.22、SEQ ID No.30、SEQ ID No.38或SEQ ID No.46所示，

所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.7、SEQ ID No.15、SEQ ID No.23、SEQ ID No.31、SEQ ID No.39或SEQ ID No.47所示，

所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.8、SEQ ID No.16、SEQ ID No.24、SEQ ID No.32、SEQ ID No.40或SEQ ID No.48所示；

或者，

2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQID No.2所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示；

所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.10所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.11所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.12所示；

所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.18所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.19所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.20所示；

所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.26所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.27所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.28所示；

所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.34所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.35所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.36所示；

所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.42所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.43所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.44所示；

所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.6所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.7所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.8所示；

所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.14所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.15所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.16所示；

所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.22所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.23所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.24所示；

所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.30所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.31所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.32所示；

所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.38所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.39所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.40所示；

或者，所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.46所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.47所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.48所示。

3.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQID No.2所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示；和，所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.6所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.7所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.8所示；

所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.10所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.11所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.12所示；和，所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.14所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.15所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.16所示；

所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.18所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.19所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.20所示；和，所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.22所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.23所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.24所示；

所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.26所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.27所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.28所示；和，所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.30所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.31所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.32所示；

所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.34所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.35所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.36所示；和，所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.38所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.39所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.40所示；

或者，所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.42所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.43所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.44所示；和，所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.46所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.47所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.48所示。

4.一种分离的蛋白质，其特征在于，其包括IL-13抗体的重链可变区和/或IL-13抗体的轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.17、SEQ ID No.25、SEQ ID No.33或SEQ ID No.41所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.5、SEQ ID No.13、SEQ ID No.21、SEQ ID No.29、SEQ ID No.37或SEQ ID No.45所示。

5.如权利要求4所述的蛋白质，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.5所示；

所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.9所示且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.13所示；

所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.17所示且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.21所示；

所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.25所示且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.29所示；

所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.33所示且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.37所示；

或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.41所示且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.45所示。

6.如权利要求1～5中任一项所述的蛋白质，其特征在于，所述的蛋白质还包括抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区。

7.如权利要求6所述的蛋白质，其特征在于，所述的抗体重链恒定区为人源或小鼠源抗体重链恒定区；所述的抗体轻链恒定区为人源或小鼠源抗体轻链恒定区。

8.如权利要求7所述的蛋白质，其特征在于，所述的抗体重链恒定区为人源抗体重链恒定区；所述的抗体轻链恒定区为人源抗体轻链恒定区。

9.如权利要求1或4所述的蛋白质，其特征在于，所述的蛋白质是IL-13抗体的单克隆抗体、抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体、单域抗体或单区抗体。

10.一种核酸，其特征在于，其编码如权利要求1～8中任一项所述的蛋白质。

11.如权利要求10所述的核酸，其特征在于，编码所述重链可变区的核酸如序列表SEQID No.49、SEQ ID No.51、SEQ ID No.53、SEQ ID No.55、SEQ ID No.57或SEQ ID No.59所示；

和/或，编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.50、SEQ IDNo.52、SEQ ID No.54、SEQ ID No.56、SEQ ID No.58或SEQ ID No.60所示。

12.如权利要求11所述的核酸，其特征在于，编码所述重链可变区的核酸如序列表SEQID No.49所示且编码所述轻链可变区的核酸如序列表SEQ ID No.50所示；

编码所述重链可变区的核酸如序列表SEQ ID No.51所示且编码所述轻链可变区的核酸如序列表SEQ ID No.52所示；

编码所述重链可变区的核酸如序列表SEQ ID No.53所示且编码所述轻链可变区的核酸如序列表SEQ ID No.54所示；

编码所述重链可变区的核酸如序列表SEQ ID No.55所示且编码所述轻链可变区的核酸如序列表SEQ ID No.56所示；

编码所述重链可变区的核酸如序列表SEQ ID No.57所示且编码所述轻链可变区的核酸如序列表SEQ ID No.58所示；

或者，编码所述重链可变区的核酸如序列表SEQ ID No.59所示且编码所述轻链可变区的核酸如序列表SEQ ID No.60所示。

13.一种包含如权利要求10～12中任一项所述的核酸的重组表达载体。

14.一种包含如权利要求13所述的重组表达载体的重组表达转化体。

15.一种IL-13抗体的制备方法，其包括如下步骤：培养如权利要求14所述的重组表达转化体，从培养物中获得IL-13抗体。

16.一种检测过表达IL-13蛋白的细胞的方法，其特征在于，包括如下的步骤：如权利要求1～8中任一项所述的蛋白质与待检样品在体外接触，检测如权利要求1～8中任一项所述的蛋白质与所述待检样品的结合即可。

17.一种检测过表达IL-13蛋白的细胞的组合物，其特征在于，其包括如权利要求1～8中任一项所述的蛋白质作为活性成分。

18.一种药物组合物，其特征在于，其包括如权利要求1～8中任一项所述的蛋白质作为活性成分和药学可接受的载体。

19.如权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的如权利要求1～8中任一项所述的蛋白质和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。

20.一种如权利要求1～8中任一项所述的蛋白质或者一种如权利要求18或19所述的药物组合物在制备预防或治疗IL-13表达或功能异常相关疾病的药物中的应用。

21.如权利要求20所述的应用，其特征在于，所述IL-13表达或功能异常相关疾病为支气管哮喘。