CN1751122A - 具有改进特性的干扰素α突变蛋白的融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及人类干扰素α，特别是具有改进特性的干扰素α2的修饰形式。改进的蛋白质在特定位点含有氨基酸置换，所述置换赋予在生物学试验中增加的相对活性。本发明也提供具有改进的生物活性、并伴以蛋白质降低的免疫原性潜能的经过修饰的干扰素α。改进的蛋白质旨在用于治疗人类疾病的治疗性用途。

Description

具有改进特性的干扰素α突变蛋白的融合蛋白
技术领域
本发明涉及人干扰素α，特别是具有改进特性的干扰素α2的修饰形式。改进的蛋白质在特定位置具有氨基酸置换，这些置换赋予在生物学试验中提高的相对活性。本发明也提供具有改进生物活性并伴以降低的蛋白质免疫原性潜能的经修饰的干扰素α。改进的蛋白质旨在用于治疗人类疾病的治疗性用途。
背景技术
干扰素α2(IFNα2)是由活化的巨噬细胞表达的重要的糖蛋白细胞因子。作为广谱抗病毒、抗增殖和免疫调节剂，该蛋白质具有不可忽视的临床重要性。INFα2的重组体和其它制剂已被用于治疗多种人的癌症和抗病毒适应症[综述于Sen，G.G.和Lengyel P，(1992)，J.Biol.Chem.267：5017-5020]。目前临床应用中有一些IFNα制剂，包括在大肠杆菌(E.coli)中产生的天然重组IFNα2(IFNα2a、RoferonA、Hoffman-La Roche；IFNα2b、IntronA、Schering-Plough；IFNα2c、Berofor、Basotherm)和更近来，基于所有亚型的共有序列并同样产生于大肠杆菌的人工的IFNα(Infergen、InterMune)。
IFNα2的主要用途是治疗慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染。尽管更近来通过IFNα与三氮唑核苷的联合实现了40％的持续病毒反应，单独使用IFNα治疗在约10％的患者当中导致持续的病毒清除[Davis GL等人(1998)N.Engl.J.Med.； 339：1493-1499；McHutchison JG等人(1998)N. Engl.J.Med.；339：1485-1492；Reichard O等人(1998)Lancet. 351：83-87]。IFNα治疗是高强度的，并且伴有严重的副作用，这些副作用在高达20％的病例中导致治疗取消。强化治疗的根本原因是IFNα2b具有相对短的血清半衰期[Glue P等人(2000)Clin.Pharmacol. Ther.； 68：556-567]，对于抗病毒功效，需要每日一次或每周三次皮下注射给药。
短的半衰期和频繁给药被认为是长期治疗的难题。为了对付这一难题，引入了RoferonA和IntronA的“聚乙二醇化”版本(Pegasys和Peg-Intron)，Infergen的相似版本处于II期临床试验阶段。将这些修饰的干扰素与聚乙二醇部分缀合，使血清半衰期增加10至20倍(6，7)，从而将给药频率降至每周一次(Peg-IntronTM和PegasysTM分别为180μg或1.4μg/Kg)，而不对临床功效起不利影响[Glue P.等人(2000)ibid；Perry CM等人(2001)Drugs； 61：2263-2288；Glue P.等人(2000) Hepatology； 32：647-653]。在这些研究中，副作用谱与未修饰的干扰素相似。
增加血清半衰期的另一个策略是将IFNα与人血清白蛋白连接[Osborn BL等人(2002)J Pharmacol.Exp.Ther.； 303：540-548]。Albuferon由与人血清白蛋白C末端连接的IFNα组成，在食蟹猴(cynomolgusmonkey)中具有比聚乙二醇化IFNα高出3倍、比未修饰的IFNα高出18倍的半衰期。还不能获得关于这一分子在人类研究中的数据。然而，对于聚乙二醇化和白蛋白连接的IFNα，修饰蛋白质的体外特异活性有所降低，与天然蛋白质相比，Peg-Intron的降低到28％[Grace M等人(2001)Cytokine Res.； 21：1103-1115]，Pegasys和Albuferon的降低到10％或更低[Osborn BL等人(2002)ibid；Bailon P等人(2001.Bioconjug Chem.12：195-202]。
尽管在IFNα的应用中发现显著的治疗好处，但已在某些患者中证明了治疗抗性，并已显示抗性的一个重要机制为受治疗患者血清中可检测的中和抗体的发展[Quesada，J.R.等人(1985)J.Clin.Oncology  3：1522-1528；Stein R.G.等人(1988)ibid；Russo，D.等人(1996)Br.J.Haematol.； 94：300-305；Brooks M.G.等人(1989)Gut  30：1116-1122]。尽管人体中内源性产生至少一级结构相同的分子的事实，在这些患者中提高了针对治疗性干扰素的免疫应答。依据适应症，重复给药数月，在高达80％的患者中诱导抗IFNα中和抗体[Schellekens H等人(1997)Jlnterferon Cytokine Res. 17 Supp 11：S5-8]，报道的慢性HCV感染频率在7％至60％范围内[Schellekens H等人(1997)ibid。尽管在有些病例中，可以通过随后使用纯化的白细胞干扰素来挽救治疗[Russo D等人(1996)ibid；Oberg K和Alm G.(1997)Biotherapy； 10：1-5；Tefferi A和GrendahlD.C.(1996)Am.J.Hematol.； 52.：231-233；Milella M等人(1995)Hepatogastroenterology； 42：201-204]，获得的证据提示，发展中和抗体的患者比没有发展抗体的患者更可能对治疗不产生反应并遭受复发[Ross C等人(2002)J Interferon Cytokine Res.； 22：421-426；McKenna R.M等人(1997)J Interferon Cytokine Res.； 17：141-143；Russo D等人(1996)ibid；Milella M等人(1993)Liver； 13：146-150；Primmer O.(1993)Cancer；71：1828-1834]。
由于该IFNα蛋白质天然存在，并在应答诸如病毒感染的事件中偶尔表达增加，针对重组IFNα的抗体发展的原因不明。给药途径和频率、IFNα的免疫调节作用、以及药物制剂中蛋白质聚集物的存在，都可能在免疫耐受的瓦解中起作用。然而，不考虑任何促进因素，导致诱导免疫应答的关键因素是蛋白质中存在能够通过MHC II类分子呈递而刺激T细胞活性的肽。这类肽序列是“T细胞表位”，通常定义为具有结合MHC II类分子能力的任何氨基酸残基序列。暗含地，“T细胞表位”意指与MHC分子结合时能够被T细胞受体(TCR)识别，并至少在原则上能够通过啮合TCR引起这些T细胞活化，从而促进T细胞应答。
根据前述，显然不断需要具有增强特性的INFα类似物。需要提高的包括：治疗剂的表达和纯化的备选方案和形式，但也包括并且尤其包括蛋白质的生物学特性的改进。当施用给人受者时，特别需要增强体内特性。就此而言，高度需要提供在人受者中具有降低的或缺乏诱导免疫应答的潜能，并具有增强的生物学潜能的INFα2。
本发明人先前已公开IFNα2分子的关键区域，所述区域包括驱动针对该自身蛋白质的免疫应答的T细胞表位，并提供了降低或完全消除这些序列作为T细胞表位的能力的组合物[WO 02/085941]。通过改变IFNα2蛋白质氨基酸序列(例如置换)，获得了这类组合物，并且本发明也涉及已经实施氨基酸置换和/或置换的组合的IFNα2分子。然而，在本案例中造成的新置换和置换组合赋予了显著增强该分子生物活性的惊人特性，这种增强结合实现降低蛋白质免疫原性谱的置换，提供了改进的IFNα2分子。
其它人已经提供了经修饰的IFNα以及使用方法，包括例如US，4,496,537；US，5,972,331；US，5,480,640；US，5,190,751；US，4,959,210；US，5,609,868；US，5,028,422和其它。
US，5,723,125描述了包含通过接头肽与人类免疫球蛋白Fc片段连接的野生型人类IFNα的融合蛋白。在所要求的融合蛋白中，IFNα结构域的N末端朝向Fc结构域。
US，6,204,022描述了IFNα类似物，该类似物具有对野生型的置换、尤其是在19、20、22、24和27位的置换，其特征在于生物学试验中降低的细胞毒性。
“人类Fc融合蛋白”的一般种类及其生产的适宜载体，先前已有说明[US，5,541,087；US，5,726,044 Lo等人(1998)，Protein Engineering  11：495-500]。
发明概述
本发明提供含有氨基酸置换的人类干扰素α2分子。所述氨基酸置换赋予蛋白质改进的特性。改进的特性涉及蛋白质特定的生物活性以及蛋白质的免疫原性特性。
本发明的分子是包含人类免疫球蛋白恒定区部分的融合蛋白，所述部分与人类IFNα突变蛋白连接。
本发明的分子具有新的和创造性的特性。这类分子可以为患有疾病，尤其是患有慢性丙型肝炎病毒感染的患者带来好处。
本发明的分子以此处定义为SEQ ID No 2-22的蛋白质序列为特征。
本发明的分子还以信号试验(signalling assay)中高于1.3至10倍之间的相对活性为特征。在一些实施方案中，信号试验中的相对活性为2倍或3倍或5倍或7倍或10倍或17倍。
本发明的分子还进一步以抗病毒试验(anti-viral assay)中2至36倍之间的相对活性为特征。在一些实施方案中，抗病毒试验中的相对活性为2倍或2倍以上、或3倍或3倍以上、或4倍或4倍以上、或7倍或7倍以上，或为约36倍。
本发明极为优选的分子以蛋白质序列SEQ ID No 2为特征，还以信号试验中高于9倍、抗病毒试验中约36倍以及抗增殖试验中约1倍的相对活性为特征。
本发明另一个优选的分子以蛋白质序列SEQ ID No 3为特征，还以信号试验中高于1.3倍、抗病毒试验中约7.4倍以及抗增殖试验中约1倍的相对活性为特征。
本发明的分子还可以进一步以抗增殖试验中每ml(毫升)13至16pg(皮克)干扰素α的活性为特征。
本发明最优选的分子还进一步以包含在人细胞中经证明显示降低免疫原性的序列为特征。
概括而言，本发明涉及如下主题：
●经修饰的干扰素α2分子，该分子具有人类干扰素α2的生物活性，含有一个或多个氨基酸置换；
●经修饰的干扰素α2分子，该分子具有人类干扰素α2的生物活性，包含人类免疫球蛋白恒定区(Fc)结构域，并且在干扰素α2结构域中含有一个或多个如上文或下文指定的氨基酸置换；
●经修饰的干扰素α2分子，该分子具有人类干扰素α2的生物活性，包含人类Fc结构域，在干扰素α结构域中含有一个或多个氨基酸置换，并且进一步以证明具有对人降低的免疫原性为特征，尤其是与本发明不含有氨基酸置换的干扰素α分子相比；
●重获具有改进特性的IFNα突变蛋白的通用方法，该方法包括；
a)鉴定T细胞表位；
b)在T细胞表位区域实施单氨基酸置换，并选择功能活性的突变蛋白；
c)任选地实施对T细胞活化有关的关键残基的精密绘图研究，以及测式多个置换中的双重或三重置换的免疫原性；
d)为构造成多重置换的突变蛋白选择具有最有利的功能和免疫原性谱的突变蛋白个体，并对所述的同一新蛋白质进行功能测试；
e)使用时程免疫原性试验(time course immunogenicity assays)测试功能活性的多重置换突变蛋白序列的降低的免疫原性；
●经修饰的干扰素α2分子的结构：
X0-CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRX1SLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLX2EMX3QQIX4NLFSTKDSSAAX5DETLLDKFYTELX6QQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSX7LAVRKYFQRITX8YLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTX9LQESLRSKE，
其中
X0＝Fc或Fc-接头
Fc＝抗体的Fc结构域
接头＝由6至25个氨基酸组成的接头肽
X1＝I、Q
X2＝H、Y
X3＝I、T；
X4＝F、T、A
X5＝W、H；
X6＝Y、D；
X7＝I、N、T、P、R
X8＝L、T、H、D、S、N以及
X9＝N、S；
条件是排除其中同时X1＝I、X2＝H、X3＝I、X4＝F、X5＝W、X6＝Y、X7＝I、X8＝L且X9＝N的IFNα分子。换言之，条件是排除野生型IFN融合蛋白。
具体而言，本发明涉及
●IFNα2突变蛋白，其中
X5＝H且X8＝N。
●IFNα2突变蛋白，其中
X3＝T且X4＝A。
●IFNα2突变蛋白，选自下列化合物：
(i)X1＝Q，x2＝H，X3＝T，X4＝A，X5＝H，X6＝Y，X7＝R，X8＝N且X9＝N
(ii)X1＝Q，X2＝H，X3＝I，X4＝F，X5＝H，X6＝Y，X7＝I，X8＝L且X9＝N
(iii)X1＝I，X2＝H，X3＝T，X4＝A，X5＝H，X6＝Y，X7＝T、R或N，X8＝N且X9＝N
(iv)X1＝I，X2＝H，X3＝T，X4＝A，X5＝H，X6＝Y，X7＝I，X8＝L且X9＝N
(v)X1＝I，X2＝Y，X3＝I，X4＝T，X5＝H，X6＝Y，X7＝I，X8＝L且X9＝N
(vi)X1＝I，X2＝H，X3＝I，X4＝F，X5＝H，X6＝Y，X7＝P、T或N，X8＝L且X9＝N
(vii)X1＝I，X2＝H，X3＝I，X4＝F，X5＝H，X6＝Y，X7＝I，X8＝T且X9＝S
(viii)X1＝I，X2＝H，X3＝T，X4＝F，X5＝H，X6＝Y，X7＝I，X8＝T且X9＝S
(ix)X1＝I，X2＝H，X3＝T，X4＝F，X5＝W，X6＝Y，X7＝I，X8＝T且X9＝S
(x)X1＝I，X2＝H，X3＝I，X4＝F，X5＝W，X6＝Y，X7＝I，X8＝T、S、N、H或D且X9＝N
(xi)X1＝I，X2＝H，X3＝I，X4＝F，X5＝H，X6＝Y，X7＝I，X8＝L且X9＝N
(xii)X1＝I，X2＝H，X3＝I，X4＝F，X5＝W，X6＝D，X7＝I，X8＝L且X9＝N
●IFNα2突变蛋白，其中Fc为人类免疫球蛋白重链恒定区结构域，通过其C末端与所述突变蛋白连接。
●IFNα2突变蛋白，其中Fc结构域为单体。
●IFNα2突变蛋白，其中接头肽由12至20个氨基酸组成。
●IFNα2突变蛋白，其中接头肽为(G)4S(G4)S(G4)SG。
为了避免疑问，根据图1的细节描述特别有利的IFNα2突变蛋白，这些突变蛋白为本发明的每个实施方案。
使用本领域熟知的重组DNA技术易于制备本发明的突变蛋白，且本发明提供这类分子的重组生产方法。
本发明涉及经修饰的IFNα2，含有这类经修饰的INFα2蛋白质或经修饰的INFα2蛋白质的片段的组合物，相关组合物应被认为属于本发明的范围。另一方面，本发明涉及编码经修饰的INFα2实体的核酸。在另一方面，本发明涉及使用经修饰的INFα2蛋白质的治疗人的方法。
发明详述
天然的成熟INFα2蛋白质是165个氨基酸的单链多肽。已知人INFα2的几个不同亚型，每个亚型在一级氨基酸序列之间显示较小的差异。因此，INFα2a和INFα2b仅在成熟蛋白质链23位具有一个残基的不同，INFα2a中为赖氨酸，INFα2b中为精氨酸。尽管本发明的公开内容是关于INFα2b的序列，可以看出，对于所有实际目的，INFα2a的序列可以与本发明的INFα2b亚型对象交替考虑。
INFα2b的氨基酸序列(以单字母代码表示)如下：
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE
此处使用术语“IFNα”表示人干扰素α2。在某些实例中，该术语使用的更为广泛，此中包括含有干扰素α部分和/或更加特别的干扰素α突变蛋白的融合蛋白(见下)。
此处使用术语“突变蛋白”表示经过改造含有有别于上述天然序列的一个或多个氨基酸置换的IFNα蛋白。
此处使用的术语“肽”，是包括两个或多个氨基酸的化合物。氨基酸通过肽键连接到一起。
肽键是所有肽、多肽或蛋白质的线性主链结构中氨基酸之间的唯一共价键。肽键是共价键，结构上为平面，并化学上构成取代的酰胺。“酰胺”是任一含有-CONH-基团的有机化合物。
在肽的生物产生中涉及20种不同的天然存在的氨基酸，它们中的任何数目可以按任何顺序连接为肽链或环。肽的生物产生中使用的天然存在的氨基酸都具有L构型。可采用常规合成方法，利用L-氨基酸、D-氨基酸或这两种不同构型的氨基酸的多种组合制备合成肽。一些肽仅含少数氨基酸单位。有时称短肽为“寡肽”，例如具有少于十个氨基酸单位的肽。其它肽含有大量氨基酸残基(例如，高达100个或以上)，有时被称为“多肽”。按照惯例，可以将“多肽”看作含有三个或更多氨基酸的任何肽链，而通常将“寡肽”看作“短”多肽的特殊类型。因此，如此处所使用，应当理解，提及的任何“多肽”也包括寡肽。另外，提及的任何“肽”包括多肽、寡肽和蛋白质。每个不同的氨基酸排列形成不同的多肽或蛋白质。可以形成的多肽的数量，以及由此形成的不同蛋白质的数量，实际上是无限的。
由于肽键是氨基酸之间的唯一连接，所有肽、多肽或蛋白质具有明确的末端，惯例上称为“N末端”或“N末端残基”以及“C末端”或“C末端残基”。N末端残基具有游离氨基，而C末端残基具有游离羧基。
因此所有连续氨基酸的序列具有由N末端至C末端的方向。在组成融合蛋白或一种蛋白质之内的不同结构域连接的地方，可以以“N末端”或“C末端”描述它们的相对方向。
此处使用术语“融合蛋白”指在一条肽链中含有两个或更多功能上不同的蛋白质结构域的蛋白质分子。融合蛋白中的蛋白质部分可以直接耦连或通过接头肽连接。
此处“接头”或“接头肽”指连接融合蛋白两部分的肽片段。适合本发明的接头肽包括具有5至25个氨基酸的肽，优选10至20个氨基酸，更优选15-20个氨基酸。接头肽的实例由通式((G)4S)XG提供，其中x为1、2、3或4。根据本发明优选的接头肽为(G)4S(G)4S(G)4SG。然而，具有10个以上氨基酸的现有技术的其它接头肽也是优选适宜的。
US，5,723,125要求了IFN-L-Fc型杂合干扰素分子(L＝接头)，其中接头序列为GGSGGSGGGGSGGGGS。所述接头为16个残基，被认为是“相对长的”。上述接头是由Huston等人描述的、熟知的接头肽(GGGGS)3[Huston等人(1988)Proc Natl. Acad Sci.USA  85：5879]的变体。也已知该接头的其它更短的序列变体，例如(GGGGS)n，其中n＝1、2或3，以提供5、10或15个残基[Holliger，P.等人(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA  90：6444]。在US，6,686,179中使用包括4个残基(GGGG)的该接头特别短的版本。本领域认可的接头肽的其它实例包括下列全部：(A)3，(A)4，(A)5，GG，GS，GGG，(G)7，GPG，GGPGG，EFGGGGGTA。
通常使用重组DNA技术产生融合蛋白，如此可以视融合蛋白为在自然界没有直接对应物的人工蛋白质(天然的融合蛋白可以发生，例如通过染色体易位，但是在此不考虑)。融合蛋白的实例是免疫球蛋白Fc区置于另一个蛋白质(例如IFNα)N端的融合体(fusion)。这样的融合体称为“Fc-X”融合体，其中X为配体(例如IFNα)，Fc-X蛋白质具有一些与众不同的有利的生物学特性。具体而言，鉴于这类融合蛋白仍然可以结合细胞表面相关的Fc受体，当配体与其受体结合时，Fc区的方向发生改变，以致Fc结构域中存在的序列激活抗体依赖的细胞介导的细胞毒性以及补体结合(complement fixation)。根据本发明，优选Fc-X融合体。
此处使用术语“免疫球蛋白”指由一个或多个基本由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质。公知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、σ、ε、和μ恒定区基因，以及实际上的多个免疫球蛋白可变区基因。
此处使用术语Fc指免疫球蛋白重链恒定区结构域，并包括抗体Fc部分的二聚体和单体形式。优选单链Fc融合体(单体)形式。
根据本发明的理解，术语“T细胞表位”意为氨基酸序列，该氨基酸序列能够与MHC II类结合，能够刺激T细胞和/或也在与MHC II类的复合物中结合T细胞(不必有可测量的活化)。
关于“基本无免疫原性”或“降低的免疫原性潜能”，包括与亲本蛋白质或含有测试部分的野生型或天然氨基酸序列的融合蛋白相比而言降低的免疫原性。
术语“免疫原性”包括在宿主动物中激发、诱导或以别的方式促进体液或T细胞介导的应答的能力，其中“宿主动物”特别为人。
术语“T细胞试验”和“免疫原性试验”涉及免疫反应性的离体测量。就此而言，这些涉及将待测免疫原，例如蛋白质或肽与活的人免疫细胞接触，并测量它们的反应性。诱导的反应性的典型参数为增殖。在该试验中，存在合适的对照测定是关键且必须的。
“时程试验(Time course assay)”指如增殖试验之类的生物学试验，其中活性测定在一段时间内连续进行。在本文中，“时程T细胞试验”指在暴露于测试免疫原后多次对应答测试免疫原(肽)产生的T细胞增殖进行测定。术语“时程T细胞试验”和“时程免疫原性试验”在此可以交换使用。
表述T细胞试验的一个常规的方法是使用“刺激指数”或“SI”。刺激指数(SI)惯例上来源于将测量的测试免疫原(例如肽)的增殖分值(例如，如果使用如3H胸苷掺入，则为放射活性的每分钟计数)除以在没有接触测试免疫原的细胞中测量的分值。尽管实际上在0.8-1.2范围内的SI值都是不显著的，但给定不引起应答的测试免疫原(肽)为SI＝1.0。本发明人已确定，在这类免疫原性试验的操作中，等于或高于2.0的刺激指数是显著的诱导增殖的有用量度。
PBMC指外周血液单核细胞，特别是从供体血液样品中获得的外周血液单核细胞。使用本领域熟知的密度梯度离心技术，可容易地从全血样品中分离PBMC，PBMC主要包括淋巴细胞(B和T细胞)和单核细胞。也代表其它细胞类型。
根据本文，“相对活性”指相对于在任何单一试验中相对于所测阳性对照蛋白质的活性表示的在通常平行进行的同一试验中对测试蛋白质测量的活性。因此，如果测试蛋白质和对照蛋白质具有相同的测量活性，称相对活性为1。
抗病毒试验是测量目的测试蛋白质抑制病毒在合适的宿主细胞中发挥功能的任何能力的生物学试验。通常设定这样的试验，以便抗病毒活性与在引起细胞病变剂量的病毒存在下，延长的细胞存活或增殖等同。平行进行合适的对照测试，以使其成为有用的测量。在该试验中，存在合适的对照测定是关键并必需的。Rubinstein等人描述了一个特别合适的抗病毒试验[Rubinstein S等人(1981)J Virol. 37：755-758]，并在此作为范例。可以考虑其它试验形式，并提供测试分子特定活性的定量评价，以允许ED50测定。
根据本文，“信号试验”意为能够就测试蛋白质在活细胞内引起特定的可测量反应的能力提供读数的生物学试验。具体而言，将测试蛋白质与细胞外表面接触，测量的反应是只有卷入至少一种特异性受体和细胞内多个细胞因子(例如转录因子)才能发生的现象。受体和其它多个细胞因子共同构成“信号通路”，已知这样的通路由功能活性IFN蛋白激活[Williams，B.R.(1991)Eur.J.Biochem. 15：1-11；David，M.(1995)Pharmacol. Ther. 65：149-161]。此处以特别合适的信号试验为例，也可考虑其它的试验形式，以提供测试分子特定活性的定量评价。
“抗增殖”试验是测量目的测试蛋白质抑制指示细胞培养物生长的任何能力的生物学试验。为使其成为有效的测量，平行进行合适的对照测试。Mark等人描述了一个特别合适的抗增殖试验[Mark，D.F(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA  81：5662-5666]，此处以其修改形式为例。可以考虑其它试验形式，并提供测试分子特定活性的定量评价，以允许ED50测定。
另一方面，本发明涉及编码经修饰的IFNα实体的核酸。优选这类核酸包含在表达载体内。适于原核细胞的控制序列包括例如启动子、任选的操纵基因序列，及核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和多腺苷酸化信号。这类核酸通常包括选择手段，一般是编码能够供宿主细胞存活的蛋白质的额外基因。这类选择基因的实例为适于一些大肠杆菌宿主细胞的β-内酰胺酶基因，该基因及其它基因为本领域所熟知[《MolecularCloning：A Laboratory Manual》，第二版(Sambrook等人，1989)；《GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《Current Protocols in Molecular Biology》(F.M.Ausubel等人编，1987)]。
当核酸置于与另一个核酸序列的功能关系中时，该核酸为“有效连接的”。例如，如果前序列或分泌性前导序列的DNA表达作为参与多肽分泌的前蛋白质，则其与多肽DNA有效连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其与该序列有效连接；或者如果核糖体结合位点的定位能帮助翻译，则它与编码序列有效连接。通常，“有效连接的”意为连接的DNA序列为毗邻的，在分泌性前导序列的情况下，“有效连接”是毗邻的，并且在同一读框中。然而，增强子不必毗邻。通过连接于方便的限制位点，从而完成连接。如果不存在这样的位点，依照常规实践使用合成的寡核苷酸连接物或接头。
在有些实施方案中，表达载体包含与表达控制序列有效连接的编码IFNα变体的核酸序列。在不同的实施方案中，表达载体包含编码如下蛋白质的核酸序列，所述蛋白质含有选自SEQ ID No 2至SEQ ID No 22的序列。这样的表达载体将至少包含一种所述蛋白质的IFNα编码结构域，该编码结构域与合适的表达控制和选择序列有效连接。这样的表达载体将包括核酸的简并版本，其中关于多核苷酸的简并性，指遗传密码子中许多氨基酸由一个以上密码子确定的公认事实。密码子的简并性解释了20种不同的氨基酸由构成DNA的4个不同碱基的64种可能三联序列编码。
本发明的另一方面是含有至少一种上述载体的培养细胞。
本发明还有的方面是制备经修饰的IFNα的方法，该方法包括：在允许从表达载体表达IFNα的条件下培养上述细胞，并从细胞中纯化IFNα。
另一方面，本发明涉及使用IFNα组合物来对人进行治疗的方法。为了施用于个体，优选生产至少80％纯度、无致热源及其它污染物的任何经修饰的组合物。进一步理解，IFNα蛋白的治疗性组合物可以与可药用赋形剂结合使用。根本发明的药物组合物系按照常规制备，包括通常用于药品的物质，例如《Remington′s Pharmaceutical Sciences》(Alfonso R.Gennaro编，第十八版，1990)，包括赋形剂、载体、佐剂和缓冲液。组合物可以经例如胃肠外、肠道、肌肉、皮下、静脉内或其它有利于实现效果的途径施用。常规的赋形剂包括可药用的有机或无机载体物质，这些物质适合胃肠外、肠道和其它的给药途径，并且不与药剂起有害反应。对于胃肠外应用，尤其合适的是可注射的无菌溶液，优选油或水溶液，以及悬液、乳液或植入物，包括栓剂。安瓿是便利的单位剂量。可以将药物制剂消毒，如果需要，可以与稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲液或其它不与活性化合物起有害反应的物质混合。
本发明的主要实施方案围绕蛋白质序列SEQ ID No 2-22。这些蛋白质是“Fc-X”型融合蛋白，其中，X在本发明中包括IFNα突变蛋白。与含有野生型(WT)IFNα部分的融合蛋白相比，发现这种融合蛋白表现出增加的活性。此处将发明人构建的“WT”或“天然”融合蛋白指定为IFN120(SEQ ID No 23)和IFN5(SEQ ID No 1)，差别仅在于存在或不存在(G)4S(G)4S(G)4SG结构的接头肽。为了明确，IFN5不含有所述接头。
使用信号试验，于此发现具有或不具有接头的天然融合蛋白具有非常相似的4.5和5ng/ml的ED50值。该发现证明，对于天然IFNα，Fc和IFNα分子之间接头的存在对活性没有影响。
通过对比，有些惊讶地发现本发明最优选的分子IFN311(SEQ ID No3)和IFN316(SEQ ID No 2)在信号试验中具有3.4和0.5ng/ml的ED50值，因此比对照活性高1.3倍以上和9倍以上。考虑到这些分子为INFα突变蛋白，这些结果说明，序列的改变已对活性产生有利的影响。
其它含有两个或三个或四个或五个氨基酸置换的IFNα突变蛋白在信号试验中也发现具有改进的相对活性。各具有两个置换的实例包括IFNα蛋白IFN197(SEQ ID No 12)、IFN201(SEQ ID No 11)、IFN202(SEQ IDNo 10)、IFN306(SEQ ID No 4)，它们分别显示出2、7、5、和4倍的活性提高。各具有三个置换的蛋白质IFN173(SEQ ID No 15)、IFN176(SEQ IDNo 13)、IFN219(SEQ ID No 9)也分别显示出10、5和17倍的活性提高。具有四个置换的INFα蛋白质IFN174(SEQ ID No 14)表现出5倍的信号活性提高。
这些关于信号试验中活性的有利影响不限于含有多个置换的突变蛋白。因此例如单突变体IFNα蛋白IFN28(SEQ ID No 22)展示出增加10倍的相对活性。类似地，蛋白质IFN64(SEQ ID No 21)显示增加三倍以上的活性，IFN164(SEQ ID No 20)显示出增加3倍的活性，蛋白质IFN167(SEQ ID No 19)和IFN168(SEQ ID No 18)都显示出2倍，蛋白质IFN171(SEQID No 17)显示出4倍，蛋白质IFN172(SEQ ID No 16)显示出7倍的信号活性提高。
尽管信号活性是IFNα蛋白功能性的有用指示，并被发明人用作IFNα突变蛋白的快速筛选试验，但抗病毒活性是测量IFNα潜能的公认国际标准，在一定程度上，是可能的临床活性的更加真实的替代品。因此抗病毒活性可以用于比较不同IFNα分子的活性，发明人将此用于本案例中，以确证本发明最优选的分子显示出临床有效的IFNα制剂范围内的活性。更具体地，融合蛋白IFN316具有13％的标准活性，而Peg-Intron、Pegasys和Albuferon已被报道分别具有28％、10％和7％的标准活性[Osborn BL等人(2002)；J Pharmacol Exp Ther. 303：540-548；Grace M等人(2001)J Interferon Cytokine Res. 21：1103-1115；Bailon P等人(2001)BioconjugChem. 12：195-2029，10，11]。
蛋白质的抗病毒活性，是蛋白质引起从干扰素受体延伸到细胞核中新基因表达的细胞内信号途径的能力的函数。预期的结果是信号活性的提高与抗病毒活性的提高相一致，并且本发明的IFNα突变蛋白已显示为这种情况。因此，各具有5个置换的IFNα蛋白IFN270(SEQ ID No 7)、IFN273(SEQ ID No 6)和IFN276(SEQ ID No 5)分别显示出2倍、3倍和另一个3倍的相对信号活性提高，同时也分别显示出高于6倍、高于4倍和另一个高于4倍的相对抗病毒活性提高。一个IFNα突变蛋白没有显示出信号活性提高，在此方面等于对照，但是仍然显示出高于2倍(约2.8)的抗病毒活性提高。所述突变蛋白为IFN248蛋白(SEQ ID No 8)，含有3个置换。
本发明的IFNα突变蛋白经构建而比亲本分子具有更低的免疫原性。基于免疫学考虑和功能性活性数据指导单个突变蛋白的设计。使用筛选试验确定分子内具有三个免疫学重要的区域，筛选试验涉及来自健康供体被试者和事先接受治疗性IFNα IntronA的个体的PBMC制品。主要构建在三个确定的免疫原性区内含有突变的IFNα突变蛋白。基于已知的HLA-DR分子结合特性来靶定残基，因为它们在穴1(pocket 1)中对疏水氨基酸具有几乎排他的优选性，并且这是肽结合的最重要的决定因素[Jardetzky，T.S.等人(1990)，EMBO J. 9：1797-1803；Hill，C.M.等人(1994)J.Immunol. 152：2890-2898]。详尽的突变分析确定了这些区域内那些既可以改变又不对融合蛋白活性产生不利影响的残基(表2)。通过在解析的NMR结构中定位靶标[Klaus，W等人(1997)，J.mol.Boil. 274：661-675]，以及与其它的人IFNα蛋白和来自其它物种的IFNα蛋白比较，指导替代残基的选择。使用丙氨酸或相似大小的非疏水性残基替代隐蔽的残基，反之，以所有可能的非疏水性替换残基扫描暴露的残基。
也以能够对涉及人T细胞功能活化的关键残基精细绘图的形式应用T细胞试验。使用一类变体合成肽扫描目的区域，并使用已知的反应性供体样品进行这些研究。除了已经可以获得活性数据来指导选择之处，使用丙氨酸作为扫描氨基酸实施突变筛选T细胞试验。这种方法可以突显个别氨基酸残基对包括其位置的T细胞表位的免疫原性的贡献。尽管最需要的是改变涉及免疫原性的关键残基，但这一点可能并不总是与蛋白质功能的保持相一致。可以采用多重置换，这些置换中没有一个能单独消除免疫原性，但是在降低其它免疫原性区的免疫原性潜能中，组合依然是有效的。在本申请中，表位精细绘图研究(表4)以及之后的组合突变体T细胞试验(表5)之后的可以确定最能够保持功能又能显示降低目的区域免疫原性的置换组合。
使用含有多突变集合的全部组合的合成肽(表3)实施更具实证性的T细胞试验，以证实在最需要的置换集合中降低的免疫原性。使用跨越分子三个免疫原性区的每一个的合成肽实施后面的这些试验，并使用PBMC以时程T细胞试验进行，所述PBMC来自健康供体和事先经IntronA治疗的患者。本领域技术人员将认识到，纯蛋白质因其抗增殖特性，不可能在T细胞试验中测试。
因此，重获具有改进特性的IFNα突变蛋白的一般方法涉及：
a)鉴定T细胞表位；
b)在T细胞表位区内实施单氨基酸置换，并选择功能活性的突变蛋白；
c)任选地实施涉及T细胞活化的关键残基的精密绘图研究，并(任选地)多个置换中的双重或三重置换的免疫原性；
d)选择具有最有利的功能和免疫原性谱的突变蛋白个体，以构建多重置换的突变蛋白，并对所述的同一新蛋白质进行功能测试；
e)使用时程免疫原性试验，检测用于功能活性的多重置换突变蛋白序列的降低免疫原性。
总之，发明人已能够确定改进的IFNα蛋白，可以通过下列结构对其进行描述：
X0-CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRX1SLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLX2EMX3QQIX4NLFSTKDSSAAX5DETLLDKFYTELX6QQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSX7AVRKYFQRITX8YLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTX9LQESLRSKE，
其中X0＝Fc或Fc-接头，
Fc＝抗体Fc结构域
接头＝由6至25个氨基酸组成的接头肽
X1＝I、Q
X2＝H、Y
X3＝I、T；
X4＝F、T、A
X5＝W、H；
X6＝Y、D；
X7＝I、N、T、P、R
X8＝L、T、H、D、S、N以及
X9＝N、S；
条件是排除其中同时X1＝I、X2＝H、X3＝I、X4＝F、X5＝W、X6＝Y、X7＝I、X8＝L且X9＝N的IFNα分子。
提供下列附图、序列表和实施例以帮助对本发明的理解。应当理解，在不背离本发明精神的情况下，可以对前述程序进行修改。
序列说明
为了帮助对本发明的理解，下面的表1列出融合蛋白IFNα突变蛋白的说明。在实施例中也更完整地公开了这些蛋白质的来历和特性。
表1
序列说明
  克隆ID   置换(s)*   SEQ ID No
  IFN5   无＝WT   SEQ ID No 1
  IFN316   I24Q，I60T，F64A，W76H，I116R，L128N   SEQ ID No 2
  IFN311   I24Q，I60T，F64A，W76H，I116R，L128N   SEQ ID No 3
  IFN306   I24Q，W76H   SEQ ID No 4
  IFN276   I60T，F64A，W76H，I116T，L128N   SEQ ID No 5
  IFN273   I60T，F64A，W76H，I116,L128N   SEQ ID No 6
  IFN270   I60T，F64A，W76H，I116N，L128N   SEQ ID No 7
  IFN248   I60T，F64A，W76H   SEQ ID No 8
  IFN219   H57Y，F64T，W76H   SEQ ID No 9
  IFN202   W76H，I116P   SEQ ID No 10
  IFN201   W76H，I116T   SEQ ID No 11
  IFN197   W76H，I116N   SEQ ID No 12
  IFN176   W76H，L128T，N156S   SEQ ID No 13
  IFN174   I60T，W76H，L128T，N156S   SEQ ID No 14
  IFN173   I60T，L128T，N156S   SEQ ID No 15
  IFN172   L128T   SEQ ID No 16
  IFN171   L128S   SEQ ID No 17
  IFN168   L128N   SEQ ID No 18
  IFN167   L128H   SEQ ID No 19
  IFN164   L128D   SEQ ID No 20
  IFN64   W76H   SEQ ID No 21
  IFN28   Y89D   SEQ ID No 22
  IFN120   无＝WT   SEQ ID No 23
*用于IFN置换的残基编号从IFN读框的残基1开始，并独立于任何Fc元件。
附图说明
图1列出本发明各优选IFNα突变蛋白的相对生物活性。克隆ID号和各克隆内实施的置换如所示。该图表示使用实施例中列出的生物学试验，针对IFN受体介导的细胞活化(＝信号试验)、抗病毒活性和抗增殖活性而测定的相对活性。相对Fc-IFNα蛋白IFN5来描述所有活性，Fc-IFNα蛋白IFN5具有与N端Fc结构域直接融合的WT IFNα。
图2显示细胞培养物上清液的受体信号试验的结果。以编码IFN5、IFN120、IFN316和IFN311的质粒瞬时转染HEK293细胞。通过Fc ELISA定量上清液中的蛋白质浓度，并稀释至200ng/ml。在三倍连续稀释液中用滴定法测量活性。
图3显示纯化的IFN311和IFN316与Peprotech IFNα2a的活性比较。
(a)受体信号试验。从200ng/ml起始，之后利用3倍连续稀释液进行滴定。
(b)Daudi细胞抗增殖试验。从200ng/ml起始，之后利用4倍连续稀释液进行滴定。
(c)抗病毒试验。起始浓度：IFN311为250pg/ml，IFN316为62.5pg/ml，IFNα2a为6.25pg/ml，在2倍连续稀释液中完成滴定。各图显示来自三个实验的平均数据。
图4显示使用合成肽的时程免疫原性试验结果(NB：表3中给出肽序列)。使用20个健康个体和20个HCV患者(以IntronA治疗)评估野生型和修饰的IFNα肽的免疫原性。通过在刺激后第6、7、8、9天滴定掺入的胸苷评估PBMC的增殖。
(a)使用跨越1、2和3区的肽刺激后，来自健康个体的阳性反应(SI＞2)。
(b)使用跨越1、2和3区的肽刺激后，来自HCV患者的阳性反应(SI＞2)。
(c)在任何时间点，从20个健康供体和20个HCV患者中观察到的对跨越免疫原性1、2和3区的肽具有SI＞2的反应频率。
图5.1至5.12显示本发明优选分子的蛋白质序列。序列以单字母代码表示。将各融合蛋白的Fc和Fc-接头部分加以下划线。IFNα结构域未加下划线。显示各序列的克隆ID号。
实验实施例
实施例1
IFNα2b的克隆和诱变
使用常规重组DNA技术制备本发明经修饰的IFNa蛋白质。使用PCR从人胎盘DNA(Sigma，Poole，UK)克隆成熟IFNα2b的编码序列。野生型基因用作对照试剂和模板，通过定点诱变从该模板衍生经修饰的IFN。将WT和经修饰的基因插入表达载体pdC-huFc[Lo K-M等人(1998)Protein Eng  11：495-500]以使IFNα2b序列成为人类IgG1铰链/CH2/CH3 Fc区C末端的直接融合物。将所述载体中的WT IFN蛋白质指定为IFN5。
除了直接融合之外，对载体进行修饰，使在CH3的C端和IFNα2b的N末端之间含有柔性接头。该接头的氨基酸序列为(G)4S(G)4S(G)3SG，将具有该接头的WT IFN蛋白指定为IFN120。一些突变体IFN蛋白质在两类载体中表达，例如变体IFN311(SEQ ID No 3)和IFN316(SEQ ID No2)，它们尽管在其IFN结构域中含有相同置换集合，但是关于(G)4S(G)4S(G)3SG接头存在差别。IFN311为直接融合，而IFN316含有该接头。
对所有构建体进行DNA测序。不断地实施DNA测序以确证所需置换的引入，并确定没有通过例如PCR错误引入无关(不需要的)置换。
技术细节及WT和变体IFN蛋白质的克隆策略在其它地方[WO02/085941]详细说明，并为本领域公知。
实施例2
IFNα突变蛋白的设计
构建连接到人类IgG1 Fc部分的IFNα2b变体，所述变体在蛋白质的三个免疫原性区内含有突变。涉及构建和功能测试的突变分析循环确定了既可以被改变又不对与Fc连接的蛋白质的活性产生不利影响的区域内的那些残基。此处描述的信号试验(见实施例5)是该方面的主要筛选工具。突变分析结果显示于表2。
表2
靶定用于突变的IFNα氨基酸残基
*表示测试了所有非疏水性替换，并显示最具活性的替换
+使用受体信号试验测定，并与Fc连接的野生型IFNα比较。
  区域1
  I24   L26   F27   L30   F36
  置换   P/Q*   H*   S   A   A
  相对活性+   4   0.25   0.1   0   0
  区域2
 I60   I63   F64   L66   F67  W79
  置换  T   T   A*   T*   A  H
  相对活性+  1   0.5   0.8   0   0  5
  区域3
  I116   L117   V119   Y122   F123   I126   L128
  置换   T*   H*   A   H   H   A/T   T*
  相对活性+   2   0.9   0.5   0   0.1   0.1   7
根据解析的NMR结构中靶标的位置[Klaus，W.等人(1997)，J.Mol.Biol. 274：661-675]，以及与其它人类IFNα蛋白和来自其它物种的IFNα蛋白的比较，指导替代残基的选择。以丙氨酸或相似大小的非疏水性残基替代隐蔽的残基，而以所有可能的非疏水性备选残基扫描暴露的残基。
在1区内，可以被成功置换并显著提高活性的唯一疏水性残基为I24。L26、F27和L30尽管充分暴露，但推测其不能被改变，因为它们形成具有分子间功能的明确的疏水性补丁。
在2区内，唯一充分暴露的残基为F64，该残基改变为A，活性适度降低。尽管通常被隐藏，残基I60和I63成功地被改变为具有相似大小的T，T可以向所述残基所处的α-螺旋中增加氢键。位于该分子一顶端的残基W76，尽管基本被隐藏，但被改变为H而显著有利于活性。
在3区内，只有充分暴露的那些残基可以被成功改变。改变I116和L128显著有利于活性，L117的改变导致稍微降低的活性。
也包括从免疫原性区3上进行的扫描T细胞试验得到的数据，以进一步精炼突变蛋白的设计过程(见表4和5，实施例9)。尽管免疫学上最有利的单置换为F123，该置换不与任何有用的信号活性水平兼容。经过比较，证实在残基I116和L128处的置换组合能调节该区的T细胞应答。测试了各位点的其它置换，以获得显示良好活性的侧链大小的范围。将I116置换为T、N和R，L128置换为N、H和R。建立九个突变体，这些突变体含有这些残基的每一组合以及显示可接受活性的区1和2中的突变(I24Q、I60T、F64A、W76H)。
以Fc和IFNα融合配偶体之间含有或不含有灵活接头的形式，构建含有I116R和L128N以及I24Q、I60T、F64A和W76H的组合突变蛋白(分别为IFN316和IFN311)。
实施例3
融合蛋白的转染和纯化
使用HEK293(ATCC# CRL-1573)细胞和Lipofectamine 2000(Invitrogen，Paisley，UK)，按照制造商说明进行瞬时转染。按照先前的描述[Baum C等人(1994)Biotechniques  17：1058-106224]使用电穿孔在NS0细胞(ECACC# 85110503)中建立稳定的转染子，并在含有100nM氨甲蝶呤的培养基中选择。所有细胞系维持在具有抗生素和抗真菌剂、添加10％ FBS的DMEM中。通过Prosep-A层析以及随后的大小排阻层析(SEC)纯化融合蛋白。简要地，在用0.2μM过滤的细胞培养物上清液(上至500ml)上样前，将1ml Prosep-A柱(Millipore，Watford，UK)在PBSpH7.4中平衡，上样前已用1/20体积的1M Tris-HCl pH7.4调节上清液的pH。以50ml PBS pH7.4清洗柱子，以0.1M柠檬酸缓冲液pH3.0洗脱融合蛋白，收集0.9ml级分。立即以0.1ml 1M Tris-HCl pH8.0中和该级分。使用Superdex 200(Amersham Pharmacia，Amersham，UK)在3.2/30柱中进行SEC，在含有0.1％ Tween 80的PBS pH7.4中平衡及运行该柱。合并跨越主峰的级分，使用LasergeneTM软件(Dnastar，Madison，WI，USA)计算280nm的摩尔消光系数，从而定量融合蛋白。使用BCA蛋白质试验(Pierce，Chester，UK)确认浓度。IFNα元件代表融合蛋白42％的分子量，因此通过该因素调节浓度。
实施例4
细胞培养物上清液中融合蛋白的定量
通过以ELISA形式检测人类IgG1 Fc的量来定量融合蛋白，该方法如下：在37℃，以小鼠单克隆抗人IgG Fc特异性抗体包被ELISA板(DynexImmulon4)2小时，小鼠抗体为1/1500的PBS pH7.4稀释液，100μl/孔。以100μl/孔的PBS/0.05％Tween 20洗涤板4次。将人IgG标准品(TheBinding Site，Birmingham，UK)在PBS/2％BSA中稀释为2μg/ml，并垂直沿板制成一式两分两倍稀释液。测试样品于PBS/2％BSA中1/100和1/500稀释，并一式两分地测定。于室温将板孵育1小时，并如前洗涤。使用100ul/孔山羊抗人IgG Fc特异性过氧化酶缀合物(The Binding Site，Birmingham，UK)检测，该缀合物以1/1000稀释于PBS中，如前述洗涤板，并使用SigmaFast OPD，100μl/孔(Sigma，Poole，UK)显色。通过添加50μl 2M硫酸终止呈色反应，在Anthos HTII平板读出器中于492nm测量吸收。
实施例5
Fc-IFNα2b活性试验(信号试验)
将编码变体和WT IFN融合蛋白的质粒瞬时转染进HEK293细胞中，三天后定量细胞培养物上清液中融合物的Fc部分。使用信号试验测定上清液活性。该试验中活性的测量需要触发(活化)表达于细胞表面的I型干扰素受体。活化的受体引起细胞内Jak/STAT1信号通路的激活。该通路以蛋白质STAT1的磷酸化而终结，磷酸化使蛋白质STAT1能够结合干扰素刺激应答元件(ISRE)。ISRE为顺式作用的DNA片段，它能够启动连接于其下游的基因(例如报告基因)的转录。
使用商品供应的信号报告载体，即pISRE-TA-luc(Clonetech Europe，Brussels，Belgium)，测定本发明的融合蛋白从I型干扰素受体诱导信号的能力。该载体含有处于干扰素刺激应答元件(ISRE)控制之下的萤火虫萤光素酶基因。将ISRE/萤光素酶盒(在NotI/BamHI片段上)转移至游离的哺乳动物表达载体pREP4(Invitrogen，Paisley，UK)，取代RSV启动子/MCS/SV40多聚A(通过SalI消化去除)，以产生pREP-ISRE。将该载体转染进HEK293细胞，并以100μg/ml潮霉素选择稳定转染子，以产生HEK-ISRE细胞。以4×105细胞/ml的密度将HEK-ISRE细胞接种到黑壁、底部清洁的96孔发光计板(Greiner，Stonehouse，Glouc.，UK)中，在不存在抗生素的正常条件下培养24小时，进行Fc-IFNα2b活性试验。
沿板在无抗生素培养基中制备标准IFNα2a 2×108 IU/mg(Peprotech，London，UK)和融合蛋白的一式两分连续稀释液，孵育过夜。通过添加100μl Steady-Glo试剂(Promega，Southampton，UK)，继之使用Wallac Microbeta Trilux发光计测量发光检测萤光素酶活性，其中按照供应商的指导制备所述试剂。
图1列表显示各IFNα突变蛋白的相对活性。图2显示融合蛋白IFN5、IFN120、IFN311和IFN316的信号活性曲线。这些结果显示，与天然融合蛋白(IFN120和IFN5，分别带有或不带有接头)相比，变体融合蛋白具有增加的活性。带有或不带有接头的天然融合蛋白，具有非常相似的、分别为4.5和5ng/ml的ED50值，表明对于天然IFNα，Fc和IFNα分子之间接头的存在对活性没有影响。IFN311和IFN316具有3.4和0.5ng/ml的ED50值，因此具有高于对照＞1.3×和＞9×的活性，证实序列的改变对活性具有有利影响。在此试验中发现令人惊讶的结果，与天然IFNα构建体不同，Fc和IFNα之间接头的存在增加了融合蛋白的活性。
也将融合蛋白IFN311和IFN316的信号活性与天然IFNα制剂(Peprotech，London，UK)比较，活性曲线描述于图3a中。
实施例6
经修饰的Fc-IFNα2b融合蛋白的活性(抗增殖)：
通过Daudi细胞增殖抑制评估融合蛋白的抗增殖特性，操作如下：在添加10％FBS、添加抗生素的RPMI1640(Daudi培养基)中生长Daudi细胞(ATCC#CCL-213)。将处于对数中期的细胞稀释至2×105细胞/ml，以75ul/孔置于96孔微滴定板中。在75μl Daudi培养基中一式三份地制备标准IFNα2a(Peprotech)及融合蛋白的稀释液，并添加至细胞。横跨滴定板制备连续的1/4稀释液；因此每板测定一个标准和一个测试样品。将板孵育3天。使用按照制造商说明制备的Aqueous One试剂(Promega)进行检测。每孔添加30μl试剂，将板孵育4小时并使用Anthos HTII平板读出器读取492nm的吸收。
图3b显示相对于天然(非融合蛋白)IFNα制剂(Peprotech)绘制的融合蛋白IFN311和IFN316的抗增殖特性。
实施例7
经修饰的Fc-IFNα2b融合蛋白的活性(抗病毒)：
如先前描述的[Rubinstein S等人(1981)J Virol. 37：755-758]，通过人肺癌A549细胞(ATCC# CC1-185)中脑心肌炎病毒(EMCV)的致细胞病变效应试验的抑制来测定融合蛋白的抗病毒特性。
图1将该试验中几种IFNα突变蛋白的相对活性制成表格。融合蛋白IFN316显示最大的相对活性，计算出的高于对照的倍数为36。令人惊讶的结果是，与没有接头的对应物IFN311(相对活性＝7.4)相比，IFN316中接头的存在对其抗病毒活性具有显著的有利影响。在带有和不带有该接头的WT IFNα融合蛋白(IFN5对IFN120)的比较中，没有发现这种显著差异。图3c显示相对于天然(非融合蛋白)IFNα制剂(Peprotech)绘制的融合蛋白IFN311和IFN316的抗病毒特性。
实施例8
通过时程T细胞试验绘制人类IFNαT细胞表位图谱和免疫原性区分析：
最初的人类IFNαT细胞表位绘图研究是使用合成肽和来自健康供体的PBMC进行的，该试验的结果和细节在别处已有说明[WO 02/085941]。使用时程T细胞试验对IFNα内确定的称为R1、R2和R3的三个免疫原性区进行进一步分析。根据NICE指导方针，使用PBMC进行该试验，所用的PBMC分离至20个健康个体(经选择以覆盖＞80％的普通HLA-DR等位基因)和20个慢性HCV感染并之前以IFN2b(IntronA)治疗的患者捐献的血液(与Dr G.Alexander，Addenbrooke′s Hospital，Cambridge，UK协作进行患者研究)。由于完整IFNα的免疫活性特性与此试验不兼容，以合成肽测试免疫原性表位R1、R2和R3。在这些试验中，将24孔板的2-4×106 PBMC/孔的大量培养物用跨越免疫原性区的肽孵育6至9天(见表3)。通过温和重悬浮大量培养物和取出PMBC的样品，在多个时间点评定增殖，所述PMBC样品随后在含有1μCi/孔含氘胸苷的U形底96孔板的三联孔中一式三份地孵育18小时，之后使用Tomtec Mach III平板收获仪(plate harvester)收获到玻璃纤维滤垫上，并使用Wallac MicroplateBeta计数器通过闪烁计数确定cpm值。
表3
用于时程试验的肽序列
  表位区   野生型序列
  R1   QMRRISLFSCLKDRHDFGF
  R2   EMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFY
  R3   TPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAW
  表位区   经修饰的序列*
  R1   QMRR QSLFSCLKDRHDFGFP
  R2   EM TQQI ANLFSTKDSSAA HDETLLDKFY
  R3   TPLMKEDS RLAVRKYFQRIT NYLKEKKYSPCAW
*组成修饰序列的氨基酸置换加下划线显示。
图4a显示以跨越免疫原性区1、2和3的肽刺激健康个体得到的所有阳性反应(SI＞2)。修饰的肽不能在任何健康个体中诱导增殖，而在六个供体中观察到对野生型肽的阳性反应(图4a)。也发现HCV患者对所有三个区的野生型肽反应，而对于修饰肽，他们仅仅对3区反应(图4b)。对肽的反应频率的分析显示，2区和3区表现出在15％的被试健康供体中诱导最频繁的增殖(图4c)，而在HCV患者中，3区诱导最高的应答频率(25％)，继之为1区(10％)，然后为2区(5％)(图4c)。
因为T细胞表位图谱绘制的结果显示来自3区的肽也以最高频率在健康供体中诱导增殖[WO 02/085941]，根据这些以及其它数据，认为3区含有优势免疫T细胞表位。对于健康个体，在第七天观察到对1区肽的应答(图4a，供体11和供体13)，而仅在唯一的HCV患者T细胞应答中于第六天检测到增殖。2区肽趋向于第九天在健康供体中诱导增殖(图4a，供体6和供体18)，而在第八天观察到唯一的HCV患者T细胞应答(图4c，供体13)。与1区和2区应答不同，3区肽在健康个体中比在HCV患者中诱导更为迅速的应答，分别在第七天和第八天观察到增殖。
实施例9
IFNα免疫原性区3的扫描T细胞试验
为进一步精炼突变蛋白的设计过程，还包括了来自对免疫原性区3进行的扫描T细胞试验的数据。使用来自13个供体样本的PBMC进行T细胞试验，这13个供体样本大部分被预先确定至少对目的WT肽序列产生应答。产生了跨越IFNα残基T108-W140的一组8个合成肽。该组肽家族含有WT序列和如表4中所鉴定的7个不同的置换序列。所有试验一式三份地进行。确定横跨13个供体样本的平均SI。
表4
IFNα免疫原性区3的突变扫描T细胞试验
  I116   L117   V119   Y122   F123   I126   L128
  置换   S   A   A   H   H   A   A
  SI平均值*   1.58   1.53   2.46   -   1.02   1.09   1.82
  频率SI＞1.95   15％   15％   15％   -   0％   15％   23％
*以跨越IFNα残基T108-W140的肽进行T细胞试验。野生型肽以15％的应答频率产生2.12的平均SI。
除了已经获得活性数据以指导选择之外，使用丙氨酸作为扫描氨基酸(由于突变体没有活性，Y122未被扫描)。发现F123H是就降低整个T细胞应答而言最有效的单突变，在整个一组13个供体中具有始终低于野生型的SI，然而，突变F123不能恢复足够的活性。这些改变中有几个产生与WT相等的阳性应答频率(表4)，但是，尽管有部分重叠，它们并不应答相同的供体子集。突变体的平均SI通常低于WT肽，即使对于引起增加的阳性应答频率的L128A也是如此，尽管V119A在供体集合中一贯引起更高的SI，但阳性应答频率与WT相似。使用免疫原性试验，测试3区突变蛋白的可选组合。合成跨越3区、含有各氨基酸组合的九个肽，并重新测试于T细胞增殖试验(表5)。
表5
3区突变蛋白的免疫原性
  3区突变   平均SI#(频率SI＞1.95)
  WT   1.43(15％)
  I116R+L128N   1.13
  I116R+L128H   1.21
  I116R+L128R   1.17
  I116N+L128N   1.15
  I116N+L128H   1.14
  I116N+L128R   1.21(5％)
  I116T+L128N   1.10
  I116T+L128H   1.08
  I116T+L128R   1.07
#使用跨越IFNα残基T108-W140、含有3区突变的肽进行T细胞试验，所述3区突变显示于左列
15％的供体以SI＞1.95应答WT肽。WT肽对所有供体样品的平均SI为1.43。所有的改变组合在一组20个供体中引起低于WT肽的平均SI，然而，含有I116N+L128R的肽在一个供体中的确引起阳性应答(SI＞1.95)。

Claims (13)

1.具有改进的生物学和免疫原性特性的经修饰的人干扰素α2(IFNα2)分子，其具有以下氨基酸序列：
X0-CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRX1SLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLX2EMX3QQIX4NLFSTKDSSAAX5DETLLDKFYTELX6QQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSX7LAVRKYFQRITX8YLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTX9LQESLRSKE，
其中
X0＝Fc或Fc-接头
Fc＝抗体的Fc结构域
接头＝由6至25个氨基酸组成的接头肽
X1＝I、Q
X2＝H、Y
X3＝I、T；
X4＝F、T、A
X5＝W、H；
X6＝Y、D；
X7＝I、N、T、P、R
X8＝L、T、H、D、S、N以及
X9＝N、S；
条件是排除其中同时X1＝I，X2＝H，X3＝I，X4＝F，X5＝W，X6＝Y，X7＝I，X8＝L且X9＝N的IFNα分子。
2.权利要求1的IFNα2突变蛋白，其中X5＝H并且X8＝N。
3.权利要求2的IFNα2突变蛋白，其中X3＝T并且X4＝A。
4.权利要求1至5中任何一项的IFNα2突变蛋白，其选自下列化合物：
(i)X1＝Q，X2＝H，X3＝T，X4＝A，X5＝H，X6＝Y，X7＝R，X8＝N和X9＝N
(ii)X1＝Q，X2＝H，X3＝I，X4＝F，X5＝H，X6＝Y，X7＝I，X8＝L和X9＝N
(iii)X1＝I，X2＝H，X3＝T，X4＝A，X5＝H，X6＝Y，X7＝T、R或N，X8＝N和X9＝N
(iv)X1＝I，X2＝H，X3＝T，X4＝A，X5＝H，X6＝Y，X7＝I，X8＝L和X9＝N
(v)X1＝I，X2＝Y，X3＝I，X4＝T，X5＝H，X6＝Y，X7＝I，X8＝L和X9＝N
(vi)X1＝I，X2＝H，X3＝I，X4＝F，X5＝H，X6＝Y，X7＝P、T或N，X8＝L和X9＝N
(vii)X1＝I，X2＝H，X3＝I，X4＝F，X5＝H，X6＝Y，X7＝I，X8＝T和X9＝S
(viii)X1＝I，X2＝H，X3＝T，X4＝F，X5＝H，X6＝Y，X7＝I，X8＝T和X9＝S
(ix)X1＝I，X2＝H，X3＝T，X4＝F，X5＝W，X6＝Y，X7＝I，X8＝T及X9＝S
(x)X1＝I，X2＝H，X3＝I，X4＝F，X5＝W，X6＝Y，X7＝I，X8＝T、S、N、H或D和X9＝N
(xi)X1＝I，X2＝H，X3＝I，X4＝F，X5＝H，X6＝Y，X7＝I，X8＝L和X9＝N
(xii)X1＝I，X2＝H，X3＝I，X4＝F，X5＝W，X6＝D，X7＝I，X8＝L和X9＝N。
5.根据权利要求1至4中任何一项的IFNα2突变蛋白，其中Fc为人免疫球蛋白重链恒定区结构域，它通过C端与所述突变蛋白连接。
6.根据权利要求5的IFNα2突变蛋白，其中Fc结构域为单体。
7.根据权利要求1至6中任何一项的IFNα2突变蛋白，其中接头肽由12至20个氨基酸组成。
8.根据权利要求7的IFNα2突变蛋白，其中接头肽为(G)4S(G4)S(G4)SG。
9.根据权利要求1至8中任何一项的IFNα2突变蛋白，其中改进的免疫原性特性导致免疫原性的丧失，其中所述免疫原性的丧失是通过缺失存在于初始未修饰分子上的MHC II类结合的T细胞表位来实现。
10.根据权利要求9的IFNα2突变蛋白，当在T细胞增殖的生物学试验中以完整蛋白质测试时，其展示出小于未经修饰的亲本IFN分子并且小于2的刺激指数(SI)。
11.DNA序列，所述序列编码权利要求1-10中任何一项的IFNα2突变蛋白。
12.药物组合物，其包含上述任何一项权利要求中定义的IFNα2突变蛋白，并任选地包含可药用载体、稀释剂或赋形剂。
13.权利要求1-11中任何一项的IFNα2突变蛋白的用途，用于制备治疗丙型肝炎病毒感染患者的药物。
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