CN109776677A - 一种人源化抗il-13抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人源化IL‑13抗体及其制备方法和应用。所述IL‑13抗体包括IL‑13抗体的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3中的一种或多种，和/或，IL‑13抗体的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3中的一种或多种，其氨基酸序列分别如本发明中所述。所述IL‑13抗体具有高亲和力，能明显抑制IL‑13诱导的胸腺活化调节趋化因子和骨膜蛋白的分泌以及血管细胞粘附分子‑1的表达，明显抑制IL‑13诱导的小鼠气道高反应性，因此运用于预防或治疗IL‑13表达或功能异常相关疾病的药物的制备中。

Description

一种人源化抗IL-13抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及抗体领域，具体涉及一种人源化抗IL-13抗体及其制备方法和应用。
背景技术
支气管哮喘(简称哮喘)是一种常见的慢性气道性炎症疾病，通常伴随气道反应性增高，出现反复发作的喘息、气促、胸闷和/或咳嗽等症状。20世纪70年代以后，哮喘病广泛流行。到2011年，全球约有2.35亿至3亿人受到影响，大约有25万人因此失去生命。临床上，哮喘通常是以吸入类固醇等糖皮质激素并辅助长效β-肾上腺素能受体激动剂等方式来治疗。但是，约有10％的病人不能通过常规的气道吸入的方法加以缓解，这些病人往往需要口服副作用很大的类固醇类药物来控制病情，而且仍然伴随着较高的死亡率。患者不仅生活质量受到巨大影响，而产生的直接医疗费用和间接成本会造成个人和社会经济的巨大负担。
近年来，随着对哮喘的深入研究，发现很大部分哮喘患者是由于Th2细胞过度释放可溶性细胞因子诱导IgE的产生，导致肥大细胞、嗜酸性粒细胞脱颗粒增多，从而引起多种炎症细胞参与的气道过敏反应和慢性气道炎症。其中白细胞介素13(以下简称IL-13)和白细胞介素4(以下简称IL-4)在这个过程中起着非常重要的作用。IL-13是一种主要由Th2细胞分泌的多效应细胞因子，分子量约为10KDa，其基因位于第5号染色体上，与IL-4基因紧密连接。IL-4和IL-13都由Th2细胞产生，他们共享同一条受体链，在功能上有很多相似之处。近年来，多项动物实验已经证实IL-4和IL-13均可导致气道反应性增高，嗜酸性粒细胞浸润和粘液分泌的增加。哮喘患者中普遍出现的血浆IgE水平的升高，也已经被证实是IL-13刺激B细胞增殖、分化的结果。近年来随着对IL-13基因单核苷酸的多态性的深入研究，还发现IL-13存在一个天然变体R130Q。人群中约25％的染色体上均出现这种变体的编码，但在哮喘患者中，这个比例可以提高到大约50％。文献报道指出R130Q变体与哮喘的发病直接相关，而且更容易出现过敏症状。深入的研究发现，表达IL-13变体R130Q的患者体内IL-13浓度更高，且效果更强，更易引发哮喘等症状(参见May and Fung 2015,Cytokine75:89)。
因此，迫切需要可抑制IL-13的药物，如能够与IL-13相结合的特异性单克隆抗体。这些抗体能够结合人IL-13蛋白(野生型或R130Q变体)并能够在蛋白水平和细胞水平抑制IL-13与其受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体或受体IL-13Ra2结合；能明显抑制IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子的分泌和骨膜蛋白的分泌以及血管细胞粘附分子-1的表达；且能够明显抑制IL-13诱导的小鼠气道高反应性。因此，IL-13抗体能够运用于预防、诊断和治疗支气管哮喘等疾病的药物的制备中。单克隆抗体由于具有靶向性、特异性、专一性、高亲和力等优势，正发展成为新型诊断和治疗药物。然而，早期的临床试验揭示，在人体中使用非人源单克隆抗体，常常因为人抗小鼠抗体(HAMA)和人抗大鼠抗体(HARA)应答，导致严重的免疫反应，抗体被快速清除。随后开发出免疫原性较小的抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。根据人源化程度不同,治疗性单克隆抗体药物可分为4种：鼠源性抗体(无人源氨基酸序列)、嵌合抗体(60％～70％人源化氨基酸序列)、CDR移植抗体(90％～95％人源化氨基酸序列)以及全人源抗体(100％人源氨基酸序列)。随着人源化程度增加，非鼠源单克隆抗体可以减轻人体治疗过程中人抗鼠抗体反应(HAMA和HARA反应)，逐步消除异源性抗体的免疫原性问题，在保持对抗原高亲和力的同时，改善了抗体的药代动力学，临床上已大量使用这些抗体药物进行靶向治疗。
目前，单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
传统的杂交瘤制备技术由Kohler and Milstein在40年前建立(Kohler andMilstein 1975，Nature 256:495)，现在已广泛应用于科研、诊断、治疗等许多单克隆抗体相关的制备和生产之中。其基本方法虽然延用至今，但在许多方面都有所变化、改进和创新，包括不同品系动物如转基因动物的使用、电融合技术的引入、高效筛选技术设备的应用如ClonePix设备等。从而使杂交瘤技术的应用更多样化和高效化。常规动物如小鼠等制备的单抗，可以通过常规分子生物学方法克隆抗体重链可变区和轻链可变区基因，可变区基因可以嫁接到人源抗体恒定区基因从而形成人鼠嵌合抗体(参见美国专利文献U.S.Pat.No.4,816,567)，以大大降低人体使用时的免疫原性。此外，鼠源抗体可变区的CDR结构域可以嫁接到人源抗体架构上，从而使鼠源抗体成分降低到5％以下，大大增加了抗体在人体内使用的安全性。这一途径得到抗体称为人源化抗体，并且是目前抗体药物市场的主要产品(参见美国专利文献U.S.Pat.No.5,225,539等)。
因此，本领域迫切需要开发可抑制IL-13的药物，如IL-13抗体用于预防或治疗支气管哮喘。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术目前缺少IL-13抗体的不足，提供了一种亲和力高、特异性强的人源化抗IL-13抗体及其制备方法和应用。所述的人源化抗IL-13抗体与人IL-13蛋白(野生型或R130Q变体)具有高度亲和力，并能够在蛋白水平和细胞水平抑制IL-13与其受体IL-13Ra1/IL-4Ra异原二聚体或受体IL-13Ra2结合。在趋化因子释放实验和细胞外基质蛋白释放实验，细胞粘附分子表达实验中，这些抗体表现出良好的生物学活性。
这些抗体的用途，包括但不仅限于抑制IL-13/IL-13受体介导的信号通路的负调节，抑制气道高反应性、嗜酸性粒细胞浸润及粘液过度分泌等哮喘症状，单独或与其他抗哮喘抗体联合应用用于哮喘的治疗，以及相关的哮喘患者的诊断等用途。随着这些抗体人源化程度增加，可减轻人体治疗过程中人抗鼠抗体反应(HAMA反应)，逐步消除异源性抗体的免疫原性问题，在保持对抗原高亲和力的同时，改善了抗体的药代动力学。
在本发明的第一方面，提供了一种人源化抗体，包括重链可变区和/或轻链可变区；
其中，所述人源化抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:10所示的CDR1，
SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:11所示的CDR2，和
SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:12所示的CDR3；
所述人源化抗体的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:14所示的CDR1，
SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:15所示的CDR2，和
SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:16所示的CDR3；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留IL-13结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，上述任一CDR的氨基酸序列中包含经过添加、缺失、修饰和/或取代1、2或3个氨基酸的衍生CDR序列，并且使得含有所述衍生CDR序列的VH和VL所构成的衍生抗体能够保留与IL-13结合的亲和力。
在另一优选例中，所述的衍生抗体与IL-13结合的亲和力F1与相应非衍生的抗体与IL-13结合的亲和力F0之比(F1/F0)为0.5-2，较佳地为0.7-1.5，和更佳地0.8-1.2。
在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1-5个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)。在另一优选例中，所述的人源化抗体在人中的免疫原性Z1与非人源化的抗体(如鼠源抗体)在人中的免疫原性Z0之比(Z1/Z0)为0-0.5，较佳地0-0.2，更佳地0-0.05(如0.001-0.05)。
在另一优选例中，所述重链可变区CDR1的氨基酸序列与如序列表中SEQ IDNo.18、SEQ ID No.2、SEQ ID No.10所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性，
所述重链可变区CDR2的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.19、SEQ ID No.3、SEQ ID No.11所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性，和
所述重链可变区CDR3的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.20、SEQ ID No.4、SEQ ID No.12所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性。
在另一优选例中，所述轻链可变区CDR1的氨基酸序列与如序列表中SEQ IDNo.22、SEQ ID No.6、SEQ ID No.14所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性，
所述轻链可变区CDR2的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.23、SEQ ID No.7、SEQ ID No.15所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性，
所述轻链可变区CDR3的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.24、SEQ ID No.8、SEQ ID No.16所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性。
在另一优选例中，所述人源化抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:18所示的CDR1，
SEQ ID NO:19所示的CDR2，和
SEQ ID NO:20所示的CDR3；
或
SEQ ID NO:2所示的CDR1，
SEQ ID NO:3所示的CDR2，和
SEQ ID NO:4所示的CDR3；
或
SEQ ID NO:10所示的CDR1，
SEQ ID NO:11所示的CDR2，和
SEQ ID NO:12所示的CDR3。
在另一优选例中，所述人源化抗体的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:22所示的CDR1，
SEQ ID NO:23所示的CDR2，和
SEQ ID NO:24所示的CDR3；
或
SEQ ID NO:6所示的CDR1，
SEQ ID NO:7所示的CDR2，和
SEQ ID NO:8所示的CDR3；
或
SEQ ID NO:14所示的CDR1，
SEQ ID NO:15所示的CDR2，和
SEQ ID NO:16所示的CDR3。
在另一优选例中，所述人源化抗体的重链可变区序列选自下组：SEQ ID NO:17、1或9；和/或
所述人源化抗体的轻链可变区序列选自下组：SEQ ID NO:21、5或13。
在另一优选例中，所述人源化抗体的重链可变区序列为SEQ ID NO:17，并且轻链可变区序列为SEQ ID NO:21。
在另一优选例中，所述人源化抗体的重链可变区序列为SEQ ID NO:1，并且轻链可变区序列为SEQ ID NO:5。
在另一优选例中，所述人源化抗体的重链可变区序列为SEQ ID NO:9，并且轻链可变区序列为SEQ ID NO:13。
在另一优选例中，所述人源化抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:18所示的CDR1，
SEQ ID NO:19所示的CDR2，和
SEQ ID NO:20所示的CDR3；
和/或
所述人源化抗体的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:22所示的CDR1，
SEQ ID NO:23所示的CDR2，和
SEQ ID NO:24所示的CDR3。
在另一优选例中，所述人源化抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO:57、51、52、53、54、55或56所示；和/或所述人源化抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO:58、59或60所示。
在另一优选例中，所述人源化抗体的重链和轻链可变区序列如表A所示：
表A
在另一优选例中，所述人源化抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO:57、51、52、53、54、55、或56所示；并且所述人源化抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO:58、59、或60所示。
在另一优选例中，所述的人源化抗体还包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源的，和/或所述的轻链恒定区为人源的。
在另一优选例中，所述人源化抗体为单克隆抗体。
在另一优选例中，所述人源化抗体为双链抗体、单链抗体、单域抗体、或单区抗体。
在另一优选例中，所述人源化抗体为抗体全长蛋白、或抗原结合片段。
在另一优选例中，所述人源化抗体为双特异性抗体、或多特异性抗体。
在另一优选例中，所述人源化抗体的重链可变区还包括人源的框架区，和/或所述人源化抗体的轻链可变区还包括人源的框架区。
在另一优选例中，所述人源化抗体的重链可变区上的重链FR序列，来源于人种系重链序列包含1)VH1-f或VH4-59的FR1、FR2、FR3区，和2)JH1或JH6的FR4区的人抗体重链构架区的组合。
在另一优选例中，所述人源化抗体的轻链可变区上的轻链FR序列，来源于人种系轻链包含1)L1、7B或O12的FR1、FR2、FR3区，和2)JK4或JL1的FR4区的人抗体轻链构架区的组合。
在另一优选例中，所述人源化抗体的重链框架区选自种系：DP3(VH1-f)、DP4、DP7、DP8、DP9、DP10、DP31、DP33、DP35(VH3-11)、DP45、DP46、DP47、DP48、DP49(VH3-30)、DP50、DP51(VH3-48)、DP53、DP54、DP65、DP66、DP67、DP68、DP69或DP71(VH4-59)；和/或
所述人源化抗体的轻链框架区选自种系：L1、O2、O12、DPK1(O18)、DPK2、DPK3、DPK4、DPK5、DPK6、DPK7、DPK8、DPK9、DPK10、DPK12(A2)、DPK13、DPK15、DPK16、DPKI8、DPK19、DPK20、DPK21、DPK22、DPK23、DPK24(B3)、DPK25、DPK26、DPK28、DPL1、DPL7、DPL6、DPL2、DPL3、DPL5、DPL12、DPL11、DPL13、DPL10、D9、DPL16、DPL24、DPL18、DPL19(7b)、DPL21、DPL22或DPL20。
在另一优选例中，所述人源化抗体的重链框架区选自种系：DP3(VH1-f)、DP4、DP7、DP8、DP9、DP10、DP31、DP33、DP35(VH3-11)、DP45、DP46、DP47、DP48、DP49(VH3-30)、DP50、DP51(VH3-48)、DP53、DP54、DP65、DP66、DP67、DP68、DP69或DP71(VH4-59)的FR1、FR2、FR3；以及JH片段JH1、JH2、JH3、JH4、JH4b、JH5和JH6，特别是这些种系的FR4编码的序列，或重链框架区的共有序列。
在另一优选例中，所述人源化抗体的轻链框架区选自种系：L1、O2、O12、DPK1(O18)、DPK2、DPK3、DPK4、DPK5、DPK6、DPK7、DPK8、DPK9、DPK10、DPK12(A2)、DPK13、DPK15、DPK16、DPKI8、DPK19、DPK20、DPK21、DPK22、DPK23、DPK24(B3)、DPK25、DPK26、DPK28、DPL1、DPL7、DPL6、DPL2、DPL3、DPL5、DPL12、DPL11、DPL13、DPL10、D9、DPL16、DPL24、DPL18、DPL19(7b)、DPL21、DPL22或DPL20，优选为这些种系的FR1、FR2、FR3；以及由Jk片段Jk1、Jk2、Jk3、Jk4和JK5，特别是这些种系的FR4编码的序列。
在另一优选例中，所述人源化抗体的重链和轻链可变区序列如表B所示：
表B
。
在另一优选例中，所述人源化抗体的重链和轻链可变区序列如表C所示：表C
。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物形式。
在本发明的第二方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白包括：
(i)表2所示的任一重链可变区序列和任一轻链可变区序列；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列；
表2
在另一优选例中，所述的重组蛋白包括：
(i)SEQ ID NO:57、28、37、17、1或9所示的重链可变区，SEQ ID NO:58、34、48、21、5或13所示的轻链可变区；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在本发明的第三方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)表2所示的任一重链可变区序列和任一轻链可变区序列；以及
(2)本发明的第二方面所述的重组蛋白。
在另一优选例中，所述多核苷酸如表4所示。
在另一优选例中，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)SEQ ID NO:57、28、37、17、1或9所示的重链可变区，SEQ ID NO:58、34、48、21、5或13所示的轻链可变区；或
(2)本发明的第二方面所述的重组蛋白。
在另一优选例中，编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:117、88、97、77、61或69所示；和/或，
编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:118、94、108、81、65或73所示。
在另一优选例中，编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:117所示，并且编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:118所示；或
编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:88所示，并且编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:94所示；
或
编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:97所示，并且编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:108所示；
或
编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:77所示，并且编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:81所示；
或
编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:61所示，并且编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:65所示；
或
编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:69所示，并且编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:73所示。
在本发明的第四方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明本发明的第三方面中任一项所述的多核苷酸。
在本发明的第五方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第四方面所述的载体或基因组中整合有本发明的第三方面中任一项所述的多核苷酸。
在本发明的第六方面，提供了一种抗体偶联物，该抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分为本发明的第一方面中任一项所述的人源化抗体；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
在本发明的第七方面，提供了一种免疫细胞，所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有本发明的第一方面中任一项所述的人源化抗体。
在本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：本发明的第一方面中任一项所述的人源化抗体、本发明的第二方面所述的重组蛋白、本发明的第六方面所述的抗体偶联物、本发明的第七方面所述的免疫细胞、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的本发明的第一方面中任一项所述的人源化抗体、本发明的第二方面所述的重组蛋白、本发明的第六方面所述的抗体偶联物、本发明的第七方面所述的免疫细胞、或其组合和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
在本发明的第九方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：本发明的第一方面中任一项所述的人源化抗体、本发明的第二方面所述的重组蛋白、本发明的第六方面所述的抗体偶联物、本发明的第七方面所述的免疫细胞、或其组合，其中所述活性成分被用于(a)制备诊断试剂；和/或(b)制备预防和/或治疗IL-13相关的疾病的药物。
在另一优选例中，所述诊断试剂包括药剂、试剂、检测板或试剂盒。
在另一优选例中，所述IL-13相关的疾病选自下组：支气管哮喘。
在本发明的第十方面，提供了一种体外检测样品中IL-13蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)在体外，将所述样品与本发明的第一方面中任一项所述的人源化抗体、本发明的第二方面所述的重组蛋白、本发明的第六方面所述的抗体偶联物、本发明的第七方面所述的免疫细胞、或其组合接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在IL-13蛋白。
在本发明的第十一方面，提供了一种体外检测样品中IL-13蛋白的组合物，其包括本发明的第一方面中任一项所述的人源化抗体、本发明的第二方面所述的重组蛋白、本发明的第六方面所述的抗体偶联物、本发明的第七方面所述的免疫细胞、或其组合作为活性成分。
在本发明的第十二方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有本发明的第一方面中任一项所述的人源化抗体、本发明的第二方面所述的重组蛋白、本发明的第六方面所述的抗体偶联物、本发明的第七方面所述的免疫细胞、或其组合。
在本发明的第十三方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养本发明的第五方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是本发明的第一方面中任一项所述的人源化抗体或本发明的第二方面所述的重组蛋白。
在本发明的第十四方面，提供了一种治疗支气管哮喘的方法，包括：使用本发明的第一方面中任一项所述的人源化抗体、本发明的第二方面所述的重组蛋白、本发明的第六方面所述的抗体偶联物、本发明的第七方面所述的免疫细胞。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为TARC分泌试验检验重组IL-13蛋白的生物学活性的结果。
图2为ELISA检测免疫原A免疫后小鼠血清抗体效价的结果。
图3为ELISA(酶联免疫吸附实验)中IL-13先导抗体与人IL-13反应活性的结果。
图4为ELISA(酶联免疫吸附实验)中IL-13先导抗体与人IL-13变体(IL-13R130Q变体)反应活性的结果。
图5为ELISA(酶联免疫吸附实验)中IL-13先导抗体与猴IL-13变体反应活性的结果。
图6为ELISA(酶联免疫吸附实验)中IL-13先导抗体与鼠IL-13变体反应活性的结果。
图7为流式细胞分析方法检测过表达全长人IL-13Ra1的HEK293细胞株中hIL-13Ra1蛋白的表达水平的结果。其中，抗体指羊抗人IL-13Ra1抗体(购自RnD systems)；阴性对照指羊IgG对照。
图8为流式细胞分析方法检测过表达全长人IL-4Ra的HEK293细胞株中hIL-4Ra蛋白的表达水平的结果。其中，抗体指鼠抗人IL-4Ra抗体(购自RnD systems)；阴性对照指鼠IgG对照。
图9为流式细胞分析方法检测过表达全长人IL-13Ra2的HEK293细胞株中hIL-13Ra2蛋白的表达水平的结果。其中，抗体指羊抗人IL-13Ra2抗体(购自RnD systems)；阴性对照指羊IgG对照。
图10为FACS检测IL-13先导抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合的结果。
图11为FACS检测IL-13先导抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合的结果。
图12为IL-13先导抗体中和IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌的结果。
图13为ELISA检测IL-13嵌合抗体与免疫原A的反应活性的结果。
图14为ELISA检测IL-13嵌合抗体与IL-13R130Q变体的反应活性的结果。
图15为ELISA检测IL-13嵌合抗体与猴IL-13变体的反应活性的结果。
图16为FACS检测IL-13嵌合抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结果。
图17为为FACS检测IL-13嵌合抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2结合的结果。
图18为IL-13嵌合抗体中和IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌的结果。
图19为IL-13嵌合抗体中和IL-13诱导的骨膜蛋白分泌的结果。
图20为IL-13嵌合抗体中和IL-13诱导的血管细胞粘附分子-1表达的结果。
图21为IL-13嵌合抗体抑制人IL-13诱导的小鼠呼吸炎症实验的结果。
图22为人源化抗IL-13抗体Hu-29D9H8重链可变区Hu-29D9H8.VH1及其变体与c29D9H8嵌合抗体VH及人种系VH外显子hVH1-F/JH1的序列比较。
图23为人源化抗IL-13抗体Hu-29D9H8轻链可变区Hu-29D9H8.VK1及其变体与c29D9H8嵌合抗体VK及人种系VK外显子L1/JK4的序列比较。
图24为人源化抗IL-13抗体Hu-28A2E11重链可变区Hu-28A2E11.VH1及其变体与c28A2E11嵌合抗体VH及人种系VH外显子hVH1-F/JH1的序列比较。
图25为人源化抗IL-13抗体Hu-28A2E11轻链可变区Hu-28A2E11.VL1及其变体与c28A2E11嵌合抗体VL及人种系VL外显子7B/JL1的序列比较。
图26为人源化抗IL-13抗体Hu-35E2C3重链可变区Hu-35E2C3.VH1及其变体与c35E2C3嵌合抗体VH及人种系VH外显子hVH4-59/JH6的序列比较。
图27为人源化抗IL-13抗体Hu-35E2C3轻链可变区Hu-35E2C3.VK1及其变体与c35E2C3嵌合抗体VK及人种系VK外显子O12/JK4的序列比较。
图28为ELISA(酶联免疫吸附实验)中人源化抗IL-13抗体与免疫原A的反应活性的结果。
图29为ELISA(酶联免疫吸附实验)中人源化抗IL-13抗体与免疫原A的反应活性的结果。
图30为ELISA(酶联免疫吸附实验)中人源化抗IL-13抗体与免疫原A的反应活性的结果。
图31-1流式细胞分析方法检测检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合的结果。
图31-2为流式细胞分析方法检测检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合的结果。
图32-1为流式细胞分析方法检测检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合的结果。
图32-2为流式细胞分析方法检测检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合的结果。
图33-1为流式细胞分析方法检测检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合的结果。
图33-2为流式细胞分析方法检测检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合的结果。
图34-1为流式细胞分析方法检测检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合的结果。
图34-2为流式细胞分析方法检测检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合的结果。
图35-1为流式细胞分析方法检测检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合的结果。
图35-2为流式细胞分析方法检测检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合的结果。
图36-1流式细胞分析方法检测检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合的结果。
图36-2为流式细胞分析方法检测检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合的结果。
图37-1为流式细胞分析方法检测检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合的结果。
图37-2为流式细胞分析方法检测检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合的结果。
图38-1为流式细胞分析方法检测检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合的结果。
图38-2为流式细胞分析方法检测检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合的结果。
图39-1为流式细胞分析方法检测检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合的结果。
图39-2为流式细胞分析方法检测检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合的结果。
图40-1为流式细胞分析方法检测检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合的结果。
图40-2为流式细胞分析方法检测检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合的结果。
图41-1为流式细胞分析方法检测检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合的结果。
图41-2为流式细胞分析方法检测检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合的结果。
图42-1为人源化抗IL-13抗体中和IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌的结果。
图42-2为人源化抗IL-13抗体中和人IL-13R130Q变体诱导的胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌的结果。
图43-1为人源化抗IL-13抗体中和IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌的结果。
图43-2为人源化抗IL-13抗体中和人IL-13R130Q变体诱导的胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌的结果。
图44-1为人源化抗IL-13抗体中和IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌的结果。
图44-2为人源化抗IL-13抗体中和人IL-13R130Q变体诱导的胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌的结果。
图45-1为人源化抗IL-13抗体中和IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌的结果。
图45-2为人源化抗IL-13抗体中和人IL-13R130Q变体诱导的胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌的结果。
图46-1为人源化抗IL-13抗体中和IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌的结果。
图46-2为人源化抗IL-13抗体中和人IL-13R130Q变体诱导的胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌的结果。
图47-1为人源化抗IL-13抗体中和IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌的结果。
图47-2为人源化抗IL-13抗体中和人IL-13R130Q变体诱导的胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌的结果。
图48-1为人源化抗IL-13抗体中和IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌的结果。
图48-2为人源化抗IL-13抗体中和人IL-13R130Q变体诱导的胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌的结果。
图49-1为IL-13人源化抗体抑制人IL-13诱导的小鼠肺杯状细胞化生及黏液过度分泌实验的结果。
图49-2为IL-13人源化抗体抑制人IL-13诱导的小鼠肺杯状细胞化生及黏液过度分泌实验的结果。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，以重组人IL-13蛋白作为免疫原，采用传统的杂交瘤制备技术(参见Kohler and Milstein，Nature，1975，256:495)，通过一系列的调整和改进获得IL-13抗体的先导抗体。再通过对先导抗体的初步生产、纯化和鉴定，获得具备与人IL-13蛋白等蛋白具有高度亲和力的IL-13抗体。并且通过分子生物学方法测序获知所得的IL-13抗体的重链可变区和IL-13抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
更进一步，本发明利用经过详细分析的小鼠抗体，取其与抗原结合的CDR区与人的抗体框架嫁接，经亲和力重塑，形成CDR移植抗体，即人源化抗体，维持其特异性和大部分的亲和力，同时几乎完全去除免疫原性和毒副作用。具体地，本发明经过大量筛选，意外地最终获得一种抗IL-13人源化单克隆抗体Hu-35E2C3-19，实验结果表明，所述的人源化单克隆抗体能够高特异性地结合IL-13抗原，其具有很高的亲和力(KD<1×10-8M)并且，所述的抗体具有显著的抑制小鼠呼吸炎症的活性，而对于哺乳动物本身没有可见的毒副作用。在此基础上完成了本发明。
本发明通过阻断IL-13信号通路，可以很好地缓解IL-13导致的一系列哮喘症状，从而起到治疗哮喘的作用。尤其是针对严重哮喘起到辅助常规治疗方式甚至替代常规疗法的治疗作用。
术语
人源化抗IL-13抗体
本发明提供一种人源化抗IL-13抗体，其包括：
1)所述的人源化抗IL-13抗体包含人抗体框架区(构架区)残基的框架区。
所述的人抗体框架区包括重链框架区和轻链框架区，人抗体轻链框架区残基可以包含种系L1、O2、O12、DPK1(O18)、DPK2、DPK3、DPK4、DPK5、DPK6、DPK7、DPK8、DPK9、DPK10、DPK12(A2)、DPK13、DPK15、DPK16、DPKI8、DPK19、DPK20、DPK21、DPK22、DPK23、DPK24(B3)、DPK25、DPK26、DPK28、DPL1、DPL7、DPL6、DPL2、DPL3、DPL5、DPL12、DPL11、DPL13、DPL10、D9、DPL16、DPL24、DPL18、DPL19(7b)、DPL21、DPL22或DPL20，特别是这些种系的FR1、FR2、FR3；以及由Jk片段Jk1、Jk2、Jk3、Jk4和JK5，特别是这些种系的FR4编码的序列。人抗体重链框架区残基可以包含种系DP3(VH1-f)、DP4、DP7、DP8、DP9、DP10、DP31、DP33、DP35(VH3-11)、DP45、DP46、DP47、DP48、DP49(VH3-30)、DP50、DP51(VH3-48)、DP53、DP54、DP65、DP66、DP67、DP68、DP69或DP71(VH4-59)，特别是这些种系的FR1、FR2、FR3；以及JH片段JH1、JH2、JH3、JH4、JH4b、JH5和JH6，特别是这些种系的FR4编码的序列，或重链框架区的共有序列。此类框架区序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在"VBase"人种系序列数据库(www.mrcco8.com.ac.uk/vbase)获得，以及在Kabat，E.A等人，1991Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版中找到。
所述人源化抗体的轻链框架区选自种系：人的抗体可变区框架经过选择，其中所述抗体轻链可变区上的轻链FR序列，来源于人种系轻链包含1)L1、7B或O12的FR1、FR2、FR3区，和2)JK4或JL1的FR4区的人抗体轻链框架区的组合；所述抗体的重链可变区上的重链FR序列，来源于人种系重链序列包含1)VH1-f或VH4-59的FR1、FR2、FR3区，和2)JH1或JH6的FR4区的人抗体重链框架区的组合。一般而言，人受体框架区的选择应类似于供体抗体的框架区，或最类似于可变区亚家族的共有序列进行选择。移植后，可以在供体和/或受体序列中进行序列突变，以优化抗原结合、功能性、密码子使用、表达水平等，包括将非人残基引入框架区内。
2)所述的人源化抗IL-13抗体中，CDR是小鼠的CDR，选自SEQ ID NO.5、13或21所示的轻链可变区的一个或多个CDRs，或SEQ ID NO.1、9或17所示的重链可变区的一个或多个CDRs。
较佳地，所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.10或SEQ ID No.18所示，更佳地，编码所述重链CDR1的氨基酸序列的核苷酸序列如序列表中SEQID No.62、SEQ ID No.70或SEQ ID No.78所示；
所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3、SEQ ID No.11或SEQ IDNo.19所示，更佳地，编码所述重链CDR2的氨基酸序列的核苷酸序列如序列表中SEQ SEQ IDNo.63、SEQ ID No.71或SEQ ID No.79所示；
所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4、SEQ ID No.12或SEQ IDNo.20所示，更佳地，编码所述重链CDR3的氨基酸序列的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo.64、SEQ ID No.72或SEQ ID No.80所示；
所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.6、SEQ ID No.14或SEQ IDNo.22所示，更佳地，编码所述轻链CDR1的氨基酸序列的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo.66、SEQ ID No.74或SEQ ID No.82所示；
所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.7、SEQ ID No.15或SEQ IDNo.23所示，更佳地，编码所述轻链CDR2的氨基酸序列的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo.67、SEQ ID No.75或SEQ ID No.83所示；
所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.8、SEQ ID No.16或SEQ IDNo.24所示；更佳地，编码所述轻链CDR3的氨基酸序列的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo.68、SEQ ID No.76或SEQ ID No.84所示；
较佳地，所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.4所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.10所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.11所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.12所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.18所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.19所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.20所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.6所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.7所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.8所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.14所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQID No.15所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.16所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.22所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.23所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.24所示。
较佳地，所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.4所示；和，所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.6所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.7所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.8所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.10所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.11所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.12所示；和，所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.14所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.15所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.16所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.18所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.19所示且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.20所示；和，所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.22所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.23所示且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.24所示。
3)所述的人源化抗IL-13抗体包括至少一个重链可变区和/或至少一个轻链可变区。
所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.17、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ IDNo.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ IDNo.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ IDNo.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56或SEQ ID No.57所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.5、SEQ ID No.13、SEQ ID No.21、SEQ ID No.32、SEQID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59或SEQ ID No.60所示；更佳地，编码所述重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No.61、SEQ ID No.69、SEQ ID No.77、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ IDNo.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.96、SEQ IDNo.97、SEQ ID No.98、SEQ ID No.99、SEQ ID No.100、SEQ ID No.101、SEQ ID No.102、SEQID No.110、SEQ ID No.111、SEQ ID No.112、SEQ ID No.113、SEQ ID No.114、SEQ IDNo.115、SEQ ID No.116或SEQ ID No.117所示；编码所述的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No.65、SEQ ID No.73、SEQ ID No.81、SEQ ID No.92、SEQID No.93、SEQ ID No.94、SEQ ID No.95、SEQ ID No.103、SEQ ID No.104、SEQ ID No.105、SEQ ID No.106、SEQ ID No.107、SEQ ID No.108、SEQ ID No.109、SEQ ID No.118、SEQ IDNo.119或SEQ ID No.120所示。
或者，所述的重链可变区的氨基酸序列为，与如序列表中SEQ ID No.1、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.17、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ IDNo.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ IDNo.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ IDNo.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56或SEQ ID No.57所示的氨基酸序列至少有80％序列同源的氨基酸序列；所述轻链可变区的氨基酸序列为，与如序列表中SEQ ID No.5、SEQ ID No.13、SEQ ID No.21、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ IDNo.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ IDNo.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59或SEQ ID No.60所示的氨基酸序列至少有80％序列同源的氨基酸序列；较佳地，所述的重链可变区的氨基酸序列为，与如序列表中SEQ ID No.61、SEQ ID No.69、SEQ ID No.77、SEQ ID No.85、SEQ IDNo.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ IDNo.96、SEQ ID No.97、SEQ ID No.98、SEQ ID No.99、SEQ ID No.100、SEQ ID No.101、SEQID No.102、SEQ ID No.110、SEQ ID No.111、SEQ ID No.112、SEQ ID No.113、SEQ IDNo.114、SEQ ID No.115、SEQ ID No.116或SEQ ID No.117所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列有80％序列同源的氨基酸序列；所述的轻链可变区的氨基酸序列为，与如序列表中SEQID No.65、SEQ ID No.73、SEQ ID No.81、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQID No.95、SEQ ID No.103、SEQ ID No.104、SEQ ID No.105、SEQ ID No.106、SEQ IDNo.107、SEQ ID No.108、SEQ ID No.109、SEQ ID No.118、SEQ ID No.119或SEQ ID No.120所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列有80％序列同源的氨基酸序列。
较佳地，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.26所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.33所示；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.86所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.93所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.26所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.34所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.86所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.94所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.26所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.35所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.86所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.95所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.27所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.32所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.87所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.92所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.27所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.33所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.87所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.93所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.27所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.34所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.87所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.94所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.27所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.35所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.87所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.95所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.28所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.32所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.88所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.92所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.28所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.33所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.88所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.93所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.28所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.34所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.88所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.94所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.28所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.35所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.88所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.95所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.29所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.32所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.89所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.92所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.29所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.33所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.89所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.93所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.29所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.34所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.89所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.94所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.29所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.35所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.89所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.95所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.30所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.32所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.90所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.92所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.30所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.33所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.90所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.93所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.30所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.34所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.90所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.94所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.30所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.35所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.90所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.95所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.31所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.32所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.91所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.92所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.31所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.33所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.91所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.93所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.31所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.34所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.91所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.94所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.31所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.35所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.91所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.95所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.37所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.43所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.97所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.103所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.37所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.44所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.97所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.104所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.37所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.45所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.97所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.105所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.37所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.46所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.97所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.106所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.37所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.47所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.97所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.107所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.37所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.48所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.97所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.108所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.37所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.49所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.97所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.109所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.38所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.43所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.98所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.103所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.38所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.44所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.98所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.104所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.38所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.45所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.98所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.105所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.38所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.46所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.98所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.106所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.38所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.47所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.98所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.107所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.38所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.48所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.98所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.108所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.38所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.49所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.98所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.109所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.39所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.43所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.99所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.103所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.39所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.44所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.99所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.104所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.39所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.45所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.99所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.105所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.39所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.46所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.99所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.106所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.39所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.47所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.99所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.107所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.39所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.48所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.99所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.108所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.40所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.43所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.100所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.103所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.40所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.44所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.100所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.104所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.40所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.45所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.100所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.105所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.40所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.46所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.100所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.106所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.40所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.47所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.100所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.107所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.41所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.43所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.101所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.103所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.41所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.44所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.101所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.104所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.41所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.45所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.101所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.105所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.41所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.46所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.101所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.106所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.42所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.43所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.102所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.103所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.42所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.44所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.102所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.104所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.42所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.45所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.102所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.105所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.42所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.46所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.102所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.106所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.51所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.58所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.111所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.118所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.51所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.59所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.111所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.119所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.51所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.60所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.111所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.120所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.52所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.58所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.112所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.118所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.52所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.59所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.112所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.119所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.52所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.60所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.112所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.120所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.53所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.58所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.113所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.118所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.53所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.59所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.113所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.119所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.53所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.60所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.113所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.120所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.54所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.58所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.114所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.118所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.54所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.59所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.114所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.119所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.54所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.60所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.114所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.120所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.55所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.58所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.115所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.118所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.55所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.59所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.115所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.119所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.55所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.60所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.115所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.120所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.56所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.58所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.116所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.118所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.56所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.59所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.116所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.119所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.56所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.60所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.116所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.120所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.57所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.58所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.117所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.118所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.57所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.59所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.117所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.119所示的序列；
或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.57所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.60所示的序列；更佳地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.117所示的序列，且所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.120所示的序列；
综上所述，本发明的较佳实例抗体氨基酸序列的编号如表1和2所示：
表1-1 IL-13抗体的氨基酸序列编号
表1-2 IL-13抗体的氨基酸序列编号
表1-3 IL-13抗体的氨基酸序列编号
表1-4 IL-13抗体的氨基酸序列编号
表2.人源化IL-13抗体蛋白序列编号
其中，表1\2中的数字即为序列表“SEQ ID No.”编号，如c29D9H8的重链蛋白可变区的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.1，而c29D9H8的轻链蛋白可变区的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.5。
4)所述的人源化抗IL-13抗体，较佳地为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(Single chain antibody fragment，scFv)、单域抗体(Single domain antibody，sdAb)和单区抗体(Signle-domain antibody)中的一种或多种，以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。本发明还包括超人源化抗体、双抗体(diabody)等。
所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。
较佳地，所述的人源化抗IL-13抗体还包括人源抗体重链恒定区和/或人源抗体轻链恒定区。所述的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成人源化抗体全长蛋白。其中所述的人源化抗体重链恒定区为本领域常规，可以包含衍生自人恒定区的恒定区，其进一步包含人源IgG1，IgG2，IgG3，IgG4或其变体的重链恒定区；所述的人源化抗体轻链恒定区为本领域常规，可以包含衍生自人恒定区的恒定区，其进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。
所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括所述的重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。
所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为本领域常规的抗原抗体结合域蛋白质片段，其包括轻链可变区、轻链恒定区和重链恒定区的Fd段。较佳地，所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为Fab和F(ab’)2。
所述的单域抗体为本领域常规的单域抗体，其包括重链可变区和重链恒定区。
所述的单区抗体为本领域常规的单区抗体，其仅包括重链可变区。
其中，所述人源化抗IL-13抗体的制备方法为本领域常规的制备方法。所述制备方法较佳地为：从重组表达该人源化抗IL-13抗体的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。所述的从重组表达该人源化抗IL-13抗体的表达转化体中分离获得优选如下方法：将编码所述人源化抗IL-13抗体的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，即可分离纯化获得所述人源化抗IL-13抗体。本发明的代表性人源化抗IL-13抗体的制备在实施例10中得到描述。
人源化抗体广义上也是一类嵌合抗体，其中负责抗原结合的可变区残基，包括衍生自非人物种的互补决定区、缩短的互补决定区、或参与抗原结合的任何其它残基；而其余可变区残基如，框架区的残基和恒定区至少部分衍生自人抗体序列。人源化抗体的框架区残基和恒定区残基的一个子集可以衍生自非人来源。人源化抗体的可变区也描述为人源化的轻链可变区和/或重链可变区。非人物种一般是用于由抗原免疫接种的物种，例如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类、或其他非人哺乳动物物种。人源化抗体一般比传统嵌合抗体的免疫原性小，并且在给人施用后显示出改善的稳定性。
互补决定区(CDRs)是参与抗原结合的抗体可变区的残基。用于标识CDRs的几种编号系统是常用的，包括例如Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。概括地说，Kabat定义是基于序列的变异性、Chothia定义是基于结构环区的位置，AbM定义是Kabat和Chothia方法之间的折中。根据Kabat、Chothia或AbM算法，轻链可变区有三个CDR区，其CDR1位于由第24-34位氨基酸(CDR1-L)、CDR2位于第50-56位氨基酸(CDR2-L)、CDR3位于第89-97位氨基酸(CDR3-L)。由于可变区的长度变化，在不同的中枢或不同的亚群中，第27位可有1-6个氨基酸，第95位也可有1-6个氨基酸，它们在原编号的基础上加上英文字母进行编位，如：27A、27B、95A、95B等。根据Kabat定义，重链可变区的CDRs由在第31和35B位(CDR1-H)、第50和65位(CDR2-H)、以及第95和102位(CDR3-H)的残基界定(根据Kabat编号)。根据Chothia定义，重链可变区的CDRs由第26和32位(CDR1-H)、第52和56位(CDR2-H)、以及第95和102位(CDR3-H)上的残基界定(根据Chothia编号)。根据AbM定义，重链可变区的CDRs由26和35B位(CDR1-H)、第50和58位(CDR2-H)、以及第95和102位(CDR3-H)的残基界定(根据Kabat编号)。与轻链可变区类似，在第35位、52位、82位及100位也可有多个氨基酸，以A、B、C……等编号。参见Martin等人(1989)Proc.Nat l.Acad.Sci.USA 86:9268-9272；
Martin等人(1991)Methods Enzymol.203:121-153；Pedersen等人(1992)lmmunomethods 1:126；Protein Structure Prediction,Oxford University Press,Oxford,第141-172页。
在本发明的优选例中，各CDR区是用Kabat定义的。
特异性决定区(SDRs)是与抗原直接相互作用的CDRs内的残基。SDRs对应高变残基。参见Padlan等人(1995)FASEB J.9:133-139)。
框架(构架)残基是轻链可变区或重链可变区的一部分，是除高变残基(高变残基多指互补决定区或CDR)或CDR残基外的抗体可变区残基，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。构架残基可以衍生自天然存在的人的抗体，还可以使用代表个体序列之间的共有序列的人工框架区序列。当选择用于人源化的框架区时，在人类中广泛呈现的序列可能优于较不常见的序列。可以制备人构架受体序列的另外突变，以恢复被认为涉及抗原接触的鼠类残基和/或涉及抗原结合位点的结构完整性的残基，或改善抗体表达。肽结构预测可以用于分析人源化重链可变区和轻链可变区序列，以鉴定和避免由人源化设计引入的翻译后蛋白质修饰位点。
所述的人源化抗体可以使用各种方法中的任何一种进行制备，包括互补决定区(CDRs)的镶饰、移植、缩短的CDRs的移植、特异性决定区(SDRs)的移植、和Frankenstein装配。
所述的人源化抗体还包括超人源化抗体，它是一种人源化抗体的制备方法，此方法不依赖于将人构架序列作为分析点，而是依赖于比较非人抗体的规范CDR结构类型和人抗体的CDR结构类型，尤其是人胚系序列所编码的人抗体，从中识别出可以得到适宜的人构架序列的候选的人抗体序列。例如，人残基可以置换CDRs中的非人残基，其中一个或多个变化已引入CDRs中。镶饰(veneering)的一个前提是鼠源抗体可变区的免疫原性起源于它的表面残基，且残基的运动性和溶剂的可及性是其成为抗原决定簇的基本条件。根据对现有的抗体晶体结构数据的分析结果统计，在序列配对位置上，人和鼠的抗体可变区残基的相对溶剂可及性分布的保真度达98％，这说明在异种间诱导免疫反应的残基是由其余的种特异性溶剂可及表面残基引起的。因此将鼠特异性表面残基换成人源性的，就可以模拟人源抗体的表面轮廓，逃避人体免疫系统的识别，达到人源化的目的。简单来说，镶饰基于通过用人氨基酸序列重建抗体的溶剂可及的表面来减少在啮齿类动物或其他非人抗体中的潜在免疫原性的氨基酸序列的概念。参见Padlan(1991)Mol.Immunol.28:489-980.通过鉴定非人抗体中暴露在表面的溶剂可及性残基的外部框架区残基(所述残基不同于人抗体的框架区中相同位置上的那些残基)，并用占据人抗体中的那些相同位置的氨基酸替换所鉴定的残基，以进行镶饰，即镶饰的抗体，其表面残基主要是人源序列，而包裹在内部的残基主要是最初的鼠源序列。CDRs的移植通过用供体抗体(如，非人抗体)的CDRs替换受体抗体(例如，包含所需构架残基的人抗体或其他抗体)的一个或多个CDRs来进行。受体抗体可以基于在候选受体抗体和供体抗体之间的构架残基的相似性进行选择。例如，根据Frankenstein方法，鉴定与相关的非人抗体的各框架区具有实质上的序列同源性的人框架区，并且将非人抗体的CDRs移植到这些不同的人框架区的复合物上。可以结合上述方法，以产生任何所需序列的抗IL-13抗体。
5)本发明还提供一种核酸，其编码上述的人源化抗IL-13抗体，包括编码所述重链可变区的核酸，和/或编码所述轻链链可变区的核酸。
较佳地，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1、SEQID No.9、SEQ ID No.17、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQID No.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56或SEQ ID No.57所示；所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.5、SEQ ID No.13、SEQID No.21、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.43、SEQID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQID No.58、SEQ ID No.59或SEQ ID No.60所示；更佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No.61、SEQ ID No.69、SEQ ID No.77、SEQ ID No.85、SEQID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQID No.96、SEQ ID No.97、SEQ ID No.98、SEQ ID No.99、SEQ ID No.100、SEQ ID No.101、SEQ ID No.102、SEQ ID No.110、SEQ ID No.111、SEQ ID No.112、SEQ ID No.113、SEQ IDNo.114、SEQ ID No.115、SEQ ID No.116或SEQ ID No.117所示；编码所述的轻链可变区的核酸的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No.65、SEQ ID No.73、SEQ ID No.81、SEQ IDNo.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ ID No.95、SEQ ID No.103、SEQ ID No.104、SEQID No.105、SEQ ID No.106、SEQ ID No.107、SEQ ID No.108、SEQ ID No.109、SEQ IDNo.118、SEQ ID No.119或SEQ ID No.120所示。
进一步更佳地，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.26所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.33所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.86所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.93所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.26所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.34所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.86所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.94所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.26所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.35所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.86所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.95所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.27所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.32所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.87所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.92所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.27所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.33所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.87所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.93所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.27所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.34所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.87所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.94所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.27所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.35所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.87所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.95所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.28所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.32所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.88所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.92所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.28所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.33所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.88所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.93所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.28所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.34所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.88所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.94所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.28所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.35所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.88所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.95所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.29所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.32所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.89所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.92所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.29所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.33所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.89所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.93所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.29所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.34所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.89所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.94所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.29所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.35所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.89所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.95所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.30所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.32所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.90所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.92所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.30所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.33所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.90所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.93所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.30所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.34所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.90所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.94所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.30所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.35所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.90所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.95所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.31所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.32所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.91所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.92所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.31所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.33所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.91所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.93所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.31所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.34所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.91所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.94所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.31所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.35所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.91所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.95所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.37所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.43所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.97所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.103所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.37所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.44所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.97所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.104所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.37所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.45所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.97所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.105所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.37所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.46所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.97所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.106所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.37所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.47所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.97所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.107所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.37所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.48所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.97所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.108所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.37所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.49所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.97所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.109所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.38所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.43所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.98所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.103所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.38所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.44所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.98所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.104所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.38所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.45所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.98所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.105所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.38所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.46所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.98所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.106所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.38所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.47所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.98所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.107所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.38所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.48所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.98所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.108所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.38所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.49所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.98所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.109所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.39所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.43所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.99所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.103所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.39所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.44所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.99所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.104所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.39所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.45所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.99所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.105所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.39所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.46所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.99所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.106所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.39所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.47所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.99所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.107所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.39所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.48所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.99所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.108所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.40所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.43所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.100所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.103所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.40所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.44所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.100所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.104所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.40所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.45所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.100所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.105所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.40所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.46所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.100所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.106所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.40所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.47所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.100所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.107所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.41所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.43所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.101所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.103所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.41所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.44所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.101所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.104所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.41所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.45所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.101所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.105所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.41所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.46所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.101所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.106所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.42所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.43所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.102所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.103所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.42所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.44所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.102所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.104所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.42所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.45所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.102所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.105所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.42所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.46所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.102所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.106所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.51所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.58所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.111所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.118所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.51所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.59所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.111所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.119所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.51所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.60所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.111所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.120所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.52所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.58所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.112所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.118所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.52所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.59所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.112所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.119所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.52所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.60所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.112所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.120所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.53所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.58所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.113所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.118所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.53所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.59所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.113所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.119所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.53所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.60所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.113所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.120所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.54所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.58所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.114所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.118所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.54所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.59所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.114所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.119所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.54所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.60所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.114所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.120所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.55所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.58所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.115所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.118所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.55所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.59所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.115所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.119所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.55所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.60所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.115所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.120所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.56所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.58所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.116所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.118所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.56所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.59所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.116所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.119所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.56所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.60所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.116所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.120所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.57所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.58所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.117所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.118所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.57所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.59所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.117所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.119所示；
或者，所述重链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.57所示，且所述轻链可变区的核酸编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.60所示；较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.117所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.120所示；
上述抗体的核苷酸序列的编号如表3-4所示：
表3-1 IL-13抗体的核苷酸序列编号
表3-2 IL-13抗体的核苷酸序列编号
表3-3 IL-13抗体的核苷酸序列编号
表3-4IL-13抗体的核苷酸序列编号
表4.人源化IL-13抗体核苷酸序列编号
其中，表3-4中的数字即为序列表“SEQ ID No.”编号，如编码c29D9H8的重链蛋白可变区的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.61，而编码c29D9H8的轻链蛋白可变区的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.65。
所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地，包括以下的步骤：通过基因克隆技术获得编码上述人源化抗IL-13抗体的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述人源化抗IL-13抗体的核酸分子。
本领域技术人员知晓，编码上述人源化抗IL-13抗体的核酸可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该人源化抗IL-13抗体的核酸的一个或多个核苷酸在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
本发明还提供一种包含所述核酸的重组表达载体。其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载前述核酸分子即可。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。
本发明还提供一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。其中，所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。较佳地，所述宿主细胞为E.coli TG1或BL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体)，或者CHO-K1细胞(表达全长IgG抗体)。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
本发明提供一种人源化抗IL-13抗体的制备方法，其包括如下步骤：培养上述的重组表达转化体、或者细胞、或者细胞系，从培养物中获得人源化抗IL-13抗体。
本发明还提供一种检测过表达IL-13蛋白的细胞的方法，包括如下的步骤：上述的蛋白质与待检样品在体外接触，检测上述的蛋白质与所述待检样品的结合即可。
所述的过表达的含义为本领域常规，指IL-13蛋白在待检样品中的RNA或蛋白质的过表达(由于转录增加、转录后加工、翻译、翻译后加工以及蛋白质降解改变)，以及由于蛋白质运送模式改变(核定位增加)而导致的局部过表达和功能活性提高(如在底物的酶水解作用增加的情况下)。
所述结合的检测方式是本领域常规的检测方式，较佳地为FACS检测。
本发明提供一种检测过表达IL-13蛋白的细胞的组合物，其包括上述的蛋白质作为活性成分。较佳地，其还包括上述的蛋白质的功能片段组成的化合物作为活性成分。
本发明提供上述蛋白质在制备药物中的应用。较佳地，所述的药物是用于预防或治疗支气管哮喘的药物。
本发明还提供一种药物组合物，其活性成分包括上述的蛋白质。较佳地，所述的药物组合物是用于预防或治疗支气管哮喘的药物组合物。
本发明所述的药物组合物的给药途径较佳地为注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳地为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。
较佳地，本发明所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。所述的药用载体为本领域常规药用载体，所述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳的包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述蛋白质和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
较佳地，所述的药物组合物的施用量为有效量，所述有效量为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定，并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。本领域技术人员可以通过使用个体基础等上述因素和使用不超过常规的实验来确定有效量。
本发明提供上述蛋白质在制备预防或治疗IL-13表达或功能异常相关疾病的药物中的应用。
本发明中，所述IL-13表达或功能异常相关疾病为本领域常规的IL-13表达或功能异常相关疾病。较佳地，为支气管哮喘。
本发明提供上述药物组合物在制备预防或治疗IL-13表达或功能异常相关疾病的药物中的应用。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件(例如商品说明书)。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例中所述的室温为本领域常规的室温，一般为20-25℃。
实施例中若无特别说明，所述的PBS缓冲液为PBS磷酸缓冲液，pH7.4。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明所述的蛋白质，即提供的IL-13抗体亲和力高，与人IL-13的亲和力达到KD<1×10-8M；
(2)在IL-13诱导胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌试验中，能明显抑制IL-13诱导的分泌；
(3)在IL-13诱导的骨膜蛋白(Periostin)分泌试验中，能明显抑制IL-13诱导的分泌；
(4)在IL-13诱导的人脐带静脉内皮细胞表达血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)，能明显抑制IL-13诱导的表达；
(5)在以流式细胞分析建立的受体-配体结合阻滞实验中，抑制IL-13与其配体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合；
(6)在以流式细胞分析建立的受体-配体结合阻滞实验中，抑制IL-13与其配体IL-13Ra2的结合；
(7)在IL-13诱导的小鼠气道炎症的动物模型中，能明显抑制小鼠气道呼吸炎症，抑制IL-13诱导的小鼠气道高反应性；
(8)在IL-13诱导的小鼠肺杯状细胞化生及黏液过度分泌的动物模型中，能明显抑制小鼠肺中杯状细胞化生及，抑制IL-13诱导的小鼠肺部粘液分泌；
(9)本发明所述的蛋白质，有望提供的IL-13抗体能够应用于制备预防或治疗支气管哮喘的药物。
实施例1：人IL-13和人IL-13R130Q变体的表达与纯化
1.免疫原A和人IL-13R130Q变体的制备
将编码人IL-13蛋白氨基酸序列(参见GenBank数据库，登录号：AAK53823.1)中Met1-Asn132的核苷酸序列的3’端加入编码六个组氨酸的核苷酸，得编码his标签重组人IL-13蛋白的核苷酸序列(如序列表SEQ ID No.121所示)。
或者，将编码人IL-13蛋白变体IL-13R130Q氨基酸序列中Met1-Asn132的核苷酸序列的3’端加入编码六个组氨酸的核苷酸，得编码his标签的重组人IL-13R130Q变体的核苷酸序列(如序列表SEQ ID No.122所示)。
将编码his标签重组人IL-13蛋白的核苷酸序列和编码his标签的重组人IL-13R130Q变体的核苷酸序列分别克隆到PCP载体(购自Invitrogen)并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒，具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press)。对FreeStyle 293F细胞(购自Invitrogen)进行瞬时转染(PEI，Polysciences)并使用FreeStyle TM 293(Invitrogen)在37℃下进行扩大培养。5-7天后收集细胞培养液，离心去除细胞成分，得含his标签的人IL-13的培养上清液，或含his标签的人IL-13R130Q变体的培养上清液。将上述培养上清液分别上样到Ni-NTA亲和层析柱(购自GE)，纯化上清液中his标签的人IL-13(即免疫原A)和含his标签的人IL-13R130Q变体，再使用分子筛柱(购自GE)进行进一步纯化，除去大分子聚合体等杂质。纯化后的免疫原A和含his标签的人IL-13R130Q变体保存在PBS磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，经0.22μm无菌滤膜过滤后分装于-80℃保存。
将纯化的免疫原A进行TARC分泌试验。TARC分泌试验的具体方法参照Miller etal.2008,J Immunol Methods 334(1-2):134-41。
将A549细胞(购自ATCC)培养在含有10％(w/w)胎牛血清F-12k培养基(购自Gibco)中，待其在T-175细胞培养瓶中扩大培养至75-90％汇合度时，弃去培养基，用PBS缓冲液洗涤1-2次，然后用胰蛋白酶溶液(Trypsin-EDTA，购自Life technology)消化并收集细胞。将收集到的细胞重悬与培养基中，计数后将细胞稀释至2×106个细胞/mL，按照每孔细胞100μL加到96孔细胞培养板中(每孔2×105个细胞)，将培养板置于37℃，5％(v/v)CO2培养箱培养过夜。第二日，将梯度稀释的免疫原A与重组人TNFα(购自Peprotech)混合得混合物Ⅰ(其中，TNFα占混合物Ⅰ的终浓度为200ng/mL)。将过夜培养的细胞培养板弃去培养上清，加入上述混合物Ⅰ，将细胞培养板放在37℃、5％(v/v)CO2培养箱培养过夜。20小时后，吸出板中的培养上清液，离心去除细胞，用TARC ELISA试剂盒(购自RnD systems)检定培养上清液中TARC的浓度。实验操作按照试剂盒说明书要求进行。
具体实验简述如下：将鼠抗人TARC抗体用PBS稀释至2μg/mL，然后按照100μL每孔加到96孔酶标板。4℃孵育过夜；第二天用洗板液[含有0.05％(w/w)Tween20的PBS缓冲液]洗板2次后，加入样品稀释液[含有1％(w/w)BSA的PBS缓冲液]300μL每孔室温封闭1小时；弃去封闭液，将标准品用样品稀释液稀释至500pg/mL，再倍比稀释六个点，用样品稀释液作为空白对照，同时将培养上清液用样品稀释液稀释8倍。按照每孔100μL将标准品和样品加入酶标板，室温孵育2小时。用洗板液洗板2-3次。将生物素标记的羊抗人TARC抗体用样品稀释液稀释至终浓度0.5ng/mL，按照每孔100微升加入酶标板。室温孵育2小时；将辣根过氧化物酶标记(HRP)的链霉亲和素用样品稀释液稀释至体积比为1:200后按照每孔100μL加入酶标板，室温孵育30分钟后，用洗板液洗板2-3次。加入TMB底物(购自湖州英创)每孔100μL，室温孵育15分钟后，每孔加入50μL终止液(1.0N HCl)。用ELISA读板机(SpectraMax M5e，购自Molecular Device)读取OD450nm值，并以OD540nm值作为背景计算光吸值，计算出培养上清液中的TARC浓度。部分实验结果见图1和表5。表5说明，免疫原A可以刺激A549细胞分泌胞胸腺活化调节趋化因子(TARC)，且免疫原A所具有的生物学活性与商业化蛋白的生物学活性基本一致。
表5 TARC分泌试验检验IL-13蛋白的生物学活性
其中，IL-13(Sino生物)指商业化的IL-13蛋白，购自Sino biological，作为阳性对照；IL-13(批次1)即为上述免疫原A。
2.免疫原A的生物素标记
将Biotin-X-X-NHS(购自SIGMA-ALDRICH)和实施例1制备的纯化的免疫原A按摩尔比3:1的比例混合，室温下振荡反应30分钟后，加入终浓度为50mM的NH4Cl终止反应，得生物素标记的免疫原A。然后将生物素标记的免疫原A透析到PBS缓冲液(pH7.4)中，用Broadford试剂(购自Pierce)，以BSA作为标准品测定浓度(具体操作方法参见Bradford，1976，AnalBiochem 72:248-54)。实验结果见表6。利用标准品拟合曲线，生物素标记的免疫原A测定的OD595nm值为0.49。经计算，生物素标记的免疫原A的浓度为0.319mg/mL。
表6生物素标记的免疫原A的浓度的测定
将生物素标记的免疫原A用0.22μm无菌滤膜过滤后无菌分装，再置于-80℃保存。
实施例2：利用杂交瘤技术获得先导抗体
1.小鼠免疫
使用免疫原A免疫。采用的是6-8周龄的Balb/c，SJL/J小鼠(上海斯莱克提供)。小鼠接收后在Specific pathogen Free(SPF)条件下饲养。初次免疫剂量为每只小鼠50μg免疫原A。将蛋白用弗氏完全佐剂乳化后尾部皮下注射0.25mL。初次免疫2周后，加强免疫。免疫原A(每只小鼠25μg)用弗氏不完全佐剂乳化后腹腔注射0.25mL。以后每次加强免疫间隔3周。每次加强免疫一周后采集血清样品，用ELISA检测血清中抗体效价并用受体配体结合阻滞实验检测血清中抗体的活性。血清效价较高且可以更好阻滞免疫原A与受体结合的小鼠将优先选择用于细胞融合和杂交瘤细胞制备，剩余小鼠继续加强免疫备用。部分实验结果见图2和表7所示。表7说明，经免疫原A免疫的小鼠的血清对免疫原A均有不同程度的结合，呈现抗原抗体反应。其中，血清的最高稀释度(即稀释倍数)在十万左右。表7中空白对照指1％(w/w)BSA，批次TB2指第二次加强免疫后第七天的小鼠血清，表中的数据为OD450nm值。
表7 ELISA检测免疫原A免疫后小鼠血清抗体效价
使用基因免疫。将实施例1中构建的表达重组人IL-13蛋白的PCP表达载体包被到1.0μm金胶体子弹上，用Helios基因枪(Bio-rad)免疫。金胶体子弹制备和免疫程序根据Helios基因枪说明书进行制定。6-8周龄雌性SJL/J小鼠(上海斯莱克提供)接收后在SPF条件下饲养。所有小鼠经腹部用基因枪免疫3-4次，每次3-4枪，每枪1.0μg质粒。初次免疫与第一次加强免疫之间隔2周，以后每次加强免疫间隔3周。每次加强免疫7天后采集血清样品，用ELISA检测血清中抗体效价并用受体配体结合阻滞实验检测血清中抗体的活性。血清效价较高且可以更好阻滞重组人IL-13蛋白与受体结合的小鼠将优先选择用于细胞融合和杂交瘤细胞制备，剩余小鼠继续加强免疫备用。
2.杂交瘤细胞的制备和先导抗体筛选
通常大部分使用免疫原A免疫的小鼠经2-3次免疫后效价可达到1:1000以上，即可用于收集淋巴细胞进行细胞融合和杂交瘤制备。
细胞融合前，小鼠最后一次免疫用每只50-100μg免疫原A腹腔注射。3-5天后处死小鼠，收集脾细胞。加入NH4OH至终浓度1％(w/w)以裂解脾细胞悬液中的红细胞，用DMEM基础培养基离心清洗细胞2-3次，然后按细胞数5:1的比率与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合(购自ATCC)，采用传统的PEG细胞融合方法或高效电融合方法进行细胞融合(参见METHODS INENZYMOLOGY,VOL.220)，得融合后的细胞，即为杂交瘤细胞。
将融合后的细胞稀释到含20％(w/w)胎牛血清、1×HAT的DMEM选择性培养基中，按1×105/20μL每孔加入到96孔细胞培养板中，放入5％(v/v)CO2、37℃培养箱中。10-14天后用ELISA筛选细胞融合板上清，将ELISA中OD450nm>1.0的阳性克隆扩增到24孔板扩大培养，2-3天后对24孔板上清复检，包括利用ELISA检测上清中的抗体对免疫原A的结合活性、利用流式细胞技术检测上清中的抗体阻滞人IL-13与受体结合活性以及利用A549胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌试验检验上清中的抗体中和免疫原A的生物学活性。挑选ELISA实验中OD450nm>1.0、受体配体结合阻滞实验中杂交瘤细胞培养上清对人IL-13与hIL-13Ra/hIL-4R异源二聚体和/或人IL-13与hIL-13Ra2受体结合的阻滞率达到60％，和/或A549胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌试验中杂交瘤上清中和人IL-13诱导TARC分泌，抑制率达到60％的杂交瘤细胞为符合条件的阳性克隆。
根据24孔板样品的筛选结果，选择符合条件的阳性克隆用有限稀释法在96孔板进行亚克隆，即在含10％(w/w)FBS的DMEM培养基中(购自invitrogen)37℃，5％(v/v)CO2的条件下培养上述阳性克隆。亚克隆后7-10天用ELISA进行初步筛选，挑选3-4个阳性单克隆扩增到24孔板继续培养。2-3天后对上清按照亚克隆之间的检验方法进行复检，包括ELISA，受体配体结合阻滞实验，胸腺活化调节趋化因子分泌试验。根据24孔板样品检测结果，挑选最优亚克隆进行扩大培养、液氮冻存、抗体生产和纯化，作为先导抗体。这些先导抗体的克隆号分别为29D9H8、28A2E11和35E2C3。
实施例3：小鼠杂交瘤细胞单克隆抗体的生产和纯化
杂交瘤细胞产生的抗体浓度较低，大约仅1-10μg/mL，浓度变化较大。且培养基中细胞培养所产生的多种蛋白和培养基所含胎牛血清成分对很多生物活性分析方法都有不同程度的干扰，因此需要进行小规模(1-5mg)抗体生产纯化。
将实施例2制备的杂交瘤细胞扩增到T-75细胞培养瓶并用生产培养基(Hybridomaserum free medium，购自Invitrogen)驯化传代2-3代。待杂交瘤细胞生长状态良好，接种细胞培养转瓶。每个2升的培养转瓶中加入200-500mL生产培养基，接种细胞密度为0.5-1.0×105个/mL。盖紧瓶盖，将转瓶置于37℃培养箱中的转瓶机上，调到转速3转/分钟。连续旋转培养10-14天后，收集细胞培养液，离心或过滤去除细胞，并用0.22-0.45μm的滤膜过滤。处理后的细胞培养上清可马上进行纯化或-30℃冻存。
杂交瘤细胞培养上清中的单克隆抗体可用蛋白G亲和层析(Protein G，蛋白G柱)柱进行纯化。根据样品量的大小，准备相应的体积的层析柱。对于200-300mL的小体积纯化，需要1-2mL的蛋白G柱。蛋白G柱先用平衡缓冲液(PBS缓冲液，pH7.4)平衡，然后将培养上清上样至蛋白G柱，控制流速在3-4mL/分钟。上样完毕，用平衡缓冲液清洗层析柱3-5柱床体积。用洗脱液(0.1M甘氨盐酸缓冲液，pH2.5)洗脱结合在柱上的抗体，用紫外检测器监测洗脱情况。收集洗脱的抗体(根据A280紫外吸收峰)，加入10％(v/v)的1.0M Tris-HCl缓冲液中和pH，然后立即用PBS缓冲液透析过夜，第二天换液一次，并继续透析2-3小时。收集透析后的抗体，用0.22μm的滤器进行无菌过滤，即得IL-13单克隆抗体，将其无菌保存。分装小样进行蛋白浓度、纯度、内毒等检测分析。检测发现，IL-13单克隆抗体的内毒素浓度小于3.0EU/mg。它们的部分检测分析结果参见表8。
表8抗体检测分析
实施例4：先导抗体的检定
将实施例3获得的先导抗体分别进行如下的检定试验。
A、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测先导抗体与免疫原A、IL-13R130Q变体、猴IL-13以及鼠IL-13的结合
将链霉亲和素用PBS稀释到终浓度1.0μg/mL，然后按照100微升每孔加到96孔酶标板。4℃孵育过夜；第二天用洗板液[含有0.05％(w/w)Tween20的PBS缓冲液]洗板2次，加入封闭液[含有0.05％(w/w)Tween20和2％(w/w)BSA的PBS缓冲液]37℃封闭1-2小时。弃去封闭液，将实施例1制备的生物素标记的免疫原A、IL-13R130Q变体(实施例1制备)、猴IL-13(购自sino biological)和鼠IL-13(购自sino biological)分别用样品稀释液[含有0.05％(w/w)Tween20和0.2％(w/w)BSA的PBS缓冲液]稀释至0.5μg/mL，按照每孔50-100μL加入酶标板，37℃孵育1小时。用洗板液[含有0.01％(w/w)Tween20的PBS缓冲液]洗板2-3次。分别加入梯度稀释的实施例3制备的先导抗体每孔50-100μL，37℃孵育1小时后，用洗板液洗板2-3次。加入辣根过氧化物酶标记(HRP)的人或小鼠IgG二抗(购自Sigma)，37℃孵育1小时后，再用洗板液[含有0.05％(w/w)Tween20的PBS缓冲液]洗板2-3次。加入100μL/孔TMB底物，室温孵育15分钟后，每孔加入50μL 1.0N HCl终止。用ELISA读板机(SpectraMax M5e，购自Molecular Device)读取OD450nm值。部分实验结果见图3～6和表9～11所示。表9～11说明，先导抗体与重组人IL-13蛋白，重组人IL-13R130Q变体，重组猴IL-13在ELISA水平结合。但与小鼠IL-13没有结合。其中IgG对照为鼠IgG，表中的数据为OD450nm值。
表9 ELISA检测先导抗体与免疫原A的反应活性
表10 ELISA检测先导抗体与猴IL-13变体的反应活性
表11 ELISA检测先导抗体与鼠IL-13变体的反应活性
B、受体配体结合阻滞实验
1.稳定表达细胞株的构建：
将人IL-13Ra1、人IL-13Ra2和人IL-4Ra全长基因的核苷酸序列(如序列表SEQ IDNo.123～125所示)分别克隆到pIRES表达载体上，并包装成慢病毒(pIRES表达载体和慢病毒均购自上海吉玛制药技术有限公司，并按照说明书进行操作)，对HEK293细胞分别进行慢病毒感染。人IL-13Ra1和人IL-4Ra基因被共同转染至同一HEK293细胞株，以在其表面形成IL-13Ra1/IL-4Ra异原二聚体，感染后将细胞在含100μg/mL Hygromycin B(购自MILLIPORE)和0.25μg/mL Puromycin(购自Invitrogen)中的一种或两种和10％(w/w)胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5％(v/v)CO2下选择培养2周。2周后用有限稀释法将感染后的细胞亚克隆到96孔培养板中。待克隆长大后，将单克隆孔细胞扩增到6孔板中或培养瓶中，得过表达全长人IL-13Ra1和人IL-4Ra的HEK293细胞株。对扩增后的克隆用抗每种受体对应的特异性抗体(hIL-13Ra1抗体、hIL-4Ra抗体、hIL-13Ra2抗体均购自RnD systems)经流式细胞分析法检测受体表达水平，及与配体IL-13蛋白的结合能力。选择长势较好、表达水平较高、结合强的单克隆的细胞系继续扩大培养并液氮冻存。用包含人IL-13Ra2基因的慢病毒颗粒感染HEK293细胞，按照同样的方法筛选选择长势较好、表达水平较高、结合强的单克隆的细胞系扩大培养并于液氮中保存，得过表达全长人IL-13Ra2的HEK293细胞株。部分实验结果见图7～9和表12～14。表12～14的结果说明，HEK293细胞克隆4C1表面同时表达hIL-13Ra1和hIL-4Ra两个受体，HEK293细胞克隆1A1表达hIL-13Ra2受体，且细胞表面受体表达量均较高，可以用作后续试验使用。
表12流式细胞分析方法检测过表达全长人IL-13Ra1的HEK293细胞株中hIL-13Ra1蛋白的表达水平
表13流式细胞分析方法检测过表达全长人IL-4Ra的HEK293细胞株中hIL-4Ra蛋白的表达水平
表14流式细胞分析方法检测过表达全长人IL-13Ra2的HEK293细胞株中hIL-13Ra2蛋白的表达水平
2.利用流式细胞技术的受体配体结合阻滞实验
将实施例4实验B中步骤1.所得的过表达全长人IL-13Ra1和人IL-4Ra的HEK293细胞株克隆4C1和过表达全长人IL-13Ra2的HEK293细胞株克隆1A1在T-175细胞培养瓶中扩大培养至75-90％汇合度弃去培养基。其中，扩大培养的培养基为含100μg/mL Hygromycin B(购自MILLIPORE)和0.25μg/mL Puromycin(购自Invitrogen)中的一种或两种和10％(w/w)胎牛血清的DMEM培养基。扩大培养的条件为37℃、5％(v/v)CO2下培养。用PBS缓冲液洗涤1-2次，然后用重组酶细胞解离液(TrypLE，购自Life technology)消化并收集细胞；用PBS缓冲液洗涤细胞1-2次，进行细胞计数后将细胞用封闭液[含有2％(w/w)胎牛血清的PBS缓冲液]稀释至1-2×106个细胞/mL，冰上孵育20-30分钟，然后用封闭液[含有2％(w/w)胎牛血清的PBS缓冲液]洗涤2次。将收集的细胞用封闭液悬浮至1×106个细胞/mL，按每孔100μL加入到96孔FACS反应板中(即每孔1×105个细胞)。
将梯度稀释的实施例3制备的先导抗体(以下统称“先导抗体”)与实施例1制备的生物素标记的免疫原A混合后，按照每孔100μL加入细胞中，冰上孵育1-2小时。其中，对实施例4试验B步骤1.所得的过表达全长人IL-13Ra1和人IL-4Ra的HEK293细胞株，加入梯度稀释的先导抗体和终浓度为30ng/mL的生物素标记的免疫原A；对过表达全长人IL-13Ra2的HEK293细胞株，加入梯度稀释的先导抗体和终浓度为20ng/mL的生物素标记的免疫原A。用封闭液离心洗涤2次，加入每孔100μL荧光(Alexa 488)标记的链霉亲和素(购自Lifetechnology，货号S11223)，冰上孵育0.5-1.0小时。用封闭液离心洗涤2-3次，加入每孔100μL PBS缓冲液悬浮细胞，用FACS(FACS Verse，购自BD)检测和分析结果。部分实验结果见图10～11和表15～16，表15～16说明，IL-13抗体与人IL-13结合后，能阻滞人IL-13与细胞表面的受体人IL-13Ra1/hIL-4Ra异源二聚体的结合，或者能阻滞IL-13与细胞表面人IL-13Ra2受体的结合。其中IgG对照为鼠IgG，表格中数据为平均荧光强度。
表15 FACS检测检测先导抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合
表16 FACS检测检测先导抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合
C、胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌试验
将A549细胞(购自ATCC)培养在含有10％(w/w)胎牛血清F-12k培养基(购自Gibco)中于37℃、5％(v/v)CO2培养，待其在T-175细胞培养瓶中扩大培养至75-90％汇合度时，弃去培养基，用PBS缓冲液洗涤1-2次，然后用胰蛋白酶溶液(Trypsin-EDTA，购自Lifetechnology)消化并收集细胞。将收集到的细胞重悬于培养基中，计数后将细胞稀释至2×106个细胞/mL，按照每孔细胞100μL加到96孔细胞培养板中(每孔2×105个细胞)，将培养板置于37℃、5％(v/v)CO2培养箱培养过夜。第二日，将梯度稀释的实施例3制备的先导抗体与实施例1制备的免疫原A混合得混合物A；将重组人TNFα(购自Peprotech)用含有10％(w/w)胎牛血清F-12k培养基等体积混合得混合物B于培养基中。其中，混合后的重组人TNFα在混合物B的终浓度为200ng/mL。弃去培养过夜的细胞培养板的培养上清后，向该细胞培养板中按照1:1体积比例加入上述混合物A和混合物B。其中，免疫原A占混合物A与混合物B的总体积的终浓度为5ng/mL，重组人TNFα占混合物A和混合物B的总体积的终浓度为200ng/mL。将细胞培养板放在37℃、5％(v/v)CO2培养箱培养过夜。20小时后，吸出板中的培养上清液，离心去除细胞，用TARC ELISA试剂盒(购自RnD systems)检定培养上清液中TARC的浓度。实验操作按照试剂盒说明书要求进行(详见实施例1)。部分实验结果见图12和表17。表17说明，先导抗体通过与人IL-13的结合，能够中和由IL-13和TNFα共同刺激条件下诱导产生的A549细胞分泌TARC。表17的数据为培养上清中TARC的浓度(pg/ml)，其中IgG对照为鼠IgG。
表17先导抗体中和IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子分泌
实施例5：轻重链可变区氨基酸序列测定
总RNA分离：将实施例3制得的先导抗体所对应的杂交瘤细胞复苏，培养，离心收集1-5×107个细胞，加入1mL Trizol混匀并转移到1.5mL离心管中，室温静置5分钟。加0.2mL氯仿，振荡15秒，静置2分钟后于4℃，12000g离心5分钟，取上清转移到新的1.5mL离心管中。加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟后于4℃，12000g离心15分钟，弃上清。加入1mL 75％(v/v)乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，12000g离心5分钟后弃上清，将沉淀物晾干，加入DEPC处理过的H2O溶解(55℃水浴促溶10分钟)，即得总RNA。
逆转录与PCR：取1μg总RNA，配置20μL体系，加入逆转录酶后于42℃反应60分钟，于7℃反应10分钟终止反应。配置50μL PCR体系，包括1μL cDNA、每种引物25pmol、1μL DNA聚合酶以及相配的缓冲体系、250μmol dNTPs。设置PCR程序，预变性95℃3分钟，变性95℃30秒，退火55℃30秒，延伸72℃35秒，35个循环后再额外于72℃延伸5分钟，得PCR产物(其中逆转录所用的试剂盒为PrimeScript RT Master Mix，购自Takara，货号RR036；PCR所用的试剂盒为Q5超保真酶，购自NEB，货号M0492)。
克隆与测序：取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将检测阳性样品使用柱回收试剂盒纯化(其中回收试剂盒为Gel&PCR Clean-up，购自MACHEREY-NAGEL，货号740609)。进行连接反应：样品50ng，T载体50ng，连接酶0.5μL，缓冲液1μL，反应体系10μL，于16℃反应半小时得连接产物(其中连接的试剂盒为T4DNA连接酶，购自NEB，货号M0402)；取5μL连接产物加入100μL的感受态细胞(Ecos 101competent cells，购自Yeastern，货号FYE607)中，冰浴5分钟。而后于42℃水浴热激1分钟，放回冰上1分钟后加入650μL无抗生素SOC培养基，于37℃摇床上以200RPM的速度复苏30分钟，取出200μL涂布于含抗生素的LB固体培养基上于37℃孵箱过夜培养。次日，使用T载体上引物M13F和M13R配置30μL PCR体系，进行菌落PCR，用移液器枪头蘸取菌落于PCR反应体系中吹吸，并吸出0.5μL点于另一块含100nM氨苄青霉素的LB固体培养皿上以保存菌株。PCR反应结束后，取出5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性样品进行测序。其中，测序的步骤参见Kabat，Sequences ofProteins of Immunological Interest，National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)。
结果显示：
所述的29D9H8重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，轻链可变区序列如序列表中SEQ ID NO.5所示。
其中重链可变区的CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1中的第31位至第35位所示，CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1中的第50位至第66位所示，CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1中的第99位至第109位所示；
所述鼠源抗体轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.5中的第24位至第34位所示，CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.5中的第50位至第56位所示，CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.5中的第89位至第97位所示。
所述28A2E11重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.9所示，轻链可变区序列如序列表中SEQ ID NO.13所示。
其中重链可变区的CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.9中的第31位至第35位所示，CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.9中的第50位至第66位所示，CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.9中的第99位至第107位所示；
所述鼠源抗体轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.13中的第23位至第36位所示，CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.13中的第52位至第58位所示，CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.13中的第91位至第99位所示。
所述35E2C3重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.17所示，轻链可变区序列如序列表中SEQ ID NO.21所示。
其中重链可变区的CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.17中的第31位至第35位所示，CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.17中的第50位至第65位所示，CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.17中的第98位至第107位所示；
所述鼠源抗体轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.21中的第24位至第34位所示，CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.21中的第50位至第56位所示，CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.21中的第89位至第97位所示。
核苷酸测序结果：
29D9H8的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.61所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.65所示；
28A2E11的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.69所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.73所示；
35E2C3的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.77所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示；
其中，编码29D9H8的重链蛋白可变区中CDR1域的核苷酸序列为序列表SEQ IDNo.61中的第91位至第105位；
编码29D9H8的重链蛋白可变区中CDR2域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.61中的第148位至第198位；
编码29D9H8的重链蛋白可变区中CDR3域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.61中的第295位至第327位；
编码29D9H8的轻链蛋白可变区中CDR1域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.65中的第70位至第102位；
编码29D9H8的轻链蛋白可变区中CDR2域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.65中的第148位至第168位；
编码29D9H8的轻链蛋白可变区中CDR3域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.65中的第265位至第291位；
编码28A2E11的重链蛋白可变区中CDR1域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.69中的第91位至第105位；
编码28A2E11的重链蛋白可变区中CDR2域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.69中的第148位至第198位；
编码28A2E11的重链蛋白可变区中CDR3域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.69中的第295位至第321位；
编码28A2E11的轻链蛋白可变区中CDR1域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.73中的第67位至第108位；
编码28A2E11的轻链蛋白可变区中CDR2域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.73中的第154位至第174位；
编码28A2E11的轻链蛋白可变区中CDR3域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.73中的第271位至第297位；
编码35E2C3的重链蛋白可变区中CDR1域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.77中的第91位至第105位；
编码35E2C3的重链蛋白可变区中CDR2域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.77中的第148位至第195位；
编码35E2C3的重链蛋白可变区中CDR3域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.77中的第292位至第321位；
编码35E2C3的轻链蛋白可变区中CDR1域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.81中的第70位至第102位；
编码35E2C3的轻链蛋白可变区中CDR2域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.81中的第148位至第168位；
编码35E2C3的轻链蛋白可变区中CDR3域的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.81中的第265位至第291位；
实施例6：小鼠-人嵌合IL-13抗体的制备
实施例3已从杂交瘤细胞的培养上清液中获得了纯化的IL-13抗体(先导抗体)。其中，按照本实施例记载的步骤进行操作，能够从实施例3所得的先导抗体制备出小鼠-人嵌合IL-13抗体。
1、质粒构建与准备：
根据实施例5的测序结果明确了IL-13抗体重链可变区和轻链可变区序列。将实施例3所得的先导抗体的重链可变区序列重组到包含信号肽和人源重链抗体IgG1恒定区的表达载体(其中表达载体购自Invitrogen)中，将IL-13抗体的轻链可变区序列重组到包含信号肽和人源抗体轻链kappa恒定区或Lambda恒定区的表达载体(其中表达载体购自Invitrogen)当中，得重组质粒(上述质粒重组的实验原理及步骤的出处见《分子克隆实验指南(第三版)》，(美)J.萨姆布鲁克等著)并经测序验证(测序方法与实施例5中测序方法相同)。使用碱裂解法试剂盒(购自MACHEREY-NAGEL)中量抽提高纯度的重组质粒，质量为500μg以上，经0.22μm滤膜(购自Millopore)过滤，供转染使用。
2、细胞转染：
在培养基Freestyle 293expression medium(购自Invitrogen)培养293E细胞(购自Invitrogen)。摇床设置为37℃、130RPM和8％CO2(v/v)。Freestyle 293expressionmedium在转染时添加10％(v/v)F68(购自Invitrogen)至F68终浓度为0.1％(v/v)，得含0.1％(v/v)F68的Freestyle 293表达培养基，即培养基A。取5mL培养基A和200μg/mL PEI(购自Sigma)混匀，得培养基B。取5mL培养基A和100μg/mL步骤(1)所得的重组质粒(即重链重组质粒和轻链重组质粒按常规等比例混合的混合重组质粒)混匀，得培养基C。5分钟后将培养基B和培养基C合并混匀，静置15分钟，得混合液D。将10mL混合液D缓缓加入100mL含293E细胞的培养基Freestyle 293expression medium中至293E的细胞密度为1.5×106个/mL，边加边振荡，避免PEI过度集中，放入摇床培养。第二天加入蛋白胨至终浓度为0.5％(w/v)。第5～7天，测培养液抗体效价。第6～7天，离心(3500RPM，30分钟)收集上清，经0.22μm滤膜过滤，得滤好的细胞上清液，以供纯化。
3、抗体纯化：
对于连续生产的无内毒素的层析柱和Protein A填料(购自GE)，使用5个柱体积的0.5M NaOH冲洗。然后用5个柱体积的PBS(PBS缓冲液，pH7.4)进行平衡至中性后，将步骤(2)所得过滤好的细胞上清液上柱，必要时收集流穿液。上柱完成后，使用5倍柱体积的PBS清洗。用5倍柱体积的0.1M pH 3.0的Glycine-HCl进行洗脱，收集洗脱液，并立刻在洗脱液中加入0.1倍体积的pH 8.5的1M Tris-HCl(1.5M NaCl)中和IL-13抗体。上述所用溶液均需要新配置。收获IL-13抗体后，在1╳PBS中透析4小时，避免内毒素污染。透析结束后，使用分光光度或试剂盒测定浓度，使用HPLC-SEC测定抗体纯度，使用内毒素检测试剂盒(购自Lonza)检测抗体内毒素含量。并对所获IL-13抗体进行特性鉴定。用29D9H8、28A2E11和35E2C3先导抗体分别制得嵌合抗体c29D9H8、c28A2E11和c35E2C3，克隆号前端字母c(chimera)表示小鼠-人嵌合抗体(以下简称嵌合抗体)。
实施例7:小鼠-人嵌合IL-13抗体的检定
将实施例6获得的小鼠-人嵌合IL-13抗体进行如下的检定试验(操作步骤同实施例4)。
A、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测嵌合抗体与免疫原A、IL-13R130Q变体以及猴IL-13的结合
具体操作步骤同实施例4试验A。部分实验结果见图13～15和表18～20所示。表18～20说明，上述嵌合抗体与重组人IL-13蛋白，重组人IL-13R130Q变体，重组猴IL-13在ELISA水平结合。其中IgG对照为鼠IgG，表中的数据为OD450nm值。
表18 ELISA检测IL-13嵌合抗体与免疫原A的反应活性
表19 ELISA检测IL-13嵌合抗体与IL-13R130Q变体的反应活性
表20 ELISA检测IL-13嵌合抗体与猴IL-13变体的反应活性
B、受体配体结合阻滞实验
具体试验步骤请参见实施例4试验B部分。部分实验结果见图16～17和表21～22，表21～22说明，嵌合抗体与人IL-13结合后，能阻滞人IL-13与细胞表面的受体人IL-13Ra1/hIL-4Ra异源二聚体的结合，或者能阻滞IL-13与细胞表面人IL-13Ra2受体的结合。其中IgG对照为鼠IgG，表格中数据为平均荧光强度。
表21 FACS检测嵌合抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合
表22 FACS检测嵌合抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合
C、胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌试验
具体操作步骤请参见实施例4的C试验部分。部分实验结果见图18和表23。表23说明，嵌合抗体通过与人IL-13的结合，能够中和由IL-13和TNFα共同刺激条件下诱导产生的A549细胞分泌TARC。表23的数据为培养上清中TARC的浓度(pg/ml)，其中IgG对照为鼠IgG。
表23嵌合抗体中和IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子分泌
D、骨膜蛋白(periostin)分泌试验
将MRC5细胞(购自ATCC)培养在含有10％(w/w)胎牛血清EMEM培养基(购自Gibco)中，于37℃、5％(v/v)CO2条件下培养。待其在T-175细胞培养瓶中扩大培养至75-90％汇合度，弃去培养基，用PBS缓冲液洗涤1-2次，然后用胰蛋白酶溶液(Trypsin-EDTA，购自Lifetechnology)消化并收集细胞。计数后将细胞用培养液稀释至1×105个细胞/mL，按照每孔细胞100μL加到96孔细胞培养板中(每孔1×104个细胞)，将培养板置于37℃、5％(v/v)CO2培养箱培养过夜；第二天，弃去培养上清，将梯度稀释的实施例6制备的嵌合抗体与实施例1制备的免疫原A混合得混合物C(免疫原A在混合物C中的终浓度为5ng/mL)，加入混合物C于培养板中，将细胞培养板放在37℃、5％(v/v)CO2培养箱培养过夜。20小时后，用骨膜蛋白ELISA试剂盒(购自RnD systems)检定上清中骨膜蛋白的浓度。实验操作按照试剂盒说明书要求进行。部分实验结果见图19和表24。表24说明，嵌合抗体与人IL-13结合，能够中和由人IL-13诱导下MRC5细胞分泌骨膜蛋白。表24中数据为培养上清中骨膜蛋白的浓度(pg/ml)，IgG对照为鼠IgG。
表24嵌合抗体中和IL-13诱导的骨膜蛋白分泌
E、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)表达实验
将人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)(购自AllCells)培养在HUVEC完全培养基中，置于37℃、5％(v/v)CO2条件下培养。待其在T-175扩大培养至75-90％汇合度，弃去培养基，用PBS缓冲液洗涤1-2次，然后用胰蛋白酶溶液(Trypsin-EDTA，购自Life technology)消化并收集细胞。计数后将细胞用培养液稀释至1.5×105个细胞/mL，按照每孔HUVEC细胞3000个细胞(20μL)加到384孔细胞培养板中；将梯度稀释的实施例6制备的抗体与实施例1制备的免疫原A以及重组人TNFα按体积比1:1:2混合得混合物D。将混合物D按照每孔20μL的添加量添加到培养板中得混合物D，使混合物D与培养板中HUVEC细胞的体积比为1:1。此时重组人TNFα占混合物D’的终浓度为25ng/mL，免疫原A占混合物D’的终浓度为0.5ng/mL)。
将细胞培养板放在37℃、5％(v/v)CO2培养箱培养过夜。20小时后，弃去培养液上清，将鼠抗人VCAM-1(CD106)抗体(购自Biolegend)用培养基稀释至终浓度为2μg/mL，按照每孔20μL加入培养板中，冰上孵育2小时。用FACS缓冲液[含有2％(w/w)BSA的PBS缓冲液]洗涤3次，加入每孔20μL荧光(Alexa 488)标记的驴抗鼠二抗(购自invitrogen)，冰上孵育0.5-1.0小时。再加入每孔20μL固定液[4％(w/w)多聚甲醛]，5-10分钟后用PBS缓冲液洗涤3次。用PBS缓冲液将PI(购自invitrogen)和RNAseA(购自Qiagen)稀释至PI和RNAseA的终浓度分别为9nM和200ng/mL，按照每孔20μL加入384孔板中，在37℃孵育30分钟后，用Acumen(微孔板细胞检测法)检验并分析细胞表面上血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)的表达水平。部分实验结果见图20和表25。表25说明，嵌合抗体与人IL-13结合，能够中和由人IL-13和TNFα共同刺激条件下诱导产生的HUVEC细胞表面表达血管粘附因子-1。表25中数据为平均荧光强度；IgG对照为鼠IgG；TNFα为单独用TNFα刺激，而无IL-13情况下的背景值。
表25嵌合抗体中和IL-13诱导的血管细胞粘附分子-1表达
实施例8：IL-13嵌合抗体抑制人IL-13诱导的小鼠呼吸炎症实验
雌性Balb/c小鼠(8-12周龄，购自上海灵畅生物科技有限公司)接收后在SPF级饲养，适应1周后，开始实验。小鼠在第一天及第三天腹腔注射实施例6制备的嵌合抗体，克隆号分别为c29D9H8、c28A2E11和c35E2C3，每只动物200μL(3mg抗体每公斤体重)。第二天及第四天用实施例1制备的免疫原A进行刺激诱导，剂量为1mg/mL，每只动物给予气道喷雾25μL。第五天将所有动物用FinePointe全身体积描记系统(即DSIFinePointe WBP系统，购自DSI)进行肺功能检测。动物在清醒无约束状态下通过雾化给药方式给予甲基乙酰胆碱，同时通过仪器自带软件记录气道缩窄指数Penh(增强呼气间歇)。(检测的具体操作步骤按照仪器的说明手册中记载的方法进行)
部分实验结果见图21和表26。表26说明，小鼠在人IL-13，或者说免疫原A的刺激之下会诱发气道的高反应性，使其对甲基乙酰胆碱的刺激更为敏感，使penh读数增大。嵌合抗体会与人IL-13结合，并中和由人IL-13诱导产生的气道高反应性。表中数据为气道缩窄指数Penh，代表气道高反应性；IgG对照为人IgG。
表26嵌合抗体抑制人IL-13诱导的小鼠呼吸炎症实验
实施例9：IL-13嵌合抗体亲和力检测试验
用氨基偶联方法将抗人Fc IgG(购自Geneway)偶联固定在CM5芯片(购自GE)表面至6000-10000RU，FC1作为参比通道。偶联固定过程如下：用新鲜配置的摩尔比为1:1的50mMN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和200mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的混合物活化芯片7分钟。然后注入10-50μg/mL稀释在10mM醋酸纳缓冲液(pH5.0)中的抗人FcIgG。剩余的活化位点用1M乙醇胺封闭。然后，用含HBS-EP缓冲液将实施例6制备的嵌合抗体稀释至5μg/mL(可根据捕获水平适当调整)。以10μL/分钟的流速捕获到芯片上，得到大约100～300RU的响应值。接着将实施例1制备的纯化的免疫原A稀释至100nM(即最高浓度暂定100nM)，以30μL/分钟的流速流经芯片表面。若得到足够的信号值，就将实施例1制备的纯化的免疫原A倍比稀释几个浓度梯度，分别流经芯片表面。在每个循环结束后，芯片表面用10mM，pH 1.5的甘氨酸进行再生。动力学速率常数需减去空白对照，用global fit分析方法1：1结合模型进行数据拟合(参照Biacore操作手册进行操作)。解离平衡速率常数(KD)用以下公式计算：KD＝kd/ka，其中，Kd为解离常数，Ka为结合常数。部分实验结果见表27。表27说明，实施例6制备的嵌合抗体与人IL-13的亲和力KD<9×10-8M。
表27嵌合抗体与人IL-13亲和力检测结果
克隆号 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
c29D9H8 2.51×10<sup>7</sup> 8.13×10<sup>-4</sup> 3.24×10<sup>-11</sup>
c28A2E11 5.49×10<sup>5</sup> 4.38×10<sup>-3</sup> 7.98×10<sup>-9</sup>
c35E2C3 3.00×10<sup>5</sup> 2.60×10<sup>-4</sup> 8.63×10<sup>-10</sup>
实施例10:人源化抗IL-13抗体的制备
在Germline数据库中选取与上述嵌合抗体c29D9H8、c28A2E11和c35E2C3的非CDR区匹配最好的人种系抗体重链和轻链可变区模板。人源化IL-13抗体的人接受序列选自人种系外显子VH、JH、Vk、Jk、VL和JL序列。其中c29D9H8抗体重链可变区的模板为人种系抗体重链VH外显子的VH1-F，JH外显子的JH-1，轻链可变区的模板为人种系抗体轻链VK外显子的L1，JK外显子的JK-4。其中c28A2E11抗体重链可变区的模板为人种系抗体重链VH外显子的VH1-F，JH外显子的JH-1，轻链可变区的模板为人种系抗体轻链VL外显子的7B，JL外显子的JL-1。其中c35E2C3抗体重链可变区的模板为人种系抗体重链VH外显子的VH4-59，JH外显子的JH-6，轻链可变区的模板为人种系抗体轻链VK外显子的O12，JK外显子的JK-4。
根据Kabat定义确定的嵌合抗体c29D9H8、c28A2E11和c35E2C3的重链和轻链CDR分别移植到所选人种系模板中，替换人种系模板的CDR区，得到人源化的抗体。然后，以鼠源抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对VL和VH的构象有重要影响的构架区的残基进行回复突变，得到人源化之后的抗体。简要说，产生跨越人源化VH或VL结构域的合成重叠寡核苷酸、并利用PCR重叠延伸来组装各结构域。利用掺入PCR产物的限制性位点将VH结构域定向克隆到包含信号肽和人源抗体重链IgG1恒定区的表达载体，将VL结构域定向克隆到包含信号肽和人源抗体轻链kappa恒定区或Lambda恒定区的表达载体中，得到的重组质粒经过测序验证，使用碱裂解法试剂盒(购自MACHEREY-NAGEL)中量抽提高纯度的重组质粒，质量为500μg以上，经0.22μm滤膜(购自Millopore)过滤，供转染使用。
人源化抗IL-13抗体变体的重链和轻链可变区与人种系重链和轻链可变区及嵌合抗体的重链和轻链可变区的序列比对如图22-27所示，其中图22为人源化抗IL-13抗体Hu-29D9H8重链可变区Hu-29D9H8.VH1及其变体与c29D9H8嵌合抗体VH及人种系VH外显子hVH1-F/JH1的序列比较；图23为人源化抗IL-13抗体Hu-29D9H8轻链可变区Hu-29D9H8.VK1及其变体与c29D9H8嵌合抗体VK及人种系VK外显子L1/JK4的序列比较；图24为人源化抗IL-13抗体Hu-28A2E11重链可变区Hu-28A2E11.VH1及其变体与c28A2E11嵌合抗体VH及人种系VH外显子hVH1-F/JH1的序列比较；图25为人源化抗IL-13抗体Hu-28A2E11轻链可变区Hu-28A2E11.VL1及其变体与c28A2E11嵌合抗体VL及人种系VL外显子7B/JL1的序列比较；图26为人源化抗IL-13抗体Hu-35E2C3重链可变区Hu-35E2C3.VH1及其变体与c35E2C3嵌合抗体VH及人种系VH外显子hVH4-59/JH6的序列比较；图27为人源化抗IL-13抗体Hu-35E2C3轻链可变区Hu-35E2C3.VK1及其变体与c35E2C3嵌合抗体VK及人种系VK外显子O12/JK4的序列比较。
选择数个框架位置以重新引入小鼠供体残基。可通过在VH结构域中掺入小鼠框架供体残基或在VL结构域中掺入人CDR残基的不同组合产生数种人源化Hu-29D9H8、Hu-28A2E11和Hu-35E2C3变体。下表28-30小结了这些变体。其中，表28-30显示的是这些变体的可变区，不包括恒定区。表28-30中，c开头表示嵌合抗体，Hu开头表示人源化抗体；其中供体构架残基及回复突变栏中显示的：例如各人源化抗IL-13抗体Hu-29D9H8重链可变区Hu-29D9H8.VH1及其变体中“T73K”表明如图22中所示的第73位氨基酸由“T”谷氨酸突变为“K”精氨酸，回复突变的位点位于构架区，以此为例，不一一说明。
表28
表29
表30
注：表中的“/”代表的含义是“和”，为并列关系。
根据各人源化抗体轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列合成cDNA(即分别为序列表中的SEQ ID NO.86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，111，112，113，114，115，116，118，119和120所示序列)，重链cDNA用FspAI和AfeI消化，轻链cDNA用FspAI和BsiwI或者FspAI和HindIII后，将cDNA片段通过FspAI/AfeI，FspAI/BsiwI或者FspAI/HindIII酶切位点分别插入到包含信号肽和人源重链抗体IgG1恒定区的表达载体及包含信号肽和人源抗体轻链kappa/Lambda恒定区的表达载体当中(其中表达载体购自Invitrogen)中，重组质粒并经测序验证，使用碱裂解法试剂盒(购自MACHEREY-NAGEL)中量抽提高纯度的重组质粒，质量为500μg以上，经0.22μm滤膜(购自Millopore)过滤，供转染使用。
转染前，用培养基Freestyle 293expression medium(购自Invitrogen)培养293E细胞(购自Invitrogen)。转染时在Freestyle 293expression medium中添加10％(v/v)F68(购自Invitrogen)至F68终浓度为0.1％(v/v)，得含0.1％(v/v)F68的Freestyle 293表达培养基，即培养基A。取5mL培养基A和200μg/mL PEI(购自Sigma)混匀，得培养基B。取5mL培养基A和100μg重链和轻链重组质粒(重链重组质粒与轻链重组质粒的质量比为1:1-1:3范围)混匀，得培养基C。5分钟后将培养基B和培养基C合并混匀，静置15分钟，得混合液D。将10mL混合液D缓缓加入100mL含293E细胞的培养基Freestyle 293expression medium中至293E的细胞密度为1.5×106个/mL，边加边振荡，避免PEI过度集中，放入摇床培养，摇床设置为37℃、130RPM和8％CO2(v/v)。第二天加入蛋白胨至终浓度为0.5％(w/v)。第5～7天，测培养液抗体效价。第6～7天，离心(3500RPM，30分钟)收集上清，经0.22μm滤膜过滤，得滤好的细胞上清液，以供纯化。
抗体纯化时，对于连续生产的无内毒素的层析柱和蛋白A填料(购自GE)，使用5个柱体积的0.5M NaOH冲洗。然后用5个柱体积的PBS(PBS缓冲液，pH7.4)进行平衡至中性后，将过滤好的细胞上清液上柱，必要时收集流穿液。上柱完成后，使用5倍柱体积的PBS清洗。用5倍柱体积的0.1M pH 3.0的Glycine-HCl进行洗脱，收集洗脱液，并立刻在洗脱液中加入0.1倍体积的pH 8.5的1MTris-HCl(1.5M NaCl)中和IL-13抗体。上述所用溶液均需要新鲜配制。收获IL-13抗体后，在1×PBS中透析4小时，避免内毒素污染。透析结束后，使用分光光度或试剂盒测定浓度，使用HPLC-SEC测定抗体纯度，使用内毒素检测试剂盒(购自Lonza)检测抗体内毒素含量。并对所获IL-13抗体进行特性鉴定(操作步骤如下述实施例4和7所述)。
实施例11:人源化抗IL-13抗体的检定
将实施例10制备的人源化抗IL-13抗体分别进行如下的检定试验(操作步骤同实施例4和7)。
A、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体与免疫原A的结合
具体操作步骤同实施例4和7试验A。部分实验结果见图28-30和表31-33所示。表31-33说明，上述人源化抗IL-13抗体与重组人IL-13蛋白在ELISA水平结合。其中IgG对照为人IgG，表中的数据为OD450nm值。
表31-1人源化抗IL-13抗体与免疫原A的反应活性
表31-2人源化抗IL-13抗体与免疫原A的反应活性
表31-3人源化抗IL-13抗体与免疫原A的反应活性
表31-4人源化抗IL-13抗体与免疫原A的反应活性
表31-5人源化抗IL-13抗体与免疫原A的反应活性
表32-1人源化抗IL-13抗体与免疫原A的反应活性
表32-2人源化抗IL-13抗体与免疫原A的反应活性
表32-3人源化抗IL-13抗体与免疫原A的反应活性
表32-4人源化抗IL-13抗体与免疫原A的反应活性
表32-5人源化抗IL-13抗体与免疫原A的反应活性
表32-6人源化抗IL-13抗体与免疫原A的反应活性
表32-7人源化抗IL-13抗体与免疫原A的反应活性
表33-1人源化抗IL-13抗体与免疫原A的反应活性
表33-2人源化抗IL-13抗体与免疫原A的反应活性
表33-3人源化抗IL-13抗体与免疫原A的反应活性
表33-4人源化抗IL-13抗体与免疫原A的反应活性
表33-5人源化抗IL-13抗体与免疫原A的反应活性
表33-6人源化抗IL-13抗体与免疫原A的反应活性
B、受体配体结合阻滞实验
具体试验步骤请参见实施例4和7试验B部分。部分实验结果见图31～41和表34～44，表34～44说明，部分人源化抗IL-13抗体与人IL-13结合后，能阻滞人IL-13与细胞表面的受体人IL-13Ra1/hIL-4Ra异源二聚体的结合，或者能阻滞IL-13与细胞表面人IL-13Ra2受体的结合。其中IgG对照为人IgG，表格中数据为平均荧光强度。
表34-1 FACS检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合
表34-2 FACS检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结
表35-1 FACS检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合
表35-2 FACS检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合
表36-1 FACS检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合
表36-2 FACS检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合
表37-1 FACS检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合
表37-2 FACS检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合
表38-1 FACS检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合
表38-2 FACS检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合
表39-1 FACS检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合
表39-2 FACS检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合
表40-1 FACS检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合
表40-2 FACS检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合
表41-1 FACS检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合
表41-2 FACS检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合
表42-1 FACS检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合
表42-2 FACS检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合
表43-1 FACS检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合
表43-2 FACS检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合
表44-1 FACS检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra1/IL-4Ra异源二聚体的结合
表44-2 FACS检测人源化抗IL-13抗体阻滞IL-13与细胞表面受体IL-13Ra2的结合
C、胸腺活化调节趋化因子(TARC)分泌试验
具体操作步骤请参见实施例4的C试验部分。部分实验结果见图42-48和表45-51。表45-51说明，人源化抗IL-13抗体通过与人IL-13/人IL-13R130Q变体的结合，能够中和由人IL-13/人IL-13R130Q变体和TNFα共同刺激条件下诱导产生的A549细胞分泌TARC。表45-51的数据为培养上清中TARC的浓度(pg/ml)，其中IgG对照为人IgG。
表45-1人源化抗IL-13抗体中和IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子分泌
表45-2人源化抗IL-13抗体中和人IL-13R130Q变体诱导的胸腺活化调节趋化因子分泌
表46-1人源化抗IL-13抗体中和IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子分泌
表46-2人源化抗IL-13抗体中和人IL-13R130Q变体诱导的胸腺活化调节趋化因子分泌
表47-1人源化抗IL-13抗体中和IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子分泌
表47-2人源化抗IL-13抗体中和人IL-13R130Q变体诱导的胸腺活化调节趋化因子分泌
表48-1人源化抗IL-13抗体中和IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子分泌
表48-2人源化抗IL-13抗体中和人IL-13R130Q变体诱导的胸腺活化调节趋化因子分泌
表49-1人源化抗IL-13抗体中和IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子分泌
表49-2人源化抗IL-13抗体中和人IL-13R130Q变体诱导的胸腺活化调节趋化因子分泌
表50-1人源化抗IL-13抗体中和IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子分泌
表50-2人源化抗IL-13抗体中和人IL-13R130Q变体诱导的胸腺活化调节趋化因子分泌
表51-1人源化抗IL-13抗体中和IL-13诱导的胸腺活化调节趋化因子分泌
表51-2人源化抗IL-13抗体中和人IL-13R130Q变体诱导的胸腺活化调节趋化因子分泌
实施例12：人源化抗IL-13抗体的表征分析(Biacore)
为了评估人源化抗IL-13抗体的结合特异性和亲和力，使用固定在CM5芯片上的人IL-13抗原进行Biacore分析。Biacore技术利用抗体与固定在表层上的IL-13抗原结合后表层上的折射率改变。结合通过从表面折射的激光的表面等离子体共振(SPR)进行检测。信号动力学结合速率和解离速率的分析允许区分非特异性和特异性相互作用。
具体操作步骤同实施例9，部分实验结果见表52。表52说明，实施例10制备的人源化抗IL-13抗体与人IL-13的亲和力KD<9×10-8M。
表52人源化抗IL-13抗体与人IL-13亲和力检测结果
Antigen Antiboy ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
hIL-13 c29D9H8 3.90E+07 9.62E-04 2.47E-11
hIL-13 hu-29D9H8-19 5.11E+07 1.44E-03 2.81E-11
hIL-13 hu-29D9H8-3 6.42E+07 3.33E-03 5.18E-11
hIL-13 hu-29D9H8-10 4.46E+07 2.56E-03 5.74E-11
hIL-13 hu-28A2E11-6 1.28E+06 3.90E-04 3.03E-10
hIL-13 c28A2E11 8.10E+05 3.29E-04 4.06E-10
hIL-13 hu-35E2C3-21 3.02E+05 2.21E-04 7.33E-10
hIL-13 c35E2C3 2.89E+05 2.48E-04 8.60E-10
hIL-13 hu-35E2C3-20 3.22E+05 3.29E-04 1.02E-09
hIL-13 hu-35E2C3-19 2.96E+05 3.19E-04 1.08E-09
hIL-13 hu-35E2C3-9 4.40E+05 1.37E-03 3.11E-09
hIL-13 hu-35E2C3-10 5.06E+05 1.71E-03 3.37E-09
hIL-13 hu-35E2C3-11 5.30E+05 1.79E-03 3.38E-09
实施例13：IL-13人源化抗体抑制人IL-13诱导的小鼠肺杯状细胞化生及黏液过度分泌实验
雌性Balb/c小鼠(8-12周龄，购自上海灵畅生物科技有限公司)接收后在SPF级饲养，适应1周后，开始实验。小鼠在第一天及第三天腹腔注射制备的人源化抗体，克隆号分别为：IgG对照，Tab2(根据专利US 8,088,618B2中克隆228B/C氨基酸序列表达纯化完成)、Tab3(根据专利US7935343B2中克隆BAK0502G9氨基酸序列表达纯化完成)、Hu-35E2C3-19，每只动物200μL(3mg或0.3mg抗体每公斤体重)。第二天及第四天用实施例1制备的免疫原A进行刺激诱导，剂量为1mg/mL，每只动物给予气道喷雾25μL。另有一组老鼠不给抗体，也不给免疫原A，最为阴性对照组。第六天进行安乐死，取肺组织，放入10％(v/v)福尔马林固定。将固定好的肺组织进行石蜡包埋，切片，通过PAS染色法进行染色，观察杯状细胞化生(粘液分泌)状况。
部分实验结果见图49和表53。表53说明，小鼠在人IL-13，或者说免疫原A的刺激之下会诱发肺组织内的杯状细胞化生及粘液过度分泌，使PAS染色阳性区域占比增大。人源化抗体会与人IL-13结合，并中和由人IL-13诱导产生的杯状细胞化生及粘液过度分泌。表中数据为每组中不同老鼠肺组织中PAS染色阳性区域占比的平均值；IgG对照为人IgG。
表53 IL-13人源化抗体抑制人IL-13诱导的小鼠肺杯状细胞化生实验
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明涉及的序列信息如下：
IL-13抗体的氨基酸序列编号
表54
表55
表56
表57
IL-13抗体的氨基酸序列编号对应的氨基酸序列：
表58
IL-13抗体编码氨基酸的核苷酸序列编号：
表59
表60
表61
表62
IL-13抗体的编码氨基酸序列对应的核苷酸序列表63
序列表
<110> 上海开拓者生物医药有限公司
<120> 一种人源化抗IL-13抗体及其制备方法和应用
<130> P2017-1902
<160> 125
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Ser Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ser Gly Asp Tyr Phe Gly Gly Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 2
Asp Tyr Glu Met His
1 5
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 3
Gly Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Ser Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 4
Gly Asp Tyr Phe Gly Gly Gly Pro Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 5
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Asp Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 6
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 7
Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 8
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 9
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 9
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Leu Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Leu Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Leu Gln Arg Thr Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
His Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Phe Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Tyr Asp Tyr Tyr Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 10
Asp Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 11
Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe His
1 5 10 15
Asp
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 12
Tyr Asp Tyr Tyr Gly Pro Phe Ala Tyr
1 5
<210> 13
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 13
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Val Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ile Asn
85 90 95
His Phe Ile Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 14
Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 15
Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 16
Ala Leu Trp Tyr Ile Asn His Phe Ile
1 5
<210> 17
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 17
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Ala Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Gln Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Lys Ser Ala Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Ala Lys Trp Thr Trp Tyr Phe Asp Ile Trp Gly Thr Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 18
Ser Asp Tyr Trp Asn
1 5
<210> 19
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 19
Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 20
Leu Ala Lys Trp Thr Trp Tyr Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 21
Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Leu Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asp Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 22
His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp Leu Ser
1 5 10
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 23
Lys Ala Ser Asp Leu His Thr
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 24
Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 25
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Ser Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Asp Tyr Phe Gly Gly Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Ser Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Asp Tyr Phe Gly Gly Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 27
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1 5 10 15
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20 25 30
Glu Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Ser Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr Thr Gly Asp Tyr Phe Gly Gly Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
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<213> 人工序列(Artifical Sequence)
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<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 30
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<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 31
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 32
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Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
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Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
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Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 35
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
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Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Leu Lys Pro Gly Ala
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Thr Tyr Asp Tyr Tyr Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Leu Lys Pro Gly Ala
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 38
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100 105 110
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<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 39
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Arg Tyr Asp Tyr Tyr Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 40
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Leu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Leu Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Thr Ile Thr Asp Tyr
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Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Arg Tyr Asp Tyr Tyr Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 41
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Leu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Leu Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Thr Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
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His Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Arg Tyr Asp Tyr Tyr Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Leu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Leu Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Thr Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
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His Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Arg Tyr Asp Tyr Tyr Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 43
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 43
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
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Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
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35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
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Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ile Asn
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<210> 44
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 44
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
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Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
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Leu Ile Tyr Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
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Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ile Asn
85 90 95
His Phe Ile Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210> 45
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 45
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ile Asn
85 90 95
His Phe Ile Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210> 46
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 46
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
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Ser Gly Ser Leu Leu Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
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Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ile Asn
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His Phe Ile Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210> 47
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 47
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
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Leu Ile Tyr Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
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Ser Gly Ser Leu Leu Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
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Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ile Asn
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<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 48
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
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Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
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<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 49
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
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100 105
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 50
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
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100 105 110
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<210> 51
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 51
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asp
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100 105 110
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115
<210> 52
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 52
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asp
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100 105 110
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115
<210> 53
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 53
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asp
20 25 30
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100 105 110
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115
<210> 54
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 54
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asp
20 25 30
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 55
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asp
20 25 30
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Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Ala Lys Trp Thr Trp Tyr Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 56
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 56
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Gln Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Ala Lys Trp Thr Trp Tyr Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 57
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 57
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Pro Pro Gly Lys Lys Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Gln Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Ala Lys Trp Thr Trp Tyr Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asp Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 59
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 59
Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asp Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 60
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 60
Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Leu Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asp Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 61
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 61
caggttcaac tacagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg 60
tcctgcaagg cttcgggcta cacatttact gactatgaaa tgcactgggt gaagcagaca 120
cctgtgcatg gcctggaatg gattggaggt attgatcctg aaactggtgg cactgcctcc 180
aatcagaagt tcaagggcaa ggccatactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtac aagtggggat 300
tacttcggtg gtggcccttt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360
<210> 62
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 62
gactatgaaa tgcac 15
<210> 63
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 63
ggtattgatc ctgaaactgg tggcactgcc tccaatcaga agttcaaggg c 51
<210> 64
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 64
ggggattact tcggtggtgg cccttttgct tac 33
<210> 65
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 65
gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60
atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agctatttaa gctggttcca gcagaaacca 120
gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggattat 240
gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa a 321
<210> 66
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 66
aaggcgagtc aggacattaa tagctattta agc 33
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 67
cgtgcaaaca gattggtaga t 21
<210> 68
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 68
ctacagtatg atgagtttcc gtacacg 27
<210> 69
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 69
gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc cgggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gactactata tgcactgggt gaagcagagg 120
actgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg aggatggtga aactaaatat 180
gccccgaaat tccacgacaa ggccacttta acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240
ctgcagttca gcagcctggc atctgaggac actgccgtct attactgtac tagatacgat 300
tactacggtc cttttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354
<210> 70
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 70
gactactata tgcac 15
<210> 71
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 71
aggattgatc ctgaggatgg tgaaactaaa tatgccccga aattccacga c 51
<210> 72
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 72
tacgattact acggtccttt tgcttac 27
<210> 73
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 73
caagctgttg tgactcagga atctgtactc accacatcac ctggtgaaac agtcacactc 60
acttgtcgct caagtactgg ggctgttaca actagtaact atgccaactg ggtccaagaa 120
aaaccagatc atttattcac tggtctaata ggtggtacca acaaccgagc tccaggtgtt 180
cctgccagat tctcaggctc cctgattgga gacaaggctg ccctcaccat cacaggggca 240
cagactgagg atgaggcaat atatttctgt gctctatggt acatcaacca ttttattttc 300
ggcagtggaa ccaaggtcac tgtccta 327
<210> 74
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 74
cgctcaagta ctggggctgt tacaactagt aactatgcca ac 42
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 75
ggtaccaaca accgagctcc a 21
<210> 76
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 76
gctctatggt acatcaacca ttttatt 27
<210> 77
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 77
gaggtgcagc ttcaggagtc aggacctggc ctggcaaaac cttctcagac tctgtccctc 60
acctgttctg tcactggcta ctccatcacc agtgattact ggaactggat ccggaagttc 120
ccagggaata aacttgagta catggggtat ataagttaca atggtaacac ttactacaat 180
ccatctctca aaagtcaaat ctccataact cgagacactt ccaagaacca actttacctg 240
cagttgaaat ctgcgacgac tgaggacaca gccacatatt actgtgcaag acttgctaag 300
tggacctggt acttcgatat ctggggcaca gggaccacgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 78
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 78
agtgattact ggaac 15
<210> 79
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 79
tatataagtt acaatggtaa cacttactac aatccatctc tcaaaagt 48
<210> 80
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 80
cttgctaagt ggacctggta cttcgatatc 30
<210> 81
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 81
gacatccaga tgaaccagtc tccatccagt ctgtctgcat cccttggaga cacaattacc 60
attacttgcc atgccagtca gaacattaat gtttggttaa gctggtacca gcagaaacca 120
ggaagtcttc ctaagctatt gatctataag gcttccgact tgcacacagg cgtcccatca 180
aggtttagtg gcagtggatc tggaacaggt ttcacattaa ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagacattg ccacttacta ctgtcaacag ggtcaaagtt atccatacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa a 321
<210> 82
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 82
catgccagtc agaacattaa tgtttggtta agc 33
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 83
aaggcttccg acttgcacac a 21
<210> 84
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 84
caacagggtc aaagttatcc atacacg 27
<210> 85
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 85
gaggtgcagc tcgtgcagtc tggcgctgag gtgaagaagc ccggcgccac agtgaagatt 60
tcttgcaagg tgtctggata caccttcaca gactacgaga tgcactgggt gcagcaggct 120
ccaggaaagg gccttgagtg gatgggaggc atcgaccctg agaccggcgg aaccgcttct 180
aaccagaagt tcaagggtcg agtgacaatt accgccgaca ccagcacaga cacagcctac 240
atggagctgt cctctctcag atccgaggac accgctgtgt actactgcgc taccggcgac 300
tacttcggag gcgggccatt cgcttactgg ggccagggaa cactcgtgac cgtgtctagc 360
<210> 86
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 86
gaggtgcagc tcgtgcagtc tggcgctgag gtgaagaagc ccggcgccac agtgaagatt 60
tcttgcaagg tgtctggata caccttcaca gactacgaga tgcactgggt gcagcaggct 120
ccaggaaagg gccttgagtg gatgggaggc atcgaccctg agaccggcgg aaccgcttct 180
aaccagaagt tcaagggtcg agtgacaatt accgccgaca agagcacaga cacagcctac 240
atggagctgt cctctctcag atccgaggac accgctgtgt actactgcgc taccggcgac 300
tacttcggag gcgggccatt cgcttactgg ggccagggaa cactcgtgac cgtgtctagc 360
<210> 87
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 87
gaggtgcagc tcgtgcagtc tggcgctgag gtgaagaagc ccggcgccac agtgaagatt 60
tcttgcaagg tgtctggata caccttcaca gactacgaga tgcactgggt gcagcaggct 120
ccaggaaagg gccttgagtg gatgggaggc atcgaccctg agaccggcgg aaccgcttct 180
aaccagaagt tcaagggtcg agtgacaatt accgccgaca agagcacaga cacagcctac 240
atggagctgt cctctctcag atccgaggac accgctgtgt actactgcac caccggcgac 300
tacttcggag gcgggccatt cgcttactgg ggccagggaa cactcgtgac cgtgtctagc 360
<210> 88
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 88
gaggtgcagc tcgtgcagtc tggcgctgag gtgaagaagc ccggcgccac agtgaagatt 60
tcttgcaagg tgtctggata caccttcaca gactacgaga tgcactgggt gcagcaggct 120
ccaggaaagg gccttgagtg gatgggaggc atcgaccctg agaccggcgg aaccgcttct 180
aaccagaagt tcaagggtcg agtgacaatt accgccgaca agagcacaga cacagcctac 240
atggagctgt cctctctcag atccgaggac accgctgtgt actactgcac ctccggcgac 300
tacttcggag gcgggccatt cgcttactgg ggccagggaa cactcgtgac cgtgtctagc 360
<210> 89
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 89
gaggtgcagc tcgtgcagtc tggcgctgag gtgaagaagc ccggcgccac agtgaagatt 60
tcttgcaagg tgtctggata caccttcaca gactacgaga tgcactgggt gcagcaggct 120
ccaggaaagg gccttgagtg gatgggaggc atcgaccctg agaccggcgg aaccgcttct 180
aaccagaagt tcaagggtcg agtgacactg accgccgaca agagcacaga cacagcctac 240
atggagctgt cctctctcag atccgaggac accgctgtgt actactgcac ctccggcgac 300
tacttcggag gcgggccatt cgcttactgg ggccagggaa cactcgtgac cgtgtctagc 360
<210> 90
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 90
gaggtgcagc tcgtgcagtc tggcgctgag gtgaagaagc ccggcgccac agtgaagatt 60
tcttgcaagg tgtctggata caccttcaca gactacgaga tgcactgggt gcagcaggct 120
ccaggaaagg gccttgagtg gatcggaggc atcgaccctg agaccggcgg aaccgcttct 180
aaccagaagt tcaagggtaa ggctacactg accgccgaca agagcacaga cacagcctac 240
atggagctgt cctctctcag atccgaggac accgctgtgt actactgcac ctccggcgac 300
tacttcggag gcgggccatt cgcttactgg ggccagggaa cactcgtgac cgtgtctagc 360
<210> 91
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 91
gaggtgcagc tcgtgcagtc tggcgctgag gtgaagaagc ccggcgccac agtgaagatt 60
tcttgcaagg cttctggata caccttcaca gactacgaga tgcactgggt gaagcaggct 120
ccaggaaagg gccttgagtg gatcggaggc atcgaccctg agaccggcgg aaccgcttct 180
aaccagaagt tcaagggtaa ggctacactg accgccgaca agagcacatc cacagcctac 240
atggagctgt cctctctcag atccgaggac accgctgtgt actactgcac ctccggcgac 300
tacttcggag gcgggccatt cgcttactgg ggccagggaa cactcgtgac cgtgtctagc 360
<210> 92
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 92
gacatccaga tgacacagtc tccttctagc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgggtgaca 60
attacatgca aggcctctca ggacatcaac tcctacctgt cttggttcca gcagaagcct 120
ggcaaggccc caaagtctct gatctatcgc gccaacagac tcgtggacgg cgtgccatct 180
aggttcagcg gctccggctc tggccaggac tacacactca ccattagctc cctcgacccc 240
gaggacttcg ccacatacta ctgcctacaa tacgacgagt tcccttacac attcggcggc 300
ggcaccaagg tggagattaa g 321
<210> 93
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 93
gacatccaga tgacacagtc tccttctagc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgggtgaca 60
attacatgca aggcctctca ggacatcaac tcctacctgt cttggttcca gcagaagcct 120
ggcaaggccc caaagtctct gatctatcgc gccaacagac tcgtggacgg cgtgccatct 180
aggttcagcg gctccggctc tggccaggac tacacactca ccattagctc cctcgacccc 240
gaggacttcg ccacatacta ctgcctacaa tacgacgagt tcccttacac attcggcggc 300
ggcaccaagg tggagattaa g 321
<210> 94
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 94
gacatccaga tgacacagtc tccttctagc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgggtgaca 60
attacatgca aggcctctca ggacatcaac tcctacctgt cttggttcca gcagaagcct 120
ggcaaggccc caaagtctct gatctatcgc gccaacagac tcgtggacgg cgtgccatct 180
aggttcagcg gctccggctc tggccaggac tacacactca ccattagctc cctccagccc 240
gaggacttcg ccacatacta ctgcctacaa tacgacgagt tcccttacac attcggcggc 300
ggcaccaagg tggagattaa g 321
<210> 95
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 95
gacatcaaga tgacacagtc tccttctagc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgggtgaca 60
attacatgca aggcctctca ggacatcaac tcctacctgt cttggttcca gcagaagcct 120
ggcaaggccc caaagaccct gatctatcgc gccaacagac tcgtggacgg cgtgccatct 180
aggttcagcg gctccggctc tggccaggac tacacactca ccattagctc cctcgacccc 240
gaggacttcg ccacatacta ctgcctacaa tacgacgagt tcccttacac attcggcggc 300
ggcaccaagg tggagattaa g 321
<210> 96
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 96
gaggtgcagc tcgtgcagag cggagccgag gtgctgaagc ctggcgccac agtgctcatt 60
agctgcaagg tgtccggata caccttcacc gactactaca tgcactgggt gcagcaggct 120
cccggcaagg gattagagtg gatgggaaga attgacccag aggacggcga gaccaagtac 180
gctcctaagt tccacgaccg cgtgacaatc acagccgaca catctacaga caccgcttac 240
atggagctgt cttctctgcg gtctgaggac accgccgtgt actactgcgc aacatacgac 300
tactacgggc ctttcgctta ctggggccag ggaaccctcg tgacagtgtc ctct 354
<210> 97
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 97
gaggtgcagc tcgtgcagag cggagccgag gtgctgaagc ctggcgccac agtgctcatt 60
agctgcaagg tgtccggata caccttcacc gactactaca tgcactgggt gcagcaggct 120
cccggcaagg gattagagtg gatgggaaga attgacccag aggacggcga gaccaagtac 180
gctcctaagt tccacgaccg cgtgacaatc acagccgaca catctacaga caccgcttac 240
atggagctgt cttctctgcg gtctgaggac accgccgtgt actactgcac aagatacgac 300
tactacgggc ctttcgctta ctggggccag ggaaccctcg tgacagtgtc ctct 354
<210> 98
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 98
gaggtgcagc tcgtgcagag cggagccgag gtgctgaagc ctggcgccac agtgctcatt 60
agctgcaagg tgtccggata caccattacc gactactaca tgcactgggt gcagcaggct 120
cccggcaagg gattagagtg gatgggaaga attgacccag aggacggcga gaccaagtac 180
gctcctaagt tccacgaccg cgtgacaatc acagccgaca catctacaga caccgcttac 240
atggagctgt cttctctgcg gtctgaggac accgccgtgt actactgcac aagatacgac 300
tactacgggc ctttcgctta ctggggccag ggaaccctcg tgacagtgtc ctct 354
<210> 99
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 99
gaggtgcagc tcgtgcagag cggagccgag gtgctgaagc ctggcgccac agtgctcatt 60
agctgcaagg tgtccggata caccattacc gactactaca tgcactgggt gcagcaggct 120
cccggcaagg gattagagtg gatgggaaga attgacccag aggacggcga gaccaagtac 180
gctcctaagt tccacgaccg cgtgacactg acagccgaca catctacaga caccgcttac 240
atggagctgt cttctctgcg gtctgaggac accgccgtgt actactgcac aagatacgac 300
tactacgggc ctttcgctta ctggggccag ggaaccctcg tgacagtgtc ctct 354
<210> 100
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 100
gaggtgcagc tcgtgcagag cggagccgag gtgctgaagc ctggcgccac agtgctcatt 60
agctgcaagg tgtccggatt caccattacc gactactaca tgcactgggt gcagcaggct 120
cccggcaagg gattagagtg gatgggaaga attgacccag aggacggcga gaccaagtac 180
gctcctaagt tccacgaccg cgtgacactg acagccgaca catctacaga caccgcttac 240
atggagctgt cttctctgcg gtctgaggac accgccgtgt actactgcac aagatacgac 300
tactacgggc ctttcgctta ctggggccag ggaaccctcg tgacagtgtc ctct 354
<210> 101
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 101
gaggtgcagc tcgtgcagag cggagccgag gtgctgaagc ctggcgccac agtgctcatt 60
agctgcaagg tgtccggatt caccattaag gactactaca tgcactgggt gcagcaggct 120
cccggcaagg gattagagtg gatgggaaga attgacccag aggacggcga gaccaagtac 180
gctcctaagt tccacgaccg cgtgacactg acagccgaca catctacaga caccgcttac 240
atggagctgt cttctctgcg gtctgaggac accgccgtgt actactgcac aagatacgac 300
tactacgggc ctttcgctta ctggggccag ggaaccctcg tgacagtgtc ctct 354
<210> 102
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 102
gaggtgcagc tcgtgcagag cggagccgag gtgctgaagc ctggcgccac agtgctcatt 60
agctgcaagg tgtccggatt caccattaag gactactaca tgcactgggt gcagcaggct 120
cccggcaagg gattagagtg gatcggaaga attgacccag aggacggcga gaccaagtac 180
gctcctaagt tccacgaccg cgtgacactg acagccgaca catctacaga caccgcttac 240
atggagctgt cttctctgcg gtctgaggac accgccgtgt actactgcac aagatacgac 300
tactacgggc ctttcgctta ctggggccag ggaaccctcg tgacagtgtc ctct 354
<210> 103
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 103
caggctgtgg tgacccagga acctagcctc accgtgtctc ctggcggaac agtgacactc 60
acatgccgca gttctacagg ggccgtgacc acatctaact acgctaactg gttccagcag 120
aagcccggtc aggctcctcg cacactgata tacgggacca acaaccgcgc tccctggacc 180
ccagctagat tctctggaag cctgctcggc ggcaaggccg ccctcaccct gagcggtgca 240
cagccagagg acgaggccga gtactactgc gctctgtggt acatcaacca cttcattttc 300
ggcaccggaa caaaggtgac agtgctg 327
<210> 104
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 104
caggctgtgg tgacccagga acctagcctc accgtgtctc ctggcggaac agtgacactc 60
acatgccgca gttctacagg ggccgtgacc acatctaact acgctaactg gttccagcag 120
aagcccggtc aggctcctcg cacactgata tacgggacca acaaccgcgc tcccggcgtg 180
ccagctagat tctctggaag cctgctcggc ggcaaggccg ccctcaccct gagcggtgca 240
cagccagagg acgaggccga gtactactgc gctctgtggt acatcaacca cttcattttc 300
ggcaccggaa caaaggtgac agtgctg 327
<210> 105
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 105
caggctgtgg tgacccagga acctagcctc accgtgtctc ctggcggaac agtgacactc 60
acatgccgca gttctacagg ggccgtgacc acatctaact acgctaactg gttccagcag 120
aagcccggtc aggctcctcg cacactgata tacgggacca acaaccgcgc tcccggcgtg 180
ccagctagat tctctggaag cctgctcggc gacaaggccg ccctcaccct gagcggtgca 240
cagccagagg acgaggccga gtactactgc gctctgtggt acatcaacca cttcattttc 300
ggcaccggaa caaaggtgac agtgctg 327
<210> 106
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 106
caggctgtgg tgacccagga acctagcctc accgtgtctc ctggcggaac agtgacactc 60
acatgccgca gttctacagg ggccgtgacc acatctaact acgctaactg gttccagcag 120
aagcccggtc aggctcctcg cggcctgata tacgggacca acaaccgcgc tcccggcgtg 180
ccagctagat tctctggaag cctgctcggc gacaaggccg ccctcaccct gagcggtgca 240
cagccagagg acgaggccga gtactactgc gctctgtggt acatcaacca cttcattttc 300
ggcaccggaa caaaggtgac agtgctg 327
<210> 107
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 107
caggctgtgg tgacccagga acctagcctc accgtgtctc ctggcggaac agtgacactc 60
acatgccgca gttctacagg ggccgtgacc acatctaact acgctaactg ggtgcagcag 120
aagcccggtc aggctcctcg cggcctgata tacgggacca acaaccgcgc tcccggcgtg 180
ccagctagat tctctggaag cctgctcggc gacaaggccg ccctcaccct gagcggtgca 240
cagccagagg acgaggccga gtactactgc gctctgtggt acatcaacca cttcattttc 300
ggcaccggaa caaaggtgac agtgctg 327
<210> 108
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 108
caggctgtgg tgacccagga acctagcctc accgtgtctc ctggcggaac agtgacactc 60
acatgccgca gttctacagg ggccgtgacc acatctaact acgctaactg ggtgcagcag 120
aagcccggtc aggctcctcg cggcctgata ggcgggacca acaaccgcgc tcccggcgtg 180
ccagctagat tctctggaag cctgctcggc gacaaggccg ccctcaccct gagcggtgca 240
cagccagagg acgaggccga gtactactgc gctctgtggt acatcaacca cttcattttc 300
ggcaccggaa caaaggtgac agtgctg 327
<210> 109
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 109
caggctgtgg tgacccagga acctagcctc accgtgtctc ctggcggaac agtgacactc 60
acatgccgca gttctacagg ggccgtgacc acatctaact acgctaactg ggtgcaggag 120
aagcccggtc agctgttccg cggcctgata ggcgggacca acaaccgcgc tcccggcgtg 180
ccagctagat tctctggaag cctgctcggc gacaaggccg ccctcaccct gagcggtgca 240
cagccagagg acgaggccga gtacttctgc gctctgtggt acatcaacca cttcattttc 300
ggcaccggaa caaaggtgac agtgctg 327
<210> 110
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 110
gaggtgcagc tccaggaaag cggtcccggt ctcgtgaagc catccgagac cctgtccctc 60
acctgcacag tgtccggcgg atctattagc agcgactact ggaactggat tcggcagcct 120
ccaggaaagg gattagaatg gatcggatac atttcttaca acggaaacac atactacaac 180
ccatctctga agtctcgcgt gacaatcagc gtggacacaa gcaagaacca gttcagcctc 240
aagctctcct ctgtgaccgc tgccgacacc gccgtgtact actgcgctag gctggctaag 300
tggacatggt acttcgacat ttggggccag ggcaccacag tgaccgtgtc tagc 354
<210> 111
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 111
gaggtgcagc tccaggaaag cggtcccggt ctcgtgaagc catccgagac cctgtccctc 60
acctgcacag tgtccggcgg atctattagc agcgactact ggaactggat tcggcagcct 120
ccaggaaagg gattagaatg gatcggatac atttcttaca acggaaacac atactacaac 180
ccatctctga agtctcgcgt gacaatcagc agagacacaa gcaagaacca gttcagcctc 240
aagctctcct ctgtgaccgc tgccgacacc gccgtgtact actgcgctag gctggctaag 300
tggacatggt acttcgacat ttggggccag ggcaccacag tgaccgtgtc tagc 354
<210> 112
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 112
gaggtgcagc tccaggaaag cggtcccggt ctcgtgaagc catccgagac cctgtccctc 60
acctgcacag tgtccggcgg atctattagc agcgactact ggaactggat tcggcagcct 120
ccaggaaagg gattagaata catcggatac atttcttaca acggaaacac atactacaac 180
ccatctctga agtctcgcgt gacaatcagc agagacacaa gcaagaacca gttcagcctc 240
aagctctcct ctgtgaccgc tgccgacacc gccgtgtact actgcgctag gctggctaag 300
tggacatggt acttcgacat ttggggccag ggcaccacag tgaccgtgtc tagc 354
<210> 113
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 113
gaggtgcagc tccaggaaag cggtcccggt ctcgtgaagc catccgagac cctgtccctc 60
acctgcacag tgaccggcgg atctattagc agcgactact ggaactggat tcggcagcct 120
ccaggaaagg gattagaata catcggatac atttcttaca acggaaacac atactacaac 180
ccatctctga agtctcgcgt gacaatcagc agagacacaa gcaagaacca gctgagcctc 240
aagctctcct ctgtgaccgc tgccgacacc gccgtgtact actgcgctag gctggctaag 300
tggacatggt acttcgacat ttggggccag ggcaccacag tgaccgtgtc tagc 354
<210> 114
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 114
gaggtgcagc tccaggaaag cggtcccggt ctcgtgaagc catccgagac cctgtccctc 60
acctgcacag tgaccggcgg atctattagc agcgactact ggaactggat tcggcagcct 120
ccaggaaagg gattagaata catcggatac atttcttaca acggaaacac atactacaac 180
ccatctctga agtctcagat cacaatcagc agagacacaa gcaagaacca gctgagcctc 240
aagctctcct ctgtgaccgc tgccgacacc gccgtgtact actgcgctag gctggctaag 300
tggacatggt acttcgacat ttggggccag ggcaccacag tgaccgtgtc tagc 354
<210> 115
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 115
gaggtgcagc tccaggaaag cggtcccggt ctcgtgaagc catccgagac cctgtccctc 60
acctgcacag tgaccggcgg atctattagc agcgactact ggaactggat tcggcagcct 120
ccaggaaagg gattagaata catgggatac atttcttaca acggaaacac atactacaac 180
ccatctctga agtctcagat cacaatcagc agagacacaa gcaagaacca gctgagcctc 240
aagctctcct ctgtgaccgc tgccgacacc gccgtgtact actgcgctag gctggctaag 300
tggacatggt acttcgacat ttggggccag ggcaccacag tgaccgtgtc tagc 354
<210> 116
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 116
gaggtgcagc tccaggaaag cggtcccggt ctcgtgaagc catccgagac cctgtccctc 60
acctgcacag tgaccggcgg atctattacc agcgactact ggaactggat tcggcagcct 120
ccaggaaagg gattagaata catgggatac atttcttaca acggaaacac atactacaac 180
ccatctctga agtctcagat cacaatcagc agagacacaa gcaagaacca gctgagcctc 240
aagctctcct ctgtgaccgc tgccgacacc gccgtgtact actgcgctag gctggctaag 300
tggacatggt acttcgacat ttggggccag ggcaccacag tgaccgtgtc tagc 354
<210> 117
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 117
gaggtgcagc tccaggaaag cggtcccggt ctcgtgaagc catccgagac cctgtccctc 60
acctgcacag tgaccggcgg atctattacc agcgactact ggaactggat tcggaagcct 120
ccaggaaaga agttagaata catgggatac atttcttaca acggaaacac atactacaac 180
ccatctctga agtctcagat cacaatcagc agagacacaa gcaagaacca gctgagcctc 240
aagctctcct ctgtgaccgc tgccgacacc gccgtgtact actgcgctag gctggctaag 300
tggacatggt acttcgacat ttggggccag ggcaccacag tgaccgtgtc tagc 354
<210> 118
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 118
gacattcaga tgacccagtc cccttcctct ctgagcgcct ccgtgggcga ccgcgtgaca 60
atcacatgcc acgcttctca gaacatcaac gtgtggctgt cttggtatca gcagaagcct 120
ggcaaggctc caaagctgct catatataag gccagcgacc tccacaccgg agtgccatct 180
aggttctctg gcagcgggtc tggaaccgac ttcacactga caatttctag cctgcaaccc 240
gaggacttcg ctacctacta ctgccagcag ggacagtctt acccatacac attcggcgga 300
ggcaccaagg tggagattaa g 321
<210> 119
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 119
gacattcaga tgaaccagtc cccttcctct ctgagcgcct ccgtgggcga ccgcgtgaca 60
atcacatgcc acgcttctca gaacatcaac gtgtggctgt cttggtatca gcagaagcct 120
ggcaaggctc caaagctgct catatataag gccagcgacc tccacaccgg agtgccatct 180
aggttctctg gcagcgggtc tggaaccgac ttcacactga caatttctag cctgcaaccc 240
gaggacttcg ctacctacta ctgccagcag ggacagtctt acccatacac attcggcgga 300
ggcaccaagg tggagattaa g 321
<210> 120
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 120
gacattcaga tgaaccagtc cccttcctct ctgagcgcct ccgtgggcga ccgcgtgaca 60
atcacatgcc acgcttctca gaacatcaac gtgtggctgt cttggtatca gcagaagcct 120
ggcaagctgc caaagctgct catatataag gccagcgacc tccacaccgg agtgccatct 180
aggttctctg gcagcgggtc tggaaccgac ttcacactga caatttctag cctgcaaccc 240
gaggacttcg ctacctacta ctgccagcag ggacagtctt acccatacac attcggcgga 300
ggcaccaagg tggagattaa g 321
<210> 121
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 121
atggcgcttt tgttgaccac ggtcattgct ctcacttgcc ttggcggctt tgcctcccca 60
ggccctgtgc ctccctctac agccctcagg gagctcattg aggagctggt caacatcacc 120
cagaaccaga aggctccgct ctgcaatggc agcatggtat ggagcatcaa cctgacagct 180
ggcatgtact gtgcagccct ggaatccctg atcaacgtgt caggctgcag tgccatcgag 240
aagacccaga ggatgctgag cggattctgc ccgcacaagg tctcagctgg gcagttttcc 300
agcttgcatg tccgagacac caaaatcgag gtggcccagt ttgtaaagga cctgctctta 360
catttaaaga aactttttcg cgagggacgg ttcaaccatc atcaccatca ccat 414
<210> 122
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 122
atggcgcttt tgttgaccac ggtcattgct ctcacttgcc ttggcggctt tgcctcccca 60
ggccctgtgc ctccctctac agccctcagg gagctcattg aggagctggt caacatcacc 120
cagaaccaga aggctccgct ctgcaatggc agcatggtat ggagcatcaa cctgacagct 180
ggcatgtact gtgcagccct ggaatccctg atcaacgtgt caggctgcag tgccatcgag 240
aagacccaga ggatgctgag cggattctgc ccgcacaagg tctcagctgg gcagttttcc 300
agcttgcatg tccgagacac caaaatcgag gtggcccagt ttgtaaagga cctgctctta 360
catttaaaga aactttttcg cgagggacag ttcaaccatc atcaccatca ccat 414
<210> 123
<211> 1284
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 123
atggagtggc cggcgcggct ctgcgggctg tgggcgctgc tgctctgcgc cggcggcggg 60
ggcgggggcg ggggcgccgc gcctacggaa actcagccac ctgtgacaaa tttgagtgtc 120
tctgttgaaa acctctgcac agtaatatgg acatggaatc cacccgaggg agccagctca 180
aattgtagtc tatggtattt tagtcatttt ggcgacaaac aagataagaa aatagctccg 240
gaaactcgtc gttcaataga agtacccctg aatgagagga tttgtctgca agtggggtcc 300
cagtgtagca ccaatgagag tgagaagcct agcattttgg ttgaaaaatg catctcaccc 360
ccagaaggtg atcctgagtc tgctgtgact gagcttcaat gcatttggca caacctgagc 420
tacatgaagt gttcttggct ccctggaagg aataccagtc ccgacactaa ctatactctc 480
tactattggc acagaagcct ggaaaaaatt catcaatgtg aaaacatctt tagagaaggc 540
caatactttg gttgttcctt tgatctgacc aaagtgaagg attccagttt tgaacaacac 600
agtgtccaaa taatggtcaa ggataatgca ggaaaaatta aaccatcctt caatatagtg 660
cctttaactt cccgtgtgaa acctgatcct ccacatatta aaaacctctc cttccacaat 720
gatgacctat atgtgcaatg ggagaatcca cagaatttta ttagcagatg cctattttat 780
gaagtagaag tcaataacag ccaaactgag acacataatg ttttctacgt ccaagaggct 840
aaatgtgaga atccagaatt tgagagaaat gtggagaata catcttgttt catggtccct 900
ggtgttcttc ctgatacttt gaacacagtc agaataagag tcaaaacaaa taagttatgc 960
tatgaggatg acaaactctg gagtaattgg agccaagaaa tgagtatagg taagaagcgc 1020
aattccacac tctacataac catgttactc attgttccag tcatcgtcgc aggtgcaatc 1080
atagtactcc tgctttacct aaaaaggctc aagattatta tattccctcc aattcctgat 1140
cctggcaaga tttttaaaga aatgtttgga gaccagaatg atgatactct gcactggaag 1200
aagtacgaca tctatgagaa gcaaaccaag gaggaaaccg actctgtagt gctgatagaa 1260
aacctgaaga aagcctctca gtga 1284
<210> 124
<211> 1143
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 124
atggctttcg tttgcttggc tatcggatgc ttatatacct ttctgataag cacaacattt 60
ggctgtactt catcttcaga caccgagata aaagttaacc ctcctcagga ttttgagata 120
gtggatcccg gatacttagg ttatctctat ttgcaatggc aacccccact gtctctggat 180
cattttaagg aatgcacagt ggaatatgaa ctaaaatacc gaaacattgg tagtgaaaca 240
tggaagacca tcattaccaa gaatctacat tacaaagatg ggtttgatct taacaagggc 300
attgaagcga agatacacac gcttttacca tggcaatgca caaatggatc agaagttcaa 360
agttcctggg cagaaactac ttattggata tcaccacaag gaattccaga aactaaagtt 420
caggatatgg attgcgtata ttacaattgg caatatttac tctgttcttg gaaacctggc 480
ataggtgtac ttcttgatac caattacaac ttgttttact ggtatgaggg cttggatcat 540
gcattacagt gtgttgatta catcaaggct gatggacaaa atataggatg cagatttccc 600
tatttggagg catcagacta taaagatttc tatatttgtg ttaatggatc atcagagaac 660
aagcctatca gatccagtta tttcactttt cagcttcaaa atatagttaa acctttgccg 720
ccagtctatc ttacttttac tcgggagagt tcatgtgaaa ttaagctgaa atggagcata 780
cctttgggac ctattccagc aaggtgtttt gattatgaaa ttgagatcag agaagatgat 840
actaccttgg tgactgctac agttgaaaat gaaacataca ccttgaaaac aacaaatgaa 900
acccgacaat tatgctttgt agtaagaagc aaagtgaata tttattgctc agatgacgga 960
atttggagtg agtggagtga taaacaatgc tgggaaggtg aagacctatc gaagaaaact 1020
ttgctacgtt tctggctacc atttggtttc atcttaatat tagttatatt tgtaaccggt 1080
ctgcttttgc gtaagccaaa cacctaccca aaaatgattc cagaattttt ctgtgataca 1140
tga 1143
<210> 125
<211> 2478
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<400> 125
atggggtggc tttgctctgg gctcctgttc cctgtgagct gcctggtcct gctgcaggtg 60
gcaagctctg ggaacatgaa ggtcttgcag gagcccacct gcgtctccga ctacatgagc 120
atctctactt gcgagtggaa gatgaatggt cccaccaatt gcagcaccga gctccgcctg 180
ttgtaccagc tggtttttct gctctccgaa gcccacacgt gtatccctga gaacaacgga 240
ggcgcggggt gcgtgtgcca cctgctcatg gatgacgtgg tcagtgcgga taactataca 300
ctggacctgt gggctgggca gcagctgctg tggaagggct ccttcaagcc cagcgagcat 360
gtgaaaccca gggccccagg aaacctgaca gttcacacca atgtctccga cactctgctg 420
ctgacctgga gcaacccgta tccccctgac aattacctgt ataatcatct cacctatgca 480
gtcaacattt ggagtgaaaa cgacccggca gatttcagaa tctataacgt gacctaccta 540
gaaccctccc tccgcatcgc agccagcacc ctgaagtctg ggatttccta cagggcacgg 600
gtgagggcct gggctcagtg ctataacacc acctggagtg agtggagccc cagcaccaag 660
tggcacaact cctacaggga gcccttcgag cagcacctcc tgctgggcgt cagcgtttcc 720
tgcattgtca tcctggccgt ctgcctgttg tgctatgtca gcatcaccaa gattaagaaa 780
gaatggtggg atcagattcc caacccagcc cgcagccgcc tcgtggctat aataatccag 840
gatgctcagg ggtcacagtg ggagaagcgg tcccgaggcc aggaaccagc caagtgccca 900
cactggaaga attgtcttac caagctcttg ccctgttttc tggagcacaa catgaaaagg 960
gatgaagatc ctcacaaggc tgccaaagag atgcctttcc agggctctgg aaaatcagca 1020
tggtgcccag tggagatcag caagacagtc ctctggccag agagcatcag cgtggtgcga 1080
tgtgtggagt tgtttgaggc cccggtggag tgtgaggagg aggaggaggt agaggaagaa 1140
aaagggagct tctgtgcatc gcctgagagc agcagggatg acttccagga gggaagggag 1200
ggcattgtgg cccggctaac agagagcctg ttcctggacc tgctcggaga ggagaatggg 1260
ggcttttgcc agcaggacat gggggagtca tgccttcttc caccttcggg aagtacgagt 1320
gctcacatgc cctgggatga gttcccaagt gcagggccca aggaggcacc tccctggggc 1380
aaggagcagc ctctccacct ggagccaagt cctcctgcca gcccgaccca gagtccagac 1440
aacctgactt gcacagagac gcccctcgtc atcgcaggca accctgctta ccgcagcttc 1500
agcaactccc tgagccagtc accgtgtccc agagagctgg gtccagaccc actgctggcc 1560
agacacctgg aggaagtaga acccgagatg ccctgtgtcc cccagctctc tgagccaacc 1620
actgtgcccc aacctgagcc agaaacctgg gagcagatcc tccgccgaaa tgtcctccag 1680
catggggcag ctgcagcccc cgtctcggcc cccaccagtg gctatcagga gtttgtacat 1740
gcggtggagc agggtggcac ccaggccagt gcggtggtgg gcttgggtcc cccaggagag 1800
gctggttaca aggccttctc aagcctgctt gccagcagtg ctgtgtcccc agagaaatgt 1860
gggtttgggg ctagcagtgg ggaagagggg tataagcctt tccaagacct cattcctggc 1920
tgccctgggg accctgcccc agtccctgtc cccttgttca cctttggact ggacagggag 1980
ccacctcgca gtccgcagag ctcacatctc ccaagcagct ccccagagca cctgggtctg 2040
gagccggggg aaaaggtaga ggacatgcca aagcccccac ttccccagga gcaggccaca 2100
gacccccttg tggacagcct gggcagtggc attgtctact cagcccttac ctgccacctg 2160
tgcggccacc tgaaacagtg tcatggccag gaggatggtg gccagacccc tgtcatggcc 2220
agtccttgct gtggctgctg ctgtggagac aggtcctcgc cccctacaac ccccctgagg 2280
gccccagacc cctctccagg tggggttcca ctggaggcca gtctgtgtcc ggcctccctg 2340
gcaccctcgg gcatctcaga gaagagtaaa tcctcatcat ccttccatcc tgcccctggc 2400
aatgctcaga gctcaagcca gacccccaaa atcgtgaact ttgtctccgt gggacccaca 2460
tacatgaggg tctcttag 2478

Claims (25)

1.一种人源化抗体，其特征在于，包括重链可变区和/或轻链可变区；
其中，所述人源化抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:10所示的CDR1，
SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:11所示的CDR2，和
SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:12所示的CDR3；
所述人源化抗体的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:14所示的CDR1，
SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:15所示的CDR2，和
SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:16所示的CDR3；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留IL-13结合亲和力的衍生序列。
2.如权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于，所述人源化抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:18所示的CDR1，
SEQ ID NO:19所示的CDR2，和
SEQ ID NO:20所示的CDR3；
和/或
所述人源化抗体的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:22所示的CDR1，
SEQ ID NO:23所示的CDR2，和
SEQ ID NO:24所示的CDR3。
3.如权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于，所述人源化抗体的重链和轻链可变区序列如表A所示：
表A
4.如权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于，所述的人源化抗体还包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
5.如权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于，所述人源化抗体的重链可变区还包括人源的框架区，和/或所述人源化抗体的轻链可变区还包括人源的框架区。
6.如权利要求1所述的的人源化抗体，其特征在于，所述人源化抗体的重链框架区选自种系：DP3(VH1-f)、DP4、DP7、DP8、DP9、DP10、DP31、DP33、DP35(VH3-11)、DP45、DP46、DP47、DP48、DP49(VH3-30)、DP50、DP51(VH3-48)、DP53、DP54、DP65、DP66、DP67、DP68、DP69或DP71(VH4-59)；和/或
所述人源化抗体的轻链框架区选自种系：L1、O2、O12、DPK1(O18)、DPK2、DPK3、DPK4、DPK5、DPK6、DPK7、DPK8、DPK9、DPK10、DPK12(A2)、DPK13、DPK15、DPK16、DPKI8、DPK19、DPK20、DPK21、DPK22、DPK23、DPK24(B3)、DPK25、DPK26、DPK28、DPL1、DPL7、DPL6、DPL2、DPL3、DPL5、DPL12、DPL11、DPL13、DPL10、D9、DPL16、DPL24、DPL18、DPL19(7b)、DPL21、DPL22或DPL20。
7.如权利要求1所述的的人源化抗体，其特征在于，所述人源化抗体的重链框架区选自种系：DP3(VH1-f)、DP4、DP7、DP8、DP9、DP10、DP31、DP33、DP35(VH3-11)、DP45、DP46、DP47、DP48、DP49(VH3-30)、DP50、DP51(VH3-48)、DP53、DP54、DP65、DP66、DP67、DP68、DP69或DP71(VH4-59)的FR1、FR2、FR3；以及JH片段JH1、JH2、JH3、JH4、JH4b、JH5和JH6，特别是这些种系的FR4编码的序列，或重链框架区的共有序列。
8.如权利要求1所述的的人源化抗体，其特征在于，所述人源化抗体的轻链框架区选自种系：L1、O2、O12、DPK1(O18)、DPK2、DPK3、DPK4、DPK5、DPK6、DPK7、DPK8、DPK9、DPK10、DPK12(A2)、DPK13、DPK15、DPK16、DPKI8、DPK19、DPK20、DPK21、DPK22、DPK23、DPK24(B3)、DPK25、DPK26、DPK28、DPL1、DPL7、DPL6、DPL2、DPL3、DPL5、DPL12、DPL11、DPL13、DPL10、D9、DPL16、DPL24、DPL18、DPL19(7b)、DPL21、DPL22或DPL20，优选为这些种系的FR1、FR2、FR3；以及由Jk片段Jk1、Jk2、Jk3、Jk4和JK5，特别是这些种系的FR4编码的序列。
9.如权利要求1所述的的人源化抗体，其特征在于，所述人源化抗体的重链和轻链可变区序列如表B所示：
表B
10.如权利要求1所述的的人源化抗体，其特征在于，所述人源化抗体的重链和轻链可变区序列如表C所示：
表C
11.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白包括：
(i)表2所示的任一重链可变区序列和任一轻链可变区序列；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列；
表2
12.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)表2所示的任一重链可变区序列和任一轻链可变区序列；以及
(2)如权利要求11所述的重组蛋白。
13.如权利要求12所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:117、88、97、77、61或69所示；和/或，
编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:118、94、108、81、65或73所示。
14.如权利要求13所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:117所示，并且编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:118所示；或
编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:88所示，并且编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:94所示；
或
编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:97所示，并且编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:108所示；
或
编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:77所示，并且编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:81所示；
或
编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:61所示，并且编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:65所示；
或
编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:69所示，并且编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:73所示。
15.一种载体，其特征在于，所述载体含有本发明权利要求12-14中任一项所述的多核苷酸。
16.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求15所述的载体或基因组中整合有权利要求12-14中任一项所述的多核苷酸。
17.一种抗体偶联物，其特征在于，该抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分为权利要求1-10中任一项所述的人源化抗体；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
18.一种免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有权利要求1-10中任一项所述的人源化抗体。
19.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：权利要求1-10中任一项所述的人源化抗体、如权利要求11所述的重组蛋白、如权利要求17所述的抗体偶联物、权利要求18所述的免疫细胞、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
20.一种活性成分的用途，其特征在于，所述活性成分选自下组：权利要求1-10中任一项所述的人源化抗体、如权利要求11所述的重组蛋白、如权利要求17所述的抗体偶联物、权利要求18所述的免疫细胞、或其组合，其中所述活性成分被用于(a)制备诊断试剂；和/或(b)制备预防和/或治疗IL-13相关的疾病的药物。
21.一种体外检测样品中IL-13蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)在体外，将所述样品与权利要求1-10中任一项所述的人源化抗体、如权利要求11所述的重组蛋白、如权利要求17所述的抗体偶联物、权利要求18所述的免疫细胞、或其组合接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在IL-13蛋白。
22.一种体外检测样品中IL-13蛋白的组合物，其特征在于，其包括权利要求1-10中任一项所述的人源化抗体、如权利要求11所述的重组蛋白、如权利要求17所述的抗体偶联物、权利要求18所述的免疫细胞、或其组合作为活性成分。
23.一种检测板，其特征在于，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有权利要求1-10中任一项所述的人源化抗体、如权利要求11所述的重组蛋白、如权利要求17所述的抗体偶联物、权利要求18所述的免疫细胞、或其组合。
24.一种重组多肽的制备方法，其特征在于，该方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养权利要求16所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是权利要求1-10中任一项所述的人源化抗体或权利要求11所述的重组蛋白。
25.一种治疗支气管哮喘的方法，其特征在于，包括：使用如权利要求1-10中任一项所述的人源化抗体、如权利要求11所述的重组蛋白、如权利要求17所述的抗体偶联物、权利要求18所述的免疫细胞。
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