CN1145693C - 作为趋化因子拮抗剂的氨基端截短的mcp-2 - Google Patents

Abstract

本发明涉及以氨基端截短的MCP-2，它缺少对应于天然存在的MCP-2的氨基酸残基1、1-2、1-3、1-4或1-5的NH₂端氨基酸并具有趋化因子拮抗活性，本发明还涉及编码这些MCP-2的cDNA序列，以及它们在需要有趋化因子作用拮抗活性的疾病治疗和/或诊断中的应用，以及包含它们的药物组合物。

Description

作为趋化因子拮抗剂的氨基端截短的MCP-2

发明领域

本发明涉及氨基端截短的MCP-2，它缺少对应于天然存在的MCP-2的氨基酸残基1、1-2、1-3、1-4或1-5的NH2端氨基酸，并具有趋化因子拮抗活性，本发明还涉及编码这些MCP-2的cDNA序列，以及它们在需要有趋化因子作用拮抗活性的疾病治疗和/或诊断中的应用，以及包含它们的药物组合物。

发明背景

趋化因子构成了具有白细胞趋化和活化性能的一个促炎性细胞因子小家族。根据第一个半胱氨酸的位置，趋化因子家族可以分为C-C、C-X-C和C-X₃-C趋化因子(Baggiolini M.等人，1994；Baggiolini M.等人，1997和Taub D.等人，1996)。

许多C-X-C趋化因子，如白细胞介素-8(IL-8)，对于嗜中性粒细胞有趋化作用，而C-C趋化因子，如单核细胞趋化蛋白-3(MCP-3)，则对包括单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞和树突细胞在内的各种白细胞有活性。

趋化因子的氨基端区域参与受体结合，氨基端的加工可以激活趋化因子或使趋化因子完全没有活性。

C-X-C趋化因子血小板碱性蛋白只有在除去氨基端的24个残基后才变成一种嗜中性粒细胞趋化肽(NAP-2)(Walz A.等人，1989和Van Damme J.等人，1990)。

IL-8缺失8个氨基端残基导致趋化活性增强，但是位于所有嗜中性粒细胞趋化性C-X-C趋化因子中第一个Cys前的Glu-Leu-Arg基序进一步断裂却导致其完全失去活性(Clark-Lewis I.等人，1991)。

另一个C-X-C趋化因子粒细胞趋化蛋白-2(GCP-2)发生相似的氨基端蛋白水解(解离下8个氨基酸)却对嗜中性粒细胞趋化活性没有影响(Proost P.等人，1993a)。

缺少8到9个氨基端氨基酸的合成的C-C趋化因子MCP-1、MCP-3和RANTES对单核细胞没有活性，并被用作受体拮抗剂(Gong J.等人，1996；和Gong J.等人，1995)。

RANTES延伸一个甲硫氨酸将导致该分子完全失去活性，Met-RANTES表现为真正的RANTES拮抗剂(Proudfoot A.E.等人，1996)。

已经用cDNA探针(从刺激的针对休眠的外周血淋巴细胞(PBL)衍生获得)通过差示实验室筛选分离出人MCP-2(单核细胞引诱蛋白-2)的克隆(它最初称为“HCl4”，Chang H.C.等人，1989)。cDNA衍生的蛋白序列与纯化的天然MCP-2相同；然而，还分离出推定的等位基因变体(其中Gln46代替Lys46)(Van Coillie等人，1997)。

还用固相化学方法合成了MCP-2(Proost P.等人，1995)。

发明描述

本发明的主要目的是氨基端截短的MCP-2，它缺少对应于天然存在的MCP-2的氨基酸残基1、1-2、1-3、1-4或1-5的氨基端氨基酸，并具有趋化因子拮抗剂活性。

更具体地说，本发明的一个目的是MCP-2(6-76)，它是缺少氨基端氨基酸1-5的MCP-2，如图1和SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。

本发明的这种氨基端截短的MCP-2可以是糖基化形式或非糖基化形式。

术语“趋化因子拮抗剂”指“成熟的、天然存在的全长趋化因子的拮抗剂”。

本发明的另一个目的是包含编码本发明氨基端截短的MCP-2的DNA序列的DNA分子，其中所述DNA序列包括基本上相同的核苷酸序列。

“基本上相同的核苷酸序列”包括凭借遗传密码的简并性也能编码出给定氨基酸序列的所有其它核酸序列。

本发明还包括含有上述DNA的表达载体，转化了该载体的宿主细胞，以及通过将所述转化细胞培养在合适培养基中来制备本发明这些氨基端截短的MCP-2的方法。

编码本发明蛋白的DNA序列可以插入合适的质粒并与其连接。一旦形成表达载体，就将其导入合适的宿主细胞，该宿主细胞进而表达载体，产生所需蛋白。

本文提到的任何本发明重组蛋白的表达均可用合适的表达载体在真核细胞(如酵母、昆虫或哺乳动物细胞)或原核细胞中进行。本领域中已知的任何方法均可采用。

例如，用本领域熟知的技术(参见Sambrook等人，1989)将上述任一方法获得的编码蛋白的DNA分子插入适当构建的表达载体中。利用同聚物加尾、采用合成的DNA接头的限制性连接或平头连接技术，将双链cDNA连接到质粒载体中。用DNA连接酶连接DNA分子，通过碱性磷酸酶处理避免不希望发生的连接。

为了能表达所需的蛋白，表达载体还应包含特异的含有转录和翻译调控信息的核苷酸序列，该核苷酸序列与编码所需蛋白的DNA连接，从而允许该基因表达和产生蛋白。首先，为了使基因被转录，它的前面必须有能被RNA聚合酶识别的启动子，该启动子与聚合酶结合，从而启动转录过程。可以采用具有不同工作效率的各种启动子(强的和弱的启动子)。

对于真核宿主，可以采用不同的转录和翻译调控序列，这取决于宿主的性质。它们可以来自病毒，如腺病毒、牛乳头瘤病毒、猿猴病毒等，其中调控信号与具有高表达水平的特定基因相关联。例子是疱疹病毒的TK启动子、SV40早期启动子、酵母gal4基因启动子等。可以选择转录起始调控信号，使其具有阻遏和激活作用，从而能够调节基因的表达。

将包含编码本发明蛋白的核苷酸序列的DNA分子插入载体中与转录和翻译调控信号操作性相连，该载体能将所需基因序列整合入宿主细胞中。

还可以通过导入一个或多个允许选择含有表达载体的宿主细胞的标记物，来选择被导入的DNA稳定转化的细胞。标记物还可为营养缺陷型宿主提供光营养、杀微生物的抗性，例如抗生素，或重金属如铜等。可选择的标记基因可以和待表达的DNA基因序列直接连接，或通过共转染导入同一细胞中。为了使本发明蛋白的合成最优，可能还需要额外的元件。

选择特定质粒或病毒载体的重要因素包括：从不含载体的受体细胞中识别和选出含有载体的受体细胞的容易程度；特定宿主中所希望的载体拷贝数；以及是否希望载体能在不同种宿主细胞之间“穿梭”。

一旦制得了用于表达的载体或含DNA序列的构建物，就可用以下多种合适的方法将该DNA构建物导入合适的宿主细胞中：转化、转染、偶联、原生质体融合、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射等。

宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。较佳的是真核宿主，例如哺乳动物细胞，如人、猴、小鼠和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，因为它们为蛋白质分子提供了翻译后的修饰，包括正确折叠或在正确位点的糖基化。酵母细胞也可进行包括糖基化的翻译后肽修饰。有许多重组DNA策略采用了强启动子序列和高拷贝数的质粒，它们可用来在酵母中产生所需的蛋白质。酵母识别克隆的哺乳动物基因产物上的前导序列，并分泌携带前导序列的肽(即前肽(pre-peptide))。

在导入载体后，使宿主细胞在选择性培养基中生长，该培养基使含有载体的细胞选择性地生长。克隆的基因序列的表达导致产生所需的蛋白质。

本发明的氨基端截短的MCP-2可用本领域中其它熟知的方法来制备，尤其是已建立的化学合成方法：用自动化固相肽合成仪，然后进行层析纯化。

例如，本发明的趋化因子可用Fmoc(9-芴甲氧基羰基)、tBoc(叔丁氧羰基)或其它任何类似的化学合成在不同氨基酸上有或没有合适的侧链保护基团的条件下合成。有或没有合适的侧链保护基团的氨基酸被预先激活(例如用HBTU/HOBt[2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基-脲六氟磷酸/1-羟基苯并三唑)，并偶联到生长的肽链上。在加入下一个残基之前，从α氨基上除去保护基团(例如Fmoc)。合成后除去所有保护基团，纯化完整的全长肽并用化学方法或酶法将肽折叠(包括在半胱氨酸之间形成二硫键)成本发明的对应的趋化因子。

天然的、合成的或重组的蛋白可用已知用于纯化的任一种方法(即任何常规方法，包括抽提、沉淀、层析、电泳等(例如参见Proost P.等人，1996))来进行纯化。用于纯化本发明蛋白的另一优选的纯化方法是亲和层析，该方法利用的是结合靶蛋白并产生和固定在柱中所含凝胶基质上的单克隆抗体或肝素的亲和力。使含有蛋白质的不纯制备物通过该柱。蛋白质将会通过肝素或特异性抗体结合在柱上，而杂质则将通过柱。洗柱后，通过改变pH或离子强度将蛋白质从凝胶上洗脱下来。

本发明的氨基端截短的MCP-2可用于治疗和/或诊断需要有趋化因子拮抗作用的疾病。这些疾病的例子包括：炎性疾病、血管生成和血细胞生成相关疾病、肿瘤、传染病(包括HIV)、自身免疫疾病、动脉粥样硬化、肺疾病和皮肤病。

因此，本发明另一方面提供了本发明的蛋白在生产用于治疗上述疾病的药物中的应用。

药物宜为包含本发明蛋白以及一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂的药物组合物形式。这些药物组合物形成了本发明的另一个方面。

本发明还有一个方面是一种治疗上述疾病的方法，该方法包括给予处于发生这些疾病危险的对象或已经表现出这些病理学现象的对象药学上活性量的本发明氨基端截短的MCP-2。

现在将通过下列实施例来描述本发明，这些实施例不应被理解成以任何方式限定了本发明。实施例将参考下文所述的附图。

附图简述

图1：它显示了MCP-2以及其已知变体的氨基酸序列。信号序列用斜体字表示，而C端残基用粗体表示。箭头表示本发明的氨基端截短的MCP-2(6-76)的第一个氨基酸。下划线是与MCP-2变体中不同的氨基酸。

图2：氨基端截短的MCP-2(6-76)的SDS-PAGE：

泳道1：天然MCP-2(1-76，100ng/泳道)；

泳道2：天然MCP-2(1-76，30ng/泳道)；

泳道3：天然MCP-2(6-76，30ng/泳道)；和

泳道4：合成的MCP-2(1-76，60ng/泳道)。

凝胶在还原性条件下进行电泳，蛋白质用银染色。

图3：它显示了修饰型MCP-2的趋化效力的比较。

测试完整的天然(nat)和合成(syn)MCP-2(1-76)、氨基端截短的天然MCP-2(6-76)以及羧基端截短的合成的MCP-2(1-74)在THP-1细胞上的趋化活性。结果表示成四次或四次以上单独实验的CI平均值±SEM。

图4：与MCP-1相比，天然的MCP-2是使单核细胞中钙流动的较弱的激动剂。完整的MCP-2随剂量的增加(15、50和150ng/ml)而增加THP-1细胞中的[Ca²⁺]_i。图中显示了两个实验中一个典型实验的结果。

实施例

实施例1：氨基端截短的MCP-2

材料和方法

趋化因子和免疫试验

如前所述的那样(Proost P.等人，1995)合成和纯化MCP-2。

从小鼠获得特异性抗人MCP-2抗体，并在Sepharose柱(CNBr活化的Sepharose4B，Phamacia，Uppsala，Sweden)上亲和纯化，用生产商提供的条件使合成的MCP-2与柱偶联。

用亲和纯化的抗人MCP-2包被ELISA板，并用生物素化的抗-MCP-2作为捕获性抗体。用过氧化物酶标记的链霉亲和素和TMB进行检测。MCP-2 ELISA的检测极限约为0.1ng/ml。

MCP-2的生产和纯化

从Antwerp和Leuven输血中心所得132份献血员的外周血单核细胞衍生的条件培养基中纯化获得单核细胞趋化蛋白(Proost P.等人，1996)。

通过在羟乙基淀粉(Fresenius AG，Bad Homburg，Germany)中沉淀和在3-乙酰氨基-5-乙酰甲氨基-2，4，6-三碘苯甲酸钠溶液(sodium metrizoate，Lymphoprep；Nyegaard，Oslo Norway)梯度离心，除去红细胞和粒细胞。

用10微克/毫升Con A和2微克/毫升LPS培育单核细胞(60×10⁹细胞)。48至120小时后，收集条件培养基并置于-20℃直至纯化。

如以前所描述的那样(Proost P.等人，1996)，用四步纯化程序纯化天然的MCP-2。

简言之，在控制孔径的玻璃或硅酸上浓缩条件培养基，并在肝素-Sepharose柱(Pharmacia)上亲和层析部分纯化。

含有MCP-2免疫反应性的级分用Mono S(Pharmacia)阳离子交换层析进一步纯化，并用pH4.0的NaCl梯度洗脱。

在用0.1％三氟乙酸(TFA)平衡的C-8 Aquapore RP-300柱(Perkin Elmer，NorwalkCT)上通过RP-HPLC将天然的MCP-2纯化至均一。蛋白质用乙腈梯度洗脱。

用SDS-PAGE、氨基酸序列分析和质谱法对MCP-形式进行生物化学特性分析

在还原性条件下、Tris/麦黄酮(tricine)凝胶上用SDS-PAGE检测柱级分的纯度(Proost P.等人，1996)。银染蛋白质，并用下列相对分子量(Mr)标记：OVA(Mr 45000)，碳酸酐酶(Mr 31000)、大豆胰蛋白酶抑制剂(Mr 21500)、β-乳球蛋白(Mr 18400)、溶菌酶(Mr 14400)以及抑蛋白酶肽(Mr 6500)。

在脉冲液体477A/120A蛋白质测序仪(Perkin Elmer)上，用N-甲基哌啶作为偶联碱，用Edman降解法测定纯化的趋化因子的氨基端序列。将封闭的蛋白置于75％甲酸中50小时，使其在Asp和Pro之间断裂。不作进一步纯化就对甲酸消化物测序。用基质辅助性激光解吸电离/飞行时间质谱法(MALDI/TOF-MS)(Micromass TofSpec，Manchester，UK)测定MCP-2的Mr。分别用α-氰基-4-羟基肉桂酸和细胞色素C作为基质和内部标准。

趋化活性的检测

在Boyden微室中用孔径5微米的聚乙烯吡咯烷酮处理的聚碳酸膜测试MCP-2在新鲜纯化的单核细胞(2×10⁶细胞/毫升)或单核细胞性THP-1细胞(0.5×10⁶细胞/毫升；转种后2天)上的趋化活性。

将样品和细胞稀释在添加了1毫克/毫升人血清白蛋白(Red Cross Belgium)的HBSS(Life technologies/Gibco BRL，Paisley，Scotland)中。37℃培育2小时后，固定细胞，用Diff-Quick染色液(Harleco，Gibbstown.NJ)染色，然后用显微镜在10个放大500倍的油浸视野中计数迁移通过膜的细胞。

根据迁移到样品中的细胞数与迁移至对照培养基中的细胞数之比(Van Damme J.等人，1992)，计算样品(每个室中一式三份)的趋化指数(CI)。

对于脱敏实验，在加入Boyden微室的上排孔之前，用无生物活性的趋化因子变体37℃培育细胞10分钟。用HBSS处理的细胞的CI对样品的CI作为参照值，计算CI的抑制％。

胞内Ca²⁺浓度的检测

如以前所述的那样(Wuyts A.等人，1997)，测定胞内钙浓度([Ca²⁺]_i)。在含荧光指示剂fura-2(fura-2/AM 2.5μM；Molecular Probes Europe BV，Leiden，The Netherlands)和0.01％Pluronic F-127(Sigma，St Louis MO)的Eagle极限必需培养基(EMEM，Gibco)+0.05％FCS中，培育纯化的单核细胞或THP-1细胞(10⁷细胞/毫升)。

37℃放置30分钟后，洗涤细胞两次，并以10⁶细胞/毫升的浓度重悬于含1mM Ca²⁺和0.1％FCS的HBSS(用pH7.4的10mM Hepes/NaOH作为缓冲液)中。37℃平衡细胞10分钟，然后在LS50B发光分光光度计(Perkin Elmer)中测定fura-2荧光。

在340和380nm处激发后，在510nm检测荧光。用Grynkiewicz方程式(Grynkiewicz等人，1985)计算[Ca²⁺]_i。为了测定R_max，用50μM毛地黄皂苷裂解细胞。随后，用20mM Tris调节pH至8.5，在裂解的细胞中加入10mM EGTA，获得R_min。所用K_d为224nM。

对于脱敏实验，首先用缓冲液、不同浓度的趋化因子或趋化因子拮抗剂刺激单核细胞或THP-1细胞。作为第二刺激，MCP-2所用浓度为缓冲液预先刺激后诱导[Ca²⁺]_i显著增加的浓度。第二刺激在加入第一刺激后2分钟施加。比较用趋化因子或趋化因子拮抗剂预先刺激后的信号与加入缓冲液后的信号，计算对第二刺激反应中[Ca²⁺]_i增加的抑制百分数。

结果

翻译后修饰型MCP-2的分离

用特异的、灵敏的ELISA追踪检测促分裂素和内毒素刺激的外周血单核细胞所产生的不同形式的MCP-2。

根据标准的分离方法(Proost P.等人，1996)纯化条件培养基，这些方法包括吸附到孔径控制的玻璃上和肝素Sepharose层析。

随后，进行FPLC mono S阳离子交换层析纯化，然后采用C-8 RP HPLC作进一步纯化。用SDS-PAGE和MALDI/TOF-MS测定分子量。

分离获得不同形式的MCP-2：除了真实的7.5kDa的MCP-2(1-76)外，用RP-HPLC将缺少5个残基的7kDa氨基端截短型MCP-2[MCP-2(6-76)]纯化至均一，并用氨基酸序列分析鉴定(图2)。MALDI/TOF-MS(表I)测得完整MCP-2的分子量为8881Da(理论上的相对分子量为8893Da)，而测得MCP-2(6-76)的分子量为8365Da，这确认了有5个氨基端氨基酸缺失(理论上的相对分子量为8384Da)。这些天然形式的MCP-2在THP-1趋化试验中的功能比较表明，完整的MCP 2在5ng/ml下仍有活性，而截短的MCP-2(6-76)在0.6-60ng/ml的浓度范围内测试时仍没有趋化活性(图3)。还比较了完整的天然MCP-2与合成的MCP-2(1-76)以及缺少2个残基的羧基端截短的合成型MCP-2[MCP-2(1-74)](Proost P.等人，1995)的效力。

还发现这些形式的最低有效趋化浓度为5ng/ml(图3)。尽管在趋化试验中，天然的完整MCP-1和MCP-2的比活是相当的(Van Damme J，等人，1992)，但是MCP-2使钙迁移的性能仍有待争论。

然而，在Ca²⁺迁移实验中，天然的或合成的MCP-2(1-76)的最低有效剂量比天然的完整的MCP-1(1-76)高10倍(图4)，而MCP-2(6-76)却仍没有活性。

尽管如此，完整的MCP-2(50ng/ml)却能使MCP-2(15ng/ml)和MCP-3(10ng/ml)脱敏，使两者的趋化作用分别受到52％和45％的抑制。

由于MCP-2在Ca²⁺试验中的比活较低，因此在Boyden微室中进行了MCP-2(6-76)对趋化作用的脱敏。据报道，完整的MCP-2在单核细胞趋化试验中与活性MCP-1、MCP2和MCP 3交叉脱敏(Sozzani S.等人，1994)，所以，我们研究天然的无活性的MCP-2(6-76)是否也能使MCP-1、MCP-2、MCP-3和RANTES脱敏(表II)。用100ng/ml无活性MCP-2(6-76)预先培育THP-1细胞已经能明显抑制10ng/ml MCP-1(63％)、5ng/ml MCP-2(75％)、30ng/ml MCP-3(62％)和100ng/ml RANTES(75％)诱导的趋化作用。另外，浓度低3倍的各MCP所产生的趋化作用被100ng/ml MCP-2(6-76)完全(91-100％)抑制。而且，在低达10ng/ml的浓度下，MCP-2(6-76)仍然能明显抑制MCP-1(3ng/ml)、MCP-2(1.5ng/ml)或MCP 3(10ng/ml)以及RANTES(30ng/ml)诱导的趋化活性。总之，MCP-2(6-76)是天然产生的、无活性的化学引诱剂，并拮抗几种C-C趋化因子，对MCP-3的效果最突出。

                              表I

天然型MCP-2的生物化学特性分析。氨基端氨基酸分析以及C-8 RP-HPLC纯化的天然MCP-同种型的实验(SDS-PAGE和MALDI/TOF-MS)和理论的相对分子量的比较

MCP形式	氨基端序列	相对分子量(Da)
							未糖基化的理论值	SDS-PAGE	MALDI/TOF-MS
MCP-2(1-76)	封闭	8893	7500	8881
					MCP-2(2-76)	SIPITCC	8384	7500	8365

                               表II

MCP-2(6-76)使微室中的MCP-1、MCP-2、MCP-3和RANTES的单核细胞趋化反应脱敏。

趋化因子a	浓度	趋化反应的拮抗作用b，c		趋化作用的抑制％
							缓冲液	100ng/mlMCP-2(6-76)
MCP-1	10	22.3±7.9	8.3±3.8	63±21
						3	15.0±8.0	1.3±0.3	99±1.0
MCP-2	5	36.0±15.6	10.8±6.1	75±8.0
						1.5	6.7±1.4	1.5±0.3	91±7.0
MCP-3	30	13.2±0.4	6.0±4.0	62±31
						10	3.0±1.5	＜1	100±0.0
RANTES	100	6.3±0.8	2.6±1.3	75±19
						30	4.0±0.8	1.5±0.3	77±16
		缓冲液	100ng/mlMCP-2(6-76)
					MCP-1	10	12.7±2.3	10.5±3.8	24±1.8
	3	7.5±0.0	3.0±0.3	69±4.0
					MCP-2	5	38.0±5.3	27.2±4.9	30±6.0
	1.5	18.3±4.6	9.2±1.4	45±23
					MCP-3	30	13.2±1.9	8.0±1.0	37±19
	10	7.7±1.4	1.7±0.3	90±6.0
					RANTES	100	5.5±0.6	5.8±0.9	17±7.0
	30	3.2±0.7	2.5±0.5	39±18

^a将MCP-1、MCP-2、MCP-3或RANTES作为化学吸引剂加入下排孔中。

^b微室的上排孔中加入预先用MCP-2(6-76)或缓冲液培育的THP-1细胞

^c3个独立实验的CI平均值±SEM

                                        参考文献

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Wuyts A.，等人，Biochemistry 36，2716-2723，1997.

                           序列表(1)一般信息：

(i)申请人：

          (A)姓名：APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V.

          (B)街道：14 JOHN B.GORSIRAWEG

          (C)城市：CURACAO

          (E)国家：THE NETHERLANDS ANTILLES

          (F)邮政编码：没有

          (G)电话：639300

          (H)电传：614129

          (I)电报：

(ii)发明名称：作为趋化因子拮抗剂的氨基端截短的MCP-2

(iii)序列数目：4

(v)计算机可读形式：

    (A)记录介质类型：软盘

    (B)计算机：IBM PC兼容型

    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

    (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：99氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(iii)假设：没有

(ix)特征：

    (A)名称/关键：蛋白质

    (B)位置：1..76

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Met Ala Ala Thr

        -20                 -15                 -10Phe Ser Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Asp Ser Val Ser Ile Pro Ile

    -5                  1               5Thr Cys Cys Phe Asn Val Ile Asn Arg Lys Ile Pro Ile Gln Arg Leu10                  15                  20                  25Glu Ser Tyr Thr Arg Ile Thr Asn Ile Gln Cys Pro Lys Glu Ala Val

            30                  35                  40Ile Phe Lys Thr Lys Arg Gly Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu

        45                  50                  55Arg Trp Val Arg Asp Ser Met Lys His Leu Asp Gln Ile Phe Gln Asn

    60                  65                  70Leu Lys Pro

75(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：99氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(iii)假设：没有

(ix)特征：

    (A)名称/关键：蛋白质

    (B)位置：1..76

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Met Ala Ala Thr

        -20                 -15                 -10Phe Ser Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Asp Ser Val Ser Ile Pro Ile

    -5                  1               5Thr Cys Cys Phe Asn Val Ile Asn Arg Lys Ile Pro Ile Gln Arg Leu10                  15                  20                  25Glu Ser Tyr Thr Arg Ile Thr Asn Ile Gln Cys Pro Lys Glu Ala Val

            30                  35                  40Ile Phe Lys Thr Gln Arg Gly Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu

        45                  50                  55Arg TrP Val Arg Asp Ser Met Lys His Leu Asp Gln Ile Phe Gln Asn

    60                  65                  70Leu Lys Pro

75(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：71氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(iii)假设：没有

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

  Ser Ile Pro Ile Thr Cys Cys Phe Asn Val Ile Asn Arg Lys Ile Pro

  1               5                   10                  15

  Ile Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Thr Arg Ile Thr Asn Ile Gln Cys Pro

              20                  25                  30

  Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Arg Gly Lys Glu Val Cys Ala

          35                  40                  15

  Asp Pro Lys Glu Arg Trp Val Arg Asp Ser Met Lys His Leu Asp Gln

      50                  55                  60

  Ile Phe Gln Asn Leu Lys Pro

  65                  70(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：71氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(iii)假设：没有

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Ser Ile Pro Ile Thr Cys Cys Phe Asn Val Ile Asn Arg Lys Ile Pro1               5                   10                  15Ile Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Thr Arg Ile Thr Asn Ile Gln Cys Pro

        20                  25                  30Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Gln Arg Gly Lys Glu Val Cys Ala

    35                  40                  45Asp Pro Lys Glu Arg Trp Val Arg Asp Ser Met Lys His Leu Asp Gln

50                  55                  60Ile Phe Gln Asn Leu Lys Pro65                  70

Claims (10)

1.一种氨基端截短的MCP-2，它缺少对应于天然存在的MCP-2的氨基酸残基1-5的氨基端氨基酸，并具有趋化因子拮抗活性。

2.根据权利要求1所述的氨基端截短的MCP-2，它具有SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列。

3.根据前述任一权利要求所述的氨基端截短的MCP-2，它是糖基化的形式。

4.一种DNA分子，它包含编码权利要求1所述的氨基端截短MCP-2的DNA序列。

5.一种表达载体，它包含权利要求4所述的DNA分子。

6.一种宿主细胞，它包含权利要求5所述的表达载体。

7.一种制备权利要求1所述的氨基端截短的MCP-2的重组方法，该方法包括将权利要求6所述的宿主细胞培养在培养基中。

8.权利要求1所述的氨基端截短的MCP-2在生产用于治疗或诊断疾病的药物中的应用，其中该疾病的治疗或诊断需要有拮抗趋化因子作用的活性。

9.根据权利要求8所述的应用，该应用用于生产用来治疗炎性疾病、HIV感染、血管生成和血细胞生成相关疾病或肿瘤的药物。

10.一种药物组合物，它包含权利要求1所述的氨基端截短的MCP-2以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

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