CN100343282C - 杂合干扰素融合多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一类由两个片段构成的杂合干扰素融合多肽，所含的第一个片段为一个干扰素-τ多肽的N端氨基酸序列，第二个片段为非τ的I型干扰素多肽的C端序列。两个片段在成熟干扰素多肽约第8和第37位残基间的区域连接。本发明还描述了编码这类干扰素融合多肽的核酸序列、含有此序列的表达载体以及这类干扰素融合多肽在治疗上的应用。在治疗上的应用包括抗病毒和抗细胞增殖的应用。本发明的这类干扰素融合多肽的一个优点在于它们用于对细胞进行处理时没有细胞毒效应。

Description

杂合干扰素融合多肽
本申请是申请日为1997年4月11日、申请号为97195391.0、题目为“杂合干扰素组合物及其使用方法”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及含有来自干扰素τ的一个或几个区域以及来自其他干扰素的一个或几个区域的杂合干扰素蛋白。
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背景技术
各种哺乳动物的孕体膜或滋养外胚层产生生化信号以使妊娠得以建立和保持(Bazer等，1983)。此类蛋白的一种，羊滋养层蛋白-1(oTP-1)，曾被确定为怀孕10至12天的绵羊孕体分泌的一种低分子量蛋白(Wilson等，1979；Bazer等，1986)，oTP-1蛋白显示出可以抑制前列腺素F2-α的子宫分泌，导致卵巢的黄体化而使得未怀孕的山羊受到生理和内分泌损伤(Bazer等，1986)。因而，oPT-1蛋白具有抗黄体溶解的生物学活性。oTP-1的主要功能据推测与妊娠的建立相关。
oTP-1随后被发现(i)呈现出与不同种的干扰素α(IFNα)具有一定的同源性(50％-70％)(Imakawa等，1987)，以及(ii)与I型干扰素受体结合(Stewart等，1987)。除了有这些与IFNα相似之处，oPT-1还具有与IFNα相区别的特性，包括：oTP-1在生殖生物化学上的功能(其他的干扰素还不知道在生殖周期的生物化学调控中具有任何的功能)，oTP-1的细胞来源-滋养外胚层细胞(IFNα则来自淋巴细胞)，oTP-1的大小-172个氨基酸(IFNα则一般为165-166个氨基酸)，以及oTP-1不易被病毒诱导(病毒对IFNα具有高的可诱导性)。国际干扰素学会把oTP-1编作一个完全的干扰素新类，称作干扰素-τ(IFNτ)。这里的希腊字母τ代表滋养外胚层(trophoblast)。
干扰素被分为两个明显的组别：I型干扰素，包括IFNα，IFNβ和IFNω(也称IFNαII)；和II型干扰素，其代表是IFNγ(DeMaeyer等综述，1988)。人体中据估计有至少17个IFNα的非等位基因，至少2或3个的IFNβ的非等位基因，以及一个单个的IFNγ基因。
IFNα尤其可用于抗血液恶性肿瘤如毛状细胞白血病(Quesada等，1984)。而且这些蛋白还表现出抗多骨髓瘤、慢性淋巴白血病、低级骨髓瘤、Kaposi肿瘤、慢性骨髓瘤白血病、肾细胞癌、泌尿膀胱肿瘤和卵巢癌(Bonnem等，1984；Oldham，1985)。干扰素以及干扰素受体在某些自身免疫和炎症疾病的病理发生中的作用也有所研究(Benoit等，1993)。
IFNα还用于抗各种类型的病毒感染(Finter等，1991)。干扰素α在抗人乳头瘤病毒、乙型肝炎、和丙型肝炎中表现出活性(Finter等，1991；Kashima等，1988；Dusheiko等，1986；Davis等，1989)。
但是显然，IFNα的用途由于其毒性而具有局限性：在治疗癌症和病毒性疾病中使用干扰素会导致严重的副作用，如发烧、发冷、厌食、体重下降和疲劳(Pontzer等，1991；Oldham，1985)。这些副作用常常导致：(i)降低干扰素的剂量直到影响疗效的程度，或者(ii)停止对患者的治疗。这些毒性减少了这类有效抗病毒和抗增殖的蛋白质在对衰弱的患者和动物治疗上的应用。
发明内容
一方面，本发明包括编码杂合干扰素融合多肽的核酸分子。每种这样的分子是由编码一个干扰素-τN末端氨基酸序列的5’端片段，和编码一个非τ的I型干扰素多肽的C末端氨基酸序列的3’端片段所构成。这两个片段剪接的区域相当于成熟干扰素多肽的约第8至第37个残基的部分。非τ-I型干扰素多肽的例子包括干扰素α和干扰素β。在一个实施方案中，5’端还包括一个前导序列。
5’端片段编码序列的例子包括那些选自下列一组的一个序列中所含有的序列：SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：35，SEQ IDNO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，和SEQ ID NO：53。尤其是SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：15，或SEQ ID NO：35。5’端片段也可以是编码一个来自上述任何一个的共有序列，或者是一个内在的保守序列。优选的实施方案为其序列来自人源的，如SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：35。
在不同的实施方案中，3’端片段可以编码一个来自α1-干扰素、α2-干扰素、干扰素β或者ω-干扰素的氨基酸序列。3’端片段也可以编码一个来自上述任何一个的共有序列，或者是一个内在的保守序列。优选的实施方案为其序列来自人源的，如人的IFNα或者是人的IFNβ。
在一个一般性的实施方案中，这两个片段接合的区域相当于成熟干扰素多肽的约第8至第28个残基的部分。在另一个实施方案中，这两个片段接合的区域相当于成熟干扰素多肽的约第8至第22个残基的部分。而在又一个实施方案中，这两个片段接合的区域相当于成熟干扰素多肽的约第8至第16个残基的部分。在一个优选的实施方案中，这两个片段接合于相当于成熟干扰素多肽的约第22个残基的位置。
在其他的实施方案中，干扰素-τ多肽可以是人的或者是反刍动物的(如羊的)干扰素-τ多肽。而非干扰素-τI型多肽也同样可以是人的或非人源的I型干扰素多肽。在一个优选的实施方案中，干扰素-τ多肽为一个羊干扰素-τ多肽，而非干扰素-τI型多肽是一个人I型干扰素多肽。
本发明的一个典型的嵌合核酸分子是SEQ ID NO：54，它具有编码人干扰素-τ的第1-28位氨基酸(SEQ ID NO：3)的5’端片段，和编码人IFNα的第29-167位氨基酸的3’端片段(克隆pIFN105；Genbank HUMIFNN Acc.M28585)。
上述的任何一个嵌合分子可以进一步包括一个前导序列。
在一个相关方面，本发明包括一个杂合干扰素融合多肽，它由含有干扰素τ的N-末端氨基酸序列的第一个片段，和含有一个非τ的干扰素I型多肽的C-末端氨基酸序列的第二个片段所构成。两个片段连接于成熟干扰素多肽的约第8至第37个残基的区域。上面所述的为该嵌合分子的特别实施方案。干扰素α和干扰素β为此类非τ-I型干扰素的例子。在将干扰素用于药物成分或治疗应用时，这类杂合融合蛋白可以降低非τI型干扰素的毒性。
在不同的实施方案中，此第一个片段可以具有选自下列一组的序列中所含的氨基酸序列：SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：15，SEQ IDNO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ IDNO：49，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，和SEQ IDNO：53。优选的实施方案中其序列来自人的干扰素-τ序列，如SEQ IDNO：15或SEQ ID NO：35。
在一个一般性的实施方案中，这两个片段接合于成熟干扰素多肽的约第8至第28个残基的区域。在另一个实施方案中，它们接合于成熟干扰素多肽的约第8至第22个残基的区域。而在又一个实施方案中，它们接合于成熟干扰素多肽的约第8至第16个残基的区域。
另一方面，本发明包括一个表达载体，其具有的核酸序列含有一个编码杂合干扰素融合多肽的开放阅读框(ORF)，包括上述的核酸和多肽序列。该载体还包括调控序列，以有效地在一个宿主细胞中表达此开放阅读框：此序列可以是内源性的(如通常存在的IFN前导序列)，或者是异源性的(如在酵母，哺乳动物细胞，昆虫细胞，组织培养物或细菌表达系统中被识别的分泌信号)。在此表达载体上，调控序列还可包括，在所说的核酸序列的5’端的一个启动子区域和一个与杂合干扰素融合多肽的编码序列(嵌合核酸分子)同阅读框的一个ATG起始密码子，在所说编码序列的3’端，有一个翻译终止信号及其后的一个转录终止信号。进而，本发明还包括利用本发明的表达载体重组产生杂合干扰素融合多肽的方法。该表达载体引入合适的宿主细胞，此宿主细胞然后在适当的条件下培养，从而表达该ORF序列。
在进一步的实施方案中，本发明包括一种重组产生杂合干扰素融合多肽的方法。在该方法中，含有编码杂合干扰素融合多肽开放阅读框(ORF)的序列的表达载体被引入合适的宿主细胞中，在该宿主细胞中载体可以如期表达此ORF。然后，将转化的宿主细胞在适当的条件下培养，从而表达该ORF序列。大量的载体和与其相应的宿主可以用于本发明的这个方法的实验中，包括，λgt11噬菌体载体和大肠杆菌细胞。其他的宿主包括，酵母，哺乳动物细胞，昆虫细胞，组织培养物，植物细胞培养物，转基因植物或细菌表达系统。
本发明进而包括抑制肿瘤细胞生长的方法。在此方法中，肿瘤细胞与杂合干扰素融合多肽以可有效抑制肿瘤细胞生长的浓度相接触。该杂合干扰素融合多肽可以是任何可行的药物制剂中的一部分。可以被杂合干扰素融合多肽抑制生长的肿瘤细胞包括，但并不限于，癌细胞，造血癌细胞，白血病细胞，淋巴瘤细胞，和黑色素瘤细胞。在一个实施方案中，肿瘤细胞为类固醇敏感的肿瘤细胞，例如，乳房瘤细胞。
在本发明的另一个方面，杂合干扰素融合多肽用于抑制病毒复制的方法中。在此方法中，感染病毒的细胞与杂合干扰素融合多肽以可有效抑制其中病毒的复制的浓度相接触。该杂合干扰素融合多肽可以是任何可行的药物制剂中的一部分。RNA和DNA病毒的复制都可以被杂合干扰素融合多肽所抑制，典型的RNA病毒包括猫白血病病毒，羊进行性肺炎病毒，羊慢病毒，马感染性贫血症，牛免疫缺损病毒，维斯纳一梅迪病毒，山羊关节炎脑炎病毒，人免疫缺损病毒(HIV)或者丙型肝炎病毒(HCV)。典型的DNA病毒为乙型肝炎病毒。
在另一方面，本发明包括一种在需要此类治疗的患者中治疗自身免疫疾病的方法。在一个实施方案中，自身免疫疾病为多样硬化症。该方法包括对患者施用药物有效量的杂合干扰素融合多肽。该杂合干扰素(hybIFN)可以通过例如口服或者通过静脉或肌肉注射而施用。口服施用hybIFN为优选的患者摄入方法。
本发明的其他实施方案包括在需要此类治疗的患者中治疗红斑狼疮，I型糖尿病，和风湿性关节炎的方法。该方法包括对患者施用药物有效量的本发明的杂合干扰素融合多肽。
结合所附附图阅读下面的本发明的详细描述，将能够更为全面地对本发明的这些以及其它的目的和特征加以理解。
附图说明
图1A，1B，1C，1D和1E表示了OvIFNτ的合成基因的核苷酸编码序列，其设计包括19个平均分布于编码序列的单一限制酶位点。
图2表示产生编码OvIFNτ的合成基因的克隆策略。
图3示出人干扰素τ基因与羊干扰素τ基因的预测蛋白序列的比较。通过核酸序列下面列出的变化的氨基酸对趋异进化的氨基酸进行了标记。
图4提供的数据显示OvIFNτ和IFNα都能够降低HL-60细胞的生长。
图5提供的数据显示rHu IFNα具有细胞毒性，而OvIFNτ没有。图中三次重复实验的一次结果以平均％存活±SD表示。
图6表示衍生自IFNτ序列的多肽序列。
图7提供了一个OvIFNτ序列的完整的核苷酸和氨基酸序列。
图8提供的数据体现了当将IFNτ用于处理外周血单核细胞时，相对于IFNα，其不具有细胞毒性。
图9表示了用IFNτ处理人皮肤T细胞淋巴瘤细胞系HUT的结果。
图10表示用IFNτ处理人T细胞淋巴瘤细胞系H9的结果。
图11A提供的数据为衍生自OvIFNτ的多肽参照与全OvIFNτ对FIV(猫免疫缺损病毒)复制的肽抑制。图11B提供的数据为衍生自OvIFNτ的多肽参照与全OvIFNτ对HIV(人免疫缺损病毒)复制的肽抑制。
图12提供的数据显示IFNτ衍生肽对IFNτ抗病毒活性的抑制作用。
图13提供的数据显示IFNτ-衍生肽对OvIFNτ抗病毒活性的抑制作用。
图14提供的数据显示IFNτ-衍生肽对牛IFNα的抗病毒活性的抑制作用。
图15提供的数据显示IFNτ-衍生肽对人IFNα抗病毒活性的抑制作用。
图16提供的数据显示了IFNτ-衍生肽对牛IFNγ抗病毒活性缺乏抑制作用。
图17提供的数据显示了抗-IFNτ-衍生肽的抗血清对IFNτ抗病毒活性抑制作用。
图18提供的数据显示了抗-IFNτ-衍生肽的抗血清对放射性标记的IFNτ与细胞的结合的抑制作用。
图19A和19B提供了编码IFNτ多肽的核酸序列的对比。
图20A和20B提供了IFNτ多肽的氨基酸序列的对比。
图21提供的数据比较了IFNτ和IFNβ的细胞毒性。
图22A和22B表示IFNαA(图22A)和IFNτ(图22B)对MDBK细胞的细胞毒性情况。
图23A和23B表示IFNτ对IFNαA在MDBK细胞中细胞毒性的影响。
图24A和24B表示125I-IFNτ(图24A)和125I-IFNαA(图24B)与MDBK细胞的结合，以及结合数据的Scatchard图。
图25A和25B表示IFNτ(图25A)和IFNαA(图25B)与MDBK细胞的竞争结合。
图26表示由针对IFNτ的N末端(实心柱)和C末端(斜纹柱)产生的抗血清相对于免疫前处理的对照(空心柱)对IFNτ和IFNαA与MDBK细胞结合的抑制。
图27A和27B表示IFNτ(图27A)和IFNαA(图27B)在MDBK细胞中最大抗病毒活性百分比(○)，细胞毒性(□)，和结合(◇)的剂量-应答/占据曲线。
图28示出杂合干扰素融合多肽的示意图。
序列的简要描述
SEQ ID NO：1为一个编码羊干扰素τ(OvIFNτ)的合成基因的核苷酸序列。也表示了编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2为一个成熟的OvIFNτ蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3为一个编码人干扰素τ(HuIFNτ)的合成基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO：4为一个成熟的HuIFNτ蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5为SEQ ID NO：2的1-37片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6为SEQ ID NO：2的34-64片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7为SEQ ID NO：2的62-92片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8为SEQ ID NO：2的90-122片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9为SEQ ID NO：2的119-150片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10为SEQ ID NO：2的139-172片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11为一个带有一个前导序列的成熟的HuIFNτ1基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO：12为SEQ ID NO：11预测的氨基酸编码序列。
SEQ ID NO：13为一个根据本发明而设计的25mer的合成的寡核苷酸。
SEQ ID NO：14为一个根据本发明而设计的25mer的合成的寡核苷酸。
SEQ ID NO：15为SEQ ID NO：4的1-37片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：16为SEQ ID NO：4的34-64片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：17为SEQ ID NO：4的62-92片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：18为SEQ ID NO：4的90-122片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：19为SEQ ID NO：4的119-150片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：20为SEQ ID NO：4的139-172片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：21为cDNA HuIFNτ6的核苷酸序列。
SEQ ID NO：22为由SEQ ID NO：21所表示序列而预测的氨基酸编码序列。
SEQ ID NO：23为cDNA HuIFNτ7的核苷酸序列。
SEQ ID NO：24为由SEQ ID NO：23所表示序列而预测的氨基酸编码序列。
SEQ ID NO：25为cDNA HuIFNτ4的核苷酸序列。
SEQ ID NO：26为由SEQ ID NO：25所表示序列而预测的氨基酸编码序列。
SEQ ID NO：27为cDNA HuIFNτ5的核苷酸序列。
SEQ ID NO：28为由SEQ ID NO：27所表示序列而预测的氨基酸编码序列。
SEQ ID NO：29为基因组DNA克隆HuIFNτ2的核苷酸序列。
SEQ ID NO：30为由SEQ ID NO：29所表示序列而预测的氨基酸编码序列。
SEQ ID NO：31为包括前导序列的基因组DNA克隆HuIFNτ3(一个天然的HuIFNτ基因)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：32为由SEQ ID NO：31所表示序列而预测的氨基酸编码序列(包括前导序列)。
SEQ ID NO：33为不包括前导序列的基因组DNA克隆HuIFNτ3(一个天然的HuIFNτ基因)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：34为由成熟的HuIFNτ3所编码的，SEQ ID NO：33所表示序列所编码的成熟人IFNτ蛋白的预测的氨基酸序列。
SEQ ID NO：35为SEQ ID NO：33的1-37片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：36为SEQ ID NO：33的34-64片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：37为SEQ ID NO：33的62-92片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：38为SEQ ID NO：33的90-122片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：39为SEQ ID NO：33的119-150片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：40为SEQ ID NO：33的139-172片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：41为SEQ ID NO：32的1-23片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：42为SEQ ID NO：11的1-23片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO：43为不包括前导序列的DNA克隆HuIFNτ1的核苷酸序列。
SEQ ID NO：44为由HuIFNτ1所编码的，SEQ ID NO：43所表示序列所编码的，成熟人IFNτ蛋白的预测的氨基酸序列。
SEQ ID NO：45为来自序列A40068(Bin 12，Accession#gi108955)1-37片段(成熟序列)的预测的氨基酸序列，它编码牛TP-1(克隆bTP509)。
SEQ ID NO：46为来自序列BovTPH1Bcds1(Bin 13，Accession#gi 163767)1-37片段(成熟序列)的预测的氨基酸序列，它编码牛TP-1。
SEQ ID NO：47为来自序列BovTPH1Ccds1(Bin 14，Accession#gi 163769)1-37片段(成熟序列)的预测的氨基酸序列，它编码牛TP-1。
SEQ ID NO：48为来自序列A39505(Bin 15，Accession#gi163769)1-37片段(成熟序列)的预测的氨基酸序列，它编码牛TP-1(克隆bTP4)。
SEQ ID NO：49为来自序列OATP5cds1(Bin 16，Accession#gi1412)1-37片段(成熟序列)的预测的氨基酸序列，它编码羊TPp5。
SEQ ID NO：50为来自序列OATP3cds1(Bin 17，Accession#gi1410)1-37片段(成熟序列)的预测的氨基酸序列，它编码羊TPp3。
SEQ ID NO：51为来自序列SHP010TPcds1(Bin 18，Accession#gi165821)1-37片段(成熟序列)的预测的氨基酸序列，它编码羊TP-1。
SEQ ID NO：52为来自序列SHP02TPcds1(Bin 19，Accession#gi165823)1-37片段(成熟序列)的预测的氨基酸序列，它编码羊TP-1。
SEQ ID NO：53为来自序列GOTCTPcds1(Bin 21，Accession#gi164117)1-37片段(成熟序列)的预测的氨基酸序列，它编码Caprahircus的IFNτ。
SEQ ID NO：54为衍生自人DNA的嵌合核酸序列，它带有编码人IFNτ(来自SEQ ID NO：3)1-28位氨基酸的5’端片段，和编码人IFNα(克隆pIFN105；Genbank HUMIFNN Acc.M28585)29-167位氨基酸的3’端片段。
SEQ ID NO：55为由SEQ ID NO：54所示序列所编码的预测的氨基酸序列。
具体实施方式
I.定义
干扰素τ(IFNτ)是指任何一个与(a)SEQ ID NO：2或(b)SEQ IDNO：34序列之一具有大于70％，或者优选地大于80％，或者更为优选地大于90％的氨基酸同源性的蛋白家族成员。氨基酸同源性的测定可以使用，例如，省缺参数LALIGN程序。该程序可在FASTA 1.7版的序列比较程序套件(Pearson和Lipman 1988；Pearson，1990；程序可从William R.Pearson，Department of Biological Chemistry，Box440，Jordan Hall，Charlottesville，VA处获得)中找到。典型地，IFNτ具有下列一组特征中的至少一个特征：(a)在胚胎/婴儿期由滋养外胚层表达，(b)抗黄体属性，(c)抗病毒属性，和(d)抗细胞增殖属性。IFNτ可以从许多来源包括牛，绵羊，和人中获得。
干扰素τ多肽是一种具有衍生自干扰素τ氨基酸编码序列的约15至172个氨基酸的多肽，其中所说的15至172个氨基酸在天然的干扰素τ中是连续的。这15-172个氨基酸区域也可以装配于这样的多肽中，其中两个或多个的干扰素τ区域相连接而它们在天然的蛋白中是不连续的。
一个多肽序列或片段“衍生自”另一个多肽序列或片段是指，它含有和存在于所衍生自的序列或片段中相同的的氨基酸序列。例如，如果一个细菌质粒中的插入片段的多肽序列与特定的人基因的多肽序列相同，那么该质粒含有一个“衍生自”特定的人基因的插入片段。
同样，当一个多肽序列或片段含有和存在于它所衍生的序列或片段相同的氨基酸序列时，其“衍生自”另一个的多肽序列或片段。
用于两个氨基酸序列间的相同性百分比(％)是指，在对两个序列进行优化比较且无罚分赋值到“缺口”处时，两个序列之间相同残基的百分比。就是说，如果需要在第一个序列中插入一个缺口而将其与第二个序列进行优化比较，那么相同性百分比则只通过对那些和相应氨基酸残基配对的残基进行计算(即：计算不考虑第二个人序列上处在第一个序列的“缺口”处的残基。)优化比较的定义是该比较可给出最高的相同性百分比数值。这种比较可以通过“GENEWORKS”程序进行。也可以利用局部比较程序LALIGN，以ktup1，缺省参数和缺省PAM来进行比较。
治疗一种疾病是指施用一种治疗性物质以有效减轻该病的症状和/或降低该病的严重程度。
II.干扰素τ的分离与鉴定
A.羊和牛的干扰素τ
1.干扰素τ的编码序列
羊干扰素τ(OvIFNτ)是在绵羊母体识别的关键时期，由胚胎滋养外胚层产生的一种主要的孕体分泌蛋白。一个成熟的OvIFNτ分离物长172个氨基酸(SEQ ID NO：2)。其cDNA编码序列包括在成熟蛋白的氨基端有额外的23个氨基酸(Imakawa，1987)，该OvIFNτ分离物的编码序列如图7中所示。
相对于其他的干扰素而言，OvIFNτ与干扰素α具有45％至68％的氨基酸同源性，并且与ω-干扰素(IFN ωs)具有最大的相似性，约为68％。
为了分离OvIFNτ蛋白，从怀孕绵羊中搜集孕体，并在前面所述的修正的最低基本培养基(Godkin等，1982)中体外培养。收集怀孕天数不同的孕体，交配的第一天记作第0天。基本按照Vallet等(1987)和Godkin(1982)的方法从孕体培养物培养基中纯化OvIFNτ。
OvIFNτ的均质性通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE；Maniatis等，1982；Ausubel等，1988)来检测。纯化的OvIFNτ的蛋白浓度通过二金鸡宁试验(BCA)(Pierce ChemicalCo.Rockford，IL；Smith，P.K.，等，1985)来确定。
与OvIFNτ同源的蛋白从牛中得到了分离(BoIFNτ；Helmer等，1987；Imakawa，1989)。OvIFNτ和BoIFNτ(i)在妊娠的母体识别中具有相同的功能，且(ii)在成熟蛋白中的氨基酸序列上具有高度的同源性。OvIFNτ和BoIFNτ的核酸序列同源性在5’非编码区为76.3％，在编码区为89.7％，在3’非编码区为91.9％。氨基酸的同源性为80.4％。
实施例1描述了OvIFNτ的生殖功能。OvIFNτ和重组人干扰素α2(rHuIFNα)以不同的浓度注入到母羊的子宫内腔中。通过测试发情间隔，孕酮分泌的保持和前列腺素分泌的抑制来检测黄体的生命周期，对这些测试结果数据的比较表明，当以100μg/天施用OvIFNτ时发情间隔明显延长，而施用rHuIFNα则无有意义的效果。这些数据支持OvIFNτ显著影响性欲周期中的生化事件的结论。
对在生殖周期的不同阶段干扰素τ的抗病毒特性也进行了测试(实施例2)。以16天发情周期的第12天的绵羊中得到的孕体建立孕体培养物。测试了每个孕体培养物上清中的抗病毒活性。培养物上清中具有的抗病毒活性，随着孕体的进一步发育不断增高，一直到第16天的后发情期。
2.IFNτ的重组产生
重组OvIFNτ利用细菌和酵母细胞产生。从OvIFNτ的氨基酸编码序列中得出相应的DNA编码序列，为在E.coli中表达(实施例3)而使用偏爱的密码子。该DNA编码序列通过相继添加寡核苷酸而合成构建。克隆的寡核苷酸如图2中所列，利用限制消化和连接而融合进入一个多核苷酸中。该多核苷酸编码序列具有如SEQ IDNO：1所示的序列。
为了表达重组干扰素多肽，例如合成的OvIFNτ或者本发明的杂合干扰素融合多肽，可将嵌合编码序列置于各种细菌表达载体中：例如，λgt11(Promega，Madison WI)；pGEX(Smith，D.B.等，1988)；pGEMEX(Promega)；和pBS(Strategene，La Jolla CA)载体。也可以使用其他的含有合适的启动子，如T7RNA聚合酶启动子或者tac启动子的细菌表达载体。实施例3描述了将合成的OvIFNτ多核苷酸克隆入一个经修改的pIN III omp-A表达载体中。通过加入IPTG诱导产生OvIFNτ蛋白。可溶性的重组IFNτ通过超声波或渗透分馏而从细胞中释放出来。
该蛋白可通过标准方法进一步纯化，包括大小分级分离(柱层析或预凝胶电泳)或者使用例如抗干扰素抗体(固相载体可从Pharmacia，Piscataway NJ获得)的亲和层析。蛋白制备物可以通过例如超滤(Amicon，Danvers，Mass)进行浓缩。
合成的OvIFNτ基因也可以克隆到酵母克隆载体pBS24Ub中(实施例4；Sabin等，1989；Ecker等，1989)。构建合成的接头子以使OvIFNτ的编码序列与载体上的蛋白质编码序列处于同一阅读框。形成的连接可使得遍在蛋白质序列与OvIFNτ序列能够在体内剪切开。
重组质粒pBS24Ub-IFNτ转化入啤酒酵母中。转化的酵母细胞经培养，裂解并将重组IFNτ(r-IFNτ)蛋白从细胞裂解物中分离。
r-IFNτ的量通过放射性免疫试剂定量。进行纯化的r-IFNτ的微量测序，结果显示与天然的OvIFNτ的前15个氨基酸相同。结果也证实遍在蛋白/IFNτ融合蛋白在体内经过了正确的加工。
通过此方法获得的重组IFNτ所表现的抗病毒活性与从孕体条件培养物培养基中纯化的IFNτ的抗病毒活性相似。
其他的酵母载体也可以用于本发明的实践中。它们包括2微米质粒载体(Ludwig等，1993)，酵母整合质粒(如Yips；Shaw等，1988)，YEP载体(Shen等，1986)，酵母着丝粒质粒(如Ycps；Ernst，1986)，等等。优选地，载体包括一个表达盒，它含有有效的酵母启动子，如MFα1启动子(Ernst，1986；Bayne等，1988)，GADPH启动子(甘油醛-3-磷酸脱氢酶；Wu等，1991)，半乳糖-诱导型GAL10启动子(Ludwig等，1993；Feher等，1989；Shen等，1986)，或者甲醇调控的乙醇氧化酶(AOX)动子。AOX启动子在巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞中尤为有用(例如，AOX启动子用于可从Invitrogen，SanDiego，CA获得的毕赤氏酵母表达试剂盒内的pHIL和pPIC载体中)。
该表达盒中也可以包括其他的元件，以助于重组蛋白的表达和纯化，并/或助于将该表达盒插入酵母的染色体上。例如，元件盒中可包括一个信号序列以指导蛋白的分泌。一个适用于各种酵母表达载体的典型的信号序列为MFα1前原信号序列(Bayne等，1988；Ludwig等，1993；Shaw等，1988)。其他的信号序列也可以使用，例如，Phol信号序列(Elliot等，1986)在巴斯德毕赤氏酵母和粟酒裂殖糖酵母宿主细胞中尤为有效。
典型的表达盒包括(i)一个含有(5’到3’)AOX启动子，Phol信号序列，和编码OvIFNτ的DNA序列的元件盒，和(ii)用于在啤酒糖酵母宿主细胞中表达的一个含有(5’到3’)MFα1启动子，MFα1前原信号序列，和编码本发明的干扰素组合物的DNA序列的元件盒。
另外的可适用于本发明的酵母载体包括，但不局限于，其他的可调控表达的载体(Hitzeman等，1988；Rutter等，1988；Oeda等，1988)。典型的酵母转化宿主为啤酒裂殖糖酵母，但是，如上所述，其他的可适用于本发明的酵母也可使用(如，粟酒裂殖糖酵母，巴斯德毕赤氏酵母等等)。
编码这种干扰素多肽的DNA序列可以克隆到任何一种商业可得的载体上，而在适当的宿主系统中得到该多肽的表达。这些系统包括上述的细菌和酵母表达系统，同样也包括下列：杆状病毒表达(Reilly等，1992；Beames等，1991；Clontech，Palo Alto CA)，植物细胞表达，转基因植物表达(如，S.B.Gelvin和R.A.Schilperoot，PlantMolecular Biology，1988)，和哺乳动物细胞中的表达(Clontech，PaloAlto CA；Gibco-BRL，Gaithersburg MD)。这些重组多肽可以作为融合蛋白或作为天然蛋白表达。一些特性可以被引入载体中，例如能促使表达序列分泌到培养基中的前导序列。重组产生的多肽典型地可以从裂解的细胞或培养基中分离。纯化可按照本领域所熟知的方法进行，包括分子筛，离子交换层析，和亲和层析。可按照如上所述，利用基于IFN多肽产生的抗体应用免疫亲和层析。
B.人干扰素τ
1.编码干扰素τ蛋白的人基因组序列的鉴定和克隆.
对人基因组DNA扫描与干扰素τ的同源序列(实施例5)。确定出几个与OvIFNτcDNA探针杂交的序列。然后分离出含有部分人干扰素τ序列的克隆(实施例6)。合成了两个相应于OvIFNτ的cDNA序列(Imakawa等，1987；Whaley等，1994)的25-mer寡核苷酸。这些引物用于扩增反应，其中所用的DNA来自下列两个cDNA文库：从足期胚胎分离的人胎盘和细胞滋养层细胞。所得到的扩增的DNA片段经电泳分离，并分离出来含有人IFNτ扩增产物的条带。扩增产物进行亚克隆，插入的扩增产物通过双脱氧终止法测序。
对来自五个这样的克隆的序列的比较表明，虽然这些分离物间存在高度的序列同源，但是序列并不完全一致。该结果提示人干扰素τ基因多重变异的存在。对这些核苷酸和蛋白质序列的分析提示，根据序列同源性人干扰素τ基因可至少分成三个组。这些组如下面所示。
实施例7描述了几种全长人IFNτ基因的分离。高分子量DNA经分子筛分离自人外周血单核细胞(PBMCs)。通过聚合酶链反应检测分离组份中IFNτ的存在：检测出扩增阳性的组份中得到DNA分子用作制备一个λgt11的亚基因组文库。
该亚基因组文库铺板并与OvIFNτ的cDNA探针杂交(实施例7A)。检出大约20个与该探针杂交上的克隆。相应于阳性克隆的噬斑进行了传代，通过利用OvIFNτ引物的扩增反应分离并分析DNA。这二十个噬斑中，有六个产生出阳性信号。这六个克隆的噬菌体被纯化，插入子被测序。来自这六个克隆的一个插入子用作下面扫描的杂交探针。
利用刚才所述的杂交探针对来自该λgt11亚克隆的重组噬菌体进行扫描(实施例7B)。分离到五个显示出阳性杂交信号的克隆，对插入子测序。这些克隆的三个序列相重叠，得到的共有核酸序列(HuIFNτ1)如SEQ ID NO：11所示，其预测的蛋白质编码序列如SEQ ID NO：12所示。预测的成熟蛋白编码序列如SEQ ID NO：4所示。来自另外两个克隆的序列如SEQ ID NO：29(HuIFNτ2)和SEQ ID NO：31(HuIFNτ3)所示。预测的来自HuIFNτ3的氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示，而成熟的氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示。
对一个人干扰素τ基因(SEQ ID NO：4)与羊干扰素τ基因的预测蛋白序列的比较(图3)显示出在氨基酸水平上的序列同源性。
本文描述的(实施例6和7)7个人干扰素τ核酸序列与羊干扰素τ的核酸序列的排列比较如图19A和19B所示。OvIFNτ(oIFNτ)，HuIFNτ1，HuIFNτ2和HuIFNτ3的序列从图19A的左上角开始，以ATG密码子为起始，一直到该图的第二页。HuIFNτ4，HuIFNτ5，HuIFNτ6和HuIFNτ7的序列在图19A约中途部分，于氨基酸位置40的CAG(叹号的右侧)开始，直到该图的第二页。HuIFNτ4，HuIFNτ5，HuIFNτ6和HuIFNτ7每个克隆的3’和5’末端以叹号标记。
完整的OvIFNτ编码序列列于每组排列比较的顶行。其他序列的核苷酸只有在与OvIFNτ的核苷酸不相同的位置上才标出。小写字母代表不会导致氨基酸变化的核苷酸，大写字母代表导致氨基酸替换的核苷酸。
按照与上述基本相同的方法构建的这7个相应的氨基酸序列的一个排列比较如图20A和20B所示。同上，完整的OvIFNτ编码序列列于每组排列比较的顶行。其他序列的氨基酸只有在与OvIFNτ的不相同的位置上才标出。
对排列比较的检测揭示这7个序列可分成至少三个组别。组I含有HuIFNτ1和HuIFNτ2，组II含有HuIFNτ3，HuIFNτ4和HuIFNτ5，而组III含有HuIFNτ6和HuIFNτ7。这些组代表了具有不同细胞功能的干扰素τ基因家族。
分组的建立基于下列标准。在成熟的蛋白中，组I的HuIFNτ的第95位氨基酸(编号参考图20A至20B)为天冬酰铵(ASN)，第104位氨基酸为甲硫氨酸(MET)及第120位氨基酸为亮氨酸(LEU)。组II的HuIFNτ的第95位氨基酸为天冬氨酸(ASP)，第104位氨基酸为苏氨酸(THR)及第120位氨基酸为甲硫氨酸(MET)。组III的HuIFNτ的第72位氨基酸为精氨酸(ARG)，第120位氨基酸为缬氨酸(VAL)及第122位氨基酸为丝氨酸(SER)。
人IFNτ核酸序列和多肽序列如下所示：SEQ ID NO：3，SEQ IDNO：4，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：11，SEQ IDNO：12，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34。它们可以作为特异引物和探针的来源，用于以后的人IFNτ编码序列和/或假基因分离物的检测。而且，如上所述，每个物种中可能有一个以上的IFNτ蛋白的异构型和一个以上的编码序列。本发明实践中所用的特异核酸探针以及与多肽反应的抗体，可按照本发明在此公开的方法，用于分离哺乳动物中尚未鉴定的干扰素τ变异体。
2.人组织中干扰素τ表达的鉴定
人胎盘cDNA文库和羊cDNA文库通过与OvIFNτcDNA探针(实施例8)杂交进行分析。该DNA杂交分析提示，来自人cDNA文库的IFNτ信号约为来自羊cDNA文库的信号的1/100。OvIFNτcDNA占羊cDNA文库的约0.4％。所以，人cDNA对OvIFNτ探针的丰度显得很低，至少对于产生该cDNA文库的胎盘来说。
还分析了人胎盘和羊膜中HuIFNτmRNA的存在。结果提示在胎儿胎盘附件中存在HuIFNτmRNA。羊膜细胞也表达与OvIFNτ引物和人探针相关的信息，说明HuIFNτmRNA的表达并不限于胎盘。
通过原位杂交检测了人组织中干扰素τ的表达(实施例9)。检测了4个健康的，不同足月的和头三月的人胎盘的分泌。分析中使用了一个衍生自OvIFNτcDNA序列的cDNA探针(实施例9B)。用一个反义RNA探针进行杂交。在三个独立的实验中，所有足月的和头三月的胎盘组织都呈现出特异杂交。
头三月胎盘绒毛(由外层的合胞滋养层，底层的细胞滋养层，以及含有各种间充质的中央基质区组成)在其细胞滋养层和基质细胞中都表现出最高的表达水平。相类似的转录表达类型也显现在足月组织的胚胎绒毛中，但是检测到的信号水平很低。头三月的外绒毛滋养层显现出最强的信号和染色阳性，当存在于蜕膜中母血空间时。
Howatson等，(1988)纪录了头三月和足月组织中的绒膜绒毛的合胞滋养层都有IFNτ产物。另外，Paulesu等(1991)发现在合胞滋养层和外绒毛滋养层都有IFNτ，与足月的比较，在头三月胚胎有更强烈更丰富的反应性。这些调查中使用对人IFNα亚型的增强抗体，在绒毛细胞滋养层未发现任何IFNα。
这些结果表明人IFNτ基因在早期胚胎组织中由迁移的外绒毛滋养层高表达，但也在合胞滋养层、细胞滋养层和各种基质细胞中表达。这些结果表明检测出了在人妊娠组织中的IFNτ转录本，以及头三月期胚胎的绒毛细胞滋养层和外绒毛滋养层中IFNτ的表达。
C.干扰素τ的抗病毒特性
OvIFNτ的抗病毒活性在抗一些病毒方面，包括RNA和DNA病毒，已有证实。均一纯化的OvIFNτ的相对特异活性已经用于抗病毒分析(实施例10)。无论比rBoIFNα或rBoIFNγ，OvIFNτ都具有较高的抗病毒活性(实施例10，表3)。
本发明的一个优点在于，OvIFNτ具有有效的抗病毒活性而只有有限的细胞毒效应。对暴露于猫AIDS和人AIDS逆转录病毒的外周血淋巴细胞，用高度纯化的OvIFNτ检测其抗逆转录病毒活性和其细胞毒效应(Bazer等，1989)。猫AIDS慢病毒在猫中产生慢性的类似AIDS的综合症，可作为人AIDS的一个模型(Pederson等，1987)。两种病毒在外周血淋巴细胞(PBL)中的复制通过一定时间内培养上清中的逆转录酶(RT)来监测。
为了确定IFNτ对FIV和HIV的抗病毒活性，在经OvIFNτ处理的FIV-和HIV-感染的猫和人的PBL培养物中测定RNA依赖的DNA聚合酶RT的活性(实施例11)。当细胞在OvIFNτ存在下培养时，FIV的复制被降低至对照值的约三分之一。OvIFNτ的加入导致逆转录酶(RT)活性的迅速的、剂量依赖性的降低(实施例11，表4)。低至0.62ng/ml浓度的IFNτ可抑制病毒复制，而更高的浓度(40ng/ml)具有更高的抑制RT活性的作用，但没有对细胞的毒性效应。该结果提示，当细胞在OvIFNτ存在下培养时，与对照值比较，猴免疫缺损病毒的复制被显著降低。
IFNτ表现出对于逆转录病毒的宿主细胞不显现细胞毒性效应。在IFNτ在培养基中存在浓度达到40ng/ml也是如此。这一浓度相当于干扰素α的约8000抗病毒单位—在对OvIFNτ和HuIFNα分别进行的测试其保护Madin-Darby牛肾细胞防止被疱疹口炎病毒裂解的能力的试验中证明了这一点(裂解试验如Pontzer等1988所述)。
还测试了IFNτ在人细胞中抗HIV复制的活性。已感染HIV的人外周血淋巴细胞用不同浓度的IFNτ处理(实施例12)。通过不同时间内逆转录酶活性来对外周血淋巴细胞中HIV的复制进行监测。在一系列的IFNτ浓度下产生了显著的抗HIV作用。仅6天中10ng/ml的浓度就导致RT活性50％以上的降低。10天中500ng/ml的浓度导致RT活性90％的降低。而且，IFNτ的施用没有任何的细胞毒性效应(实施例12，表5)。
而且，通过在以HIV感染的同时，以不同剂量的其他的重组IFNτ或者重组人IFNα处理人PBMC细胞，对IFNτ的抗HIV效果进行了评估(实施例19)。这些实验的数据(实施例19，表11)支持这样的结论：以相似的浓度，IFNα和IFNτ可有效地降低人淋巴细胞中HIV的复制。但是，以IFNα处理细胞会产生细胞毒性，而用IFNτ处理却未发现这种细胞毒性，即使是用高得多的IFNτ浓度。使用IFNτ未发现细胞毒性，即使当IFNτ以相当于αII-干扰素的200倍的剂量使用时也是如此。
FIV和HIV的逆转录酶本身都不受PBL中IFNτ存在的影响。因此，抗病毒活性不是因为对病毒RT的直接作用。
干扰素τ还表现出对肝细胞中乙型肝炎病毒DNA复制的抑制(实施例19)。通过一个来自转染了乙型肝炎病毒(HBV)的肝细胞的人细胞系测试IFNτ的抗病毒效果。以一系列浓度的IFNα和IFNτ处理细胞。与无干扰素的对照相比，IFNα和IFNτ都两倍地降低了DNA的产生。
为了表明干扰素特异地作用于感染病毒而不导致对普通肝细胞代谢的影响，检测了该肝细胞中IFNα和IFNτ对肝细胞特异的mRNA产物的作用(实施例19)。用杂交分析检测了两个肝细胞特异的蛋白，Apo E和Apo A1。高达40000单位/ml的IFNα或IFNτ浓度下，两个肝细胞特异的mRNA产物都没有明显的降低。而且，该试验中没有看到表明IFNτ的肝细胞毒性的证据。
还评价了重组羊干扰素IFNτ(roIFNτ)对羊慢病毒(OvLV)复制的作用。通过以连续稀释的OvLV感染山羊滑液膜细胞试验体外作用。受感染的细胞每天用roIFNτ处理(0-2500抗病毒单位/ml(AVU/ml))6至12天，检测病毒的复制和致细胞病变效应(CPE；如实施例2)。
评价方法包括病毒生长曲线、细胞增殖试验(例如实施例13，14或15所述)、多核构成试验(例如，如Nagy等1983；Dalgleish等1964所述)、以及通过PCR和逆转录酶试验(Mullis，1987；Mullis等，1987)对原病毒DNA的定量。在经roIFNτ处理的培养物中出现OvLV滴度的降低(p＜0.00)和CPE(80-99％)。
通过对24只新生羊羔接种5×106TCID的OvLV毒株84/85试验roIFNτ的体内活性。11只这样的羊羔每天以105-106AVU/Kg的roIFNτ处理进行30天后接种(PI)，以后每周两次。13只羊羔作为对照。通过端点稀释法确定病毒滴度，两组的最高值都出现在PI的4-6周。相对于对照动物，经roIFNτ处理的羊羔的OvLV滴度降低了。相对于对照动物，在4周PI中经处理的动物中OvLV滴度最大降低了90％(p＜0.01)。
上述的OvLV的研究表明重组ovIFNτ能够显著地降低OvLV复制，并提示IFNτ可用于控制由慢病毒感染导致的临床疾病。结合其他的抗病毒数据，这些结果提示IFNτ是一种有效的抗病毒剂，可对付广泛的各种病毒，包括RNA病毒和DNA病毒。
本发明的干扰素组合物可用于兽医应用，包括但不限于对下列病毒疾病的治疗：猴白血病病毒，羊进行性肺炎，羊慢病毒，马感染性贫血病病毒，牛免疫缺损病毒，维斯纳—梅迪病毒，以及山羊关节炎脑炎病毒。
人来源的干扰素组合物可用于，例如，下列病毒疾病的治疗：人免疫缺损病毒(HIV)，丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)。
D.IFNτ的抗增殖特性
还对IFNτ在细胞生长中的作用进行了检测。在一个分析中，通过集落抑制试验(实施例13)检测了抗细胞生长活性。人羊膜(WISH)或MDBK细胞以低细胞密度铺板以产生来自单细胞的集落。稀释的干扰素被加入到培养孔中，孵育培养板使集落形成。IFNτ在这些试验中抑制集落的大小与数量。在抑制人细胞系(WISH)的细胞增殖上IFNτ比IFNα更为有效。IFNτ的抗细胞增殖活性是剂量依赖性的。高浓度的IFNτ使增殖停止，但细胞的存活性并未受损。
根据流式细胞计数进行的细胞周期分析，IFNτ表现为抑制细胞通过S期的进程。这些结果表明了IFNτ的抗增殖效应，并突出了它的低细胞毒性。
IFNτ的抗增殖效应也在大鼠和牛的细胞系中进行了研究(实施例14)。利用3H-胸腺嘧啶的掺入率来确定细胞增殖的比率。获得的数据表明IFNτ对每种测试的细胞系都强烈地降低了细胞增殖的比率(实施例14，表7)。
利用一系列的人肿瘤细胞系进一步对IFNτ的抗增殖活性和低细胞毒性作了检测(实施例15)。利用NIH扫描抗肿瘤剂程序(Pontzer等，1991)从标准细胞系中选出了不同的人肿瘤细胞系。每个肿瘤类别中至少选出一个细胞系进行检测。
下列细胞系得自美国典型培养物保藏中心(12301，Parklawn Dr.，Rockville MD 20852)：
NCI-H460    人肺大细胞癌
DLD-1       人结肠腺癌
SK-MEL-28   人恶性黑色素瘤
ACHN        人肾腺癌
HL-60       人早幼粒细胞白血病
H9          人T细胞淋巴瘤
HUT 78      人皮肤T细胞淋巴瘤；和
MCF7        人胸腺癌
同上，通过对经IFNτ处理的细胞中3H-胸腺嘧啶的掺入率的测量来确定抗增殖活性。按照Scheffe的F-测验进行的差异分析得出各处理间存在显著的差异。通过流式细胞计数进行细胞周期分析。
IFNτ对MCF7(人胸腺癌)的抑制的测试表明IFNτ以剂量依赖方式降低了MCF7的增殖。10000单位/ml的IFNτ导致3H-胸腺嘧啶50％的降低(实施例15，表8)。该细胞系以前曾发现对抗雌激素的处理无反应。
利用HL-60(人早幼粒细胞白血病)细胞获得了对IFNτ和IFNα抗增殖效应的比较。人早幼粒细胞白血病HL-60细胞中对IFNτ和IFNα的比较的结果是典型的(实施例15)。两种IFN浓度低至100单位/ml时都产生了显著的生长下降(＞60％)，IFN量的增加进一步降低肿瘤细胞的增殖(图4)。高剂量的HuIFNα具有细胞毒性，而OvIFNτ则没有(图5)。IFNα导致细胞存活性下降了约80％。相反，当应用10000单位/ml的IFNτ时，近100％的IFNτ处理的细胞保持存活。没有毒性对IFNτ用于体内治疗提供了一个优势。
当用IFNτ处理时，人皮肤T细胞淋巴瘤HUT 78的反应与HL-60相似(实施例5，表9)。OvIFNτ和rHuIFNα都降低了HUT78的细胞生长，但是IFNα对细胞存活有副作用。
人T细胞淋巴瘤H9比上述的其他肿瘤细胞系对IFNα的抗增殖效应的敏感性低。虽然IFNα对H9细胞没有毒性，但它在任何的测试浓度下都无法显著地抑制细胞分裂(实施例15，表10)。相反，发现IFNτ可降低H9生长的约60％。因此，只有OvIFNτ是一种对该T细胞淋巴瘤的有效的生长抑制剂。
在其他的三种细胞系中(NCI-H460，DLD-1和SK-MEL-28)，IFNτ和IFNα是同样有效的抗肿瘤剂。在黑色素瘤SK-MEL-28中IFNα的抑制附带着13％的存活性下降，而IFNτ则没有毒性。在测试的大部分肿瘤中，IFNτ在作为抗人肿瘤的抗肿瘤剂上等同于或者优于IFNα。
IFNτ表现出对人肿瘤细胞的无毒性抗增殖效应，它与人IFNα相比同样有效或者更为有效。IFNα2的临床试验表明它们是有效的抗瘤剂(Dianzani，1992；Krown，1987)。作为一种治疗剂，IFNτ的一个优势在于它消除了高剂量IFNα所带出的毒性效应。
IFNτ的另一个应用是抗Kaposi肉瘤类肿瘤(与HIV感染相关)，此时IFNτ的抗肿瘤效应与IFNτ的抑制逆转录病毒生长的能力相偶联。
在一个小鼠系统中测试了干扰素τ治疗的体内效力(实施例16)。B16-F10是一种性细胞遗传的小鼠可移植性肿瘤，它具有肺转移的高发生率(Poste等，1981)。植入肿瘤细胞后3天开始干扰素处理。IFNτ的体内施用强烈地减少了B16-F10肺肿瘤。因此，IFNτ在体内和在体外一样表现为一种有效的抗肿瘤剂。
这些结果提示本发明的干扰素组合物可用于抑制或者降低肿瘤细胞生长的方法中，包括但不局限于下列类型的肿瘤细胞：人癌细胞、造血癌细胞、人白血病细胞、人淋巴瘤细胞、人黑色素瘤细胞和类固醇敏感性肿瘤细胞(例如乳房瘤细胞)。
E.I型IFN对自身免疫紊乱的治疗
本发明的组合物和方法可用于治疗，从而减轻各种由于“超强”或者“衰退”的免疫系统功能而导致的免疫系统紊乱。这种紊乱包括超变态反应和自身免疫紊乱，例如多重硬化症、I型(胰岛素依赖型)糖尿病、红斑狼疮、肌肉萎缩性侧生硬化症、Crohn氏病、风湿性关节炎、口炎、哮喘、过敏反应、牛皮癣等等。
F.口服IFNτ的效果
在用于疾病的治疗或者用IFNτ改善疾病状况方面，例如对自身免疫疾病(如多重硬化症)，本发明进行的支持实验表明口服IFNτ多肽组合物的效力可以比得上注射IFNτ组合物。
在对能因IFNτ处理而改善的疾病的治疗中，口服施用IFNτ不仅有效，而且，口服施用相对于注射IFNτ组合物的治疗，还具有意外的优点。例如，口服施用IFNτ在受治疗个体的血清中产生明显低水平的抗IFNτ抗体。这点很有益处，因为口服施用的IFNτ就几乎不可能被宿主免疫系统无效呈递(就是说，对治疗不敏感和/或剂量水平显著的低)，而接受治疗的个体就可能不用忍受这类免疫应答导致的副作用。
G.干扰素的细胞毒性
相对于其他干扰素例如IFNα来说，IFNτ的一个优点在于，以治疗剂量的IFNτ对一个个体的处理并不产生相关的毒性。尤其是，在一个IFNβ可产生毒性的浓度下，IFNτ表现出无毒性。通过以不同的浓度，范围从6000U/ml至200000U/ml，的oIFNτ或MuIFN-β(Lee Biomolecular，San Diego，CA)处理L929细胞的实验可以证明这点(实施例19E)。
oIFNτ，MuIFN-β或培养基(对照)在时间为零时加入，细胞孵育72小时。该实验的结果列于图21。活细胞的百分比(相对于对照)沿y轴表示(带标准差)。100％相当于只用培养基处理的L929细胞的存活性。结果显示oIFNτ在浓度高至100000U/ml时基本无毒性，而且在该化合物整个的治疗范围内显著低于MuIFN-β的毒性。
先前有证据表明两种I型IFN，IFNβ和IFNα在人和动物的体内治疗中会产生毒性，这些各种副作用的证据包括发烧、嗜睡、心动过速、体重下降和白细胞减少(Degr，1974；Fent and Zbinden，1987)。在体内IFNτ，IFNβ和IFNα(105U/每次注射)的处理对NZW小鼠总白细胞(WBC)、总淋巴细胞数和体重(表13)的影响如实施例19所述进行了测试。在WBC，淋巴细胞数和体重变化上，IFNτ处理的与未处理的小鼠间没有明显的差别。
相比之下，IFNβ处理的小鼠的白细胞数在注射12小时后下降了31.7％。而且，IFNβ注射后白细胞数持续下降了24小时。IFNα处理的小鼠在注射12小时后显现出55.8％的白细胞下降和显著的体重下降。其他的支持本发明的实验表明IFNτ在高剂量时不抑制骨髓。因此，在外周血和体重测量的研究所提供的证据中，IFNτ不同于IFNβ和IFNα，它无毒性。如下面所述，进行的支持本发明的实验提示，相对于IFNβ和IFNα来说IFNτ的低毒性，如前面所小结的，可能是因为N末端IFNτ的37个氨基酸序列的存在，而以这些序列替换了相应的非τ-I型干扰素，如，IFNβ和/或IFNα，可能导致在所得到的杂合干扰素多肽中具有减低的细胞毒性。
III.干扰素τ多肽片段和I型干扰素受体被IFNτ与IFNα的差异识别
A.IFNτ多肽片段
正如本文所教导的IFNτ的各种活性、其效力和无细胞毒性提示出对这种新型干扰素结构/功能分析的重要性。利用对应于整个OvIFNτ序列的6个合成的重叠肽对OvIFNτ功能的结构基础进行了测试(图6)。衍生自羊IFNτ序列的相应多肽如SEQ ID NO：5和SEQID NO：10所示。三个相应于氨基酸1-37，62-92和139-172的多肽表现出对IFNτ抗病毒活性的抑制(实施例17)。这些多肽在300μM以上的浓度时是有效的竞争物。
对应于ovIFNτ的C末端区域的合成肽，OvIFNτ(139-172)和内部肽(62-92)，在相同的范围内抑制IFNτ和rBoIFNτ的抗病毒活性，而N末端的OvIFNτ(1-37)对抑制OvIFNτ抗病毒活性更为有效。剂量依赖性数据表明IFNτ(62-92)和IFNτ(139-172)在相同的范围中抑制IFNτ的抗病毒活性程度相似。阻断IFNτ抗病毒活性的相同肽同样也阻断重组牛IFNα(rBoIFNα)的抗病毒活性；重组IFNγ不受这些肽的影响。这两个IFNτ肽可能代表着IFNτ和各种IFNα的通用受体结合区域。
两个合成肽OvIFNτ(1-37)和OvIFNτ(139-172)也阻断OvIFNτ抗FIV和抗HIV的活性(实施例17；图11A和11B)。虽然这两个肽都阻断FIV RT活性，但是只有C末端肽OvIFNτ(139-172)表现出在马细胞系Fc9中是疱疹口炎病毒活性的有效抑制物。
多克隆抗肽抗血清对IFNτ肽的作用结果与上述的多肽抑制研究的结果相似。对同样的这三个区域(OvIFNτ(1-37)，IFNτ(62-92)和IFNτ(139-172))的抗体阻断了OvIFNτ的功能，这证实了这三个功能区在抗病毒活性中的重要性(实施例17)。这些肽虽然表现出与干扰素受体的结合，但是它们本身并不对细胞产生类似干扰素的效应。
IFNτ的抗增殖活性(实施例17，表11)涉及该分子的另一个区域，因为IFNτ(119-150)是对OvIFNτ导致细胞增殖降低最有效的抑制物。此结果提示该分子中主要负责对细胞生长抑制的区域是IFNτ(119-150)区域。IFNτ分子的这个区域可单独或者与其它蛋白(如血清白蛋白，抗体或者干扰素α)相融合作为一个抗肿瘤药剂应用。来自人干扰素的N末端肽和血清白蛋白之间的偶联蛋白显现出具有抗细胞增殖的活性(Ruegg等，1990)。
最后，125I-OvIFNτ与MDBK细胞中其受体的结合可以被这6个肽中的4个的抗血清所阻断；这4个肽相应于OvIFNτ的1-37，62-92，119-150和139-172位的氨基酸。这反映出了多个结合功能区以及这些区域在功能上的重要性。由于IFNτ不同的区域涉及不同功能的产生，因此对有选择的氨基酸的修饰可能得到带有选定的生物功能的IFNτ类干扰素。
根据上述所提供的关于OvIFNτ多肽片段的数据，结合本文在此公开的HuIFNτ序列信息，可提示具有上述的OvIFNτ多肽相似的特性的人IFNτ蛋白的多肽片段。这些人序列衍生的多肽包括，但不限于：SEQ ID NO：15至SEQ ID NO：20，以及SEQ ID NO：35至SEQ ID NO：40。
B.IFNτ和IFNα对I型干扰素受体的作用与相互作用
与上述的和实施例17所述的肽拮抗剂研究相一致，实施例18中所述的实验表明，高浓度(高至10倍过量)的OvIFNτ在MDBK细胞中与人IFNαA无法竞争受体和阻断其毒性效应。从对OvIFNτ和人IFNαA相应的抗病毒，细胞毒性，受体结合以及受体竞争反应等特性的比较中得到了在配体-受体相互作用水平上的认识。IFNτ和IFNαA具有相似的特异抗病毒活性，如先前所示(Pontzer等，1988)。但是，如实施例18所示，IFNαA比IFNτ的Kd低约10倍，且因此与受体具有较高的结合亲和力。而且在用125I-IFNτ或者125I-IFNαA进行的结合竞争试验中IFNαA比IFNτ的效力高数倍(图24A，24B)。由于每个细胞中对IFNτ和IFNαA的结合位点的数量很相似，而IFNτ与IFNαA竞争结合，所以似乎IFNαA和IFNτ识别相同的受体复合物。
对细胞毒性和抗病毒活性的剂量反应/占据曲线的比较(图27A和27B)表明细胞毒性与最大受体占据量，进而与结合亲和力相关；IFNαA具有较大的亲和力因而具有实际上较大的毒性。相反，抗病毒活性只有在导致很少的受体占据量的浓度时最大，而并不为饱和结合数据所反应。
支持本发明的实验还表明羊IFNτ，同IFNαA一样，可以诱导I型受体相关激酶Tyk2和转录因子Stat1α和Stat2的迅速磷酸化。一定时间内的IFNαA和IFNτ的刺激，只有少部分的受体需要被占据以诱导Tyk2，Stat1α和Stat2的磷酸化。和起来，这些数据提示这些信号转导蛋白可能不足以诱导与“其他”的I型IFN(即：除IFNτ的I型IFN)相关的细胞毒性。
IFNαA对受体较高的亲和力以及IFNτ和IFNαA不同的竞争特性还提示两种IFN识别不同的受体。利用合成的肽拮抗物进行的支持本发明的实验，包括如实施例17所述的实验，表明C末端肽IFNτ(139-172)(SEQ ID NO：10)与IFNαA和IFNτ活性都具有竞争性，而N末端肽IFNτ(1-37)(SEQ ID NO：5)在5至10倍的高浓度下只对IFNτ活性有效。使用抗IFNτ(139-172)和IFNτ(1-37)的抗血清的实验表明IFNτ(1-37)的抗血清只阻断IFNτ的结合，而IFNτ(139-172)的抗血清对IFNαA和IFNτ的结合都阻断。这些数据提示IFNαA和IFNτ的N末端部分代表着重要的高亲和力结合的决定蔟，且IFNαA和IFNτ之间高亲和饱和结合的差异是由于受体与这些分子的N末端相互作用的差异。因此，这些分子末端也表现为IFN细胞毒性效应重要的决定蔟。
C.杂合干扰素融合蛋白
上述数据和起来提示I型干扰素的C末端区域结合于I型干扰素受体的一个通用位点(即一个对IFNαA和IFNτ的受体激活特性都有影响的位点)，而N末端区域可能关系到特定功能的行使(即结合于一个仅对IFNτ的受体激活特性都有影响的位点)，数据尤其提示N末端区域决定了相对于其他I型干扰素如IFNα来说IFNτ细胞毒性的下降。
本发明使用的发现涉及IFNτ的N末端区域提供的减低的毒性，利用嵌合DNA结构产生杂合干扰素融合蛋白，该蛋白拥有一个衍生自IFNτ的N末端部分和一个衍生自非τI型干扰素多肽的C末端部分。后者作为治疗剂的效力因其相对高的毒性而减小。这种非τI型干扰素多肽包括IFNβ和的IFNα各种异构形式。
参考图28，这样的一个杂合干扰素融合蛋白或多肽40，由一个嵌合核酸分子编码，拥有一个N-末端42和一个C-末端44。该融合蛋白由第一个(N端)片段46和第二个(C端)片段48组成。N末端片段含有一个干扰素τ多肽的N末端氨基酸序列，它由该嵌合核酸分子的5’端片段编码。C末端片段含有一个非τ-I型干扰素多肽的C末端氨基酸序列和一个干扰素τ多肽的氨基酸序列，它由该嵌合核酸分子的3’端片段编码。这两个片段接合或剪切于一个接合位点50，其所处的这个区域(接合区域)相应于成熟干扰素多肽约第8和第37位残基间的部分。注意：成熟的IFNτ多肽典型地起始于完整序列(包括前导序列和甲硫氨酸起始点)的第24位氨基酸的半胱氨酸。
该接合区域包含在上述实验中所用的37个氨基酸的N末端肽(SEQ ID NO：5)之内。对几种IFNτ，IFNα和IFNβ克隆的成熟氨基酸序列中第1至第37位间的氨基酸的排列比较表明，接近N末端的这些序列之间有着很大程度的差异。尤其是，序列之间最大程度的差异发生于第1位和第6位氨基酸间。第29位和第37位氨基酸之间的区域在不同的I型干扰素中相对的保守，它被认为与I型干扰素受体结合相互作用相关(Fish，1992)。
可以通过例如本文所描述的方法，利用相应于IFNτ(1-37)中或长或短的多肽序列或者编码多肽的DNA序列，结合本文所述的功能试验(例如，抗病毒，抗增殖和细胞毒性试验)鉴定出最佳的接合处(即：上游(朝向N-末端或5’端)氨基酸序列为干扰素τ，而其下游(朝向C-末端或3’端)为另一种干扰素如IFNα或IFNβ的氨基酸位置)。应理解的是，例如，本发明的含有干扰素-τ的第1-28位氨基酸和其余的来自其他非τ-I型干扰素的氨基酸的杂合或嵌合干扰素，具有与干扰素-τ相关的低毒性，同时也具有来自该I型干扰素的生物活性。例如，一个IFNτ/IFNα杂合蛋白可以，例如，降低IFNα的毒性但不影响IFNα的抗病毒特性。
如上所述，本发明的干扰素融合蛋白的氨基酸序列中，成熟序列的前面约8至37个氨基酸为IFNτ分子的序列，而其余的氨基酸为一个非τ-I型干扰素多肽的序列。样板序列中干扰素融合蛋白的前面8至37个氨基酸可从本文所提供的下列序列中选出：SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：50，SEQ IDNO：51，SEQ ID NO：52，和SEQ ID NO：53。
其余的序列(即：“第二个”氨基酸序列，C端片段，它由嵌合核酸分子的3’端片段编码)可以选自人和适当的非τ-I型干扰素多肽。如干扰素α(例如，α-1或α-2)、干扰素β、干扰素ω、杂合干扰素或共有干扰素。τ-I型干扰素的序列为本领域所熟知。例如，Gunther等，1990，Leibowitz等，1990，Goeddel，1983，1984，1987和Creasey等，1986，1988所提供的杂合干扰素的样板序列。Stabinsky，1990提供了共有干扰素的样板序列。Capon，1983，Dworkin-Rastl，1989，Sato，1988和Sloma，1988提供了干扰素α的样板序列。Fish，1992提供了其他的干扰素α和干扰素β的序列。也可以从GenBank或其他的公共序列库中获得适当的序列。
对非τ-I型干扰素氨基酸残基中3’端或C末端片段的起始位置的确定，是通过对母本序列进行优化对比并构建一个接合区，从而得到的嵌合干扰素分子的序列与(i)在5’端或N端片段的母本干扰素-τ序列以及(ii)在3’端或C端片段的母本非τ-I型干扰素序列完美排列对比。这里的母本序列当然是指5’端或N端片段和3’端或C端片段所来自的干扰素序列。
非τ-I型干扰素氨基酸残基中3’端或C末端片段的起始位置典型地为紧接于5’端或N端干扰素-τ序列片段的最后一个氨基酸残基。例如，在一个杂合干扰素中，其前10个氨基酸序列为SEQ ID NO：5的前10个氨基酸，其余的氨基酸序列是成熟的干扰素α(例如，IFN-αCon，如Fish，1992所述)减去干扰素α的前10个氨基酸。
本发明的优选的实施方案是N端和C端片段都来自人干扰素序列的融合蛋白。例如，构建产物中的前面，例如，28个氨基酸为SEQID NO：15或SEQ ID NO：35的前28个氨基酸，而其余序列为人α或干扰素β的部分。人干扰素-τ序列如Bazer等，1994所述。人干扰素α或干扰素β的序列可从GenBank中获得。
应当理解，虽然所描述的干扰素融合蛋白是“成熟”蛋白，即，它们开始于完整干扰素序列的第24个残基，但是本发明也包括含有前导肽(即，开始于起始甲硫氨酸)的融合蛋白和编码融合蛋白的嵌合核酸分子。在此干扰素融合蛋白中的前导序列可来自一个τ或非τ-I型干扰素。
进而，应当理解第一个和第二个片段的序列可以是“共有”序列。就是说，5’片段的序列可以不是一个“天然的”IFNτ，而是一个通过对几种不同的IFNτ排列比较而获得的共有序列。类似地，3’片段的序列可以不是一个“天然的”非τ-I型IFN，而是一个通过对几种不同的非τ-I型IFN排列比较而获得的共有序列。
另外，每个片段的序列可以是一种“内在一致的”序列，即，一个序列中的各个位点所含有的残基至少可以在一个IFNτ(对于N端片段而言)或者非τ-I型IFN(对于C端片段而言)的天然存在的异构型中找到。例如，如果两个异构型，每个长3个氨基酸，含有序列“CRS”和“CKG”，那么一个内在一致的序列是“CRG”。
而且应当理解，本发明还包括更为复杂的嵌合体，例如，含有一个以上的来自IFNτ的不连续区域和/或一个以上的来自其他干扰素的区域。这种嵌合体可以在如下情况下获得，例如，当非τ-I型IFN的第二个(C端)片段本身是一个杂合干扰素，由例如干扰素α和干扰素β(Creasey等，1986，188)，α1和α2干扰素(Leibowitz等，1990)或干扰素α或和ω-干扰素(Gunther等，1990)构成。
如上面所指出的，本发明的杂合干扰素融合蛋白组合物的一个明显优势是降低了组合物的毒性，相对来说，天然的非τ-I型IFN，例如已被证实了在作为治疗剂时具有毒性。该杂合组合物可具有与非τ-I型IFN相同的生物学活性及IFNτ的低细胞毒性。
嵌合核酸分子可以通过合成或以标准的分子实验操作产生(Ausubel等，1988；Sambrook等，1989)，如本文所例举的。编码母本多肽(构成杂合蛋白的两个片段所来自的两个多肽序列)的DNA序列以标准的重组方法(例如，通过对DNA序列进行限制酶切位点的操作而不改变翻译的氨基酸序列，质粒的消化，以及将适当的片段克隆入选好的表达载体中)，克隆连接于一个表达载体中。
然后，重组杂合干扰素融合多肽从上述的表达载体中产生，经纯化，用于疾病的治疗和/或用于因IFNτ处理而得到改善的病情中。
IV.蛋白建模和蛋白改造
上节中的数据表明，鉴定了具有与和受体作用及生物活性相关的OvIFNτ蛋白中的4个不连续的位点的合成肽。为了阐明这些区域的结构关系，进行了IFNτ三维结构的模型构建。三维结构模型对于已有的数据阐明和进一步的结构/功能研究很有益处。
A.分子蛋白模型的构建
结合OvIFNτ和IFNβ(其三维结构已知(Senda等，1992))两者的园二色性(CD)构建了OvIFNτ的模型。该模型最为吃惊的一点是IFNτ被分到4-螺旋束基序的一类蛋白中。OvIFNτ园二色性光谱在AVIV 60S光谱偏振仪上测量。使用了两种方法对二级结构进行估算，Perczel等(1991)的运算法则和W.C.Johnson，Jr.(1992)的变量选择。
光谱的二级结构估算显示出70-75％的α-螺旋(最低222和208nm，最高190nm的鉴定)。变量选择算法估算出剩余的分子为20％的β-折叠和10％的转折。Chang的方法估算出剩余为30％的随机螺旋。IFNτ和IFNβ序列的排列比较揭示出两个分子间的同源性，尤其在IFNβ已知的螺旋结构区域。IFNτ的序列分析也显示出已知的螺旋区域拥有一个意味着4-螺旋束基序的一个极性周期。
最后的建模步骤为对IFNτ序列应用IFNβ的X射线晶体图像和IFNβ的碳骨架。如前面所述的IFNτ的具有功能性的区域被定位于该分子的一侧，而且发现在空间上接近。这与IFNτ同时和I型IFN受体作用的多重结合位点相一致。
三维模型的数据结合上述的功能数据，提供了必要的信息，可用于在IFNτ特定的区域中引入序列突变，以增强特定的功能(例如，抗病毒或抗细胞增殖)或者将特定的功能置换到其他干扰素分子中去(例如抗病毒、抗神经炎或降低细胞毒性)。
B.重组和合成操作
OvIFNτ的合成基因的构建如实施例3所述。简要地，从一个OvIFNτ的cDNA(Imakawa等，1987)用E.coli.偏爱的密码子反翻译出OvIFNτ的核酸序列，该序列编辑成含20个单一的限制位点，遍布于整个序列。将该540个碱基对的合成基因分割成11个寡核苷酸片段，合成每个片段并以单链或双链克隆到pTZ 19R，pTZ18R或pBluescript上，扩增，融合。合成的OvIFNτ构建物然后被克隆到经修改过的pIN-III-ompA表达载体上，在细菌中表达，还被克隆到一个酵母表达质粒上。还设计构建了一个人IFNτ合成基因(SEQ IDNO：3)类似的构建物，并在酵母细胞中表达。
OvIFNτ合成基因在酵母中的表达(实施例4)在S.cerevisiae中能够得到高效IFNτ的重组产物：随后应用离子交换和分子筛层析，从可溶性酵母抽提物中纯化出大量的重组IFNτ(5-20mg/l)。以此方式纯化的IFNτ表现出与天然的OvIFNτ类似的有效的抗病毒活性(2至3×105单位/mg)。
该合成基因构建物有利于引入突变而可增强抗肿瘤(抗细胞增殖)和抗病毒活性。而且，该分子上负责不同功能的区域可以单独进行修饰以产生带有所预期功能的分子。例如，构建了两个缺失突变，OvIFNτ(1-162)和OvIFNτ(1-166)，用以检测IFNτ分子C端序列的作用。
还构建了其他的突变IFNτ分子用以确定对抗增殖活性重要的残基。例如，已证明在IFNα的抗细胞增殖活性中有一个特别的残基TYR123(McInnes等，1989)。IFNτ中TYR123等价物包含在肽OvIFNτ(119-150)中：该肽抑制OvIFNτ和人IFNα的抗增殖活性。构建了将TYR123转变成保守的(TRP)和非保守的(ASP)的取代突变，以及该残基缺失的突变序列。TYR123的密码子位于SspI位点中；用该位点的消失与否来检测。这些突变的IFNτ抗增殖活性的测试如本文所描述。
可以产生相应于本发明的IFNτ多肽的合成肽。合成肽可以商业合成或用本领域的标准方法和仪器(Applied Biosystems，Foster CityCA)制备。
另外，编码肽的寡核苷酸序列可以按标准的寡核苷酸合成方法直接合成，或者，当是大量的编码序列情况时，通过一系列克隆步骤合成，步骤包括相应于编码序列的多个寡核苷酸片段的串联(Crea，1989；Yoshio等，1989；Easton等，1988)。寡核苷酸编码序列可通过标准的重组程序被表达(Maniatis等，1982；Ausubel等，1988)。
上述的干扰素τ多肽的生物学活性的应用可以通过单独地使用干扰素τ也可以结合或融合如上面和下面所述的其他的蛋白而实现。
V.融合蛋白的产生
另一方面，本发明包括干扰素τ、干扰素τ的衍生多肽，或者与第二个多肽共价结合而形成一个融合或杂合蛋白的杂合干扰素。构成这样的融合蛋白的干扰素τ序列可重组产生干扰素τ或其生物活性部分，如上所述。
例如当干扰素τ用于抑制病毒的表达时，衍生自具有抗病毒活性的IFNτ的多肽，可以优势地融合一个可溶性肽，如血清白蛋白或一个抗体(例如特异针对一个病毒特异表面抗原的)，或融合一个干扰素α多肽。在一个实施方案中，如上所述的杂合干扰素融合多肽，IFNτ多肽提供了一个降低其他干扰素分子(如IFNβ或IFNα)毒性的方法，即，以相应的IFNτ低毒性的区域置换这些干扰素中的毒性相关区域。这些区域可从例如本文所公开的人干扰素τ序列中得到。
本发明中的融合蛋白可通过化学偶联或重组技术获得。前一种方法中，干扰素和第二个所选的多肽用常规的偶联剂做共价结合的修饰。在一个将可溶性血清白蛋白与干扰素多肽偶联的样板方法中，血清白蛋白用N-琥珀酰亚胺-S-乙酰-硫代醋酸酯处理(Duncan等，1983)，产生硫醇血清白蛋白。然后该激活了的血清白蛋白与经N-琥珀酰亚胺-3(2-二硫吡啶)丙酸酯处理的干扰素(Cumber等，1985)反应，形成通过二硫键连接的融合蛋白。
作为另一种方法，重组蛋白的制备可利用一个半胱氨酸残基，使得该干扰素与一个激活的配体形成二硫键，从而简化偶联反应。用于产生重组干扰素的干扰素τ表达载体可以按照标准的定点诱变的方法修饰，插入一个中间的或末端的半胱氨酸密码子(Ausubel等，1988)。
在一个方法中，利用一个表达载体重组制备融合蛋白，该载体上第二个所选多肽的编码序列与干扰素τ编码序列相连接。例如，可将人血清白蛋白编码序列与干扰素τ多肽的编码序列，如SEQ IDNO：9，SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：39同阅读框融合。然后在一个适当的宿主细胞中表达该融合蛋白。该融合蛋白可通过分子筛和离子交换层析方法纯化，如有需要，还可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和/或HPLC层析进行其他的纯化。
从以上所述中可以理解如何制备含有干扰素τ的融合蛋白。上述的融合的一个变化是，在该融合蛋白中改变干扰素τ-和所选的第二个蛋白的位置(如，氨基端变为羧基端)。此外，天然干扰素τ多肽的内部部分(例如15-172位氨基酸的区域)可以组装到多肽中去，从而两个或多个这种干扰素τ部分在此多肽中是相邻的，而在天然蛋白中它们是不连续的。
VI.与干扰素τ反应的抗体
与谷胱甘肽-S-转移酶(Sj26)融合的含有本发明的多肽抗原的融合蛋白，可以利用pGEX-GLI载体系统在大肠杆菌JM101细胞中表达。该融合Sj26蛋白可方便地利用谷胱甘肽底物亲和层析(Smith，D.B.等，1988)而分离。IFN蛋白的表达和部分纯化如实施例21所述，其适用于由本发明描述的任何序列所编码的可溶性的诱导的多肽。
不溶性的GST(sj26)融合蛋白可通过制备型凝胶电泳纯化。
另外，IFNτ-β-半乳糖苷酶融合蛋白可按照实施例20中所述进行纯化。
本发明还包括一个表达载体，如上述的λgt11或pGEX载体，它含有IFNτ编码序列和可使编码区在一个适当的宿主中表达的表达调控元件。调控元件一般包括启动子、翻译起始密码和翻译和转录终止序列、和一个可在载体中引入插入片段的插入位点。
编码所要多肽的DNA可克隆到任何一种载体中(如上所讨论的)从而在适当的宿主系统中获得该多肽的表达。这些重组多肽可以融合蛋白或者天然蛋白形式表达。许多特征可以引入到表达载体中，如可促使表达序列分泌到培养集中去的前导序列。重组生产的IFN和由它衍生的多肽通常可以从裂解的细胞或培养基中分离。纯化可以按照本领域所熟知的方法如盐分馏、离子交换层析和亲和层析进行。也可利用抗所要IFNτ或杂合干扰素抗原的抗体而使用免疫亲和层析方法。
另一方面，本发明包括针对本发明所提供的多肽的特异抗体。典型地，为制备抗体，用纯化的抗原或融合蛋白抗原免疫一个宿主动物，如兔。利用许多衍生自其他蛋白的序列，如β-半乳糖苷酶或谷胱甘肽-S-转移酶，可以产生杂合或融合蛋白。经适当的时间间隔后收集宿主血清或血浆，测试该血清对抗原的特异抗体。实施例21描述了兔血清抗体的产生，该抗体特异地抗Sj26/hybIFN杂合蛋白中的hybIFN抗原。这些技术可以应用于所有的hybIFN分子和由其衍生的多肽。
可以通过，例如用饱和硫酸铵或DEAE Sephadex，或其他本领域熟练技术人员所知道的生产多克隆抗体的方法，获得免疫动物的γ球蛋白或IgG抗体。
另外，纯化的蛋白或融合蛋白可用于产生单克隆抗体。将以所需的抗原免疫的动物的脾或淋巴细胞取出或体外增殖，或通过本领域熟练技术人员所熟知的方法用于制备杂交瘤(Harlow等，1988)。可从外周血样品中分离淋巴细胞。Epstein-Barr病毒(EBV)可用于体外无限增殖人淋巴细胞或者使用一个融合配对物来产生杂交瘤。
通过例如ELISA或Western blot的方法(Ausubel等，1988)，对体外增殖细胞所分泌的抗体扫描，以确定分泌所需的特异抗体的克隆。支持本发明所进行的实验产生了4个杂交瘤，它们可产生对分离的羊IFNτ特异的单克隆抗体。
多肽的抗原性区域通常比较小，典型长度为7至10个氨基酸。已有小片段被确定为抗原性区域。干扰素τ多肽抗原按如上所述鉴定。得到的DNA编码区域可以融合蛋白或分离的多肽形式重组表达。
此外，一些氨基酸序列可以方便地化学合成(Applied Biosystems，Foster City CA)。以上述方法之一获得的抗原可直接用于抗体的产生或者将其结合于适当的载体分子。许多这类载体分子为本领域所熟知或者可以商业购买(如，Pierce，Rockford IL)。
与IFNτ或者杂合干扰素反应的抗体可用于例如分析结构/功能关系。
VII.应用
A.繁殖
虽然IFNτ在结构上和在其有效的抗病毒特性上与IFNα家族相似，但是IFNα不具备IFNτ所有的繁殖特性。例如，重组IFN与IFNτ相比，即使施用两倍的剂量对发情间隔也无作用(Davis等，1992)。
因此，虽然IFNτ与其他干扰素具有一些结构相似性，但是它具有其鲜明的特性：例如，能够显著地影响发情周期的生物学事件。
本发明的人IFNτ可用于增强生育能力和延长雌性动物黄体的生命期的方法中，通常例如Hansen等1991所述，附此可参考。而且，本发明的IFNτ可用于调控子宫和/或胚胎组织的生长发育。人IFNτ尤其可用在对人的治疗中，因为潜在的抗原反应在使用同种蛋白时较小。
B.抗病毒特性
I型干扰素显示出有效的抗病毒特性。IFNτ的抗病毒活性具有广泛的无毒效治疗应用，而IFNα则通常带有这些毒效。虽然在培养基中存在的IFNτ抑制猫的免疫缺损病毒反转录酶活性(实施例11)，但这并不是由于IFNτ对反转录酶的直接作用。而是IFNτ诱导宿主细胞产生了对病毒反转录酶的抑制因子。
IFNτ被发现执行其抗病毒活性而不对细胞具有副作用：未发现由于施用IFNτ而导致细胞毒性效应的证据。IFNτ没有细胞毒性使得其在作为体内治疗药剂上极为有价值。无细胞毒性将IFNτ与大多数其他的抗病毒药剂和所有其它干扰素区分开来。
包括本发明的含IFNτ杂合干扰素融合化合物的配制物可用于抑制病毒复制。
本发明的杂合干扰素融合蛋白可用于影响胎儿和母亲间的免疫关系，例如防止母体病毒(如HIV)转移至发育中的胎儿。人干扰素组合物尤其可用在对人的治疗中，因为潜在的抗原反应在使用同源蛋白时较小。
C.抗细胞增殖特性
I型干扰素显示出有效的抗细胞增殖特性。本文所述的这种杂合干扰素也可用于抑制细胞生长，而没有其他现在已知的干扰素所带的副作用。含有本发明的杂合干扰素化合物的配制物可用于抑制、防止或减缓肿瘤的生长。
某些肿瘤的发育受雌激素的介导。支持本发明所进行的实验表明IFNτ可以降低雌激素受体数量。因此，含有IFNτ的组合物可用于治疗或防止雌激素依赖型肿瘤。
D.免疫系统紊乱
可用本发明的方法治疗的疾病包括自身免疫，炎症，增殖性或高增殖性疾病，以及皮肤表现形式的免疫介导疾病。本发明的方法在涉及免疫系统超敏性时的治疗条件下尤其优越。有4种类型的免疫系统超敏性(Clayman)。类型I，或直接型/过敏性超敏性是由于对过敏原(如花粉)反应而肥大细胞脱粒，包括哮喘、过敏性鼻炎(干草热)、风疹(荨麻疹)、过敏性休克和其他的变态性疾病。类型II，或自身免疫超敏是由于直接针对所察觉的身体自身细胞上的“抗原”的抗体所致。类型III超敏是由于寄存于各种组织中并激活进一步免疫应答的抗原/抗体复合物的构成，它相应的情形有血清疾病、过敏性肺泡炎和有时加强免疫后的大发胀。类型IV超敏是由于致敏T-细胞淋巴因子的释放，它导致炎症反应。例子包括接触性皮炎、麻疹和对某些药物的“过敏性”反应。
虽然在一些个体中某种条件导致超敏的机制一般无法被完全了解，但它可能涉及遗传和外在的因素。例如，对于一个已经带有自身免疫紊乱的遗传因素的个体，细菌、病毒或药物可能在启动自身免疫应答上起一定的作用。据推测，某种类型超敏的发病可与其他类型相关联。例如有报道带有某种常见的变态性的个体对自身免疫紊乱有更高的易感性。
自身免疫紊乱可大概分为主要限于特异器官和组织的一类和影响整个身体的一类。器官特异的紊乱(其涉及器官)的例子包括多重硬化症(包被神经过程的髓鞘质)、I型糖尿病(胰腺)、Hashimotos甲状腺炎(甲状腺)、恶性贫血症(胃)、Addison疾病(肾上腺)、重症肌无力(神经肌肉接合处的乙酰胆碱受体)、风湿性关节炎(关节衬)、葡萄膜炎(眼睛)、牛皮癣(皮肤)、Guillain-Barre综合症(神经细胞)和Grave疾病(甲状腺)。系统自身免疫疾病包括系统性红斑狼疮和皮肤肌炎。
其他的超敏紊乱包括哮喘、湿疹、遗传过敏性皮炎、接触性皮炎、其他湿疹性皮炎、皮脂溢性皮炎、Pemplugus、天疱疮、Epidermolysis疱、uriccaris、血管水肿、visculitides、红斑、皮肤性嗜曙红细胞增多、Alopecia areata、动脉硬化症、初级胆硬化和肾病综合症。相关疾病包括、肠道炎症如Coeliac疾病、直肠炎、嗜曙红细胞增多肠胃炎、肥大细胞病、发炎肠疾病、Chrohn疾病和溃疡性结肠炎，以及食物相关的过敏。
自身免疫疾病尤其适合于本发明的方法治疗，包括多重硬化症、I型(胰岛素依赖型)糖尿病、红斑狼疮、肌肉萎缩性侧相硬化症、Crohn疾病、风湿性关节炎、口炎、哮喘、葡萄膜炎(眼睛)、变态和牛皮癣。
含有hybIFN的药剂可用于治疗处理并减轻上面所述的自身免疫紊乱症状。
E.干扰干扰素与受体的结合
IFNτ能够通过分子上的几个表位与I型IFN受体反应，这些区域可以或单独或联合地影响IFNτ的独特功能。
本发明的肽可用于选择性地抑制干扰素与干扰素受体的结合。特别是如本文所述，某些所公开的肽选择性地抑制IFNτ的抗病毒活性，而另外的肽抑制抗增殖活性。这些肽联合起来可用于抑制两种活性。有利的是，尽管结合干扰素受体并阻断IFNτ活性，这些肽本身并不表现抗病毒或抗增殖活性。
因此，这些肽可以用作免疫调节分子，用于防止干扰素分子激发的免疫应答。这些肽可用作免疫抑制剂，防止例如对组织移植的干扰素介导的免疫应答。其他类型的干扰素介导的应答也可被阻断，如干扰素α的细胞毒效应。
F.药物组合物
本发明的杂合干扰素融合多肽可按照已知的方法配制药物用途的组合物。先前已描述(例如，Martin等，1976)包含干扰素或干扰素类化合物的配制物。通常，本发明的组合物可以有效量的杂合干扰素结合适当的载体配制，以有效地促进该组合物的施用。
用于治疗的组合物可以是不同的形式。包括，例如，固体的，半固体的和液体的形式，如，片剂、丸剂、液态溶液或悬液、脂质体、栓剂、注射型或不溶性溶液。其优选形式基于所需的施用方式和治疗应用。组合物还优选地包括本领域熟练技术人员所熟知的常规的药物学可接受的载体和赋型剂。优选地，本发明的组合物以一个单位剂量的形式构成，并通常能够对患者一天施用一次或多次。
杂合干扰素融合多肽或相关多肽可对患者以药物学可接受的剂量形式施用，这些形式包括口服、吸入、鼻腔喷雾、腹膜内、静脉、肌肉、内壁或皮下注射。特别地，用于其他干扰素化合物的组合物和方法可用于这些化合物的输入。
本发明的化合物的一个重要优点是IFNτ蛋白极低的细胞毒性。由于其低细胞毒性，该杂合干扰素组合物可以以高于其他干扰素(如IFNα)化合物应用时的浓度来施用。因此，本发明的杂合干扰素组合物可以考虑以大约5×104至20×106单位/天甚至500×106单位/天或更多的剂量来施用。对于系统施用优选的是高剂量。当然应当理解本发明的组合物和方法可与其他的治疗相结合。
当患者的病状有所改善时，如需要可施用保持剂量。然后，施用的剂量或频率或两者一起随症状而定降低至一个能够保持改善病症的水平。当症状减轻至所需水平时，可以停止治疗。但患者可能需要在一个长时期内根据疾病症状的复发情况进行间歇治疗。
本发明的组合物可通过标准的程序施用，以治疗各种癌症和病毒性疾病，包括那些其他干扰素已经显示出效果的病症。可参见例如Fintre等，1991；Dianzani，1992；Francis等，1992和U.S.专利4,885,166和4,975,276。然而如上面所讨论的，本发明的组合物具有独特的特点和优点，包括它们可以无毒性地治疗那些病症。
G.对皮肤紊乱的治疗
皮肤紊乱症可以使用本发明的杂合干扰素治疗，其配方和剂量可根据施用的方法和损伤的大小和严重程度确定。优选的方法包括真皮和皮下注射。对于大的损伤可以多次注射，而单个患者皮肤上的几块损伤可以一次处理。施用的时间计划可以由本领域熟练人员确定。设计的可持续释放的配方能够降低施用频率。
H.系统治疗
系统治疗在各项应用上基本相同。可用多次静脉、皮下和/或肌肉剂量，而对于植入方法的治疗，设计的持续释放配方尤为有用。患者也可通过植入皮下门、储存池、或泵来治疗。
I.区域治疗
利用本发明的杂合干扰素融合多肽的区域治疗可用于特定组织的癌症治疗。治疗可通过动脉灌输完成。可利用外科或血管造影方法植入导管直接地对所影响的器官治疗。一个与导管相连的皮下门可用于持续治疗，或者也可使用一个植入的再装泵。
下列的实施例是对本发明的解释而非限制。
材料和方法
限制性内切酶，T4连接酶，T4多核苷酸激酶，Taq DNA聚合酶，和小牛肠磷酸酶购自New England Biolabs(Beverly，MA)或PromegaBiotech(Madison，WI)，这些试剂按照制造商的说明书使用。对于测序反应，使用了“SEQUENASE DNA IFNα”测序试剂盒(UnitedStates Biochemical Corporation，Cleveland OH)。免疫杂交和其他试剂来自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)或Fisher Scientific(Needham，MA)。醋酸纤维素膜购自Schleicher and Schuell(Keene，NH)。
合成的寡核苷酸连接子和引物通过商业购买的自动核苷酸合成仪制备(如，ABI 380B-02型DNA合成仪(Applied Biosystems，FosterCity，CA))。或者，常用设计的合成寡核苷酸可购自例如，SyntheticGenetics(San Diego，CA)。cDNA合成试剂盒和随机引物标记试剂盒购子Boehringer-Mannheim Biochemical(BMB，Indianapolis，IN)。
编码多肽的寡核苷酸序列的合成可通过标准的寡核苷酸合成方法，或者，对于大的编码序列，通过一系列的克隆步骤，利用相应于该编码序列的一组多个寡核苷酸串联片段(Crea，1989；Yoshio等，1989；Eaton等，1988)而完成。寡核苷酸编码序列通过标准的重组程序(Maniatis等，1982；Ausubel等，1988)而表达。或者，通过标准体外技术(Applied Biosystems，Foster City CA)直接合成肽。
重组人IFNα(rHuIFNα)和rBIFNγ购自Genentech Inc.(SouthSan Francisco，CA)。参照的重组人IFNα(rHuIFNα)制备物得自Natonal Institutes of Health：rHuIFNα商购自Lee Biomolecular(SanDiego，CA)。纯化的人IFNαA(2×104单位/mg)得自BiosourceInternational(Camarillo，CA)。除非另有说明，通过二金鸡宁酸试验试剂盒(Pierce，Rockford IL)按照制造商的说明书确定蛋白浓度。
涉及多克隆和单克隆抗体工作的一般的操作，包括抗体的纯化，按照标准的程序进行(Harlow等，1988)。Pierce(Rockford，IL)为许多抗体试剂的来源。
亲和纯化的对Tyk2，Stat1α，和Stat2特异的兔抗肽抗体购自SantaCruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。单克隆抗磷酸酪氨酸抗体(4G 10)购自Upstate Biotechnology(Lake Placid，NY)。Western blots以增强的化学发光(ECL)检测试剂盒(Amersham Corp.ArlingtonHeights，IL)显色。
牛肾细胞系MDBK和人Burkitt淋巴瘤细胞系Daudi得自美国典型培养物保藏中心(ATCC；Rockville，MD)。Daudi细胞生长于RPMI1640培养基，其中加有20％胎牛血清和抗生素(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)。MDBK细胞生长于Eagle最小基本培养基(EMEM)，其中加有10％马血清和抗生素(Gibco/BRL)。
本研究中使用的所有组织培养基，血浆和IFN为内毒素阴性，这是由Limulus变型细胞溶胞产物(Associates of Cape Cod，WoodsHole，MA)试验，以0.07ng/ml的灵敏度水平确定。
抗体检测的一般ELISA实验程序
聚苯乙烯96孔板Immulon II(PGC)用5μg/mL(100μl/每孔)抗原，0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH9.5包被。平板用石蜡膜封住，置于4℃过夜。
平板抽气并用300μl 10％NGS封闭，于37℃孵育1小时。
用PBS 0.5％TWEEN-20洗板5次。
抗血清稀释于0.1M PBS，pH7.2。将所需的抗血清(0.1mL)加入每孔中，平板于37℃孵育1小时。然后用PBS 0.5％TWEEN-20洗涤5次。
辣根过氧化物酶(HRP)缀合的羊抗人抗血清(Cappel)1/5000稀释于PBS。在每孔中加入0.1mL的此溶液。平板于37℃孵育30分钟，然后用PBS洗涤5次。
Sigma ABTS(底物)在加入到平板中之前备好。
试剂中含有50mL 0.05M柠檬酸，pH4.2，0.078mL 30％过氧化氢溶液和15mg ABTS。在每孔中加入0.1mL的底物，然后于室温孵育30分钟，加入0.050mL5％SDS(w/v)终止反应。在410nm处测量相对吸收值。
实施例1
IFNτ的生殖功能
测试了干扰素τ对黄体寿命的作用。
将IFNτ按照表1的浓度输入母羊的子宫腔内。重组人IFNα(rHuIFNα)以相似的浓度输入。此外，还使用了接受对照蛋白的对照动物。黄体的寿命通过检测发情间隔、孕酮分泌的保持、和前列腺分泌的抑制(Davis等，1992)来测试。
表1  干扰素对生殖生理学的作用
  干扰素   处理   发情间隔(天)(平均)
  对照   -   17.3
rHuIFNα   100μg/天200μg/天2000μg/天   16.016.019.0
  OvIFNτ   100μg/天   27.2
当IFNτ以100μg/天施用时，对照动物与接受OvIFNτ的动物发情间隔的比较显示出明显的间隔增加。另一方面，对照动物和接受人重组干扰素α的动物发情间隔的比较显示rHuINFα没有有意义的效果。
结果表明干扰素τ具有显著影响生殖周期生化事件的能力。
实施例2
在生殖周期的不同时期干扰素τ的抗病毒特性
从处于16天发情周期的第12天的绵羊上获得孕体建立孕体培养物。通过致细胞病变效应试验(Familetti等，1981)检测每个孕体培养物上清中抗病毒活性。简要地，IFNτ或其他IFN的稀释液与Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞一起于37℃孵育16-18小时。孵育后，在致细胞病变效应试验中用疱状口炎病毒(VSV)作为感染病毒，检测对病毒复制的抑制(Armstrong，1989)。相对于受VSV感染而没经处理的MDBK细胞(对照板)，一个抗病毒单位可导致单层细胞破坏率下降50％。利用正常的羊成纤维细胞(Shnf)通过斑抑制试验(Langford等，1981)进一步评测了特异活性。每个时间点至少测试了3个样品，每个样品试验3次。结果以平均单位/ml列于表2中。
表2  孕体培养物和尿囊液和羊膜液中的IFNτ的抗病毒活性
  天   样品   单位/ml
孕体培养物   10   9   ＜3
  12   5   34
  13   6   4.5×103
  14   3   7.7×103
  16   12   2.0×106
  尿囊液   60   3   1.4×103
  100   4   11
  140   3   ＜3
羊膜液   60   3   22
  100   4   ＜3
培养物上清中的抗病毒活性随着孕体的进一步发育而增加(表2)。
实施例3
IFNτ在细菌中的表达
以编码OvIFNτ的氨基酸序列(Imakawa等，1987)，使用为E.coli.表达而优化的密码子，产生一个相应的DNA编码序列。在5’和3’端加入接头序列以方便在细菌表达载体中的克隆。核苷酸序列的设计包括19个单限制酶位点，它们均匀地遍布于编码序列上(图1A和1B)。
核苷酸序列分成11个大小范围在33至75个碱基的寡核苷酸片段。这11个寡核苷酸都在380-B 2-柱DNA合成仪(AppliedBiosystems)上合成，并以单链或者双链形式克隆到下列之一的载体中：“pBLUESCRIPT+(KS)”(Stratagen，LaJolla，CA)，pTZ18R(Pharmacia，Piscataway，NJ)，或pTZ19R(Pharmacia，Piscataway，NJ)克隆载体。
载体转化进E.coli.菌株”XL1-BLUE”(recA1 end A1 gyrA96 thihsdR17(rs -，ms+)supE44 relA1λ-(lac)，{F’，proAB，lacqZΔM15，Tn10(tetR)})，它可从Stratagen(LaJolla，CA)商业购买。转化细胞在加入了氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基中生长。寡核苷酸的克隆和融合按照标准的重组DNA技术进行。
克隆载体用适当的限制酶切割，插入合成的寡核苷酸。载体用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)处理以去除末端磷酸基团。寡核苷酸进行磷酸化，并以单链或者双链分子，使用T4连接酶克隆入适当的载体中。当引入克隆载体的是单链时，第二条链由转染后的细菌宿主完成。
对于双链克隆，寡核苷酸先与合成的互补链退火，然后连接入载体中。然后以连接产物转化E.coli K12菌株SB221或NM522。当涉及到甲基化敏感的StuI和ClaI限制位点时，使用E.coli GM119菌株。在每一步的克隆程序中对分离的DNA进行限制酶切分析。将克隆的寡核苷酸按照图2所示，经限制酶切和连接形成一个多核苷酸。含有DNA片段的寡核苷酸一般通过低熔点琼脂糖上的电泳而进行分离(Maniatis等，1982；Sambrook等，1989；Ausubel等，1988)。得到的IFNτ多肽编码序列的跨度为第16位至531位，它编码172个氨基酸。
最终所得多核苷酸的核苷酸序列通过双脱氧链终止法的DNA测序加以确定。
将全长的StuI/SstI片段(540bp；图2)克隆到一个修改过的pIN IIIompA表达载体上，并转化入E.coli SB221菌株感受态细胞。为了表达IFNτ蛋白，含有表达载体的细胞在含氨苄青霉素的L-肉汤中生长至0.1-1的OD(550nm)值时，用IPTG诱导3个小时，离心收集。可溶性重组IFNτ经超声波或渗透压破碎从细胞中释放出来。
实施例4
IFNτ在酵母中的表达
如实施例3所合成的合成IFNτ基因，5’端加有StuI限制酶位点3’端加有SacI限制位点。
A.合成的IFNτ基因的分离
用两个寡核苷酸引物(SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14)将接头通过聚合酶链反应连接到合成的IFNτ基因上。在5’端的接头使得该合成的IFNτ基因以正确的读框置于酵母表达载体pBS24Ub(Chiron Corp，Emeryville，CA)上的遍在蛋白编码序列。此接头还构建出一个遍在蛋白-IFNτ连接区域，可使得遍在蛋白序列在体内与IFNτ序列切离开来。5’寡核苷酸还编码一个SacII限制内切酶切点。3’寡核苷酸含有一个StuI切点。
带有合成的IFNτ基因的载体(实施例3)通过碱裂解法从E.coli“XLI-BLUE”菌株中分离。分离的载体用10mM Tris，pH8.0/1mMEDTA/10mM NaCl稀释500倍。在100μl的体积里用Taq DNA聚合酶和引物SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：14进行PCR反应。扩增片段用SacII和StuI消化。消化后的片段连接到“pBLUESCRIT+(KS)”的SacII和StuI位点上。
得到的质粒命名为pBSY-IFNτ。用双链DNA作为模板鉴定该DNA序列。
B.表达质粒的构建
用SacII和EcoRV消化质粒pBSY-IFNτ，分离含有合成的IFNτ基因的片段。酵母表达载体pBS24Ub(Sabin等，1989；Ecker等，1989)用SalI消化。用T4 DNA聚合酶产生平末端。载体DNA用酚抽提并用乙醇沉淀(Sambrook等，1989)。回收的线性化质粒用SacII消化，经琼脂糖凝胶电泳纯化，与从pBSY-IFNτ分离的SacII-EcoRV片段相连接。得到的重组质粒命名为pBS24Ub-IFNτ。
将重组质粒pBS24Ub-IFNτ转化进E.coli。分离出含有IFNτ插入片段的重组克隆并用限制酶分析鉴定。从含有IFNτ编码序列的克隆中获得的质粒DNA用于转化S.cerevisiae(Rothstein，1986)。转化混合物铺于尿嘧啶缺乏培养基，于30℃孵育3-5天。然后将克隆在尿嘧啶和亮氨酸缺乏的培养基上划线并保存(Rothstein，1986)。
C.表达实验
为了小量表达，从尿嘧啶和亮氨酸缺乏的培养基上挑取含有pBS24Ub-IFNτ的S.cerevisiae单菌落，在YEP培养基(1％酵母抽提物，2％的蛋白胨)上，诱导条件下含有1％葡萄糖而在非诱导条件下含有8％的葡萄糖，于30℃生长。回收细胞裂解物并以15％的丙烯酰胺，0.4％甲叉丙烯酰胺进行SDS-PAGE(Sambrook等，1989)。分离的蛋白通过考马斯亮兰染色显示。
将分离的细胞抽提物电转移至NYTRAN纸上，利用单克隆抗体或对羊IFNτ的多克隆抗血清，通过免疫杂交特异显示重组IFNτ。
为了大量表达，pBS24Ub-IFNτ在含有8％葡萄糖的5×尿嘧啶和亮氨酸缺乏的培养基中于30℃生长24小时。然后将培养物于含有1％葡萄糖的YEP培养基中稀释20倍，进一步孵育24-36小时。
离心收集细胞，由50mM Tris，pH7.6，/1mM EDTA洗涤，重悬于含有1mM PMSF的洗涤缓冲液中。用Bead-beater仪(BiospecProducts，Bartlesville，OK)裂解细胞。裂解物以43000g离心20分钟。回收上清，用于下面所述的纯化步骤。
D.酵母细胞裂解物中roIFNτ的纯化
将上清上样于1×10cm DEAE柱，并用10mM Tris，pH8.0洗涤。保留蛋白用300ml，在10mM Tris，pH8.0中的0-0.5M NaCl梯度洗脱。每次3毫升部分收集。含有重组子(roIFNτ)的第17-26管中的10微升样品在15％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离。凝胶用考马斯亮兰染色。
第18，19和20管部分含有最高量的roIFNτ。这些部分分别在1.5×90cm Sephadex S-200柱上样，蛋白分成两个峰。每个蛋白峰的液体(25μl)在15％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，蛋白用考马斯亮兰染色显示。
合并纯化的含有roIFNτ的部分，通过放射免疫试验(Vallet等，1988)确定roIFNτ的量。总蛋白浓度通过Lowry蛋白试验(Lowry等，1951)确定。
roIFNτ的微量测序显示它与天然的IFNτ前15个氨基酸一致，确证了遍在蛋白/roIFNτ融合蛋白在体内得到正确加工。
纯化的roIFNτ每毫克蛋白(n＝3重复板)显示出2至3×105单位的抗病毒活性，这与孕体条件培养物培养基中获得的抗病毒活性(2×105/U/mg)相似。
实施例5
人高分子量DNA的Southern Blot分析
在加有肝素的管中收集来自健康供体的人静脉血样品，通过Ficoll-Isopaque梯度(1.077g/ml)(Sigma Chemical Co.)的密度梯度离心分离外周血淋巴细胞。从这些细胞中分离出高分子量(HMW)DNA(Sambrook等，1989)。
两个10μg的HMW DNA样品用限制内切酶HindIII或PstI(promega)于37C消化2小时，DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶(Bio-Rad，Richmond，CA)上于75伏电泳分离8小时，将DNA片段转移到尼龙膜上(IBI-International Biotechnoligies，Inc.，New Haven，CT)。将膜于80℃烘烤2小时，并在如下的预杂交溶液中于42℃孵育4小时：5×SSC(1×0.15M NaCl，0.15M柠檬酸钠)，50％v/v甲酰胺，0.6％(wt/vol)SDS，0.5％(wt/vol)脱脂奶粉，20mM Tris-HCl(pH7.5)，4mM EDTA，和0.5mg/ml鱼精DNA(Promega)。
放射性自显影在PstI消化的DNA中检测到一个大约3.4kb的杂交信号带，而在HindIII消化的DNA中检测到较小的片段(3.0kb)。这些结果表明存在与OvIFNτcDNA探针互补的人DNA序列。
实施例6
通过PCR分离人IFNτcDNA部分序列
合成了两个合成寡核苷酸(每个25mer)，它们是对应于OvIFNτcDNA序列上第231至255位(SEQ ID NO：13)和第566至590位(SEQ ID NO：14)的寡核苷酸(编号是相对于帽位点的，Imakawa等，1987)，这两个引物分别包含限制内切酶PstI和EcoRI的切割位点。SEQ ID NO：13经修改而从第569位起含有EcoRI位点。
从下面的两个cDNA文库中的大约1×105个噬斑形成单位分离出DNA：人足月胎盘(Clontech，inc.，Palo Alto，CA)和人足月细胞滋养层(Dr.J.F.Strauss，University of Pennsylvania，Philadelphia PA)。此DNA用于聚合酶链反应(PCR)扩增(Mullis，1987；Mullis等，1987；Perkin Elmer Cetus Corp.Norwalk CT)。扩增反应使用引物SEQID NO：13/SEQ ID NO：14，进行30个循环(45℃，1m；72℃，2m；94℃，1m)(温度循环仪和试剂，Perkin Elmer Cetus)。
扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳分离(100伏，Bio-Rad)并转移到尼龙膜上(IBI)。膜在80℃烘烤2小时，按如上所述与32P标记的OvIFNτcDNA预杂交和杂交。滤膜用5×SSC/0.1％(wt/vol)SDS于42℃洗涤5分钟，再用2×SSC/0.1％(wt/vol)SDS于42℃洗涤2分钟。然后在增感屏中于-80℃暴露于X光胶片(XAR，EastmanKodak，Rochester，NY)24小时。检测到一个与标记引物杂交的扩增产物。
再次按如上所述进行PCR。扩增产物用限制内切酶EcoRI和PstI(Promega)于37℃消化90分钟。所得的DNA片段如上所述电泳分离，从凝胶上切下含有IFNτ扩增产物的条带。通过电洗脱回收DNA片段，将其亚克隆到经EcoRI和/PstI消化并去磷酸化的质粒pUC19上，并通过氯化钙法(Sambrook等，1989)转化入E.coli.菌株JM101(Promega)。分离质粒并通过双脱氧终止法(Sanger等，1977；“SEQUENASE”反应，United States Biochemical，Cleveland，OH)对插入的扩增产物测序。确定这些核苷酸序列，并用“DNA STARSOFTWARE”(Madison，WI)程序将它们和由其推导出的氨基酸序列与其他IFNτ序列进行比较。
对这些克隆的序列的比较显示出有4种不同的克隆：来自人胎盘文库的HuIFNτ6(299bp)，HuIFNτ7(288bp)和HuIFNτ4(307bp)，它们的核苷酸序列显示出95％的同一性；来自细胞滋养层文库的克隆CTB35(HuIFNτ5；294bp)，它与HuIFNτ6和HuIFNτ4分别具有95％和98％的同一性。
实施例7
全长人IFNτ基因的分离
10毫克的PBMC HMW DNA用限制内切酶EcoRI消化，在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳分析。从凝胶上切下大小范围1.5至10kb(如，1.5-2.5kb，2.5-3kb)的一系列DNA样品。DNA经电洗脱并纯化。用OvIFNτ引物如上对每个DNA样品扩增。将每个产生阳性PCR信号的样品DNA分子克隆到λgt11上(亚基因组λgt11文库)。
A.含有与OvIFNτ互补序列的克隆的PCR鉴定
然后将λgt11噬菌体铺板，用32P标记的OvIFNτcDNA探针进行噬菌斑杂交和去除噬菌斑的杂交。鉴定出大约20个与探针杂交的克隆。
与探针杂交的噬菌斑进一步用上述的OvIFNτ引物进行PCR分析。将6个产生PCR阳性信号的噬菌斑纯化。分离出这些克隆的噬菌体DNA，并用EcoRI限制内切酶消化。DNA插入片段亚克隆到pUC19载体上，并通过双脱氧核苷酸测序确定其核苷酸序列。
B.含有与PCR阳性噬菌体互补序列的克隆的杂交鉴定
来自λgt11亚基因组文库的重组噬菌体在E.coli.Y1080中繁殖，并与E.coli.Y1080一起以大约20000个噬菌体/150mm平板的密度铺板。将其与来自上面分离的6个人IFNτcDNA克隆之一的32P标记探针杂交。用双层醋酸纤维滤膜覆盖这些平板。
对显示出阳性杂交信号的克隆进一步扫描和纯化。分离出杂交阳性克隆的噬菌体DNA，用EcoRI消化，将其亚克隆入pUC19载体并测序。然后对序列信息进行分析。
1.HuIFNτ1
三个克隆得到了位于距离mRNA帽位点800多个碱基的重叠的序列信息(对克隆进行双向测序)。合并的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，其预测的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。对由该基因预测的成熟蛋白序列(SEQ ID NO：12)与OvIFNτ预测的序列的比较见图3。
2.HuIFNτ2，HuIFNτ3
对另外两个显示出阳性杂交信号的克隆(HuIFNτ2，HuIFNτ3)也进行了扫描、纯化，噬菌体DNA也如上进行了亚克隆和测序。这两个克隆的序列如图19A和19B所示。正如可从图19A和19B中看出的，两个克隆的核苷酸序列(HuIFNτ2，HuIFNτ3)都与HuIFNτ1和OvIFNτ同源。
HuIFNτ2(SEQ ID NO：29)可能是个假基因，因为它在第115-117位含有一个终止密码子。该序列，SEQ ID NO：29，未提供前导序列。前导序列如图20A所示。从图20A所示的HuIFNτ2的序列可以看出，在成熟的HuIFNτ1中存在的第一个氨基酸(CYS残基)并不存在于HuIFNτ2序列中。因此，如SEQ ID NO：29所示预测的氨基酸序列相当于一个不带有第一个CYS残基和原有终止密码子的成熟的IFNτ蛋白。
核酸编码序列中原有的终止密码子可通过标准方法用一个氨基酸密码子，例如编码GLN的密码子，替换掉这个终止密码子。氨基酸GLN在其他的人IFNτ(HuIFNτ)分离产物的这个位置上存在。如果愿意，标准的重组操作可以引入这个起始的CYS残基。
HuIFNτ3(SEQ ID NO：31)编码人IFNτ蛋白。其翻译的全部蛋白的氨基酸序列，包括前导序列，如SEQ ID NO：32所示。其翻译的成熟蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示。
实施例8
通过RT-PCR分析HuIFNτmRNA的存在
对人胎盘cDNA文库和构建自第15-16天的孕体的羊cDNA文库通过如上所述与OvIFNτcDNA探针杂交进行了分析。在琼脂糖凝胶上大小分离cDNA并转移到滤膜上(Maniatis等，1982；Sambrook等，1989)。用OvIFNτ探针的Southern blot分析显示来自人cDNA文库的放射性自显影信号约为从OvIFNτcDNA文库中获得的信号的1/100。
用逆转录酶-PCR(RT-PCR)方法(Clontech Laboratories，Palo AltoCA)分析人足月胎盘和羊膜细胞中HuIFNτmRNA的存在。
从人胎盘、羊膜细胞和羊孕体中分离出的总细胞RNA(tcRNA)用引物SEQ ID NO：14进行逆转录。然后在反应中加入引物SEQ IDNO：13进行40个循环的聚合酶链反应。PCR产物在琼脂糖凝胶上大小分离并转移到滤膜上。滤膜上的DNA与32P标记的OvIFNτ和HuIFNτcDNA杂交。分析结果表明在胎盘附属物中存在人IFNτmRNA。羊膜细胞也表达相应于OvIFNτ引物和人探针的信息。
此外，还对从成年人淋巴细胞分离的tcRNA中HuIFNτ的存在进行了RT-PCR分析。密度计数分析表明HuIFNτmRNA存在于淋巴细胞中。
实施例9
原位杂交
A.组织
对来自4个健康的、不同的足月的和头三月期的人胎盘的半连续5-μ石蜡包埋切片进行了实验。
B.cDNA探针的制备
从来自OvIFNτ扩增文库的cDNA克隆中，将一个相应于OvIFNτcDNA的#77-736位碱基(#1位碱基为帽位点，OvIFNτcDNA的开放阅读框为#81-665位碱基，图7)的片段亚克隆到转录载体pBS上(New England Biolabs)。分离、亚克隆了几个pBS克隆，并对其核苷酸进行了测序。从该克隆中将一个3’端片段(#425-736位碱基)用限制内切酶NlaIV和EcoRI切下，并克隆到转录载体pBS上。该载体命名为pBS/OvIFNτ。
线性化此pBS/OvIFNτ质粒后，利用T7RNA聚合酶(Stratagene)通过体外转录(Sambrook等，1989)合成了一个反义cRNA探针。在转录反应中使用了痕量的3H-CTP(NEN-DuPont，Cambridge，MA)。地高辛标记的dUTP结合到cRNA上，通过TCA沉淀和闪烁计数估算产率。
C.杂交
使用该反义RNA探针，按照Lawrence等(1985)所述及如下的修改进行原位杂交。去石蜡并水合的切片在室温下于含有5mM MgCl2的磷酸缓冲盐(PBS)中预杂交10分钟。切片上的核酸于65℃在50％的甲酰胺/2×SSC中变性。切片在含有0.3μg/ml地高辛标记的cRNA探针的杂交混合液中于37℃孵育过夜，然后于37℃在50％的甲酰胺/1×SSC中洗涤30分钟。最后于室温下在1×SSC中和0.1×SSC中各洗涤30分钟。切片用0.5％Triton X-100(Sigma)和0.5％脱脂奶粉封闭30分钟。
用纯化的缀合碱性磷酸酶的绵羊地高辛Fab片段(Boehringer-Mannheim)检测杂交信号。除去未结合抗体后，加入氮蓝四唑/5-溴-4氯-3-吲哚-磷酸底物(Promega)和左旋四咪唑(Bector Laboratories，Burlingame，CA)，产生比色底物来做信号检测。组织用甲基绿染色，脱水，并制成标本。
作为对照，一些组织用100μg/ml的胰RNaseA(Sigma)于37℃预处理30分钟。RNase在切片上用400单位的RNase抑制剂(Promega)灭活。然后切片用250ml的PBS/5mM MgCl2洗涤两次。在其他的对照实验中，用tRNA(Sigma)替换地高辛探针。
在三次用不同的OvIFNτcRNA探针浓度和封闭试剂的独立实验中，在所有的足月的和头三月期的胎盘组织中均观察到了特异杂交。
头三月期胎盘绒毛由一个外层的合胞滋养层、一个底层的细胞滋养层、以及一个含有各种间充质细胞的中央基质区组成，在其细胞滋养层细胞中表现出最高的IFNτ转录水平。而在合胞滋养层和基质细胞中都表现出低强度但可检测到的水平。相类似的转录表达类型也显现在足月组织的胚胎绒毛中，但是检测到的信号水平很低。头三月期存在于母血空间中的外绒毛滋养层显现出最强的信号和染色阳性。
实施例10
IFNτ的抗病毒活性
在抗病毒试验中对纯化至同质性的OvIFNτ的相对比活性进行了评估。抗病毒试验基本上按照上面实施例2所述进行。通过用Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞或者绵羊正常成纤维细胞(Shnf)进行的抗病毒试验所获得的比活性以抗病毒单位/mg蛋白表示。所有样品同时试验以消除试验内差异。如表3所示，结果为4次测定的平均值，其标准偏差小于平均值的10％。
表3  IFNτ和已知的IFN的抗病毒活性
              比活性
  MDBK   Shnf
  OvIFNτ   2×106   3×106
  rBoIFNα   6×107   1×107
  rBoIFNγ   4.5×106   3×106
  NIH rHuIFNα   2.2×108   2.2×108
  rHuIFNα   2.9×109   4.3×109
无论比rBoIFNα还是比rBoIFNγ，IFNτ都具有更高的比活性(表3)。rHuIFNα的NIH标准制备物具有相似的比活性，而商业购买的rHuIFNα显示出较低的抗病毒比活性。比较的相对抗病毒活性用牛或羊细胞证实。
实施例11
IFNτ的抗逆转录病毒活性和细胞毒性作用
在暴露于猫免疫缺损逆转录病毒的猫外周血淋巴细胞中，对高度纯化的OvIFNτ测试其抗逆转录病毒活性和细胞毒性作用。该慢病毒在猫中导致慢性的类似AIDS的综合症，是一个人AIDS的模型(Pederson等，1987)。该病毒在外周血淋巴细胞中的复制通过随时间变化的培养上清中逆转录酶的活性来监测。试验的数据如表4所示。
表4  OvIFNτ对FIV复制的作用
  IFNτ浓度(mg/ml)                          RT活性(cpm/ml)
实验1                             收集时间
  第2天   第5天   第8天   第12天   第15天
  0.00   93,908   363,042   289,874   171,185   125,400
  0.62   77,243   179,842   172,100   218,281   73,039
  1.25   94,587   101,873   122,216   71,916   50,038
  2.50   63,676   72,320   140,783   75,001   36,105
  5.00   69,348   82,928   90,737   49,546   36,299
实验2                             收集时间
  第2天   第5天   第8天   第13天   第17天
  0.0   210,569   305,048   279,556   500,634   611,542
  2.5   121,082   106,815   108,882   201,676   195,356
  5.0   223,975   185,579   108,114   175,196   173,881
  10.0   167,425   113,631   125,131   131,649   129,364
  20.0   204,879   80,399   59,458   78,277   72,179
  40.0   133,768   54,905   31,606   72,580   53,493
OvIFNτ的加入导致逆转录酶(RT)活性快速的，剂量依赖的降低(表4)。当浓度低至0.62ng/ml时IFNτ就可抑制病毒的复制，而更高的浓度(40ng/ml)对RT活性具有更大的作用，但却对细胞没有毒性效应。该结果提示当细胞在OvIFNτ存在下培养时，猫免疫缺损病毒的复制与对照值相比较显著降低了。
即使培养基中IFNτ存在浓度达到40ng/ml时，IFNτ对逆转录病毒宿主细胞也不产生细胞毒性效应。
实施例12
IFNτ对HIV感染的人外周血淋巴细胞的作用
还测试了IFNτ抗HIV对人细胞感染的活性。已经感染了HIV的人外周血淋巴细胞(Crowe等，1987)用不同浓度的OvIFNτ处理。HIV在外周血淋巴细胞中的复制通过随时间变化的培养上清中逆转录酶的活性来监测。逆转录酶的活性基本上按照Hoffman等(1985)的方法测定。试验的数据如表5所示。
表5  OvIFNτ对人外周血淋巴细胞中HIV复制的作用
IFNτ浓度(ng/ml)                         RT活性
          第6天           第10天
  cpm/ml   降低百分率   cpm/ml   降低百分率
  0   4,214   -   25,994   --
  10   2,046   51   9,883   62
  50   1,794   57   4,962   81
  100   1,770   58   3,012   88
  500   1,686   60   2,670   90
  1000   1,499   64   2,971   89
如表5所示，OvIFNτ的浓度产生了显著的抗病毒效应。只有10ng/ml的浓度在6天后就导致RT活性50％的降低。而500ng/ml的浓度在10天中导致了RT活性90％的降低。
经IFNτ以一定的浓度范围处理3-13天后，人外周血淋巴细胞的存活性通过锥虫蓝排除法测定。存活性分析的结果如表6所示。
表6  OvIFNτ对HIV感染的人外周血淋巴细胞存活性的作用
  IFNτ浓度(ng/ml)           活细胞/ml×105
第3天 第6天 第13天
  0   16.0   7.5   5.3
  10   13.0   7.5   6.0
  50   13.0   11.5   9.0
  100   15.0   8.5   9.5
  500   16.5   12.0   11.0
  1000   21.9   9.5   8.5
表6的数据表明没有证据显示出由于IFNτ施用而产生的细胞毒性效应。
实施例13
细胞生长的抑制
还测试了IFNτ对细胞生长的作用。通过集落抑制试验来测试抗细胞生长活性。人羊膜(WISH)或MDBK细胞以低细胞密度铺板，形成源于单细胞的集落。细胞在24孔板上以200或400个细胞/孔，于加有2％胎牛血清(FBS)和基本与非基本氨基酸的HMEM中培养。将不同稀释度的干扰素加到三个平行孔内，将板孵育8天以形成集落。集落用晶紫染色并计数。用含有5％的“耗尽”培养基继续培养7天作细胞周期分析。WISH细胞无需同步即可使用。
为了测试IFNτ活性，细胞以2.5×105细胞/孔转铺于含有10％FBS的HMEM的6孔板上。单独或与肽联合加入不同稀释度的OvIFNτ至终体积1ml。培养板在5％CO2于37℃孵育12，15，18，24，或48小时。细胞用胰蛋白酶处理，低速离心收集并洗涤。吸干细胞沉淀，每管中加入250μl核染色溶液(5mg碘化丙锭，0.3ml NP40和0.1gm柠檬酸钠，溶于100ml蒸馏水中)。管子在室温下孵育。10分钟后，每管中加入250μl的RNase(500单位/ml于1.12％柠檬酸钠中)继续孵育20分钟。核用44μm网过滤，在FACstar(Becton Dickinson，Mountain View，CA)上用DNA Star 2.0软件分析。
在细胞生长试验中使用了牛上皮细胞系MDBK，还使用了人羊膜细胞系WISH，OvIFNτ对集落的大小和数量都抑制。羊IFNτ比人IFNα对人细胞系更为有效；故它具有有效的种间活性。其活性是剂量依赖性的，在浓度低至1单位/ml时也可观察到对增殖的抑制。浓度高达50000单位/ml(抗病毒活性/ml)时使增殖停止，但细胞存活性却没有削弱。
利用碘化丙锭染色的WISH细胞用流式细胞器进行的细胞周期分析表明，经48小时的OvIFNτ处理后处于G2/M期的细胞比例增加了。因此，IFNτ抑制细胞通过S期。OvIFNτ的抗增殖效应早在培养物抑制12小时后就可观察到并保持6天。
上述结果都显示出IFNτ的抗增殖效应而又具有低细胞毒性。
实施例14
IFNτ进一步的抗增殖效应
对一个大鼠细胞系和一个牛细胞系研究了OvIFNτ的抗增殖效应。用3H-胸腺嘧啶的掺入率来评测细胞增殖比率。
在加有3％的右旋糖苷包被的活性炭脱色的控制加工血清替代物2(charcoal stripped Controlled Process Serum Replacement 2，CPSR 2，Sigma)和5％的右旋糖苷包被的活性炭脱色的胎牛血清(FBS)的无酚红DME-F12培养基中接种大鼠细胞(MtBr7.c5)或牛肾(MDBK)细胞。附着约15-18个小时后，用无血清的DME-F12培养基洗涤细胞一次。将培养基换成无酚红的DME-F12培养基，其中加有3％脱色的CPSR 2，1％脱色的FBS(“3/1”培养基)或含有不同单位的抗病毒活性(经干扰素的疱状口炎病毒激发试验确定(实施例2))的OvIFNτ的3/1培养基。用溶有OvIFNτ的同样稀释度的缓冲液(未稀释缓冲液＝10mM Tris，330mM NaCl，[TS])作对照。
细胞用3H-胸腺嘧啶脉冲标记2小时，再有约48小时的后处理。通过闪烁计数确定三氯乙酸(TCA)沉淀的掺入计数。每次处理包括三次重复实验。OvIFNτ的平均值与含有可比稀释度的载体TS缓冲液样品相比较。实验结果如表7所示。
表7  3H-胸腺嘧啶的掺入
  处理  3H-胸腺嘧啶掺入的降低百分率
            实验1：MtBr7.c5(大鼠)
  3/1   -
  103u OvIFNτ/ml   0(+12)
  1∶5000TS   -
  104u OvIFNτ/ml   24
  1∶500TS   -
  105u OvIFNτ/ml   87
                实验2：MDBK
  3/1   -
103u OvIFNτ/ml 74
  1∶5000TS   -
  104u OvIFNτ/ml   83
  1∶500TS   -
  105u OvIFNτ/ml   83
如表7所示，OvIFNτ对每个测试的细胞系都强烈地降低了细胞增殖比率(根据胸腺嘧啶的掺入)。
实施例15
IFNτ对人肿瘤细胞系的抗增殖效应
通过经OvIFNτ处理的细胞中3H-胸腺嘧啶的掺入比率来测定OvIFNτ对人肿瘤细胞系的抗增殖活性。
在生长于悬浮液中的肿瘤细胞系的实验中，将1ml的细胞按2.5-5×105细胞/孔铺于24孔板。在三个重复的孔内加入适当的试剂，100，1000或10000单位/ml的OvIFNτ，或相当的抗病毒浓度的rHuIFNα2A(Lee Biomolecular)。孵育48小时后，通过锥虫蓝排除法对细胞计数测定生存率。
贴壁肿瘤细胞系按2.5×105细胞/孔铺于6孔板上。如上所述用干扰素处理，但在计数前先胰酶消化。
通过Scheffe‘s F测验的差异分析评测，不同的处理间呈现出显著的区别。利用碘化丙锭通过流式细胞计数器进行细胞周期分析。
A.乳腺癌细胞
从加有3％的右旋糖苷包被的活性炭脱色的CPSR 2和5％的右旋糖苷包被的FBS的无酚红DME-F12培养基中处于对数生长期的培养物，转种人MCF7乳腺癌细胞。附着大约15-18小时后，用无血清的DME-F12培养基洗涤细胞一次。将培养基换成无酚红的DME-F12培养基，其中加有3％脱色的CPSR 2，1％脱色的FBS(“3/1”培养基)或含有一定单位的抗病毒活性(经干扰素的疱状口炎病毒激发试验确定)的OvIFNτ的3/1培养基。用溶有OvIFNτ的同样稀释度的缓冲液(未稀释缓冲液＝10mM Tris，330mM NaCl，[TS])作对照。细胞用3H-胸腺嘧啶脉冲标记2小时，再有约48小时的后处理。
通过闪烁计数确定三氯乙酸(TCA)沉淀的掺入数。每次处理包括三次重复实验。OvIFNτ的平均值与含有可比稀释度的载体TS缓冲液样品相比较。实验结果如表8所示。
表8  3H-胸腺嘧啶的掺入
  处理  3H-胸腺嘧啶掺入的降低百分率
                   MCF7人
  3/1   -
  103u OvIFNτ/ml   35
  1∶5000TS   -
  104u OvIFNτ/ml   53
  1∶500TS   -
  105u OvIFNτ/ml   70
可从表7所示的结果看出，OvIFNτ能够实际地降低人癌细胞系中3H-胸腺嘧啶的掺入。这显示了OvIFNτ在抑制肿瘤细胞增殖，尤其是乳腺肿瘤细胞增殖上的效应。
B.人早幼粒细胞白血病
基本上如上面对MDBK细胞那样，用HL-60(人白血病)细胞(Foa等，1982；Todd等，1981)对OvIFNτ和IFNα抗病毒效应进行了比较。OvIFNτ和IFNα都抑制HL-60细胞的增殖。三次重复实验的每一次结果以平均的％生长降低±SD的形式在图4中表示。图4表明OvIFNτ和IFNα都可以强烈地降低HL-60细胞的生长。在测试的各个浓度下两个干扰素对生长的降低都超过了60％。在10000单位/ml时，OvIFNτ导致了大约80％的生长降低，而IFNα导致了100％的生长降低。
然而图4的数据还表明，IFNα降低生长能力的一个实际因素是它对细胞的毒性效应。在10000单位/ml时，IFNα的毒性导致25％以下单细胞还保持有存活性。相反，在使用10000单位/ml的OvIFNτ时，近100％的细胞保持着存活性。
图5中的数据显示rHuIFNα具有细胞毒性。图中，三次重复实验的每一次结果以平均％存活性±SD的形式表示。
C.人皮肤T细胞淋巴瘤
皮肤T细胞淋巴瘤HUT78对IFNτ处理的反应与HL-60一样。OvIFNτ和IFNα都能够降低HUT78细胞的生长，但是10000单位/ml的rHuIFNα使细胞数下降到低于原铺板的数量(5×105)。这表明细胞存活性降低至大约60％。
通过流式细胞计数器进行的细胞周期分析表明，经两种干扰素处理48小时后处于细胞周期的G2/M相的细胞比率增加了(表9)。在表9中，三次重复实验的每一次结果以处于各个细胞周期时相中细胞的百分比表示。每个样品分析了10000个细胞。
该结果可能是因为通过细胞周期的细胞进程减慢。在以10000单位/ml rHuIFNα处理的样品中，存在有大部分细胞，很少向前发展多为两侧发散的，可视为死细胞。这点与增殖实验中获得的数据一致，只有OvIFNτ抑制HUT78的增殖而不具有毒性。
表9  HUT78细胞周期分析
  处理(单位/ml)   G0/G1   S   G2/M
  Media   44.43   49.95   5.61
  100OvIFNτ   44.35   47.45   8.20
  100rHuIFNα   40.01   57.53   2.45
  1,000OvIFNτ   41.29   50.50   8.21
  1,000rHuIFNα   41.73   44.91   13.36
  10,000OvIFNτ   42.79   42.61   14.60
  10,000rHuIFNα   18.01   71.31   10.67(细胞死亡)
D.人T细胞淋巴瘤
T细胞淋巴瘤细胞系H9比上面所述的肿瘤细胞系对IFN的抗增殖效应的敏感性略低。三次重复实验的每一次结果以平均的％生长降低±SD的形式在图10中表示。尽管rHuIFNα对H9细胞没有毒性，但它在任何测试的浓度下都不能显著地抑制细胞分裂。相反，OvIFN发现可以降低H9的生长约60％(图10)。因此，OvIFNτ是该T细胞淋巴瘤有效的生长抑制剂。
上述结果既显示出了IFNτ的抗增殖效应也显示除了它的低毒性。
实施例16
用OvIFNτ的初步的体内治疗
三组4只C57B1/6小鼠，每组从尾静脉给入2.5×104的B16-F10细胞：B16-F10是一种同系鼠移植性肿瘤，选用它是因为它的高发性肺转移(Poste等，1981)。引入肿瘤细胞的第3天开始干扰素处理。每只小鼠，连续3天，每天接受100μl的空白的PBS，或者含有1×105单位OvIFNτ的PBS，或者含有1×105单位的重组鼠IFNα(MuIFNα)的PBS。
第21天处死小鼠，其肺保存于10％的缓冲福尔马林。在对照小鼠(PBS)、经OvIFNτ处理的小鼠(OvIFNτ)、和经MuIFNα处理的小鼠之间比较肺转移率。该体内施用的结果显示OvIFNτ强烈地降低肺肿瘤。此结果支持可将IFNτ在体内用作为一种有效的抗肿瘤药剂。
实施例17
IFNτ肽片段的竞争结合
A.基于IFNτ的肽对IFNτ和IFNα抗病毒活性的阻断能力
相应于全部的IFNτ序列合成若干重叠肽(图6)。各个序列通过将每个氨基酸亲水值之和除以氨基酸总数计算出平均亲水值。氨基酸亲水值取自Kyte等(1982)。
这些肽在分子量上大体相同而在整体的亲水性上略有差异。虽然有这些差异，但所有的肽在滴度大于1∶3000的兔抗血清产物的ELISA(Harlow等，1988)试验中都显示出抗原性。
用这些肽抑制OvIFNτ和rBoIFNα的抗病毒活性(实施力2)。分析结果如图12所示：1mM N-端和C-端肽都有效地阻断MDBK细胞中OvIFNτ的抗病毒活性。第三个肽，对应于第62-92位氨基酸，也降低了IFNτ的抗病毒活性(70％的抑制)。肽OvIFNτ(119-150)表现的抑制活性最小。OvIFNτ(34-64)和(90-122)肽没有显示出抑制活性。
按如下所述还测试了肽对OvIFNτ抗病毒活性的抑制。在OvIFNτ肽以不同浓度存在或不存在的情况下，将单层的Madin Darby牛肾细胞与40单位/ml的OvIFNτ一起孵育(见图13)。图13中的结果以对照的(即，不存在任何的竞争肽)抗病毒活性的百分比来表示。数据为6次重复实验的平均值。数据显示出在10-3M和3×10-3M时OvIFNτ(1-37)，(62-92，(119-150)，和(139-172)的抑制显著地不同于OvIFNτ(34-64)和(90-122)。在10-3M时OvIFNτ(139--172)与其它的肽有显著的差异。通过Scheffe F测验p＜0.05的差异分析来评测出显著性。因此，OvIFNτ(1-37)，(62-92，(119-150)，和(139-172)，尤其是(139-172)，可能为IFNτ受体的结合区域。
如下所述测试了OvIFNτ肽对牛IFNα(BoIFNα)抗病毒活性的抑制能力。在OvIFNτ肽以不同浓度存在或不存在的情况下，将单层的Madin Darby牛肾细胞与40单位/ml的牛IFNα一起孵育。结果如图14所示，以不存在OvIFNτ肽的对照抗病毒活性的百分比来表示。数据为4次重复实验的平均值。结果显示出在10-3M时OvIFN(62-92，(119-150)，和(139-172)的抑制显著地不同于OvIFNτ(1-37)，(34-64)和(90-122)。通过Scheffe F测验p＜0.05的差异分析来评测显著性。因此，OvIFNτ(62-92，(119-150)，和(139-172)，尤其是(139-172)，可能为IFNτ和牛IFNα共同的受体结合区域。
如下所述还测试了OvIFNτ肽对人IFNα抗病毒活性的抑制能力。在OvIFNτ肽以不同浓度存在或不存在的情况下，将单层的MadinDarby牛肾细胞与40单位/ml的人IFNα一起孵育。结果以不存在OvIFNτ肽的对照抗病毒活性的百分比来表示。数据如图15所示，为3次重复实验的平均值。在10-3M时OvIFNτ(139-172)与其它的肽有显著的差异。通过Scheffe F测验p＜0.05的差异分析来评测出显著性。因此，OvIFNτ(139-172)可能为IFNτ和各种IFNα共同的受体结合区域。
上述的OvIFNτ肽对IFNγ抗病毒活性没有表现出作用。如下所述评测了肽对牛IFNγ抗病毒活性的抑制能力。在OvIFNτ肽以不同浓度存在或不存在的情况下，将单层的Madin Darby牛肾细胞与40单位/ml的人牛IFNγ一起孵育。结果以不存在OvIFNτ肽的对照抗病毒活性的百分比来表示。数据如图16所示，为3次重复实验的平均值。通过Scheffe F测验p＜0.05的差异分析评测，各个肽没有显著差异。
两个合成肽OvIFNτ(1-37)和(139-172)也阻断OvIFNτ的抗FIV和抗HIV的活性。在14天的时间内对FIV感染的FET-1细胞(1×106/ml)和HIV感染的HPBL细胞(1×106/ml)监测逆转录酶(RT)的活性(实施例12和13)。使用100ng/ml的OvIFNτ和200μM的肽。从一个典型的实验中所得的数据以cpm/ml培养物上清来表示，图11A所示的为FIV感染的细胞，图11B为HIV感染的细胞。OvIFNτ的N-端和C-端都与其抗逆转录病毒的活性相关。两个肽都阻断FIT RT活性，但是只有C-端肽OvIFNτ(139-172)在猫细胞系Fc9中是泡状口炎病毒活性的有效抑制剂。因此I型IFN的C-端区域可能结合受体的共同位点，而N-端区域可能与特定功能的产生有关。
B.抗肽血清
还检测了抗肽的抗血清对OvIFNτ抗病毒活性的抑制能力。按如下所述评测抗肽的抗血清对OvIFNτ抗病毒活性的抑制能力。在1∶30稀释的免疫前血清或者上述每种OvIFNτ肽的抗血清存在下，将单层的MDBK细胞与20单位/mlOvIFNτ一起孵育。图17中的数据来自两次重复实验，以相对于适当的免疫前血清，抗肽抗血清产生的对OvIFNτ抗病毒活性的抑制的百分比±标准差表示。通过Scheffe F测验p＜0.05的差异分析评测。与肽对抗病毒活性的抑制一致，含有与OvIFNτ(1-37)，OvIFNτ(62-92)和OvIFNτ(139-172)免疫反应的抗体的血清，也是OvIFNτ抗病毒活性的最有效的抑制剂，他们所含的直接针对N-端和C-端肽的抗体是最为有效的。
同样的血清也用于检测对IFNτ与其受体结合的作用。
IFNτ结合试验如下进行。在25μl0.5M磷酸钾缓冲液，pH7.4，和10μl氯胺-T(5mg/ml)中，将5μl的IFNτ用500μCi的Na125I(15mCi/μg；Amersham Corporation，Arlingto Heights，IL)碘化2分钟(Griggs等1992)。碘化蛋白的特异活性为137μCi/μg。结合试验中，将单层的MDBK细胞与低聚甲醛混合，并用5％的脱脂奶粉封闭。在1∶30稀释的含有抗IFNτ肽抗体的血清或者适当的免疫前血清存在下，将细胞与2nM 125I IFNτ一起在加有1％BSA的磷酸缓冲液中于4℃孵育2小时。通过与100倍摩尔数过量的非标记IFNτ一起孵育来评测特异结合。例如，总结合计数是6850±133，而100倍摩尔数过量的OvIFNτ产生4398±158次计数/分钟。孵育后，单层细胞洗涤三次，用1％的十二烷基磺酸钠固定，作放射性计数。来自3次重复实验的数据如图18所示，以相对于适当的免疫前血清，抗肽抗血清产生的对OvIFNτ抗病毒活性的抑制的百分比平均值±标准偏差表示。通过Scheffe F测验的差异分析来评测出显著性。
同样的血清(含有与OvIFNτ(1-37)，OvIFNτ(62-92)和OvIFNτ(139-172)免疫反应的抗体)也是MDBK细胞上125I-IFNτ与其受体结合的最有效的抑制剂。血清与其它IFNτ-衍生肽免疫反应能力的缺乏，不随抗OvIFNτ滴度的变化而改变。因为，每种血清相对于这三种抑制血清，对其相应的肽具有相同的或更高的滴度：在用ELISA评测每种血清抗全长OvIFNτ分子反应能力的试验中得到了同样的结果。
这些肽虽然表面上能结合干扰素受体，但是他们本身在细胞中并不能够产生类似干扰素的效应。
C.抗增殖活性
利用合成肽也测试了IFNτ的抗增殖活性中功能上重要的位点(表10)。利用MDBK细胞同上所述检测细胞增殖。在实验1和2中以5×105细胞/孔，实验3中以10×5细胞/孔的浓度培养细胞，并以空白培养基为对照，加入浓度为300单位/ml的IFNτ和1M肽，培养48小时。每次计数2个重复孔，共进行3次重复实验。在统计分析中，以空白培养基的数据为基准，通过最小显著性差异多重比较测验(p＜0.05)的差异分析对数据进行评测。
表10  肽对IFNτ抗病毒活性抑制
处理           实验1           实验2             实验3
  细胞计数   存活性   细胞计数   存活性   细胞计数   存活性
  仅培养基   9.8×105   99％   13.0×105   96％   27.3×105   97％
  IFNτ   5.0×105   96％   5.6×105   97％   8.3×105   97％
  IFNτ+IFNτ(1-37)   6.3×105   100％   10.6×105   98％   13.4×105   100％
  IFNτ+IFNτ(34-64)   5.3×106   96％   6.9×105   95％   16.0×105   96％
  IFNτ+IFNτ(62-92)   6.5×105   97％   9.2×105   93％   8.9×105   96％
  IFNτ+IFNτ(90-122)   5.9×105   100％   11.0×105   97％   19.6×105   96％
  IFNτ+IFNτ(119-150)   8.4×105   100％   13.2×105   96％   31.8×105   90％
  IFNτ+IFNτ(139-172)   5.1×105   100％   12.7×105   96％   18.9×105   96％
在两天的时间内对MDBK细胞增殖的监测中，细胞数增加大约两倍，具有95％以上的存活性。加入300单位/ml的OvIFNτ，则完全抑制了细胞的增殖而细胞存活性没有下降。OvIFNτ(119-150)是IFNτ抗病毒活性的最为有效的抑制剂。
可抑制OvIFNτ与受体结合的IFNτ(119-150)的抗血清，也对OvIFNτ的抗增殖效应起负作用。几种其他的肽，特别是IFNτ(139-172)，虽然也OvIFNτ的对抗增殖效应起负作用，但程度较小。
实施例18
IFNτ和IFNα的干扰素受体的差异识别
A.在MDBK细胞上试验OvIFNτ和人IFNαA的相对毒性
以生长于96孔板上的MDBK细胞进行细胞毒性试验。测试细胞用不同浓度的(如图中所示)IFNτ处理，IFNτ溶于加有2％新生小牛血清的100μl的EMEM中，对照细胞只用空白的溶液处理，试验重复三次。将OvIFNτDNA编码序列克隆到pHIL-S1 Pichia表达质粒(Invitrogen，San Diego，CA)上，质粒以BglII酶切，按供应商的说明用线性质粒转化Pichia pastoris(菌株GS115；Invitrogen)原生质体。重组的OvIFNτ蛋白通过转化的His+Mut-酵母细胞而表达，并通过离子交换和羟磷灰石层析纯化至同质水平(0.8×105单位/mg)。纯化的重组人IFNαA得自Biosource International(Camarillo，CA)。
细胞温育于37℃直到显微镜检测到明显的细胞死亡。细胞用结晶紫染色，洗涤平板并用2-甲氧基乙醇(甲基溶纤剂)浸取染料。在570nm测量洗脱染料的吸收值。
结果如图22A和22B所示。IFNτ对MDBK细胞的毒性比IFNα至少低30倍。IFNα导致50％的细胞死亡的浓度为2500单位/ml，而相比之下IFNτ的浓度为85000单位/ml。这些结果进一步确定了IFNτ和IFNα在它们的细胞毒性效应上明显地不同。
B.OvIFNτ不抑制IFNαA介导的细胞毒性
按照刚才上面所述的细胞毒性试验，检测了作为IFNα细胞毒性效应的竞争性拮抗剂的IFNτ低毒性浓度的可能性。
第一个实验如图23A所示，在细胞中加入IFNτ(50000单位/ml)和/或IFNαA(50000单位/ml)，按照刚才上面所述的方法进行试验。数据表明IFNτ的处理，以10倍高于IFNαA的浓度(但低毒性)，不阻断IFNαA对MDBK细胞的毒性。
第二个实验如图23B所示，用IFNτ(25000单位/ml)于37℃处理细胞1小时，然后不去除IFNτ再加入IFNαA(5000单位/ml)。结果表明，在细胞中加入IFNαA之前1小时，加入5倍以上浓度的IFNτ不阻断IFNαA的毒性。
和起来这些结果表明IFNτ对于IFNα细胞毒性效应只是一个弱的拮抗剂。考虑到这两个I型干扰素在结构和功能上的同源性(Jarpe等，1994)和他们在MDBK细胞上的特异抗病毒活性(Pontzer等，1988)，这是一个令人惊讶的发现。IFNτ不能阻断IFNαA的细胞毒性，这表明这些IFN与I型受体复合物结合的不同，可能启动了不同的信号事件。
C.125I标记的IFNτ和IFNα与MDBK细胞的结合
用Bolton-Flunter试剂(单[125I]碘衍生物～2000Ci/mmol，Amersham；1Ci＝37GBq)，如Langer和Pestka(1986)所述标记IFNτ和IFNαA。标记蛋白的比活性为40-70μCi/μg。标记的IFN保持了完整的在MDBK细胞上的抗病毒活性，在4℃下至少4周内没有变化。
按照对IFNαA所作的方法(Zoon等，1986)，进行了MDBK细胞上的结合试验。将6孔板上铺满的MDBK单层细胞4℃预冷，加入适当浓度的溶于2ml完全生长培养基的标记或未标记的IFNs，4℃下对于125I-IFNαA温育4小时，对于125I-IFNτ温育过夜(＞17小时)，使得结合至饱和状态。饱和度结合数据用“EBDA”程序(McPherson，1985)分析。
结果如图24A(125I-IFNτ)和24B(125I-IFNαA)所示。在每个浓度下加入100倍过量的相应的未标记的IFN而确定非特异结合。减去这些非特异结合计算出特异结合。非特异结合对于IFNτ小于20％，对于IFNαA小于7％。数值以平均值±SE作图。每个图中的插图为结合数据的Scatchard图(B，结合；F，游离)。
数据表明，125I-IFNτ以高特异性与MDBK细胞结合(图24A)。结合的Scatchard分析(图24A的插图)给出了一个近似的Kd值3.90×10-10M。该Kd值处于在不同的IFNα与不同的细胞类型的结合中的Kd值范围内(10-11到10-9)(Rubinstein等，1986；Aguet等，1983)，并相似于重组牛IFNαD(3.5×10-10M)和重组牛IFNτ(3.7×10-10M)与牛子宫内膜结合的数值(Li和Roberts，1994)。但是，125I-IFNαA与MDBK细胞结合的Scatchard分析(图24B的插图)得出了一个近似的IFNαA Kd值4.45×10-11M。这与以前报道的(6.0×10-11M)相似(Zoon等，1986)。Scatchard作图得到的125I-IFNαA总的受体浓度(4.62pM)与125I-IFNτ非常相似(4.22pM)。这些结果表明对MDBK细胞的IFN受体，IFNαA的Kd值比IFNτ的低10倍。而且，结果还提示，结合亲和力的实质上的不同导致了IFNτ不能“竞争”受体而阻断IFNαA毒性。
D.125I标记的IFNτ和IFNα与MDBK细胞的竞争结合
进行竞争性结合实验以确定IFNτ和IFNα结合于相同的受体。将6孔板上铺满的MDBK单层细胞以三份重复与所示浓度的未标记的IFNαA或IFNτ及0.2nM 125I-IFNτ(图25A)或0.02nM125I-IFNαA(图25B)保温。数值以相对于无竞争物存在的对照的百分比来表示。100％表示平均的特异结合对于125I-IFNτ是1673±51cpm(平均值±SE)，对于125I-IFNαA是1255.7±16.3cpm(平均值±SE)。对125I-IFNτ和125I-IFNαA，分别加入200nM未标记的IFNτ(11％的非特异结合)和20nM未标记的IFNαA(5％的非特异结合)以确定的其非特异结合，并从总的结合中减去。
IFNαA对125I-IFNτ结合MDBK细胞是一个有效的竞争剂(图25A)。事实上，在以50％的水平抑制的结合上，IFNαA的效率是IFNτ本身的40倍。在用重组人IFNαD作为竞争剂时得到了相似的结果。另外使用125I-IFNαA进行的交叉竞争的研究表明，以50％的水平置换125I-IFNαA，IFNαA的效率比IFNτ高40倍以上。
这些结果表明，对于MDBK细胞上的IFN受体，IFNαA比IFNτ具有高的多的亲和性，这与低10倍的Kd值相一致。而且，竞争实验给出了一个解释为什么过量的(5∶1)IFNτ不能阻断IFNαA对MDBK细胞的毒性效应。IFNαA的高受体亲和性提示IFNτ和IFNαA具有不同的受体识别，而解释了为什么IFNτ不能阻断IFNαA细胞的毒性效应。
E.针对IFNτ的N-端或C-端的抗血清对IFN与MDBK细胞结合的抑制
对如实施例17中所描述的抗IFNτ肽IFNτ(1-37)(N-端；SEQID NO：5)和IFNτ(139-172)(C-端；SEQ ID NO：10)的兔抗血清检测了它们对IFNα和IFNτ与MDBK细胞结合的阻断能力。将96孔板上铺满的MDBK单层细胞，与0.3μM生物素酰化的IFNα和IFNτ一起，在含有5％胎牛血清磷酸缓冲盐溶液和1∶30稀释的适当的抗血清中室温下温育3小时。用含有5％胎牛血清磷酸缓冲盐溶液洗涤后，用对-硝基苯作为底物通过“EXTRAVIDIN”-碱性磷酸盐结合使平板显色(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。按照供应商的说明用Immunopure NHS-LC-生物素酰化试剂盒(Pierce)进行IFNα和IFNτ的生物素酰化。按上面所述对125I标记的IFN的方法确定特异结合。
结果如图26所示。实心柱代表抗N-末端的抗血清对IFNα和IFNτ与MDBK细胞结合的抑制，阴影柱代表抗C-末端的抗血清的抑制。数据以平均吸收值±SD表示。对照样品用免疫前血清处理(空心柱)。
数据表明N-末端肽IFNτ(1-37)(SEQ ID NO：5)的抗血清特异阻断IFNτ与MDBK细胞结合，但不阻断IFNα。相反，C-末端肽IFNτ(139-172)(SEQ ID NO：10)的抗血清特异对IFNτ和IFNα与MDBK细胞结合都阻断。这些发现与关于IFNτ(1-37)含有一个IFNτ特有的表位而有助于IFNτ在MDBK细胞上的结合与活性的假说相一致。此外，数据提示IFNα和IFNτN-末端不同的相互作用至少是部分地因为MDBK细胞受体的差异竞争。
F.在MDBK细胞中IFNτ和IFNα的剂量反应/占据曲线
用上述的数据作为浓度的函数作图，计算(i)最大抗病毒活性的百分比，(ii)最大细胞毒性百分比，和(iii)IFNα和IFNτ与MDBK细胞最大结合的百分比的剂量反应/占据曲线，或浓度效应曲线，如图27A(IFNτ)和27B(IFNα)所示。利用泡状口炎病毒通过致细胞病变效应抑制试验(Armstrong，1981)对抗病毒活性定量，如实施例2所述，对IFNαA用2×108单位/mg的量为基准。来自细胞毒性剂量反应曲线和饱和结合曲线的数据再以最大值百分比作图。通过MDBK细胞上2×108单位/mg的IFNα和0.8×108单位/mg的IFNτ的特异活性，从抗病毒单位来确定浓度。符号如下：最大抗病毒活性的百分比(○)，最大细胞毒性百分比(□)，和最大结合的百分比(◇)。
结果表明细胞毒性与受体的饱和结合相关，而抗病毒活性涉及到受体的分部占据。就是说，毒性与Kd相关。IFNαA以比IFNτ高10倍的亲和力结合于MDBK细胞，而在低得多的浓度下就具有毒性。这两个IFN的特异抗病毒活性相似，IFNα为2×108单位/mg蛋白而IFNτ为0.8×108单位/mg蛋白，这与仅以较低的受体分部占据而得到最大抗病毒活性是一致的。
G.IFNτ和IFNαA对Tyk2，Stat1α和Stat2的磷酸化
IFNs与受体的结合通过涉及到一系列磷酸化激活的酪氨酸激酶和转录因子的信号传导机制在细胞中被解释。因此进行了实验以确定在激活I型受体相关的酪氨酸激酶Tyk2和转录因子Stat1α和Stat2上，IFNτ和IFNαA的结合差异是否导致了明显的变化。
在RPM1 1640培养基中的Dauli细胞(4-5×107个细胞/ml样品)，用5000单位/ml的IFNτ或IFNαA刺激，或者37℃下不给与处理4分钟(Tyk2)或10分钟(Stat1α和Stat2)。然后将细胞在500μl冰冷的裂解缓冲液中4℃裂解20分钟。裂解缓冲液含有50mM Tris HCl(pH7.4)，150ml NaCl，2mM EDTA，2mM EGTA，50mM NaF，20mM B-磷酸甘油，2mM Na3VO4，0.05mM对-硝基苯酰-对-胍基苯甲酸(来自溶于二甲基甲酰胺的储存液)，亮肽素(10μg/ml)，抑胃肽(10μg/ml)，抑肽酶(10μg/ml)，苯甲脒(5μg/ml)，1mM苯甲基磺酰氟，10％(v/v)甘油，和1％(vol/vol)”NONIDET P-40”。
用1μg的抗-Tyk2抗体或者1μg抗Stat1α和1μg抗Stat2抗体的混合物对抽提物免疫沉淀，并进行免疫印迹后，用单克隆抗-磷酸酪氨酸(抗-PY)抗体(4G10)探测印迹，并用ECL(Amersham)检测Tyk2，Stat1α和Stat2的酪氨酸磷酸化。然后印迹除去抗-PY用Tyk2蛋白的抗体或Stat1和Stat2抗体的混合物再次探测。
结果表明在Tyk2磷酸化中IFNτ与IFNα同样有效。未刺激的细胞中和用IFNs刺激的细胞中，在Tyk2的水平上没有显示出差异。IFNτ与IFNα对Stat1α和Stat2豆诱导出类似水平的磷酸化。而且，从未刺激和刺激的细胞中免疫沉淀的Stat1α和Stat2在蛋白水平上没有显示出差异。因此，IFNτ在其结构和功能上保持了IFNα相似性，而在激活这些涉及I型受体的信号转导蛋白上与IFNα相似。
实施例19
对IFNτ的细胞效应和抗病毒效应进一步的分析
A.抗HIV病毒的效应
通过在感染HIV时用不同数量的重组羊IFNτ(OvIFNτ)或者重组人IFNαA处理人PBMC细胞，评测IFNτ抗HIV的抗病毒效应。在整个实验中都加有IFNτ。在第7天和第14天测定p24产物(ELISA法(Wang等，1988，1989)，并与零药物对照相比较)。分析结果如表11所示。
表11
         药物量单位/ml   ％抑制第7天   ％抑制第14天
IFNα2a IFNτ
  10   26   58％，48％48％，45％   91％，91％88％，59％
  100   260   68％，74％58％，51％   94％，91％82％，70％
  1,000   2,600   89％，86％65％，68％   97％，93％87％，79％
  10,000   26,000260,000   90％，86％77％，85％85％，84％   99％，99％77％，96％96％，86％
这些实验的数据得出的结论是，在相对低的浓度下，IFNα2a和IFNτ都能够有效地降低HIV在人淋巴细胞中的复制。
B.在PBMC’s中的体外细胞毒性的测验
以5×105个细胞/ml接种人PBMC’s。细胞在第0天用3μg/mlPHA刺激。用重组人IFNα2A(浓度为10，100，1000和10000单位/ml)和IFNτ(浓度为2.6，26，260，2600，260000，和2600000单位/ml)处理细胞(用96孔平底板，每个浓度重复4次)。对照培养物中不加入干扰素。温育4天后，用1μCi/孔的3H-胸腺嘧啶脉冲细胞9小时。收集细胞并测定标记的胸腺嘧啶在DNA中的掺入(图8)。
在任何浓度的IFNτ下通过测量的胸腺嘧啶的掺入没有发现细胞毒性。然而，rHuIFNα2在1000单位/ml下对细胞就具有毒性。
第二个实验中，用IFNτ或人IFNα2A以100单位/ml或10000单位/ml的浓度处理相同的人PBMC’s。3天或8天的温育后，存活的细胞通过流式细胞器计数。分析结果如表12所示。
表12
处理(单位/ml) 活细胞数×10,000
  第3天   第8天
  未处理   735   840
  IFNτ100单位/mlIFNτ10,000单位/ml   745695   860910
  IFNα2a 100单位/mlIFNα2a 10,000单位/ml   635680   750495
在用IFNτ处理的细胞中没有发现细胞毒性。然而，用IFNα2a处理3天的细胞中有10％，处理8天的细胞中有49％的细胞死亡。
C.对肝细胞中乙肝病毒复制的抑制
所用的细胞系，HepG2-T14，是一种人细胞，衍生自感染乙肝病毒(HBV)的肝细胞。该细胞系半稳定地产生HBV病毒：随时间的延长，该细胞系产生的HBV细胞内DNA和分泌的病毒逐渐下降。为了获得HBV DNA和病毒的最大产量，用deAZA-C(5-氮胞苷；Miyoshi等，1992)对该细胞预处理，以诱导病毒的产生。处理2-3天，诱导的数量是2的阶数。
然后用IFNα或IFNτ以0，5000，10000，20000和40000单位/ml的水平处理细胞。
与无药对照相比，所有水平的IFNα或IFNτ以2的阶数降低了DNA产量。
D.对肝细胞中肝特异信使RNA的抑制
用肝细胞系HepG2-T14(如上所述)测定IFNα或IFNτ对肝特异信使RNA的效应。将细胞与0，5000，10000，20000和40000单位/ml的IFNα或IFNτ一起温育。利用对两个mRNA特异的探针(Shoulders等，1982；Wallis等，1983)，通过杂交分析(Sambrook等，1989；Maniatis等，1982)检测肝细胞特异的蛋白ApoE和ApoA1的信使RNA。
以高达40000单位的IFNα或IFNτ处理，都没有发现ApoE和ApoA1的mRNA产量的降低。该结果提示，前面的实验中病毒DNA复制的降低不是由于IFN对细胞看家活性的作用；降低更可能是由于对宿主中病毒复制的特异抑制。
E.IFNβ，IFNγ和IFNτ的体外毒性-L929细胞试验
利用鼠L929细胞系体外测定IFN处理的毒性。L929细胞用6000U/ml至200000U/ml的OvIFNτ或MuIFNβ处理。在时间为零时加入干扰素，细胞温育72小时用结晶紫染色。通过测量405nm处的吸收值确定活细胞的百分比。
例举的数据如图21所示。数值以存活性百分比±标准差的形式表示，其中100％相当于只用空白溶液处理L929细胞的存活性。随着IFNβ浓度的增加，L929细胞的存活性以剂量依赖的形式下降。相反，在测试的IFNτ的各个浓度下，细胞存活性都没用表现出下降。这些数据表明不同于IFNβ，IFNτ在体外的高浓度下没有毒性。
上述的结果综合起来说明，无论在体内或在体外，IFNτ在IFNβ会导致毒性的浓度下基本上是无毒的。
F.IFNβ，IFNγ和IFNτ的体内毒性—细胞计数和重量的变化
按如下所述测试了NZW小鼠中用IFNτ，IFNβ和IFNα(105U/注射)体内处理，对总白细胞(WBC)、总淋巴细胞的计数和体重的效应。以105U的浓度，总体积2mlPBS溶液，对几组新西兰白色(NZW)小鼠(Jackson laboratories，BarHarbor，ME)腹膜内注射(i.p.)干扰素(OvIFNτ，MuIFNβ和MuIFNα)。每组中包括3-4只动物。在注射前以及其后所选定的时间点(一般为12和24小时)，用血细胞计数器和标准的技术测定白细胞数(WBC)。在Wright-Giemsa染色的血涂片上进行差示WBC计数。注射前动物的体重范围在20至23克。
结果总结在表13中。
表13  通过白细胞计数和体重变化的百分比测定干扰素的体内毒性
  IFN                            细胞计数(细胞数×103)   淋巴细胞脱阻抑   注射24小时后重量变化
              注射前            注射后12小时
  总WBC   淋巴细胞   总WBC   注射后12小时
  无   7.3±1.0   6.4±0.7   8.0±0.8   7.1±0.7   0   +0.5±0.7
  τ   6.7±0.7   5.9±0.6   6.7±0.5   5.8±0.4   1.7   +1.3±0.5
  β   7.0±1.4   6.0±0.5   6.8±0.8   4.1±0.3   31.7   -20.0±1.0
  α   6.0±0.8   5.2±0.7   4.8±0.5   2.3±0.2   55.8   -8.5±2.0
在IFNτ处理的和未经处理的小鼠之间，没有发现WBC数，淋巴细胞数或体重变化的显著差异。相反，IFNβ处理的小鼠在注射12小时后表现出31.7％的淋巴细胞脱阻抑，并至少在其后的12小时中继续。IFNα处理的小鼠在注射12小时后表现出55.8％的淋巴细胞脱阻抑以及显著的体重下降。这些数据表明，如外周血细胞计数和体重测量所证实的，不同于IFNβ和IFNα，IFNτ在上述的浓度下没有体内毒性。
实施例20
杂合干扰素融合蛋白的分离
结合了抗-β半乳糖苷酶的Sepharose 4B树脂购自Promega。将树脂装于2ml的柱子中，并用含有0.02％叠氮钠的磷酸缓冲液溶液和10mlTX缓冲液(10mM Tris缓冲液，pH7.4，1％抑肽酶)依次清洗。
将一个杂合干扰素的编码序列克隆到λgt11的多克隆位点上。该嵌合的编码序列在λgt11上同阅读框地位于半乳糖苷酶编码序列氨基端。将感染gt11/IFN的溶源性细菌接种于500ml NZYDT培养基中。培养物于32℃通风培养至0.2至0.4个OD值，然后迅速升温至43℃，于43℃水浴15分钟以诱导gt11肽的合成，于37℃浴1小时。离心沉淀细胞，并用10ml裂解缓冲液(10mM Tris，pH7.4，含有2％”TRITON X-100和用前新鲜配制的1％抑肽酶)悬浮。
重新悬浮的细胞在液氮中速冻然后解冻，使得细胞基本上完全裂解。裂解物用DNaseI消化细菌和噬菌体DNA，以裂解物粘度下降来确实。不溶性物质通过离心去除。
澄清的裂解液在Sepharose柱上上样，将柱子的端口封闭，在室温下置于旋转器上振荡2小时，在4℃下16小时。融合蛋白用0.1在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH10洗脱。通常，14ml的洗脱液穿过柱子，融合蛋白被洗脱于第4-6ml的洗脱液中。
含有融合蛋白的洗脱液在“CENTRICON-30”仪器(Amicon，Danvers，Mass.)中浓缩。最终的融合蛋白浓缩物重新悬浮于例如400μl PBS缓冲液。蛋白的纯度用SDS-PAGE分析。
为了获得单克隆抗体，将纯化的融合蛋白和Freund佐剂一起皮下注射兔。在第0天和第21天注射大约1mg的融合蛋白，兔血清通常在第6和第8周收集。
实施例21
抗hybIFN抗体的制备
A.谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白的表达
将一个杂合干扰素的编码序列的嵌合核酸分子克隆到pGEX载体上(Boyer等，1992；Frangioni等，1993；Guan等，1991；Hakes等，1992；Smith，D.B.等，1988)。在pGEX载体(Smith，D.B.等，1988)中与谷胱甘肽-S-转移酶蛋白(GST-sj编码序列)同阅读框地插入一个凝血酶切点序列。此修改的载体记作pGEXthr。杂合IFN(hybIFN)编码序列同阅读框地连接于sj26-凝血酶编码序列(Guan等，。991；Hakes等，1992)。
将杂合干扰素编码序列与线性化的载体相连接。连接混合物转化入E.coli.中，选取氨苄青霉毒素抗性的菌落。从氨苄青霉素抗性的菌落中分离质粒，并用限制酶消化分析鉴定出含有IFN插入物的克隆(载体记作pGEXthr-hybIFN)。
将pGEXthr-hybIFN转化E.coli.菌株XL-I Blue，并于37℃培养过夜。从随机挑取的克隆中制备DNA。确定是否存在插入的编码序列通常根据(i)限制酶切图谱，(ii)用标记的hybIFN探针进行杂交扫描(如，Southern分析)，或(iii)直接的DNA序列分析。
B.融合蛋白的部分纯化
将pGEXthr-hybIFN克隆培养过夜。用含有氨苄青霉素的LB培养基1∶10地稀释过夜培养物并继续在37℃生长1小时。或者将过夜培养物1∶100稀释并培养生长至0.5-1.0的OD值，然后加入IPTG(异丙基-β-硫代半乳糖苷)。加入IPTG(GBICO-BRL，GaithersburgMD)至终浓度为0.2-0.5mM以诱导蛋白表达，温育通常持续2-5小时，优选地为3.5小时。
离心收集细菌细胞并用1/100培养物体积的MTPBS(150mMNaCl，16mM Na2HPO4，4mM NaH2PO4)重新悬浮。通过溶菌酶，超声处理或Frech加压使细胞裂解，并通过离心清除裂解物中的细胞碎片。
将一份经IPTG诱导的含有细胞的pGEXthr-hybIFN培养物悬浮液，和一份IPTG诱导的只含有pGEXthr载体的培养物悬浮液，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后作Western blot分析，如下所述。
如果需要，抽提物可以用例如“CENTRICON 10”滤器进行超滤浓缩。
或者，通过谷胱甘肽琼脂糖亲和柱，按照Smith，D.B.等，1988所详细描述的方法，部分纯化融合蛋白。再此方法中，过夜培养100ml培养物。培养物稀释到1升，并于37℃继续培养1小时。用IPTG诱导融合蛋白的表达。诱导的培养物于37℃继续培养3.5小时。收集细胞并用超声波仪裂解细胞。沉淀细胞碎片，将澄清的裂解液上样于一个谷胱甘肽“SEPHAROSE”柱。以几个柱体积清洗柱子。带有还原型谷胱甘肽的融合蛋白从柱子上洗脱下来，并进行透析。用凝血酶处理将IFN从结合的杂合蛋白上释放出来。通过在层析柱上或在凝胶上的分子筛大小分部分离，将结合的杂合蛋白的sj26和hybIFN片段分离。
或者，通过凝血酶处理从层析柱上释放出结合的杂合蛋白中的hybIFN部分。
C.抗融合蛋白的抗体
将纯化的Sj26/IFN融合蛋白，与Freund佐剂一起，对兔子进行皮下注射。在第0天和第21天注射大约1mg的融合蛋白，通常于第6周和第8周收集兔血清。第二只兔子类似地用从对照细菌裂解物中纯化的Sj26蛋白免疫。
从下列细菌培养物中制备小量裂解物：(1)以pGEXthr和含有hybIFN插入物的pGEXthr质粒感染的KM392细胞；和(2)以含有hybIFN插入物的λgt11感染的细胞。将小量裂解物和商业购买的β-半乳糖苷酶在SDS-PAGE上分部分离，并将条带转移至醋酸纤维膜上进行Western blot(Sambrook等，1989；Ausubel等，1988)。
总结预期的结果，来自对照(Sj26)兔的血清与各种Sj26和Sj26融合蛋白抗原发生免疫反应。来自用Sj26/hybIFN融合蛋白免疫的动物的血清，与所有的Sj26和含有hybIFN编码序列的β-gal融合蛋白反应，这表明具有对抗原的特异免疫反应。没有血清预期会对β-半乳糖苷酶起免疫反应。
通过亲和层析(以固定的重组产物的hybIFN作为配基，基本上按实施例12中所述的关于抗β-半乳糖苷酶抗体的方法)对来自Sj26/hybIFN免疫的动物的血清中存在的抗hybIFN抗体进行纯化。
虽然在本发明的描述中提及了特定的方法和实施方案，但是应当意识到可以不背离本发明而对其进行各种修改和变化。
序列表
(1)一般信息：
    (i)申请人：佛罗里达大学
    (ii)发明名称：杂合干扰素组合物及其使用方法
    (iii)序列数目：55
    (iv)联系地址：
        (A)地址：Dehlinger&Associates
        (B)街道：350 Cambridge Ave.，Suite 250
        (C)城市：Palo Alto
        (D)州：CA
        (E)国家：美国
        (F)邮政编码：94306
    (v)计算机阅读格式：
        (A)介质类型：软盘
        (B)计算机类型：IBMPC兼容机
        (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
        (D)软件：PatenIN Release#1.0，#1.25版
    (vi)本申请数据：
        (A)申请号
        (B)申请日：1997年4月11日
        (C)分类：
    (vii)在先申请数据：
        (A)申请号：US 08/631,328
        (B)申请日：1996年4月12日
    (viii)律师/代理人信息：
        (A)姓名：Sholtz，Charles K.
        (B)注册号：38,615
        (C)文档号：5600-0201.41
    (ix)电子通讯信息：
        (A)电话：415-324-0880
        (B)电传：415-324-0960
(2)序列号：1(SEQ ID NO：1)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：516个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链性：双链
        (D)拓扑：环状
    (ii)分子类型：DNA
    (iii)假说：否
    (iv)反义：否
    (vi)原始来源：
        (A)有机体：Ovis aries
        (B)品系：国内
        (C)发育阶段：囊胚(囊胚泡)
        (D)组织类型：滋养外胚层
        (E)细胞类型：单核滋养外胚层细胞
    (vii)直接来源：
        (B)克隆：oTP-1a
        (viii)基因组位置：
        (C)单位：bp
    (ix)特征：
        (A)名称/关键：CDS
        (B)位置：1..516
    (x)出版物信息：
        (A)作者：Ott，Troy L
                 Van Heeke，Gino
                 Johnson，Howard M
                 Bazer，Fuller W
        (B)题目：I型滋养层干扰素羊滋养层蛋白-1在啤酒糖酵母中的克隆和表达：纯化和抗病毒活性
        (C)期刊：J.Interferon Res.
        (D)卷：11
        (F)页：357-364
        (G)日期：1991
        (K)在SEQ ID NO：1中的相关残基：1-516
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：1
TGC TAC CTG TCG CGA AAA CTG ATG CTG GAC GCT CGA GAA AAT TTA AAA
48
Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Aan Leu Lys
  1               5                  10                  15
CTG CTG GAC CGT ATG AAT CGA TTG TCT CCG CAC AGC TGC CTG CAA GAC
96
Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp
             20                  25                  30
CGG AAA GAC TTC GGT CTG CCG CAG GAA ATG GTT GAA GGT GAC CAA CTG    144
Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Asp Gln Leu
         35                  40                  45
CAA AAA GAC CAA GCT TTC CCG GTA CTG TAT GAA ATG CTG CAG CAG TCT    192
Gln Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ser
     50                  55                  60
TTC AAC CTC TTC TAC ACT GAA CAT TCT TCG GCC GCT TGG GAC ACT ACT    240
Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr
 65                  70                  75                  80
CTT CTA GAA CAA CTG TGC ACT GGT CTG CAA CAG CAA CTG GAC CAT CTG    288
Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu Gln Gln Gln Leu Asp His Leu
                 85                  90                  95
GAC ACT TGC CGT GGC CAG GTT ATG GGT GAA GAA GAC TCT GAA CTG GGT    336
Asp Thr Cys Arg Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly
            100                 105                 110
AAC ATG GAT CCG ATC GTT ACT GTT AAA AAA TAT TTC CAG GGT ATC TAC    384
Asn Met Asp Pro Ile Val Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr
        115                 120                 125
GAC TAC CTG CAG GAA AAA GGT TAC TCT GAC TGC CCT TGG GAA ATC GTA    432
Asp Tyr Leu Gln Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val
    130                 135                 140
CGC GTT GAA ATG ATG CGG GCC CTG ACT GTG TCG ACT ACT CTG CAA AAA    480
Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gln Lys
145                 150                 155                 160
CGG TTA ACT AAA ATG GGT GGT GAC CTG AAT TCT CCG                    516
Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro
                165                 170
(2)序列号：2(SEQ ID NO：2)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：172个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离：一个成熟的OvIFNτ蛋白的氨基酸序列
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：2
Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys
  1               5                  10                  15
Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp
             20                  25                  30
Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Asp Gln Leu
         35                  40                  45
Gln Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ser
     50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr
 65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu Gln Gln Gln Leu Asp His Leu
                 85                  90                  95
Asp Thr Cys Arg Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly
            100                 105                 110
Asn Met Asp Pro Ile Val Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr
        115                 120                 125
Asp Tyr Leu Gln Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val
    130                 135                 140
Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gln Lys
145                 150                 155                 160
Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro
                165                 170
(2)序列号：3(SEQ ID NO：3)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：516个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链性：单链
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离：编码一个成熟的人τ-干扰素蛋白，HuIFNτ1的合成的核苷酸序列
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：3
TGTGACTTGT CTCAAAACCA CGTTTTGGTT GGTAGAAAGA ACTTAAGACT ACTAGACGAA     60
ATGAGACGTC TATCTCCACG CTTCTGTCTA CAAGACAGAA AGGACTTCGC TTTGCCTCAG    120
GAAATGGTTG AAGGTGGCCA ACTACAAGAA GCTCAAGCGA TATCTGTTTT GCACGAAATG    180
TTGCAACAAA GCTTCAACTT GTTCCACACC GAACACTCTT CGGCCGCTTG GGACACCACC    240
TTGTTGGAAC AGCTCAGAAC CGGTTTGCAC CAACAATTGG ACAACTTGGA TGCATGTTTG    300
GGTCAAGTTA TGGGTGAAGA AGACTCTGCT CTCGGGAGAA CCGGTCCAAC GCTAGCTTTG    360
AAGAGATACT TCCAAGGTAT CCACGTTTAC TTGAAGGAAA AGGGTTACTC TGACTGTGCT    420
TGGGAAACCG TGCGTCTAGA AATCATGCGT AGCTTCTCTT CTTTGATCAG CTTGCAAGAA    480
AGATTACGTA TGATGGACGG TGACTTGTCG AGCCCA                              516
(2)序列号：4(SEQ ID NO：4)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：172个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (C)链性：单链
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离：一个成熟的HuIFNτ蛋白，HuIFNτ1的氨基酸序列
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：4
Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg
1               5                   10                  15
Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp
            20                  25                  30
Arg Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu
        35                  40                  45
Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe His Thr Glu Hia Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asn Leu
                85                  90                  95
Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly
            100                 105                 110
Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His
        115                 110                 125
Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val
    130                 135                 140
Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser Leu Ile Ser Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro
                165                 170
(2)序列号：5(SEQ ID NO：5)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：37个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离：SEQ ID NO：2的1-37片段的氨基酸序列
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：5
Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys
                  5                  10                  15
Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp
             20                  25                  30
Arg Lys Asp Phe Gly
         35
(2)序列号：6(SEQ ID NO：6)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：31个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：SEQ ID NO：2的34-64片段的氨基酸序列
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：6
Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Asp Gln Leu Gln
                  5                  10                  15
Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ser
             20                  25                  30
(2)序列号：7(SEQ ID NO：7)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：31个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：SEQ ID NO：2的62-92片段的氨基酸序列
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：7
Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Set Ser Ala Ala Trp
                  5                  10                  15
Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu Gln Gln Gln
             20                  25                  30
(2)序列号：8(SEQ ID NO：8)的信息；
    (i)序列特征：
        (A)长度：33个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：SEQ ID NO：2的92-122片段的氨基酸序列
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：8
G1n Gln Gln Leu Asp His Leu Asp Thr Cys Arg Gly Gln Val Met Gly
                  5                  10                  15
Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly Asn Met Asp Pro Ile Val Thr Val Lys
             20                  25                  30
Lys
(2)序列号：9(SEQ ID NO：9)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：32个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：SEQ ID NO：2的119-150片段的氨基酸序列
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：9
Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr Asp Tyr Leu Gln Glu Lys
                  5                  10                  15
Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Val Glu Met Met Arg
             20                  25                  30
(2)序列号：10(SEQ ID NO：10)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：34个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：SEQ ID NO：2的139-172片段的氨基酸序列
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：10
Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val
                  5                  10                  15
Ser Thr Thr Leu Gln Lys Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn
             20                  25                  30
Ser Pro
(2)序列号：11(SEQ ID NO：11)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：588个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链性：双链
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：DNA(基因组)
    (iii)假说：否
    (iv)反义：否
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：带有一个前导序列的HuIFNτ1人T-干扰素的编码序列
    (ix)特征：
        (A)名称/关键：CDS
        (B)位置：1..585
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：11
ATG GCC TTC GTG CTC TCT CTA CTC ATG GCC CTG GTG CTG GTC AGC TAC
48
Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr
  1               5                  10                  15
GGC CCA GGA GGA TCC CTG GGT TGT GAC CTG TCT CAG AAC CAC GTG CTG
96
Gly Pro Gly Gly Ser Leu Gly Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu
             20                  25                  30
GTT GGC AGG AAG AAC CTC AGG CTC CTG GAC GAA ATG AGG AGA CTC TCC    144
Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser
         35                  40                  45
CCT CGC TTT TGT CTG CAG GAC AGA AAA GAC TTC GCT TTA CCC CAG GAA    192
Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gln Glu
     50                  55                  60
ATG GTG GAG GGC GGC CAG CTC CAG GAG GCC CAG GCC ATC TCT GTG CTC    240
Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu
 65                  70                  75                  80
CAT GAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC AAC CTC TTC CAC ACA GAG CAC TCC    288
His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser
                 85                  90                  95
TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC CTC CTG GAG CAG CTC CGC ACT GGA CTC    336
Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu
            100                 105                 110
CAT CAG CAG CTG GAC AAC CTG GAT GCC TGC CTG GGG CAG GTG ATG GGA    384
His Gln Gln Leu Asp Asn Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly
        115                 120                 125
GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA AGG ACG GGC CCC ACC CTG GCT CTG AAG    432
Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys
    130                 135                 140
AGG TAC TTC CAG GGC ATC CAT GTC TAC CTG AAA GAG AAG GGA TAC AGC    480
Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser
145                 150                 155                 160
GAC TGC GCC TGG GAA ACC GTC AGA CTG GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT    528
Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser
                165                 170                 175
TCA TTA ATC AGC TTG CAA GAA AGG TTA AGA ATG ATG GAT GGA GAC CTG    576
Ser Leu Ile Ser Leu Gln Glu Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu
            180                 185                 190
AGC TCA CCT TGA                                                    588
Ser Ser Pro
        195
(2)序列号：12(SEQ ID NO：12)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：139个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：SEQ ID NO：11(HuIFNτ1)的预测的氨基酸序列
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：12
Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr
  1               5                  10                  15
Gly Pro Gly Gly Ser Leu Gly Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Ieu
             20                  25                  30
Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser
         35                  40                  45
Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gln Glu
     50                  55                  60
Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu
 65                  70                  75                  80
His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser
                 85                  90                  95
Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu
            100                 105                 110
His Gln Gln Leu Asp Asn Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly
        115                 120                 125
Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys
    130                 135                 140
Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser
145                 150                 155                 160
Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser
                165                 170                 175
Ser Leu Ile Ser Leu Gln Glu Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu
            180                 185                 190
Ser Ser Pro
        195
(2)序列号：13(SEQ ID NO：13)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：25个碱基
        (B)类型：核酸
        (C)链性：单链
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：DNA(合成)
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：25-mer合成的寡核苷酸
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：13
CCTGTCTGCA GGACAGAAAA GACTT
25
(2)序列号：14(SEQ ID NO：14)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：25个碱基
        (B)类型：核酸
        (C)链性：单链
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：DNA(合成
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：25-mer合成的寡核苷酸
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：14
TCTGAATTCT GACGATTTCC CAGGC
25
(2)序列号：15(SEQ ID NO：15)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：37个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：肽
    (iii)假说：否
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：SEQ ID NO：4的1-37片段的氨基酸序列
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：15
Cys Asp Leu ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg
1               5                   10                  15
Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp
            20                  25                  30
Arg Lys Asp Phe Ala
        35
(2)序列号：16(SEQ ID NO：16)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：31个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：肽
    (iii)假说：否
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：SEQ ID NO：4的34-64片段的氨基酸序列
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：16
Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser
            20                  25                  30
(2)序列号：17(SEQ ID NO：17)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：31个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：肽
    (iii)假说：否
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：SEQ ID NO：4的62-92片段的氨基酸序列
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：17
Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp
1               5                   10                  15
Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln
            20                  25                  30
(2)序列号：18(SEQ ID NO：18)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：33个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：肽
    (iii)假说：否
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：SEQ ID NO：4的90-122片段的氨基酸序列
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：18
His Gln Gln Leu Asp Asn Leu Aap Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly
1               5                   10                  15
Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys
            20                  25                  30
Arg
(2)序列号：19(SEQ ID NO：19)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：32个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：肽
    (iii)假说：否
    (vi)原始来源：
            (C)个体分离物：SEQ ID NO：4的119-150片段的氨基酸序列
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：19
Ala Leu Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys
1               5                   10                  15
Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val Arg Leu Glu Ile Met Arg
            20                  25                  30
(2)序列号：20(SEQ ID NO：20)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：34个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：肽
    (iii)假说：否
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：SEQ ID NO：4的139-172片段的氨基酸序列
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：20
Cys Ala Trp Glu Thr Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser
1               5                   10                  15
Leu Ile Ser Leu Gln Glu Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser
            20                  25                  30
Ser Pro
(2)序列号：21(SEQ ID NO：21)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：299个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链性：双链
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：cDNA至mRNA
    (iii)假说：否
    (iv)反义：否
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：HuIFNτ6
    (ix)特征：
    (A)名称/关键：CDS
    (B)位置：2..298
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：21
C CAG GAG ATG GTG GAG GGC GGC CAG CTC CAG GAG GCC CAG GCC ATC
46
  Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile
    1               5                  10                  15
TCT GTG CTC CAC AAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC AAC CTC TTC CAC ACA
94
Ser Val Leu His Lys Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr
                 20                  25                  30
GAG CGC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC CTC CTG GAG CAG CTC CGC    142
Glu Arg Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg
             35                  40                  45
ACT GGA CTC CAT CAG CAG CTG GAT GAC CTG GAC GCC TGC CTG GGG CAG    190
Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln
         50                  55                  60
GTG ACG GGA GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA AGG ACG GGC CCC ACC CTG    238
Val Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu
     65                  70                  75
GCC GTG AAG AGC TAC TTC CAG GGC ATC CAT ATC TAC CTG CAA GAG AAG    286
Ala Val Lys Ser Tyr Phe Gln Gly Ile His Ile Tyr Leu Gln Glu Lys
 80                  85                  90                  95
GGA TAC AGC GAC T                                                  299
Gly Tyr Ser Asp
(2)序列号：22(SEQ ID NO：22)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：99个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：SEQ ID NO：21的预测的氨基酸序列(HuIFNτ6)
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：22
Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser
  1               5                  10                  15
Val Leu His Lys Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu
             20                  25                  30
Arg Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr
         35                  40                  45
Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val
     50                  55                  60
Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala
 65                  70                  75                  80
Val Lys Ser Tyr Phe Gln Gly Ile His Ile Tyr Leu Gln Glu Lys Gly
                 85                  90                  95
Tyr Ser Asp
(2)序列号：23(SEQ ID NO：23)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：288个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链性：双链
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：cDNA至mRNA
    (iii)假说：否
    (iv)反义：否
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：HuIFNτ7
    (ix)特征：
        (A)名称/关键：CDS
        (B)位置：2..286
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：23
C CAG GAG ATG GTG GAG GTC AGC CAG TTC CAG GAG GCC CAG GCC ATT
46
  Gln Glu Met Val Glu Val Ser Gln Phe Gln Glu Ala Gln Ala Ile
    1               5                  10                  15
TCT GTG CTC CAT GAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC AAC CTC TTC CAC AAA
94
Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Lys
                 20                  25                  30
GAG CGC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACT ACC CTC CTG GAG CAG CTC CTC    142
Glu Arg Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Leu
             35                  40                  45
ACT GGA CTC CAT CAG CAG CTG GAT GAC CTG GAT GCC TGT CTG GGG CAG    190
Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln
         50                  55                  60
TTG ACT GGA GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA AGG ACG GGC CCC ACC CTG    238
Leu Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu
     65                  70                  75
GCC GTG AAG AGC TAC TTC CAG GGC ATC CAT GTC TAC CTG CAA GAG AAG    286
Ala Val Lys Ser Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Gln Glu Lys
 80                  85                  90                  95
GG                                                                 288
(2)序列号：24(SEQ ID NO：24)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：95个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：SEQ ID NO：23的预测的氨基酸序列(HuIFNτ7)
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：24
Gln Glu Met Val Glu Val Ser Gln Phe Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser
  1               5                  10                  15
Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Lys Glu
             20                  25                  30
Arg Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Leu Thr
         35                  40                  45
Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Aap Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Leu
     50                  55                  60
Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Giy Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala
 65                  70                  75                  80
Val Lys Ser Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Gln Glu Lys
                 85                  90                  95
(2)序列号：25(SEQ ID NO：25)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：307个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链性：双链
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：cDNA至mRNA
    (iii)假说：否
    (iv)反义：否
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：HuIFNτ4
    (ix)特征：
        (A)名称/关键：CDS
        (B)位置：2..307
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：25
C CAG GAG ATG GTG GAG GGT GGC CAG CTC CAG GAG GCC CAG GCC ATC
46
  Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile
    1               5                  10                  15
TCT GTG CTC CAC GAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC AAC CTC TTC CAC ACA
94
Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr
                 20                  25                  30
GAG CAC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC CTC CTG GAG CAG CTC CGC    142
Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg
             35                  40                  45
ACT GGA CTC CAT CAG CAG CTG GAT GAC CTG GAT GCC TGC CTG GGG CAG    190
Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln
         50                  55                  60
GTG ACG GGA GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA AGG ACG GGC CCC ACC CTG    238
Val Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu
     65                  70                  75
GCC ATG AAG ACG TAT TTC CAG GGC ATC CAT GTC TAC CTG AAA GAG AAG    286
Ala Met Lys Thr Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys
 80                  85                  90                  95
GGA TAT AGT GAC TGC GCC TGG                                        307
Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp
                100
(2)序列号：26(SEQ ID NO：26)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：102个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：SEQ ID NO：25的预测的氨基酸序列(HuIFNτ4)
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：26
Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser
  1               5                  10                  15
Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu
             20                  25                  30
His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr
         35                  40                  45
Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val
     50                  55                  60
Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro TAr Leu Ala
 65                  70                  75                  80
Met Lys Thr Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly
                 85                  90                  95
Tyr Ser Asp Cys Ala Trp
            100
(2)序列号：27(SEQ ID NO：27)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：294个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链性：双链
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：cDNA至mRNA
    (iii)假说：否
    (iv)反义：否
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：HuIFNτ5
    (ix)特征：
        (A)名称/关键：CDS
        (B)位置：2..292
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：27
C CAG GAG ATG GTG GAG GGT GGC CAG CTC CAG GAG GCC CAG GCC ATC
46
 Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile
   1               5                  10                  15
TCT GTG CTC CAC GAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC AAC CTC TTC CAC ACA
94
Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr
                 20                  25                  30
GAG CAC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC CTC CTG GAG CAG CTC CGC    142
Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg
             35                  40                  45
ACT GGA CTC CAT CAG CAG CTG GAT GAC CTG GAT GCC TGC CTG GGG CAG    190
Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln
         50                  55                  60
GTG ACG GGA GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA AGG ACG GGC CCC ACC CTG    238
Val Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu
     65                  70                  75
GCC ATG AAG ACG TAT TTC CAG GGC ATC CAT GTC TAC CTG AAA GAG AAG    286
Ala Met Lys Thr Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys
80                  85                  90                  95
GGA TAT AG                                                         294
Gly Tyr
(2)序列号：28(SEQ ID NO：28)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：97个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：SEQ ID NO：27的预测的氨基酸序列(HuIFNτ5)
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：28
Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser
  1               5                  10                  15
Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu
             20                  25                  30
His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Tnr
         35                  40                  45
Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val
     50                  55                  60
Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala
 65                  70                  75                  80
Met Lys Thr Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly
                 85                  90                  95
(2)序列号：29(SEQ ID NO：29)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：516个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链性：双链
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：DNA(基因组)
    (iii)假说：否
    (iv)反义：否
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：HuIFNτ2
    (ix)特征：
        (A)名称/关键：CDS
        (B)位置：1..516
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：29
GAC CTG TCT CAG AAC CAC GTG CTG GTT GGC AGG AAG AAC CTC AGG CTC
48
Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg Leu
  1               5                  10                  15
CTG GAC CAA ATG AGG AGA CTC TCC CCT CGC TTT TGT CTG CAG GAC AGA
96
Leu Asp Gln Met Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp Arg
             20                  25                  30
AAA GAC TTC GCT TTA CCC TAG GAA ATG GTG GAG GGC GGC CAG CTC CAG    144
Lys Asp Phe Ala Leu Pro     Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln
         35                  40                  45
GAG GCC CAG GCC ATC TCT GTG CTC CAT GAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC    192
Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe
     50                  55                  60
AAC CTC TTC CAC ACA GAG CAC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC CTC    240
Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu
 65                  70                  75                  80
CTG GAG CAG CTC CGC ACT GGA CTC CAT CAG CAG CTG GAC AAC CTG GAT    288
Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asn Leu Asp
                 85                  90                  95
GCC TGC CTG GGG CAG GTG ATG GGA GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA AGG    336
Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg
            100                 105                 110
ACG GGC CCC ACC CTG GCT CTG AAG AGG TAC TTC CAG GGC ATC CAT GTC    384
Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val
        115                 120                 125
TAC CTG AAA GAG AAG GGA TAC AGC GAC TGC GCC TGG GAA ACC GTC AGA    432
Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val Arg
    130                 135                 140
GTG GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT TCA TTA ATC AGC TTG CAA GAA AGG    480
Val Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser Leu Ile Ser Leu Gln Glu Arg
145                 150                 155                 160
TrA AGA ATG ATG GAT GGA GAC CTG AGC TCA CCT TGA                    516
Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro
                165                 170
    (ix)特征：
        (A)名称/关键：修饰的位点
        (B)位置：115-117
        (D)其它信息：/注：为使编码的蛋白表达，这一位点可以被修饰以编码一个氨基酸，例如，“Gln”
(2)序列号：30(SEQ ID NO：30)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：171个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离：SEQ ID NO：29的预测的氨基酸序列(HuIFNτ2)
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：30
Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg Leu
  1               5                  10                  15
Leu Asp Gln Met Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp Arg
             20                  25                  30
Lys Asp Phe Ala Leu Pro Xaa Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln
         35                  40                  45
Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe
     50                  55                  60
Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu
 65                  70                  75                  80
Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asn Leu Asp
                 85                  90                  95
Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg
            100                 105                 110
Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val
        115                 120                 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val Arg
    130                 135                 140
Val Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser Leu Ile Ser Leu Gln Glu Arg
145                 150                 155                 160
Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro
                165                 170
    (ix)特征：
        (A)名称/关键：修饰位点
        (B)位置：39
        (C)其他信息：/注＝“其中Xaa是一个选择的氨基酸，如Gln”
(2)序列号：31(SEQ ID NO：31)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：588个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链性：双链
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：DNA(基因组)
    (iii)假说：否
    (iv)反义：否
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：HuIFNτ3
    (ix)特征：
        (A)名称/关键：CDS
        (B)位置：1..588
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：31
ATG GCC TTC GTG CTC TCT CTA CTC ATG GCC CTG GTG CTG GTC AGC TAC
48
Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr
  1               5                  10                  15
GGC CCG GGA GGA TCC CTG CGG TGT GAC CTG TCT CAG AAC CAC GTG CTG
96
Gly Pro Gly Gly Ser Leu Arg Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Ieu
             20                  25                  30
GTT GGC AGC CAG AAC CTC AGG CTC CTG GGC CAA ATG AGG AGA CTC TCC    144
Val Gly Ser Gln Asn Leu Arg Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser
         35                  40                  45
CTT CGC TTC TGT CTG CAG GAC AGA AAA GAC TTC GCT TTC CCC CAG GAG    192
Leu Arg Phe Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Ala Phe Pro Gln Glu
     50                  55                  60
ATG GTG GAG GGT GGC CAG CTC CAG GAG GCC CAG GCC ATC TCT GTG CTC    240
Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu
 65                  70                  75                  80
CAC GAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC AAC CTC TTC CAC ACA GAG CAC TCC    288
His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser
                 85                  90                  95
TCr GCT GCC TGG GAC ACC ACC CTC CrG GAG CAG CrC CGC ACT GGA CTC    336
Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu
            100                 105                 110
CAT CAG CAG CTG GAT GAC CTG GAT GCC TGC CTG GGG CAG GTG ACG GGA    384
His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Thr Gly
        115                 120                 125
GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA AGA ACG GGC CCC ACC CTG GCC ATG AAG    432
Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Met Lys
    130                 135                 140
AGG TAT TTC CAG GGC ATC CAT GTC TAC CTG AAA GAG AAG GGA TAT AGT    480
Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser
145                 150                 155                 160
GAC TGC GCC TGG GAA ATT GTC AGA CTG GAA ATC ATG AGA TCC TTG TCT    528
Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser
                165                 170                 175
TCA TCA ACC AGC TTG CAC AAA AGG TTA AGA ATG ATG GAT GGA GAC CTG    576
Ser Ser Thr Ser Leu His Lys Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu
            180                 185                 190
AGC TCA CCT TGA                                                    588
Ser Ser Pro
        195
(2)序列号：32(SEQ ID NO：32)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：195个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：SEQ ID NO：31的预测的氨基酸序列(HuIFNτ3)
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：32
Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr
  1               5                  10                  15
Gly Pro Gly Gly Ser Leu Arg Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu
             20                  25                  30
Val Gly Ser Gln Asn Leu Arg Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser
         35                  40                  45
Leu Arg Phe Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Ala Phe Pro Gln Glu
     50                  55                  60
Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu
 65                  70                  75                  80
His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser
                 85                  90                  95
Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu
            100                 105                 110
His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Thr Gly
        115                 120                 125
Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Met Lys
    130                 135                 140
Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser
145                 150                 155                 160
Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Ser Thr Ser Leu His Lys Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu
            180                 185                 190
Ser Ser Pro
        195
(2)序列号：33(SEQ ID NO：33)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：518个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链性：双链
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：DNA(基因组)
    (iii)假说：否
    (iv)反义：否
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：HuIFNτ3，成熟的但不含有前导序列
    (ix)特征：
        (A)名称/关键：CDS
        (B)位置：1..518
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：33
TGT GAC CTG TCT CAG AAC CAC GTG CTG GTT GGC AGC CAG AAC CTC AGG
48
Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Ser Gln Asn Leu Arg
  1               5                  10                  15
CTC CTG GGC CAA ATG AGG AGA CTC TCC CTT CGC TTC TGT CTG CAG GAC
96
Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Leu Arg Phe Cys Leu Gln Asp
              20                  25                  30
AGA AAA GAC TTC GCT TTC CCC CAG GAG ATG GTG GAG GGT GGC CAG CTC    144
Arg Lys Asp Phe Ala Phe Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu
         35                  40                  45
CAG GAG GCC CAG GCC ATC TCT GTG CTC CAC GAG ATG CTC CAG CAG AGC    192
Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser
     50                  55                  60
TTC AAC CTC TTC CAC ACA GAG CAC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC    240
Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr
 65                  70                  75                  80
CTC CTG GAG CAG CTC CGC ACT GGA CTC CAT CAG CAG CTG GAT GAC CTG    288
Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu
                 85                  90                  95
GAT GCC TGC CTG GGG CAG GTG ACG GGA GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA    336
Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly
            100                 105                 110
AGA ACG GGC CCC ACC CTG GCC ATG AAG AGG TAT TTC CAG GGC ATC CAT    384
Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Met Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His
        115                 120                 125
GTC TAC CTG AAA GAG AAG GGA TAT AGT GAC TGC GCC TGG GAA ATT GTC    432
Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val
    130                 135                 140
AGA CTG GAA ATC ATG AGA TCC TTG TCT TCA TCA ACC AGC TTG CAC AAA    480
Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Ser Ser Thr Ser Leu His Lys
145                 150                 155                 160
AGG TTA AGA ATG ATG GAT GGA GAC CTG AGC TCA CCT TG                 518
Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro
                165                 170
(2)序列号：34(SEQ ID NO：34)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：172个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：34
Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Ser Gln Asn Leu Arg
  1               5                  10                  15
Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Leu Arg Phe Cys Leu Gln Asp
             20                  25                  30
Arg Lys Asp Phe Ala Phe Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu
         35                  40                  45
Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln GIn Ser
     50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr
 65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu
                 85                  90                  95
Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly
            100                 105                 110
Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Met Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His
        115                 120                 125
Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val
    130                 135                 140
Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Ser Ser Thr Ser Leu His Lys
145                 150                 155                 160
Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro
                165                 170
(2)序列号：35(SEQ ID NO：35)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：37个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：SEQ ID NO：33的1-37片段的氨基酸序列
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：35
Cs Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Ser Gln Asn Leu Arg
  1               5                 10                  15
Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Leu Arg Phe Cys Leu Gln Asp
             20                  25                  30
Arg Lys Asp Phe Ala
         35
(2)序列号：36(SEQ ID NO：36)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：31个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：SEQ ID NO：33的34-64片段的氨基酸序列
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：36
Lys Asp Phe Ala Phe Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln
  1               5                  10                  15
Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser
             20                  25                  30
(2)序列号：37(SEQ ID NO：37)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：31个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：SEQ ID NO：33的62-92片段的氨基酸序列
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：37
Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp
  1               5                  10                  15
Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln
             20                  25                  30
(2)序列号：38(SEQ ID NO：38)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：33个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：SEQ ID NO：33的90-122片段的氨基酸序列
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：38
His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Thr Gly
  1               5                  10                  15
Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Met Lys
             20                  25                  30
Arg
(2)序列号：39(SEQ ID NO：39)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：32个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：SEQ ID NO：33的119-150片段的氨基酸序列
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：39
Ala Met Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys
  1               5                  10                  15
Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Leu Glu Ile Met Arg
             20                  25                  30
(2)序列号：40(SEQ ID NO：40)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：34个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：SEQ ID NO：33的139-172片段的氨基酸序列
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：40
Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Ser
  1               5                  10                  15
Ser Thr Ser Leu His Lys Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser
             20                  25                  30
Ser Pro
(2)序列号：41(SEQ ID NO：41)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：23个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：SEQ ID NO：32的1-23片段的氨基酸序列
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：41
Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr
  1               5                  10                  15
Gly Pro Gly Gly Ser Leu Arg
             20
(2)序列号：42(SEQ ID NO：42)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：23个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：SEQ ID NO：11的1-23片段的氨基酸序列
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：42
Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr
  1               5                  10                  15
Gly Pro Gly Gly Ser Leu Gly
             20
(2)序列号：43(SEQ ID NO：43)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：519个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链性：双链
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：DNA(基因组)
    (iii)假说：否
    (iv)反义：否
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：基因组HuIFNτ1衍生的DNA编码序列，无前导序列
    (ix)特征：
        (A)名称/关键：CDS
        (B)位置：1..519
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：43
TGT GAC CTG TCT CAG AAC CAC GTG CTG GTTGGC AGG AAG AAC CTC AGG
48
Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg
  1               5                  10                  15
CTC CTG GAC GAA ATG AGG AGA CTC TCC CCT CGC TTT TGT CTG CAG GAC
96
Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp
             20                  25                  30
AGA AAA GAC TTC GCT TTA CCC CAG GAA ATG GTG GAG GGC GGC CAG CTC    144
Arg Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu
         35                  40                  45
CAG GAG GCC CAG GCC ATC TCT GTG CTC CAT GAG ATG CTC CAG CAG AGC    192
Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser
     50                  55                  60
TTC AAC CTC TTC CAC ACA GAG CAC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC    240
Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr
 65                  70                  75                  80
CTC CTG GAG CAG CTC CGC ACT GGA CTC CAT CAG CAG CTG GAC AAC CTG    288
Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asn Leu
                 85                  90                  95
GAT GCC TGC CTG GGG CAG GTG ATG GGA GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA    336
Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly
            100                 105                 110
AGG ACG GGC CCC ACC CTG GCT CTG AAG AGG TAC TTC CAG GGC ATC CAT    384
Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His
        115                 120                 125
GTC TAC CTG AAA GAG AAG GGA TAC AGC GAC TGC GCC TGG GAA ACC GTC    432
Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val
    130                 135                 140
AGA CTG GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT TCA TTA ATC AGC TTG CAA GAA    480
Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser Leu Ile Ser Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
AGG TTA AGA ATG ATG GAT GGA GAC CTG AGC TCA CCT TGA                519
Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro
                165                 170
(2)序列号：44(SEQ ID NO：44)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：172个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：44
Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Ash Leu Arg
  1               5                  10                  15
Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp
             20                  25                  30
Arg Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu
         35                  40                  45
Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser
     50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr
 65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asn Leu
                 85                  90                  95
Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val MetGly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly
            100                 105                 110
Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His
        115                 120                 125
Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val
    130                 135                 140
Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser Leu Ile Ser Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro
                165                 170
(2)序列号：45(SEQ ID NO：45)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：37个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (C)链性：单链
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (iii)假说：否
    (iv)反义：否
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：Bin 12，A40068，Acc.Gi 108955，小牛TP-1(克隆bTP509)(氨基酸1-37)
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：45
Cys Tyr Leu Ser Glu Asp His Met Leu Gly Ala Arg Glu Asn Leu Arg
1               5                   10                  15
Leu Leu Ala Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Pro Cys Leu Gln Asp
            20                  25                  30
Arg Lys Asp Phe Gly
        35
(2)序列号：46(SEQ ID NO：46)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：37个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (C)链性：单链
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (iii)假说：否
    (iv)反义：否
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：Bin 13，，Acc.gi163767，小牛TP-1(氨基酸1-37)
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：46
Cys Tyr Leu Ser Glu His His Ile Leu Gly Pro Arg Gln Asn Leu Ser
1               5                   10                  15
Leu Leu Ala Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Pro Cys Leu Gln Asp
            20                  25                  30
Arg Lys Asp Phe Gly
        35
(2)序列号：47(SEQ ID NO：47)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：37个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (C)链性：单链
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (iii)假说：否
    (iv)反义：否
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：Bin 14，BovTPH1Ccds1，Acc.gi 163769，小牛TP-1(氨基酸1-37)
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：47
Cys Tyr Leu Set Glu His His Met Leu Gly Ala Arg Gln Asn Leu Arg
1               5                   10                  15
Leu Leu Ala Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Pro Cys Leu Gln Asp
            20                  25                  30
Arg Lys Asp Phe Gly
        35
(2)序列号：48(SEQ ID NO：48)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：37个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (C)链性：单链
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (iii)假说：否
    (iv)反义：否
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：Bin 15，A39505，Acc.，小牛TP-1(克隆bTP4)(氨基酸1-37)
    (xi)序列描述：SEQ IDNO：48
Cys Tyr Leu Ser Glu Asn His Met Leu Gly Ala Arg Glu Asn Leu Arg
1               5                   10                  15
Leu Leu Ala Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Pro Cys Leu Gln Asp
            20                  25                  30
Arg Lys Asp Phe Gly
        35
(2)序列号：49(SEQ ID NO：49)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：37个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (C)链性：单链
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (iii)假说：否
    (iv)反义：否
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：Bin 16，OATP1P5cds1，Acc.gi 1412，羊TPp5(氨基酸1-37)
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：49
Cys Tyr Leu Ser Gln Arg Leu Met Leu Asp Ala Lys Glu Asn Leu Lys
1               5                   10                  15
Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp
            20                  25                  30
Arg Lys Asp Phe Gly
        35
(2)序列号：50(SEQ ID NO：50)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：37个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (C)链性：单链
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (iii)假说：否
    (iv)反义：否
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：Bin 17，OATP1P3cds1，Acc.gi 1410，羊TPp3(氨基酸1-37)
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：50
Cys Tyr Leu Ser Gln Arg Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys
1               5                   10                  15
Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp
            20                  25                  30
Arg Lys Asp Phe Gly
        35
(2)序列号：51(SEQ ID NO：51)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：37个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (C)链性：单链
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (iii)假说：否
    (iv)反义：否
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：Bin 18，SHP010TPcds1，Acc.gi 165821，羊TPp-1(氨基酸1-37)
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：51
Cye Tyr Leu Ser Gln Arg Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys
 1               5                   10                  15
Leu Leu Glu Pro Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp
            20                  25                  30
Arg Lys Asp Phe Gly
        35
(2)序列号：52(SEQ ID NO：52)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：37个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (C)链性：单链
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (iii)假说：否
    (iv)反义：否
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：Bin 19，SHP02TPcds1，Acc.gi 165823，羊TPp-1(氨基酸1-37)
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：52
Cys Tyr Leu Ser Gln Arg Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Arg
1               5                   10                  15
Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp
            20                  25                  30
Arg Lys Asp Phe Gly
        35
(2)序列号：53(SEQ ID NO：53)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：37个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (C)链性：单链
            (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (iii)假说：否
    (iv)反义：否
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：Bin 21，GOTCTP1cds1，Acc.gi 164117，Capra hircusIFNτ(氨基酸1-37)
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：53
Cys Tyr Leu Ser Arg Arg Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Arg
1               5                   10                  15
Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Gln Gln Asp
            20                  25                  30
Arg Lys Asp Phe Gly
        35
(2)序列号：54(SEQ ID NO：54)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：498个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链性：双链
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：DNA(基因组)
    (iii)假说：否
    (iv)反义：否
    (vi)原始来源：
        (C)个体分离物：HuIFNτ/HuIFNalpha杂合，(1-28)/(29-167)
    (ix)特征：
        (A)名字/关键：CDS
        (B)位置：1..498
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：54
TGT GAC TTG TCT CAA AAC CAC GTT TTG GTT GGT AGA AAG AAC TTA AGA
48
Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg
  1               5                  10                  15
CTA CTA GAC GAA ATG AGA CGT CTA TCT CCA CGC TTC TGC CTG AAG GAC
96
Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Lys Asp
             20                  25                  30
AGA TAT GAT TTC GGA TTC CCC CAG GAG GTG TTT GAT GGC AAC CAG TTC    144
Arg Tyr Asp Phe Gly Phe Pro GLn GLu Val Phe Asp Gly Asn Gln Phe
         35                  40                  45
CAG AAG GCT CAA GCC ATC TCT GCC TTC CAT GAG ATG ATC CAG CAG ACC    192
Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Ala Phe His Glu Met Ile Gln Gln Thr
     50                  55                  60
TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAG GAT TCA TCT GCT GCT TGG GAT GAG ACC    240
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
 65                  70                  75                  80
CTC CTA GAC AAA TTC TAC ATT GAA CTT TTC CAG CAA CTG AAT GAC CTA    288
Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu
                 85                  90                  95
GAA GCC TGT GTG ACA CAG GAG GTT GGG GTG GAA GAG ATT GCC CTG ATG    336
Glu Ala Cys Val Thr Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met
            100                 105                 110
AAT GAG GAC TCC ATC CTG GCT GTG AGG AAA TAC TTT CAA AGA ATC ACT    384
Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
CTT TAT CTG ATG GGG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG GTT GTC    432
Leu Tyr Leu Met Gly Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
AGA GCA GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT TTT TCA ACA AAC TTG CAA AAA    480
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys
145                 150                 155                 160
GGA TTA AGA AGG AAG GAT
Gly Leu Arg Arg Lys Asp
                165
(2)序列号：55(SEQ ID NO：55)的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：166个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：55
Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg
  1               5                  10                  15
Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Lys Asp
             20                  25                  30
Arg Tyr Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Val Phe Asp Gly Asn Gln Phe
         35                  40                  45
Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Ala Phe His Glu Met Ile Gln Gln Thr
     50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
 65                  70                  75                  80
Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu
                 85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Thr Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met
            100                 105                 110
Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Met Gly Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys
145                 150                 155                 160
Gly Leu Arg Arg Lys Asp
                165

Claims (11)

1、一种杂合干扰素融合多肽，其由
从成熟的干扰素-τ多肽的第1位氨基酸残基延伸到第28位氨基酸残基的第一种氨基酸序列，和
从非τ的I型干扰素多肽的第29位氨基酸残基延伸到C-末端氨基酸残基的第二种氨基酸序列构成。
2、权利要求1所述的杂合干扰素融合多肽，其中所述干扰素-τ多肽是反刍动物干扰素-τ多肽，所述非τ的I型干扰素多肽是人类非τ的I型干扰素多肽。
3、权利要求1所述的杂合干扰素融合多肽，其中所述非τ的I型干扰素多肽是干扰素-α或干扰素-β。
4、一种由编码如权利要求1所述的杂合干扰素融合多肽的开放阅读框(ORF)序列组成的核酸。
5、一种表达载体，包括：
(a)权利要求4的核酸，和
(b)在宿主细胞中有效表达所述ORF序列的调控序列。
6、一种重组生产杂合干扰素融合多肽的方法，包括：
将包括权利要求4所述的核酸的重组表达载体引入适当的宿主细胞，其中所述的载体是设计用于在所述宿主细胞中表达该ORF序列，
以及在适当的条件下培养所述的宿主细胞，以使该ORF序列表达。
7、一种用于抑制在患者体内的肿瘤细胞生长的药物组合物，包含能有效地抑制肿瘤细胞生长的量的如权利要求1所述的杂合干扰素融合多肽。
8、一种用于抑制在被病毒感染的患者的细胞内病毒复制的药物组合物，包含能有效地抑制细胞内病毒复制的量的如权利要求1所述的杂合干扰素融合多肽。
9、一种用于治疗需要治疗的患者的自身免疫性疾病的药物组合物，包含有效量的如权利要求1所述的杂合干扰素融合多肽。
10、权利要求7到9任何一项的药物组合物，其配制成适于注射施用。
11、权利要求7到9任何一项的药物组合物，其配制成适于口服施用。
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