CN1585778A - 修饰的抗－TNFα抗体 - Google Patents

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M·贝克尔
F·J·卡尔
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Abstract

本发明涉及对人肿瘤坏死因子α(TNFα)反应性抗体进行修饰，从而导致当用于体内时与任何非修饰的亲代抗体相比基本无免疫原性或具低的免疫原性的抗－TNFα抗体。本发明也涉及包含亲代抗体V－区域中的T－细胞抗原决定部位的肽分子，该肽分子通过氨基酸改变进行修饰以减少或消除该T－细胞抗原决定部位。

Description

修饰的抗-TNFα抗体
发明领域
本发明涉及尤其是向人施用的且特别是用于治疗用途的多肽。该多肽是修饰的多肽，所述修饰导致该多肽当给予人被试者时具有减少的引起免疫反应的倾向。本发明具体地涉及对人肿瘤坏死因子α(TNFα)反应性抗体进行修饰，从而导致当用于体内时与任何非修饰的对应物相比基本无免疫原性或具低的免疫原性的抗-TNFα抗体。
发明背景
有许多关于治疗性蛋白质的功效受对该治疗性蛋白质有害的免疫反应限制的例子。几种小鼠单克隆抗体已显示出有希望用作许多人类疾病情形的治疗剂，但在某些情况下由于引起显著程度的人抗-鼠抗体(HAMA)反应而失败[Schroff，R.W.等人(1985)Cancer Res. 45：879-885；Shawler，D.L.等人(1985)J.Immunol. 135：1530-1535]。对于单克隆抗体已发展了许多技术来试图减少HAMA反应[WOA8909622；EPA0239400；EPA0438310；WOA9106667；EPA0699755]。这些重组DNA方法通常减少最终抗体构建体中小鼠的遗传信息，同时增加最终构建体中人的遗传信息。但是，在几种情况下，结果所得的“人源化”抗体仍然在患者中引起免疫反应[Issacs，J.D.(1990)Sem.Immunol. 2：449，456；Rebello，P.R.等人(1999)Transplantation 68：1417-1420]。
抗体不是唯一一类作为治疗剂给药而可产生免疫反应的多肽分子。即使人来源的且与人体内存在的蛋白质具有相同氨基酸序列的蛋白质也可诱导人体内免疫反应。显著的例子包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子[Wadhwa，M.等人(1999)Clin.Cancer Res. 5：1353-1361]和干扰素α2[Russo，D.等人(1996)Bri.J.Haem. 94：300-305；Stein，R.等人(1988)New Engl.J.Med. 318：1409-1413]等的治疗应用。
诱导免疫反应关键的是蛋白质中肽的存在，该肽可通过在II型MHC分子上呈递而刺激T-细胞的活性，即所谓的“T-细胞抗原决定部位”。这种T-细胞抗原决定部位通常定义为具有与II型MHC分子结合的能力的任何氨基酸残基序列。“T-细胞抗原决定部位”含蓄地指如下抗原决定部位，该抗原决定部位当与MHC分子结合时可由T细胞受体(TCR)识别，且至少在原则上可通过与TCR啮合导致这些T-细胞活化以促进T-细胞反应。
II型MHC分子是一组在辅助T-细胞的选择和活化中起重要作用的高度多态的蛋白质。人类DR类白细胞抗原(HLA-DR)是该组蛋白质的主要同种型，然而同种型HLA-DQ和HLA-DP也发挥相似的功能。本发明可应用于对呈递在DR、DP或DQII型MHC环境中的T-细胞抗原决定部位的检测。在人类群体中，每个个体携带2-4个DR等位基因、2个DQ和2个DP等位基因。许多DR分子的结构已得到了解析，这些结构显示为具有许多疏水口袋的开放式(open-ended)肽结合沟，该疏水口袋与肽的疏水残基(口袋残基)结合[Brown等人Nature(1993) 364：33；Stern等人(1994)Nature  368：215]。确定不同II型MHC分子同种异型的多态性造成了肽结合沟中多种多样的不同肽结合表面，且在群体水平上确保了能够最大的灵活度地识别外源蛋白质及对病原体生物产生免疫反应。
对治疗性蛋白质的免疫反应通过II型MHC肽呈递途径进行。在此，外源蛋白质被吞入并经加工以与DR、DQ或DP类的II型MHC分子结合进行呈递。II型MHC分子是由专业的抗原呈递细胞(APC)，如巨噬细胞和树突细胞等表达的。II型MHC肽复合物与T-细胞表面上关连T-细胞受体的结合，加上某些其他共同受体如CD4分子的交互结合可诱导T-细胞内的活化状态。该活化导致细胞因子的释放，从而进一步活化其他淋巴细胞如B细胞以产生抗体，或者活化T杀伤细胞而形成完全的细胞免疫反应。
T-细胞抗原决定部位的鉴定是抗原决定部位消除的第一步，然而在本领域中几乎没有清楚的案例将鉴定抗原决定部位和去除抗原决定部位整合在单个方案中。WO98/52976和WO00/34317讲授了鉴定多肽序列的计算穿线(computational threading approach)方法，该多肽序列具有与人II型MHC DR同种异型亚型结合的潜力。在这些讲授中，预测的T-细胞抗原决定部位通过在目的蛋白质中应用合理的氨基酸替代而去除。然而利用该方案和其他鉴定抗原决定部位的基于计算的程序[Godkin，A.J.等人(1998)J.Immunol. 161：850-858；Sturniolo，T.等人(1999)Nat.Biotechnol.17：555-561]，预测能够与II型MHC分子结合的肽可能并不会在所有情况下，特别是在体内(由于加工途径或其他现象)发挥T-细胞抗原决定部位的功能。此外，这些预测T-细胞抗原决定部位的计算方法通常不能够预测具有DP或DQ限制性的抗原决定部位。
除计算技术之外，存在测量合成的肽与II型MHC分子结合能力的体外方法。一种示例性的方法应用具有限定的MHC同种异型的B-细胞系作为II型MHC结合表面的来源，且可应用于II型MHC配体的鉴定中[Marshall K.W.等人(1994)J.Immunol. 152：4946-4956；O’Sullivan等人(1990)J.Immunol. 145：1799-1808；Robadey C.等人(1997)J.Immunol.159：3238-3246]。然而，这种技术不适用于筛选可针对广泛多样的MHC同种异型的多重潜在抗原决定部位，且它们也不能证实结合的肽能否发挥T-细胞抗原决定部位的功能。
最近采用重组MHC分子与合成的肽的可溶性复合物的技术已得到应用[Kern，F.等人(1998)Nature Medicine  4：975-978；Kwok，W.W.等人(2001)TRENDS in Immunol. 22：583-588]。这些试剂和方法可用于鉴定来自人或实验动物被试者的外周血液样品中是否存在能够结合特定的MHC-肽复合物的T-细胞克隆，但这些方法和试剂也不适用于筛选可针对广泛多样的MHC同种异型的多重潜在抗原决定部位。
T-细胞活化的生物学测定法可提供实际的选择方案，通过该方案可读出所检测的肽/蛋白质序列引起免疫反应的能力。该类方法的例子包括Petra等人的工作，该工作对细菌蛋白质葡萄球菌激酶应用T-细胞增殖测定，随后用合成的肽刺激T-细胞系以对抗原决定部位进行作图[Petra，A.M.等人(2002)J.Immunol. 168：155-161]。类似地，应用合成的破伤风毒素蛋白质的肽进行的T-细胞增殖测定导致对毒素中免疫优势抗原决定部位的确定[Reece J.C.等人(1993)J.Immunol. 151：6175-6184]。WO99/53038公开了所测试蛋白质的T-细胞抗原决定部位可用分离的人免疫细胞亚群进行确定的方法，其中细胞分离后，促进其在体外分化并在合成的目的肽存在时进行细胞培养，在培养的T-细胞中对任何诱导的增殖进行测量。相同技术也由Stickler等人[Stickler，M.M.等人(2000)J.Immunotherapy 23：654-660]描述，其中在两种情况下该方法应用于在细菌枯草杆菌蛋白酶中探测T-细胞抗原决定部位。这种技术需要仔细地应用细胞分离技术和利用多种细胞因子补充物进行细胞培养以便获得想要的免疫细胞亚群(树突细胞、CD4+和/或CD8+T-细胞)，且不利于应用多个供体样品的快速通量筛选。
如上所述，由此期望从给定的原则上有治疗价值但最初为免疫原性的肽、多肽或蛋白质中鉴定并去除或至少减少T-细胞抗原决定部位。这种治疗上有价值的分子之一是对肿瘤坏死因子α(TNFα)具有结合特异性的单克隆抗体。本发明优选的单克隆抗体是描述于美国专利号6,284,471中的抗体cA2的修饰形式。在此处将抗体cA2称为本发明的“亲代”抗体。
本发明的一个目的是提供对人TNFα具有结合特异性的亲代鼠源单克隆抗体的修饰形式，该修饰形式去除了一个或多个T细胞抗原决定部位。TNFα参与介导许多病理学状况，如Crohn氏病、类风湿关节炎和内毒素性或心血管性休克。本发明修饰的抗体预期可在这些病症和TNFα作为病理生理学的显著成分的其他疾病中具有治疗用途。
cA2抗体不是对TNFα具有结合特异性的唯一抗体。各种具有类似特异性的多克隆和单克隆抗体制品是本领域中公知的。例子包括公开于EP0212489、EP0218868、EP0288088和WO91/02078中的抗-TNFα制品。对重组人TNFα特异的啮齿动物或鼠类单克隆抗体的其它例子已描述于文献中[参见如Liang等人(1986)Biochem.Biophys.Res.Comm. 137：847-854；Meager等人(1987)，Hybridoma  6：305-311；Fendly等人(1987)，Hybridoma  6：359-369；Bringman等人(1987)，Hybridoma  6：489-507；Hirai等人(1987)J.Immunol.Meth. 96：57-62和Moller等人(1990)，Cytokine  2：162-169]。这些抗体的一些能够在体外中和TNFα的作用并已用于发展对TNFα的免疫测定或用于重组TNFα的纯化。通常，但与抗体cA2相反，这些抗体尚未被开发用于人体内实施诊断和治疗。
然而已用鼠抗-TNFα抗体在人被试者中进行了临床研究。在14个接受了单一剂量的鼠抗-TNFα抗体的严重脓毒性休克患者中，7个由于治疗性鼠抗体的免疫原性而对治疗物产生了人抗-鼠抗体反应。[Exley，A.R.等人(1990)，Lancet  335：1275-1277]。这种免疫原性可使得正在接受鼠抗-TNFα抗体的诊断或治疗的患者中的治疗无效。
在这点上，Adair等人[EP0927758]描述了重组抗体分子，该重组抗体分子包括具有人恒定区序列的抗体以及通过将互补决定区(CDR)移植在修饰的人抗体构架序列上形成的抗体。这种抗体和人源化抗体声称保持了对人TNFα□的特异性且可用于诊断和治疗中。
抗体cA2的临床应用由Le等人[US5,919,425]描述，Le等人详细描述了用cA2治疗TNFα介导的疾病的方法，该cA2事实上是命名为A2的最初鼠单克隆抗体的嵌合形式。类似地，Feldmen等人[US6,270,766]描述了相同抗体与重度骨髓抑制剂氨甲蝶呤的组合疗法在治疗关节炎和Crohn氏病中的应用。
目前用该抗体已进行了大量临床试验，该抗体得到了化合物名称“infliximab”，且在一些地区以REMICADE作为商品名销售。该抗体已被证明在类风湿关节炎和Crohn氏病的治疗中具有一定程度的治疗功效，并已在美国和欧洲得到用于Crohn氏病的管理批准。该抗体是用重组技术生产的，且如上文所提出的，该抗体是“嵌合的”，从而意味着抗体的恒定区由源自人恒定区基因的序列组成，因此减少了鼠源蛋白质序列的贡献。尽管如此，Crohn氏病治疗中高达13％的患者显示出对治疗性抗体的免疫反应[Mani R.N.等人(1998)Arthritis Rheum. 41：1552-1563；Elliot M.J.等人(1994)Lancet  344：1105-1110；Targan S.R.等人(1997)N.Engl.J.Med. 337：1029-1035；Present D.H.等人(1999)N. Engl.J.Med. 340：1398-1405]。
因此需要具有增强性质，尤其在蛋白质的生物学性质中有改善的抗-TNFα抗体类似物。在这一点上，非常期望的是提供在人被试者中不具有或具有减少的诱导免疫反应潜力的抗-TNFα抗体。这种蛋白质预期在人被试者中将显示增加的循环时间，且在慢性或复发性疾病情形中，如在许多抗-TNFα抗体适应症的情况中将是特别有利的。本发明提供了预期显示增强的体内性质的抗-TNFα抗体修饰形式。
本发明的一个特定的目的是提供修饰的抗-TNFα抗体，其中免疫特征通过减少潜在T-细胞抗原决定部位的数目而被修饰。
本发明公开了在抗-TNFα抗体重链和轻链可变区序列中鉴定的序列，该序列由于其II型MHC结合潜力而是潜在的T细胞抗原决定部位。
本发明进一步公开了在抗-TNFα抗体重链和轻链可变区中鉴定的序列，该序列由于在作为合成肽呈递给体外培养的人外周血单核细胞(PBMC)群体时能够诱导该PBMC细胞的增殖反应而是潜在的T细胞抗原决定部位。这些信息使得能够构建存在于该抗体可变区中的T-细胞抗原决定部位的图谱，且提供了从分子中去除T-细胞抗原决定部位所必需的关键信息。
尽管其他人已提供了包括嵌合[US，5,919,425]和人源化[EP0927758]形式的抗-TNFα抗体分子，但这些讲授内容中无一认识到T细胞抗原决定部位对蛋白质免疫原性性质的重要性，也无一设想到根据本发明方案以特定且有控制的方式直接影响该性质。
发明概述和描述
本发明提供了修饰的抗体，其中免疫特征通过减少或去除潜在T-细胞抗原决定部位的数目而被修饰。
本发明优选的鼠源非修饰的“亲代”单克隆抗体在此处指描述于美国专利No.6,284,471中的抗体cA2。
本发明公开了在cA2重链和轻链的可变区序列中鉴定的序列，该序列由于其II型MHC结合潜力而是潜在的T细胞抗原决定部位。
本发明进一步公开了在人体中具有免疫原性的抗体V-区序列的主要区域，从而提供了对该序列进行修饰以消除或减少这些位点的免疫原性效力所必需的关键信息。
在一方面，本发明提供了对单克隆抗体cA2所识别的抗原具有特异性的修饰的抗体分子，其中对该cA2抗体可变区中的一个或多个氨基酸进行替代以减少II型MHC对源自该区域的肽的识别。
在另一方面，本发明提供了在人体中具有减少的免疫原性潜力的变体单克隆抗体，该变体在cA2抗体V-区中包含一个或多个氨基酸替代以消除或减少该V-区域中可以作为II型MHC配体或能够刺激T-细胞的肽片段。
在本发明另一方面提供了在人体中具有减少的免疫原性潜力的变体单克隆抗体，该变体包含重链和轻链V-区的组合，所述组合包含选自Vh1/Vk1、Vh1/Vk5、Vh1/Vk8、Vh5/Vk12和Vh8/Vk5的氨基酸序列。
最优选的是提供特征在于具有V-区结构域Vh5/Vk12组合的抗体，但也可以考虑如上文所列的V-区成分的其他组合。
上文所列的Vh和Vk序列的序列完整地详细描述于下面分项概述及图8中，图8也给出了如在此处所用的SEQ ID No分配号。
因此，本发明提供了在人体中具有减少的免疫原性的修饰的抗-TNFα抗体，其中该修饰的抗体包含重链和轻链可变区氨基酸序列，所述序列选自SEQ ID No：1/SEQ ID No：5、SEQ ID No：1/SEQ ID No：7、SEQ IDNo：1/SEQ ID No：8、SEQ ID No：3/SEQ ID No：6和SEQ ID No：4/SEQID No：7，或者与上列每一个配对中的一个或两个氨基酸序列具有至少70％相似性的氨基酸组合。
根据本发明命名为SEQ ID 1-8的序列为：
SEQ ID No：1(＝Vh1)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAES
VKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID No：2(＝Vh3)
EVKLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAES
VKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID No：3(＝Vh5)
EVKLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAETRSKSTNSATHYAES
VKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID No：4(＝Vh8)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAETRSKSTNSATHYADS
VKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No：5(＝Vk1)
DIQLTQSPDTSSASPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESMSGVPSRFSGS
GSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWPFTFGSGTNVEVKR
SEQ ID No：6(＝Vk12)
DIQLTQSPDTSSASPGERASFSCRASQFVGSSIHWYQHTTNGSPRLLIKYASESMSGVPSRFSGS
GSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWPFTFGSGTNLEVKR
SEQ ID No：7(＝Vk5)
DIQLTQSPDTSSASPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESMSGVPSRFSGS
GSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWPFTFGGGTKVEIKR
SEQ ID No：8(＝Vk8)
DIQLTQSPDTSSASPGERASFSCRASQFVGSSIHWYQHTTNGSPRLLIKYASESMSGVPSRFSGS
GSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWPFTFGGGTKVEIKR
概括而言，本发明涉及下面的要点：
●在此处称为Vh1的单克隆抗体V-区重链，以单字母代码形式，其包含氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHY
AESVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTLTVSS；
●在此处称为Vh3的单克隆抗体V-区重链，以单字母代码形式，其包含氨基酸序列
EVKLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHY
AESVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTVTVSS；
●在此处称为Vh5的单克隆抗体V-区重链，以单字母代码形式，其包含氨基酸序列
EVKLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAETRSKSTNSATHY
AESVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTVTVSS；
●在此处称为Vh8的单克隆抗体V-区重链，以单字母代码形式，其包含氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAETRSKSTNSATHY
ADSVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTLVTVSS；
●在此处称为Vk1的单克隆抗体V-区轻链，以单字母代码形式，其包含氨基酸序列
DIQLTQSPDTSSASPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESMSGVPSRF
SGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWPFTFGSGTNVEVKR；
●在此处称为Vk12的单克隆抗体V-区轻链，以单字母代码形式，其包含氨基酸序列
DIQLTQSPDTSSASPGERASFSCRASQFVGSSIHWYQHTTNGSPRLLIKYASESMSGVPSRF
SGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWPFTFGSGTNLEVKR；
●在此处称为Vk5的单克隆抗体V-区轻链，以单字母代码形式，其包含氨基酸序列
DIQLTQSPDTSSASPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESMSGVPSRF
SGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWPFTFGGGTKVEIKR；
●在此处称为Vk8的单克隆抗体V-区轻链，以单字母代码形式，其包含氨基酸序列
DIQLTQSPDTSSASPGERASFSCRASQFVGSSIHWYQHTTNGSPRLLIKYASESMSGVPSRF
SGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSHSWPFTFGGGTKVEIKR；
●包含重链V-区序列Vh1和轻链序列Vk1的单克隆抗体；
●包含重链V-区序列Vh1和轻链序列Vk5的单克隆抗体；
●包含重链V-区序列Vh1和轻链序列Vk8的单克隆抗体；
●包含重链V-区序列Vh5和轻链序列Vk12的单克隆抗体；
●包含重链V-区序列Vh8和轻链序列Vk5的单克隆抗体；
●包含抗体cA2的氨基酸序列的单克隆抗体V-区重链，该序列经修饰含有一个或多个选自下组中替代：M18L、K19R、V23A、I28T、I51T、I56T、S79N、A80S、V81L、T86N、D87S、R89K、L116V，其中氨基酸是以单字母代码标识的且编号指当N-末端残基为第1位残基时用数字表示的氨基酸位置；
●包含抗体cA2的氨基酸序列的单克隆抗体V-区重链，该序列经修饰含有一个或多个选自下组中替代：K3Q、E5V、M18L、K19R、V23A、I28T、S79N、A80S、V81L、T86N、D87S、R89K、G94A，其中氨基酸是以单字母代码标识的且编号指当N-末端残基为第1位残基时用数字表示的氨基酸位置；
●包含抗体cA2的氨基酸序列的单克隆抗体V-区重链，该序列经修饰含有一个或多个选自替代M18L、K19R、V23A、I28T、S79N、A80S、V81L、T86N、D87S、R89K、L116V中的替代，其中氨基酸是以单字母代码标识的且编号指当N-末端残基为第1位残基时用数字表示的氨基酸位置；
●包含抗体cA2的氨基酸序列的单克隆抗体V-区重链，该序列经修饰含有一个或多个选自替代K3Q、E5V、M18L、K19R、V23A、I28T、I51T、I56T、E64D、S79N、A80S、V81L、T86N、D87S、R89K、G94A、T115L、L116V中的替代，其中氨基酸是以单字母代码标识的且编号指当N-末端残基为第1位残基时用数字表示的氨基酸位置；
●包含抗体cA2的氨基酸序列的单克隆抗体V-区轻链，该序列经修饰含有一个或多个选自替代L3Q、A9D、I10T、L11S、V13A、V19A、Q38H、R39T、I58V、S74T、T77S、V78L、S80A、I83A、D85T中的替代，其中氨基酸是以单字母代码标识的且编号指当N-末端残基为第1位残基时用数字表示的氨基酸位置；
●包含抗体cA2的氨基酸序列的单克隆抗体V-区轻链，该序列经修饰含有一个或多个选自替代L3Q、A9D、I10T、L11S、V13A、I58V、S74T、T77S、V78L、S80A、I83A、D85T、L104V中的替代，其中氨基酸是以单字母代码标识的且编号指当N-末端残基为第1位残基时用数字表示的氨基酸位置；
●包含抗体cA2的氨基酸序列的单克隆抗体V-区轻链，该序列经修饰含有一个或多个选自替代L3Q、A9D、I10T、L11S、V13A、I58V、S74T、T77S、V78L、S80A、I83A、D85T、S100G、N103K、L104V、V106I中的替代，其中氨基酸是以单字母代码标识别的且编号指当N-末端残基为第1位残基时用数字表示的氨基酸位置；
●包含抗体cA2的氨基酸序列的单克隆抗体V-区轻链，该序列经修饰含有一个或多个选自替代L3Q、A9D、I10T、L11S、V13A、Q38H、R39T、I58V、S74T、T77S、V78L、S80A、I83A、D85T、S100G、N103K、L104V、V106I中的替代，其中氨基酸是以单字母代码标识的且编号指当N-末端残基为第1位残基时用数字表示的氨基酸位置；
●据此修饰的额外包含人IgG1恒定区结构域和人κ恒定区结构域的抗体V-区；
●据此修饰的能够结合TNFα的抗体；
●据此修饰的能够对在体外致死浓度的TNFα中生长的WEHI164细胞提供保护作用的抗体；
●据此修饰的能够抑制体外人内皮细胞中TNFα刺激的ICAM-1产生的抗体；
●据此修饰的能够抑制体外人成纤维细胞中TNFα刺激的IL-6产生的抗体；
●据此修饰的包含一个或多个V-区结构域的抗体，在所述V区结构域中免疫原性区域已用T-细胞试验进行作图并然后进行了修饰，从而当在T-细胞试验中再次检验时，修饰的蛋白质比亲代(非修饰的)分子引起较小的刺激指数；
●具有单克隆抗体cA2的生物学活性且与非修饰的cA2相比基本无免疫原性或有低的免疫原性的修饰的抗体分子；
●当体内应用时与抗体cA2具有相同生物学活性的修饰的抗体分子；
●上文所述的抗体分子，其中该免疫原性的丧失是通过去除一个或多个源自最初非修饰分子的T-细胞抗原决定部位而实现的；
●上文所述的抗体分子，其中该免疫原性的丧失是通过减少能够结合源自该分子的肽的MHC同种异型的数目而实现的；
●上文所述的抗体分子，其中去除了一个T-细胞抗原决定部位；
●上文所述的抗体分子，其中所述最初存在的T-细胞抗原决定部位是II型MHC配体或肽序列，该配体或肽序列显示出通过在II型MHC上呈递而刺激或结合T-细胞的能力；
●上文所述的分子，其中所述肽序列选自图1中描述的组；
●上文所述的分子，其中在任何一个最初存在的T-细胞抗原决定部位中1-9个氨基酸残基，优选一个氨基酸残基被改变；
●上文所述的分子，其中氨基酸残基的改变是在特定位置上由其他氨基酸残基对最初存在的氨基酸残基的替代、添加或最初存在的氨基酸残基的缺失；
●上文所述的分子，其中如果必要，额外进行进一步改变——通常由特定氨基酸替代、添加或缺失来进行——以恢复该分子的生物学活性；
●上文所述的分子，其中改变是在如下连续残基链序列(A)-(H)之任何一个或全部的一个或多个残基上进行的，其中所述序列源自该分子的cA2抗体V-区序列结构域并应用单字母代码标识为；
A.＝GLVQPGGSMKLSCVAS；
B.＝WVAEIRSKSINSA；
C.＝SRDDSKSAVYLQMTDLRT
D.＝RNYYGSTYDYWGQGTTLTVSS
E.＝DILLTQSPAILSVSPGERVSF
F.＝HWYQQRTNGSPR
G.＝LIKYASESMSGIPS
H.＝DFTLSINTVESEDIADYYCQQ
●包含来自上述序列(A)-(H)中任何一个的至少9个连续残基的肽分子；
●与源自(A)-(H)的任何一个肽序列有超过90％的氨基酸一致性的上述肽分子；
●与源自(A)-(H)的任何一个肽序列有超过80％的氨基酸一致性的上述肽分子；
●含有与上述序列(A)-(H)中一个或多个相同或基本同源的序列元件的肽分子；
●能够结合II型MHC的上述肽序列；
●包含具有II型MHC结合活性的任一上述肽或修饰的肽的药物组合物；
●编码在上文和下文中限定的任何一个特定的修饰分子的DNA序列或分子；
●包含具有cA2的生物学活性的修饰分子的药物组合物；
●如上文和/或在权利要求中限定的药物组合物，任选地还包含药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂；
●一种制备如上文或下文限定的具有抗体cA2生物学活性的修饰分子的方法，该方法包括下面的步骤：(i)确定多肽或其部分的氨基酸序列；(ii)通过任何方法鉴定蛋白质氨基酸序列中的一个或多个潜在T-细胞抗原决定部位，该方法包括用体外或in silico技术或生物学测定法确定肽与MHC分子的结合；(iii)设计新的序列变体，该变体在鉴定的潜在T-细胞抗原决定部位中具有修饰的一个或多个氨基酸，从而如由体外或in silico技术或生物学测定法通过肽与MHC分子的结合所确定的，基本减少或消除这些T-细胞抗原决定部位的活性；(iv)用重组DNA技术构建这种序列变体并检验该变体以鉴定一个或多个具有期望性质的变体；和(v)可选择地重复步骤(ii)-(iv)；
●上文所述的方法，其中步骤(iii)是通过在任何一个最初存在的T-细胞抗原决定部位中替代、添加或缺失1-9个氨基酸残基而实施的；
●上文所述的方法，其中改变是参照同源蛋白质序列和/或in silico模建(modelling)技术而进行的；
●由上述13聚体T-细胞抗原决定部位肽中的至少9个连续氨基酸残基组成的肽序列及其在制备抗-TNFα抗体中的应用，该抗体当体内应用时与任何非修饰的分子相比基本无免疫原性或具有低的免疫原性，且具有抗-TNFα抗体的生物学活性。
提到“基本无免疫原性”或“减少的免疫原性潜力”包括与亲代抗体即非修饰的鼠源或嵌合单克隆抗体相比减少的免疫原性。术语“免疫原性”包括在宿主动物中引起、诱导或否则促进体液和/或T-细胞介导的反应的能力，特别是当该“宿主动物”是人时。
本发明修饰抗体的一个重要且显著的特征是它们保持了非修饰的或“亲代”抗体的功能活性。因此特别想要的是产生修饰的抗体，其显示了与亲代非修饰的抗体的治疗功效相关的所有有利技术特征。这与本发明的预期应用有关，即提供在许多人类重要疾病中具有治疗功效的组合物，该疾病尤其包括类风湿关节炎和Crohn氏病及TNFα介导的许多其他临床适应症。这种治疗法是本发明优选的实施方案。
因此，本发明修饰的抗体对其目标抗原显示出与单克隆抗体cA2所显示的亲和力相似的亲和力。该抗体识别TNFα而不是TNFα，且能够在一系列体外测定试验中中和TNFα活性。这种测定试验包括细胞毒性、细胞分裂发生、细胞因子诱导和粘着分子诱导。除中和TNFα的生物学活性之外，亲代分子的治疗功效被认为也由抗体诱导ADCC(依赖抗体的细胞介导的细胞毒性)的能力所介导，且可有效杀伤表达细胞表面结合形式的TNFα的细胞。ADCC现象是由完整抗体分子的恒定区结构域介导的，且本发明考虑到包含与ADCC诱导相容的恒定区结构域的完整抗体分子的生产。
关于证明TNFα中和活性的体外测定试验，许多这样的测定试验在此处作为实验例子描述，并提供了本发明优选抗体具有体外能力的证据。
“抗体”指能够与抗原组合、相互作用或结合的免疫球蛋白家族的蛋白质。术语“抗原”在此处用于指能够与抗体相互作用的物质，且在本发明的情况下指TNFα。本发明的TNFα是肿瘤坏死因子α(TNFα)，且最优选地为作为抗体cA2的抗原的人TNFα或任何TNFα。TNFα可为可溶性的TNFα或膜结合的TNFα。
术语“免疫球蛋白”在此处用于指由一种或多种基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、σ、ε和μ恒定区基因和实际上多个免疫球蛋白可变区基因。一个天然形式的免疫球蛋白是包含相同的两个配对的四聚体，其中每一个配对具有一条轻链和一条重链。在每一个配对中，重链和轻链可变区一起提供了能够与抗原相互作用的结合表面。术语Vh在此处用于指重链可变区，而术语Vk在此处用于指轻链可变区，且在本情况下与许多单克隆抗体共同的是该轻链是“kappa”(κ)类型的链。
如在此处所用的，Vh指长度约为110～125个氨基酸残基的多肽，其序列相应于任何一个在此处所述的Vh链，该Vh链与Vk组合能够结合人TNFα。类似地，Vk指长度约为95～130个氨基酸残基的多肽，其序列相应于任何一个在此处所述的Vk链，该Vk链与Vh组合能够结合人TNFα。全长的免疫球蛋白重链分子量为约50kDa，且在N-末端由Vh基因编码，而在C-末端由恒定区基因之一(如γ)编码。类似地，全长的免疫球蛋白轻链分子量为约25kDa，且在N-末端由V-区基因编码，而在C-末端由κ或λ恒定区基因编码。
除完整的抗体(四聚体)之外，免疫球蛋白可以以通过重组DNA技术或蛋白质生物化学衍生的许多其他形式存在。这些形式包括如Fv、Fab、Fab’和(Fab)2分子，且全部可含有本发明的Vh或Vk序列的任何一个。其它例子可包括“双特异性的”抗体，即包含本发明的Vh/Vk组合和具有不同抗原特异性的第二Vh/Vk组合。
术语“T-细胞抗原决定部位”根据本发明的理解指能够结合II型MHC、能够刺激T-细胞和/或也能够以和II型MHC复合的形式结合T-细胞(但不一定可测量地活化T细胞)的氨基酸序列。
如在此处和在所附权利要求中所用的，术语“肽”是包括两个或多个氨基酸的化合物。氨基酸是通过肽键(在下文中定义)连接在一起的。有20种不同的天然存在的氨基酸参与肽的生物学生产，且可以将任何数目的氨基酸以任何顺序连接而形成肽链或环。在肽的生物学生产中应用的天然存在的氨基酸均具有L-构型。合成的肽可采用常规的合成方法利用L-氨基酸、D-氨基酸或两种不同构型氨基酸的各种组合来制备。一些肽仅含有少数的氨基酸单位。短肽，如少于10个氨基酸单位的肽有时称为“寡肽”。其他肽含有大数目的氨基酸残基，如多达100个或更多，并称为“多肽”。按惯例，“多肽”可认为是含有3个或更多个氨基酸的肽链，而“寡肽”通常认为是特殊类型的“短”多肽。因而，如在此处所用的，可以理解的是只要提及到“多肽”也包括寡肽。进一步地，只要提及“肽”即包括多肽、寡肽和蛋白质。氨基酸的每一种不同排列形成了不同的多肽或蛋白质。可形成的多肽的数目及由此不同蛋白质的数目实际上是无限的。“α碳(Cα)”是肽链的碳-氢(CH)成分中的碳原子。“侧链”是Cα的侧基，该基团可包含简单或复杂的基团或部分，且具有与肽的大小相比可显著变化的物理大小。
本发明导致修饰的抗-TNFα抗体的一般方法包括以下步骤：
(a)确定多肽或其部分的氨基酸序列；
(b)通过任何方法鉴定蛋白质氨基酸序列中一个或多个潜在的T-细胞抗原决定部位，该方法包括用体外或in silico技术或生物学测定法确定肽与MHC分子的结合；
(c)设计新的序列变体，该变体在鉴定的潜在T-细胞抗原决定部位中具有修饰的一个或多个氨基酸，如通过体外或in silico技术或生物学测定法由肽与MHC分子的结合而确定的，所述修饰导致基本上减少或消除T-细胞抗原决定部位的活性。这种序列变体是以一定的方式生成的，从而避免由序列改变生成新的潜在T-细胞抗原决定部位，否则这种新的潜在T-细胞抗原决定部位又进行修饰以基本减少或消除此T-细胞抗原决定部位的活性。
(d)用重组DNA技术构建这种序列变体并检测该变体以鉴定一个或多个具有想要的性质的变体。
根据步骤(b)对潜在的T-细胞抗原决定部位的鉴定可根据本领域中以前描述的方法实施。适当的方法公开于WO98/59244；WO98/52976；WO00/34317中。
通过计算鉴定T-细胞抗原决定部位的其他非常有效的方法描述于实施例1中，该实施例是根据本发明的优选实施方案。已在抗-TNFα抗体的重链和轻链可变区序列上进行了该分析。
适合于探测T-细胞抗原决定部位的其它技术方法是生物学T-细胞测定法。这种分析方法描述于实施例2中并类似地是根据本发明的优选实施方案。因此，在此处具体化的优选生物学测定方法包括检测源自抗-TNFα抗体重链和轻链可变区序列的重叠肽，或者作为替代方案检测由V-区衍生的肽亚群，如根据实施例1所述方法通过计算衍生的全部或一些肽。对合成的肽检验其在体外培养的人T-细胞中引起增殖反应的能力。该增殖反应可通过任何方便的方法进行测量，但如在本发明实施方案中所利用的一种众所周知的方法应用3H-胸腺嘧啶掺入。该方法可用从健康供体中获取的幼稚人T-细胞来实施，且也可用于检验完整蛋白质分子以及合成的肽在体外的免疫原性。这种方案也已用于本发明的研究中(实施例11)来证明本发明优选的分子具有减少的免疫原性潜力。本发明人已确立在幼稚T-细胞测定试验的操作中，等于或大于2.0的刺激指数是对所诱导的增殖作用的有用量度。刺激指数常规地通过用在有检验的肽时测量到的增殖分数(例如如果应用3H-胸腺嘧啶掺入则为每分钟的计数)除以在不与检验的(多)肽接触的细胞中测量到的增殖分数而获得。
实际上，可产生许多抗-TNFα抗体变体并检验想要的免疫和功能特征。特别重要的是当对蛋白质序列进行改变时，该预期的变化不引入新的免疫原性抗原决定部位。这在实践中可以通过用任何适当的方法再次检验预期的序列是否存在抗原决定部位或II型MHC配体而避免。作为本发明进一步的实施方案的一种特定方法是应用体外免疫学回忆(recall)试验，该试验包括在致敏量的检验蛋白质(抗体)存在时培养PBMC制品并用相同的检验蛋白质或平行地用该蛋白质的修饰形式进行再次攻击。这种方案提供了在不进行全面的临床试验的情况下对修饰的蛋白质减少的免疫原性潜力方便的实践证明。对于大多数的目的，变体蛋白质可以通过重组DNA技术产生，但也可以考虑其他方法，包括化学合成。
在一个特别优选的实施方案中，本发明修饰的抗体是通过表达此处所述的Vh和Vk基因的不同组合而生成的。根据本发明最优选的组合包括组合Vh5/Vk12。也已产生了其他组合并检验了其在结合TNFα方面的功能活性，且这些组合包括Vh1/Vk1、Vh1/Vk5、Vh1/Vk8和Vh8/Vk5。重链和轻链的所有这种组合均包含于本发明中。
因此，本发明提供了在人体中具有减少的免疫原性的修饰的抗-TNFα抗体，其中该修饰的抗体包含选自SEQ ID No：1/SEQ ID No：5、SEQ IDNo：1/SEQ ID No：7、SEQ ID No：1/SEQ ID No：8、SEQ ID No：3/SEQID No：6和SEQ ID No：4/SEQ ID No：7，或者如下氨基酸的组合的重链和轻链可变区氨基酸序列，所述氨基酸组合与上列每一个配对中的一个或两个氨基酸序列具有至少70％的相似性。
本发明涉及抗-TNFα单克隆抗体，其中在分子V-区的位置上已进行了至少一个氨基酸残基的替代，结果导致一个或多个潜在的T-细胞抗原决定部位的活性被基本减小或一个或多个潜在的T-细胞抗原决定部位从蛋白质中被基本上消除。最优选地是提供修饰的抗体分子，在该分子中在亲代分子的大多数免疫原性区域中进行了氨基酸修饰(如替代)。本发明主要的优选实施方案包括修饰的抗体分子，其中对II型MHC配体中的任一个进行改变，从而消除与MHC的结合或减少肽可结合的MHC同种异型的数目。本发明人已发现并在此处公开了在人体中抗体cA2分子的免疫原性区域。可以理解的是在某些情况下那些在此处公开的序列之外的额外区域可变为具有免疫原性的抗原决定部位，例如用表达与本发明的序列具有类似序列的蛋白质或肽的病原体感染的情况。无论如何，对于序列元件而言，充当II型MHC配体将是关键的，因此原则上在图1中公开的任何序列均可认为是在本发明的范围内的具有免疫原性的抗原决定部位。
为了消除T-细胞抗原决定部位，氨基酸替代是在肽序列中预期可实现T-细胞抗原决定部位活性的基本减少或消除的适当位点上进行的。在实践中，适当的位点优选等同于可以在II型MHC结合沟所提供的一个口袋中结合的氨基酸残基。
最优选地是改变肽在所谓的肽P1或P1锚定位置处与裂缝的第一个口袋的结合。在肽的P1锚定残基和II型MHC结合沟的第一个口袋之间的结合相互作用质量被公认为是完整肽的总结合亲和力的主要决定因素。在肽的该位置中的适当替代可为替代为较不易于容纳于口袋中的残基，如替代为更亲水的残基。肽中对应于与MHC结合裂缝其他口袋区域结合的位置的氨基酸残基也可以加以考虑并且属于本发明的范围内。
可以理解的是在给定的潜在T细胞抗原决定部位中单个氨基酸替代是最优选的消除抗原决定部位的途径。在单个抗原决定部位中也可以考虑进行组合替代，例如当单独限定的抗原决定部位相互重叠时组合替代可能是特别适当的。此外，可以在就II型MHC结合沟而言非“口袋残基”的位置，在肽序列中任何位点处进行氨基酸替代，该氨基酸替代可以是于给定的抗原决定部位中的单个替代或于单个抗原决定部位中的组合替代。所有这种替代均在本发明的范围内。
在本发明涉及修饰的抗-TNFα抗体的情况下，应该认为含有这种修饰抗体或修饰抗体的片段的组合物和相关组合物也在本发明的范围内。因此本发明考虑到应用和生成抗体片段，包括如Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2片段。这种片段可用标准方法制备[如Coligan等人(Current Protocols inImmunology，John Wiley & Sons 1991-1997)。本发明也考虑到本领域中众所周知的各种抗体衍生分子的重组形式。这种抗体衍生分子包括稳定化的Fv片段，该片段包括包含连接Vh和Vl构域的肽连接体的单链Fv形式(如scFv)，或者通过链间二硫键稳定化的Fv(dsFv)(其含有经加工有利于Vh和V1结构域连接的额外半胱氨酸残基)。同样地，其他组合物亦是本领域中熟悉的，且可包括称为“小体(minibodies)”的分子和单个可变结构域“dAb”。其他的分子还可以加入用于增加修饰抗体V-区结构域的效价的手段，即通过如对二聚化结构域(如“亮氨酸拉链”)进行加工或利用化学修饰策略得到的具有多个抗原结合位点的分子。
在另一方面，本发明涉及编码修饰的抗-TNFα抗体实体的核酸。
在再一方面，本发明涉及用修饰的抗-TNFα抗体对人进行治疗的方法。
本发明现在将由下面的实施例进行阐明，但不受其限制。该实施例涉及下面的附图：
图1提供了源自抗-TNFα抗体cA2的V-区结构域的肽序列表，所述序列具有潜在的人II型MHC结合活性。图1A涉及重链来源的序列。图1B涉及轻链来源的序列。
图2提供了证明用本发明的抗-TNFα抗体(Vh5/Vk12)可以对TNFα诱导的体外WEHI细胞杀伤进行中和的图。
图3提供的图证明了用本发明的抗-TNFα抗体(Vh5/Vk12)可以对TNFα刺激的体外人脐静脉内皮细胞中ICAM-1的表达产生进行中和。
图4提供了证明本发明的抗-TNFα抗体(Vh5/Vk12)能够在体外测定中与阳性对照抗体(infliximab)竞争结合TNFα的图。
图5提供了一组柱形图，这些图所映了在体外幼稚T-细胞增殖测定中针对合成的肽的增殖反应。该数据涉及由来自单个供体#4的PBMC记录的反应，并相应于肽CA1-CA75的每一个的1μM和5μM浓度给出。每一个图用刺激指数(SI)相对于肽标识码绘图。SI＝CPM检验肽/CPM未处理的对照。肽序列和方法详细描述于实施例2中。
图6提供了体外幼稚T-细胞增殖测定中针对13-聚体肽P1-P15的每一个所记录的增殖反应。A图描述了来自供体#2的PBMC中的反应；B图描述了来自供体#4的PBMC中的反应。结果相应于1μM和5μM浓度的给定肽来显示。对于两图，SI＞2.0的反应表示为正的(+)而SI＜2.0的结果表示为负的(-)。
图7显示平板ELISA的结果，其中TNFα是由本发明修饰的抗体(Vh5/Vk12)探测的。结合曲线是抗体浓度相对492nm的光密度(OD492)所绘制的图。
图8提供了本发明抗-TNFα抗体的修饰的可变区结构域的氨基酸序列，序列以单字母代码表示。
图9提供了证明用本发明的抗-TNFα抗体(Vh5/Vk12)可以对TNFα刺激的体外人HS27成纤维细胞中IL-6的表达产生进行中和的图。阴性对照(210G12)是非-TNFα结合抗体且阳性对照(infliximab)是TNFα中和抗体。
图10提供的图描述了应用幼稚人PBMC的免疫原性测定试验的结果，该人PBMC是在不同浓度的修饰抗体(Vh5/Vk12)或免疫原性亲代抗体(infliximab)存在时培养的。该图显示从反应性供体PBMC(A图)和非反应性供体PBMC(B图)获得的结果。SI＝刺激指数。
实施例1
用计算方法鉴定抗-TNFαVH和VL蛋白质序列中潜在的II型MHC配体。
分析具有充当II型MHC结合配体的潜力的肽序列的方案已在以前进行了详细描述[WO02/069232]。已开发了应用该程序的软件工具并将其应用于抗-TNFα抗体V-区结构域的分析中。简言之，该软件由多个元件建成，这些元件包括II型MHC分子模型文库——该文库形成以覆盖在人类群体中现存的大量同种异型变体；肽主链结构文库——该文库形成以包含理论的和已知的主链构象。利用这些元件，基于使每一个主链构象停靠(docking)在每一个MHC同种异型模型结合沟中的结果而生成一个大的数据集。该数据集也包括在给定位置上所有可能氨基酸的最佳侧链构象。肽侧链(在最佳构象中)和MHC蛋白质之间的原子间距离贮存于该数据集中。来自目标蛋白质的待检验的肽是按如下进行分析的：将其侧链序列添加到所有主链上，然后检索数据集得到最佳侧链构象，由此计算针对每一个主链的“肽分数”。选择最好的分数用于展示，并使该过程针对每一个可用的MHC模型结构进行重复。该算法已应用于分析抗-TNFα抗体cA2的V-区结构域。该分析鉴定了多个13聚体肽序列，这些序列经预测是一种或多种同种异型MHCII分子的配体，因而是潜在的T-细胞抗原决定部位。这些肽显示于图1A(重链来源的肽)和1B(轻链来源的肽)中。
实施例2
体外增殖测定中用合成的肽和幼稚人PBMC对T-细胞抗原决定部位的鉴定。
MHC、肽和T-细胞受体(TCR)之间的相互作用为T-细胞识别的抗原特异性提供了结构基础。T-细胞增殖试验检验肽与MHC的结合和TCR对MHC/肽复合物的识别。本实施例的体外T-细胞增殖测定涉及对外周血单核细胞(PBMC)的刺激，该外周血单核细胞含有抗原呈递细胞(APC)和T-细胞。刺激是在体外用合成的肽抗原进行的，且在一些实验中是用完整的蛋白质抗原进行的。刺激的T-细胞增殖是用3H-胸腺嘧啶(3H-Thy)测量的，其中掺入的3H-Thy通过对洗涤后的固定细胞进行闪烁计数来估计。
表1：合成的肽
         重链肽           轻链肽
   肽#     肽序列     肽#     肽序列
   CA1   EVKLEESGGGLVQPG     CA41     DILLTQSPAILSVSP
   CA2   LEESGGGLVQPGGSM     CA42     LTQSPAILSVSPGER
   CA3   SGGGLVQPGGSMKLS     CA43     SPAILSVSPGERVSF
   CA4   GLVQPGGSMKLSCVA     CA44     ILSVSPGERVSFSCR
   CA5   QPGGSMKLSCVASGF     CA45     VSPGERVSFSCRASQ
   CA6   GSMKLSCVASGFIFS     CA46     GERVSFSCRASQFVG
   CA7   KLSCVASGFIFSNHW     CA47     VSFSCRASQFVGSSI
   CA8   CVASGFIFSNHWMNW     CA48     SCRASQFVGSSIHWY
   CA9   SGFIFSNHWMNWVRQ     CA49     ASQFVGSSIHWYQQR
   CA10   IFSNHWMNWVRQSPE     CA50     FVGSSIHWYQQRTNG
   CA11   NHWMNWVRQSPEKGL     CA51     SSIHWYQQRTNGSPR
   CA12   MNWVRQSPEKGLEWV     CA52     HWYQQRTNGSPRLLI
   CA13   VRQSPEKGLEWVAEI     CA53     QQRTNGSPRLLIKYA
   CA14   SPEKGLEWVAEIRSK     CA54     TNGSPRLLIKYASES
   CA15   KGLEWVAEIRSKSIN     CA55     SPRLLIKYASESMSG
   CA16   EWVAEIRSKSINSAT     CA56     LLIKYASESMSGIPS
   CA17   AEIRSKSINSATHYA     CA57     KYASESMSGIPSRFS
   CA18   RSKSINSATHYAESV     CA58     SESMSGIPSRFSGSG
   CA19   SINSATHYAESVKGR     CA59     MSGIPSRFSGSGSGT
   CA20   SATHYAESVKGRFTI     CA60     IPSRFSGSGSGTDFT
   CA21   HYAESVKGRFTISRD     CA61     RFSGSGSGTDFTLSI
   CA22   ESVKGRFTISRDDSK     CA62     GSGSGTDFTLSINTV
   CA23   KGRFTISRDDSKSAV     CA63     SGTDFTLSINTVESE
   CA24   FTISRDDSKSAVYLQ     CA64     DFTLSINTVESEDIA
   CA25   SRDDSKSAVYLQMTD     CA65     LSINTVESEDIADYY
   CA26   DSKSAVYLQMTDLRT     CA66     NTVESEDIADYYCQQ
   CA27   SAVYLQMTDLRTEDT     CA67     ESEDIADYYCQQSHS
   CA28   YLQMTDLRTEDTGVY     CA68     DIADYYCQQSHSWPF
   CA29   MTDLRTEDTGVYYCS     CA69     DYYCQQSHSWPFTFG
   CA30   LRTEDTGVYYCSRNY     CA70     CQQSHSWPFTFGSGT
   CA31   EDTGVYYCSRNYYGS     CA71     SHSWPFTFGSGTNLE
   CA32   GVYYCSRNYYGSTYD    CA72     WPFTFGSGTNLEVKR
   CA33   YCSRNYYGSTYDYWG    CA73     TFGSGTNLEVKRTVA
   CA34   RNYYGSTYDYWGQGT    CA74     SGTNLEVKRTVAAPS
   CA35   YGSTYDYWGQGTTLT    CA75     NLEVKRTVAAPSVFI
   CA36   TYDYWGQGTTLTVSS
   CA37   YWGQGTTLTVSSAST
   CA38   QGTTLTVSSASTKGP
   CA39   TLTVSSASTKGPSVF
   CA40   VSSASTKGPSVFPLA
来自贮存少于12小时的人血液的白细胞层从国家血液服务部门(National Blood Service)(Addenbrooks Hospital，Cambridge，英国)获得。Ficoll-paque从Amersham Pharmacia Biotech(Amersham，英国)获得。无血清AIM V培养基从Gibco-BRL(Paisley，英国)获得，该培养基用于原代人淋巴细胞的培养并含有L-谷氨酰胺、50μg/ml链霉素、10μg/ml gentomycin和0.1％的人血清清蛋白。合成的肽从Eurosequence(Groningen，荷兰)和Babraham Technix(Cambridge，英国)获得。红细胞和白细胞是通过对白细胞层的轻轻离心而从血浆和血小板中分离的。移走并丢弃上层相(含有血浆和血小板)。使红细胞和白细胞在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中进行1∶1的稀释，然后铺在15ml ficoll-paque(Amersham Pharmacia，Amersham英国)上。根据制造商建议的条件进行离心，并从血清+PBS/ficoll paque界面收获PBMC。使PBMC与PBS混合(1∶1)并通过离心收集。移走并丢弃上清液，且将PBMC沉淀重悬于50ml PBS中。再次通过离心使细胞沉淀，并丢弃PBS上清液。将细胞用50ml AIM V培养基重悬，并在此时进行细胞计数并用锥虫蓝染料排除法进行生存力的估计。再次通过离心收集细胞并丢弃上清液。将细胞重悬并以每ml 3×107的密度进行低温贮存。贮存培养基是90％(v/v)热失活的AB人血清(Sigma，Poole，英国)和10％(v/v)DMSO(Sigma，Poole，英国)。将细胞转移到有调控的冷冻容器(Sigma)中并于-70℃放置过夜。当需要使用时，将细胞在转移到10ml预热的AIM V培养基中之前于37℃水浴中快速解冻。
PBMC是以每孔2×105个PBMC的密度在96孔的平底平板上用蛋白质和肽抗原刺激的。在用3H-Thy(Amersham-Pharmacia，Amersham英国)进行脉冲之前，使PBMC于37℃温育7日。对于本研究，制备了横跨抗体cA2的重链和轻链的完整V-区结构域的合成的肽(15聚体)。每一个肽与邻接的下一个肽在序列上重叠12个残基，即每一个肽从相继的下一个肽起增加3个残基。肽序列和标识号显示于表1中。每一个肽都单独地针对从20个供体中分离的幼稚PBMC进行筛选。在每一个供体测定试验中都应用两个对照肽C32(PKYVKQNTLKLAT)和C49(KVVDQIKKISKPVQH)(该对照肽先前已证明具有免疫原性)和有效的非回忆性抗原KLH。将肽在DMSO中溶解至10mM的终浓度，然后将这些贮存液在AIM V培养基中1/500稀释(终浓度20μM)。将肽添加到平底的96孔板上以得到100μl中2和10μM的终浓度。解冻的PBMC的生存力是通过锥虫蓝染料排除法进行估计的，然后将细胞以2×106个细胞/ml的密度进行重悬，并将100μl(2×105个PBMC/孔)转移到含有肽的每一个孔中。在每一个肽浓度重复对三个孔的细胞培养物进行测定。将平板在5％CO2的潮湿空气中于37℃温育7日。在滤器垫上收获细胞之前用每孔1μCi的3H-胸腺嘧啶对细胞脉冲18-21小时。CPM值是用Wallac小平板β顶部平板计数器(Wallac microplate beta top plate counter)(Perkin Elmer)测定的。结果表示为刺激指数(SI)，其中SI＝CPM检验的肽/CPM未处理的对照。
用幼稚T细胞增殖测定试验对cA2V-区序列中的T细胞抗原决定部位作图，导致对几个免疫原性区域的鉴定。在各供体中具有显著的刺激指数的肽包括如CA34(SI＝2.22)和CA52(SI＝2.09)等。
利用另一具有15个不同的13-聚体肽(P1-P15)的亚群对该图谱在围绕Vh和Vk序列的互补决定区(CDR)的序列区域中进行了精细化，该13-聚体肽具有如下序列：
    P1＝KGLEWVAEIRSKS
    P2＝EWVAEIRSKSINS
    P3＝AEIRSKSINSATH
    P4＝KSINSATHYAESV
    P5＝TGVYYCSRNYYGS
    P6＝STYDYWGQGTTLT
    P7＝SQFVGSSIHWYQQ
    P8＝QFVGSSIHWYQQR
    P9＝SSIHWYQQRTNGS
    P10＝HWYQQRTNGSPRL
    P11＝PRLLIKYASESMS
    P12＝RLLIKYASESMSG
    P13＝LLIKYASESMSGI
    P14＝IKYASESMSGIPS
    P15＝ESMSGIPSRFSGS
肽P1-P7源自Vh链序列，而肽P8-P15源自Vk链序列。在如前文一样包括多种不同MHC同种异型的另一组10个幼稚PBMC制品中筛选肽P1-P15以获得能体外引起增殖反应的肽。从合成肽和供体组这两个集合得到的幼稚T-细胞增殖测定结果可以综合在一起产生抗体Vh和Vk链的抗原决定部位图谱。通常，在编缉这样的图谱时，将SI＞1.95认为是正反应。显示所有15-聚体肽对一个反应性供体的SI的代表性柱形图在附图5中给出。13-聚体肽P1-P15的示例性结果在图6中给出。
实施例3
抗-TNFα抗体Vh和Vk基因的构建
抗体的序列源自美国专利5,656,272。可变结构域重链(Vh)和可变结构域轻链(Vk)基因是通过基因合成制备的。简言之，设计并合成了一组合成的寡核苷酸。基因是用连接酶链反应(LCR)组装的，其中使具有互补末端特征的寡核苷酸能够退火，随后用聚合酶链反应(PCR)进行扩增和补平。该PCR是通过添加增加浓度的侧翼寡核苷酸以充当引物而驱动的。通过进一步从载体进行PCR而将该PCR产物组装为全长抗体基因，其中该载体含有免疫球蛋白基因的5’和3’侧翼区域，并将该全长抗体基因亚克隆入表达载体中以表达完整的抗体。该组装的Vh和Vk基因可充当模板来诱变和构建多个去除了T-细胞抗原决定部位的变体抗体序列。
为了组装Vh基因，应用在表2中详述的寡核苷酸OL373-OL391。为了组装Vk基因，应用在表3中详述的寡核苷酸OL392-OL410。对于该两个基因，通过使20μl磷酸化的寡核苷酸与1μl Pfu DNA连接酶(Stratagene，Amsterdam，荷兰)、10μl 10×反应缓冲液(与酶一起提供)和69μl水混合而进行LCR。将反应混合物置于热循环仪上，于95℃温育2分钟，随后于95℃进行30秒、接着逐渐冷却到60℃、然后于60℃温育20分钟、这3个步骤重复25个循环，最后于60℃温育3小时。一般地，用2％琼脂糖凝胶电泳对LCR样品分析，得到成片的电泳条带，其中具有刚刚可以看到的正确大小的模糊条带。在所有情形中的寡核苷酸均购自MWG-Biotech(Ebersberg，德国)，并在体外用T4 DNA激酶(Roche，Lewes，英国)和厂商建议的规程进行磷酸化。在LCR后，将5μL反应物转移到PCR混合物中以扩增组装的片段。将寡核苷酸OL373和OL382用于驱动Vh反应，而将寡核苷酸OL392和OL401用于驱动Vk反应。PCR在50μl总体积中用Taq DNA聚合酶(Roche，Lewes，英国)进行15个循环。将反应物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，获取想要的条带并用Qiagen(Crawley，英国)DNA提取试剂盒进行纯化。将产物直接克隆入pGemT-easy载体(Promega，Southampton，英国)中以进行序列分析。对7个克隆进行了测序直到获得了正确的克隆。含有如上所述制备的可变区盒的全长免疫球蛋白基因用重叠PCR进行组装。简言之，将载体M13-VHPCR1和M13-VKPCR1的DNA[Orlandi等人(1989)，PNAS，89：3833-7]用作模板以分别针对Vh和Vk链产生另两个重叠的PCR片段，该PCR片段包括具有鼠重链免疫球蛋白启动子且编码前导信号肽的5’侧翼序列和包含剪接位点和内含子序列的3’侧翼序列。将针对Vh和Vk分别由此产生的DNA片段用侧翼引物在PCR中组合在一起，该侧翼引物是获得全长DNA序列所必需的。用于这些“连接”反应中的引物对对于Vh基因为寡核苷酸OL411/OL413和OL414/OL415，而对于Vk基因，应用了寡核苷酸OL411/OL412和OL411/OL401。
将末端具有5’和3’侧翼序列的此重链基因克隆入表达载体pSV gpt[Reichmann等人(1988)Nature， 332：323]中，该载体包括人IgG1恒定区结构域[Takahashi等人(1982)Cell， 29：671]和用于在哺乳动物细胞中进行选择的 gpt基因。将末端具有5’和3’侧翼序列的此轻链基因克隆入表达载体pSV hyg[Reichmann等人，见上引文]中，在该载体中 gpt基因由潮霉素抗性基因( hyg)替代且包括人κ恒定区结构域[Heiter等人(1980)Cell， 22：197]。对于两个载体，将完全组装的Vh和Vk基因以通过凝胶电泳纯化的HindIII/BamHI片段进行亚克隆，并用众所周知的程序和试剂系统进行处理。
表2：对于Vh的合成的寡核苷酸
名称OL373OL374OL375OL376OL377OL378OL379OL380OL381OL382OL383OL384OL385OL386OL387OL388OL389OL390OL391OL413OL414OL415 序列GAAGTGAAGCTGGAGGAGTCTGGAGGCGGCTTGGTGCAACCTGGAGGCTCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCATTTTCAGTAACCACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATCAAAATCGATTAATTCTGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTGCTGTGTACCTGCAAATGACCGACCTGAGAACTGAAGACACTGGCGTTTATTACTGTTCCAGGAATTACTACGGTAGTACCTACGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTGTCCTCAGGCCTGAGGACACTGTGAGAGTGGTGCCTTGGCCCCAGTAGTCGTAGGTACTACCGTAGTAATTCCTGGAACAGTAATAAACGCCAGTGTCTTCAGTTCTCAGGTCGGTCATTTGCAGGTACACAGCACTTTTGGAATCATCTCTTGAGATGGTGAACCTCCCTTTCACAGACTCCGCATAATGTGTTGCAGAATTAATCGATTTTGATCTAATTTCAGCAACCCACTCAAGCCCCTTCTCTGGAGACTGGCGGACCCAGTTCATCCAGTGGTTACTGAAAATGAATCCAGAGGCAACACAGGAGAGTTTCATGGAGCCTCCAGGTTGCACCAAGCCGCCTCCAGACTCCTCCAGCTTCACTTCAGACTCCTCCAGCTTCACTTCGGAGTGGACACCTGTGGAGAGACCACTCTCACAGTGTCCTCAGGTGAGTCCTTACAACCTCTCTTGGGATCCTATAAATCTCTGGCC 长度40404040404040404222404040404040404020424224
表3：对于Vk的合成的寡核苷酸
名称OL3920L393OL394OL395OL396OL397OL398OL399OL400OL401OL402OL403OL404OL405OL406OL407OL408OL409OL410OL411OL412 序列GACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGCCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGTTCGTTGGCTCAAGCATCCACTGGTATCAGCAAAGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATGCTTCTGAGTCTATGTCTGGCATCCCTTCTAGATTTAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTAGCATCAACACTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTACTGTCAACAAAGTCATAGCTGGCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAATTTGGAAGTAAAACGTGAGTAGAATTTAAACTTTGCTTCCTCAGTTGGATCCTGGCAGAGTCGACTCTGCCAGGATCCAACTGAGGAAGCAAAGTTTAAATTCTACTCACGTTTTACITCCAAATTTGTCCCCGAGCCGAACGTGAATGGCCAGCTATGACTTTGTTGACAGTAATAATCTGCAATATCTTCAGACTCCACAGTGTTGATGCTAAGAGTAAAATCTGTCCCTGATCCACTGCCACTAAATCTAGAAGGGATGCCAGACATAGACTCAGAAGCATACTTTATGAGAAGCCTTGGAGAACCATTTGTTCTTTGCTGATACCAGTGGATGCTTGAGCCAACGAACTGACTGGCCCTGCAGGAGAAACTGACTCTTTCTCCTGGACTCACAGACAGGATGGCTGGAGACTGAGTCAGCAAGATGTCTTACGCCAAGCTTATGAATATGCAAATCCAGACTGAGTCAGCAAGATGTCGGAGTGGACACCTGTGGAGAG 长度404040404040404050304040404040404040202942
实施例4
修饰的抗体Vh和Vk基因的构建
称为Vk1的修饰的Vk基因是通过基因合成构建的，该基因含有突变L3Q、A9D、I10T、L11S、V13A、I58V、S74T、T77S、V78L、S80A、I83A、D85T和L104V。表4列出了用于组装Vk1的寡核苷酸。这些寡核苷酸与OL393、OL394、OL395、OL400、OL401、OL403、OL405、OL407和OL408(参见上述实施例3)一起用于如前文所述的基因合成反应中。将该基因克隆入pGEM-T easy载体(Promega)中并将几个克隆进行测序直到获得了正确的克隆。全长免疫球蛋白基因的组装和在表达载体中的亚克隆如同实施例3，只除了将寡核苷酸OL411和OL469用于Vk基因的连接反应中。
在此Vk基因中引入了额外的突变以制备其它变体Vk基因。这些突变包括：V19A、Q38H、R39T、S100G、N103K、V106I。诱变是用表5中所列的寡核苷酸通过PCR进行的。将OL768和OL769、OL770和OL771与OL411和OL401(见上文)组合用于重叠PCR中。将OL648与OL411组合用于单个PCR中。将PCR产物克隆入pGEM-T Easy(Promega)中并通过测序鉴定正确的克隆。
变体Vh基因也是用诱变从野生型序列中构建的。构建了变体Vh基因，该变体Vh基因包含替代K3Q、E5V、M18L、K19R、V23A、I28T、I51T、I56T、E64D、S79N、A80S、V81L、T86N、D87S、R89K、G94A、T115L和L116V。这些突变是用表6中所列的寡核苷酸引入的。简言之，将每一套寡核苷酸与OL411和OL415组合用于重叠PCR中。将PCR产物克隆入pGEM-T Easy(Promega)中并通过测序鉴定正确的克隆。
将Vh和Vk结构域以如前文所述的HindIII BamHI片段亚克隆入表达载体中，并根据如在实施例5中详述的方法表达变体抗体。
表4：用于Vk1组装的合成的寡核苷酸
名称OL459OL460OL461OL462OL463OL464OL465OL466OL467OL468OL469 序列GACATCCAGCTGACTCAGTCTCCAGACACCTCCTCTGCCACTATGTCTGGCGTGCCTTCTAGATTTAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAACTCCCTGGAGGCCGAAGATGCCGCAACCTATTACTGTCAACAAAGTCATAGCTGGCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAATGTGGAAGTAAAAGTTTAAATTCTACTCACGTTTTACTTCCACATTTGTCCCTAATAGGTTGCGGCATCTTCGGCCTCCAGGGAGTTGATGGAGAAGGCACGCCAGACATAGACTCAGAAGCATACTTTATGACTGACTCTTTCTCCTGGACTGGCAGAGGAGGTGTCTGGAGACTGAGTCAGCTGGATGTCAGACTGAGTCAGCTGGATGTCGGAGTGGACACCTGTGGAGAG 长度4040404040404040402042
表5：用于Vk诱变的合成的寡核苷酸
名称OL648OL768OL769OL770OL771 序列GGATCCAACTGAGGAAGCAAAGTTTAAATTCTACTCACGTTTGATTTCCACCTTTGTCCCGCCGCCGAACGTGAATGGCCAGTCCAGGAGAAAGAGCCAGTTTCTCCTGCAGGCCTGCAGGAGAAACTGGCTCTTTCTCCTGGACTCCACTGGTATCAGCACACAACAAATGGTTCTCCAATTGGAGAACCATTTGTTGTGTGCTGATACCAGTGG 长度8033333535
表6：用于Vh诱变的合成的寡核苷酸
名称OL642OL643OL644OL645OL654OL655OL656OL657OL658OL659OL899OL900 序列GTCTCAGGGAGCCTCCAGGTTGCACCAAGCCGCCTCCAGACTCCACCAGCTGCACTTCGGAGAACCTGGAGGCTCCCTGAGACTCTCCTGTGCTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACCACTGGAGGCTGTTCATTTGCAGGTACAGAGAATTTTTGGAATCATCTACCTGCAAATGAACAGCCTGAAAACTGAAGACACTGCCGTTTATTACTGGAAACTAGATCAAAATCGACTAATTCTGCAATTAGTCGATTTTGATCTAGTTTCAGCAACCACATTATGCGGACTCTGTGAAAGGGCCCTTTCACAGAGTCCGCATAATGTGGGCCAAGGCACCCTTGTCACAGTGTCCTCATGAGGACACTGTGACAAGGGTGCCTTGGCCGCCAAGGCACCACTGTCACAGTGTCCTCAGGCCTGAGGACACTGTGACAGTGGTGCCTTGGC 长度626241503030262630303131
实施例5
抗-TNFα抗体的表达、纯化和定量
重链和轻链表达载体是用电穿孔共转染入NS/0中的，该NS/0是从欧洲动物细胞保藏中心(ECACC)获得的非免疫球蛋白产生性小鼠骨髓瘤。表达gpt基因的集落是在Dulbecco氏改良的Eagle培养基(Dulbecco’sModified Eagle Medium)(DMEM)上进行选择的，该培养基补充了10％(v/v)的胎牛血清和抗生素(均购自Gibco，Paisley，英国)及0.8μg/ml霉酚酸和250μg/ml黄嘌呤(Sigma，Poole，英国)。
转染的细胞克隆产生的人抗体是通过对人IgG的ELISA分析进行测量的[Tempest等人(1991)BioTechnology  9：266]。将分泌抗体的细胞系进行扩大并通过蛋白质A亲和层析对抗体进行纯化[Harlow E.Lane D.；Antibodies，a Laboratory Manual，第309页；Cold Spring HarborLaboratory Press(1988)，NY，美国]。
纯化的抗体的浓度用探测目标抗体的人κ恒定区的ELISA确定。使用治疗性抗体infliximab(Schering-Plough Ltd，英国)的商业制品确定了标准的浓度曲线，并将该标准用于计算所检验的抗体制品的浓度。该试验是在96-孔板上进行的，且所有测定均重复进行两次。
对于此试验，将平板(Dynatech Immulon 2)用每孔100μl的绵羊抗-人κ抗体(The Binding Site，Birmingham，英国)进行包被，该抗体是以1∶250在pH9.6的碳酸盐/碳酸氢盐包被缓冲液(Sigma，Poole，英国)中稀释的。包被在37℃进行1小时，且用PBST(具有0.05％Tween20的PBS)将孔洗涤3次。向孔中加入100μL PBST和所描述的对照和检验抗体的稀释物。阴性对照仅应用PBST而不添加抗体。将标准制品(infliximab)1∶1000(v/v)稀释，并在平板上横向陈列二倍稀释物系列。对于检验的抗体制品也给出二倍稀释物系列。将该平板于室温温育1小时，并将平板孔如前文所述进行洗涤。结合的抗体用过氧化物酶缀合的绵羊抗-人IgGγ链特异性试剂(The Binding Site，Birmingham，英国)进行探测。将该第二抗体在PBST中1∶1000稀释，并在平板的每一个孔中添加100μl。将平板于室温再温育1小时并如前文所述进行洗涤。探测是通过用每孔100μl“Sigmafast”过氧化物酶底物(Sigma，Poole，英国)实现的，显色反应通过添加每孔40μl的1M硫酸而终止。光密度是用平板读出器在492nm读取的。相对于对照抗体绘制了抗体浓度对A492的标准曲线并通过与标准比较确定所检验抗体的浓度。
实施例6
通过用修饰的抗体对TNFα进行中和而在体外保护TNFα敏感性细胞
抗-TNFα抗体中和TNFα对体外生长的细胞系的致死作用的能力是用Galloway提供的方案检验的[Galloway等人，1991，J.Immunol.Meth.140：37-43]。该试验应用鼠纤维肉瘤细胞系WEHI164，该细胞系对TNFα的致死作用非常敏感。
对于此试验，使细胞在固定的致死浓度的TNFα和一系列不同浓度的抗体存在时生长过夜。第二天，测量细胞的代谢活性以作为存活的指示。可中和TNFα的抗体可赋予细胞保护作用，因而在试验中可测量到更大的代谢活性。
WEHI164从欧洲动物细胞保藏中心(ECACC#.8702250)获得并生长于DMEM培养基中，该培养基具有Glutamax(Gibco，Paisley，英国)、10％胎牛血清(Perbio，Chester，英国)并含有antibiotic-mycotic(Gibco)。在测定前的一天，将细胞进行传代培养以确保在随后的试验期间的活性增殖。该试验在96孔平板上进行，对所有处理均重复进行两次。制备含有对照抗体、检验抗体的稀释物和无抗体的阴性对照的平板。一般地，平板上横向排列抗体的二倍稀释物系列，该系列起始于50μl体积中10μg/ml抗体的浓度。制备在含有4μg/ml放线霉素的培养基中的50μg/ml的TNFα贮存液(Pepro Tech EC Ltd，London，英国)并将其添加到处理孔中。通过轻轻敲打平板混合TNFα溶液，并在将制备的溶液转移到含有细胞的测定平板之前将平板于室温温育至少2个小时。
测定平板是通过以每孔50μl接种2.5×104细胞并于37℃、5％CO2温育至少1小时而制备的。随后，将50μl TNFα/抗体混合物或对照制品从用于稀释各种处理物的平板转移出来。将细胞和处理物的混合物通过轻轻敲打平板进行混合，并将平板于37℃在含有5％CO2的潮湿空气中温育过夜。下一天，用“CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell ProliferationAssay”(Promega，Southampton，英国)估计每一孔中细胞的代谢活性。在添加试验溶液之后，将平板再温育90分钟，并用平板读出器在492nm读取每一孔中溶液的吸收值。吸收数值相对抗体浓度作图。在所有测定中，阳性对照制品是治疗性抗体infliximab(Schering-Plough Ltd，英国)的样品，该样品在测定中一致地展示出在低于0.1μg/ml的浓度下对TNFα的显著中和。类似地，本发明修饰的抗体在本试验中一致地展示出与阳性对照制品等价的保护作用。图2显示从该试验中获得的示例性图。
实施例7
对TNFα刺激的体外人内皮细胞中ICAM-1的产生的中和。
在体外试验中检验了抗-TNFα抗体对人脐静脉内皮(HUVE)细胞中TNFα刺激的膜结合ICAM-1的产生进行中和的能力。简言之，使HUVE细胞在TNFα和各种浓度的检验或对照抗体存在时生长于96孔平板中。随后膜结合ICAM-1的定量相对表达应用商业上可购得的ICAM-1探测系统通过细胞裂解和酶联免疫吸附测定(ELISA)估计。
对于此测定，制备了平行的两套96孔平板。一套称为“测定平板”，是用细胞接种的，而另一套称为“制备平板”，用于制备TNFα和检验及对照抗体溶液的稀释物。制备平板中的内含物最后将转移到测定平板中。所有测定均重复进行两次。
对于测定平板，将HUVE细胞(Cambrex Bio Science，Wokingham，英国)以50μl体积中每孔5×104个细胞的密度进行接种。通过于37℃、5％CO2温育至少2小时而使细胞能够附着到平板上。
对于制备平板，将检验抗体和阳性对照抗体的二倍稀释系列在平板横向上一式两份地陈列。抗体的起始浓度为100μl/孔终体积中20μg/ml。阴性对照无抗体。制备培养基中40ng/ml的TNFα(Pepro Tech EC Ltd，London，英国)溶液，并以每孔100μl添加到制备平板上每一个处理孔中。将平板通过轻轻敲打进行混合，并于室温温育45分钟。在该温育后，将制备平板中每孔50μl添加到测定平板上其相应的孔中。将测定平板于37℃在含有5％CO2的潮湿空气中温育23小时。
下一天，去除所有孔的培养基并将细胞用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤1次。将细胞裂解，并测定裂解物中是否存在ICAM-1。裂解是通过在80μl裂解缓冲液中于4℃温育45分钟而实现的。裂解缓冲液包含8.7g/lNaCl、6.05g/l Tris、0.5％(v/v)NP40，pH8.0。裂解缓冲液也含有100mM浓度的蛋白酶抑制剂PMSF、碘乙酰胺和苯甲酰胺及各自为50mM和5mM浓度的胃蛋白酶抑制剂A和亮抑蛋白酶肽。这些抑制剂是在使用时新鲜添加入裂解缓冲液制备物中的。
在将裂解物转移到新的圆底96孔平板中之前，将孔中的内含物用微量移液器混合。将平板离心以清除沉淀的细胞碎片，并将清澈的裂解物转移到另一新的96孔平板中以进行保存(-20℃)或立即测定。
对于本测定试验，用商业的ELISA系统(sICAM-1Module set；BenderMedsystems，Towcester，英国)和厂商建议的条件分析20μl清澈的裂解物中是否存在溶解的ICAM-1。每一孔中溶液的吸收值是用平板读出器在492nm读取的。吸收数值相对抗体浓度制图。在所有测定中，阳性对照制品是治疗性抗体infliximab(Schering-Plough ltd)的样品，该样品在测定中一致地展示出在低于1μg/ml的浓度下对TNFα的显著中和。类似地，本发明修饰的抗体也一致地展示出与阳性对照制品等价的对ICAM-1表达的浓度依赖性抑制作用。图3显示从该测定中获得的示例性图。
实施例8
修饰的抗体结合TNFα的竞争测定试验
本发明修饰的抗体与TNFα受体(RII，p75)竞争的能力是在竞争ELISA中测量的，该测量基于Siegel等人[Siegel等人(1995)Cytokine 7(1)：15-25]所述的方法。将ELISA平板用受体(TNFαRII-Fc)包被，并与固定量的生物素化TNFα和抗体的二倍稀释系列的混合物进行温育。TNFα与受体的结合是通过应用链霉抗生物素蛋白-HRP缀合物的比色测定法进行测量的。该测定试验用Immulon 2HB 96孔平板(Fisher，Loughborough，英国)进行，该平板通过在碳酸盐包被缓冲液中于4℃用5μg/ml TNFαRII-Fc(R&Dsystems，Abingdon，英国)包被过夜而制备。将50μl体积应用于平板的每一个孔中。将包被的平板用PBS-0.05％(v/v)Tween20(PBS-T)洗涤至少5次，并通过添加PBS-T中的1％(v/v)BSA溶液，然后进一步于室温温育至少1小时来封闭。
在该温育过程中，设立了稀释物平板，在该平板中陈列了检验抗体和对照试剂。对于每一个检验抗体，一般使用起始于50μl/孔终体积中50μg/ml的浓度的二倍稀释系列。对照包括非-TNFα结合抗体作为阴性对照，而临床等级的Infliximab(Schering-Plough ltd，英国)作为阳性对照。对照抗体与检验抗体为相同的同种型。在添加抗体之后，添加每孔50μl的50ng/ml生物素-TNFα溶液，并将平板通过轻轻敲打而混合。该TNFα是如前文所述的商业来源产品(PeproTech，London，英国)并用EZ连接磺基-NHS-生物素(Perbio，Tattenhall，英国)按厂商建议的规程进行生物素化。
将封闭溶液从测定平板中去除并将平板如前文所述进行洗涤。将来自稀释物平板的每一孔的50μl添加到测定平板的相关孔中，且在混合后，将测定平板于室温温育至少1小时。在温育后，洗涤平板并将100μl稀释的链霉抗生物素蛋白-HRP(Sigma，Poole，英国)试剂添加到平板的每一孔中。将平板进一步于室温温育至少1小时，并如前文所述进行洗涤。测定结果用100μl/孔的Sigma-fast OPD片剂(Sigma，Poole，英国)显示，且颜色反应是通过添加每孔50μl的1M硫酸而终止的。将平板进行数据读取，并将结果绘制为抗体浓度对492nm吸收值的图。图4显示从该测定试验中获得的示例性图。本发明的优选抗体显示出与本测定中阳性对照抗体等价的对TNFα结合的浓度依赖性竞争曲线。
实施例9
对Hs27细胞中TNFα诱导的IL-6增量调节的抑制
人包皮成纤维细胞可通过暴露于TNFα而被诱导产生IL-6。本发明的修饰抗体阻断该表达的增量调节的能力通过如下方式估计：将细胞与TNFα及检验抗体共温育，然后用商业上可购得的IL-6探测系统确定随后分泌到培养基中的IL-6水平。
对于本测定试验，制备了平行的两套96孔平板。一套称为“测定平板”，是用细胞接种的，而另一套称为“制备平板”，用于制备TNFα及检验和对照抗体溶液的稀释物。制备平板中的内含物最后将转移到测定平板中。所有测定均重复进行两次。
对于测定平板，将从欧洲动物细胞保藏中心(ECACC no.94041901)获得的人包皮成纤维细胞Hs27以每孔2×104个细胞的密度进行接种，并通过于37℃在含有5％CO2的潮湿空气中温育过夜而使细胞能够附着到平板上。贯穿始终的培养基为DMEM+Glutamax(Gibco，Paisley，英国)，含有10％胎牛血清(Perbio，Chester，英国)和常规的antibiotic/mycotic制品(Gibco)。
对于制备平板，将检验抗体和阳性对照抗体的二倍稀释系列在平板横向上一式两份地陈列。抗体的起始浓度为100μl/孔终体积中1.25μg/ml。阴性对照无抗体。将3ng/ml的TNFα溶液(PeproTech EC Ltd.，London，英国)添加到含有抗体的所有孔中，而对于无抗体的对照孔，额外添加100μl/孔的培养基。将平板通过轻轻敲打进行混合，并于室温温育至少30分钟。
从含有Hs27细胞的测定平板中除去培养基，并将来自制备平板每一孔的100μl转移到测定平板的相关孔中。将平板通过轻轻敲打进行混合，并于37℃在含有5％CO2的潮湿空气中温育至少18小时。在温育后，将培养基从每一孔中转移到新的U-底96孔板中以在-20℃进行保存或立即测定。
用商业的ELISA系统(IL-6 Module set；Bender Medsystems，Towcester，英国)和厂商建议的条件分析培养基中是否存在IL-6。对于测定试验，将50μl培养基进行1∶15(v/v)的稀释。每一孔中溶液的吸收值用平板读出器在492nm读取。吸收数值对抗体浓度制图。在所有测定中，阳性对照制品是治疗性抗体infliximab(Schering-Plough ltd，英国)的样品。本发明优选的修饰抗体一致地展示出对IL-6表达的浓度依赖性抑制。图9显示从该测定试验中获得的示例性图。
实施例10
TNFα的探测
将简单的平板ELISA用于证实本发明的修饰抗体与TNFα结合的能力。该测定是用治疗性抗体Infliximab(Schering-Plough ltd，英国)制品作为正对照并用非-TNFα结合性人IgG制品(Sigma I2511)作为负对照进行比较而进行的。该测定用下面详述的方法进行，并证明本发明优选的组合物(Vh5/Vk12)与本测定中的对照抗体具有相同的功效。典型的结合曲线如图7所示。
将Immulon 2HB 96孔平板(Fisher，Loughborough，英国)在碳酸盐包被缓冲液中于4℃用2.5μg/ml TNFα(Peprotech，London，英国)包被过夜。将50μl的体积应用于平板的每一个孔中。将包被的平板用PBS-0.05％(v/v)Tween20(PBS-T)洗涤3次。
制备了每一个抗体的二倍稀释系列，并各自一式两份地以每孔100μl体积应用。最高的抗体浓度为1μg/ml。将平板于室温温育1小时并如前文所述用PBST进行洗涤。为了探测结合的抗体，将平板与在PBST中1/1000稀释的小鼠-抗人IgG-HRP缀合物(Sigma，Poole，英国)制品进行温育。温育为在室温进行至少90分钟。将平板再次如前文所述用PBST进行洗涤，且结合的抗体用100μl/孔的Sigma-Fast OPD显示。显色5分钟，然后通过添加40μl/孔的1M H2SO4而终止反应。将平板在492nm进行数据读取，并将数据绘制为抗体浓度对光密度的图。图7显示代表性的结合曲线图，该结合曲线图表明了在该测定中修饰的抗体(Vh5/Vk12)和阳性对照之间的功能等价性。
实施例11
在体外增殖测定试验中用人PBMC证明：修饰的抗-TNFα抗体的减弱的免疫原性潜力。
修饰的抗体是根据实施例5的方法制备的。阳性对照(攻击性抗体)是临床等级的infliximab(Schering-Plough ltd，英国)。对于T细胞增殖测定，将来自健康供体的4×106个PBMC(每孔)与非修饰的和修饰的抗体在2ml大体积培养物(24孔平板中)中进行温育。用5和50μg/ml的修饰的和非修饰的抗体对每一个供体进行处理。此外，维持未处理的大体积对照培养物以确定刺激指数。在5、6、7和8日，将每一大体积培养物中的细胞轻轻搅动，并取50μl样品一式三份确定增殖指数。将50μl样品等份试样各自转移到U-底96孔平板的3个孔中。将新鲜的AIM V培养基(130μl)添加到96孔中的每一个孔中。将细胞用每孔1μCi的[3H]胸腺嘧啶进行脉冲(18-21小时)，该[3H]胸腺嘧啶稀释在20μl总体积的AIMV培养基中。对于每一个培养物，总体积为200μl。CPM值是用β-平板读出器收集的，且每一个时间点的刺激指数根据上文实施例2所述确定。
相对于每一个时间点和抗体处理绘制SI图。将显著的SI取为＞2.0。在有反应的供体中，用infliximab处理导致在第7日具有峰值的显著的增殖反应。在相同的供体中，用本发明修饰的抗体组合物(Vh5/Vk12)处理未导致显著的增殖反应。该结果显示与亲代抗体相比，本发明优选的抗体组合物具有减小的免疫原性潜力。从该测定中获得的代表性图在图10中提供。

Claims (36)

1.一种修饰的单克隆抗-TNFα抗体，该抗体当体内应用时与具有基本相同的生物学特异性的任何非修饰的抗体相比基本无免疫原性或有低的免疫原性，且与非修饰的亲代抗体相比在重链和/或轻链V-区中包含特定氨基酸残基的改变，其中该改变导致在所述V-区中可以在亲代抗体中充当II型MHC结合配体并刺激T-细胞的肽序列的数目减少或消除。
2.根据权利要求1的修饰的抗体，其中所述亲代抗体是嵌合的A2(cA2)。
3.根据权利要求1或2的修饰的抗体，其中还在抗体的CDR中进行V-区的改变，从而基本保持亲代抗体的结合亲和力。
4.根据权利要求2或3的修饰的抗体，其中在非修饰的抗体的所述V-区中进行改变的肽序列选自如图1和表1所示的连续的T-细胞抗原决定部位序列。
5.根据权利要求4的修饰的抗体，其中对所述T-细胞抗原决定部位的任何一个中的1-9个氨基酸进行改变。
6.根据权利要求5的修饰的抗体，其中对1个氨基酸进行改变。
7.根据权利要求5或6的修饰的抗体，其中所述氨基酸残基的改变是通过替代实现的。
8.根据权利要求4-7中任何一项的修饰的抗体，其中还进行其它氨基酸残基改变以恢复该抗体的生物学活性。
9.根据权利要求3-8中任何一项的修饰的抗体，其中所述V-区中的氨基酸残基改变是在亲代抗体的至少一段选自如下的具有连续氨基酸残基的肽序列中进行的：
(A)  GLVQPGGSMKLSCVAS；
(B)  WVAEIRSKSINSA；
(C)  SRDDSKSAVYLQMTDLRT；
(D)  RNYYGSTYDYWGQGTTLTVSS；
(E)  DILLTQSPAILSVSPGERVSF；
(F)  HWYQQRTNGSPR；
(G)  LIKYASESMSGIPS；
(H)  DFTLSINTVESEDIADYYCQQ.
10.根据权利要求2或3的修饰的抗体，其中V-区重链(“Vh”链)包含选自SEQ ID 1(Vh1)、SEQ ID 2(Vh3)、SEQ ID 3(Vh5)和SEQID 4(Vh8)的序列。
11.根据权利要求2或3的修饰的抗体，其中V-区轻链(“Vk”链)包含选自SEQ ID 5(Vk1)、SEQ ID 6(Vk12)、SEQ ID 7(Vk5)和SEQ ID 8(Vk8)的序列。
12.根据权利要求10或11的修饰的抗体，其包含权利要求10中的任一Vh链和权利要求11中的任一Vk链。
13.权利要求12的修饰的抗体，其包含Vh5链(SEQ ID 3)和Vk12链(SEQ ID 6)。
14.权利要求12的修饰的抗体，其包含Vh1链(SEQ ID 1)和Vk1链(SEQ ID 5)。
15.权利要求12的修饰的抗体，其包含Vh1链(SEQ ID 1)和Vk5链(SEQ ID 7)。
16.权利要求12的修饰的抗体，其包含Vh1链(SEQ ID 1)和Vk8链(SEQ ID 8)。
17.权利要求12的修饰的抗体，其包含Vh8链(SEQ ID 4)和Vk5链(SEQ ID 7)。
18.权利要求2或3的修饰的抗体，其具有改变的V-区重链，并与未改变的cA2抗体相比包含下列任一组的氨基酸残基替代：
(a1)  M18L，K19R，V23A，I28T，I51T，I56T，S79N，A80S，V81L，T86N，D87S，R89K，
      L116V；
(a2)  K3Q，E5V，M18L，K19R，V23A，I28T，S79N，A80S，V81L，T86N，D87S，R89K，
      G94A；
(a3)  M18L，K19R，V23A，I28T，S79N，A80S，V81L，T86N，D87S，R89K，L116V；
(a4)  K3Q，E5V，M18L，K19R，V23A，I28T，I51T，I56T，E64D，S79N，A80S，V81L，
      T86N，D87S，R89K，G94A，T115L，L116V.
19.权利要求2或3的修饰的抗体，其具有改变的V-区轻链，并与未改变的cA2抗体相比包含下列任一组的氨基酸残基替代：
(b1)  L3Q，A9D，I10T，L11S，V13A，V19A，Q38H，R39T，I58V，S74T，T77S，V78L，
      S80A，I83A，D85T；
(b2)  L3Q，A9D，I10T，L11S，V13A，I58V，S74T，T77S，V78L，S80A，I83A，D85T，
      L104V；
(b3)  L3Q，A9D，I10T，L11S，V13A，I58V，S74T，T77S，V78L，S80A，I83A，D85T，
      S100G，N103K，L104V，V106I；
(b4)  L3Q，A9D，I10T，L11S，V13A，V19A，Q38H，R39T，I58V，S74T，T77S，V78L，
      S80A，I83A，D85T，S100G，N103K，L104V，V106I.
20.权利要求2或3的修饰的抗体，其具有改变的V-区重链和轻链，并同时包含如权利要求18所示的氨基酸替代组a1-a4中的任一组和如权利要求19所示的氨基酸替代组b1-b4中的任一组。
21.权利要求20的修饰的抗体，其具有改变的V-区重链和轻链并同时包含替代组a1和b1。
22.权利要求20的修饰的抗体，其具有改变的V-区重链和轻链并同时包含替代组a2和b2。
23.权利要求20的修饰的抗体，其具有改变的V-区重链和轻链并同时包含替代组a2和b3。
24.权利要求20的修饰的抗体，其具有改变的V-区重链和轻链并同时包含替代组a2和b4。
25.权利要求20的修饰的抗体，其具有改变的V-区重链和轻链并同时包含替代组a4和b3。
26.根据权利要求1-25中任何一项的修饰的抗体，其中恒定区结构域源自人IgG1和人κ。
27.根据权利要求1-26中任何一项的修饰的抗体，其中当该抗体以完整蛋白质形式在诱导的人T-细胞细胞增殖生物学测定试验中检测时，与使用来自相同供体的细胞平行检测的亲代抗体相比显示出较小的刺激指数，其中该指数记为在蛋白质刺激后评定的细胞增殖值除以在未接受蛋白质的对照细胞中评定的细胞增殖值，且其中细胞增殖是由任何适当的方法测量的。
28.根据权利要求1-26中任何一项的修饰的抗体，其包含V-区序列，其中从该序列可以得到肽，该肽在诱导的人T-细胞细胞增殖生物学测定试验中进行检测时，显示出比平行地进行检测的源自非修饰的亲代抗体的肽有低的刺激指数，其中该指数记为在肽刺激后评定的细胞增殖值除以在未接受肽的对照细胞中评定的细胞增殖值，且其中细胞增殖是由任何适当的方法测量的。
29.一种编码根据权利要求1-28中任何一项的抗体的DNA分子。
30.一种包含如在上述权利要求的任何一项中限定的修饰的抗-TNFα抗体的药物组合物，其任选地还包含药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
31.如在上述权利要求的任何一项中限定的修饰的抗-TNFα抗体在制备用于治疗类风湿关节炎和Crohn氏病的药物中的用途。
32.一种由9-15个连续的氨基酸残基组成的肽分子，该肽分子具有潜在的II型MHC结合活性并从非修饰的抗-TNFα抗体A2的一级序列中生成，该肽分子在细胞增殖生物学测定试验中具有至少1.8～2的刺激指数，其中该指数记为在肽刺激后评定的细胞增殖值除以在未接受肽的对照细胞中评定的细胞增殖值，且其中细胞增殖是由任何适当的方法测量的。
33.权利要求32的肽分子，其选自如在图1或表1中描述的连续的T-细胞抗原决定部位序列。
34.一种通过氨基酸替代从权利要求32或33的肽分子形成的修饰的肽分子，该修饰的肽分子具有以小于2的刺激指数表示的减小的或不存在的潜在II型MHC结合活性，其中该指数记为在肽刺激后评定的细胞增殖值除以在未接受肽的对照细胞中评定的细胞增殖值，且其中细胞增殖是由任何适当的方法测量的。
35.根据权利要求34的修饰的肽分子，该肽分子具有小于1.8的刺激指数。
36.根据权利要求32-35之任一项的肽在制备抗-TNFα抗体中的用途，其中所述抗-TNFα抗体当体内应用时与任何非修饰的亲代抗体相比基本无免疫原性或具有低的免疫原性。
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