CN101039960A - 抗il－13的嵌合人源化单克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫球蛋白，尤其是能够特异性结合人干扰素13(hIL－13)的抗体。本发明抗体可以用于治疗多种对调节hIL－13和人IL－13受体之间的相互作用有反应的疾病或紊乱。这些疾病包括重症哮喘、特应性皮炎、COPD和各种纤维变性疾病。本发明还公开了包含所述抗体的药物组合物及其制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及与干扰素13(IL-13)，特别是人IL-13(hIL-13)特异性结合的免疫球蛋白。本发明的一个实施方案涉及能特异性结合hIL-13的抗体。本发明还涉及到使用所述免疫球蛋白治疗疾病或紊乱的方法、含有该免疫球蛋白的药物组合物及其制备方法。发明的其他方面由以下描述是显而易见的。
背景技术
白细胞介素-13(IL-13)
IL-13是一种12kDa的分泌性细胞因子，以前它被描述为一种能够抑制炎症细胞因子产生的来源于T细胞的细胞因子。结构学研究表明它有一个由两个二硫键维持在一起的四螺旋束状排列。虽然IL-13有四个潜在的糖基化位点，对大鼠肺部天然IL-13所进行的分析表明它在产生时是一个未糖基化的分子。从NSO和COS-7细胞表达人IL-13证实了这一观察结果(Eisenmesser等，J.Mol.Biol.2001 310(1)：231-241；Moy等，J.Mol.Biol.2001310(1)：219-230；Cannon-Carlson等，Protein Expression and Purification 199812(2)：239-248)。
IL-13是由多种细胞类型，包括激活的Th2细胞，肥大细胞，嗜碱性粒细胞，树枝状细胞，角质形成细胞和NKT细胞所产生的多效性细胞因子。它还可以由Th0、Th1、CD8和天然CD45RA+T细胞产生。IL-13具有的免疫调节活性与IL4的有部分重叠，这一冗余现象由IL4和IL-13的受体共同使用一些成份可以得到解释。IL-13通过II型IL4受体来进行信号转导，该受体是由IL4Rα和IL-13Rα1链组成的异二聚体。IL-13Rα1结合IL-13的亲和力较低(Kd＝2-10nM)，但是结合了IL4Rα时它就能以高亲和力结合，并形成能转导信号的功能性IL-13受体(人受体在本文中用hIL-13R称呼)，从而导致JAK/STAT和IRS-1/IRS-2途径的激活。另外一个IL-13受体链(IL-13Rα2)的特点也被研究过，它与IL-13高亲和力结合(Kd＝250pM)，但是不能转导信号，人们认为它是作为一种引诱受体。IL-13的功能性受体在许多种细胞上都有表达，包括呼吸道表皮细胞、平滑肌、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、B细胞、成纤维细胞、单核细胞和巨噬细胞。T细胞没有IL-13的功能性受体(Hilton等，PNAS 1996 93(1)：497-501；Caput等，J.Biol.Chem 1996 271(28)：16921-16926；Hershey GK，J.Allergy Clin.Immunol2003 111(4)：677-690)。IL-13和IL-4都能通过促进与炎症相关的过敏反应，抑制细菌、病毒和胞内病原菌引起的炎症对免疫和炎症反应进行修饰。IL-13主要的生物学效应包括：诱导B细胞增殖；调节同种型转化为IgE；诱导MHC II和CD23在B细胞和单核细胞上的表达；上调内皮细胞上的VCAM-1；调节趋化因子的产生；激活肥大细胞，嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的功能，以及抑制单核细胞中的促炎症基因表达和巨噬细胞群。IL-13对T细胞没有任何增殖效应。因此不同于IL4，IL-13在CD4 T细胞到Th2型细胞的初始分化阶段中显得并不重要，而是对于过敏性炎症的效应阶段很重要(McKenzie等，PNAS 1993 90(8)：3735-3739；Wynn TA，Annu.Rev.Immunol.2003 21：425-456)。
IL-13与哮喘
哮喘是一种由下呼吸道发炎引起的慢性肺病，其特征在于反复出现的呼吸问题。患者的呼吸道非常敏感，并且即使没有症状的情况下也一直处于某种程度的肿涨或发炎。发炎导致呼吸道变窄，减少了进出肺部的气流，使得呼吸困难，导致气喘、胸部紧迫和咳嗽。哮喘的发生是由于对过敏原(例如尘蹒、花粉、霉菌)、刺激物(例如烟、气、强烈气味)、呼吸道感染、锻炼和干燥气候超敏感引起的。这些促发因素刺激呼吸道和呼吸道壁的肿起使炎症加重，然后粘液就会堵住呼吸道，呼吸道周围的肌肉收紧直至呼吸变得困难、紧张，出现哮喘的症状。
来自动物模型和患者的证据强烈表明，哮喘炎症和其他病理是由失调的Th2对大气过敏原以及其他刺激物的反应造成的(Busse等，Am.J.Resp.Crit.Care Med.1995 152(1)：388-393)。尤其是人们认为IL-13是引起肺部中多种细胞性反应的主要效应细胞因子，包括呼吸道超敏感、嗜酸粒细胞增多、杯形细胞组织转化和粘液分泌过多。
IL-13在哮喘中的作用的临床证据
编码IL-13的基因在染色体上位于5q31.该区域还含有编码IL-3、IL-4、IL-5、IL-9和GM-CSF的基因，并已经与哮喘联系起来了。与哮喘和特应性有关联的IL-13基因变异在启动子和编码区都有发现(Vercelli D，Curr.Opin.Allergy Clin.Immunol.2002 2(5)：389-393)。所编码的变体Q130 IL-3(本文中称为Q130 IL-3)的功能性研究数据也已存在。在第四个外显子中发现的+2044 G到A的单核甘酸多态性(SNP)导致130位点上的精氨酸被谷氨酰胺所代替。注意这在SEQ.ID.NO：9中等同于位点110，该序列中成熟的人IL-13氨基酸序列的启始处的第一个G氨基酸残基是位点1。已经发现这个变体在日本和欧洲的人群体中是与哮喘、IgE水平上升以及特应性皮炎相关的。Q130 IL-13被认为比野生型IL-13的稳定性提高了，它对IL-13Rα2引诱受体的亲和力略低，与这些观察结果一致的是，人们发现纯合Q130IL-13变体的患者中的半数血清IL-13水平比非纯合的患者更高。这些结果表明Q130 IL-13能够影响IL-13的局部和系统浓度(Kazuhiko等，J.Allergy Clin.Immunol 2002 109(6)：980-987)。
在特应性和非特应性哮喘中都测到IL-13水平升高。一项研究中测到的哮喘患者的平均血清IL-13是50pg/ml，而在正常的对照患者中是8pg/ml(Lee等，J.Asthma 2001 38(8)：665-671)。在血浆、支气管-肺泡冲洗液、肺活体解剖样品和痰中也都测到IL-13水平升高(Berry等，J.Allergy Clin.Immunol 2004 114(5)：1106-1109；Kroegel等，Eur Respir.J.1996 9(5)：899-904；Huang等，J.Immunol 1995 155(5)：2688-2694；Humbert等，J.Allergy Clin.Immunol 1997 99(5)：657-665)。
IL-13与哮喘相关的体内证据
许多研究已经在急性和慢性过敏性哮喘小鼠模型中证实了IL-13是关键的病理学诱因。高亲和力IL-13受体(IL-13Rα2)或者抗IL-13的多克隆抗体已经被用于在这些模型中中和小鼠IL-13的生物活性。在过敏原攻击时，阻断IL-13彻底抑制了OVA诱导的呼吸道超反应、嗜酸粒细胞增多和杯形细胞组织转化。相反，在致敏之后和过敏原攻击阶段给予IL-4的抗体只能部分减少哮喘表型。因此虽然外源IL-4和IL-13都能诱导出类似哮喘的表型，IL-13的效应子活性似乎优于IL-4的。这些数据提示了IL-4的首要作用是在免疫诱导过程中(特别是Th2细胞发育和补充到呼吸道，以及IgE的产生)，而IL-13被认为主要参与各种效应子后果，包括呼吸道超反应、粘液过多和细胞炎症(Wills-Karp等，Science 1998 282：2258-2261；Grunig等，Science 1998 282：2261-2263；Taube等，J.Immunol 2002 169：6482-6489；Blease等，J.Immunol 2001 166(8)：5219-5224)。
在补充实验中，通过在转基因小鼠中过表达或者在野生型小鼠气管中滴注IL-13的方法使肺部IL-13水平得到提高。两种情况中都诱导出类似哮喘的特征：对胆碱能刺激的非特异性呼吸道超反应、肺嗜酸粒细胞增多、上皮细胞增生、粘液细胞组织转化、上皮下纤维化、呼吸道阻塞和类Charcot-Leyden晶体。此外，IL-13被发现是肺中基质金属蛋白酶和组织蛋白酶蛋白酶的强力刺激物，能导致气肿性变化和粘液组织转化。因此IL-13可能是哮喘和COPD病表型的重要效应物分子(Zhu等，J.Clin.Invest.1999103(6)：779-788；Zheng等，J.Clin.Invest.2000 106(9)：1081-1093)。
这些资料表明要在充分证实的动物模型中产生过敏性哮喘的一些主要临床和病理学特征，IL-13活性是必需而充分的。
慢性阻塞性肺病(COPD)
COPD(Chronic Obstructive Pulmonary Disease)是一个概括性名称，它涵盖的几种临床综合征包括肺气肿和慢性支气管炎。COPD的症状与哮喘类似，可以用同样的药物来治疗。COPD的特征在于慢性、渐进和一般来说无法逆转的呼吸道阻塞。个体因素对疾病进程的影响还是未知的，但人们认为90％的病例是由吸烟引起的。其症状包括咳嗽、慢性支气管炎、无法呼吸以及呼吸道感染。最终该病会造成严重的功能障碍和死亡。在没有其他解释的情况下，患者在2年以上时间内至少3个月内多数时候都有咳嗽或者生痰就诊断为慢性支气管炎。肺气肿的特征是异常的充气容积永久性扩张和肺泡壁被破坏。
IL-13可能对COPD的发展起到一定作用。吸烟者中逐渐形成COPD的人的肺实质中有许多炎症细胞类型(嗜中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞)。IL-13是一种促炎Th2细胞因子，因此为了模拟肺气肿的进展，zheng等在IL-13转基因小鼠中在呼吸道上皮定向过表达了IL-13。这些动物逐渐发展出呼吸道和肺实质炎症以及肺气肿。它们还发展成让人联想到慢性支气管炎的粘液组织转化(J.Clin.Invest 2000 106(9)：1081-1093)。
也有报道说，与过敏性哮喘相关的IL-13启动子多态性(-1055C到T)在COPD患者中的发生率比健康对照更高。这暗示着IL-13启动子多态性在更有发展成COPD的危险性中起到作用(Kraan等，Genes and Immunity 20023：436-439)。此外，在得了慢性支气管炎的吸烟者中还观察到IL-13和IL-4阳性细胞比未表现症状的吸烟者的数量升高(Miotto等，Eur.Resp.J.200322：602-608)。但是最近一项研究检测了肺气肿重症患者的肺中IL-13表达水平，没有发现IL-13水平与该病相关(Boutten等，Thorax 2004 59：850-854)。
过敏性疾病包括特应性皮炎和过敏性鼻炎
IL-13还显示出与特应性紊乱，比如特应性鼻炎(atopic rhinitis)和特应性皮炎(atopic dermatitis)有关。在美国过敏性鼻炎(allergic rhinitis)是最普遍的特应性疾病，估计该病影响到多达25％的成人和超过40％的儿童。过敏性鼻炎和哮喘有很大的关系。两种症状有相同的免疫病理学和病理生理学；它们有类似的免疫学过程，在该过程中鼻和支气管组织中的嗜酸性粒细胞和Th2淋巴细胞起到一些作用。Th2细胞因子，特别是IL-4和IL-5的过量产生被认为是过敏性疾病的致病原因基础。IL-13与IL-4有一些共同的特性和效应子功能，这一点加上IL-4和IL-13在受体使用、胞内信号转导成分、和基因构成上的功能重叠提供了有力(虽然是间接)的证据，证明IL-13在促进或者维持人体内直接超敏感性中的作用。这已经由Li等确认了(Li等，JImmunol 1998；161：7007)，他们证明患有季节性过敏性鼻炎的特应性研究对象在应答依赖于Ag而非多克隆激活时，表现出更强的IL-13应答。
特应性皮炎是一种常见的慢性、复发性、非常痒的炎性皮肤病。特应性皮炎患者的皮损在组织学上的特征是炎性T细胞渗透，这一点在急性发病期与优势性地表达IL-4、IL-5以及IL-13联系在一起(Simon等，J AllergyClin Immunol 2004；114：887；Hamid等.J Allergy Clin Immunol 1996；98：225)。此外，Tazawa等证实特应性皮炎患者的亚急性和慢性皮损中IL-13(而非IL-4)mRNA显著上调(Tazawa等，Arch Derm Res 2004；296：459)。这些患者中循环CD4+和CD8+T细胞表达IL-13的频率也有显著提高(Aleksza等，British J Dermatol 2002；147；1135)。IL-13活性提高被认为会导致血清IgE水平升高，从而促进特应性皮炎的病理发生。而且，新生儿CD4+T细胞产生的IL-13增加是一个很有用的标志，可以用于识别那些随后发展成过敏性疾病，尤其是特应性皮炎的高发生新生儿(Ohshima等，Pediatr Res 2002；51：195)。Simon等(Simon等，J Allergy Clin Immunol 2004；114：887)提供了更多证据表明IL-13对于特应性皮炎的病原学重要性；局部使用他克莫司软膏(一种免疫抑制药物，能够抑制细胞因子产生的胞内信号转导途径)使得特应性皮损在临床和组织学方面得到显著的改善，并且伴有Th2细胞因子(包括IL-13)的局部表达明显减少。此外，特应性皮炎患者的皮肤上基部角质细胞上出现IL-13 Rα1(一种细胞表面蛋白，它与IL-4Rq一起形成IL-13的功能性受体)的过表达，并且IL-13能够在体外上调IL-13 Rα1 mRNA(Wongpiyabovorn等，J Dermatol Science 2003；33：31)。
这些资料共同表明针对性地干涉IL-13，包括使用IL-13单克隆抗体，可能能够提供一种治疗人过敏性疾病的有效措施。
食管嗜酸粒细胞增多
食管中嗜酸粒细胞聚集是一个常见的医学问题，在多种疾病患者中出现，包括胃食管反流病、嗜酸性食道炎、嗜酸粒细胞性胃肠炎和寄生虫感染。食管嗜酸粒细胞增多(esophageal eosinophilia)和过敏反应有关，反复用气传致敏原攻击小鼠把过敏性呼吸道炎症和食管嗜酸粒细胞增多联系在了一起。Th2细胞被认为能够通过分泌包括IL-4和IL-13在内的一系列细胞因子来诱导嗜酸粒细胞-相关的炎症，这些细胞因子能直接或者间接地激活炎性和效应子途径。IL-13似乎尤其重要，因为它由Th2细胞大量产生，并调节过敏性疾病的多种特性(例如，IgE生成、粘液过多、嗜酸粒细胞补充和存活以及呼吸道超敏反应)。在体外、间接体内、和直接体内的条件下，接触GM-CSF和/或IL-5之后，嗜酸粒细胞在嗜酸粒细胞性炎症反应中能够生成有功能的活性IL-13(Schmid-Grendelmeier，J Immunology 2002，169：1021-1027)。将IL-13通过气管内给药递送到野生型、STAT-6、嗜酸粒细胞激活趋化因子(eotaxin)-1或IL-5缺陷小鼠的肺部，这一实验确认了IL-13引发的肺部炎症是和食管嗜酸粒细胞增多症的发病联系在一起的(Mishra等，Gastroenterol 2003；125：1419)。这些资料合在一起证明IL-13在食管嗜酸粒细胞增多症中有一定的作用。
肿瘤学指征
另外一个重要的兴趣所在是针对IL-13或IL-13受体来抑制一些类型肿瘤的生长。1型T细胞介导的宿主防御被认为能够介导体内最有力的肿瘤排斥，而偏离到Th2型反应就可能导致肿瘤排斥被阻断以及/或者促进肿瘤的复发(Kobayashi M等，J Immunology 1998；160：5869)。一些利用可移植的肿瘤细胞系进行的动物研究，通过证明Stat6、IL-4和IL-13(部分由NKT细胞产生)能够抑制肿瘤排斥支持了这一论点(Terabe等，Nat.Immunol.2000；1：515；Kacha等，J Immunol 2000；165：6024-28；Ostrand-Rosenberg等，JImmunol 2000；165：6015)。在缺少Stat-6的情况下出现的强抗肿瘤活性被认为是由于肿瘤特异性IFNg的产生以及CTL活性都增强了。此外，已有证明NKT细胞减少会使IL-13的产量下降，同时肿瘤复发率上升，该现象表明IL-13(其部分由NKT细胞产生)对于免疫监督是重要的(Terabe等，Nat.Immunol 2000；1：515)。因此，这些发现提示IL-13抑制物或者新的IL-13拮抗剂(包括IL-13单抗)通过干扰IL-13的负调节作用，即下调对肿瘤细胞的免疫反应，可能成为有效的癌症免疫治疗剂。除了促进Th-1型相关的抗肿瘤防御，IL-13抑制物可能还可以更直接地阻断肿瘤细胞生长。例如，在慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)和何杰金氏病的情况中，IL-13能够阻断细胞凋亡或者促进肿瘤细胞增殖(Chaouchi等，Blood 1996；87：1022；Kapp等，J.Exp.Med.1999；189：1939)。B-CLL是一种起源于B淋巴细胞的临床上异源的疾病，该病牵扯到白血病细胞的细胞凋亡缺陷。人们不认为IL-13是一个直接的生长因子，而是它能防止肿瘤细胞的体外自发凋亡，而且可能借着使赘生性细胞免于死亡对B-CLL起到作用。
何杰金氏病(Hodgkin’s disease)在美国是一类主要影响年轻人的淋巴癌，每年多达7500例。这种癌症的特点是存在大量的多核化何杰金/Reed-Stemberg细胞(H/RS)。绝大多数病例中，恶性细胞群是从B细胞开始出现的。几种来源于何杰金氏病的细胞系，以及从何杰金氏淋巴癌患者取到的淋巴节组织都能过表达IL-13和/或IL-13受体(Kapp等，J.Exp.Med.1999；189：1939，Billard等，Eur Cytokine Netw 1997；8：19；Skinnider等，Blood 2001；97：250；Oshima等，Cell Immunol 2001；211：37)。实验显示中和抗IL-13单抗或者IL-13拮抗剂以剂量依赖性的方式抑制了H/RS细胞的增殖(Kapp等，J.Exp.Med.1999；189：1939；Oshima等，Cell Immunol 2001；211：37)。类似地，利用移植来源于何杰金氏病的细胞系将可溶性IL-13Rα2引诱受体递送给NOD/SCID小鼠使得肿瘤发生和生长被延迟，存活率提高，这一结果表明中和IL-13在体外和体内都可以抑制何杰金氏淋巴癌的生长(Trieu等，CancerResearch 2004；64：3271)。这些研究结合在一起说明了IL-13是以自分泌的方式刺激H/RS细胞的增殖(Kapp等，J.Exp.Med.1999；189：1939；Ohshima等，Histopathology 2001；38：368)。
因此中和IL-13可能代表了一种很有吸引力的有效治疗何杰金氏病和其他B细胞相关的癌症的方法，这种方法能抑制肿瘤细胞生长，同时强化抗肿瘤防御。
炎症性肠病
IL-13可能在炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)发病机制中起一定作用。炎症性肠病包括几种疾病，在临床上分为溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis)、节段性回肠炎(Crohn’s disease)和原因不明结肠炎(indeterminatecolitis)。其主要表现是由过度免疫反应和肠粘膜中Th1和Th淋巴细胞激活失衡所致的慢性肠炎。这在节段性回肠炎(Bamias等，Gastroenterol 2005；128：657)和溃疡性结肠炎(Heller等，Immunity 2002；17：629)动物模型中已证实。通过给予13Rα2-Fc中和IL-13，能在人溃疡性结肠炎的Th2小鼠模型中预防结肠炎(Heller等，Immunity 2002；17：629)。此外，该模型中IL-13的产量迅速超过IL-4的产量，而IL-13的产生可以通过刺激NKT细胞来诱导，这提示组织损伤可能是由于IL-13对上皮细胞的毒性造成的。有一些人体数据可以支持这些发现：从溃疡性结肠炎患者中取得的直肠活体解剖样品的IL-13阳性几率明显高于炎性和非炎性对照研究对象，急性也比非急性溃疡性结肠炎中观察到的IL-4和IL-3表达率更高(Inoue等，Am J Gastroenterol1999；94：2441)。另外，Akido等研究了节段性回肠炎患者肠段外肌层的免疫活性，发现IL-4和IL-13通过STAT-6途径介导肠平滑肌细胞的超收缩性。作者总结说该途径可能促成节段性回肠炎患者的肠肌超收缩(Akiho等，AmJ Physiol Gastrointest Liver Physiol 2005；288：619)。
因此，IL-13单抗，或许与针对其他细胞因子的分子结合起来可能能够提供一种终止或者减缓IBD恶化的方法。
银屑病和银屑病性关节炎
银屑病(psoriasis)是一种慢性皮肤病，其特征在于角质细胞过度增殖和免疫细胞(包括活化的T细胞)渗透，产生各种会影响皮肤角质细胞表型的细胞因子。CDw60是一个带有碳水化合物的分子，它在银屑病皮肤的银屑基部和上基部角质细胞表面被上调。源自银屑病损伤的T细胞所分泌的IL-4和IL-13能够强烈地上调CDw60在角质细胞上的表达(Skov等，Am J Pathol1997；15：675)，而γ干扰素能阻断由IL-4/IL-13介导的对培养角质细胞上的CDw60的诱导(Huang等，J Invest Dermatol 2001；116：305)。因此，CDw60在银屑皮肤角质细胞上的表达被认为至少部分受到皮损内活化T细胞所分泌的IL-13的诱导。此外，一起构成IL-13受体复合物的细胞表面蛋白IL-13 Rα1和IL-4Rα在有和没有银屑病的患者的皮肤活体解剖样品中表达是不同的(Cancino-Diaz等，J Invest Dermatol 2002；119：1114；Wongpiyabovorn等，JDermatol Science 2003；33：31)，体外实验显示IL-13(而非IL-4)能够上调IL-13Rα1的表达(Wongpiyabovorn等，J Dermatol Science 2003；33：31)。由于IL-13能够作用于许多细胞类型，这些研究提示出IL-13受体可能在银屑病的早期发炎过程中发挥作用。
银屑病性关节炎(psoriatic arthritis)的特点是由促炎性和抗炎性细胞因子介导的滑膜炎。IL-13在不同形式的关节炎中的作用越来越受关注。Spadaro等还观察到银屑病性关节炎和类风湿关节炎患者滑膜液中IL-13浓度显著高于骨关节炎患者的。此外，银屑病性关节炎患者滑膜液中IL-13浓度显著高于血清中的，IL-13的滑膜液/血清比率在银屑病性关节炎组中明显高过类风湿关节炎组，这提示，局部产生的IL-13可能在银屑病性关节炎患者的滑膜组织中发挥一定作用(Spadaro等，Ann Rheum Dis 2002；61：174)。
IL-13在其他症状中的可能作用
急性移植物抗宿主病是在干细胞移植之后致残和致死的重要原因，且该病与供体和受体之间的人白细胞抗原(HLA)不相容程度直接相关。Jordan等首次认定IL-13是一种典型的Th2细胞因子，它在不相关、不匹配MLR(混合淋巴细胞反应；一种体外检测，用于初步HLA分型之后的供体细选)情况中会大量产生(Jordan等，J Immunol Methods 2002；260：1)。该研究小组随后证实，在无关供体干细胞移植之后，供体T细胞产生的IL-13预示着急性移植物抗宿主病(aGVHD)(Jordan等，Blood 2004；103：717)。所有在干细胞移植后发生严重的III级aGVHD的患者，其供体都是产生过非常高的移植前IL-13反应，这一点表明IL-13水平和aGVHD之间有极大的关联，加大了IL-13直接引起一些aGVHD相关的病理机制的可能性。因此，基于特异性阻断IL-13的治疗方法可能能用来治疗干细胞移植后aGVHD。
糖尿病肾病(diabeti nephropathy)是西方国家中晚期肾病的主要原因之一。虽然1型糖尿病导致的肾病发病率在下降，现在2型糖尿病在美国、日本和欧洲是引起肾衰竭最常见的单一因素。此外，因为心血管原因导致的死亡率非常高，这个患者群的维持性透析预后极差。目前越来越清楚的是，血流动力学、代谢以及结构变化是交织在一起的，也鉴定到了在该病发病机理中发挥作用的各种酶、转录因子和生长因子。特别是TGF-β对肾肿大的病情发展和胞外基质成分的累积非常重要，被认为是介导肾脏中胶原形成的关键性细胞因子(Cooper，Diabetologia 2001；44：1957；Wolf，Eur JClin Invest 2004；34(12)：785)。在实验性和人糖尿病肾病中，TGF-1生物活性提高，将TGF-β1抗体给予糖尿病小鼠能够改善肾功能，并减少细胞外的基质累积。最近在肺纤维化的转基因小鼠模型中显示，IL-13的作用至少部分是通过调节TGF-β1的产生和激活以及胶原累积来介导的(Lee等，J.Exp.Med.2001；194：809；Zhu等，J.Clin.Invest.1999；103：779)，这样就在IL-13和TGF-β之间建立起直接的功能联系。因此我们可以预见到IL-13在糖尿病肾脏中有类似的调节TGF-b1活性的作用，针对IL-13进行干扰可能在对付糖尿病肾病时发挥作用。
纤维变性疾病
肺纤维化(pulmonary fibrosis)是一种不当的、有害的肺部生疤痕症状，会致残，甚至经常造成死亡。这个名词涵盖了多种不同症状，它们的病因、发病机理以及对治疗的反应各有不同。在一些病例中可以确定纤维化的起因。这些原因包括(1)吸入促纤维化物质，比如石棉或硅，或者硬金属粉尘(2)吸入患者对其有特应性免疫反应的有机物，导致纤维化(例如农民肺)(3)药物，比如硝基呋喃托英、乙胺碘呋酮和氨甲蝶呤(4)与系统性炎症有关，比如系统性硬化病或者类风湿性关节炎。
但是在许多情况中病因或者伴随的症状不明。许多这样的患者就诊断为自发性肺纤维化(IPF)，这种情况相对较少(发生率为20/100000)。这是在没有可识别病因的基础上，结合一些放射学和病理学特征，尤其是CT上的蜂窝影象或肺活体解剖做出的诊断。该病一般见于老年患者(＞50)，经常跟在不断发展的渐进性肺损伤之后，会导致死亡，平均存活期为2-5年。而且，患者在几个月或几年的病情发展过程中会经历非常痛苦的无法呼吸。这一点在开始会限制体力活动，但患者在末期(可能持续几个月)即便是休息时也无法呼吸，愈加依赖氧气。
目前该病还没有令人满意的治疗方法。现在一般采用皮质类固醇和免疫抑制剂(比如硫唑嘌呤)来治疗。但是皮质类固醇对许多患者可能无效，它们的副作用也许使病情加重。目前正在研究的许多可能的治疗方法包括使用干扰素γ和吡非尼酮，其中前者在最近一个大型研究中显示出有提高存活率的倾向。
有证据表明IL-13以及Th2表型相关的细胞因子参与了组织修复的纤维化过程(Wynn TA，Nat.Rev.Immunol.2004 4：583-594；Jakubzick等，Am.J.Pathol.2004 164(6)：1989-2001；Jakubzick等，Immunol.Res.2004 30(3)：339-349；Jakubzick等，J.Clin.Pathol.2004 57：477-486)。IL-13和IL-4似乎参与到许多纤维变性疾病中。血吸虫诱导的肝纤维化表现出IL-13依赖性，很少有证据表明硬皮病的致病机理涉及到IL-13(Hasegawa等，J.Rheumatol.199724：328-332；Riccieri等，Clin.Rheumatol.2003 22：102-106)。
就肺纤维化而言，体外实验已经显示IL-13能够促进纤维发生表型。动物研究表明在人为诱导的纤维化模型中IL-13的表达水平上升，而消除IL-13可以减轻纤维化。
IL-13能促进促纤维化表型。在细胞水平上有多种机制是IL-13可能借以促进纤维化的。这些机制的信号转导途径及其重要性还没有得到很好的解释。
有证据表明，IL-13作用于成纤维细胞可以促进胶原产生并抑制其降解，从而有利于纤维化表型。皮肤成纤维细胞具有IL-13受体，培养的皮肤成纤维细胞暴露于IL-13导致胶原生成增加(Oriente et al，J.Pharmacol.Exp.Ther.2000 292：988-994)。IL-4也有类似但更短暂的效果。人肺成纤维细胞系ICIG7表达II型IL-4受体(Jinnin et al.，J.Biol.Chem 2004 279：41783-41791)。将这些细胞暴露于IL-13可促进多种炎症介质和促纤维化介质的分泌：GM-CSF，G-CSF，VCAM β1整联蛋白(Doucet et al，Int.Immunol.1998 10(10)：1421-1433)。
IL-13能够抑制皮肤成纤维细胞在IL-1a的诱导下产生基质金属蛋白酶1和3，这样会使EC基质的分解减少(Oriente等，J.Pharmacol.Exp.Ther.2000292：988-994)。IL-13与TGF-β协同作用于由哮喘呼吸道生物解剖得到的人成纤维细胞，从而促进金属蛋白酶1(TIMP-1)的组织抑制剂的表达。胞外基质的分解受到基质蛋白酶的影响，后者被TIMP-1所抑制。因此IL-13的这一作用会减少基质的降解(Zhou等，Am.J.Physiol.Cell Physiol.2005 288：C435-C442)。
转基因小鼠过表达IL-13导致了上皮下纤维化、上皮细胞肥大、杯形细胞增生、晶体蓄积(酸性哺乳动几丁质酶)、呼吸道超反应、间质纤维化、2型细胞肥大和表面活性剂累积(Zhu等，J.Clin.Invest.1999 103(6)：779-788)。
不同小鼠株对博莱霉素诱导的肺纤维化的易感性不同。C57B1/6J小鼠对博莱霉素敏感，迅速显示出IL-13、IL-13Rα和IL-4(以及TGFβ、TNFRα和ILI Rs)的上调。不敏感的BALB/c小鼠不表现IL-13的上调。
Belperio等(Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.2002 27：419-427)在小鼠博莱霉素纤维化模型中研究了IL-13、IL-4和CC趋化因子C10的表达和功能。受到博莱霉素的作用，肺组织的IL-13和IL-4水平都提高了。通过检测肺羟脯氨酸浓度可以看到，用多克隆抗IL-13抗体预先将IL-13中和能够显著地降低博莱霉素诱导的肺纤维化。虽然在同一模型中IL-4表达也上升了，中和IL-4对肺纤维化没有影响。
另一个用FITC诱导BALB/c小鼠的急性肺纤维化模型中，在没有IL-13(基因敲除)、但有IL-4的情况下，可以抗肺纤维化。在IL-13基因敲除小鼠中再敲除IL-4没有附加的保护作用(Kolodsick等，J Immunol 2004172：4068-4076)。缺少IL-13情况下的保护作用不是由于细胞聚集到肺部有差异：在所有的基因敲除株和BALB/c中，聚集的细胞总数是类似的，所以起始阶段的炎症成分似乎没有受到影响。与BALA/c相比，IL-4和IL-13敲除株的亲酸粒细胞聚集要低，但是因为IL-4-/-没有免于纤维化，这一点不能解释纤维化差异。似乎令人惊讶的是，IL-13+/+和-/-的细胞因子(包括IL10、MCP-1、γ干扰素、TGF-í)水平没有差别。此外，不同动物用FITC处理后从肺中分离的成纤维细胞数量相同，但是在IL-13-/-小鼠中胶原蛋白I的产量减少。这表明失去IL-13不是简单地防止炎症反应，而是具有更特异的抗纤维化作用。IL-13曾经被认为可能是通过TGF-í发挥其成纤维化效果的(Lee等，J.Exp.Med.2001 194：809-821)。但是在这个FITC模型中，IL-13敲除小鼠的TGF-í的表达没有下降。
白细胞介素4因为和IL-13借助相同的受体起作用，人们预计它能发挥与IL-13类似的效果。籍博莱霉素诱导肺纤维化小鼠的肺中IL-4被显著上调(Gharaee-Kermani等，Cytokine 2001 15：138-147)。但是在C57BL6/J小鼠(过表达IL-4)、IL-4敲除和野生型中比较博莱霉素诱导的肺纤维化时，Izbicki等(Am.J.Physiol.Lung Cell Mol.Physiol 2002 283(5)：L1110-L1116)没有发现证据支持IL-4参与了肺纤维化。IL-4敲除株的纤维化没有下降，而IL-4过表达小鼠纤维化水平上升。
BAL IL-13细胞因子水平在多种形式的肺纤维化患者中显著提高，但程度有很大差异。从肺纤维化患者取到的尘细胞中IL-13的表达明显被上调。
最有力的临床证据来自于在密歇根大学进行的研究。Jakubzick及其同事研究了肺纤维化患者手术肺活体样品中IL-13、IL-4以及它们的受体的基因表达。来自IPF感染的肺的样品中IL-13基因表达比来自正常肺或者其他肺纤维化症状的样品的明显更高。和有正常肺或者其他形式肺纤维化的患者活体解剖获得的组织和成纤维细胞相比，从IPF/UIP患者培养得到的成纤维细胞表达的IL-13和IL-4受体增加了。特别是被认为是疾病活动中心的成纤维细胞病灶针对这些受体的染色非常强(Jakubzick等，J Immunol 2003171：2684-2693；Jakubzick等，Am.J.Pathol.2003 162：1475-1486；Jakubzick等，Am.J.Pathol.2004 164(6)：1989-2001；Jakubzick等，Immunol.Res.200430(3)：339-349；Jakubzick等，J.Clin.Pathol.2004 57：477-486)。
有很好的体外证据表明Th2细胞因子总体来说，尤其是IL-13能够促进促纤维化表型。至少已有两种动物模型显示可以通过去除IL-13(在基因敲除中或使用抗IL-13抗体)来降低化学物诱导的纤维化。有些证据表明就促进肺纤维化而言，IL-13比比IL-4更重要。证明IL-13在肺纤维化中的作用的临床证据提示IL-13及其受体在IPF患者的肺中被上调。
越来越多的资料显示了基于IL-13的治疗方法在治疗多种成纤维病症中的重要作用，这些病症包括血吸虫病诱导的肝纤维化和各种形式的肺纤维化(例如IPF[在别处讨论过]、硬皮病)。
在多个模型中进行的实验，将IL-4和IL-13分别抑制，证实了IL-13是主要的纤维化效应细胞因子(Chiaramonte等，J.Clin.Invest.1999；104：777-785；Blease等，J Immunol 2001；166：5219；Kumar等，Clin.Exp.Allergy2002；32：1104)。在血吸虫病中，虽然IL-13封闭剂不会影响虫卵诱发的炎症反应，IL-4持续不断地产生的情况下，慢性感染的动物体内胶原蓄积还是下降了85％以上(Chiaramonte et al J.Clin.Invest.1999；104：777；Chiaramonteet al Hepatology 2001；34：273)。
hIL-13的氨基酸序列如SEQ.ID.NO：9(这是成熟蛋白的序列，即不包含信号序列)所示。编码hIL-13的cDNA如SEQ.ID.NO：10所示(这是成熟蛋白的序列，即不包含信号序列)。
本说明书中公开的所有专利和参考文献(包括被本申请要求优先权的任何专利申请)都是明确完整地引入此文作为参考。
最近，WO 02/070711中描述了借助提高抗IL-13的免疫应答来治疗哮喘的疫苗。也有人阐述了IL-13在皮肤对环境过敏原进行感应中的作用(Herrick等，J Immunology 2003，170：2488-2495)。
本发明提供了一种称为6A1的抗体。如下文所述，6A1与hIL-13的结合表现为依赖于SEQ.ID.NO：9中107位点的精氨酸的存在。有报道说SEQ.ID.NO：9中107位点的精氨酸是参与hIL-13/hIL-13R相互作用的一个重要残基。Thompson JP和Debinski W(1999)(J.Biol.Chem.24卷，No：42，29944-29950页)称，“hIL13 α-螺旋A中位点13和16的谷氨酸，螺旋C中位点66和69的精氨酸和丝氨酸，以及螺旋D中位点109的精氨酸在诱导生物信号传递中非常重要，因为它们的定点突变导致功能的失去和/或获得”(见摘要和全文)。由于本发明人使用的编号方法与这篇文章作者不同，该文章中109位点的精氨酸等同于本说明书中SEQ.ID.NO：9的107位。因此6A1与hIL-13的结合涉及到hIL-13中的一个残基，该残基以前就被认为对hIL-13/hIL-13R相互作用非常重要，因此对IL-13途径的生物信号转导也非常重要。
发明概述
因此，本发明提供了治疗用抗体或其抗原结合片段，它们能够特异性结合并中和hIL-13的活性。参见例如下表A。
本说明书中通篇使用的名词“特异性结合”在涉及到本发明抗体和其抗原结合片段时，表示结合hIL-13的抗体与其他人蛋白质，特别是人IL-4不结合或者只有不明显的结合。但是该词不排除本发明抗体可能与食蟹猴IL-13有交叉反应的事实。
本发明另一方面提供了治疗用抗体或其抗原结合片段，它们能特异性结合hIL-13并能调节(例如抑制或阻断)hIL-13和hIL-13R之间的相互作用。所述抑制作用包括，但不限于竞争性抑制。在一些实施方案中，本发明抗体至少能抑制、也可以是阻断hIL-13和hIL-13R之间的相互作用，从而使hIL-13/hIL-13R信号转导途径中断(decoupling)。
另一方面，本发明提供了治疗用抗体或其抗原结合片段，它们能特异性结合hIL-13并含有具有SEQ.ID.NO：3所示序列的CDRH3。
本发明的再一方面，提供了治疗用抗体或其抗原结合片段，它们能特异性结合hIL-13并含有具有SEQ.ID.NO：3所示序列的变体的CDRH3，其中该变体的所述CDRH3中的一或两个残基与SEQ.ID.NO：3中相应位点不同。
本发明的一方面提供了治疗用抗体或其抗原结合片段，它们能特异性结合hIL-13并含有以下CDR：
CDRH1：SEQ.I.D.NO：1
CDRH2：SEQ.I.D.NO：2
CDRH3：SEQ.I.D.NO：3
CDRL1：SEQ.I.D.NO：4
CDRL2：SEQ.I.D.NO：5
CDRL3：SEQ.I.D.NO：6
本说明书全文中抗体序列中的氨基酸残基是根据Kabat体系编号的。相似地，名词“CDR”、“CDRL1”、“CDRL2”″CDRL3″、″CDRH1″、″CDRH2″、″CDRH3″遵循Kabat等在[Sequences of proteins of Immunological Interest，NIH，1987]中提出的Kabat编号系统。“CDRH1”包括Kabat定义的CDRH1(残基31-35B)和Chothia定义的CDRH1(Chothia等(1989)；Conformations ofimmunoglobulins hypervariable regions；Nature 342：877-883页)，该序列段包含Kabat 26-32。因此根据本发明如下定义CDR：
CDR：残基
CDRH1：26-35B
CDRH2：50-65
CDRH3：95-102
CDRL1：24-34
CDRL2：50-56
CDRL3：89-97
本发明的另一方面提供了治疗用抗体或其抗原结合片段，它们包含具有SEQ.I.D.NO：7所示序列的VH区和具有SEQ.I.D.NO：8所示序列的VL区。
本发明另一方面提供了分离的抗体VH区，该区包含SEQ.I.D.NO：7或11、12、13、14(或基本上由这些序列组成，或由这些序列组成)。
本发明另一方面提供了治疗用抗体或其抗原结合片段，它们包含选自SEQ.I.D.NO：7或11、12、13、14的VH区。
本发明另一方面提供了治疗用抗体或其抗原结合片段，它们能竞争性地抑制包含SEQ.I.D.NO：3所示CDRH3的治疗用抗体与hIL-13的结合。
本发明另一方面提供了治疗用抗体或其抗原结合片段，它们能竞争性地抑制包含SEQ.I.D.NO：1、2、3、4、5和6所示CDR的治疗用抗体与hIL-13的结合。
本发明另一方面提供了治疗用抗体或其抗原结合片段，它们能竞争性地抑制包含SEQ.I.D.NO：18所示重链和SEQ.I.D.NO：22所示轻链的治疗用抗体与hIL-13的结合。
根据本发明，还提供了一种人源化的治疗用抗体，该抗体包含选自SEQ.I.D.NO：11、12、13、14的VH区和选自SEQ.I.D.NO：15、16的VL区。
本发明另一方面提供了治疗如下疾病或病症的人类患者的方法，所述疾病或紊乱对调节hIL-13和hIL-13R之间的相互作用有反应(比如哮喘、COPD、过敏性鼻炎、特应性皮炎)。该方法包括的步骤有，将治疗有效量的本文所述治疗用抗体或其抗原结合片段给予所述患者。
本发明还提供了本发明抗体之制备用于治疗一些疾病或病患的药物的用途，所述疾病或紊乱对调节hIL-13和hIL-13R之间的相互作用有反应。
本发明另一方面提供了一种特异性结合人IL-13的治疗用抗体，该抗体特异性结合人IL-13序列SEQ.I.D.NO：9中的残基97到108。根据下文公开的结果，本领域技术人员很清楚“SEQ.I.D.NO：9中的残基97到108”包括位点97和108。
本发明另一方面提供了治疗用抗体，该抗体能竞争性地抑制具有SEQ.I.D.NO：3所示CDRH3的治疗用抗体(比如包含SEQ.I.D.NO：18所示重链和SEQ.I.D.NO：22所示轻链的治疗用抗体)与人IL-13的结合，所述竞争性抗体能特异性结合人IL-13序列SEQ.I.D.NO：9中的残基97到108。
本发明另一方面提供了治疗用抗体，该抗体特异性结合人IL-13序列SEQ.I.D.NO：9中的残基103到107(包含位点103和107)，并能调节(例如抑制或阻断)hIL-13和hIL-13R之间的相互作用。
本发明的一个实施方案提供了一种药物组合物，该组合物包含一组治疗用单克隆抗体(一般是人的或人源化的)和可药用载体。其中前者能特异性结合人IL-13序列SEQ.I.D.NO：9中的残基103到107，并能调节(例如抑制或阻断)hIL-13和hIL-13R之间的相互作用。
本发明另一个实施方案提供了制备治疗用抗体的方法，其中所述抗体能特异性结合人IL-13序列SEQ.I.D.NO：9中的残基103到107，并能调节(例如抑制或阻断)hIL-13和hIL-13R之间的相互作用。该方法包括的步骤有在无血清培养基中培养重组宿主细胞，所述宿主细胞含有第一和第二载体，其中的第一载体包含编码所述抗体的重链的多核苷酸，第二载体包含编码所述抗体的轻链的多核苷酸。根据下文公开的结果，本领域技术人员很清楚“SEQ.I.D.NO：9中的残基103到107”包括位点103和107。
本发明另一实施方案提供了制备治疗用抗体的方法，其中所述抗体能特异性结合人IL-13序列SEQ.I.D.NO：9中的残基97到108，并能调节(例如抑制或阻断)hIL-13和hIL-13R之间的相互作用。该方法包括的步骤有，在无血清培养基中培养重组宿主细胞，所述宿主细胞含有第一和第二载体，其中的第一载体包含编码所述抗体的重链的多核苷酸，第二载体包含编码所述抗体的轻链的多核苷酸。
本发明另一实施方案提供了一种完整无损的(intact)治疗用抗体，该抗体能结合hIL-13，并调节(例如抑制或阻断)hIL-13和hIL-13R之间的相互作用，该抗体与SEQ.I.D.NO：9中的残基107相互作用。
本发明另一个实施方案提供了一种完整的治疗用抗体，该抗体能结合hIL-13并调节(例如抑制或阻断)hIL-13和hIL-13R之间的相互作用，其中所述治疗用抗体与hIL-13的结合取决于(或者正相关于)SEQ.I.D.NO：9中的位点107存在精氨酸残基。
发明再一实施方案提供了治疗用抗体，该抗体能特异性结合hIL-13并调节(例如抑制或阻断)hIL-13和hIL-13R之间的相互作用，并且它们的解离常数Koff在1.4×10-4到8.22×10-5s-1之间(例如用BiacoreTM测量到的)。所述抗体可包含SEQ.I.D.NO：3所示CDRH3或其变体，也可以除包含SEQ.ID.NO：3及其变体之外还含有SEQ.I.D.NO：1、2、4、5和6。
另一实施方案提供了一种抗体，该抗体能特异性结合hIL-13并调节(例如抑制或阻断)hIL-13和hIL-13R之间的相互作用。所述抗体可包含SEQ.I.D.NO：3所示CDRH3，可选择性地另外包含下列之一：SEQ.I.D.NO：1所示CDRH1、SEQ.I.D.NO：2所示的CDRH2、SEQ.I.D.NO：4所示的CDRL1、SEQ.I.D.NO：5所示的CDRL2以及SEQ.I.D.NO：6所示的CDRL3。其中所述抗体与食蟹猴IL-13(cIL-13)有交叉反应。
附图简述
图1
夹心ELISA显示浓度递增的单克隆抗体6A1与E.coli表达的重组人IL-13的结合。
图2A
ELISA显示浓度递增的单克隆抗体6A1对E.coli表达的重组人IL-13与人IL-13受体α1链结合的抑制能力。
图2B
ELISA显示浓度递增的单克隆抗体6A1对E.coli表达的重组人IL-13与人IL-13受体α2链结合的抑制能力。
图3
中和试验显示，浓度递增的单克隆抗体6A1对E.coli表达的重组人和食蟹猴IL-13在TF-1细胞增殖试验中的生物活性的抑制能力。
图4
中和试验显示，浓度递增的单克隆抗体6A1对哺乳动物细胞系(CHO细胞)表达的人IL-13在TF-1细胞增殖试验中的生物活性的抑制能力。
图5
中和试验显示，浓度递增的单克隆抗体6A1对E.coli表达的重组Q130人IL-13在TF-1细胞增殖试验中的生物活性的抑制能力。
图6
夹心ELISA显示6A1不与E.coli表达的重组人IL-4结合。
图7
IL5中和试验显示，6A1不能抑制E.coli表达的重组人IL-5在TF-1细胞增殖试验中的生物活性。
图8
夹心ELISA显示，浓度递增的嵌合6A1单抗与E.coli表达的重组人IL-13和食蟹猴IL-13的结合。
图9
夹心ELISA显示，浓度递增的8种人源化抗人IL-13单抗与E.coli表达的重组人IL-13的结合。
图10a
夹心ELISA显示，浓度递增的嵌合6A1、L1+A1和L2+A1与E.coli表达的重组人IL-13的结合。
图10b
夹心ELISA显示，浓度递增的嵌合6A1、L1+A1和L2+A1与E.coli表达的重组食蟹猴IL-13的结合。
图11
夹心ELISA显示，浓度递增的嵌合6A1、L1+A1和L2+A1与天然人IL-13的结合。
图12a
ELISA显示，浓度递增的单克隆抗体6A1、嵌合6A1、L1+A1和L2+A1对E.coli表达的重组人IL-13与人IL-13受体α1链结合的抑制能力。
图12b
ELISA显示，浓度递增的单克隆抗体6A1、嵌合6A1、L1+A1和L2+A1对E.coli表达的重组人IL-13与人IL-13受体α2链结合的抑制能力。
图13a
中和试验显示，浓度递增的6A1、嵌合6A1、L1+A1和L2+A1对E.coli表达的重组人IL-13在TF-1细胞增殖试验中的生物活性的抑制能力。
图13b
中和试验显示，浓度递增的6A1、嵌合6A1、L1+A1和L2+A1对E.coli表达的重组食蟹猴IL-13在TF-1细胞增殖试验中的生物活性的抑制能力。
图13c
中和试验显示，浓度递增的6A1、嵌合6A1、L1+A1和L2+A1对E.coli表达的重组Q130人IL-13在TF-1细胞增殖试验中的生物活性的抑制能力。
图13d
中和试验显示，浓度递增的6A1、嵌合6A1、L1+A1和L2+A1对哺乳动物细胞系(CHO细胞)表达的重组人IL-13在TF-1细胞增殖试验中的生物活性的抑制能力。
图14a
夹心ELISA显示，6A1、嵌合6A1、L1+A1和L2+A1不与E.coli表达的重组人IL-4结合。
图14b
夹心ELISA显示，6A1、嵌合6A1、L1+A1和L2+A1不与E.coli表达的重组人GM-CSF结合。
图14c
IL5中和试验显示，6A1、嵌合6A1、L1+A1和L2+A1不能抑制E.coli表达的重组人IL-5在TF-1细胞增殖试验中的生物活性。
图15
表位作图ELISA确定6A1与人和食蟹猴IL-13结合的表位。
图16a
表位作图ELISA鉴定6A1与人IL-13的确切结合特异性。
图16b
表位作图ELISA鉴定6A1与食蟹猴IL-13的确切结合特异性。
图17a
表位作图ELISA确定6A1与人IL-13结合的关键氨基酸残基。
图17b
表位作图ELISA确定L1+A1与人IL-13结合的关键氨基酸残基。
体17c和17d显示亲本(小鼠)6A1(图17c)和人源化L1-A1抗体的丙氨酸扫描分析。
发明详述
1.抗体结构
1.1完整抗体
完整抗体包括至少包含两个重链和两个轻链的异多聚体糖蛋白。除了IgM，完整抗体通常是大约150Kda的异四聚体糖蛋白，由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。一般来说，每个轻链借助一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫键数目有所不同。每个重链和轻链也有链内二硫键。每个重链一端是可变区(VH)，其后是数个恒定区。每个轻链在其另一端有可变区(VL)和恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区排列在一起，而轻链可变区与重链可变区排列在一起。来自多数脊椎动物物种的抗体之轻链可以根据恒定区的氨基酸序列归类为κ和λ这两种类型之一。根据其重链恒定区的氨基酸序列，人抗体可以分成5个不同种类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgG和IgA可以进一步划分到亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；以及IgA1和IgA2。小鼠和大鼠中至少存在物种变体IgG2a和IgG2b。抗体的可变区赋予抗体结合特异性，其中某些显示出特定可变性的区域被称为互补决定区(CDR)。可变区中较保守的区域被称为框架区(FR)。完整重链和轻链的可变区各包含4个通过3个CDR相连的FR。每个链的CDR借助FR区被紧密维系在一起，并与其他链的CDR共同形成抗体的抗原结合位点。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但显示出各种效应子功能，比如参与抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、借助于与Fcγ受体结合的吞噬作用、借助新生儿Fc受体(FcRn)的半衰期/清除率以及经由补体级联的C1q成分实现的补体依赖性细胞毒性。
因此，在本发明的一个实施方案中，我们提供了特异性结合hIL-13的完整的治疗用抗体，所述抗体能够调制(例如抑制或阻断)hIL-13和hIL-13R之间的相互作用。该完整的治疗用抗体可以包含前文所述任何同种型或其亚类的恒定区。在一个实施方案中，该抗体是IgG同种型，特别是IgG1。所述抗体可以来自大鼠、小鼠、兔、灵长类或人。在一个典型的实施方案中，该抗体来自灵长类(比如食蟹猴、旧大陆猴或者大猩猩，参见例如WO99/55369、WO93/02108)或人。
在另一个实施方案中，提供了包含SEQ.ID.NO：3所示CDRH3的分离的完整治疗用抗体。在另一个实施方案中，提供了一种包含具有SEQ.I.D.NO：1、2、3、4、5和6所示CDR的可变区的完整治疗用抗体。
在另一个实施方案中，提供了分离的鼠完整治疗用抗体或其抗原结合片段，它们包含具有SEQ.I.D.NO：7所示序列的VH区和SEQ.I.D.NO：8所示序列的VL区。
1.1.2人抗体
人抗体可以通过本领域技术人员已知的多种方法来制备。人抗体可以利用人骨髓瘤或小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(参见Kozbor J Immunol 133，3001，(1984)和Brodeur，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications p51-63，(Marcel Dekker Inc，1987))通过杂交瘤的方法获得。替代方法包括利用噬菌体文库或转基因小鼠，它们都用到人V区所有组成成分(参见Winter G，(1994)，Annu.Rev.Immunol 12，433-455；Green LL(1999)，J.Immunol.Methods 231，11-23)。
现在有多个转基因小鼠品系可供利用，其中它们的小鼠免疫球蛋白基因座已被人免疫球蛋白基因片段取代(参见Tomizuka K(2000)PNAS 97：722-727；Fishwild D.M(1996)Nature Biotechnol.14，845-851；Mendez MJ，1997，Nature Genetics 15，146-156)。用抗原进行攻击时，这些小鼠能够产生人抗体的所有组成成分，从中可选择出感兴趣的抗体。值得一提的是TrimeraTM系统(参见Eren R等，(1998)Immunology 93：154-161)，其中将人淋巴细胞移植到被辐射过的小鼠；选定的淋巴细胞抗体系统(SelectedLymphocyte Antibody System)(SLAM，见Babcook等，PNAS(1996)93：7843-7848)，该系统使人(或其他物种)的淋巴细胞有效地经历大量收集的体外抗体产生步骤，然后经历deconvulated有限稀释和选择过程；以及Xenomouse IITM(Abgenix Inc.)。Morphotek公司提供一种使用MorphodomaTM技术的替代方法。
噬菌体展示技术可以用于制备人抗体(及其片段)，参见McCafferty，Nature 348，552-553(1990)和Griffiths AD等，(1994)EMBO 13：3245-3260。按照该技术，抗体V区基因被框内克隆到丝状噬菌体(比如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因中，然后在噬菌体颗粒表面展示为(通常需借助于辅助噬菌体)功能性的抗体片段。基于抗体功能特征进行的挑选可以挑到显示出这些特性的抗体的编码基因。噬菌体展示技术可以用于从文库中挑选抗原特异性抗体，所述文库是由人B细胞制备来的，所述B细胞取自患有上述疾病或病症的个体，或者从未免疫过的人供体(见Marks，J.Mol.Bio.222，581-597，1991)。当需要包含Fc区的完整人抗体时，必须将噬菌体展示得到的片段再克隆至包含所需恒定区的哺乳动物表达载体，并建立起稳定的表达细胞系。可以利用亲和力成熟技术(Marks，Bio/technol 10，779-783(1992))来提高结合亲和力，该技术通过依次将H和L链的V区用其天然变体来代替，然后在结合亲和力提高的基础上进行挑选从而使得初级人抗体的亲和力获得提高。此技术经变化后的形式比如“表位印记”现在也有，见WO93/06213。还可参见Waterhouse，Nucl.Acids Res 21，2265-2266(1993)。
因此，本发明的另一个实施方案提供了分离的人完整治疗用抗体或其抗原结合片段，它们能特异性结合hIL-13并调制(例如抑制或阻断)hIL-13和hIL-13R之间的相互作用。
另一方面，提供了包含SEQ.I.D.NO：3所示CDRH3的分离的人完整治疗用抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段能特异性结合hIL-13并调制(例如抑制或阻断)hIL-13和hIL-13R之间的相互作用。再一方面，提供了分离的人完整治疗用抗体或其抗原结合片段，其包含具有如上文定义的SEQ.I.D.NO：1、2、3、4、5和6所示CDR的可变区。
1.2嵌合和人源化抗体
利用完整的非人类抗体治疗人类疾病或病症带有潜在的目前已被证实的免疫原性问题，即患者的免疫系统将非人类完整抗体识别为异己而发起中和反应。这在将非人类抗体多次给予人类患者的情况中尤其明显。多年来发展了多种技术来克服这些问题，这些技术一般涉及到减少完整抗体中的非人类氨基酸序列成分，但保留从接种动物(例如小鼠、大鼠或兔)获得非人类抗体的相对简易性。概括地说已有两种方法可以达到这个目的。第一种方法是嵌合抗体，其一般包含与人恒定区融合的非人类(例如啮齿类比如小鼠)可变区。因为抗体的抗原结合位点位于可变区内，嵌合抗体仍然具有对抗原的结合亲和力，但获得了人恒定区的效应子功能，因此能够发挥上文描述过的效应子功能。嵌合抗体一般利用重组DNA方法来制备。分离出编码抗体的DNA(例如cDNA)并用常规方法进行测序(例如使用能与编码本发明抗体的H和L链的基因，例如编码上述SEQ.I.D.NO：1、2、3、4、5和6的DNA特异性结合的寡核苷酸探针)。将杂交瘤细胞用作这类DNA的常见来源。所述DNA一经分离，即被插入表达载体，后者随后转染到如不经转染则不会产生免疫球蛋白的宿主细胞(比如E.coli、COS细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞)来合成抗体。这些DNA可以通过以编码人L和H链的序列替代相应的非人类(例如鼠)H和L链恒定区来进行修饰。参见Morrison，PNAS 81，6851(1984)。
第二种方法涉及制备人源化抗体，其中该抗体的非人类组分通过人源化可变区被减少了。有两种常用的人源化技术。第一种是通过CDR移植实现人源化。CDR在接近抗体N末端形成环状，在这里形成一个处于由框架区提供的支架之上的表面。抗体的抗原结合特异性主要是由其CDR表面的拓扑学和化学特性决定的。这些特征反过来又是由各个CDR的构象、CDR的相对安排以及包含CDR的残基侧链的特性和安排决定的。通过只将非人类(例如鼠)抗体(供体抗体)的CDR移植到人框架区(受体框架)和恒定区上可以大大降低免疫原性(见Jones等，(1986)Nature 321：522-525和VerhoeyenM等(1988)Science 239：1534-1536)。但是CDR移植本身可能不会导致抗原结合特性的完全保留，人们经常会发现：想要显著挽回抗原结合亲和力的话，必须在人源化分子中保留供体抗体中的某些框架残基(有时称为“回复突变”)(见Queen C等(1989)PNAS 86：10,029-10,033，Co，M等(1991)Nature 351，501-502)。这种情况下，为了提供人框架区(FR)就要从数据库中选择那些与非人类供体抗体序列同源性最高的人V区。人FR可以从人共有序列或者各个人抗体中进行挑选。必要时可以将供体抗体的关键残基取代到人受体框架区内以便保留CDR的构象。建立抗体的计算机模型可用于协助鉴定这些在结构上重要的残基，见WO99/48523。
替代地，人源化还可以通过“表面修饰(veneering)”的过程实现。对人和鼠独特的免疫球蛋白重链和轻链可变区进行的统计学分析揭示出人和鼠抗体中暴露残基的精确模式是不同的，多数个体表面位置强烈倾向于很少的几个不同残基(见Padlan E.A.等，(1991)Mol.Immunol.28，489-498和Pedersen JT.等(1994)J.Mol.Bio.235；959-973)。这样就有可能通过将其框架区中与通常在人抗体中发现的残基不同的暴露残基替换掉，从而降低非人Fv的免疫原性。因为蛋白质的抗原性可能与其表面可接近性相关，替换表面残基可能足以使得小鼠可变区是人免疫系统所“看不见”的(还可参见Mark G.E.等，(1994)Handbook of Experimental Pharmacology vol.113：Thepharmacology of monoclonal Antibodies，Springer-Verlag，105-134页)。这种人源化过程被称为“表面修饰化”，因为只改变了抗体的表面，而没有动支持残基。
因此，本发明另一实施方案提供了嵌合治疗用抗体，它包含融合了人恒定区(可能是IgG同种型，例如IgG1)的非人类(例如啮齿类)可变区，该抗体能够特异性结合hIL-13，并调制(例如抑制或阻断)hIL-13和hIL-13R之间的相互作用。
另一个实施方案中提供了包含非人类(例如啮齿类)可变区和人恒定区(可能是IgG同种型，例如IgG1)的嵌合治疗用抗体，该抗体能够特异性结合hIL-13，并进一步包含SEQ.ID.NO：3所示的CDRH3。所述抗体可以再进一步包含IgG同种型，例如IgG1的人恒定区。
另一个实施方案中提供了包含非人类(例如啮齿类)可变区和人恒定区(可能是IgG同种型，例如IgG1)的嵌合治疗用抗体，该抗体能够特异性结合hIL-13，并具有SEQ.ID.NO：1、2、3、4、5和6所示的CDR。
另一个实施方案中提供了嵌合治疗用抗体，它包含SEQ.ID.NO：7所示VH区和SEQ.I.D.NO：8所示VL区，以及IgG同种型，例如IgG1的人恒定区，该抗体能够特异性结合hIL-13并调制(例如抑制或阻断)hIL-13和hIL-13R之间的相互作用。
另一个实施方案中提供了人源化治疗用抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段能够特异性结合hIL-13并调制(例如抑制或阻断)hIL-13和hIL-13R之间的相互作用。
另一个实施方案还提供了人源化治疗用抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段能够特异性结合hIL-13并含有SEQ.ID.NO：3所示CDRH3。这些抗体还可以含有IgG同种型，例如IgG1的人恒定区。
另一个实施方案还提供了人源化治疗用抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段能够特异性结合hIL-13并含有SEQ.ID.NO：1、2、3、4、5和6所示CDR。这些抗体还可以含有IgG同种型，例如IgG1的人恒定区。
本发明还提供了人源化治疗用抗体，该抗体含有选自SEQ.ID.NO：11、12、13、14的VH区和选自SEQ.ID.NO：15、16的VL区。所述抗体可以包含IgG同种型，例如IgG1的人恒定区。
另一个实施方案还提供了人源化治疗用抗体，该抗体含有SEQ.ID.NO：11所示的VH区和SEQ.ID.NO：15所示的VL区。
另一个实施方案提供了人源化治疗用抗体，所述抗体含有SEQ.ID.NO：12所示的VH区和SEQ.ID.NO：15所示的VL区。
另一个实施方案还提供了人源化治疗用抗体，该抗体含有SEQ.ID.NO：13所示的VH区和SEQ.ID.NO：15所示的VL区。
另一个实施方案还提供了人源化治疗用抗体，该抗体含有SEQ.ID.NO：14所示的VH区和SEQ.ID.NO：15所示的VL区。
另一个实施方案还提供了人源化治疗用抗体，该抗体含有SEQ.ID.NO：11所示的VH区和SEQ.ID.NO：16所示的VL区。
另一个实施方案提供了人源化治疗用抗体，所述抗体含有SEQ.ID.NO：12所示的VH区和SEQ.ID.NO：16所示的VL区。
另一个实施方案还提供了人源化治疗用抗体，该抗体含有SEQ.ID.NO：13所示的VH区和SEQ.ID.NO：16所示的VL区。
另一个实施方案还提供了人源化治疗用抗体，该抗体含有SEQ.ID.NO：14所示的VH区和SEQ.ID.NO：16所示的VL区。
本发明另一个实施方案提供了特异性结合hIL-13的人源化治疗用抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其片段含有CDRH3(SEQ.I.D.NO：3)，任选进一步含有SEQ.I.D.NO：1、2、4、5和6的CDR。所述抗体或片段中选自人受体重链框架区19、38、73和81位的残基以及人受体轻链框架区的85位的残基被CDRH3所来源的供体抗体框架区中的对应残基取代。
对本领域技术人员显而易见的是，术语“来源于”不仅是用来定义材料就其物理起源意义上的来源，还介定了与所述材料结构相同(就一级氨基酸序列而言)但不是起源于参照源的材料。因此“在CDRH3所来源的供体抗体中发现的残基”不需要是已经从供体抗体中纯化过。
另一个实施方案中，提供了特异性结合hIL-13的人源化治疗用抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其片段含有SEQ.ID.NO：3所示CDRH3，任选进一步含有SEQ.I.D.NO：1、2、4、5和6所示的CDR，其中人重链框架含有一或多个(例如全部)下列残基(或它们的保守取代残基)：
位点 残基
38 I
19 R
73 T
81 R
人轻链包含以下残基
位点 残基
85 V
本领域公知，某些氨基酸取代被认为是“保守的”。氨基酸按照常见侧链特性分为几组，同一组内保留了本发明抗体或其抗原结合片段的全部或基本上全部结合亲和力的取代被认为是保守取代，见下表：
| 侧链 | 成员 |
| 疏水性 | met、ala、val、leu、ile |
| 中性亲水性 | cys、ser、thr |
| 酸性 | asp、glu |
| 碱性 | asn、gln、his、lys、arg |
| 影响链方向的残基 | gly、pro |
| 芳香族 | trp、tyr、phe |
本发明还提供了人源化治疗用抗体，其含有选自SEQ.I.D.NO：18、19、20、21的重链和选自SEQ.I.D.NO：22、23的轻链。
本发明的一个实施方案提供了特异性结合hIL-13的人源化治疗用抗体，所述抗体含有SEQ.ID.NO：18所示重链和SEQ.ID.NO：22所示轻链。
本发明的一个实施方案中提供了特异性结合hIL-13的人源化治疗用抗体，该抗体含有SEQ.ID.NO：19所示重链和SEQ.ID.NO：22所示轻链。
本发明的一个实施方案提供了特异性结合hIL-13的人源化治疗用抗体，该抗体含有SEQ.ID.NO：20所示重链和SEQ.ID.NO：22所示轻链。
本发明的一个实施方案提供了特异性结合hIL-13的人源化治疗用抗体，该抗体含有SEQ.ID.NO：21所示重链和SEQ.ID.NO：22所示轻链。
本发明的一个实施方案提供了特异性结合hIL-13的人源化治疗用抗体，该抗体含有SEQ.ID.NO：18所示重链和SEQ.ID.NO：23所示轻链。
本发明的一个实施方案提供了特异性结合hIL-13的人源化治疗用抗体，该抗体含有SEQ.ID.NO：19所示重链和SEQ.ID.NO：23所示轻链。
本发明的一个实施方案提供了特异性结合hIL-13的人源化治疗用抗体，该抗体含有SEQ.ID.NO：20所示重链和SEQ.ID.NO：23所示轻链。
本发明的一个实施方案提供了特异性结合hIL-13的人源化治疗用抗体，该抗体含有SEQ.ID.NO：21所示重链和SEQ.ID.NO：23所示轻链。
1.3双特异性抗体
双特异性抗体是指对至少两种不同表位有结合特异性的抗体。本领域已有制备这类抗体的方法。传统地，双特异性抗体的重组制备是基于共表达两个免疫球蛋白H链-L链对，而其中的两个H链具有不同的结合特异性。参见Millstein等，Nature 305：537-539(1983)，WO93/08829和Traunecker等，EMBO，10(1991)：3655-3659。因为随机组合H和L链，有可能产生10种不同抗体结构的混合物，而其中只有一种具备所需的结合特异性。一种替代的方法涉及到将具有所需结合特异性的可变区与重链恒定区融合在一起，其中的恒定区包含至少部分的铰链区、CH2和CH3区域。优选使至少一个融合体中存在含有结合轻链所需要的位点的CH1区。将编码这些融合体以及L链(如果需要的话)的DNA插入分开的表达载体，然后共转染到合适的宿主生物中。当然也可以将两个或全部三个链的编码序列插入一个表达载体。在一种优选的方法中，双特异性抗体由一个臂中具有第一种结合特异性的H链和另一个臂中提供第二种结合特异性的H-L链对组成，参见WO94/04690。还可见Suresh等，Methods in Enzymology 121，210，1986。
本发明的一个实施方案提供了双特异性治疗用抗体。所述抗体的至少一种结合特异性是针对hIL-13的，该抗体能调制(例如抑制或阻断)hIL-13和hIL-13R之间的相互作用。所述抗体可以进一步包含IgG同种型，例如IgG1的人恒定区。在一些实施方案中，所述双特异性治疗用抗体具有对hIL-13的第一结合特异性，能调制(例如抑制或阻断)hIL-13和hIL-13R之间的相互作用，以及对hIL-4的第二结合特异性，能调制(例如抑制或阻断)hIL-4和hIL-4受体之间的相互作用。
本发明的一个实施方案提供了双特异性治疗用抗体，其中该抗体的至少一种结合特异性是针对hIL-13的，所述抗体包含SEQ.I.D.NO：3所示CDRH3。这些抗体可以进一步包含IgG同种型，例如IgG1的人恒定区。
本发明的一个实施方案中提供了双特异性治疗用抗体，其中该抗体的至少一种结合特异性是针对hIL-13的，所述抗体包含至少SEQ.I.D.NO：1、2、3、4、5和6所示的CDR。这些抗体可以进一步包含IgG同种型，例如IgG1的人恒定区。
1.4抗体片段
本发明某些实施方案中提供了能够调节hIL-13和hIL-13R之间的相互作用的治疗用抗体片段。这些片段可以是完整和/或人源化和/或嵌合抗体的功能性抗原结合片段，比如上文所述抗体的Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ScFv片段。传统上这些片段是完整抗体经蛋白水解消化产生的，例如木瓜蛋白酶消化(参见例如WO94/29348)，但是也可以从重组转化的宿主细胞直接产生。对于产生ScFv，参见Bird等，(1988)Science，242，423-426。此外，还可以利用以下描述的多种基因工程技术来产生抗体片段。
与Fab片段相比，Fv片段的两条链似乎具有较低的相互作用能量。为了稳定VH和VL区之间的结合，它们曾经被连上肽(Bird等，(1988)Science242，423-426；Huston等，PNAS 85，5879-5883)、二硫键(Glockshuber等，(1990)Biochemistry 29，1362-1367)和“knob in hole”突变(Zhu等(1997)，Protein Sci.，6，781-788)。ScFv片段可以经本领域技术人员熟知的方法来制备(见Whitlow等(1991)，Methods companion Methods Enzymol，2：97-105 and Huston等(1993)Int.Rev.Immunol 10：195-217)。可以在细菌细胞(比如大肠杆菌)中产生ScFv，但优选在真核细胞中产生。ScFv的一个缺点是产物的单价性，这样使得抗体亲合力(avidity)不可能借助多价结合得到提高，并且它们的半衰期短。为了克服这些问题所进行的尝试包括由ScFv来制备双价(ScFv’)2，通过化学偶联(Adams等(1993)Can.Res 53，4026-4034和McCartney等(1995)Protein Eng.8，301-314)，或者使含有未配对C末端半胱氨酸残基的ScFv自发定点二聚体化(见Kipriyanov等(1995)Cell.Biophys 26，187-204)，使它含有另外一个C末端半胱氨酸。替代地，可以通过将肽接头缩短到3到12个残基来形成“双抗体(diabodies)”，强迫ScFv形成多聚体(Holliger等，PNAS(1993)，90，6444-6448)。进一步减少接头可以得到ScFV三聚体(“三链抗体”，参见Kortt等(1997)Protein Eng.10，423-433)和四聚体(“四链抗体”，见Le Gall等(1999)FEBS Lett 453，164-168)。构建二价ScFv分子还可以通过与蛋白质二聚体化基序(motif)进行基因融合以形成“微抗体(miniantibody)”(见Pack等(1992)Biochemistry 31，1579-1584)和“微体(minibody)”(见Hu等(1996)，Can.Res 56，3055-3061)来实现。还可以通过将两个ScFv借着第三个肽接头相连来制备ScFv-Sc-Fv串联((ScFV)2，见Kurucz等(1995)J Immunol 154，4576-4582)。双特异性双抗体可以通过将两个单链融合产物非共价连接来制备，所述融合产物由一个抗体的VH区通过短接头与另一抗体的VL区连接组成，参见Kipriyanov等(1998)，Int.J.Can 77，763-772。提高这些双特异性双抗体的稳定性可以通过引入二硫键或上文描述的“knob in hole”突变，或者是通过形成单链双抗体(ScDb)，该ScDb中两个杂合ScFv片段经肽接头相连，参见Kontermann等(1999)J Immunol.Methods 226，179-188。已有的四价双特异性分子是例如将ScFv片段经铰链区与IgG分子的CH3区或者Fab片段融合，见Coloma等(1997)Nature Biotechnol 15，159-163。替代地，四价双特异性分子可以通过融合双特异性单链双抗体来产生(参见Alt等，(1999)FEBS Lett 454，90-94)。较小的四价双特异性分子也可通过使ScFv-ScFv串联用含有螺旋-圈-螺旋基序的接头二聚体化来形成(DiBi微抗体，参见Muller等(1998)FEBS Lett 432，45-49)，或者使含四个抗体可变区(VH和VL)的单链分子二聚体化形成，所述四个可变区的方向防止分子内配对(串联双抗体，见Kipriyanov等，(1999)J.Mol.Biol.293，41-56)。双特异性F(ab’)2片段可以通过Fab’片段的化学偶联或者借助亮氨酸拉链异源二聚体化形成(见Shalaby等(1992)J.Exp.Med.175，217-225和Kostelny等(1992)，J Immunol 148，1547-1553)。分离的VH和VL区也已存在(Domantisplc)，见美国专利US 6,248,516；US 6,291,158；US 6,172,197。
本发明一个实施方案中提供了治疗用抗体片段(例如ScFv，Fab，Fab’，F(ab′)2)或者上文描述的工程化抗体片段，这些片段能特异性结合hIL-13并调节(例如抑制或阻断)hIL-13和hIL-13R之间的相互作用。所述治疗用抗体片段通常包含具有SEQ.ID.NO：3所示序列的CDRH3，以及任选具有SEQ.I.D.NO：1、2、4、5和6所示序列的CDR。
1.5异源偶联抗体
异源偶联抗体也构成了本发明的一个实施方案。异源偶联抗体由两个共价结合的抗体组成，其形成可利用任何方便的交联方法。参见例如专利US4676980。
1.6其它修饰
抗体的Fc区和各Fc受体(FcγR)之间的相互作用被认为能够介导抗体的效应子功能，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒活性(ADCC)、补体的固定、细胞吞噬作用和抗体的半衰期/消除。可以根据需要的特性对本发明抗体的Fc区进行各种修饰。例如EP0629240B1和EP0307434B2中详细描述的，在Fc区进行特定突变以使本来裂解性的抗体成为非裂解性的；或者可以在抗体中引入补救受体结合表位来提高其血清半衰期(见US5739277)。目前识别到的5种人Fcγ受体是FcγR(I)、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和新生儿(neonatal)FcRn。Shields等((2001)J.Biol.Chem 276，6591-6604)证明一组公用IgG1残基参与和所有FcγR的结合，而FcγRII和FcγRIII利用这组公用残基之外的一些独特位点。一组IgG1残基(Pro-238、Asp-265、Asp-270、Asn-297和Pro-239)被改成丙氨酸时对所有FcγR的结合力下降。它们全部位于IgG的CH2区，簇集在连接CH1和CH2的铰链附近。FcγRI只使用公用IgG1残基进行结合，而FcγRII和FcγRIII除了公用残基还与一些独特残基相互作用。改变一些残基(例如Arg-292)只减弱对FcγRII的结合或(例如Glu-293)减弱对FcγRIII的结合。一些变体显示出对FcγRII或FcγRIII的结合力提高，但对其他受体的结合不受影响(例如Ser-267A1a会提高对FcγRII的结合但不影响和FcγRIII的结合)。另外一些变体显示出对FcγRII或FcγRIII的结合提高，而和其他受体的结合下降(例如Ser-298A1a提高了对FcγRIII的结合，但FcγRII结合下降)。对FcγRIIIa来说，结合最好的IgG1变体综合了Ser-298、Glu-333和Lys-334的丙氨酸取代。新生儿FcRn受体被认为参与了抗体清除和跨组织的胞吞转运作用(见Junghans RP(1997)Immunol.Res 16，29-57和Ghetie等(2000)Annu.Rev.Immunol.18，739-766)。已知的与人FcRn有直接相互作用的人IgG1残基包括Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435。这部分描述的这些位点发生任何改变可能会提高本发明抗体的血清半衰期和/或改变它们的效应子特性。
其他修饰包括本发明抗体的糖基化变体。抗体恒定区保守位点发生糖基化对抗体功能有深刻的影响，尤其是比如上文描述的那些效应子功能，参见例如Boyd等，(1996)，Mol.Immunol.32，1311-1318。我们还考虑了本发明治疗用抗体或其抗原结合片段的糖基化变体，这些变体中增加、取代、删除或者修饰了一或多个碳水化合物部分。引入天冬酰胺-X-丝氨酸或者天冬酰胺-X-苏氨酸基序产生潜在的位点便于酶促附加碳水化合物部分，因此可用于操纵抗体的糖基化。在Raju等(2001)Biochemistry 40，8868-8876中，利用β-1，4-半乳糖基转移酶和/或α-2，3-唾液酸转移酶进行再半乳糖糖基化和/或再唾液酸化，可提高TNFR-IgG免疫粘附素的末端唾液酸化。提高免疫球蛋白的末端唾液酸化被认为能够延长其半衰期。与多数糖蛋白一样，抗体通常是以糖型混合物的形式产生的。当在真核，尤其是哺乳动物细胞中产生抗体时，这种混合物尤其明显。人们已经开发出多种方法来制备指定的糖型，参见Zhang等，Science(2004)，303：371；Sears等，Science(2001)291：2344；Wacker等(2002)Science 298：1790；Davis等(2002)Chem.Rev.102：579；Hang等(2001)Acc.Chem.Res 34：727。因此本发明考虑了多种如本文所述的治疗用(单克隆)抗体(可以是IgG同种型，例如IgG1)，这些抗体包含指定量(例如7或以下，例如5或以下，比如2或1个)的糖型的所述抗体或抗原结合片段。
本发明另外的实施方案包括偶联了非蛋白性多聚体(比如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚(某)二醇(polyoxyalkylene))的本发明治疗用抗体或其抗原结合片段。使蛋白质偶联PEG是已有技术，可用于提高蛋白质半衰期、降低蛋白质的抗原性和免疫原性。人们已用不同分子量和形式(线形或分支)的PEG修饰完整抗体以及Fab’片段，见Koumenis I.L.等(2000)，Int.J.Pharmaceut.198：83-95。
2.竞争性抗体
本发明还考虑了这样的抗体和抗体的抗原结合片段，所述抗体和片段能特异性结合hIL-13、并竞争性抑制本发明所述包含SEQ.I.D.NO：3所示CDRH3的治疗用抗体或其抗原结合片段与hIL-13的结合，和/或竞争性抑制包含SEQ.ID.NO：1、2、3、4、5和6所示CDR的治疗用抗体或其抗原结合片段与hIL-13的结合。在一些实施方案中，所述治疗用抗体是包含SEQ.I.D.NO：7所示VH区和SEQ.I.D.NO：8所示VL区的小鼠抗体。所述竞争性抗体结合的hIL-13表位与包含SEQ.ID.NO：1、2、3、4、5和6所示CDR之治疗用抗体结合的hIL-13表位是相同、重叠或空间上相邻的。竞争性抗体或其抗原结合片段在等摩尔浓度的情况下显示至少25％的抑制，代表性的是35％或更高，更有代表性的是至少50％抑制。
因此本发明一个实施方案中提供了筛选候选抗体或抗体片段的方法，用于决定候选抗体或抗体片段是否此处描述的竞争性抗体。该方法包含以下步骤：
(a)将候选抗体或抗体片段与包含SEQ.I.D.NO：3所示CDRH3，任选进一步包含SEQ.I.D.NO：1、2、4、5和6所示CDR之治疗用抗体(比如具有SEQ.ID.NO：7所示VH区和SEQ.I.D.NO：8所示VL区的小鼠治疗用抗体，或者具有SEQ.I.D.NO：18之重链和SEQ.I.D.NO：22之轻链的人源化治疗用抗体，或者具有SEQ.I.D.NO：19之重链和SEQ.I.D.NO：23之轻链的人源化治疗用抗体)共培养；(b)确定步骤(a)中的候选抗体或抗体片段是否竞争性抑制所述治疗用抗体或其抗原结合片段与hIL-13的结合。
本发明还提供了一种竞争性抑制治疗用抗体或其抗原结合片段之结合的竞争性抗体或其抗原结合片段，其中所述治疗用抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ.I.D.NO：1、2、3、4、5和6所示序列之CDR。
另一个实施方案中提供了一种竞争性抑制本发明治疗用抗体与hIL-13之结合的竞争性抗体或其抗原结合片段，其中所述治疗用抗体包含SEQ.I.D.NO：18之重链和SEQ.I.D.NO：22之轻链。
竞争性抗体或其抗体结合片段可以是任何上述抗体结构。例如，所述竞争性抗体可以是灵长类或人完整抗体或者人源化抗体，优选是IgG的同种型，例如IgG1或1gG4。所述竞争性抗体片段可以是Fab，Fab′，F(ab′)2、ScFv等。这些竞争性抗体可以根据本说明书公开的方法来制备。
3.制备方法
本发明的抗体可以制备成多克隆群体，但是优选制备成单克隆群体(即抗特异性抗原结合位点的相同抗体的基本同源群体)。当然对本领域技术人员很显然的是群体意味着不止一种抗体。本发明抗体可以在转基因生物中产生，所述生物如山羊(见Pollock等(1999)，J.Immunol.Methods 231：147-157)、鸡(见Morrow KJJ(2000)Genet.Eng.News 20：1-55)、小鼠(见Pollock等)或植物(见Doran PM(2000)Curr.Opinion Biotechnol.11，199-204；Ma JK-C(1998)，Nat.Med.4；601-606；Baez J等，BioPharm(2000)13：50-54；Stoger E等(2000)Plant Mol.Biol 42：583-590)。也可以通过化学合成来产生抗体。但是本发明的抗体通常是利用本领域技术人员熟知的重组细胞培养技术制备的。分离出编码抗体的多核苷酸，将其插入可复制载体(比如质粒)以便进一步克隆(扩增)或表达。一个有用的表达系统是谷氨酰胺合成酶系统(比如Lonza Biologies出售的)，尤其是当宿主细胞是CHO或NS0的时候(见下文)。很容易地分离出编码抗体的多核苷酸，利用传统程序(例如寡核苷探针)将其测序。可以使用的载体包括质粒、病毒、噬菌体、转座子、微染色体，其中质粒是有代表性的实施方案。一般来说，这些载体还可包括促进表达的信号序列、复制起点、一或多个标志基因、增强子元件、启动子和转录终止序列，它们与轻链和/或重链多核苷酸可操纵相连。可以将编码轻链和重链的多核苷酸插入分开的载体并转染到同一宿主细胞，或者如果需要可以将两者插入相同的载体来转染宿主细胞。因此根据本发明的一个方面，提供了一种构建编码本发明治疗用抗体或其抗原结合片段之轻和/或重链的载体的方法，包括在载体中插入编码本发明治疗用抗体的轻链和/或重链的多核苷酸。
本发明的另一个方面提供了一种编码小鼠VH区的具有SEQ.ID.NO：24所示序列之多核苷酸。
本发明的再一个方面提供了一种编码小鼠VL区的具有SEQ.ID.NO：25所示序列之多核苷酸。
在另外一个实施方案中提供了一种编码VH区的多核苷酸，具有选自SEQ.I.D.NO：26、27、28、29的序列。
在另外一个实施方案中提供了一种编码VL区的多核苷酸，具有选自SEQ.I.D.NO：30、31的序列。
本发明还提供了一种编码发明所述重链的多核苷酸，该多核苷酸选自SEQ.I.D.NO：32、33、34、35。
本发明还提供了一种编码发明所述轻链的多核苷酸，该多核苷酸选自SEQ.I.D.NO：36、37。
对本领域技术人员显而易见的是由于遗传密码的冗余性，文中公开的多核苷酸的替代多核苷酸序列也可以编码本发明的多肽。
3.1信号序列
本发明的抗体可以以带有异源信号序列的融合蛋白的形式产生，该信号序列在成熟蛋白的N末端有特异性切割位点。所述信号序列应该能够被宿主细胞识别和加工。对原核宿主细胞来说，信号序列可以是碱性磷酸酶、青霉素酶或者热稳定肠毒素II引导肽。为了酵母菌分泌，信号序列可以是酵母转化酶引导肽、α因子引导肽或酸性磷酸酶引导肽(见如WO90/13646)。在哺乳动物细胞体系中，有病毒分泌引导肽比如单纯疱疹病毒gD信号和天然免疫球蛋白信号序列。通常，所述信号序列与编码本发明抗体的DNA连在同一读框内。
3.2复制起点
本领域熟知的复制起点包括，适合多数革兰氏阴性细菌的pBR322，适合多数酵母菌的2μ质粒以及适合多数哺乳动物细胞的各种病毒复制起点，比如SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或者BPV的。通常哺乳动物表达载体不需要复制起点成分，但是SV40包含早期启动子，所以可以用。
3.3选择标记
通常选择基因编码这样一些蛋白质，它们(a)赋予对抗生素(例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四环素)或其他毒素的抗性，或者(b)互补营养缺陷型或提供复合培养基中没有的营养物。选择的原理可涉及使宿主细胞停止生长。那些成功地转化了编码本发明治疗用抗体之基因的细胞，因为选择标记所赋予的例如药物抗性就能够存活。另外一个例子是被称为DHFR的选择标记，其中转化子在有氨甲蝶呤的情况下进行培养。在代表性实施方案中，在有逐渐增量的氨甲蝶呤的情况下培养细胞来扩增目的外源基因的拷贝数。CHO细胞是一种特别适用于DHFR选择的细胞系。另外一个例子是谷氨酸合成酶表达系统(Lonza Biologies)。适用于酵母菌的一种选择基因是trp1基因(见Stinchcomb等，Nature 282，38，1979)。
3.4启动子
适用于表达本发明抗体的启动子与编码该抗体的DNA/多核苷酸可操纵地连接在一起。用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸和杂合启动子，比如Tac。适用于在酵母细胞中进行表达的启动子包括3-磷酸甘油激酶或者其他糖酵解酶，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油变位酶和葡萄糖激酶。可诱导的酵母启动子包括醇脱氢酶2、同型细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白和负责氮代谢或者麦芽糖/半乳糖利用的酶。
用于在哺乳动物细胞中进行表达的启动子包括病毒启动子，比如多瘤病毒、禽痘病毒和腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒(特别是立即早期基因启动子)、逆转录病毒、乙型肝炎病毒、肌动蛋白、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子和早期或晚期猴病毒40。当然启动子的选择是基于它和用于表达的宿主细胞的相容性。因此一个实施方案中提供了第一质粒，它包含RSV和/或SV40和/或CMV启动子、编码发明所述轻链V区(VL)的DNA、κC区以及新霉素和氨苄青霉素抗性选择标记；还提供了第二质粒，包含RSV或SV40启动子、编码发明所述重链V区(VH)的DNA、编码γ1恒定区的DNA、DHFR和氨苄青霉素抗性标记。
3.5增强子元件
情况适合时(例如在高等真核细胞中进行表达时)，可以使用与启动子元件可操纵相连在载体中的增强子元件。合适的哺乳动物增强子序列包括来自球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、胎蛋白和胰岛素的增强子元件。替代地，可以使用来自真核细胞病毒的增强子元件，比如SV40增强子(在碱基100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子、杆状病毒增强子或者小鼠IgG2a位点(见WO04/009823)。优选所述增强子在载体上位于启动子上游的位置。
3.6宿主细胞
适合编码本发明抗体之克隆载体或表达载体的宿主细胞是原核、酵母或高等真核细胞。合适的原核细胞包括真细菌，例如肠杆菌科，比如埃希氏菌属(Escherichia)(例如E.coli(例如ATCC31446；31537；27325))、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如粘质沙雷氏菌(S.marcescans))和志贺氏菌属(Shigella)以及芽孢杆菌(Bacilli)属(比如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(见DD266710))、假单胞杆菌Pseudomonas)(比如铜绿假单胞杆菌(P.aeruginosa))和链霉菌(Steptomyces)。酵母宿主细胞有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)(例如ATCC 16045、12424、24178、56500)、耶氏酵母(yarrowia)(EP402226)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP183070；还可见Peng等，J.Biotechnol.108(2004)185-192)、念珠菌(Candida)、里氏木霉(Thchoderma reesia)(EP244234J)、青霉菌(Penicillin)、弯颈霉(Tolypocladium)和曲霉(Aspergillus)(比如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger))。
本发明虽然特别考虑了真核和酵母宿主细胞，但是发明所述宿主细胞优选是高等真核细胞。合适的高等真核宿主细胞包括哺乳动物细胞(比如COS-1(ATCC No.CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL1651))、人胚胎肾细胞系293、幼仓鼠肾细胞(BHK)(ATCC CRL.1632)、BHK570(ATCC NO：CRL 10314)、293(ATCC NO.CRL 1573)、中国仓鼠卵巢细胞CHO(例如CHO-K1，ATCCNO：CCL 61)、DHFR-CHO细胞系(比如DG44(见Urlaub等(1986)SomaticCell Mol.Genet.12，555-556))，尤其是那些适应于悬浮培养的CHO细胞、小鼠足细胞(sertoli cell)、猴肾细胞、非洲绿猴肾细胞(ATCC CRL-1587)、HELA细胞、犬肾细胞(ATCC CCL 34)、人肺细胞(ATCC CCL 75)、Hep G2和骨髓瘤或者淋巴瘤细胞，例如NS0(见US 5807715)、Sp2/0、Y0。
因此本发明一个实施方案提供了稳定转化的宿主细胞，其包含编码文中所述治疗用抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的载体。优选这些宿主细胞包含编码所述轻链的第一载体和编码所述重链的第二载体。
细菌发酵
细菌体系尤其适用于抗体片段的表达。这些片段位于胞内和/或周间质。不溶的周间质蛋白可以按照本领域技术人员已知的方法提取并重新折叠成活性蛋白，参见Sanchez等(1999)J.Biotechnol.72，13-20和Cu pit PM等(1999)Lett Appl Microbiol 29，273-277。
3.7细胞培养方法
转化了编码本发明治疗用抗体或其抗原结合片段之载体的宿主细胞可以通过本领域技术人员已知的任何方法来培养。可以将宿主细胞培养在旋转角瓶、旋转瓶或中空纤维系统中，但是对于大规模制备，优选搅拌罐反应器来进行悬浮培养。优选所述搅拌罐利用例如分散器、挡板或低剪切搅拌翼改造成适应通气。对于鼓泡塔和气升式反应器，可以用空气或氧气泡来直接通气。宿主细胞培养在无血清培养基的情况中，优选培养基补充了细胞保护剂比如Pluronic F-68来防止通气过程对细胞造成的损伤。根据宿主细胞的特点，对于贴壁依赖性细胞系可以用微载体作为生长基质，或者使用适应悬浮培养的细胞(通常是这样)。宿主细胞的培养，特别是无脊椎动物宿主细胞的培养可以运用多种操作模式，比如补料分批、重复分批培养(见Drapeau等(1994)Cytotechnology 15：103-109)、持续单批培养或者灌流培养。虽然可以将重组转化的哺乳动物宿主细胞培养在含有血清的培养基中，比如胎牛血清(FCS)，但是优选将这些宿主细胞培养在比如Keen等(1995)Cytotechnology 17：153-163中公开的合成的无血清培养基中，或者商业产品培养基比如ProCHO-CDM或UltraCHOTM(Cambrex NJ，USA)中，需要时补充能量来源(比如葡萄糖)和合成的生长因子(比如重组胰岛素)。宿主细胞的无血清培养要求这些细胞能够适应在无血清的情况下生长。一种适应方法是将这些宿主细胞培养在含有血清的培养基中，然后重复将80％的培养基换成无血清培养基，以便宿主细胞逐渐适应无血清条件(见例如ScharfenbergK等(1995)Animal Cell technology：Developments towards the 21st century(Beuvery E.C.等编辑)，619-623页，Kluwer Academic出版社)。
分泌到培养基中的本发明抗体可以利用各种技术回收和纯化，得到适合所需用途的纯度。例如，用本发明治疗用抗体来治疗人类患者通常要求至少95％的纯度，更常见要求98％或99％或更高的纯度(相比粗培养基)。第一个例子中，通常经离心去除培养基中的细胞残片，随后利用例如微滤、超滤和/或深层过滤来清除表面活性剂。还有多种其他技术可以使用，比如透析、凝胶电泳以及层析技术，比如羟基磷灰石层析(HA)、亲和层析(可选择包含亲和标记体系比如多组氨酸)和/或疏水相互作用层析(HIC，见US5429746)。一个实施方案中，在各种净化步骤之后，利用蛋白A或G亲和层析捕获本发明抗体，随后进行进一步层析比如离子交换和/或HA层析、阴离子或阳离子交换、大小排阻层析，以及硫酸铵沉淀。通常，还要采用多种去除病毒的步骤(例如用DV-20滤膜进行纳米过滤等)。在这些步骤之后，可以得到纯化的(优选单克隆)制品，其包含至少75mg/ml或更多(例如100mg/ml或更多)本发明抗体或其抗原结合片段，因此这构成了发明的一个实施方案。适合的这类制品基本上没有聚集形式的本发明抗体。
4.药物组合物
上文描述的本发明抗体的纯化制品(特别是单克隆制品)可配制在药物组合物中，用于治疗人类疾病和紊乱，如特应性疾病，例如哮喘、过敏性鼻炎、COPD。通常这类组合物包含已知且为药物学实践所接受的可药用载体，参见例如Remingtons Pharmaceutical Science，第16版，(1980)Mack出版公司。这类载体的例子包括用适宜缓冲液缓冲到pH5-8之间的灭过菌的载体比如盐水、林格氏液或葡萄糖溶液。用于(例如通过静脉内、腹腔内、皮内、皮下、肌肉内或门静脉内)注射或持续输注的药物组合物最好无肉眼可见的颗粒，可包含0.1ng-100mg抗体，优选5mg-25mg抗体。制备这类药物组合物的方法是本领域熟知的。在一个实施方案中，所述药物组合物在每单位用量的形式中包含0.1ng到100mg本发明治疗用抗体，任选和使用说明放在一起。本发明药物组合物可以经过冻干(冷冻干燥)，以便在给药前根据本领域技术人员熟知的方法进行重新溶解。在那些包含具有IgG1同种型的本发明抗体的发明实施方案中，可以向药物组合物中加入一种铜鳌合剂，比如柠檬酸盐(例如柠檬酸钠)或者EDTA或组氨酸，以便降低这类同种型抗体由铜介导的降解，参见EP0612251。抗hIL-13治疗可以经过口服、吸入或局部(例如，眼内、鼻内、经直肠到皮肤上的伤口)来给药。
将本发明抗体进行给药时的有效剂量和治疗方案一般是根据经验决定的，并且依赖于患者的年龄、体重和健康状况等因素以及要治疗的疾病或紊乱。这些影响因素在主治医生的考虑内。在例如Smith等(1977)：Antibodiesin human diagnosis and therapy(Raven出版社，纽约)可以找到指导选择合适的用量的内容，但一般是在1mg到1000mg。
根据要治的疾病和紊乱(但是尤其是哮喘)，包含治疗有效量的本发明抗体的药物组合物可以与有效量的另一种药剂同时、分别或顺序使用，该药剂包括比如抗炎剂(例如皮质类固醇或NSAID)、抗胆碱能药(尤其是M1/M2/M3受体拮抗剂)、β2肾上腺素受体激动剂、抗感染药(例如抗生素、抗病毒剂)、抗组胺剂和PDE4抑制剂。β2肾上腺素受体激动剂的例子包括沙米特罗(salmeterol)、沙丁醇胺(salbutamol)、福莫特罗(formoterol)、沙甲胺醇(salmefamol)、芬忒醇(fenoterol)和特布他林(terbutaline)。优选的长效β2肾上腺素受体激动剂包括WO02/66422A，WO02/270490，WO02/076933，WO03/024439和WO03/072539中公开的那些。合适的皮质类固醇包括甲基强的松龙(methyl prednisolone)、强的松龙、地塞米松(dexamethasone)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)、6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃羰基)氧]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-雄甾-1，4-双烯-17β-硫代羟酸S-氟甲基酯、6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-17α-丙酰氧基-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羟酸S-(2-氧代-四氢呋喃-3S-基)酯、氯地米松(例如其17-丙酸酯或17，21-二丙酸酯)、布地奈德(budesonide)、氟尼缩松(flunisolide)、莫米他松酯(mometasone esters)(例如康酸酯(furoate ester))、醋酸曲安奈德(triamcinolone acetonide)、罗氟奈德(rofleponide)、环索奈德(ciclesonide)(16α，17-[[(R)-环己基亚甲基]双氧基]-11β，21-二羟基-孕烷-1，4-二烯-3，20-二酮)，丙酸布替可特(butixocortpropionate)、RPR-106541以及ST-126。优选的皮质类固醇包括丙酸氟替卡松、6α，9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-17α-[(4-甲基-1，3-噻唑-5-羰基)氧基]-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羟酸S-氟甲基酯和6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃羰基)氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羟酸S-氟甲基酯，更优选6α，9α-二氟-17α-[(2-呋喃羰基)氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羟酸S-氟甲基酯。
以下专利涵盖了这类具有糖皮质激素激动作用的非固醇类化合物，它们可能具备在反式阻抑作用和反式激活作用之间对前者的选择性，并可用于组合治疗：WO03/082827、WO01/10143、WO98/54159、WO04/005229、WO04/009016、WO04/009017、WO04/018429、WO03/104195、WO03/082787、WO03/082280、WO03/059899、WO03/101932、WO02/02565、WO01/16128、WO00/66590、WO03/086294、WO04/026248、WO03/061651和WO03/08277。
合适的抗炎剂包括非固醇类抗炎药物(NSAID)。
合适的NSAID包括色甘酸钠、奈多罗米钠(nedocromil sodium)、磷酸二酯酶(PDE)抑制剂(例如茶碱、PDE4抑制剂或混合的PDE3/PDE4抑制剂)、白三烯拮抗剂、白三烯合成的抑制剂(例如孟鲁斯特(montelukast))、iNOS抑制剂、类胰蛋白酶和弹性蛋白酶抑制剂、β-2整联蛋白拮抗剂和腺苷受体激动剂量或拮抗剂(例如腺苷2α激动剂)、细胞因子拮抗剂(例如趋化因子拮抗剂，比如CCR3拮抗剂)或者细胞因子合成的抑制剂、或者5-脂肪氧化酶抑制剂。适宜的其他β2肾上腺素受体激动剂包括沙米特罗(例如其希萘酸盐(xinafoate))、沙丁胺醇(例如其硫酸盐或其本身)、福莫特罗(例如其延胡索酸盐)、非诺特罗或特布他林及其盐。iNOS(诱导型一氧化氮合成酶抑制剂)优选经口腔给药。合适的iNOS抑制剂包括在WO93/13055、WO98/30537、WO02/50021、WO95/34534和WO99/62875中公开的那些。合适的CCR3抑制剂包括WO02/26722中公开的。
我们特别感兴趣的是将本发明的抗体与磷酸二酯酶4(PDE4)抑制剂联用。适用于本发明这个方面的PDE4-特异性抑制剂可以是任何已知能够抑制PDE4酶或者被发现具有PDE4抑制剂作用的化合物，但所述化合物只是PDE4的抑制剂，而不包括那些在PDE4之外还抑制PDE家族其他成员(例如PDE3和PDE5)的化合物。
感兴趣的化合物包括顺式-4-氰基-4-(3-环戊氧基-4-甲氧基苯基)环己烷-1-羧酸、2-甲氧羰基-4-氰基-4-(3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯基)环己烷-1-酮和顺式-[4-氰基-4-(3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯基)环己烷-1-醇]。还有1996年9月3日授权的美国专利5552438所述顺式-4-氰-4-[3-(环戊氧基)-4-甲氧基苯基]环己烷-1-羧酸(又称为西洛司特(cilomilast))及其盐类、酯类、前药或物理形式，该专利和它公开的化合物全文引入做参考。
Elbion产生的AWD-12-281(Hofgen，N.等，15th EFMD Int Symp MedChem(Sept 6-10，Edinburgh)1998，摘要98页；CAS文献号247584020-9)；一个命名为NCS-613的9-苯基腺苷衍生物(INSERM)；Chiroscience和Schering-Plough产生的D-4418；辉瑞公司的名为CI-1018的苯偶氮胼PDE4抑制剂；Kyowa Hakko在WO99/16766中公开的苯并间二氧五环衍生物；Kyowa Hakko的K-34；Napp的V-11294A(Landells，L.J.等，Eur Resp J[欧洲呼吸学会年会(9月19-23，日内瓦)1998]1998，12(补充材料28)：摘要P2393)；Byk-Gulden的罗氟司特(CAS编号162401-32-3)和pthalazinone(WO99/47505，该专利说明书此处引做参考)；Pumafentrine，(-)-p-[(4aR*，10bS*)-9-乙氧基-1，2，3，4，4a，10b-六氢-8-甲氧基-2-甲基苯并[c][1，6]二氮杂萘-6-基]-N，N-二异丙基苯甲酰胺是混合的PDE3/PDE4抑制剂，该产品已由Byk-Gulden(现在是Altana)产生和发行了；由Almirall-Prodesfarma开发的阿罗茶碱(arofylline)；Vernalis公司的VM554/UM565；或者T-440(Tanabe Seiyaku；Fuji，K.等，J Pharmacol Exp Ther，1998，284(1)：162)和T2585。
其他感兴趣的化合物在公开的国际专利申请WO04/024728(GlaxoGroup Ltd)、PCT/EP2003/014867(Glaxo Group Ltd)和PCT/EP2004/005494(Glaxo Group Ltd)中有公开。
合适的抗胆碱能药物是那些行使毒蕈碱性受体拮抗剂功能的化合物，尤其是M1或M3受体的拮抗剂，M1/M3或M2/M3受体的双重拮抗剂，或者M1/M2/M3受体的广效拮抗剂。经吸入法给药的示范性化合物包括异丙托(ipratropium)(例如其溴化物，CAS 22254-24-6，以Atrovent的商品名出售)；氧托品(oxitropium)(例如其溴化物，CAS 30286-75-0)和塞托品(tiotropium)(例如其溴化物，CAS 136310-93-5，以Spiriva的商品名出售)。同样令人感兴趣的是瑞伐托酯(revatropate)(例如其氢溴酸盐，CAS 262586-79-8)和WO01/04118中公开的LAS-34273。用于口服的示范性化合物包括哌仑西平(pirenzepine，CAS 28797-61-7)、达非那新(darifenacin，CAS 133099-04-4；或其氢溴酸盐CAS 133099-07-7，商品名为Enablex)、奥昔布宁(oxybutynin，CAS 5633-20-5，商品名为Ditropan)、特罗地林(terodiline，CAS 15793-40-5)、托特罗定(tolterodine，CAS 124937-51-5；或其酒石酸盐CAS 124937-52-6，商品名Detrol)、奥替(otilonium，例如其溴化物，CAS 26095-59-0，商品名Spasmomen)、曲司氯铵(trospium chloride，CAS 10405-02-4)和素立芬新(solifenacin，CAS 242478-37-1；或其琥珀酸盐CAS 242478-38-2，又称为YM-905，商品名Vesicare)。
其他合适的抗胆碱能试剂包括美国专利申请60/487981中公开的配方(XXI)中的化合物：
其中连在托烷环上的烷基链的方向优选是内型；
R31和R32独立地选自优选具有1至6个碳原子的直链或支链低级烷基，具有5至6个碳原子的环烷基，具有6至10个碳原子的环烷基-烷基、2-噻吩基、2-吡啶基、苯基、被不超过4个碳原子的烷基取代的苯基和被不超过4个碳原子的烷氧基取代的苯基；
X-代表与带正电荷的N原子匹配的阴离子。X-可以是但不限于氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根、苯磺酸根和甲苯磺酸根，
包括例如：
溴化(3-内型)-3-(2，2-二-2-噻吩基乙烯基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子双环[3.2.1]辛烷；
溴化(3-内型)-3-(2，2-二苯基乙烯基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子双环[3.2.1]辛烷；
(3-内型)-3-(2，2-二苯基乙烯基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子双环[3.2.1]辛烷4-甲基苯磺酸盐；
溴化(3-内型)-8，8-二甲基-3-[2-苯基-2-(2-噻吩基)乙烯基]-8-氮阳离子双环[3.2.1]辛烷；和/或
溴化(3-内型)-8，8-二甲基-3-[2-苯基-2-(2-吡啶基)乙烯基]-8-氮阳离子双环[3.2.1]辛烷。
更合适的抗胆碱能剂包括在US专利申请60/511009中公开的式(XXII)或(XXIII)化合物：
其中：
标注的H原子在外位；
R41-代表与带正电荷的N原子匹配的阴离子。R1-可以是但不限于氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根、苯磺酸根和甲苯磺酸根；
R42和R43独立地选自直链或支链低级烷基(具有1至6个碳原子)、环烷基(具有5至6个碳原子)、环烷基-烷基(具有6至10个碳原子)、杂环烷基(具有5至6个碳原子)且N或O作为杂原子、杂环烷基-烷基(具有6至10个碳原子)且N或O作为杂原子、芳基、取代或未取代的芳基、杂芳基和可被取代的杂芳基；
R44选自(C1-C6)烷基，(C3-C12)环烷基，(C3-C7)杂环烷基，(C1-C6)烷基(C3-C12)环烷基，(C1-C6)烷基(C3-C7)杂环烷基，芳基，杂芳基，(C1-C6)烷基-芳基，(C1-C6)烷基-杂芳基，-OR45，-CH2OR45，-CH2OH，-CN，-CF3，-CH2O(CO)R46，-CO2R47，-CH2NH2，-CH2N(R47)SO2R45，-SO2N(R47)(R48)，-CON(R47)(R48)，-CH2N(R48)CO(R46)，-CH2N(R48)SO2(R46)，-CH2N(R48)CO2(R45)，-CH2N(R48)CONH(R47)；
R45选自(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷基(C3-C12)环烷基，(C1-C6)烷基(C3-C7)杂环烷基，(C1-C6)烷基-芳基，(C1-C6)烷基-杂芳基；
R46选自(C1-C6)烷基，(C3-C12)环烷基，(C3-C7)杂环烷基，(C1-C6)烷基(C3-C12)环烷基，(C1-C6)烷基(C3-C7)杂环烷基，芳基，杂芳基，(C1-C6)烷基-芳基，(C1-C5)烷基-杂芳基；
R47和R48独立地选自H，(C1-C6)烷基，(C3-C12)环烷基，(C3-C7)杂环烷基，(C1-C6)烷基(C3-C12)环烷基，(C1-C6)烷基(C3-C7)杂环烷基，(C1-C6)烷基-芳基，和(C1-C6)烷基-杂芳基，包括例如：
碘化(内型)-3-(2-甲氧基-2，2-二-噻吩-2-基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子-双环{3.2.1}辛烷；
3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙腈；
(内型)-8-甲基-3-(2，2，2-三苯基-乙基)-8-氮杂-双环[3.2.1]辛烷；
3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基丙酰胺；
3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙酸；
碘化(内型)-3-(2-氰基-2，2-二苯基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子-双环[3.2.1]辛烷；
溴化(内型)-3-(2-氰基-2，2-二苯基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子-双环[3.2.1]辛烷；
3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙-1-醇；
N-苄基-3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基丙酰胺；
碘化(内型)-3-(2-氨基甲酰基-2，2-二苯基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子-双环[3.2.1]辛烷；
1-苄基-3-[3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-脲；
1-乙基-3-[3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-脲；
N-[3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-乙酰胺；
N-[3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-苯甲酰胺；
3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二-噻吩-2-基-丙腈；
碘化(内型)-3-(2-氰基-2，2-二-噻吩-2-基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子-双环[3.2.1]辛烷；
N-[3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-苯磺酰胺；
[3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-脲；
N-[3-((内型)-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基)-2，2-二苯基-丙基]-甲磺酰胺；和/或
溴化(内型)-3-{2，2-二苯基-3-[(1-苯基-甲酰基)-氨基]-丙基}-8，8-二甲基-8-氮阳离子-双环[3.2.1]辛烷。
对于本发明更优选的化合物包括：
碘化(内型)-3-(2-甲氧基-2，2-二-噻吩-2-基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子双环[3.2.1]辛烷；
碘化(内型)-3-(2-氰基-2，2-二苯基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子双环[3.2.1]辛烷；
溴化(内型)-3-(2-氰基-2，2-二苯基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子-双环[3.2.1]辛烷；
碘化(内型)-3-(2-氨基甲酰基-2，2-二苯基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子-双环[3.2.1]辛烷；
碘化(内型)-3-(2-氰基-2，2-二-噻吩-2-基-乙基)-8，8-二甲基-8-氮阳离子-双环[3.2.1]辛烷；和/或
溴化(内型)-3-{2，2-二苯基-3-[(1-苯基-甲酰基)-氨基]-丙基}-8，8-二甲基-8-氮阳离子-双环[3.2.1]辛烷。
合适的抗组胺药(又称为H1-受体拮抗剂)包括大量已知能够抑制H1-受体，而且人体使用安全的拮抗剂中的一种或多种。第一代拮抗药，包括乙醇胺、乙二胺和烷胺的衍生物，例如二苯羟基胺、吡拉敏(pyrilamine)、氯马斯汀(clemastine)、chlropheniramine。第二代拮抗药没有镇静作用，包括氯雷他啶(loratidine)、地氯雷他啶(desloratidine)、特非那丁(terfenadine)、阿司咪唑(astemizole)、阿伐斯汀(acrivastine)、氮卓斯汀(azelastine)、坐旋西替利嗪(levocetirizine)、非索非那定(fexofenadine)和西替利嗪(cetirzine)。
优选的抗组胺药的例子包括氯雷他啶、地氯雷他啶、非索非那定和西替利嗪。
其他尝试过的组合包括将本发明抗体与抗IL-4药物(例如抗IL-4抗体比如pascolizumab)，和/或抗IL-5药物(例如抗IL-5抗体，比如mepolizumab)，和/或抗IgE药物(例如抗IgE抗体，比如奥马佐单抗(omalizumab，XolairTM)或他珠单抗(talizumab))联合使用。
本发明还方便地包括一种药物组合物，其包含本发明抗体或其抗原结合片段部分和其他药品，且任选与使用说明一起构成组配盒(kit of part)。
此外本发明还包括一种药物组合物，其包含治疗有效量的本文所述治疗用单克隆抗体或其抗原结合片段，用于治疗那些对调节hIL-13和hIL-13R之间的相互作用有反应的疾病。
本发明提供了一种包含治疗有效量的单克隆人源化治疗用抗体的药物组合物，所述抗体包含选自SEQ.I.D.NO：11，12，13，14的VH区和选自SEQ.I.D.NO：15，16的VL区。
本发明还提供了一种包含治疗用单克隆抗体的药物组合物，所述抗体包含选自SEQ.I.D.NO：18，19，20，21的重链和选自SEQ.I.D.NO：22，23的轻链。
本发明还提供了一种包含治疗用单克隆抗体和可药用载体的药物组合物，所述抗体包含SEQ.I.D.NO：18所示重链和SEQ.I.D.NO：22所示轻链。
本发明还提供了一种包含单克隆抗体和可药用载体的药物组合物，所述抗体包含SEQ.I.D.NO：18所示重链和SEQ.I.D.NO：22所示轻链，或基本由SEQ.I.D.NO：18所示重链和SEQ.I.D.NO：22所示轻链组成。
本发明还提供了这样一种药物组合物，它包含可药用载体和治疗有效量的治疗用抗体的单克隆群体，其中所述治疗用抗体包含SEQ.I.D.NO：18所示重链和SEQ.I.D.NO：22所示轻链。
5.临床应用
本发明抗体可以用于治疗特应性疾病/紊乱和慢性炎性疾病/紊乱。我们特别感兴趣的是用它们治疗哮喘，比如过敏性哮喘，特别是重症哮喘(这种哮喘对现有的治疗方法(包括系统给予皮质类固醇)没有反应；见Busse WW等，J Allergy Clin.Immunol 2000：106：1033-1042)、难治型哮喘(其表型特征为即便使用最高推荐剂量的处方吸入型类固醇，病情仍得不到控制，见Barnes PJ(1998)，Eur Respir J 12：1208-1218)、不稳定型哮喘(界定了患有严重、不稳定哮喘的患者群，即便给他们使用高剂量吸入型类固醇，仍维持变动较大的呼气流量峰值(PEF)，见Ayres JG等(1998)Thorax 58：315-321)、夜发哮喘、经前期哮喘、类固醇抗性哮喘(见Woodcock AJ(1993)Eur RespirJ 6：743-747)、类固醇依赖型哮喘(定义为仅有高剂量口服类固醇可以控制的哮喘)、阿司匹林诱导型哮喘、成人哮喘、小儿哮喘。本发明抗体可以用于预防急性哮喘发作(status asthmaticus)、降低发作频率或者减轻其后果。本发明抗体可以用于减少哮喘治疗中使用的其他药品的需要剂量(就给药量或给药频率而言)。例如本发明抗体还可用于减少类固醇治疗哮喘(比如皮质类固醇疗法)的剂量(节制激素疗法)。可以用本发明抗体治疗的其他疾病或紊乱包括特应性皮炎、过敏性鼻炎、节段性回肠炎(Crohn’s disease)、慢性阻塞性肺病COPD、嗜酸性粒细胞性食道炎、纤维变性疾病或紊乱比如特发性肺纤维化、进行性全身性硬化症(硬皮病)、肝纤维化、肝肉芽瘤、血吸虫病、利什曼病，以及细胞周期调节性疾病例如何杰金病、B细胞慢性淋巴细胞白血病。上文发明背景部分详述了可用本发明抗体治疗的其他疾病或紊乱。
本发明一实施方案中提供了治疗患有皮质类固醇无效的哮喘症状的人类患者的方法，该方法包含给予所述患者治疗有效量的本发明抗体的步骤。
另一实施方案中提供了预防人类患者急性哮喘病发作的方法，包括给予所述患者治疗有效量的本发明抗体的步骤。
另一实施方案中提供了减少人类患者急性哮喘病发作频率和/或减弱发作后果的方法，包括给予所述患者治疗有效量的本发明抗体的步骤。
本发明另一实施方案中提供了在人类患者受到炎性和/或过敏性攻击后，使T辅助细胞应答倾向Th1型应答途径的方法，该方法包含给予所述患者治疗有效量的本发明抗体或其抗原结合片段的步骤。
本发明另一实施方案提供了一种治疗携带Q130hIL-13变体的人类患者的方法，所述患者患有哮喘(比如重症哮喘)，该方法包含给予所述患者治疗有效量的本发明抗体或其抗原结合片段的步骤。
虽然本发明主要就治疗人类疾病或紊乱进行了描述，本发明也可能应用于治疗非人哺乳动物的类似疾病或紊乱。
以下仅以实施例的方式对本发明进行描述。
实施例
1.单克隆抗体的制备和小鼠单克隆抗体6A1的研究
单克隆抗体(mAb)通常是按照E Harlow和D Lane在Antibodies aLaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988中提出的方法由杂交瘤细胞制备的。结果得到小鼠骨髓瘤细胞和目标抗原免疫过的小鼠B淋巴细胞的融合。杂交瘤细胞借助骨髓瘤融合伴侣(partner)获得无限增殖能力，而产生抗体的能力由B淋巴细胞提供。
将5只SJL小鼠经腹腔内注射各2μg来源于E.coli的重组人IL-13(Cambridge Bioscience，Cat.No.CH-013)进行免疫。使用的接种程序在小鼠中产生高滴度抗人IL-13抗体免疫反应。64天内接种5次后，将小鼠处死，收集脾细胞。取出3只小鼠的脾细胞，将B淋巴细胞与来源于P3X细胞的小鼠骨髓瘤细胞用PEG1500(Boehringer)进行融合来产生杂交瘤。各个杂交瘤细胞系经有限稀释法进行克隆(E Harlow和D Lane，文献同上)。显微镜下挑出含有单集落的小孔，检测上清液的活性。将来自活性最高的集落的细胞扩增以备冷冻保存、抗体制备等。
首先，以夹心检测方式筛选杂交瘤上清液对E.coli表达的标记了det-1的重组人IL-13蛋白(自制(in-house))的结合活性。对阳性克隆进行的第二轮筛选是利用BIAcoreTM方法检测它们与det-1标记的人IL-13蛋白的结合。然后在TF-1细胞试验中测试来自这些杂交瘤的样品中和E.coli表达的重组人IL-13蛋白(Cambridge Bioscience，cat.no CH-013)的生物活性的能力。
将从中和人IL-13的试验中鉴定到的6个阳性克隆通过有限稀释法再克隆从而产生稳定的单克隆细胞系。生长于无血清条件细胞工厂的杂交瘤所产生的免疫球蛋白用固定化蛋白A柱子进行纯化。然后纯化的单抗在下列检测系统中进行再筛选：
-与E.coli表达的重组人IL-13的结合(在夹心ELISA中)
-抑制E.coli表达的重组det-1标记的人IL-13与IL-13受体两条链的结合(在夹心ELISA中)
-中和E.coli表达的人或食蟹猴重组IL-13(在TF-1细胞试验中)
-中和哺乳动物细胞表达的人IL-13(在TF-1细胞试验中)
-中和E.coli表达的重组Q130人IL-13变体(在TF-1细胞试验中)
-结合人IL-13的特异性，通过在抗IL-14ELISA中评价mAb对人IL-4的交叉反应性，以及在IL5中和检测中评价mAb对人IL5的交叉反应性来测定。
-用BIAcoreTM分析测量其对人IL-13的结合亲和力
鉴定到单克隆抗体6A1能够中和人和食蟹猴IL-13的生物活性。以下分析描绘出单克隆抗体6A1在这些检测中的特征。
1.1结合E.coli表达的重组人IL-13
在夹心ELISA中，6A1结合了E.coli表达的重组人IL-13，方法基本如第7部分所述。见图1。
1.2在ELISA中，抑制E.coli表达的重组det-1标记的人IL-13与IL-13Rα1和IL-13Rα2的结合
6A1抑制E.coli表达的重组det-1标记的人IL-13与人IL-13受体的两条链结合。此外，它对这些结合的抑制能力比商品抗IL-13多克隆抗体和一种抗人IL-13单克隆抗体试剂(得自R&D Systems)更高效。计算出的单克隆抗体6A1对人IL-13与人IL-13Rα1结合的抑制IC50值为0.165μg/ml。计算出的单克隆抗体6A1对人IL-13与人IL-13Rα2结合的抑制IC50值为0.056μg/ml。见图2A和2B。一个具有不相关的特异性的对照IgG没有可检测到的活性。
1.3在TF-1细胞增殖试验中，中和E.coli表达的重组人和食蟹猴IL-13
在应答人IL-13和食蟹猴IL-13时，TF-1细胞会进行增殖。我们建立了一种试验来评价抗IL-13单抗对人和食蟹猴IL-13诱导的TF-1细胞增殖的中和能力。在TF-1细胞试验中，6A1中和了重组人和食蟹猴IL-13的生物活性。此外，它对人和食蟹猴IL-13的中和能力比商品抗人IL-13多克隆和抗人IL-13单克隆试剂(得自R&D Systems)更强。见图3。
TF-1细胞试验中计算出来的单克隆抗体6A1对5ng/ml E.coli表达的重组人IL-13生物活性的中和ND50值为0.0783μg/ml。TF-1细胞试验中计算出来的单克隆抗体6A1对5ng/ml E.coli表达的重组食蟹猴IL-13生物活性的中和ND50值为0.04μg/ml。[ND50(中和剂量)值是使TF-1细胞在应答一系列浓度的IL-13时，其增殖降低50％所需的单克隆抗体浓度]。
1.4在TF-1细胞增殖试验中，中和哺乳动物细胞(CHO细胞)表达的人IL-13
单克隆抗体6A1对CHO细胞表达的人IL-13的中和能力在TF-1细胞增殖试验中进行了评价。测量到的ND50值表明，6A1对哺乳动物细胞表达的人IL-13的中和能力比商品抗人IL-13多克隆试剂更强。TF-1细胞试验中计算出来的单克隆抗体6A1对～50ng/ml哺乳动物细胞表达的重组人IL-13生物活性的中和ND50值为0.037μg/ml。见图4。
1.5在TF-1细胞增殖试验中，中和重组Q130人IL-13变体
在TF-1细胞增殖试验中对单克隆抗体中和E.coli表达的重组Q130人IL-13(Peprotech，Cat.No.200-13A)的能力进行了评价。6A1对Q130人IL-13的中和能力比商品抗人IL-13多克隆试剂更强。TF-1细胞试验中计算出来的单克隆抗体6A1对60ng/ml Q130人IL-13生物活性的中和ND50值为0.11μg/ml。见图5。
1.6结合人IL-13的特异性
由于人IL-4与人IL-13在结构和功能上有许多相同之处，我们通过人IL-4结合ELISA评价了单克隆抗体对人IL-13的特异性。6A1与E.coli表达的重组人IL-4没有检测得到的结合，这表明该单克隆抗体对人IL-13的高度特异性。此外，在TF-1细胞试验中没有检测到6A1能够交叉中和E.coli表达的重组人IL5。见图6和7。
1.7 BIAcoreTM分析
6A1对人和食蟹猴IL-13的亲和力通过BIAcoreTM分析进行了评价。见表1。
表1
| IL13样品 | 结合速率Ka(1/Ms) | 解离速率Kd(us) | 亲和力常数(KD) |
| det-1标记的人IL13 | 2.25×106 | 7.2×10-5 | 32pM |
| 人IL13(VA) | 6.82×105 | 1.84×10-4 | 270pM |
| 食蟹猴IL13(CA) | 9.14×105 | 5.6×10-5 | 61.2pM |
这些数据表明6A1对人和食蟹猴IL-13都有亲和力。[该分析中使用了两种不同的人IL-13样品(都是在E.coli中产生的)。IL-13在E.coli中产生时基本都是不溶的，但可以在体外进行溶解和重新折叠。两种重新折叠的IL-13样品的质量不同可以解释6A1对每种人IL-13样品结合亲和力的不同]。
2.6A1可变区的克隆
从6A1杂交瘤细胞中提取总RNA，利用特异于预定同种型(lgG1/κ)的小鼠引导序列和抗体恒定区的引物，经逆转录制备其重链和轻链可变区的cDNA。然后将重链和轻链可变区cDNA克隆到pCR2.1载体中进行测序。
2.1提取RNA
用Promega的SV Total RNA Isolation System根据制造商的说明，从大约1066A1杂交瘤细胞团中提取总RNA。
2.2逆转录
用小鼠引导序列和小鼠IgG1/κ恒定区的特异引物，将RNA进行逆转录来制备重链和轻链可变区的cDNA。Jones ST和Bendig MM在Bio/technology9：88-89(1991)中列出了所用的引物混合物。
小鼠VH和VL引导序列的正向引物库制备成50μM的浓度。小鼠IgG1和κ恒定区的反向引物溶液也制备成50μM。
2.3逆转录PCR(RT-PCR)
用Promega的Access RT-PCR System按照制造商的说明，以重复实验的形式将编码重链和轻链可变区的RNA进行逆转录。VH和VL正向和反向引物如上文所述。
2.4 RT-PCR产物的凝胶纯化
将溶于凝胶上样液的RT-PCR产物(2×VH和2×VL)上样到含有0.01％溴化乙啶的制备型1％琼脂糖凝胶中，于100V在TAE缓冲液中跑胶1小时，切下V区条带。凝胶上同时跑一个100bp的DNA分子量条带，以便于识别VH和VL条带。然后用Qiagen的QIAquickTM凝胶提取试剂盒按照制造商的说明提取DNA片段并纯化
2.5连接
将纯化好的RT-PCR片段(2×VH和2×VL)用Invitrogen的TA克隆试剂盒按照制造商的说明克隆到pCR2.1载体中。
2.6转化
连接好的质粒按照TA克隆试剂盒的说明转化TOP10F′细胞。取50μl和200μl转化细胞铺在L-琼脂平板上，该平板含有100μg/ml氨苄青霉素，并覆盖8μl 500mM IPTG溶液和16μl溶于DMF的50mg/ml X-Gal溶液。平板在37℃培养过夜。
2.7测序
挑取菌落，在5ml补充了100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中于37℃培养过夜。用Qiagen QIAprep Spin微量制备试剂盒按照制造商说明，抽提和纯化含有6A1 VH和VL区的pCR2.1质粒。将VH和VL区用T7、M13正向和M13反向引物进行测序。
6A1 VH区氨基酸序列(来自2次RT-PCR反应的10个克隆的共有序列)：SEQ.I.D.NO：7
6A1 VL区氨基酸序列(来自2次RT-PCR反应的10个克隆的共有序列)：SEQ.I.D.NO：8
3.嵌合抗体
将由亲本小鼠V区构成的嵌合抗体(2.7部分描述的)移植到人IgG1/κ野生型C区上，这样设计是用于证明克隆了正确的小鼠V区，并且在测试人源化构建体时作为参照。嵌合抗体在CHO细胞中进行表达，纯化后通过ELISA测试其与人IL-13的结合。
3.1 PCR扩增
克隆的小鼠V区经PCR扩增来引入克隆到哺乳动物表达载体RId和RIn中时需要的限制酶位点。Hind III和Spe I位点是设计用来框出VH区并使其能够克隆到修饰过的RId载体中，该载体含有人γ1野生型C区。Hind III和BsiW I位点是设计用来框出VL区并使其能够克隆到修饰过的RIn载体中，该载体含有人κC区。
VH正向引物：5′-GAT G
AA GCT T 
AT GAA ATG CAG CTGGGT CAT C-3′(SEQ.I.D.NO：86)
Hind III限制酶位点加了下划线，Kozak序列用粗体表示。
VH反向引物：5′-GAT GG
A CTA GTG TTC CTT GAC CCC AGT A-3′(SEQ.I.D.NO：87)
Spe I限制酶位点加了下划线。
VL正向引物：5′-GAT G
AA GCT T 
AT GAA GTT GCC TGTTAG GCT G-3′(SEQ.I.D.NO：88)
Hind III限制酶位点加了下划线，Kozak序列用粗体表示。
VL反向引物：5′-GAT G
CG TAC GTT TGA TTT CCA GCT TGG TGC C-3′(SEQ.I.D.NO：89)
BsiW I限制酶位点加了下划线。
PCR反应：水 66μl
10×PCR缓冲液 10μl
dNTP(2mM) 10μl
引物1(5μM) 4μl
引物2(5μM) 4μl
AmpliTaq聚合酶 2μl
纯化的质粒 4μl
总体积 100μl
引物1：VH或VL正向引物
引物2：VH或VL反向引物
纯化质粒：Qiagen Minipreps纯化的pCR2.1 VH或VL质粒(稀释200×)
PCR循环：1-95℃ 4分钟
2-95℃ 1分钟
3-55℃ 1分钟
4-72℃ 1分钟
5-72℃ 7分钟
步骤2到4：重复30次
3.2克隆到哺乳动物表达载体
用Qiagen的MinElute PCR纯化试剂盒按照制造商的说明将PCR产物纯化。
用Hind III-Spe I消化VH PCR产物和RId hCγ1wt哺乳动物表达载体：
10×缓冲液(NE Buffer2) 5μl
BSA 100x(NEB) 0.5μl
DNA 5μl
Hind III(Promega) 2μl
Spe I(NEB) 2μl
水 35.5μl
总体积 50μl
DNA：纯化的VH PCR产物或RId hCγ1wt载体(浓度为0.25mg/ml)
37℃保温2小时。
用Hind III-BsiW I消化VL PCR产物和RIn hCκ哺乳动物表达载体：
10×缓冲液(NE Buffer2) 5μl
DNA 5μl
Hind III(Promega) 2μl
水 38μl
总体积 50μl
DNA：纯化的VL PCR产物或RIn hCκ载体(浓度为0.25mg/ml)
37℃保温2小时。加入2μl BsiW I(NEB)，55℃保温2小时。
将限制酶消化产物加入凝胶上样液上样到含有0.01％溴化乙啶的制备型1％琼脂糖凝胶，于100V在TAE缓冲液中跑胶1小时，切下RId和RIn载体以及VH和VL PCR片段条带。胶上同时跑一个100bp DNA分子量条带以便识别VH、VL和载体条带。用Qiagen的QIAquick凝胶提取试剂盒按照制造商使用说明从凝胶中抽提并纯化DNA。
将Hind III-Spe I消化的VH PCR片段连接到经Hind III-Spe I消化的RIdhCγ1 wt载体。将Hind III-BsiW I消化好的VL PCR片段连接到用HindIII-BsiW I消化的RIn hCκ载体中。连接反应用Promega的LigaFast RapidDNA连接体系按照制造商使用说明进行：
VH：载体：Hind III-Spe I消化的RId hCγ1 wt
插入片段：Hind III-Spe I消化的VH PCR片段
VL：载体：Hind III-BsiW I消化的RIn hCκ
插入片段：Hind III-BsiW I消化的VL PCR片段
将连接产物转化入DH5α感受态细胞。在冰上解冻200μl DH5α管。在转化试管中准备50μl液样。加入2μl连接混合物，用移液器枪头温和混合，然后置冰上培育30分钟。将混合物在42℃无震荡保温45秒。然后转移到冰上2分钟。加入450μl SOC培养基，试管在震荡培养器上于37℃保温1小时。取100μl培养物铺到补充100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂平板上，37℃培养过夜。
3.3测序
将VH和VL克隆在5ml加有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中于37℃培养过夜。用Qiagen的QIAprep Spin微量制备试剂盒，按照制造商的使用说明抽提并纯化分别含有VH和VL区的RId和RIn质粒。VH区用RId载体和信号序列的正向引物以及人Cγ1区的反向引物进行测序。
VL区用RIn载体和信号序列的正向引物以及人Cκ区的反向引物进行测序。鉴定带有正确VH和VL序列的克隆，制备质粒用于在CHO细胞中进行表达。
3.4嵌合抗体在CHO细胞中的表达
将分别含有6A1 VH和VL的RId和RIn质粒瞬间共转染到CHO细胞中进行表达。通过蛋白质A Sepharose亲和层析从细胞培养上清液中纯化嵌合抗体。
3.4.1质粒纯化
将含有RId-6A1 VH和RIn-6A1 VL质粒的DH5α细胞在5ml补充100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中于37℃在震荡培养器上培养8小时。取1ml该培养物接种200ml补充了100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，于37℃在震荡培养器上培养过夜。按照制造商使用说明用Qiagen的QIAfilter PlasmidMaxi试剂盒抽提并纯化质粒。将乙醇沉淀重悬在200μl TE缓冲液中，储液稀释100倍后测量260nm吸光度来确定质粒浓度。
3.4.2转染
将CHO细胞用Dulbecco′s MEM Glutamax-1(DMEM)培养基在4×175cm2BD Falcon组织培养三角瓶中于37℃培养至铺满，该培养基补充有超低胎牛血清和1％青霉素-链霉素。对每个三角瓶，在50ml Falcon试管中加入以下物质并混匀：
8ml含有Glutamax-1的Optimem 1
20μg RId-6A1 VH纯化质粒
20μg RIn-6A1 VL纯化质粒
240μl TransFast转染试剂(旋转混匀)
将混合物置室温培养10-15分钟。从三角瓶中取出DMEM培养基，然后将上述混合物旋转混匀并加入三角瓶。混合物置37℃培养1小时。向瓶中加入32ml Optimem，置37℃培养48-72小时。
3.4.3嵌合抗体的纯化
将所有175cm2三角瓶中的培养基合在一起，在一台MSE Mistral 2000上1500rpm离心3分钟，上清液用500mL Filter System 0.22μm CA过滤。用Unicorn软件在Amersham Biosciences Akta Explorer上从澄清的上清液中纯化抗体。所用的柱子是1ml HiTrap r蛋白A Sepharose FF。流速是1ml/min。
柱子用10个柱体积(CV)的Dulbecco′s PBS进行平衡，然后将澄清上清液通过泵A上样。用20CV的Dulbecco′s PBS洗柱子，泵A洗后流到废液中，另加10CV的Dulbecco′s PBS过柱子以确保上清液被完全清除。
抗体用10CV的ImmunoPure IgG洗脱缓冲液(Pierce)洗脱，收集1ml的级分，其中含有100μl 1M Trizma-HCI(pH8.0)中和缓冲液。柱子用5CVDulbecco′s PBS重新平衡。
洗脱级分中的抗体通过280nm处吸光度读数进行定量，空白对照含有10个体积的ImmunoPure IgG洗脱缓冲液和1体积1M Trizma-HCl(pH8.0)。将含有足够量纯抗体的级分并在一起，按100μl等份试样分装保存于-20℃。
3.4.4嵌合抗体的分析
通过人和食蟹猴IL-13结合ELISA分析上清液和纯化的6A1嵌合抗体(6A1c)。来自瞬间转染嵌合6A1单克隆抗体的CHO细胞的上清液在夹心ELISA中与E.coli表达的重组人和食蟹猴IL-13两者都能结合。纯化抗体在夹心ELISA中也能结合E.coli表达的重组人和食蟹猴IL-13(数据未显示)。见图8。
食蟹猴IL-13(包括信号序列)的氨基酸序列和cDNA序列分别如SEQ.I.D.NO：90和91所示。
这些结果证明成功地克隆了正确的6A1可变区，产生的抗原结合性嵌合抗体能结合人和食蟹猴IL-13。
4.克隆6A1的人源化
4.1人源化策略
4.1.1检索小鼠数据库
检索肽数据库(Genbank)鉴定到12个与6A1 VH氨基酸序列同源性最高的小鼠序列，和11个与VL氨基酸序列同源性最高的小鼠序列。
将6A1 VH氨基酸序列与检索数据库得到的12条小鼠序列进行比较，鉴定到以下重要的框架残基：
位点 6A1 VH 小鼠 发生率
19 R K 12/12
38 I K 12/12
81 R Q 12/12
位点是根据Kabat等的体系进行编号的。将6A1 VL氨基酸序列与检索数据库得到的11条小鼠序列进行比较，没有鉴定到重要的框架残基。
4.1.2.检索人数据库
利用EasyBlast在肽数据库中鉴定与6A1 VH和VL框架同源性最高的人框架区序列。
鉴定到一组对应6A1 VH的人序列，从中选出进行人源化的框架序列是：SEQ.I.D.NO：92
以下框架残基被认定对于恢复亲和力可能很重要，因此需要进行回复突变：
位点(Kabat编号) 人VH 6A1 VH
19 K R
38 R I
73 E T
81 E R
设计了4个带有不同回复突变的人源化VH构建体，其中一个是根据上文描述的CDR定义直接构建的(A1)，其他带有各种回复突变(A2、A3、A4)。因此
A2是A1加上R38I
A3是A2加上E73T
A4是A3加K19R加E81R
鉴定到一组对应6A1 VL的人序列，从中选出进行人源化的框架序列是：SEQ.I.D.NO：93
以下框架残基被认定对于恢复亲和力可能很重要，因此需要进行回复突变：
位点(Kabat编号) 小鼠6A1 VL 人VL
85 V I
设计了两个构建体，一个是直接构建(L1)，另一个带有回复突变(L2)(即有I85V的L1)。
人源化VH构建体A1：
SEQ.I.D.NO：11
人源化VH构建体A2：
SEQ.I.D.NO：12
人源化VH构建体A3：
SEQ.I.D.NO：13
人源化VH构建体A4：
SEQ.I.D.NO：14
人源化VL构建体L1：
SEQ.I.D.NO：15
人源化VL构建体L2：
SEQ.I.D.NO：16
4.2 6A1的人源化
人源化VH和VL构建体是通过“新生(de novo)”途径，利用包含用于克隆到RId和RIn哺乳动物表达载体的限制酶位点，还有人信号序列的重叠寡核苷酸拼合(build up)的。引入Hind III和Spe I限制酶位点来框出含有人信号序列的VH区以便克隆到携带人γ1野生型恒定区的RId。引入Hind III和BsiW I限制酶位点来框出含有人信号序列的VL区以便克隆到携带人κ恒定区的RIn。
人信号序列：SEQ.I.D.NO：17
设计了4个人源化VH构建体和2个人源化VL构建体。这样会产生8个不同的重链-轻链组合。设计了将近10条约60个碱基长(约18个碱基重叠)的寡核苷酸进行拼合。
4.2.1寡核苷酸拼合
用5μl各种寡核苷酸储液制成100μM的寡核苷酸集合液。人源化VH和VL基因通过拼合寡核苷酸进行的合成基本上按照Stemmer WP等((1995)Gene 164(1)：49-53)的方法，使用Ertl PF等((2003)Method 31：199-206)描述的软件进行。
4.2.1.1代表性的拼接PCR(assembly PCR)反应：
水 41.5μl
10×ProofStart PCR缓冲液 5μl
dNTP(10mM) 1.5μl
oligo集合 1μl
ProofStart DNA聚合酶 1μl
总体积 50μl
拼接PCR循环：1-94℃2分钟
2-94℃30秒
3-40℃2分钟
4-72℃10秒
5-94℃15秒
6-40℃30秒
7-72℃20秒+3秒/循环
步骤4到7重复25次。
4.2.1.2代表性回收性PCR(recovery PCR)
引物1和2是拼接PCR中使用的第一上和下寡核苷酸。回收性PCR使完整的V基因得到扩增。
回收性PCR反应：
水 42μl
10×ProofStart PCR缓冲液 4μl
dNTP(10mM) 1.5μl
引物1(100μM) 0.5μl
引物2(100μM) 0.5μl
拼接PCR反应物 1μl
ProofStart DNA聚合酶 0.5μl
总体积 50μl
回收性PCR循环：1-94℃2分钟
2-94℃45秒
3-60℃30秒
4-72℃2分钟
5-72℃4分钟
步骤2到4重复25次
回收性PCR产物按照厂商的使用说明用Qiagen的MinElute PCR纯化试剂盒进行纯化。
4.2.2限制酶消化
如部分3所述类似地，人源化6A1 VH构建体A1、A2、A3、A4用HindIII-Spe I消化，人源化6A1 VL构建体L1、L2用Hind III-BsiW I消化。
4.2.3凝胶纯化
限制酶消化产物如部分3类似地进行纯化。
4.2.4连接反应
将Hind III-Spe I消化好的6A1人源化VH片段连接到Hind III-Spe I消化好的RId hCγ1 wt载体中。
Hind III-BsiW I消化过的6A1人源化VL片段连接到Hind III-BsiW I消化好的RIn hCκ载体中。
用Promega的LigaFast快速DNA连接系统按照厂商的使用说明进行连接反应。
4.2.5转化
类似于前面部分3的描述。
4.2.6代表性的测序方法
每个反应平板上的菌落用5ml补充有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基在37℃培养过夜。用Qiagen的QIAprep Spin微量制备试剂盒按照厂商的使用说明抽提并纯化质粒，然后用上文部分3描述的引物进行测序。鉴定带有正确人源化VH和VL序列的克隆，制备质粒在CHO细胞中进行表达。
5.人源化抗体的表达和特性研究
在RId hCγ1wt和RIn hιCκ哺乳动物表达载体中制备了四个人源化VH构建体(A1、A2、A3、A4)和两个人源化VL构建体(L1和L2)。将八个质粒重链-轻链组合(A1L1、A1L2、A2L1、A2L2、A3L1、A3L2、A4L1、A4L2)瞬间共转染到CHO细胞中，小规模表达得到8种不同的人源化抗体。产生到CHO细胞上清液中的抗体在人IL-13结合ELISA中进行分析。
5.1代表性质粒纯化方法
含有上述之一种质粒的DH5α细胞在5ml补充了100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中置37℃震荡培养器上培养8小时。取1ml该培养物接种200ml补充了100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，置37℃震荡培养器上培养过夜。用Qiagen的QIAfilter Plasmid Maxi试剂盒按照厂商的使用说明抽提并纯化质粒。将乙醇沉淀重悬在200μl TE缓冲液中，储液稀释100倍后测量260nm吸光度确定质粒浓度。
5.2代表性的转染方法
在Corning Costar 3506 6-孔平板的9个孔中接种106CHO细胞，在含有Glutamax-1的Dulbecco′s MEM(DMEM)培养基中37℃培养过夜，该培养基中补充了超低胎牛血清(Ultra Low Fetal Bovine Serum)和1％青霉素-链霉素。
给每个孔加入5ml以下物质的混合物，使每个转染反应含有一种不同的轻链和重链组合方式。
1ml含有Glutamax-1的Optimem 1
5μg携带人源化VH的质粒
5μg携带人源化VL的质粒
30μg TransFast转染剂，旋转混匀
在室温保温10-15分钟。吸出DMEM培养基，然后将上述混合物旋转混匀加入相应的孔中。置37℃保温1小时。每孔加入2ml Optimem，在37℃保温48-72小时。
5.3人源化抗体的分析
回收每个孔中的培养基，在Eppendorf 5415R台式离心机上13000rpm离心1分钟，将上清液用0.2μm Pall Acrodisc 25mm注射器滤器过滤。用ELISA评价细胞上清液与人IL-13的结合。人IL-13结合ELISA显示，所有8种人源化抗体与人IL-13的结合特性和6A1嵌合抗体的类似。见图9。
挑选出人源化抗体L1+A1和L2+A1进行放大(scale-up)表达、纯化和进一步分析。
6.人源化抗人IL-13抗体L1+A1和L2+A1的评价
6.1在人和食蟹猴IL-13结合ELISA中的活性
由放大表达成功地制备了L1+A1和L2+A1，通过ELISA来评价它们与E.coli表达的人和食蟹猴IL-13的结合。见图10a和10b以及表B。
表B
| ELISA | 单抗 | EC50(μg/ml) |
| 与人IL-13的结合 | 6A1亲本单抗 | 0.049 |
| 嵌合6A1 | 0.015 | |
| L1+A1 | 0.018 | |
| L2+A1 | 0.024 | |
| 与食蟹猴IL-13的结合 | 6A1亲本单抗 | 0.039 |
| 嵌合6A1 | 0.018 | |
| L1+A1 | 0.021 | |
| L2+A1 | 0.028 |
L1+A1和L2+A1与E.coli表达的人和食蟹猴IL-13的结合特性类似。EC50值(用Excel ′Robosage′曲线吻合函数产生的)表明它们的结合活性与嵌合6A1单抗标准非常相似。
6.2对L1+A1和L2+A1结合天然(PBMC来源的)人IL-13的评价
用CD4+Th2细胞(产生自人PBMC培养物)的上清液来评价嵌合6A1单抗、L1+A1和L2+A1与天然(PBMC来源的)人IL-13之间的结合，其中CD4+Th2细胞是用抗CD3和抗CD28刺激过的。ELISA实验中，3种抗体全部与Th2细胞上清液中的天然人IL-13发生结合，其表现与亲本6A1单抗非常相似。见图11。
此外，用商品试剂制作标准曲线以便确定Th2细胞上清液中的天然人IL-13的浓度。全部3种抗体和商品抗人IL-13单抗在Th2上清液样品中检测到等量的IL-13。见下表2。
表2
| 单抗 | 天然IL-13(ng/ml) |
| 6A1亲本单抗 | 22.5 |
| 嵌合6A1 | 19.6 |
| L1+A1 | 25.1 |
| L2+A1 | 22.7 |
| +对照单抗 | 28.0 |
6.3 IL-13受体结合ELISA中L1+A1和L2+A1对人1L-13的抑制
在竞争ELISA实验中评价了6A1亲本小鼠单抗、嵌合6A1、L1+A1和L2+A1抑制人IL-13和IL-13Rα1及IL-13Rα2链之间的结合的能力。见图12a和12b和下表3。
表3
| ELISA | 单抗 | IC50(μg/ml) |
| 人IL-13Rα1竞争 | 6A1亲本单抗 | 0.039 |
| 嵌合6A1 | 0.034 | |
| L1+A1 | 0.044 | |
| L2+A1 | 0.056 | |
| 人IL-13Rα2竞争 | 6A1亲本单抗 | 0.020 |
| 嵌合6A1 | 0.040 | |
| L1+A1 | 0.113 | |
| L2+A1 | 0.117 |
所有抗体都能抑制E.coli表达的标记了det-1的人IL-13与人IL-13Rα1之间的结合，其抑制特性相似。类似地，所有抗体都能抑制E.coli表达的标记了det-1的人IL-13与人IL-13Rα2之间的结合，但在这项检测中，L1+A1和L2+A1的抑制能力有所减弱(IC50值是利用Excel ′Robosage′曲线吻合函数产生的)。
6.4 L1+A1和L2+A1结合人IL-13的亲和力评价
L1+A1和L2+A1与人IL-13的结合动力学用BIAcoreTM系统进行了评价。所用方法见以下部分7。
分析1：
人和食蟹猴IL-13(E.coli表达的蛋白质)都进行了该项分析。引用的KD值是来自5个不同IL-13浓度曲线(重复3次)的平均值。注意该项分析中有明显的传质问题，在分析4(不存在传质问题)中使用了修改过的实验方法(来改正这个问题)。见表4。
表4
| IL-13样品 | 单抗 | 结合速率ka(Ms-1) | 解离速率kd(s-1) | 亲和力常数KD(pM) |
| 人IL-13 | 6A1亲本单抗 | 1.96×106 | 6.78×10-5 | 35 |
| 嵌合6A1 | 4.64×105 | 2×10-5 | 43 | |
| L1+A1 | 5.07×105 | 1.55×10-4 | 300 | |
| L2+A1 | 5.07×105 | 1.56×10-4 | 310 | |
| 食蟹猴IL-13 | 6A1亲本单抗 | 9.14×105 | 5.6×10-5 | 61 |
| 嵌合6A1 | 5.92×105 | 3.27×10-5 | 55 | |
| L1+A1 | 4.46×105 | 1.55×10-5 | 35 | |
| L2+A1 | 5.77×105 | 5.58×10-5 | 97 |
分析2：
对人IL-13(E.coli表达的蛋白质)结合L1+A1进行了该项分析。见表5。
表5
| IL-13样品 | 单抗 | 结合速率ka(Ms-1) | 解离速率kd(s-1) | 亲和力常数KD(pM) |
| 人IL-13 | L1+A1 | 4.66×105 | 6.95×10-5 | 149 |
分析3：
对16聚体(16mer)生物素化人IL-13肽(编号24，见第6.7部分，鉴定为亲本单抗6A1的线性结合表位)进行了该项分析。注意由结合肽配体得到的绝对KD值通常与结合整个目标蛋白质得到的值非常不同。但是我们认为这组数据与整个蛋白质的数据和IL-13中和数据(在TF-1试验中)是一致的，因为它们都显示出从嵌合6A1到L1+A1的亲和力降低了大约3倍。见表6。
表6
| IL-13样品 | 单抗 | 结合速率ka(Ms-1) | 解离速率kd(s-1) | 亲和力常数KD(nM) |
| 肽24 | 6A1亲本单抗 | 2.95×105 | 9.15×10-4 | 3.11 |
| 嵌合6A1 | 2.57×105 | 9.19×10-4 | 3.58 | |
| L1+A1 | 1.95×105 | 1.7×10-3 | 9.03 | |
| L2+A1 | 1.79×105 | 1.67×10-3 | 9.35 |
分析4：
对人和食蟹猴IL-13(E.coli表达的蛋白质)进行了这项分析。引用的KD值是来自5个不同IL-13浓度曲线(重复3次)的平均值。注意这组数据中没有明显的传质问题。见表7。
表7
| IL-13样品 | 单抗 | 结合速率ka(Ms-1) | 解离速率kd(s-1) | 亲和力常数KD(pM) |
| 人IL-13 | 嵌合6A1 | 1.06×106 | 4×10-5 | 38 |
| L1+A1 | 8.24×105 | 1.4×10-4 | 170 | |
| L2+A1 | 9.07×105 | 1.39×10-4 | 153 | |
| 食蟹猴IL-13 | 嵌合6A1 | 8.85×105 | 2.65×10-5 | 30 |
| L1+A1 | 7.3×105 | 5.86×10-5 | 80 | |
| L2+A1 | 7.72×105 | 4.25×10-5 | 55 |
结果显示人源化构建体L1+A1和L2+A1没有显著差异。
L1+A1显示对人IL-13的亲和力常数约为168pM。其动力学主要由异常慢的解离速率主导，这从该抗体显著的中和活性也可以预测到。结合常数kon的数据维持在大约6×105M-1S-1。解离常数KOff的估计值变化较大，在1.4×10-4到8.22×10-5s-1的范围内，这反映出要对这样慢的解离速率进行准确定量在技术上很有挑战性。
6.5 L1+A1和L2+A1在IL-13中和试验中的活性
在体外TF-1细胞试验(该试验是用于评价IL-13生物活性和评价商品抗IL-13抗体的中和能力的行业标准)中评价了6A1亲本小鼠单抗、嵌合6A1、L1+A1和L2+A1对IL-13的中和活性。对多种IL-13变体在该检测中进行了评价，它们包括E.coli表达的人IL-13、E.coli表达的食蟹猴IL-13、E.coli表达的Q130人IL-13(与哮喘相关的变体)，以及哺乳动物CHO细胞表达的人IL-13(备注：Th2细胞上清液中的天然人IL-13不能用于该试验，因为该上清液还含有其他能增殖TF-1细胞的细胞因子)。见图13a、13b、13c和13d。
所有测试的抗体在该试验体系中都能中和全部IL-13变体的生物活性；我们确定了每种抗体对各个IL-13变体的中和能力，并将其表述为ND50值。见表8。
表8
| IL-13变体 | 单抗 | 两次检测的平均ND50(μg/ml) |
| E.coli表达的人IL-13 | 嵌合6A1 | 0.119 |
| L1+A1 | 0.428 | |
| L2+A1 | 0.608 | |
| 6A1亲本单抗 | 0.193 | |
| E.coli表达的食蟹猴IL-13 | 嵌合6A1 | 0.059 |
| L1+A1 | 0.078 | |
| L2+A1 | 0.120 | |
| 6A1亲本单抗 | 0.078 | |
| E.coli表达的Q130人IL-13 | 嵌合6A1 | 0.128 |
| L1+A1 | 0.438 | |
| L2+A1 | 0.705 | |
| 6A1亲本单抗 | 0.213 | |
| CHO表达的人IL-13 | 嵌合6A1 | 0.285 |
| L1+A1 | 0.975 | |
| L2+A1 | 1.200 | |
| 6A1亲本单抗 | 0.440 |
备注：因为在该试验中使TF-1细胞增殖到相同程度所需要的各个IL-13变体的量不同，可能不应该在某个特定抗体对每种IL-13变体产生的ND50值之间进行比较。但是，比较各抗体对单个IL-13变体的ND50值是合适的。
总的来说，亲本6A1单抗和嵌合6A1所达到的中和水平相似，表明亲本单抗和嵌合单抗之间没有发生能检测到的活性损失。然而，L1+A1和L2+A1与亲本6A1单抗和嵌合6A1相比可以测量到活性下降，对所测试的每种IL-13变体平均大约下降3到4倍。这些数据与由BIAcoreTM评价得到的非常接近。
6.6 L1+A1和L2+A1结合人IL-13的特异性
对L1+A1和L2+A1结合人IL-13的特异性的评价是通过分析它们在结合ELISA中与人IL-4和人GM-CSF发生交叉反应的可能性来进行的。见图14a和14b。
我们发现这些单抗与IL-13的结合具有特异性，单抗浓度到30μg/ml仍与人IL-4或者人GM-CSF没有交叉反应性。此外，在IL5试验中这些单抗不能交叉中和人IL5的生物活性。见图14c。
6.7用生物素化的肽对6A1进行表位作图
人IL-13和食蟹猴IL-13蛋白在变性SDS-PAGE胶上电泳。用小鼠单抗6A1做Western印迹检测到预期大小的人(E.coli表达的，自备)和食蟹猴(E.coli表达的，自备)IL-13蛋白条带。6A1可能由于技术上的失败没有检测到hIL-13(E.coli表达的，Cambridge Bioscience)。这项分析提示单抗6A1识别人和食蟹猴IL-13序列中的一段线性肽表位(数据未显示)。
我们合成了生物素化的16聚肽(偏移值＝4)来对单抗6A1识别的B细胞表位在人和食蟹猴IL-13上的位置进行作图。用ELISA方法探测固定化的生物素化肽与亲本单抗6A1的结合。
专门设计的16聚体肽细节：88×16聚体，偏移值(offset)为4(由Mimotopes，Australia提供)。
格式：肽25&44＝生物素-SGSG-肽-酸
肽2-24&27-43＝生物素-SGSG-肽-酰胺
编号 疏水性 分子量 N-末端 序列 C-末端
2 0.42 2,311.66 生物素- SEQ.I.D.NO：38-NH2
3 0.27 2,453.82 生物素- SEQ.I.D.NO：39-NH2
4 0.38 2,326.70 生物素- SEQ.I.D.NO：40-NH2
5 0.31 2,231.58 生物素- SEQ.I.D.NO：41-NH2
6 0.43 2,289.66 生物素- SEQ.I.D.NO：42-NH2
7 0.S9 2,190.57 生物素- SEQ.I.D.NO：43-NH2
8 0.57 2,260.64 生物素- SEQ.I.D.NO：44-NH2
9 0.62* 2,255.64 生物素- SEQ.I.D.NO：45-NH2
10 0.51 2,197.56 生物素- SEQ.I.D.NO：46-NH2
11 0.56 2,144.52 生物素- SEQ.I.D.NO：47-NH2
12 0.46 2,090.38 生物素- SEQ.I.D.NO：48-NH2
13 0.29 2,219.54 生物素- SEQ.I.D.NO：49-NH2
14 0.29 2,180.53 生物素- SEQ.I.D.NO：50-NH2
15 0.36 2,318.70 生物素- SEQ.I.D.NO：51-NH2
16 0.32 2,303.73 生物素- SEQ.I.D.NO：52-NH2
17 0.47 2,209.57 生物素- SEQ.I.D.NO：53-NH2
18 0.48 2,257.60 生物素- SEQ.I.D.NO：54-NH2
19 0.17 2,273.57 生物素- SEQ.I.D.NO：55-NH2
20 0.27 2,300.60 生物素- SEQ.I.D.NO：56-NH2
21 0.29 2,383.77 生物素- SEQ.I.D.NO：57-NH2
22 0.35 2,401.83 生物素- SEQ.I.D.NO：58-NH2
23 0.45 2,407.92 生物素- SEQ.I.D.NO：59-NH2
24 0.42 2,541.08 生物素- SEQ.I.D.NO：60-NH2
25 0.33 2,513.97 生物素- SEQ.I.D.NO：61-OH
27 0.42 2,283.64 生物素- SEQ.I.D.NO：62-NH2
28 0.27 2,425.81 生物素- SEQ.I.D.NO：63-NH2
29 0.57 2,228.57 生物素- SEQ.I.D.NO：64-NH2
30 0.62* 2,223.57 生物素- SEQ.I.D.NO：65-NH2
31 0.51 2,165.49 生物素- SEQ.I.D.NO：66-NH2
32 0.56 2,112.45 生物素- SEQ.I.D.NO：67-NH2
33 0.27 2,207.56 生物素- SEQ.I.D.NO：68-NH2
34 0.33 2,34S.73 生物素- SEQ.I.D.NO：69-NH2
35 0.29 2,330.76 生物素- SEQ.I.D.NO：70-NH2
36 0.45 2,236.60 生物素- SEQ.I.D.NO：71-NH2
37 0.43 2,276.64 生物素- SEQ.I.D.NO：72-NH2
38 0.12 2,292.62 生物素- SEQ.I.D.NO：73-NH2
39 0.22 2,319.64 生物素- SEQ.I.D.NO：74-NH2
40 0.24 2,402.82 生物素- SEQ.I.D.NO：75-NH2
41 0.33 2,387.80 生物素- SEQ.I.D.NO：76-NH2
42 0.43 2,393.90 生物素- SEQ.I.D.NO：77-NH2
43 0.39 2,527.05 生物素- SEQ.I.D.NO：78-NH2
44 0.35 2,471.88 生物素- SEQ.I.D.NO：79-OH
(*表示高疏水性值)
例子：一个用于该检测的典型96孔平板设置
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 |
| B | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 |
| C | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 |
| D | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 |
| E | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 |
| F | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 |
| G | 39 | 39 | 40 | 40 | 41 | 41 | 42 | 42 | 43 | 43 | 44 | 44 |
| H | +VE(4) | +VE(16) | +VE(32) | +VE(4) | +VE(16) | -VE(32) | -VE(4) | -VE(16) | -VE(32) | -VE(4) | -VE(16) | -VE(32) |
NB：表示每孔中的肽的编号
括号中的数字表示对照抗体的稀释系数
上述96孔在490nm的吸光度
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 0.057 | 0.067 | 0.079 | 0.063 | 0.072 | 0.061 | 0.084 | 0.061 | 0.075 | 0.064 | 0.075 | 0.066 |
| B | 0.068 | 0.070 | 0.105 | 0.065 | 0.075 | 0.072 | 0.071 | 0.070 | 0.064 | 0.061 | 0.062 | 0.063 |
| C | 0.119 | 0.081 | 0.099 | 0.064 | 0.073 | 0.077 | 0.060 | 0.061 | 0.090 | 0.144 | 2.109 | 2.200 |
| D | 0.115 | 0.129 | 0.141 | 0.060 | 0.090 | 0.063 | 0.104 | 0.078 | 0.076 | 0.135 | 2.148 | 2.210 |
| E | 0.060 | 0.074 | 0.098 | 0.062 | 0.064 | 0.071 | 0.088 | 0.082 | 0.089 | 0.073 | 0.068 | 0.067 |
| F | 0.082 | 0.078 | 0.071 | 0.062 | 0.056 | 0.057 | 0.084 | 0.067 | 0.090 | 0.074 | 0.063 | 0.056 |
| G | 0.057 | 0.055 | 0.060 | 0.060 | 0.058 | 0.058 | 0.104 | 0.108 | 2.236 | 2.237 | 2.229 | 2.229 |
| H | 1.499 | 1.197 | 0.739 | 1.548 | 1.209 | 0.976 | 0.077 | 0.080 | 0.072 | 0.072 | 0.082 | 0.103 |
这个结果(多次尝试中的一次)与下文所示肽24、25、43和44(以及阳性对照肽)的阳性结果是相关联的。见图15。所有尝试均表明肽24、25、43和44是阳性的。
肽24：QFVKDLLLHLKKLFRE(SEQ.I.D.NO：80)
肽25：DLLLHLKKLFREGRFN(SEQ.I.D.NO：81)
肽43：QFVKDLLVHLKKLFRE(SEQ.l.D.NO：82)
肽44：DLLVHLKKLFREGQFN(SEQ.I.D.NO：83)
肽24和25来源于hIL-13。肽43和44来源于食蟹猴IL-13。
此外，嵌合6A1、L1+A1和L2+A1单抗都结合到人和食蟹猴IL-13 C-末端区的相同线性表位上(此处没有显示嵌合6A1、L1+A1和L2+A1单抗的数据)。
总之，ELISA结果表明亲本小鼠单抗6A1、嵌合6A1、L1+A1和L2+A1单抗都结合人IL-13蛋白的下列序列：
DLLLHLKKLFRE(SEQ.I.D.NO：84)
以及食蟹猴IL-13蛋白质的下列序列：
DLLVHLKKLFRE(SEQ.I.D.NO.85)
NB：粗体表示人IL-13和食蟹猴IL-13直系同源物之间不同的残基。
相应地，我们确定出亲本小鼠单抗6A1、嵌合6A1、L1+A1和L2+A1单抗免疫特异性地结合到人IL-13 SEQ.I.D.NO：9中的残基97和108之间。
6.8用生物素化肽进行6A1表位的精确定位
我们用一组肽确定了结合单抗6A1的表位，在确定人IL-13与之结合的表位时，所用的肽基于KDLLLHLKKLFREG序列；确定食蟹猴IL-13与之结合的表位时，这组肽是基于KDLLVHLKKLFREG的。这些肽在设计时，从亲本肽序列(即KDLLLHLKKLFREG或者KDLLVHLKKLFREG)的N或C末端依次去除一个氨基酸，以便确定准确的结合单抗6A1的线性表位。
使用ELISA方法来探知固定化生物素化肽与亲本单抗6A1的结合。
以下列出了肽的编号(413到447)和相应序列。
肽序列：
肽编号 N-末端 序列 C-末端
413 生物素- SEQ.I.D.NO：94 -NH2
414 生物素- SEQ.I.D.NO：95 -NH2
415 生物素- SEQ.I.D.NO：96 -NH2
416 生物素- SEQ.I.D.NO：97 -NH2
417 生物素- SEQ.I.D.NO：98 -NH2
418 生物素- SEQ.I.D.NO：99 -NH2
419 生物素- SEQ.I.D.NO：100 -NH2
420 生物素- SEQ.I.D.NO：101 -NH2
421 生物素- SEQ.I.D.NO：102 -NH2
422 生物素- SEQ.I.D.NO：103 -NH2
423 生物素- SEQ.I.D.NO：104 -NH2
424 生物素- SEQ.I.D.NO：105 -NH2
425 生物素- SEQ.I.D.NO：106 -NH2
426 生物素- SEQ.I.D.NO：107 -NH2
427 生物素- SEQ.I.D.NO：108 -NH2
428 生物素- SEQ.I.D.NO：109 -NH2
429 生物素- SEQ.I.D.NO：110 -NH2
430 生物素- SEQ.I.D.NO：111 -NH2
431 生物素- SEQ.I.D.NO：112 -NH2
432 生物素- SEQ.I.D.NO：113 -NH2
433 生物素- SEQ.I.D.NO：114 -NH2
434 生物素- SEQ.I.D.NO：115 -NH2
435 生物素- SEQ.I.D.NO：116 -NH2
436 生物素- SEQ.I.D.NO：117 -NH2
437 生物素- SEQ.I.D.NO：118 -NH2
438 生物素- SEQ.I.D.NO：119 -NH2
439 生物素- SEQ.I.D.NO：120 -NH2
440 生物素- SEQ.I.D.NO：121 -NH2
441 生物素- SEQ.I.D.NO：122 -NH2
442 生物素- SEQ.I.D.NO：123 -NH2
443 生物素- SEQ.I.D.NO：124 -NH2
444 生物素- SEQ.I.D.NO：125 -NH2
445 生物素- SEQ.I.D.NO：126 -NH2
446 生物素- SEQ.I.D.NO：127 -NH2
447 生物素- SEQ.I.D.NO：128 -NH2
44(对照) 生物素- SEQ.I.D.NO：79 -OH
例子：该项检测的96孔板设置
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 413 | 414 | 415 | 416 | 417 | 418 | 419 | 420 | 421 | 422 | 423 | 424 |
| B | 413 | 414 | 415 | 416 | 417 | 418 | 419 | 420 | 421 | 422 | 423 | 424 |
| C | 425 | 426 | 427 | 428 | 429 | 430 | 431 | 432 | 433 | 434 | 435 | 436 |
| D | 425 | 426 | 427 | 428 | 429 | 430 | 431 | 432 | 433 | 434 | 435 | 436 |
| E | 437 | 438 | 439 | 440 | 441 | 442 | 443 | 444 | 445 | 446 | 447 | 44 |
| F | 437 | 438 | 439 | 440 | 441 | 442 | 443 | 444 | 445 | 446 | 447 | 44 |
| G | 空白 | 空白 | 空白 | 空白 | 空白 | 空白 | 空白 | 空白 | 空白 | 空白 | 空白 | 空白 |
| H | 空白 | 空白 | 空白 | 空白 | 空白 | 空白 | 空白 | 空白 | 空白 | 空白 | 空白 | 空白 |
NB：数字表示每个孔中的肽
上述96孔板在490nm的吸光度
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 2.456 | 2.501 | 2.434 | 2.419 | 2.746 | 2.661 | 2.224 | 2.407 | 0.059 | 0.052 | 0.052 | 2.527 |
| B | 2.480 | 2.452 | 2.444 | 2.624 | 2.639 | 3.106 | 2.188 | 2.473 | 0.059 | 0.055 | 0.052 | 2.568 |
| C | 2.472 | 0.099 | 0.065 | 0.059 | 0.070 | 0.058 | 0.053 | 0.054 | 0.162 | 2.479 | 2.389 | 2.883 |
| D | 2.399 | 0.100 | 0.067 | 0.053 | 0.049 | 0.051 | 0.052 | 0.047 | 0.485 | 2.838 | 2.783 | 2.640 |
| E | 2.582 | 2.359 | 2.585 | 2.512 | 0.096 | 0.052 | 0.054 | 0.048 | 0.049 | 0.183 | 0.051 | 2.424 |
| F | 2.431 | 2.872 | 2.522 | 2.243 | 0.097 | 0.059 | 0.052 | 0.049 | 0.057 | 0.047 | 0.050 | 2.342 |
| G | 0.056 | 0.051 | 0.058 | 0.065 | 0.056 | 0.067 | 0.049 | 0.047 | 0.053 | 0.057 | 0.052 | 0.056 |
| H | 0.047 | 0.052 | 0.050 | 0.070 | 0.054 | 0.047 | 0.056 | 0.053 | 0.049 | 0.050 | 0.052 | 0.049 |
见图16a和16b。结果显示亲本单抗6A1结合到人IL-13和食蟹猴IL-13直系同源物C末端区域内的线性氨基酸表位KKLFR。
此外，嵌合6A1、L1+A1和L2+A1单抗都结合到人IL-13C末端区域内的相同线性表位(即KKLFR)(嵌合6A1、L1+A1和L2+A1单抗的数据没有显示)。后来实验显示亲本单抗6A1结合到食蟹猴IL-13中的同一表位。
总之，ELISA结果显示亲本小鼠单抗6A1、嵌合6A1、L1+A1和L2+A1单抗都结合到人IL-13蛋白的以下序列：KKLFR
6.9用生物素化肽对6A1结合表位进行丙氨酸扫描
为了鉴定参与IL-13和单抗6A1之间相互作用的关键残基，采用了丙氨酸扫描的方法，其中使用了含有KKLFR结合表位的亲本肽序列(即QFVKDLLLHLKKLFREGRFN)。这项分析中制备的肽(由AnaSpec Inc提供)是将KKLFR表位中的每个氨基酸位点(包括直接位于表位边缘的每个氨基酸)依次用丙氨酸进行取代。
ELISA方法被用来探测固定化生物素化肽与亲本单抗6A1和L1+A1的结合。
为该项分析制备的肽及其相应肽编号如下所示：
肽编号 N-末端 序列
1 生物素 SEQ.I.D.NO：129
62 生物素 SEQ.I.D.NO：130
63 生物素 SEQ.I.D.NO：131
64 生物素 SEQ.I.D.NO：132
65 生物素 SEQ.I.D.NO：133
66 生物素 SEQ.I.D.NO：134
67 生物素 SEQ.I.D.NO：135
68 生物素 SEQ.I.D.NO：136
结果：490nm的吸光度
平均测试结果(n＝2)。
对于亲本(小鼠)6A1单抗：
| 肽编号 | 1 | 62 | 63 | 64 | 65 | 66 | 67 | 68 |
| 平均A490 | 3.543 | 3.489 | 3.2795 | 1.468 | 3.8495 | 3.5995 | 0.595 | 3.581 |
对于L1+A1：
| 肽编号 | 1 | 62 | 63 | 64 | 65 | 66 | 67 | 68 |
| 平均A490 | 2.8535 | 2.832 | 2.6535 | 1.8175 | 3.0165 | 2.84 | 0.816 | 2.8085 |
参见图17a和17b。
这些数据表明参与单抗6A1或L1+A1与人IL-13之间相互作用的关键氨基酸残基是位点107的精氨酸(R)，和位点103的赖氨酸(K)。
我们对这项分析进行了重复，但使用的是多种浓度的6A1和L1+A1单抗，以此在单抗稀释范围内验证该效果。
我们检测了亲本小鼠单抗6A1(图17c)和人源化候选单抗L1+A1(图17d)在不同浓度与丙氨酸扫描肽(SEQ I.D.129、131-135)的结合情况。因为要将这些肽分到两个96孔板上，在两个板上都检测了不含有丙氨酸取代的亲本序列肽(SED I.D：129)，因此每个图有两组结果。这样做是为了确定是否存在板和板之间的差异，结果在两种情况中都没有明显差异。
含有K103A、L105A和F106A这些取代的肽(分别是SEQ I.D 131、133和134，残基编号如SEQ ID 9所示)与单抗的结合情况显示出与亲本肽(SEQID 129)非常相似，因此这些残基对6A1/L1+A1和IL-13进行结合不重要。而含有K104A和R107A取代的肽(分别是SEQ I.D.132和135，残基编号如SEQ ID 9所示)与亲本肽(SEQ ID 129)相比，它们和6A1/L1+A1的结合下降了，尤其是在较低浓度时，这表明这些残基对于6A1/L1+A1与IL-13之间的最佳结合是很关键的。
参见图17c和17d。
这些数据表明参与亲本(即小鼠)6A1或L1+A1和人IL-13之间的相互作用的关键氨基酸残基是SEQ.I.D.NO：9中位点107的精氨酸(R)和位点103的赖氨酸(K)。
部分7-材料与方法
以下部分中，适当地使用了如下材料与方法。这些是代表性的材料和方法。在重复实验中可能对材料和方法进行了小的改动。
材料
SV总RNA分离系统：Promega Z3100
Access RT-PCR系统：Promega A1250
QIAquick凝胶提取试剂盒：Qiagen 28704
凝胶上样液：Sigma G7654
琼脂糖：Invitrogen 15510-019
溴化乙啶：Sigma E1510
TAE缓冲液：自备
100bp DNA分子量条带：New England BioLabs N3231S
TA克隆试剂盒：Invitrogen 45-0046
TOP10F′细胞：Invitrogen 44-0300
L-琼脂+100μg/ml氨苄青霉素：自备
X-Gal，50mg/ml溶于DMF：Promega V394A
AmpliTaq DNA聚合酶：Applied Biosystems
10×PCR缓冲液：Applied Biosystems
E-凝胶1.2％琼脂糖：Invitrogen G501801
LB培养基+100μg/ml氨苄青霉素：自备
QIAprep Spin微量制备试剂盒：Qiagen 27106
MinElute PCR纯化试剂盒：Qiagen 28004
NEBuffer 210×浓度：New England Biolabs B7002S
纯化的BSA 100×浓度：New England Biolabs B9001S
BsiW I：New England Biolabs R0553L
Hind III：Promega R604A
Spe I：New England Biolabs R0133S
LigaFast快速DNA连接系统：Promega M8225
MAX Efficiency DH5α化学感受态细胞：Invitrogen 18258-012
SOC培养基：自备
QIAfilter Plasmid Maxi试剂盒：Qiagen 12263
含有Glutamax-1的Dulbecco′s MEM：Invitrogen 31966-021
含有Glutamax-1的Optimem1：Invitrogen 51985-026
TransFast转染试剂：Promega E2431
1ml HiTrap r蛋白A Sepharose FF：Amersham Biosciences 17-5079-01
Dulbecco′s PBS：Sigma D8537
ImmunoPure IgG洗脱缓冲液：Pierce 21009
1M Trizma-HCl pH8.0：Sigma T2694
ProofStart DNA聚合酶：Qiagen 1016816
ProofStart PCR缓冲液：Qiagen 1016961
7.1.人或食蟹猴IL-13结合ELISA
这项检测描述了ELISA实验，该实验用于检测抗体与人或食蟹猴IL-13之间的结合。其是夹心ELISA。
7.1.1材料
1.Nunc Immunoplate 1 F96 Maxisorp(Life Technologies，4-39454A)
2.人IL-13(Cambridge Biosciences，目录编号CH1-013)
3.食蟹猴IL-13(由GlaxoSmithkline制备)
4.山羊抗人IL-13多克隆抗体(R+D Systems，目录编号AF-213-NA)
5.抗人IgG-HRP(Sigma，目录编号A-6029)
6.抗小鼠IgG-HRP(Sigma，目录编号A-9309)
7.碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(Sigma；目录编号C-3041)
8.TBST[Tris缓冲的盐水(6.06g Tris+8.06g NaCl+0.2g KCl+H2O至1L)+0.05％ Tween 20]
9.BSA(Sigma A-7030)
10.OPD(Sigma，目录编号P-9187)
11.硫酸
7.1.2方法
1.封闭液是3％BSA+TBST
2.洗涤液是TBST
3.将′Nunc Maxisorp′ELISA板包被50μl溶于碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(Sigma；目录编号C-3041，按照厂商的使用说明制备)的5μg/ml山羊抗人IL-13多克隆抗体(R+D Systems，目录编号AF-213-NA。按照厂商的说明制备成500μg/ml的储液，分装保存在-20℃)，盖上盖子，于4℃培育过夜。
4.用100μl 3％BSA/TBST封闭，室温常压(rtp)培育1小时。
5.在TBST中洗涤3次(每个孔每次至少用200μl洗涤液清洗)。
6.每个孔中加入溶于封闭液的20ng(在50μl体积中)人IL-13(Cambridge Bioscience，目录编号CH1-013。按照厂商的说明制备成100ng/μl的储液，分装保存在-20℃)或者每个孔20ng食蟹猴IL-13，室温培育1小时。
7.在TBST中洗3次。
8.加入50μl溶于封闭液的抗体样品(如果需要，进行滴定获得终点滴度数据)，室温常压培育1小时。
9.在TBST中洗3次。
10.对于6A1嵌合抗体或人源化抗体，每孔用50μl 1/2000稀释于封闭液的抗人IgG-HRP(Sigma，目录编号A-6029)置室温常压1小时来探测它们的结合。对6A1小鼠单克隆抗体，检测结合是每孔用50μl 1/1000稀释于封闭液的抗小鼠IgG-HRP(Sigma，目录编号A-9309)置室温常压1小时。
11.在TBST中洗3次。
12.用100μl OPD(Sigma，目录编号P-9187。按照厂商说明制备)进行显影，用50μl 3M H2SO4终止显影反应，读取490nm处的吸光度。显影时间大约12分钟。
7.2.人IL-13结合人IL-13Rα1链ELISA
这项ELISA用于确定抗体是否能抑制人IL-13结合到IL-13Rα1链。
7.2.1材料
1.Nunc Immunoplate 1 F96 Maxisorp(Life Technologies，4-39454A)
2.人IL-13Rα1-Fc(R&D Systems，目录编号146-IR)
3.Det-1标记的人IL-13(自备)
4.生物素化的抗人IL-13(R&D Systems，目录编号BAF213)
5.链霉亲和素-HRP
6.碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(Sigma；目录编号C-3041)
7.TBST[Tris缓冲的盐水(6.06g Tris+8.06g NaCl+0.2g KCl+H20至1L)+0.05％ Tween 20]
8.BSA(Sigma A-7030)
9.OPD(Sigma，目录编号P-9187)
10.硫酸
7.2.2方法
1.封闭液是3％BSA+TBST
2.洗涤液是TBST
3.将′Nunc Maxisorp′ELISA板包被50μl溶于碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液的5ng/μl人IL-13Rα1-Fc。盖上盖子，于4℃培育过夜。
4.用100μl 3％BSA/TBST封闭，室温常压培育1小时。
5.在TBST中洗涤3次(每个孔每次至少用200μl洗涤液洗)。
6.在50μl的总体积中，使0.04ng/μl det-1标记的人IL-13与抗体样品(滴定过的)在封闭液中预保温30分钟。将预保温的样品加入包被了受体的ELISA板，于室温培育1小时。
7.在TBST中洗3次
8.每孔用50μl稀释到1μg/ml的生物素化的抗人IL-13检测结合的人IL-13。室温培育1小时。
9.在TBST中洗3次
10.每孔加入50μl 1/1000稀释的链霉亲和素-HRP偶联物。室温保温1小时。
11.在TBST中洗3次。
12.用每孔100μl OPD(Sigma，目录编号P-9187。按照厂商的说明制备)进行显影，用每孔50μl 3M H2SO4终止显影反应，读取490nm处的吸光度。显影时间大约2分钟。
7.3.人IL-13结合人IL-13Rα2链ELISA
这项ELISA用于确定抗体是否能抑制人IL-13结合到IL-13Rα2链。
7.3.1材料
1.Nunc Immunoplate 1 F96 Maxisorp(Life Technologies，4-39454A)
2.抗人IgG(Sigma，目录编号I-3382)
3.人IL-13Rα2-Fc(R&D Systems，目录编号641-IR)
4.Det-1标记的人IL-13(自备)
5.生物素化的抗人IL-13(R&D Systems，目录编号BAF213)
6.链霉亲和素-HRP
7.碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(Sigma；目录编号C-3041)
8.TBST[Tris缓冲的盐水(6.06g Tris+8.06g NaCl+0.2g KCl+H20至1L)+0.05％ Tween 20]
9.BSA(Sigma A-7030)
10.OPD(Sigma，目录编号P-9187)
11.硫酸
7.3.2方法
1.封闭液是3％BSA+TBST
2.洗涤液是TBST
3.将′Nunc Maxisorp′ELISA板包被50μl 1/1000稀释于碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液的抗-人IgG。盖上盖子，于4℃培育过夜。
4.用100μl 3％BSA/TBST封闭，室温常压培育1小时。
5.在TBST中洗涤3次(每个孔每次至少用200μl洗涤液洗)。
6.每孔加入50μl溶于封闭液的1μg/ml人IL-13αR2-Fc。盖上盖子，室温培育1小时。
7.在TBST中洗3次
8.在50μl的总体积中，使0.04ng/μl det-1标记的人IL-13与抗体样品(滴定过的)在封闭液中预保温30分钟。将预保温过的样品加入包被了受体的ELISA板，于室温培育1小时。
9.在TBST中洗3次
10.每孔用50μl稀释到1μg/ml的生物素化的抗人IL-13检测任何结合的人IL-13。室温培育1小时。
11.在TBST中洗3次
12.每孔加入50μl 1/1000稀释的链霉亲和素-HRP偶联物。室温保温1小时。
13.在TBST中洗3次。
14.用每孔100μl OPD(Sigma，目录编号P-9187。按照厂商的说明制备)进行显影，用每孔50μl 3M H2SO4终止显影反应，读取490nm处的吸光度。显影时间大约2分钟。
7.4.IL-13中和试验(TF-1细胞增殖测试)
这项IL-13试验可以用于确定抗IL-13抗体的中和能力。以下描述的方法使用了重组人或食蟹猴IL-13。该项检测也可以使用哺乳动物表达的人IL-13或Q130人IL-13变体。(TF-1细胞在应答人IL-5时也会增殖。这项检测也被用来评价6A1对人IL5的中和能力)。
7.4.1材料
1.TF-1细胞系(自备)
2.96孔组织培养板(Invitrogen)
3.人IL-13(Cambridge Bioscience，目录编号CH1-013)
4.CellTiter 96非放射性细胞增殖检测(Promega，目录编号G4000)
7.4.2方法
1.这种方法是在TF-1细胞试验(TF-1细胞系是自制的，不是ATCC的)中，测量抗人IL-13单抗中和重组人或食蟹猴IL-13的生物活性的能力。
2.该项检测是在无菌条件下，在无菌96孔组织培养板(Invitrogen)中进行的。所有实验重复了三次。
3.将10ng/ml人IL-13(Cambridge Bioscience，目录编号CH 1-013。按照厂商的说明，采用无菌技术在2级组织培养通风橱中制备得到100ng/μl的储液，分装保存在-20℃)或10ng/ml食蟹猴IL-13(从CA获得的自制品)与不同稀释度的抗人IL-13单抗(从6μg/ml以3倍稀释度稀释到0.025μg/ml)在37℃预保温1小时，系统总体积为50μl。还包括有IL-13但没有抗人IL-13单抗的阳性对照孔。此外，阴性对照孔既没有IL-13也没有抗人IL-13单抗。用无菌、低蛋白质结合、圆底的96孔板进行这项预保温。(注意在后期加入细胞时，IL-13和抗人IL-13单抗的浓度会被减少一半)。
4.在无菌96孔组织培养板上逐孔加入50μl浓度为2×105/ml的TF-1细胞。1小时预保温后，向细胞中加入IL-13和抗人IL-13单抗样品。最后的100μl检测体积，含有不同抗人IL-13单抗稀释液、重组IL-13和TF-1细胞。将其在保湿的CO2培养箱中于37℃保温大约70小时。
5.在大约66小时时，仔细观察小孔以确定它们都是无菌的，没有发生细菌污染。
6.每个孔中加入15μl过滤除菌的MTT底物(目录编号G4000，Promega.按照厂商的说明制备)进行最后4小时的保温。
7.用100μl终止液(MTT试剂盒中提供的)终止反应，以便溶解代谢产生的蓝甲臜产物。放置至少2小时，然后用移液器上下吸放促进晶体溶解。替代地，可以盖上盖子，置4℃过夜，然后第二天混匀(就混匀溶液来说，这样更容易)。
8.在96孔板测读仪中读取每个微孔中的溶液在570nm波长的吸光度。
9.抗人IL-13单抗中和人或食蟹猴IL-13生物活性的能力表达为，使一定量人或食蟹猴IL-13(5ng/ml)的生物活性被中和50％(＝ND50)所需的抗人IL-13单抗浓度。所需浓度越低，其中和能力越强。
例子：该项检测的96孔板设置
样品1 阳性抗体
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |||
| A | 3μg/ml抗hIL-13单抗+IL-13+TF-1 | 单抗样品2 | 单抗样品3 | 3μg/ml抗hIL-13多克隆抗体+IL-13+TF-1 | ||||||||||
| B | 1μg/ml抗hIL-13单抗+IL-13+TF-1 | 1μg/ml抗hIL-13多克隆抗体+IL13+TF-1 | ||||||||||||
| C | 0.33μg/ml抗hIL-13单抗+IL-13+TF-1 | 0.33μg/ml抗hIL-13多克隆抗体+IL-13+TF-1 | ||||||||||||
| D | 0.11μg/ml抗hIL-13单抗+IL-13+TF-1 | 0.11μg/ml抗hIL-13多克隆抗体+IL13+TF-1 | ||||||||||||
| E | 0.037μg/ml抗hIL-13单抗+IL-13+TF-1 | 0.037μg/ml抗hIL-13多克隆抗体+IL-13+TF-1 | ||||||||||||
| F | 0.0123μg/ml抗hIL-13单抗 | 0.0123μg/ml抗hIL-13多克隆抗体 | ||||||||||||
| +IL-13+TF-1 | +IL-13+TF-1 | |||
| G | TF-1细胞增殖阳性对照＝TF-1细胞+IL-13(没有单抗，12孔) | |||
| H | 背景对照＝只有TF-1细胞(没有IL-13，没有单抗样品，12孔) | |||
7.5.人IL-4结合ELISA
这项测试描述了检测抗体与人IL-4结合情况的ELISA实验。所述ELISA是夹心ELISA。
7.5.1材料
1.Nunc lmmunoplate 1 F96 Maxisorp(Life Technologies，4-39454A)
2.人IL-4(R+D Systems，目录编号)
3.山羊抗人IL-4多克隆抗体(R+D Systems，目录编号AF-204-NA)
4.生物素化的大鼠抗人IL-4单克隆抗体(BD/Pharmingen，目录编号)
5.抗小鼠IgG-HRP(Dako，目录编号P0260)
6.抗小鼠IgG-HRP(Sigma，目录编号A-9309)
7.碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(Sigma；目录编号C-3041)
8.PBST(PBS+0.05％ Tween 20)
9.BSA(Sigma A-7030)
10.OPD(Sigma，目录编号P-9187)
11.硫酸
7.5.2方法
1.封闭液是溶于PBST的3％BSA
2.洗涤液是PBST
3.将′Nunc Maxisorp′ELISA板包被50μl溶于碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(Sigma；目录编号C-3041，按照厂商的使用说明制备)的5μg/ml山羊抗人IL-4多克隆抗体(R+D Systems，目录编号AF-204-NA。按照厂商的说明制备成500μg/ml的储液，分装保存在-20℃)，盖上盖子，于4℃培育过夜。
4.用100μl 3％BSA/PBST封闭，在室温常压(rtp)下培育1小时。
5.在PBST中洗涤3次(每个孔每次至少用200μl洗涤液清洗)。
6.加入溶于封闭液的1ng/ml(50μl体积)的人IL-4，室温培育1小时。
7.在PBST中洗3次。
8.加入50μl溶于封闭液的抗体样品(如果需要，进行滴定获得终点滴度数据)，室温常压培育1小时。用一个生物素化的抗人IL-4单克隆抗体(滴定过的)作为结合人IL-4的阳性对照。
9.在PBST中洗3次。
10.对于6A1小鼠单克隆抗体，每孔用50μl 1/1000稀释于封闭液的抗小鼠IgG-HRP(Sigma，目录编号A-9309)置室温常压1小时来探测它们的结合。对于6A1嵌合抗体或人源化抗体，每孔用50μl 1/2000稀释于封闭液的抗人IgG-HRP(Sigma，目录编号A-6029)置室温常压1小时来探测它们的结合。对阳性对照生物素化的大鼠抗人IL-4单克隆抗体，用偶联了链霉亲和素-HRP的抗体进行检测。(替代地，抗小鼠HRP抗体，P0260能够检测到6A1和生物素化的大鼠抗人IL-4单克隆抗体)。
11.在PBST中洗3次。
12.用100μl OPD(Sigma，目录编号P-9187。按照厂商说明制备)进行显影，用50μl 3M H2SO4终止显影反应，读取490nm处的吸光度。
7.6.表位作图ELISA
这项检测描述的ELISA实验用于探测小鼠单抗6A1与人或食蟹猴IL-13肽的结合。
7.6.1材料
1.Nunc lmmunoplate 1 F96 Maxisorp(Life Technologies，4-39454A)
2.ImmunoPure链霉亲和素(Pierce，目录编号21125)
3.PBST(磷酸缓冲盐溶液+0.05％ Tween 20)
4.BSA(Sigma A-7030)
5.人和食蟹猴IL-1316聚体肽，偏移量＝4(Mimotopes为我们特制)
6.阳性和阴性对照20聚体肽(Mimotopes特制)
7.6A1单抗
8.对照抗体(Mimotopes特制)
9.偶联HRP的兔抗小鼠Ig(DAKO，代码P0260)
10.OPD(Sigma，目录编号P-9187)
11.3M硫酸
7.6.2方法
1.封闭液是3％BSA+PBST
2.洗涤液是PBST
3.将′Nunc Maxisorp′ELISA板包被100μl用PBST稀释的5μg/mlImmunoPure链霉亲和素(Pierce，目录编号21125，按照厂商的说明制备1mg/ml的储液，分装保存于4℃)。于37℃培育过夜使溶液变干。
4.用200μl 3％BSA/PBST封闭。加上盖子，在室温常压(rtp)下培育1小时。
5.在PBST中洗涤3次(每个孔每次至少用200μl洗涤液清洗)。
6.以重复实验的方式，PBST作为稀释液，在每个孔(除了对照孔)中加入100μl每种肽(按照厂商的说明溶解在200μl 40％乙腈60％水中，然后在同一溶剂中10倍稀释分装，保存于-20℃)的1000倍稀释液。
7.在对照孔中，以重复实验的方式，PBST作为稀释液，每个孔中加入100μl对照肽(按照厂商的说明溶解在1ml 40％乙腈60％水中，保存于-20℃)的10倍稀释液。加上盖子，在摇台上室温常压培育1小时。
8.在PBST中洗3次(每个孔每次至少用200μl洗涤液清洗)。
9.每孔(除了对照孔)加入100μl溶于PBST的1.506μg/ml小鼠单抗。
10.给每个对照孔加入100μl用PBST稀释4、16和32倍的对照抗体(直接使用厂商提供的，保存在-20℃)。加上盖子，于室温常压下在摇台上保温1小时。
11.在PBST中洗3次(每个孔每次至少用200μl洗涤液清洗)。
12.在每个孔中加入100μl偶联HRP的兔抗小鼠Ig(DAKO，代码P0260，直接使用，保存在4℃)的2000倍稀释液(PBST作稀释液)，加上盖子，于室温常压下在摇台上保温1小时。
13.在PBST中洗3次(每个孔每次至少用200μl洗涤液清洗)。
14.用100μl OPD(Sigma，目录编号P-9187。按照厂商说明制备)进行显影，用50μl 3M H2SO4终止显影反应，读取490nm处的吸光度。显影时间大约10分钟。
7.7.精确表位作图ELISA
这项检测描述的ELISA实验用于探测单抗6A1与人或食蟹猴IL-13肽的结合。
7.7.1材料
1.Nunc Immunoplate 1 F96 Maxisorp(Life Technologies，4-39454A)
2.ImmunoPure链霉亲和素(Pierce，目录编号21125)
3.PBST(磷酸缓冲盐溶液+0.05％ Tween 20)
4.BSA(Sigma A-7030)
5.人和食蟹猴IL-13部分敲除(window net)肽(从N末端和C末端一次截去一个氨基酸产生的14聚体；Mimotopes为我们特制)
6.阳性对照16聚体肽(前述Mimotopes特制的)
7.6A1单抗(自备)
8.偶联HRP的山羊抗小鼠IgG(Fc特异的)抗体(Sigma A-9309)
9.OPD(Sigma，目录编号P-9187)
11.3M硫酸
7.7.2方法
1.封闭液是3％BSA+PBST
2.洗涤液是PBST
3.将′Nunc Maxisorp′ELISA板包被100μl溶于超纯水的5μg/mlImmunoPure链霉亲和素(Pierce，目录编号21125，按照厂商的说明制备1mg/ml的储液，分装保存于4℃)。于37℃培育过夜。
4.用200μl 3％BSA/PBST封闭。加上盖子，在4℃保温过夜。
5.在PBST中洗涤3次(每个孔每次至少用200μl洗涤液清洗)。
6.以重复实验的方式，3％BSA/PBST作为稀释液，在每个孔中加入100μl每种肽(按照厂商的说明溶解在200μl 40％乙腈60％水中，保存于-20℃)的1000倍稀释液。加上盖子，于室温在摇台上保温1小时。
7.在PBST中洗3次(每个孔每次至少用200μl洗涤液清洗)。
8.每孔加入100μl稀释于3％BSA/PBST的3μg/ml 6A1。加上盖子，于室温在摇台上保温1小时。
9.在PBST中洗3次(每个孔每次至少用200μl洗涤液清洗)。
10.在每个孔中加入100μl偶联HRP的山羊抗小鼠IgG(Sigma A-9309，直接使用，保存在4℃)的1000倍稀释液(3％BSA/PBST作稀释液)。加上盖子，于室温在摇台上保温1小时。
11.在PBST中洗3次(每个孔每次至少用200μl洗涤液清洗)。
12.用100μl OPD(Sigma，目录编号P-9187。按照厂商说明制备)进行显影，用50μl 3M H2SO4终止显影反应，读取490nm处的吸光度。显影时间大约10分钟。
7.8 BiacoreTM方法分析IL13抗体的人源化构建体比对全长IL13
采用抗体捕获方法在一台Biacore 3000仪上做动力学分析。简而言之，用蛋白A来捕获嵌合6A1和人源化抗体构建体，而对亲本小鼠6A1抗体，捕获是用Biacore提供的抗小鼠Fc抗体进行的。
简单来说，该方法如下所述，按照Biacore的标准方法，利用Biacore的伯胺基偶联试剂盒中提供的试剂，将捕获配体通过伯胺基偶联固定到CM5生物传感器芯片上。该方法涉及使50mM N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)和200mM N-乙基-N′-二甲氨基丙基碳化物(EDC)溶液流过M5传感器表面使表面被活化。然后将捕获配体(溶解在pH5或pH4.5的乙酸缓冲液中)偶联到活化的传感器表面，随后通过注射1M盐酸乙醇胺(pH8.5)来封闭所有仍然处于活化态的酯。然后根据待测抗体是来源于人还是小鼠的，使其流过蛋白A或抗小鼠Fc抗体表面，并被捕获。待可以看到稳定的结合信号，使不同指定浓度的IL13流过被捕获抗体的表面。利用Biacore分析软件BIAeval v4.1来分析随后的结合曲线从而确定其动力学。实验采用Biacore HBS-EP缓冲液来进行。
7.8.1 BiacoreTM方法分析IL-13抗体比对(vs)肽
动力学分析是在Biacore 3000仪上利用抗体直接结合固定的IL-13肽来进行的。简而言之，用Biacore SA(链霉亲和素)生物传感器芯片捕获IL-13生物素化的肽。然后使不同浓度的抗体流过传感器表面。用Biacore分析软件BIAeval v4.1分析随后的结合曲线从而确定其动力学。实验采用BiacoreHBS-EP缓冲液来进行。
8.L1+A1人源化抗IL-13单抗在食蟹猴哮喘模型中的效能
这部分是预言性的。
猪蛔虫(Ascaris suum)-诱导的食蟹猴(Macaca fascicularis)肺支气管收缩模型被认为是人的哮喘或哮喘相关疾病的非临床模型(Patterson R，et al，Trans.Assoc.Am.Physicians 1980 93：317-325；Patterson R et al，J.Lab.Clin.Med.1983 101：864-872)。
在这个模型中，将对猪蛔虫有天生肺敏感性的动物与雾化的猪蛔虫进行接触来诱导哮喘反应。通过测量气道过强反应性(AHR)、在支气管肺泡灌洗(BAL)液中测量细胞浸润和血清IgE水平对该哮喘反应进行研究。实验方法与以前Mauser P等(Am.J.Resp.Crit.Care Med.1995 204：467-472)和Evanoff H等(Immunologic Investigation 1992 21：39)描述的类似。
这项研究使用了30只动物，这些动物在初选时均对特定剂量的猪蛔虫抗原表现出阳性支气管收缩反应。将猪蛔虫以最佳反应剂量(ORD)给予每只动物。ORD是预先确定的猪蛔虫剂量，通过喷雾吸入(用喷雾器在15次呼吸内给予单个剂量)时，使得RL(肺耐药性)至少上升40％，而CDYN(动态顺应性)至少下降35％。
研究分两个阶段进行。在第一阶段中，给予猪蛔虫抗原之前(第1天评价了基础肺功能)和之后(第11天)，均对应答静脉内(i/v)组胺攻击的AHR进行了评价(在第9和第10天，通过喷雾剂吸入将猪蛔虫以最佳预先确定的剂量对每一动物给药)。其中所述组胺的剂量足够诱导RL比基础水平上升至少30％(PC30)。
第2阶段与第1阶段相同，除了动物接受的是抗体处理(参见下文)，每只动物在第1、5和9天，通过i/v输注被给予3剂大约30mg/kg剂量的每种抗体。
第1组(n＝12)：L1+A1(人源化抗IL-13单抗，SEQ.I.D.NO：18和SEQ.I.D.NO：22)
第2组(n＝12)：L1+A1(人源化抗IL-13单抗，30mg/kg)和Pascolizumab(人源化抗IL4单抗，30mg/kg)
第3组(n＝6)：只有载体的阴性对照处理
第1和第2阶段的AHR结果数据是用Buxco肺力学系统，取应答组胺时的气压和气流读数-肺耐药性(RL)和动力学顺应性(CDYN)计算的。比较第1阶段和第2阶段(即有或没有抗体处理)中，从基础水平到猪蛔虫抗原攻击后的最大百分比变化[对肺耐药性(RL)和动态顺应性(CDYN)而言]，这些数据用来评价AHR表现型。
此外，在第1和第2阶段的第1和第11天，取BAL样品来测量细胞浸润情况，特别是嗜酸性粒细胞增多。还抽取了血清样品来监控IgE水平。
表A
| 蛋白或多核苷酸(PN)描述 | 序列编号(SEQ.I.D.NO：) |
| 6A1，CDRH1 | 1 |
| 6A1，CDRH2 | 2 |
| 6A1，CDRH3 | 3 |
| 6A1，CDRL1 | 4 |
| 6A1，CDRL2 | 5 |
| 6A1，CDRL3 | 6 |
| 6A1，VH(小鼠) | 7 |
| 6A1，VL(小鼠) | 8 |
| hIL-13 | 9 |
| hIL-13(PN) | 10 |
| 6A1，VH，人源化构建体A1 | 11 |
| 6A1，VH，人源化构建体A2 | 12 |
| 6A1，VH，人源化构建体A3 | 13 |
| 6A1，VH，人源化构建体A4 | 14 |
| 6A1，VL，人源化构建体L1 | 15 |
| 6A1，VL，人源化构建体L2 | 16 |
| 6A1，重链，人源化构建体A1 | 18 |
| 6A1，重链，人源化构建体A2 | 19 |
| 6A1，重链，人源化构建体A3 | 20 |
| 6A1，重链，人源化构建体A4 | 21 |
| 6A1，轻链，人源化构建体L1 | 22 |
| 6A1，轻链，人源化构建体L2 | 23 |
| 6A1，编码SEQ.I.D.NO：7的PN | 24 |
| 6A1，编码SEQ.I.D.NO：8的PN | 25 |
| 6A1，编码SEQ.I.D.NO：11的PN | 26 |
| 6A1，编码SEQ.I.D.NO：12的PN | 27 |
| 6A1，编码SEQ.I.D.NO：13的PN | 28 |
| 6A1，编码SEQ.I.D.NO：14的PN | 29 |
| 6A1，编码SEQ.I.D.NO：15的PN | 30 |
| 6A1，编码SEQ.I.D.NO：16的PN | 31 |
| 6A1，编码SEQ.I.D.NO：18的PN | 32 |
| 6A1，编码SEQ.I.D.NO：19的PN | 33 |
| 6A1，编码SEQ.I.D.NO：20的PN | 34 |
| 6A1，编码SEQ.I.D.NO：21的PN | 35 |
| 6A1，编码SEQ.I.D.NO：22的PN | 36 |
| 6A1，编码SEQ.I.D.NO：23的PN | 37 |
序列表
SEQ.I.D.NO：1
FYIKDTYMH
SEQ.I.D.NO：2
TIDPANGNTKYVPKFQG
SEQ.I.D.NO：3
SIYDDYHYDDYYAMDY
SEQ.I.D.NO：4
RSSQNIVHINGNTYLE
SEQ.I.D.NO：5
KISDRFS
SEQ.I.D.NO：6
FQGSHVPWT
SEQ.I.D.NO：7
EIQLQQSVAELVRPGASVRLSCTASGFYIKDTYMHWVIQRPEQGLEWIGTIDPAN
GNTKYVPKFQGKATITADTSSNTAYLRLSSLTSEDTAIYYCARSIYDDYHYDDYY
AMDYWGQGTSVTVSS.
SEQ.I.D.NO：8
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHINGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYK
ISDRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKLE
IK.
SEQ.I.D.NO：9
GPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSG
CSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGR
FN
SEQ.I.D.NO：10
GGCCCTGTGCCTCCCTCTACAGCCCTCAGGGAGCTCATTGAGGAGCTGGTCAACA
TCACCCAGAACCAGAAGGCTCCGCTCTGCAATGGCAGCATGGTATGGAGCATCAA
CCTGACAGCTGGCATGTACTGTGCAGCCCTGGAATCCCTGATCAACGTGTCAGGC
TGCAGTGCCATCGAGAAGACCCAGAGGATGCTGAGCGGATTCTGCCCGCACAAGG
TCTCAGCTGGGCAGTTTTCCAGCTTGCATGTCCGAGACACCAAAATCGAGGTGGC
CCAGTTTGTAAAGGACCTGCTCTTACATTTAAAGAAACTTTTTCGCGAGGGACGG
TTCAACTGA
SEQ.I.D.NO：11
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPAN
GNTKYVPKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYY
AMDYWGQGTLVTVSS
SEQ.I.D.NO：12
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVIQAPGQGLEWMGTIDPAN
GNTKYVPKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYY
AMDYWGQGTLVTVSS
SEQ.I.D.NO：13
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVIQAPGQGLEWMGTIDPAN
GNTKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYY
AMDYWGQGTLVTVSS
SEQ.I.D.NO：14
QVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGFYIKDTYMHWVIQAPGQGLEWMGTIDPAN
GNTKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMRLSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYY
AMDYWGQGTLVTVSS
SEQ.I.D.NO：15
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVHINGNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYK
ISDRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDVGIYYCFQGSHVPWTFGQGTKLE
IK
SEQ.I.D.NO：16
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVHINGNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYK
ISDRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDVGVYYCFQGSHVPWTFGQGTKLE
IK
SEQ.I.D.NO：17
MGWSCIILFLVATATGVHS
SEQ.I.D.NO：18
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPAN
GNTKYVPKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYY
AMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS
WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD
KKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK
VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI
AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL
HNHYTQKSLSLSPGK
SEQ.I.D.NO：19
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVIQAPGQGLEWMGTIDPAN
GNTKYVPKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYY
AMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS
WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD
KKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK
VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI
AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL
HNHYTQKSLSLSPGK
SEQ.I.D.NO：20
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVIQAPGQGLEWMGTIDPAN
GNTKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYY
AMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS
WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD
KKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK
VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI
AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL
HNHYTQKSLSLSPGK
SEQ.I.D.NO：21
QVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGFYIKDTYMHWVIQAPGQGLEWMGTIDPAN
GNTKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMRLSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYY
AMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS
WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD
KKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK
VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI
AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL
HNHYTQKSLSLSPGK
SEQ.I.D.NO：22
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVHINGNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYK
ISDRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDVGIYYCFQGSHVPWTFGQGTKLE
IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ
ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ.I.D.NO：23
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVHINGNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYK
ISDRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDVGVYYCFQGSHVPWTFGQGTKLE
IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ
ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ.I.D.NO：24
GAAATTCAGCTGCAGCAGTCTGTGGCAGAACTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCA
GGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCTACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGT
GATTCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAACGATTGATCCTGCGAAT
GGTAATACTAAATATGTCCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACTGCAGACA
CATCCTCCAACACAGCCTACCTGCGGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGC
CATCTATTACTGTGCTAGAAGCATCTATGATGATTACCACTACGACGATTACTAT
GCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
SEQ.I.D.NO：25
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAG
CCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAACATTGTACATATTAATGGAAACACCTA
TTTAGAATGGTACCTTCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAA
ATTTCCGACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGA
CAGATTTCACGCTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTA
CTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAA
ATCAAA
SEQ.I.D.NO：26
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGA
AGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATTCTACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGT
GCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAACGATTGATCCTGCGAAT
GGTAATACTAAATATGTCCCGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACG
AATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGC
CGTGTATTACTGTGCGAGAAGCATCTATGATGATTACCACTACGACGATTACTAT
GCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCA
SEQ.I.D.NO：27
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGA
AGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATTCTACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGT
GATACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAACGATTGATCCTGCGAAT
GGTAATACTAAATATGTCCCGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACG
AATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGC
CGTGTATTACTGTGCGAGAAGCATCTATGATGATTACCACTACGACGATTACTAT
GCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCA
SEQ.I.D.NO：28
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGA
AGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATTCTACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGT
GATACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAACGATTGATCCTGCGAAT
GGTAATACTAAATATGTCCCGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACA
CATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGC
CGTGTATTACTGTGCGAGAAGCATCTATGATGATTACCACTACGACGATTACTAT
GCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCA
SEQ.I.D.NO：29
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGA
GGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATTCTACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGT
GATACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAACGATTGATCCTGCGAAT
GGTAATACTAAATATGTCCCGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACA
CATCCACGAGCACAGCCTACATGAGGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGC
CGTGTATTACTGTGCGAGAAGCATCTATGATGATTACCACTACGACGATTACTAT
GCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCA
SEQ.I.D.NO：30
GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGG
CCTCCATCTCCTGCAGATCTAGTCAGAACATTGTACATATTAATGGAAACACCTA
TTTAGAATGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACGGCTCTTGATCTATAAA
ATTTCCGACCGATTTTCTGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCA
CAGATTTTACATTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGACGATGTTGGAATTTATTA
CTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTGGACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAG
ATCAAG
SEQ.I.D.NO：31
GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGG
CCTCCATCTCCTGCAGATCTAGTCAGAACATTGTACATATTAATGGAAACACCTA
TTTAGAATGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACGGCTCTTGATCTATAAA
ATTTCCGACCGATTTTCTGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCA
CAGATTTTACATTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGACGATGTTGGAGTTTATTA
CTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTGGACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAG
ATCAAG.
SEQ.I.D.NO：32
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGA
AGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATTCTACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGT
GCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAACGATTGATCCTGCGAAT
GGTAATACTAAATATGTCCCGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACG
AATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGC
CGTGTATTACTGTGCGAGAAGCATCTATGATGATTACCACTACGACGATTACTAT
GCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCA
AGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCAC
AGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCG
TGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGT
CCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGG
CACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC
AAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAG
CACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGA
CACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC
CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATA
ATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAG
CGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAG
GTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAG
GGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAC
CAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATC
GCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC
CCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAA
GAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTG
CACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ.I.D.NO：33
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGA
AGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATTCTACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGT
GATACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAACGATTGATCCTGCGAAT
GGTAATACTAAATATGTCCCGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACG
AATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGC
CGTGTATTACTGTGCGAGAAGCATCTATGATGATTACCACTACGACGATTACTAT
GCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCA
AGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCAC
AGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCG
TGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGT
CCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGG
CACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC
AAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAG
CACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGA
CACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC
CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATA
ATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAG
CGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAG
GTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAG
GGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAC
CAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATC
GCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC
CCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAA
GAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTG
CACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ.I.D.NO：34
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGA
AGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATTCTACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGT
GATACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAACGATTGATCCTGCGAAT
GGTAATACTAAATATGTCCCGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACA
CATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGC
CGTGTATTACTGTGCGAGAAGCATCTATGATGATTACCACTACGACGATTACTAT
GCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCA
AGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCAC
AGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCG
TGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGT
CCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGG
CACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC
AAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAG
CACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGA
CACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC
CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATA
ATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAG
CGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAG
GTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAG
GGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAC
CAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATC
GCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC
CCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAA
GAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTG
CACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ.I.D.NO：35
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGA
GGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATTCTACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGT
GATACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAACGATTGATCCTGCGAAT
GGTAATACTAAATATGTCCCGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACA
CATCCACGAGCACAGCCTACATGAGGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGC
CGTGTATTACTGTGCGAGAAGCATCTATGATGATTACCACTACGACGATTACTAT
GCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCA
AGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCAC
AGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCG
TGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGT
CCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGG
CACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC
AAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAG
CACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGA
CACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC
CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATA
ATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAG
CGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAG
GTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAG
GGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAC
CAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATC
GCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC
CCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAA
GAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTG
CACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ.I.D.NO：36
GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGG
CCTCCATCTCCTGCAGATCTAGTCAGAACATTGTACATATTAATGGAAACACCTA
TTTAGAATGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACGGCTCTTGATCTATAAA
ATTTCCGACCGATTTTCTGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCA
CAGATTTTACATTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGACGATGTTGGAATTTATTA
CTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTGGACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAG
ATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGC
AGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAG
AGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAG
GAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCC
TGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCAC
CCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
SEQ.I.D.NO：37
GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGG
CCTCCATCTCCTGCAGATCTAGTCAGAACATTGTACATATTAATGGAAACACCTA
TTTAGAATGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACGGCTCTTGATCTATAAA
ATTTCCGACCGATTTTCTGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCA
CAGATTTTACATTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGACGATGTTGGAGTTTATTA
CTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTGGACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAG
ATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGC
AGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAG
AGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAG
GAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCC
TGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCAC
CCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
SEQ.I.D.NO：38
SGSGPSTALRELIEELVNIT
SEQ.I.D.NO：39
SGSGLRELIEELVNITQNQK
SEQ.I.D.NO：40
SGSGIEELVNITQNQKAPLC
SEQ.I.D.NO：41
SGSGVNITQNQKAPLCNGSM
SEQ.I.D.NO：42
SGSGQNQKAPLCNGSMVWSI
SEQ.I.D.NO：43
SGSGAPLCNGSMVWSINLTA
SEQ.I.D.NO：44
SGSGNGSMVWSINLTAGMYC
SEQ.I.D.NO：45
SGSGVWSINLTAGMYCAALE
SEQ.I.D.NO：46
SGSGNLTAGMYCAALESLIN
SEQ.I.D.NO：47
SGSGGMYCAALESLINVSGC
SEQ.I.D.NO：48
SGSGAALESLINVSGCSAIE
SEQ.I.D.NO：49
SGSGSLINVSGCSAIEKTQR
SEQ.I.D.NO：50
SGSGVSGCSAIEKTQRMLSG
SEQ.I.D.NO：51
SGSGSAIEKTQRMLSGFCPH
SEQ.I.D.NO：52
SGSGKTQRMLSGFCPHKVSA
SEQ.I.D.NO：53
SGSGMLSGFCPHKVSAGQFS
SEO.I.D.NO：54
SGSGFCPHKVSAGQFSSLHV
SEQ.I.D.NO：55
SGSGKVSAGQFSSLHVRDTK
SEQ.I.D.NO：56
SGSGGQFSSLHVRDTKIEVA
SEQ.I.D.NO：57
SGSGSLHVRDTKIEVAQFVK
SEQ.I.D.NO：58
SGSGRDTKIEVAQFVKDLLL
SEQ.I.D.NO：59
SGSGIEVAQFVKDLLLHLKK
SEQ.I.D.NO：60
SGSGQFVKDLLLHLKKLFRE
SEQ.I.D.NO：61
SGSGDLLLHLKKLFREGRFN
SEQ.I.D.NO：62
SGSGPSTALKELIEELVNIT
SEQ.I.D.NO：63
SGSGLKELIEELVNITQNQK
SEQ.I.D.NO：64
SGSGNGSMVWSINLTAGVYC
SEQ.I.D.NO：65
SGSGVWSINLTAGVYCAALE
SEQ.I.D.NO：66
SGSGNLTAGVYCAALESLIN
SEQ.I.D.NO：67
SGSGGVYCAALESLINVSGC
SEQ.I.D.NO：68
SGSGVSGCSAIEKTQRMLNG
SEQ.I.D.NO：69
SGSGSAIEKTQRMLNGFCPH
SEQ.I.D.NO：70
SGSGKTQRMLNGFCPHKVSA
SEQ.I.D.NO：71
SGSGMLNGFCPHKVSAGQFS
SEQ.I.D.NO：72
SGSGFCPHKVSAGQFSSLRV
SEQ.I.D.NO：73
SGSGKVSAGQFSSLRVRDTK
SEQ.I.D.NO：74
SGSGGQFSSLRVRDTKIEVA
SEQ.I.D.NO：75
SGSGSLRVRDTKIEVAQFVK
SEQ.I.D.NO：76
SGSGRDTKIEVAQFVKDLLV
SEQ.I.D.NO：77
SGSGIEVAQFVKDLLVHLKK
SEQ.I.D.NO：78
SGSGQFVKDLLVHLKKLFRE
SEQ.I.D.NO：79
SGSGDLLVHLKKLFREGQFN
SEQ.I.D.NO：80
QFVKDLLLHLKKLFRE
SEQ.I.D.NO：81
DLLLHLKKLFREGRFN
SEQ.I.D.NO：82
QFVKDLLVHLKKLFRE
SEQ.I.D.NO：83
DLLVHLKKLFREGQFN
SEQ.I.D.NO：84
DLLLHLKKLFRE
SEQ.I.D.NO：85
DLLVHLKKLFRE
SEQ.I.D.NO：86
GATGAAGCTTGCCACCATGAAATGCAGCTGGGTCATC
SEQ.I.D.NO：87
GATGGACTAGTGTTCCTTGACCCCAGTA
SEQ.I.D.NO：88
GATGAAGCTTGCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTG
SEQ.I.D.NO：89
GATGCGTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC
SEQ.I.D.NO：90
SPVPPSTALKELIEELVNITQNQKAPLCN
GSMVWSINLTAGVYCAALESLINVSGCSA
IEKTQRMLNGFCPHKVSAGQFSSLRVRDT
KIEVAQFVKDLLVHLKKLFREGQFN
SEQ.I.D.NO：91
AGCCCTGTGCCTCCCTCTACAGCCCTCAAGGAGCTCATTGAGGAGCTGGTCAACA
TCACCCAGAACCAGAAGGCCCCGCTCTGCAATGGCAGCATGGTGTGGAGCATCAA
CCTGACAGCTGGCGTGTACTGTGCAGCCCTGGAATCCCTGATCAACGTGTCAGGC
TGCAGTGCCATCGAGAAGACCCAGAGGATGCTGAACGGATTCTGCCCGCACAAGG
TCTCAGCTGGGCAGTTTTCCAGCTTGCGTGTCCGAGACACCAAAATCGAGGTGGC
CCAGTTTGTAAAGGACCTGCTCGTACATTTAAAGAAACTTTTTCGCGAGGGACAG
TTCAACTGA
SEQ.I.D.NO：92
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFYIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGTIDPAN
GNTKYVPKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSIYDDYHYDDYY
AMDYWGQGTLVTVSSG
SEQ.I.D.NO：93
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVHINGNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYK
ISDRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEADDVGIYYCFQGSHVPWTFGQGTKLE
IK
SEQ.I.D.NO：94
SGSGKDLLLHLKKLFREG
SEQ.I.D.NO：95
SGSGDLLLHLKKLFREG
SEQ.I.D.NO：96
SGSGLLLHLKKLFREG
SEQ.I.D.NO：97
SGSGLLHLKKLFREG
SEQ.I.D.NO：98
SGSGLHLKKLFREG
SEQ.I.D.NO：99
SGSGHLKKLFREG
SEQ.I.D.NO：100
SGSGLKKLFREG
SEQ.I.D.NO：101
SGSGKKLFREG
SEQ.I.D.NO：102
SGSGKLFREG
SEQ.I.D.NO：103
SGSGLFREG
SEQ.I.D.NO：104
SGSGFREG
SEQ.I.D.NO：105
SGSGKDLLLHLKKLFRE
SEQ.I.D.NO：106
SGSGKDLLLHLKKLFR
SEQ.I.D.NO：107
SGSGKDLLLHLKKLF
SEQ.I.D.NO：108
SGSGKDLLLHLKKL
SEQ.I.D.NO：109
SGSGKDLLLHLKK
SEQ.I.D.NO：110
SGSGKDLLLHLK
SEQ.I.D.NO：111
SGSGKDLLLHL
SEQ.I.D.NO：112
SGSGKDLLLH
SEQ.I.D.NO：113
SGSGKDLLL
SEQ.I.D.NO：114
SGSGKDLL
SEQ.I.D.NO：115
SGSGKDLLVHLKKLFREG
SEQ.I.D.NO：116
SGSGDLLVHLKKLFREG
SEQ.I.D.NO：117
SGSGLLVHLKKLFREG
SEQ.I.D.NO：118
SGSGLVHLKKLFREG
SEQ.I.D.NO：119
SGSGVHLKKLFREG
SEQ.I.D.NO：120
SGSGKDLLVHLKKLFRE
SEQ.I.D.NO：121
SGSGKDLLVHLKKLFR
SEQ.I.D.NO：122
SGSGKDLLVHLKKLF
SEQ.I.D.NO：123
SGSGKDLLVHLKKL
SEQ.I.D.NO：124
SGSGKDLLVHLKK
SEQ.I.D.NO：125
SGSGKDLLVHLK
SEQ.I.D.NO：126
SGSGKDLLVHL
SEQ.I.D.NO：127
SGSGKDLLVH
SEQ.I.D.NO：128
SGSGKDLLV
SEQ.I.D.NO：129
QFVKDLLLHLKKLFREGRFN
SEQ.I.D.NO：130
QFVKDLLLHAKKLFREGRFN
SEQ.I.D.NO：131
QFVKDLLLHLAKLFREGRFN
SEQ.I.D.NO：132
QFVKDLLLHLKALFREGRFN
SEQ.I.D.NO：133
QFVKDLLLHLKKAFREGRFN
SEQ.I.D.NO：134
QFVKDLLLHLKKLAREGRFN
SEQ.I.D.NO：135
QFVKDLLLHLKKLFAEGRFN
SEQ.I.D.NO：136
QFVKDLLLHLKKLFRAGRFN
Claims (73)
1.治疗用抗体或其抗原结合片段，其能特异性结合hIL-13并中和它的活性。
2.治疗用抗体或其抗原结合片段，其能特异性结合hIL-13并调制(例如抑制或阻断)hIL-13和hIL-13R之间的相互作用。
3.治疗用抗体或其抗原结合片段，其能特异性结合hIL-13并调制(例如抑制或阻断)hIL-13和hIL-13R之间的相互作用，并包含以下CDRH3：SEQ.I.D.NO：3。
4.治疗用抗体或其抗原结合片段，其能特异性结合hIL-13并调制hIL-13和hIL-13R之间的相互作用，所述抗体或其片段包含以下CDR：
CDRH1：SEQ.I.D.NO：1
CDRH2：SEQ.I.D.NO：2
CDRH3：SEQ.I.D.NO：3
CDRL1：SEQ.I.D.NO：4
CDRL2：SEQ.I.D.NO：5
CDRL3：SEQ.I.D.NQ：6
5.治疗用抗体或其抗原结合片段，其能特异性结合SEQ.I.D.NO：9的SEQ.I.D.NO：84所示的表位并调制hIL-13和hIL-13R之间的相互作用。
6.权利要求5的治疗用抗体或抗原结合片段，其中所述抗体结合到SEQ.I.D.NO：9的103至107位残基，包括103和107位残基。
7.权利要求6的治疗用抗体或抗原结合片段，其中所述抗体与hIL-13的结合取决于SEQ.I.D.NO：9的107位上精氨酸残基的存在。
8.权利要求7的治疗用抗体或抗原结合片段，其中与SEQ.I.D.NO：9的107位精氨酸残基不被丙氨酸取代时所述抗体和其抗原结合片段之间的结合相比，SEQ.I.D.NO：9的107位的精氨酸残基被丙氨酸取代导致所述抗体失去和hIL-13结合的能力。
9.上述任一权利要求的治疗用抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是完整抗体。
10.权利要求9的治疗用抗体或抗原结合片段，其中所述抗体来自大鼠、小鼠、灵长类(例如食蟹猴、旧大陆猴或者大猩猩)或人类。
11.权利要求1到8中任一项的治疗用抗体，其中所述抗体是人源化或嵌合的抗体。
12.权利要求9到11中任一项的抗体，其中所述抗体包含人恒定区。
13.权利要求12的抗体，其中所述抗体包含IgG同种型的恒定区。
14.权利要求13的抗体，其中所述抗体是IgG1或IgG4。
15.权利要求10的鼠抗体，所述抗体包含SEQ.I.D.NO：7的VH区和SEQ.I.D.NO：8的VL区。
16.权利要求11的人源化抗体，所述抗体包含SEQ.I.D.NO：11的VH区和SEQ.I.D.NO：15的VL区。
17.权利要求11的人源化抗体，所述抗体包含SEQ.I.D.NO：12的VH区和SEQ.I.D.NO：15的VL区。
18.权利要求11的人源化抗体，所述抗体包含SEQ.I.D.NO：13的VH区和SEQ.I.D.NO：15的VL区。
19.权利要求11的人源化抗体，所述抗体包含SEQ.I.D.NO：14的VH区和SEQ.I.D.NO：15的VL区。
20.权利要求11的人源化抗体，所述抗体包含SEQ.I.D.NO：11的VH区和SEQ.I.D.NO：16的VL区。
21.权利要求11的人源化抗体，所述抗体包含SEQ.I.D.NO：12的VH区和SEQ.I.D.NO：16的VL区。
22.权利要求11的人源化抗体，所述抗体包含SEQ.I.D.NO：13的VH区和SEQ.I.D.NO：16的VL区。
23.权利要求11的人源化抗体，所述抗体包含SEQ.I.D.NO：14的VH区和SEQ.I.D.NO：16的VL区。
24.权利要求16到23中任一项的人源化抗体，进一步包含IgG同种型的人恒定区(例如IgG1或IgG4)。
25.人源化抗体，其包含SEQ.I.D.NO：18的重链和SEQ.I.D.NO：22的轻链。
26.人源化抗体，其包含SEQ.I.D.NO：19的重链和SEQ.I.D.NO：22的轻链。
27.人源化抗体，其包含SEQ.I.D.NO：20的重链和SEQ.I.D.NO：22的轻链。
28.人源化抗体，其包含SEQ.I.D.NO：21的重链和SEQ.I.D.NO：22的轻链。
29.人源化抗体，其包含SEQ.I.D.NO：18的重链和SEQ.I.D.NO：23的轻链。
30.人源化抗体，其包含SEQ.I.D.NO：19的重链和SEQ.I.D.NO：23的轻链。
31.人源化抗体，其包含SEQ.I.D.NO：20的重链和SEQ.I.D.NO：23的轻链。
32.人源化抗体，其包含SEQ.I.D.NO：21的重链和SEQ.I.D.NO：23的轻链。
33.特异性结合hIL-13的人源化治疗用抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段包含CDRH3(SEQ.I.D.NO：3)，任选进一步包含SEQ.I.D.NO：1，2，4，5和6的CDR，其中选自人受体重链框架区的19，38，73和81位的残基，以及人受体轻链框架区的85位残基被CDRH3所来源的供体抗体框架区的对应残基取代。
34.特异性结合hIL-13的人源化治疗用抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段包含CDRH3(SEQ.I.D.NO：3)，任选进一步包含SEQ.I.D.NO：1，2，4，5和6的CDR，其中人重链框架区包含一个或多个(例如全部)以下残基(或其保守取代残基)
位点 残基
39 I
20 R
74 T
81 R
人轻链包含以下残基
位点 残基
85 V。
35.上述任一权利要求的抗原结合片段，其中所述片段是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、双抗体、三链抗体、四链抗体、微抗体、微体、分离的VH、分离的VL。
36.权利要求12到14中任一项的抗体，其包含突变的Fc区，使得所述抗体的ADCC和/或补体激活活性下降。
37.治疗用抗体，其竞争性抑制上述任一权利要求中的抗体与hIL-13的结合。
38.重组转化或转染的宿主细胞，该细胞包含第一载体和第二载体，其中所述第一载体包含编码上述任一权利要求所述抗体之重链的多核苷酸，所述第二载体包含编码上述任一权利要求所述轻链的多核苷酸。
39.权利要求38的宿主细胞，其中所述第一载体包含SEQ.I.D.NO：7的多核苷酸，所述第二载体包含SEQ.I.D.NO：8的多核苷酸。
40.权利要求38的宿主细胞，其中所述第一载体包含选自SEQ.I.D.NO：26，SEQ.I.D.NO：27，SEQ.I.D.NO：28，SEQ.I.D.NO：29，SEQ.I.D.NO：32，SEQ.I.D.NO：33，SEQ.I.D.NO：34，SEQ.I.D.NO：35的多核苷酸，所述第二载体包含选自SEQ.I.D.NO：15，SEQ.I.D.NO：16，SEQ.I.D.NO：36，SEQ.I.D.NO：37的多核苷酸。
41.权利要求38到40中任一项的宿主细胞，其中所述细胞是真核细胞。
42.权利要求41的宿主细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
43.权利要求41或42的宿主细胞，其中所述细胞是CHO或NS0。
44.制备权利要求1到37中任一项所述治疗用抗体的方法，该方法包括在无血清培养基中培养权利要求38到43中任一项所述宿主细胞的步骤。
45.权利要求44的方法，其中所述抗体被所述宿主细胞分泌到所述培养基中。
46.权利要求45的方法，其中相对于含有培养基的抗体，所述抗体被进一步纯化到至少95％或更高(例如98％或更高)。
47.药物组合物，所述组合物包含权利要求1到37中任一项所述治疗用抗体或其抗原结合片段，以及可药用载体。
48.包含权利要求47所述组合物和使用说明的试剂盒。
49.治疗患有哮喘的人类患者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的权利要求1到37中任一项所述治疗用抗体的步骤。
50.权利要求49的方法，其中所述患者患有过敏性哮喘。
51.权利要求49的方法，其中所述患者患有重症哮喘。
52.权利要求49的方法，其中所述患者患有难治型哮喘。
53.权利要求49的方法，其中所述患者患有不稳定型哮喘。
54.权利要求49的方法，其中所述患者患有夜发哮喘、经前期哮喘、类固醇抗性哮喘、类固醇依赖型哮喘、阿司匹林诱导型哮喘、成人哮喘、小儿哮喘。
55.治疗患有对皮质类固醇治疗无反应的哮喘疾病之人类患者的方法，所述方法包括给所述患者施用治疗有效量的权利要求1到37中任一项所述抗体或抗原结合片段的步骤。
56.预防人类患者急性哮喘病发作的方法，所述方法包括给所述患者施用治疗有效量的权利要求1到37的抗体的步骤。
57.降低人类患者急性哮喘病发作的频率和/或减弱发作后果的方法，所述方法包括给所述患者施用治疗有效量的权利要求1到37中任一项的抗体的步骤。
58.治疗人类患者的方法，所述患者患有选自以下的疾病或紊乱：特应性皮炎、过敏性鼻炎、节段性回肠炎、COPD、纤维变性疾病或紊乱比如特发性肺纤维化、进行性全身性硬化症、肝纤维化、肝肉芽瘤、血吸虫病、利什曼病、细胞周期调节性疾病比如何杰金病、B细胞慢性淋巴细胞白血病。
59.权利要求1到37任一项所述治疗用抗体或其抗原结合片段用于制备药物的用途，其中所述药物可以治疗选自以下的疾病或紊乱：过敏性哮喘、重症哮喘、难治型哮喘、不稳定型哮喘、夜发哮喘、经前期哮喘、类固醇抗性哮喘、类固醇依赖型哮喘、阿司匹林诱导型哮喘、成人哮喘、小儿哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎、节段性回肠炎、COPD、纤维变性疾病或紊乱比如特发性肺纤维化、进行性全身性硬化症、肝纤维化、肝肉芽瘤、血吸虫病、利什曼病、细胞周期调节性疾病比如何杰金病、B细胞慢性淋巴细胞白血病。
60.权利要求1到37中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体能抑制hIL-13和hIL-13R结合。
61.权利要求60的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体能阻断hIL-13和hIL-13R的结合。
62.治疗用抗体，该抗体能特异性结合hIL-13并调制(例如抑制或阻断)hIL-13和hIL-13R之间的相互作用，所述抗体能结合SEQ.I.D.NO：9的KKLFR表位。
63.治疗用抗体，该抗体能特异性结合hIL-13并调制(例如抑制或阻断)hIL-13和hIL-13R之间的相互作用，其解离常数koff在1.4×10-4到8.22×10-5s-1之间(例如用BiacoreTM测量得到)。
64.权利要求63的治疗用抗体，所述抗体包含SEQ.I.D.NO：3的CDRH3。
65.权利要求64的治疗用抗体，其进一步包含SEQ.I.D.NO：1的CDRH1、SEQ.I.D.NO：2的CDRH2、SEQ.I.D.NO：4的CDRL1，SEQ.I.D.NO：5的CDRL2以及SEQ.I.D.NO：6的CDRL3。
66.权利要求65的治疗用抗体，其中所述抗体是人源化抗体。
67.治疗人类患者的方法，所述患者患有选自以下的疾病或紊乱：过敏性哮喘、重症哮喘、难治型哮喘、不稳定型哮喘、夜发哮喘、经前期哮喘、类固醇抗性哮喘、类固醇依赖型哮喘、阿司匹林诱导型哮喘、成人哮喘、小儿哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎、节段性回肠炎、COPD、纤维变性疾病或紊乱比如特发性肺纤维化、进行性全身性硬化症、肝纤维化、肝肉芽瘤、血吸虫病、利什曼病、细胞周期调节性疾病比如何杰金病、B细胞慢性淋巴细胞白血病；该方法包括施用治疗有效量的权利要求1到37任一项所述抗体和治疗有效量的抗IL-4单克隆抗体。
68.权利要求67的方法，其中所述抗IL-4单克隆抗体与权利要求1到37中任一项所述抗体同时、顺序或分开给药。
69.权利要求67或68的方法，其中所述抗IL-4抗体是pascolizumab。
70.权利要求1到37中任一项所述抗体和抗IL-4单克隆抗体，比如pascolizumab用于制备药物的用途，其中所述药物可以治疗选自以下的疾病或紊乱：过敏性哮喘、重症哮喘、难治型哮喘、不稳定型哮喘、夜发哮喘、经前期哮喘、类固醇抗性哮喘、类固醇依赖型哮喘、阿司匹林诱导型哮喘、成人哮喘、小儿哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎、节段性回肠炎、COPD、纤维变性疾病或紊乱比如特发性肺纤维化、进行性全身性硬化症、肝纤维化、肝肉芽瘤、血吸虫病、利什曼病、细胞周期调节性疾病比如何杰金病、B细胞慢性淋巴细胞白血病。
71.权利要求1到37中任一项所述抗体和抗IL-4单克隆抗体，比如pascolizumab用于制备试剂盒的用途，该
试剂盒可以治疗选自以下的疾病或紊乱：过敏性哮喘、重症哮喘、难治型哮喘、不稳定型哮喘、夜发哮喘、经前期哮喘、类固醇抗性哮喘、类固醇依赖型哮喘、阿司匹林诱导型哮喘、成人哮喘、小儿哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎、节段性回肠炎、COPD、纤维变性疾病或紊乱比如特发性肺纤维化、进行性全身性硬化症、肝纤维化、肝肉芽瘤、血吸虫病、利什曼病、细胞周期调节性疾病比如何杰金病、B细胞慢性淋巴细胞白血病。
72.试剂盒，其包含含有权利要求1到37中任一项所述抗体和药物可接受载体的第一药物组合物，以及含有抗IL-4单克隆抗体，比如pascolizumab和药物可接受载体的第二药物组合物，任选还带有使用说明。
73.药物组合物，其包含权利要求1到37中任一项所述的第一抗体，第二抗体以及可药用载体，其中所述第二抗体是抗IL-4抗体，比如pascolizumab。
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