HU226414B1 - Amino-terminally truncated rantes as chemokine antagonists - Google Patents
Amino-terminally truncated rantes as chemokine antagonists Download PDFInfo
- Publication number
- HU226414B1 HU226414B1 HU0003505A HUP0003505A HU226414B1 HU 226414 B1 HU226414 B1 HU 226414B1 HU 0003505 A HU0003505 A HU 0003505A HU P0003505 A HUP0003505 A HU P0003505A HU 226414 B1 HU226414 B1 HU 226414B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- rantes
- cells
- amino
- chemokine
- truncated
- Prior art date
Links
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 title claims abstract description 44
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 title claims abstract description 9
- 102000001327 Chemokine CCL5 Human genes 0.000 title claims description 8
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 title description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 36
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002559 chemokine receptor antagonist Substances 0.000 claims description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 3
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 claims description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 claims 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 abstract description 17
- 102000001902 CC Chemokines Human genes 0.000 abstract description 10
- 108010040471 CC Chemokines Proteins 0.000 abstract description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 abstract description 5
- AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N mcp 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N 0.000 abstract description 4
- 102100034871 C-C motif chemokine 8 Human genes 0.000 abstract description 3
- 101710155833 C-C motif chemokine 8 Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 3
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 69
- 102100025012 Dipeptidyl peptidase 4 Human genes 0.000 description 47
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 37
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 36
- 101000908391 Homo sapiens Dipeptidyl peptidase 4 Proteins 0.000 description 29
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 22
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 description 22
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 21
- 108010067722 Dipeptidyl Peptidase 4 Proteins 0.000 description 20
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 17
- 102100032366 C-C motif chemokine 7 Human genes 0.000 description 16
- 108010055124 Chemokine CCL7 Proteins 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 16
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 13
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 12
- 101710149814 C-C chemokine receptor type 1 Proteins 0.000 description 11
- 102100031172 C-C chemokine receptor type 1 Human genes 0.000 description 11
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 11
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 9
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 9
- 101710149862 C-C chemokine receptor type 3 Proteins 0.000 description 8
- 102100024167 C-C chemokine receptor type 3 Human genes 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 7
- 102000014962 Monocyte Chemoattractant Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010064136 Monocyte Chemoattractant Proteins Proteins 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101710205625 Capsid protein p24 Proteins 0.000 description 6
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 6
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 6
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 6
- 101710149279 Small delta antigen Proteins 0.000 description 6
- 102100022563 Tubulin polymerization-promoting protein Human genes 0.000 description 6
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 6
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- -1 9-fluorenylmethoxycarbonyl Chemical group 0.000 description 5
- 102100036153 C-X-C motif chemokine 6 Human genes 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 101710085504 C-X-C motif chemokine 6 Proteins 0.000 description 4
- 101710115997 Gamma-tubulin complex component 2 Proteins 0.000 description 4
- 101710151805 Mitochondrial intermediate peptidase 1 Proteins 0.000 description 4
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 4
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 4
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 3
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 3
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 3
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 3
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 102100039373 Membrane cofactor protein Human genes 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N fura-2 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=3OC(=CC=3C=2)C=2OC(=CN=2)C(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000027425 release of sequestered calcium ion into cytosol Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PAMIQIKDUOTOBW-UHFFFAOYSA-N 1-methylpiperidine Chemical compound CN1CCCCC1 PAMIQIKDUOTOBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JAYIQMNQDMOBFY-KKUMJFAQSA-N Arg-Glu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JAYIQMNQDMOBFY-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- YUOXLJYVSZYPBJ-CIUDSAMLSA-N Asn-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O YUOXLJYVSZYPBJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- MKJBPDLENBUHQU-CIUDSAMLSA-N Asn-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MKJBPDLENBUHQU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 108091008927 CC chemokine receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005674 CCR Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108050006947 CXC Chemokine Proteins 0.000 description 2
- 102000019388 CXC chemokine Human genes 0.000 description 2
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- BEGQVWUZFXLNHZ-IHPCNDPISA-N Lys-Lys-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 BEGQVWUZFXLNHZ-IHPCNDPISA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- WSTIOCFMWXNOCX-YUMQZZPRSA-N Ser-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)N WSTIOCFMWXNOCX-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- NAXBBCLCEOTAIG-RHYQMDGZSA-N Thr-Arg-Lys Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O NAXBBCLCEOTAIG-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000034196 cell chemotaxis Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 102000045598 human DPP4 Human genes 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000028550 monocyte chemotaxis Effects 0.000 description 2
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 230000009131 signaling function Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 3',5'-di-O-methyltricetin Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C=2)=C1 HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229940124321 AIDS medicine Drugs 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N Arg-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- NGYHSXDNNOFHNE-AVGNSLFASA-N Arg-Pro-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NGYHSXDNNOFHNE-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N Asn-Pro Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- RSMZEHCMIOKNMW-GSSVUCPTSA-N Asp-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RSMZEHCMIOKNMW-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010014423 Chemokine CXCL6 Proteins 0.000 description 1
- 101710091342 Chemotactic peptide Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QJUDRFBUWAGUSG-SRVKXCTJSA-N Cys-Cys-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)N QJUDRFBUWAGUSG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- KVCJEMHFLGVINV-ZLUOBGJFSA-N Cys-Ser-Asn Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O KVCJEMHFLGVINV-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N Digitonin Natural products CC1CCC2(OC1)OC3C(O)C4C5CCC6CC(OC7OC(CO)C(OC8OC(CO)C(O)C(OC9OCC(O)C(O)C9OC%10OC(CO)C(O)C(OC%11OC(CO)C(O)C(O)C%11O)C%10O)C8O)C(O)C7O)C(O)CC6(C)C5CCC4(C)C3C2C QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- VSRCAOIHMGCIJK-SRVKXCTJSA-N Glu-Leu-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O VSRCAOIHMGCIJK-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HQOGXFLBAKJUMH-CIUDSAMLSA-N Glu-Met-Ser Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N HQOGXFLBAKJUMH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- PMSDOVISAARGAV-FHWLQOOXSA-N Glu-Tyr-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 PMSDOVISAARGAV-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000946926 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000797762 Homo sapiens C-C motif chemokine 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000947177 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 6 Proteins 0.000 description 1
- 101001058904 Homo sapiens Gamma-tubulin complex component 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- HIZYETOZLYFUFF-BQBZGAKWSA-N Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O HIZYETOZLYFUFF-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- QMKFDEUJGYNFMC-AVGNSLFASA-N Leu-Pro-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O QMKFDEUJGYNFMC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- ODUQLUADRKMHOZ-JYJNAYRXSA-N Lys-Glu-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O ODUQLUADRKMHOZ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 102000009571 Macrophage Inflammatory Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010009474 Macrophage Inflammatory Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010023347 Met- RANTES Proteins 0.000 description 1
- WTHGNAAQXISJHP-AVGNSLFASA-N Met-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O WTHGNAAQXISJHP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N Met-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N N-L-cysteinyl-L-phenylalanine Natural products SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- MHNBYYFXWDUGBW-RPTUDFQQSA-N Phe-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)O MHNBYYFXWDUGBW-RPTUDFQQSA-N 0.000 description 1
- IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N Piscigenin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2C(C3=C(O)C=C(O)C=C3OC=2)=O)=C1 IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036154 Platelet basic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710195957 Platelet basic protein Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- WFLWKEUBTSOFMP-FXQIFTODSA-N Pro-Cys-Cys Chemical compound OC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 WFLWKEUBTSOFMP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100438969 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CDC26 gene Proteins 0.000 description 1
- XGQKSRGHEZNWIS-IHRRRGAJSA-N Ser-Pro-Tyr Chemical compound N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(O)=O XGQKSRGHEZNWIS-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- PPCZVWHJWJFTFN-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PPCZVWHJWJFTFN-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- ZESGVALRVJIVLZ-VFCFLDTKSA-N Thr-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O ZESGVALRVJIVLZ-VFCFLDTKSA-N 0.000 description 1
- UMSZZGTXGKHTFJ-SRVKXCTJSA-N Tyr-Ser-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 UMSZZGTXGKHTFJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000001275 ca(2+)-mobilization Effects 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 1
- PRQROPMIIGLWRP-BZSNNMDCSA-N chemotactic peptide Chemical compound CSCC[C@H](NC=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PRQROPMIIGLWRP-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N digitonin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)C[C@@H](O)[C@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO7)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@@H](CO)O5)O)C[C@@H]4CC[C@H]3[C@@H]2[C@@H]1O)C)[C@@H]1C)[C@]11CC[C@@H](C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N digitonine Natural products CC1C(C2(CCC3C4(C)CC(O)C(OC5C(C(O)C(OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)CO7)O)C(O)C(CO)O6)OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)C(CO)O7)O)C(O)C(CO)O6)O)C(CO)O5)O)CC4CCC3C2C2O)C)C2OC11CCC(C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001210 effect on neutrophils Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000222 eosinocyte Anatomy 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000003269 fluorescent indicator Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 102000045341 human CCL5 Human genes 0.000 description 1
- 102000048160 human CCR5 Human genes 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 1
- VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N norethisterone Chemical compound O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000036515 potency Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 229940043131 pyroglutamate Drugs 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 230000003578 releasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N tricin Natural products COc1cc(OC)c(O)c(c1)C2=CC(=O)c3c(O)cc(O)cc3O2 BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/4813—Exopeptidases (3.4.11. to 3.4.19)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/521—Chemokines
- C07K14/523—Beta-chemokines, e.g. RANTES, I-309/TCA-3, MIP-1alpha, MIP-1beta/ACT-2/LD78/SCIF, MCP-1/MCAF, MCP-2, MCP-3, LDCF-1, LDCF-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
A találmány tárgyát képezi olyan, aminoterminálisa felől csonkolt RANTES, amely kemokinantagonista aktivitású és amelyből a természetesen előforduló RANTES 1-2. aminosavainak megfelelő aminoterminális aminosavak hiányoznak. A találmány tárgyát képezik továbbá a csonkolt RANTES-eket kódoló cDNS-szekvenciák, terápiás és/vagy diagnosztikus alkalmazásuk olyan betegségekben, amelyekben a kemokinhatások antagonista aktivitása szükséges, és az ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények.
A kemokinek a fehérvérsejtekre kemotaktikus és aktiváló tulajdonságú, kis proinflammatorikus citokinek családjához tartoznak. Az első ciszteinek helyzetétől függően a kemokincsalád C-C, C-X-C és C-X3-C típusú kemokinekre osztható [Baggiolini, M. és munkatársai, Ann. Rév. Immunoi. 55, 97-179 (1994); Baggiolini, M. és munkatársai, Ann. Rév. Immunoi. 15, 675-705 (1997); Taub, D. és munkatársai, Cytokine & Growth Factor Reviews 7, 335-76 (1996)].
Sok C-X-C típusú keniokin, például az interleukin-8 (IL—8) a neutrofilokra kemotaktikus hatású, míg a C-C-kemokinek, például a monocita kemotaktikus fehérje 3 (MCP-3, „monocyte chemotactic protein-3) számos fehérvérsejtre hat, például monocitákra, limfocitákra, eozinofilokra, bazofilokra, NK-sejtekre és dendrites sejtekre.
A kemokinek aminoterminális doménje a receptorkötésben vesz részt, és az aminoterminális végek processzálása aktiválhatja vagy teljesen inaktívvá teheti a kemokineket.
A C-X-C-kemokin vérlemezke bázikus fehérje csak a 24 aminoterminális aminosav eltávolítása után alakul neutrofil kemotaktikus pepiiddé (NAP-2) [Walz, A. és munkatársai, Biochem. Biophys. Rés. Commun. 159, 969-75 (1989); Van Damme, J. és munkatársai, Eur. J. Immunoi, 20, 2113-8 (1990)].
Az IL-8-ból akár 8 aminoterminális aminosav eltávolítása megnöveli a kemotaktikus aktivitást, de a minden, neutrofil sejtekre kemotaktikus hatású C-X-C-kemokinben az első cisztein előtt elhelyezkedő Glu-Leu-Arg minta további hasítása teljes inaktivációt eredményez [Clark-Lewis, I. és munkatársai, J. Bioi. Chem. 266, 23 128-23 134 (1991)].
Egy másik C-X-C-kemokinben, a 2 típusú granulocita kemotaktikus fehérjében (GCP-2, „granulocyte chemotactic protein-2”) hasonló aminoterminális proteolízis (egészen 8 aminosavig) nincs hatással a neutrofil kemotaktikus aktivitásra [Proost, P. és munkatársai, Biochemistry 32, 10 170-10 177 (1993)].
A RANTES („Regulated upon Activation, /Vormally T Expressed, and presumably Secreted”, azaz az „aktivációval szabályozott, normál T-sejt által expresszált és feltehetőleg szekretált” kifejezés angol rövidítése) C-C-kemokin, amelynek cDNS-klónját T-sejt-specifikus szekvenciákra dúsított cDNS-könyvtárból izolálták [Schall, T. J. és munkatársai, J. Immunoi. 141, 1918-1025(1988)].
A 8-9 aminoterminális aminosavban hiányos, szintetikus C-C kemokinek, az MCP-1, az MCP-3 és a RANTES monocitákon inaktívak és receptorantagonistákként alkalmazhatók [Gong, J. és munkatársai, J. Bioi. Chem. 271, 10 521-10 527 (1996); Gong, J. és munkatársai, J. Exp. Med. 181, 631-640 (1995)].
A RANTES kibővítése egy metioninnal a molekula teljes inaktivációját eredményezi és a Met-RANTES az eredeti RANTES antagonistájaként viselkedik [Proudfoot, A. E. és munkatársai, J. Bioi. Chem. 271, 2599-2603 (1996)].
A következőkben ismertetjük a találmányt. A találmány szerinti megoldás kidolgozásával elsődleges célunk volt a természetesen előforduló RANTES 1., 1-2., 1-3. vagy 1—4. aminosavainak megfelelő aminoterminális aminosavakban hiányos, aminoterminálisa felől csonkolt RANTES előállítása, amely kemokinantagonista aktivitású.
A találmány szerinti megoldás előnyös célja a RANTES(3-68), amely olyan RANTES, amelyből az első két aminosav hiányzik, mint ezt az 1. ábrán és a 2. azonosító számú szekvenciában bemutatjuk.
A találmány szerinti, aminoterminálisa felől csonkolt RANTES lehet glikozilált vagy glikozilálatlan formájú.
A „kemokinantagonista” kifejezés azt jelenti, hogy „az érett, teljes hosszúságú, természetesen előforduló kemokinekre” antagonistaként hat.
A találmány szerinti megoldás kidolgozásával egy másik célunk olyan DNS-molekulák előállítása volt, amelyek tartalmazzák a találmány szerinti, aminoterminálisa felől csonkolt RANTES-t kódoló DNS-szekvenciákat, közöttük a lényegében azonos nukleotidszekvenciákat.
A „lényegében azonos nukleotidszekvenciák” kifejezés minden más nukleinsavszekvenciát jelent, amely a genetikai kód degenerációja következtében szintén az adott aminosavszekvenciát kódolja.
A találmány tárgyát képezik a fenti DNS-eket tartalmazó expressziós vektorok, az ilyen vektorokkal transzformált gazdasejtek és a találmány szerinti, aminoterminálisa felől csonkolt RANTES előállítására szolgáló eljárás a transzformált sejtek megfelelő tápközegben történő tenyésztése útján.
A találmány szerinti fehérjéket kódoló DNS-szekvencia egy megfelelő plazmidba beépíthető és ligálható. A létrehozott expressziós vektor egy alkalmas gazdasejtbe juttatható, amely azután expresszálja a vektorokat, amely a kívánt fehérjét eredményezi.
A leírásban ismertetett, a találmány szerinti, bármelyik rekombináns fehérje expressziója eukarióta sejtekben (például élesztőkben, rovar- vagy emlőssejtekben) vagy prokarióta sejtekben végrehajtható megfelelő expressziós vektorok alkalmazásával. Bármilyen, a technika állása szerint ismert eljárás alkalmazható.
A fenti eljárások bármelyikével kapott fehérjéket kódoló DNS-molekulák például egy megfelelően kialakított expressziós vektorba építhetők a technika állása szerinti, jól ismert technológiákkal [lásd, Sambrook és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1989)]. Kettős szálú cDNS-t a plazmidvektorhoz homopolimer végkészítéssel vagy szintetikus DNS-kapcsolók alkalmazásával restrikciós kapcsolás2
HU 226 414 Β1 sál vagy tompa végű ligálási technológiákkal kapcsolhatunk: DNS-ligázokat alkalmazunk a DNS-molekulák kapcsolására és a nemkívánatos kapcsolódásokat alkalikus foszfatáz-enzimes kezeléssel kerüljük el.
A kívánt fehérje expressziója érdekében az expressziós vektor transzkripciós és transzlációs szabályozóinformációt hordozó specifikus nukleotidszekvenciákat is tartalmaz a kívánt fehérjét kódoló DNS-hez oly módon kapcsolva, hogy a génexpressziót és a fehérje termelődését lehetővé tegyék. Először is a gén átírása érdekében egy, az RNS-polimeráz által felismerhető promoter kell hogy megelőzze, amelyhez a polimeráz kötődik és így elindítja a transzkripciós folyamatot. Számos ilyen promoter alkalmazható, amelyek különböző hatékonyságúak (erős vagy gyenge promoterek).
Eukarióta gazdákban a gazdától függően különböző transzkripciós és transzlációs szabályozószekvenciák használhatók. Ezek származhatnak vírusokból, például adenovírusból, szarvasmarha papillomavírusából, Simian vírusból vagy hasonlókból, ahol a szabályozószignálok egy bizonyos, magas expressziós szintű génnel állnak kapcsolatban. Ilyenek például a Herpes vírus TK-promotere, az SV40 korai promoter, az élesztő ga14-génpromotere stb. A transzkripciós iniciációs szabályozószignálok úgy választhatók, hogy repressziót és aktivációt lehetővé tegyenek, így a gének expressziója befolyásolható legyen.
A találmány szerinti fehérjét kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó DNS-molekulát, amelyhez működőképesen transzkripciós és transzlációs szabályozószignálok kapcsolódnak, beépítjük egy vektorba/vektorokba, amely(ek) a kívánt génszekvenciákat be tudják építeni a gazdasejtbe.
A bejuttatott DNS-sel stabilan transzformált sejtek egy vagy több, az expressziós vektort tartalmazó gazdasejtek kiválogatását lehetővé tevő marker bevitelével szelektálhatok. A marker egy auxotróf gazdának prototrófiát biztosíthat, biocid rezisztenciát, például antibiotikumokra vagy nehézfémekre, mint például rézre, vagy hasonlók. A szelekciós marker közvetlenül az expresszálandó génszekvenciák DNS-éhez kapcsolható vagy kotranszfekcióval juttatható be ugyanabba a sejtbe. További elemek is szükségesek lehetnek a találmány szerinti fehérjék optimális szintéziséhez.
Egy bizonyos plazmid vagy vírusvektor kiválasztásában fontos tényezők például: az egyszerűség, amellyel a vektort tartalmazó recipiens sejtek felismerhetők és kiválogathatok a vektort nem tartalmazó recipiens sejtek közül, a vektor kívánatos kópiaszáma egy bizonyos gazdában, és hogy vajon kívánatos-e, hogy a vektor „átvihető” („shuttle”) legyen különböző fajták gazdasejtjei között.
Amikor a vektor(ok) vagy a konstrukció(ka)t tartalmazó DNS-szekvencia az expresszióhoz elkészült, a DNS-konstrukció(k) egy megfelelő gazdasejtbe vihetők a számos alkalmas eszköz bármelyikével, például transzformációval, transzfekcióval, konjugációval, protoplasztfúzióval, elektroporációval, kalcium-foszfátos kicsapással, közvetlen mikroinjekcióval stb.
A gazdasejtek lehetnek prokarióta vagy eukarióta sejtek. Előnyösek az eukarióta gazdák, például emlőssejtek, mint például humán, majom, egér és kínai hörcsög petefészek sejtje (CHO, „Chinese hamster ovary cell), mivel a fehérjemolekulák poszttranszlációs módosítására lehetőséget nyújtanak, például a helyes térszerkezet kialakítására vagy a megfelelő helyeken történő glikozilálásra. Rekombináns DNS-stratégiák egész sora használ erős promoterszekvenciákat és nagy kópiaszámú plazmidokat, amelyek élesztőben a kívánt fehérje előállítására alkalmazhatók. Az élesztősejtek felismerik a klónozott emlőseredetű géntermékeken lévő vezetőszekvenciákat, és vezetőszekvenciákat hordozó peptideket (azaz prepeptideket) választanak ki.
A vektor(ok) bejuttatása után a gazdasejteket szelekciós tápközegen tenyésztjük, amely a vektort tartalmazó sejtek növekedésére szelektál. A klónozott génszekvencia/génszekvenciák expressziója a kívánt fehérjék termelődését eredményezi.
A találmány szerinti, aminoterminálisa felől csonkolt RANTES a technika állása szerinti, bármilyen jól ismert módszerrel előállítható, előnyösen jól kidolgozott kémiai szintézises módszerekkel, automatizált szilárd fázisú peptidszintetizátorokkal, amelyet kromatográfiás tisztítás követ.
A találmány szerinti kemokinek megszintetizálhatók például Fmoc (9-fluor-enil-metoxi-karbonil), tBoc (t-butoxi-karbonil) vagy bármilyen, más, hasonló kémiai szintézissel a különböző aminosavakon megfelelő oldallánc-védőcsoportokkal vagy anélkül. A megfelelő oldallánc-védőcsoportokkal ellátott vagy anélküli aminosavakat előzetesen aktiváljuk - például HBTU/HOBt-tal [2-( 1 H-benzo-triazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil-uromium-hexafluoro-foszfát/1-hidroxi-benzo-triazol] - és a növekvő peptidlánchoz kapcsoljuk. A következő aminosav hozzáadása előtt a védőcsoportot (például Fmoc) eltávolítjuk az α-amino-csoportról. A szintézis után minden védőcsoportot eltávolítunk, az ép, teljes hosszúságú peptidet tisztítjuk és kémiailag vagy enzimesen hajtogatjuk (többek között a ciszteinek közötti diszulfidhidak kialakítása) a találmány szerinti kemokineknek megfelelően.
A természetes, szintetikus vagy rekombináns fehérjék tisztítását bármilyen, erre a célra ismert eljárás szerint hajtjuk végre, azaz bármilyen hagyományos módszerrel, például extrakcióval, kicsapással, kromatográfiával, elektroforézissel vagy hasonlókkal [lásd például Proost, P. és munkatársai, Methods: A companion to Methods in Enzymol. 10, 82 (1996)]. További tisztítási eljárás, amely előnyösen alkalmazható a találmány szerinti fehérje tisztítására az affmitáskromatográfia monoklonális antitesttel vagy heparinnal szembeni affinitás alapján, amelyek kötik a célfehérjét, és amelyeket egy oszlopban lévő gélmátrixon immobilizálva végezhetjük el az eljárást. A fehérjéket tartalmazó nem tiszta készítményeket az oszlopon keresztülengedjük. A fehérje a specifikus ellenanyagon keresztül az oszlophoz kötődik, míg a szennyező anyagok áthaladnak az oszlopon. Mosás után a fehérjét a gélről a pH vagy az ionerősség megváltoztatásával oldjuk le.
HU 226 414 Β1
A találmány szerinti, aminoterminálisa felől csonkolt RANTES olyan betegségek terápiájában és/vagy diagnózisában alkalmazható, amelyekben a kemokinhatások antagonista aktivitása szükséges. Ilyen betegségek például: gyulladásos betegségek, ér- vagy vérképződéssel kapcsolatos betegségek, tumorok, fertőző betegségek, például HÍV, autoimmun betegségek, atherosclerosis, légzőszervi betegségek és bőrrendellenességek. A találmány előnyösen alkalmazható a HIV-fertőzés területén.
A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti fehérje alkalmazása egy, a fent említett betegségek kezelésére szolgáló gyógyszer előállításában.
A gyógyszert előnyösen egy gyógyászati készítmény formájában állítjuk elő, amely a találmány szerinti fehérjékből áll egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozóval vagy kötőanyaggal. Ilyen gyógyászati készítmények a találmány még egy további szempontját képezik.
A találmány egy további megvalósítási módja szerint eljárás a fent említett betegségek kezelésére, amely során a találmány szerinti, aminoterminálisa felől csonkolt RANTES gyógyászatilag aktív mennyiségét adagoljuk a páciensnek ilyen betegségek kifejlődésének veszélye esetén vagy már tüneteket mutató páciensnek.
Azt is felismertük, hogy a CD26/DPP-IV segítségével in vitro aminoterminálisa felől csonkolt RANTES-t állítható elő. A RANTES az első citokin, amelyről leírták, hogy biológiai aktivitását CD26/DPP-IV befolyásolja.
Ez az első azonosított mechanizmus kemokinek endogén módon szabályozott, antagonistává történő módosítására, amely hasonló a fiziológiai folyamatokhoz, de más tényezők (proteázok) közvetítésével megy végbe. Az ilyen faktorok (proteázok) alkalmazása a fent említett betegségek terápiájában és/vagy diagnózisában szintén a találmány tárgyát képezi.
A találmányt a következő, a találmányt semmilyen formában nem korlátozó példák segítségével írjuk le. A példákban az alábbiakban ismertetett ábrákra hivatkozunk.
A következőkben az ábrák leírását ismertetjük.
Az 1. ábrán a RANTES aminosavszekvenciáit mutatjuk be. A szignálszekvenciákat italic betűtípussal jelöltük, míg a C-aminosavakat félkövér betűtípussal írtuk. Nyilak jelölik a találmány szerinti, aminoterminálisa felől csonkolt RANTES, amelyet RANTES(3-68)-nak is nevezünk, első aminosavait.
A 2. ábrán az ép, és a természetes vagy rekombináns RANTES aminoterminálisan csonka formáinak Boyden-mikrokamrás vizsgálati eljárással mért, monocita ΤΗΡ-1-sejtekre való kemotaktikus képességének összehasonlítását mutatjuk be: a természetes RANTES(1-68) (Δ), a természetes, csonka RANTES(3-68) (□), az ép, rekombináns RANTES(1-68) (A) és CD26/DPP-IV hasította rekombináns RANTES(3-68) (). Az eredmények négy vagy több független kísérlet átlagos kemotaktikus indexét (Cl) ±SEM értékét mutatják.
A 3. ábrán a természetes RANTES(3-68) (□), a természetes RANTES(1-68) (Δ), a rekombináns RANTES(1-68) (A) és a rekombináns, CD26/DPP-IV-gyel kezelt RANTES(3-68) () hatását mutatjuk be a THP-1-sejtek intracelluláris Ca2+-ion mennyiségére ([Ca2+]j). Az eredmények három vagy több független kísérlet átlagos [Ca2*], növekedését ±SEM értékét jelentik.
A 4. ábrán az ép recRANTES(1-68) Ca2+-mozgósító képességének RANTES(3-68) által történő deszenzitizációját mutatjuk be. A THP-1-sejteket először pufferrel vagy rekombináns RANTES(1-68) vagy RANTES(3-68) különböző koncentrációival stimuláltuk. Az eredmények három vagy több független kísérlet átlagos [Ca2+]i növekedését ±SEM értékeit képviselik második stimulusként 30 ng/ml ép, rekombináns RANTES-re történő válaszként.
Az 5. ábrán a csonka RANTES(3-68) kemotaktikus képességének az ép RANTES(1-68)-éval történő összehasonlítását mutatjuk be. A természetes (nat) és a rekombináns (rec) csonka RANTES, az ép RANTES és a szintetikus MCP-3 eozinofil granulocita kemotaktikus aktivitását mikrokamrás vizsgálati eljárással határoztuk meg. Az eredmények két vagy több független kísérlet (mindegyik három párhuzamos méréssel) átlagos kemotaktikus indexe (Cl) ±SEM értéke.
A 6. ábrán a kalciummozgósítás ép RANTES hatására történő deszenzitizációját mutatjuk be CCR-transzfektánsokban. A kalciummozgósításos kísérleteket CD4-gyel és CCR1 vagy CCR5 CC-kemokin-receptorokkal transzfektált HOS-sejteken végeztük. A sejteket először az ép vagy csonka RANTES különböző koncentrációival stimuláltuk, amelyet 100 ng/ml ép RANTES-sel történő ingerlés követett. A második inger által kiváltott [Ca2*], növekedés százalékos gátlását mutatjuk be. A százalékot RANTES(1-68) vagy RANTES(3-68) hozzáadása után 100 ng/ml ép RANTES-re adott reakciónak a pufferrel történő stimuláció után adott reakcióval (100%) történő összehasonlításával számoltuk. Az eredmények két vagy több kísérlet átlagos százalékos gátlását ±SEM értékét jelentik.
HU 226 414 Β1
A 7. ábrán RANTES(3-68) jelentős gátlóhatása látható mononukleáris sejtek HIV-1-gyel történő fertőzésére. A PHA-aktivált PBMC-t M-tropikus HIV-1 Ba-L törzzsel fertőztük RANTES(1-68) vagy RANTES(3-68) különböző koncentrációinak jelenlétében (O-tól 1000 ng/ml-t adtunk a fertőzés pillanatában). Tíz nap múlva megmértük a vírushozamot a sejtfelülúszókban p24-antigén ELISA-val (a négyből egy reprezentatív kísérletet mutatunk be).
A 8. ábrán RANTES(1-68) és RANTES(3-68) hatása látható HIV-1 SF162 törzzsel történő fertőzésre PHA-aktivált PBMC-sejtekben. A vírushozamot 10 nappal a fertőzés után p24-antigén ELISA-val mértük a sejtek felülúszójában. A három kísérletből az egyik reprezentatív kísérlet eredményét mutatjuk be. *A p24-antigén ELISA kimutatási határa alatt (<5 pg/ml).
A 9. ábrán CD26 expresszióját mutatjuk be HOS.CD4.CCR5-sejteken, U87.CD4.CCR5-sejteken és frissen izolált PBMC-n. A CD26-pozitív sejtek százalékát (%) jelöltük mindegyik oszlopdiagramban.
A 10. ábrán RANTES(1-68), RANTES(1-68) és SCD26 (50 U/l) és RANTES(3-68) hatása látható HOS.CD4.CCR5-sejtek HIV-1 BaL törzzsel történő fertőzésére. A vírushozamot a sejtfelülúszóban 8 nappal a fertőzés után vizsgáltuk p24-antigén ELISA-val. A három kísérletből az egyik reprezentatív kísérlet eredményét mutatjuk be.
A következőkben a példákat ismertetjük.
1. példa
Aminoterminálisan csonka RANTES Anyagok és módszerek Anyagok
A természetes, humáneredetű RANTES-t humán Malavu hepatosarcoma sejtekből, MG-63 osteosarcoma sejtekből vagy perifériás vér fehérvérsejtekből (Antwerp és Leuven Vértranszfúziós központjai) állítottuk elő és tisztítottuk a fentiekben leírtak szerint [Proost, P. és munkatársai, Methods: A companion to Methods in Enzymol. 10, 82 (1996) és Proost, P. és munkatársai, J. Immunoi. 150, 1000-1010 (1993)]. Az MCP-2-t, az MCP-3-at és a GCP-2-t Fmoc kémiai eljárással szintetizáltuk [Proost, P. és munkatársai, Cytokine 7, 97-104 (1995) és Wuyts, A. és munkatársai, Biochemistry 36, 2716-2723 (1997)], a rekombináns humán RANTES-t Peprotechtől (Rocky Hill, NJ) szereztük be, és a rekombináns MCP-1 Dr J. J. Oppenheim (NCI-NIH, Frederick, MD) ajándéka volt.
CD4-gyel és CCR1, CCR3 vagy CCR5 CC-kemokin-receptorok [Deng, H. és munkatársai, Natúré 381,
661-666 (1996)] egyikével fertőzött humán osteosarcoma sejteket (HŐS) glutamaxszal kiegészített DMEM-ben tenyésztettünk. Puromycint (1 pg/ml) adtunk a tápközeghez szelekciós anyagként. Minden tenyésztő táptalajt (Gibco BRL/Life Technologies, Paisley, UK) 10% FCS-sel egészítettünk ki.
A humán CD26/DPP-IV-et prosztaszómákból, az ondófolyadékban bőségesen jelen lévő, prosztataeredetű organellumokböl állítottuk elő. Az enzimet a fentiekben leírtak szerint homogenitásig tisztítottuk ioncserét követően adenozindeaminázra történő affinitáskromatográfiával [De Meester, I. és munkatársai, J. Immunoi. Methods 189, 99-10526 (1996)].
A kemokinek inkubációja CD26/DPP-IV-gyel és a proteolitikus folyamat kimutatása A kemokint 100-tól 1000 moláris feleslegben inkubáltuk egy éjszakán keresztül CD26/DPP-IV-gyel 100 mmol Tris/HCI pH=7,7 pufferben. A kemokineket a CD26/DPP-IV-től SDS-PAGE-val választottuk el Tris/Tricin gélrendszerben a fentiekben leírtak szerint [Proost, P. és munkatársai, Methods: A companion to Methods in Enzymol. 10, 82 (1996)].
A fehérjéket elektroblot módszerrel PVDF-membránokra (polivinilidén-fluorid) vittük (Problott, Perkin-EImer, Foster City, CA) és Coomassie brilliant blue R250-nel festettük. A kimosás után a membránokat legalább ötször öblítettük ultratiszta vízzel (Milli Q, Millipore, Bedford, MA).
A biológiai vizsgálathoz elegendő mennyiségű, tiszta, csonka kemokin előállítása céljából körülbelül 50 pg rekombináns kemokint CD26/DPP-IV-gyel kezeltünk és a hasítási terméket 0,1% trifluor-ecetsawal (TFA) savaztuk. Tween 20-at (0,01%) adtunk hozzá, hogy megakadályozzuk a kemokineknek a csőhöz történő tapadását.
A kemokineket a CD26/DPP-IV-től acetonitrilgradienssel C-8 Aquapore RP-300 oszlopon (1><50 mm) (Perkin-Elmer) választottuk el. A fehérjéket tartalmazó frakciókat SDS-PAGE-val vizsgáltuk és ezüsttel festettük a fentiek szerint.
A CD26/DPP-IV-gyel kezelt, RP-HPLC-vel tisztított vagy PVDF-blotból kivágott kemokinek aminoterminális végét Edman-bontással szekvenáltuk pulzáló folyadékfázisú 477A/120A fehérjeszekvenátorral (Perkin-Elmer) kapcsolóbázisként N-metil-piperidin alkalmazásával.
A kemotaktikus aktivitás kimutatása
A kemokinek kemotaktikus képességét frissen tisztított perifériás vér neutrofil granulocitákon (106 sejt/ml) vagy monocitikus THP-1-sejtkultúrán (0,5x10® sejt/ml) mértük Boyden-mikrokamrában [Proost, P. és munkatársai, Methods: A companion to Methods in Enzymol. 10, 82 (1996) és Proost, P. és munkatársai, J. Immunoi. 150, 1000-1010(1993)].
Negyvenöt perces (granulociták) vagy két órás (THP-1-sejtek) 37 °C-on történő inkubációt követően a sejteket rögzítettük és festettük. Az 5 pm pórusméretű polikarbonátmembránokon keresztülvándorolt sejteket tíz olajimmerziós mezőben mikroszkóposán megszámoltuk.
HU 226 414 Β1
A minták kemotaktikus indexét (Cl, „chemotactic index”) - mindegyik kamrában háromszoros ismétlésben - a vizsgálandó minta felé vándorolt sejtek számának a kontrolltápközeg felé vándorolt sejtek számával történő osztásával számoltuk.
A deszenzitizációs kísérletekben a sejteket biológiailag inaktív kemokinváltozattal inkubáltuk 10 percen keresztül 37 °C-on mielőtt a kamrába helyeztük.
A HBSS-sel kezelt kontrollsejtekkel történő deszenzitizálással kapott százalékos Cl-gátlást a kemotaxis deszenzitizációjának kiértékelésére számoltuk.
Az intracellulárís Ca2+-koncentráció kimutatása te intracellulárís kalciumkoncentrációkat {[Ca2+]j) az előzőekben ismertetettek szerint mértük [Wuyts, A. és munkatársai, Biochemistry 36, 2716-2723 (1997)]. Röviden ismertetve, a tisztított sejteket fura-2 fluoreszcens indikátorral (2,5 pmol fura-2/ΑΜ, Molecular Probes Europe BV, Leiden, The Netherlands) és 0,01% Pluronic F-127-tel (Sigma, St Louis MO) inkubáltuk.
Harminc perc elteltével a sejteket kétszer mostuk, 1 mmol Ca2+-ot tartalmazó HBSS-ben szuszpendáltuk, és 37 °C-on 10 percen keresztül inkubáltuk mielőtt a fura-2 fluoreszcenciát LS50B luminospektrofotométeren (Perkin-Elmer) mértük.
340 és 380 nm-en történő gerjesztésnél a fluoreszcenciát 510 nm-en mértük. A [Ca2+]rt a Grynkiewicz-egyenletből számoltuk [Grynkiewicz, G. és munkatársai, J. Bioi. Chem. 260, 3440 (1985)].
Az Rmax meghatározása érdekében a sejteket 50 pmol digitoninnal emésztettük. Ezt követően a pH-t 8,5-re állítottuk 20 mmol Trisszel és az Rmin-ot 10 mmol EGTÁ-nak az emésztett sejtekhez történő hozzáadásával kaptuk. A kalibrációhoz alkalmazott Kd 224 nmol.
A deszenzitizációs kísérletekben a sejteket először pufferrel vagy kemokin különböző koncentrációival stimuláltuk. Második stimulusként olyan koncentrációjú kemokineket alkalmaztunk, amelyek szignifikáns növekedést váltottak ki a [Ca2+]rben a pufferrel történő előzetes stimuláció után. Kiszámoltuk a második stimulusra történő [Ca2+]j növekedésének a sejtek előstimulációja miatti százalékos gátlását.
A HIV-1-fertőzés gátlása
A HÍV—1 M-tropikus BaL- és SF162-törzseit az MRC AIDS hatóanyag projekt (Herts, UK) révén kaptuk. Az egészséges donoroktól származó perifériás vér mononukleáris sejteket (PBMC „peripherial blood mononuclear cell) sűrűséggradiens centrifugálással (5,23) izoláltuk és 1 pg/ml PHA-val (Sigma, Bomem, Belgium) stimuláltuk 3 napon keresztül 37 °C-on. Az aktivált sejteket (a PHA-stimulált blasztokat) PBS-sel háromszor mostuk, és a vírussal fertőztük a fentiekben leírtak szerint [Schols, D. és munkatársai, J. Exp. Med. 186, 1383-1388 (1997)]. A HIV-1-gyel vagy csak kontrollként fertőzött PHA-stimulált blasztokat 25 U/ml IL—2 és RANTES(1-68) vagy RANTES(3-68) változó koncentrációinak jelenlétében tenyésztettük. A sejtfelülúszókat a 10. napon gyűjtöttük be, és a felülúszókban a HÍV—1 magantigént ρ-24-antigén ELISA reagenskészlettel (DuPont/NEN Life Science Products, Brussels, Belgium) vizsgáltuk.
Eredmények
A természetes, aminoterminállsa felől csonkolt
RANTES azonosítása és biológiai jellemzése
A humán GCP-2 különböző aminoterminálisa felől csonkolt formáját már izolálták [Proost, P. és munkatársai, J. Immunoi. 150, 1000-1010 (1993)]. A legkisebb, csonka GCP-2 formát az utolsó előtti helyzetben lévő prolinon túl hasították [GCP-2(3-75)]. Hasonló, hagyományos tisztítási módszer alkalmazásával tisztították a RANTES CC-kemokint perifériás vér fehérvérsejtekből vagy sarcomasejtekből [Proost, P. és munkatársai, Methods: A companion to Methods in Enzymol. 10, 82 (1996)].
Előnyösen citokinkeverékkel indukált MG-63 vagy Malavu sarcomasejtek kondicionált közegéből izoláltuk a természetes kemokinvariánsokat. A kemokineket ezt követően affinitás- vagy heparin-affinitáskromatográfiával, kationcserélő kromatográfiával (Mono S FPLC) és RP-HPLC-vel tisztítjuk, és az immunológiailag aktív formákat specifikus kemokin ELISA-val mutattuk ki. A kationcserélő oszlopon az IL—8 a RANTES közvetlen közelségében (0,7 és 0,75 mól nátrium-klorid között) eluálódik. RP-HPLC-vel azonban mindkét kemokin elválasztható egymástól (a RANTES, illetve az IL—8 27,5%, illetve 30% acetonitrilnél eluálódik). A tiszta fehérjék aminosavszekvencia-analízise megerősítette, hogy az IL—8 különböző, aminoterminálisa felől csonkolt formákban fordul elő, amelyeket korábban kemotaktikus aktivitásuk alapján izoláltak [Van Damme, J. és munkatársai, Eur. J. Biochem. 181, 337-344 (1989)]. RANTES esetében azonban csak egyetlen formát izoláltak, amelynek az ép RANTES-hez képest két aminoterminális aminosava hiányzik. Túlnyomó mértékű előfordulása miatt ezzel a RANTES(3-68)-cal foglalkoztunk részletesebben, hogy vizsgáljuk monocitákra és eozinofilekre való kemotaktikus aktivitását. Előnyösen a RANTES(3-68) kemotaktikus és/vagy intracelluláris Ca2+-felszabadító aktivitását vizsgáltuk és összehasonlítottuk a megfelelő, ép kemokinek biológiai képességével.
A RANTES-ből a két aminosav aminoterminális deléciója jelentősen csökkenti a monocita kemotaktikus és a Ca2+-felszabadító aktivitást. Az ép, természetes RANTES-sel összehasonlítva (minimálisan hatékony dózisa 3-10 ng/ml) a természetes RANTES(3-68) teljesen inaktív volt még egészen 300 ng/ml koncentrációkban is Boyden-mikrokamrában (2. ábra). Továbbá a RANTES(1-68)-cal összehasonlítva a természetes RANTES(3-68) tízszer nagyobb koncentrációi voltak szükségesek hasonló Ca2+-reakció kiváltásához (3. ábra).
A CD26/DPP-IV eltávolítja a kemokinek aminoterminális dipeptidjét
Meg akartuk vizsgálni, hogy vajon a CD26/DPP-IV aminopeptidáz felelős-e a RANTES aminoterminális csonkításáért, ezért az ép kemokint egy éjszakán keresztül inkubáltuk CD26/DPP-IV-gyel, PVDF-membránokra blottoltuk, Coomassie-kékkel festettük és automatikus Edman-bontásnak vetettük alá. A RANTES CD26/DPP-IV-gyel történő kezelése az aminoterminá6
HU 226 414 Β1 lis dipeptidek eltávolítását eredményezte. A kemokinnek pufferrel történő inkubálása CD2 6/DPP-IV nélkül nem okozott változást.
Mivel más kemokinek is tartalmazzák a CD26/DPP-IV hasítási konszenzusszekvenciáját, és mivel az MCP-k aminoterminális végéről kimutatták, hogy a biológiai aktivitás szempontjából lényegesek [Gong, J. és munkatársai, J. Bioi. Chem. 271, 10 521-10 527 (1996) és Gong, J. és munkatársai, J. Exp. Med. 181, 631-640 (1995)], az MCP-1-et, az MCP-2-t és az MCP-3-at is inkubáltuk CD26/DPP-IV-gyel.
A kezelés után az MCP-ket PVDF-membránokon blottoltuk és Coomassie-kékkel festettük, hogy meggyőződjünk arról, hogy az Edman-bontáshoz elegendő mennyiségű fehérjét sikerült kinyerni.
Aminoterminális szekvenciát azonban nem lehetett kimutatni, ami jelzi, hogy a CD26/DPP-IV nem változtatja meg az MCP-k aminoterminális végét, amely az Edman-bontáshoz piroglutamátsawal van védve.
Az ép és a CD26/DPP-IV-gyel kezelt RANTES biológiai aktivitásának összehasonlítása A természetes RANTES(3-68)-hoz hasonlóan a
C-8 RP-HPLC-vel tisztított CD26/DPP-IV-gyel kezelt rekombináns RANTES is inaktív volt a Boyden-mikrokamrában végzett kemotaxis vizsgálatokban egészen 1 pg/ml koncentrációig, míg az ép, rekombináns RANTES-sel 30 ng/ml-től 100 ng/ml-ig (2. ábra) szignifikáns monocita kemotaktikus válasz volt kimutatható.
Amennyiben a csonkulás hatását vizsgáltuk a Ca2+-mozgósító vizsgálati eljárásban, a RANTES(3-68) alacsony, de szignifikáns növekedést váltott ki 100 ng/ml-nél. Az ép RANTES azonban már 10 ng/ml-nél aktív (3. ábra). Összefoglalva tehát elmondhatjuk, hogy bár csak két aminoterminális amino5 sav hiányzik, a RANTES monocita kemotaktikus és Ca2+-mozgósító képessége 10-100-szorosára csökkent.
A RANTES(3-68) az ép RANTES természetes kemotaktikus antagonistája
A RANTES(3-68) monocita kemotaxis kísérletekben mutatott inaktivitása miatt megvizsgáltuk, hogy ez a csonka RANTES antagonistaként hathat-e. A RANTES(3-68) 1 pg/ml koncentrációban csaknem teljesen (82%) deszenzitizálta 100 ng/ml ép RANTES kemotak15 tikus hatását (I. táblázat).
Amikor RANTES(3-68) háromszoros feleslegét adtuk a felső kamrába, a THP-1-sejtek kemotaxisa az ép RANTES irányába körülbelül 50-70%-ban gátlódott. A RANTES(3-68) 300 ng/ml koncentrációban még mindig körülbelül 30%-ban gátolta a kemotaktikus reakciót az azonos koncentrációjú, ép RANTES felé.
A THP-1-sejtekkel történő Ca2+-mozgósítási kísérletekben (4. ábra) 30 ng/ml ép RANTES deszenzitizálta 30 ng/ml ép RANTES hatását 39±5%-ban. A RAN25 TES(3-68) körülbelül tízszer nagyobb koncentrációira volt szükség ugyanilyen mértékű deszenzitizáció eléréséhez. 300 ng/ml koncentrációnál azonban a RANTES(3-68) maga szignifikáns Ca2+-reakciót váltott ki. Ez a Ca2+-reakció összehasonlítható volt 30 ng/ml ép
RANTES-sel kapott reakcióval.
/. táblázat
RANTES(3-68) deszenzitizálja RANTES(1-68) által indukált monocita kemotaxist1
| Kemokin (ng/ml) | Kemotaktikus reakció (Cl) | ||||||
| alsó kamra | felső kamra | gátlás % | |||||
| RANTES (1-68) | RANTES (3-68) | A | B | C | D | átlag ±SEM | átlag ±SEM |
| 300 | 1000 | 12,5 | 7,5 | 27,5 | 50,5 | 25±10 | 67±8 |
| 300 | 22,0 | 20,5 | 72,5 | 79,5 | 49±16 | 31±13 | |
| 0 | 41,0 | 46,0 | 71,5 | 97,0 | 64±13 | 0 | |
| 100 | 1000 | 4,0 | 3,0 | 13,5 | 11,0 | 8±3 | 82±4 |
| 300 | 7,5 | 7,0 | 29,0 | 33,0 | 19±7 | 53±11 | |
| 0 | 24,0 | 21,5 | 50,0 | 44,5 | 35±7 | 0 |
1 Az eredmények négy független kísérlet (A-tól D-ig) kemotaktikus indexét (Cl), az átlag ±SEM értékeket és a THP-1-sejteknek inaktív RANTES(3-68)-cal vagy pufferrel történő előinkubációját követően a RANTES(1-68) felé irányuló kemotaktikus reakció százalékos gátlását (gátlás %), a négy kísérlet százalékos gátlásának átlagát ±SEM értékeket mutatják be.
A RANTES(3-68) kemotaktikus aktivitása csökkent a monociták és eozinofilok felé 55
A II. táblázatban a természetes RANTES(3-68) kemotaktikus képességét hasonlítjuk össze az MCP-3, monocita kemotaktikus fehérjével és az ép RANTES(1-68)-cal. Látható, hogy az MCP-3 és a RANTES(1—68) a frissen izolált perifériás vér monocitákra 60 ng/ml (MCP-3), illetve 30 ng/ml [RANTES(1-68)] koncentrációkban még kemotaktikus hatású, míg a természetes RANTES(3-68) 100 ng/ml koncentrációban még inaktív.
Ennek a természetes variánsnak a csökkent kemotaktikus képességét rekombináns RANTES(3-68)-cal igazoltuk. Bár monocitákra gyengén kemotaktikus
HU 226 414 Β1 (1 gg/ml), a tisztított, rekombínáns RANTES(3-68) az ép, rekombínáns RANTES-nél tízszer alacsonyabb specifikus aktivitást mutatott.
Végül a RANTES(3-68) kemotaktikus képességét humán eozinofileken vizsgáltuk, amelyek 100 ng/ml 5 ép RANTES-re és 30 ng/ml MCP-3-ra még reagáltak (5. ábra). A monocitákhoz hasonlóan eozinofil sejtek vándorlását csak 1 pg/ml RANTES(3-68) váltotta ki.
II. táblázat
RANTES(3-68) monocita kemotaktikus aktivitásának összehasonlítása RANTES(1-68)-cal és MCP-3-mal
| Monocita kemotaktikus aktivitás3) | ||||
| Konc. (ng/ml) | MCP-3 | Természetes RANTES(3-68) | Rekombínáns RANTES(1-68) | Rekombínáns RANTES(3-68) |
| 1000 | —b) | - | 3,6±0,8 (6) | 3,3 (1) |
| 300 | 6,0±1,2 (6) | - | - | - |
| 100 | - | 1,1±0,1 (3) | 3,3±0,4 (6) | 1,0 (1) |
| 30 | 6,9±1,0 (6) | 1,7±0,2 (3) | - | - |
| 10 | - | 1,9±0,6 (3) | 1,9±0,4 (6) | <1.0 (1) |
| 3 | 4,1 ±0,4 (6) | - | - | - |
a) átlagos kemotaktikus index (Cl) ±SEM frissen izolált perifériás vér monocitákon; b> nincs meghatározva.
A RANTES(3-68) szignálfunkciót tölt be és deszenzitizál RANTES(1-68)-ra CCR5-ön keresztül, de CCR1-en és CCR3-on keresztül nem A RANTES(3-68) gyenge kemotaktikus aktivitásának megmagyarázása érdekében vizsgáltuk ennek a kemokinvariánsnak azt a képességét, hogy a RANTES által használt, ismert receptorokon kötődik és azokon keresztül jelt továbbít.
CCR1-, CCR3- vagy CCR5-kemokin-receptorokkal transzfektált HOS-sejteket alkalmaztunk a szignál vizsgálati eljárásban, amely az intracelluláris kalciumkoncentráció növekedését méri. A RANTES(3-68) egészen 300 ng/ml koncentrációig nem növeli az intracelluláris kalciumkoncentrációt a CCR1-gyel (III. táblázat) vagy a CCR3-mal (az adatokat nem mutatjuk) transzfektált HOS-sejtekben, míg 30 ng/ml, illetve 100 ng/ml ép RANTES elegendő volt az intracelluláris kalciumkoncentráció növekedésének kiváltásához a CCR1-, illetve CCR3-transzfektánsokban.
Mind az ép, mind a csonka RANTES azonban szignifikánsan növelte az intracelluláris kalciumkoncentrációt 30 ng/ml koncentrációban CCR5-transzfektánsokban. Továbbá a CCR5-tel transzfektált sejtek RANTES(3-68) vagy ép RANTES 3-10-szeres feleslegével történő előinkubációja után az ép RANTES-sel (100 ng/ml) történő stimulációra az intracelluláris kalciumkoncentráció azonos (körülbelül 75%-os) gátlását kaptuk (6. ábra).
Ezzel szemben 300 ng/ml RANTES(3-68) csak kevéssé deszenzitizálta a CCR1-gyel és CCR3-mal transzfektált sejtek kalciumreakcióját 100 ng/ml ép RANTES-re, míg első stimulusként az ép RANTES háromszoros feleslege csaknem teljesen gátolta az ezt követően adott RANTES(1-68)-cal kiváltott intracelluláris kalciumkoncentráció-növekedést ezekben a sejtekben.
Levonható tehát az a következtetés, hogy RANTES-ből a két aminoterminális aminosav eltávolítása jelentősen befolyásolja a szignáltranszdukciót azzal, hogy a CCR1- és CCR3-kemokin-receptorok funkcionálisan többé fel nem ismerhetők. A RANTES(3-68) rosszabb kemotaktikus képessége tehát azzal magyarázható, hogy a CCR1-en és CCR3-on keresztül nem tud működni. Ezzel szemben a RANTES(3-68) teljes mértékben megőrizte az ép RANTES-re jellemző, CCR5-ön keresztüli szignálátadásí képességét. A RANTES(3-68) gyulladásgátló hatású lehet azáltal, hogy az ép RANTES-sel versenyez, de működhet HIV-gátló szerként azáltal, hogy megőrizte CCR5-kötő képességét.
III. táblázat
A RANTES-formák kalciummozgósító képessége CCR1- és CCR5-transzfektánsokban
| Kemokin | Konc. (ng/ml) | [Ca2+]j növekedés (nmol)3 | |
| CCR1 | CCR5 | ||
| RAN- TES(1-68) | 300 | 133±5 (3) | 96±1 (2) |
| 100 | 100±28 (3) | 60±4 (2) | |
| 30 | 25±8 (3) | 24±2 (2) | |
| 10 | <15(2) | <15(1) | |
| RAN- TES(3-68) | 300 | 19±9 (3) | 119±5 (2) |
| 100 | <15±0 (3) | 76±4 (2) | |
| 30 | <15(2) | 56±13 (2) | |
| 10 | <15(1) |
a> a [Ca2+]j-növekedést (nmol ±SEM) két vagy több független 60 kísérlet átlagában mutatjuk be.
HU 226 414 Β1
CC-kemokin által kiváltott kemotaxis gátlása
RANTES(3-68)-cal humáneredetű monocitasejteken
Annak vizsgálatára, hogy vajon a CC-kemokin szignálfunkciójának RANTES(3-68)-cal történő gátlása monocitasejteken is előfordul-e, THP-1-sejteken is elvégeztük a gátlási kísérleteket. Kimutattuk, hogy RANTES(3-68) intracelluláris kalciumkoncentrációt növelő képessége monocitasejtekben 10-szer gyengébb az ép RANTES-ével összehasonlítva (az adatokat nem mutatjuk). Továbbá az ép RANTES (30 ng/ml) kemotaktikus hatását monocitasejteken 71%-ban gátolta a vizsgálati sejtek 300 ng/ml RANTES(3-68)-cal történő inkubálása, mint ezt a IV. táblázatban bemutatjuk.
Ezenkívül RANTES(3-68) csökkentette a más CC-kemokinekre történő kemotaktikus reakciót, például 3 típusú monocita kemotaktikus fehérjére (MCP-3) (67%), 1a típusú makrofág gyulladásos fehérjére (MIP—1a)(61 %) és ΜΙΡ-Ιβ-ra (80%).
Ez azt mutatja, hogy a RANTES(3-68) más kemokinek által kiváltott monocita sejtvándorlás széles spektrumú gátlószereként működik.
IV. táblázat
CC-kemokinek felé irányuló monocitasejt kemotaxisának gátlása RANTES(3-68)-cal
| THP-1-sejt kemotaxisának gátlása | ||||
| Kemo- kin8) | Konc. (ng/ml) | Puffért | RANTES (3-68)bc> | Gátlás %d> |
| RANTES | 30 | 19,0±6,6 | 3,7±0,6 | 71±16 |
| MCP-3 | 30 | 48,5±9,3 | 24,9±2,0 | 45±10 |
| MCP-3 | 3 | 7,6±2,5 | 3,1±0,8 | 67±13 |
| MIP-1a | 30 | 6,2±2,4 | 3,0±1,1 | 61 ±22 |
| ΜΙΡ-1β | 300 | 4,3±1,0 | 1,9±0,6 | 80±12 |
| Kontroll | 1,5±0,5 | 1,0±0,5 |
a) A RANTES-t, az MCP-3-at, a MIP-1a-t, a MIP-1 β-t és a puffért kemoattraktánsokként a mikrokamra alsó üregeibe helyeztük.
b> A mikrokamra felső üregeit 300 ng/ml RANTES(3-68)-cal vagy pufferrel előinkubált (10 percig, 37 °C-on) THP-1-sejtekkel töltöttük meg.
c) Négy független kísérlet átlagos Cl ±SEM értékei.
d) Az ép kemokinnek 300 ng/ml RANTES(3-68) jelenlétében kiváltott vándorlásának gátlása.
A RANTES CD26-specifikus csonkítása szükséges a vírusellenes aktivitásához A RANTES különböző formáinak hatását először két különböző M-tropikus HIV-1-törzs (BaL és SF162) ellen vizsgáltuk egészséges véradóktól származó humáneredetű PBMC-ben. Az ép RANTES(1-68) IC50-értéke BaL-törzzsel szemben 3,4 nmol volt és a RANTES(3-68) IC50-értéke 0,39 nmol volt. A RANTES(1-68) IC9t)-értéke 71 nmol volt, amely körülbelül tízszerese a RANTES(3-68) IC90-értékének. PBMC-sejteken vizsgálva az SF162-törzzsel szemben
RANTES(1-68) (ICgQ: 23 nmol, IC90: 95 nmol) tízszer kevésbé volt aktív RANTES(3-68)-nál (IC50: 2 nmol, IC90: 8,2 nmol) (V. táblázat). Mindkét kemokin koncentrációfüggő hatását HIV-1 SF162 szaporodására PBMC-ben 133 nmol-tól 0,2 nmol-ig a 8. ábrán mutatjuk be. RANTES(3-68) 5,2 nmol koncentrációban hatékonyan csökkentette a vírus szaporodását, míg RANTES(1-68) inaktív volt ebben a koncentrációban. A vírusellenes aktivitásban nem volt különbség tapasztalható a PeproTechtől vagy az R&D Systemstől kapott ép RANTES között.
A RANTES két formája közötti szembeszökő különbség a vírusellenes aktivitásban még nyilvánvalóbb, ha humáneredetű CCR5-tel transzfektált sejteket vizsgálunk. U78.CD4.CCR5-sejtekben a RANTES(1-68) és a RANTES(3-68) IC50-értéke BaL-törzzsel szemben 21 nmol [RANTES (1-68)] és 0,65 nmol [RANTES (3-68)]. RANTES (1-68) IC90-értéke több, mint 133 nmol, míg RANTES (3-68) IC90-értéke 63 nmol. Az V. táblázatban azt is bemutatjuk, hogy a RANTES(1-68) gyakorlatilag inaktív HOS.CD4.CCR5-sejtekben (IC5o>133 nmol), azonban RANTES(3-68) hatékony gátlószere a HIV-1 BaL szaporodásának ezekben a sejtekben (IC50: 5,5 nmol). RANTES ezen formáinak ICgo-értékét azonban nem értük el ezekben a sejtekben.
A RANTES vírusellenes aktivitása függ a membránhoz kötött vagy oldható CD26 (sCD26) jelenlététől
Megvizsgáltuk a CD26 expresszióját két különböző CCR5-tel transzfektált sejtvonalon és frissen izolált PBMC-n. „Flow” citometriás vizsgálattal megállapítottuk, hogy a HOS-transzfektánsok negatívak voltak CD26 expressziójának tekintetében, az U87-transzfektánsok viszont gyengén festődtek, de anti-CD26 monoklonális ellenanyaggal szignifikánsan pozitívak voltak (9. ábra). Továbbá a frissen izolált PBMC egy alpopulációjának CD26-expresszióját erősen pozitívnak találtuk (9. ábra).
A RANTES(1-68) és RANTES(3-B8) koncentrációfüggő hatását BaL-törzs víruseredetű p24-antigén termelésére HOS.CD4.CCR5-transzfektált sejtekben sCD26 jelenlétében a 10. ábrán mutatjuk be. A HlV-fertőzés időpontjában sCD26 hozzáadása RANTES(1-68)-cal együtt szignifikánsan növelte az ép RANTES vírusellenes aktivitását HOS.CD4.CCR5-sejtekben. Amennyiben sCD26-ot 50 U/ml koncentrációban a RANTES-sel együtt adtuk, a RANTES 13 nmol IC50-értékét figyeltük meg. Egyedül csak az sCD26 hozzáadásának a vírus replikációjára nem volt hatása. Az sCD26 RANTES(3-68)-hoz történő hozzáadása szintén nem változtatta meg a RANTES(3-68) vírusellenes aktivitását (az adatokat nem mutatjuk). A CD26 jelenléte ezek szerint alapvető fontosságú, hogy az ép RANTES aktívvá váljon a vírus ellen.
A természetes MIP-1a aminoterminális csonkítása nem befolyásolja HIV-1-ellenes kemotaktikus és Ca2+-mozgósító aktivitását.
Mivel a természetesen előforduló MIP-1a többségének aminoterminális vége csonka (négy aminosav
HU 226 414 Β1 hiányzik), megvizsgáltuk, hogy ennek a csonka MIP-1a(5-70)-nek megváltozott-e a HÍV—1-gátló képessége. A RANTES-sel kapott eredményekkel szemben szignifikáns különbség nem volt kimutatható az ép MIP-1a és a MIP-1a(5-70) IC50-értéke között PBMC- 5 vagy CCR5-transzfektált sejtekben (V. táblázat,
8. ábra). Összehasonlítottuk az ép MIP-1a-t és a csonka MIP-1oc(5-70)-et kemotaxis és intracelluláris Ca2+-mozgósító vizsgálati eljárásokban THP-1-monocitasejteken. A VI. táblázatban látható, hogy a ló
MIP-1a(5-70)-nek az intracelluláris kalciumkoncentrációban növekedést okozó minimálisan hatékony dózisa csak alig volt alacsonyabb az ép MIP-1a-nál. Ezenkívül a kemotaxis vizsgálatban 0,13 nmol-nál kapott maximális vándorlás magasabb volt ugyan az ép MIP-1a-nál, de mindkét izoforma minimálisan hatékony koncentrációja nagyon hasonló volt. összefoglalva tehát megállapíthatjuk, hogy a MIP-1a aminoterminális folyamatai a RANTES-sel szemben csak minimáV. táblázat
A RANTES és az MIP-1a HIV-1-ellenes aktivitása PHA-stimulált PMBC-ben U87.CD4.CCR5-sejtekben
| RANTES(1-68) | RANTES(3-68) | MIP-1a (1-70) | MIP—1 ot(5—70) | |||||
| '^50 | !θ90 | IC50 | ,C90 | !θ50 | Ιθ90 | IC50 | IC90 | |
| PBMC BaL | ||||||||
| 3,4 | 71 | 039 | 6,9 | 1,9 | 62 | 1,6 | 13 | |
| SF162 | ||||||||
| 23 | 95 | 2,0 | 8,2 | 3,1 | 30 | 3,6 | 32 | |
| U87.CD4.CCR5 BaL | ||||||||
| 21 | >130 | 0,65 | 63 | ND | ND | ND | ND | |
| HOS.CD4.CCR5 BaL | ||||||||
| >130 | >130 | 5,5 | >130 | 32 | >130 | 21 | >130 |
lisan gyengítik a gyulladásos és HIV-1 -ellenes aktivitását.
A vírushozamot a sejtmentes felülúszókban mértük 8-12 nappal a fertőzés után víruseredetű p24-antigén
ELISA-val. Az IC50- és IC90-értékek átlagát (nmol) mutatjuk be. Az adatok két vagy több független kísérletből származnak. A „>130” jelölésű értékek azt jelentik, hogy az 50%-os vagy 90%-os gátlást 130 nmol-nál
VI. táblázat
Az ép és a csonka MIP-1a biológiai képessége között nincs különbség
| Kemotaxis* | [Ca2+]j-növekedés+ | |||
| Kemokin | nmol | Cl | nmol | nmol [Ca2+]j |
| MIP-1a(1-70) | 1,3 | 8,5±3,3 | 3,9 | 240/195 |
| 0,13 | 22,2±4,4 | 0,39 | 120/130 | |
| 0,013 | 5,7±1,6 | 0,34 | 30/14 | |
| 0,0013 | 4,0±3,1 | |||
| MIP-1a(5-70) | 1,3 | 14,2±0,4 | 4,0 | 196/178 |
| 0,13 | 11,4±2,9 | 0,4 | 71/33 | |
| 0,013 | 3,8±1,4 | 0,04 | 10/<10 | |
| 0,0013 | 2,1 ±0,6 |
* A monocita THP-1-sejtek vándorlása a mikrokamrában 5,0 pm pórusokon keresztül. Az eredmények három független kísérlet átlaga.
+ A [Ca2+]rnövekedés kimutatása THP-1-sejtekben. Az eredmények két független kísérletet szemléltetnek.
nem értük el. ND: nem végeztük el.
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HU 226 414 Β1
HÁNY SZÁLÚ:
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: fehérje
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: fehérje
ELHELYEZKEDÉS: 1...68
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
| Met | Lys Val | Ser Alá Alá Arg Leu Alá | Val | He | Leu | He | Alá -10 | Thr | Alá | ||||||
| -20 | -15 | ||||||||||||||
| Leu | Cys | Alá | Pro | Alá | Ser | Alá | Ser | Pro | Tyr | Ser | Ser | Asp | Thr | Thr | Pro |
| -5 | 1 | 5 | |||||||||||||
| Cys | Cys | Phe | Alá | Tyr | He | Alá | Arg | Pro | Leu | Pro | Arg | Alá | His | He | Lys |
| 10 | 15 | 20 | 25 | ||||||||||||
| Glu | Tyr | Phe | Tyr | Thr | Ser | Gly | Lys | Cys | Ser | Asn | Pro | Alá | Val | Val | Phe |
| 30 | 35 | 40 | |||||||||||||
| Tyr | Ser | Ser | Asp | Thr | Thr | Pro | Cys | Cys | Phe | Alá | Tyr | He | Alá | Arg | Pro |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Leu | Pro | Arg | Alá | His | He | Lys | Glu | Tyr | Phe | Tyr | Thr | Ser | Gly | Lys | Cys |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Ser | Asn | Pro | Alá | Val | Val | Phe | Val | Thr | Arg | Lys | Asn | Arg | Gin | Val | Cys |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Alá | Asn | Pro | Glu | Lys | Lys | Trp | Val | Arg | Glu | Tyr | He | Asn | Ser | Leu | Glu |
55 60
Met Ser 65
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 66 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ:
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: fehérje
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
| Val | Thr | Arg | Lys | Asn | Arg | Gin | Val | Cys | Alá | Asn | Pro Glu Lys Lys Trp |
| 45 | 50 | 55 | |||||||||
| Val | Arg | Glu | Tyr | He | Asn | Ser | Leu | Glu | Met | Ser | |
| 60 | 65 |
nak megfelelő aminoterminális aminosavak hiányoz-
Claims (10)
- 2. Az 1. igénypont szerinti, aminoterminálisa felől csonkolt RANTES, amelynek aminosavszekvenciája a 2. azonosító számú szekvencia.SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Aminoterminálisa felől csonkolt RANTES, amely kemokinantagonista aktivitású és amelyből a természetesen előforduló RANTES 1-2. aminosavai- 60HU 226 414 Β1
- 3. Az 1-2. igénypontok bármelyike szerinti, aminoterminálisa felől csonkolt RANTES, amely glikozilált formájú.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti, aminoterminálisa felől csonkolt RANTES-t kódoló DNS-szekvenciát vagy vele lényegében azonos nukleotidszekvenciát tartalmazó DNS-molekula.
- 5. A 4. igénypont szerinti DNS-molekulát tartalmazó expressziós vektor.
- 6. Az 5. igénypont szerinti expressziós vektort tartalmazó gazdasejt.
- 7. Az 1-3. igénypontok szerinti fehérjék bármelyikének előállítására szolgáló rekombináns eljárás, azzal jellemezve, hogy a 6. igénypont szerinti sejteket megfelelő tenyésztő tápközegben tenyésztjük.
- 8. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti fehérje gyógyszerként történő alkalmazásra.
- 9. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti fehérje alkalmazása kemokinhatások antagonista aktivitását5 igénylő betegségek terápiájára és/vagy diagnózisára szolgáló gyógyszer előállításában.
- 10. A 9. igénypont szerinti alkalmazás gyulladásos betegségek, HIV-fertőzés, ér- vagy vérképződéssel kapcsolatos betegségek és tumorok kezelésére szol10 gáló gyógyszer előállításában.
- 11. Gyógyászati készítmény, amely az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét és egy vagy több, gyógyászatilag elfogadható hordozót és/vagy segédanyagot tartalmaz.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97116863A EP0906954A1 (en) | 1997-09-29 | 1997-09-29 | Amino-terminal truncated c-c chemokines as chemokine antagonist |
| EP97122471A EP0905240A1 (en) | 1997-09-29 | 1997-12-19 | Amino-terminally truncated c-c chemokines as chemokine antagonists |
| EP98104216A EP0905241A1 (en) | 1997-09-29 | 1998-03-10 | Amino-terminally truncated c-c chemokines as chemokine antagonists |
| PCT/EP1998/006143 WO1999016877A1 (en) | 1997-09-29 | 1998-09-28 | Amino-terminally truncated rantes as chemokine antagonists |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0003505A2 HUP0003505A2 (hu) | 2001-02-28 |
| HUP0003505A3 HUP0003505A3 (en) | 2005-11-28 |
| HU226414B1 true HU226414B1 (en) | 2008-11-28 |
Family
ID=8227408
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0003505A HU226414B1 (en) | 1997-09-29 | 1998-09-28 | Amino-terminally truncated rantes as chemokine antagonists |
| HU0003563A HU226468B1 (en) | 1997-09-29 | 1998-09-28 | Amino-terminally truncated mcp-2-as chemokine antagonists |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0003563A HU226468B1 (en) | 1997-09-29 | 1998-09-28 | Amino-terminally truncated mcp-2-as chemokine antagonists |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US6905676B2 (hu) |
| EP (6) | EP0906954A1 (hu) |
| JP (2) | JP4230659B2 (hu) |
| KR (2) | KR100542934B1 (hu) |
| CN (3) | CN1233415C (hu) |
| AR (2) | AR013528A1 (hu) |
| AT (3) | ATE264390T1 (hu) |
| AU (2) | AU750341B2 (hu) |
| BG (2) | BG64679B1 (hu) |
| BR (2) | BR9812394A (hu) |
| CA (2) | CA2304827A1 (hu) |
| CY (1) | CY1110927T1 (hu) |
| CZ (2) | CZ299478B6 (hu) |
| DE (3) | DE69823218T2 (hu) |
| DK (3) | DK1021541T3 (hu) |
| EA (2) | EA003940B1 (hu) |
| EE (2) | EE200000152A (hu) |
| ES (3) | ES2287601T3 (hu) |
| HK (3) | HK1032426A1 (hu) |
| HU (2) | HU226414B1 (hu) |
| IL (2) | IL135351A (hu) |
| NO (2) | NO20001584D0 (hu) |
| NZ (3) | NZ503235A (hu) |
| PL (2) | PL196427B1 (hu) |
| PT (3) | PT1021541E (hu) |
| SK (2) | SK286495B6 (hu) |
| UA (2) | UA73080C2 (hu) |
| WO (2) | WO1999016877A1 (hu) |
| ZA (2) | ZA988676B (hu) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6989435B2 (en) | 1997-09-11 | 2006-01-24 | Cambridge University Technical Services Ltd. | Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response |
| US7067117B1 (en) | 1997-09-11 | 2006-06-27 | Cambridge University Technical Services, Ltd. | Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response |
| AU1616499A (en) | 1997-12-01 | 1999-06-16 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Chemokine variants and methods of use |
| US7238711B1 (en) | 1999-03-17 | 2007-07-03 | Cambridge University Technical Services Ltd. | Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response |
| AU1259501A (en) * | 1999-10-25 | 2001-05-08 | Euroscreen S.A. | Processed human chemokines phc-1 and phc-2 |
| EP1167527A1 (en) * | 2000-06-22 | 2002-01-02 | Euroscreen S.A. | Processed human chemokines PHC-1 and PHC-2 |
| AU2505601A (en) * | 1999-11-15 | 2001-05-30 | Wolf-Georg Forssmann | Novel use of hcc-2 |
| CA2316405A1 (en) * | 2000-05-26 | 2001-11-26 | Ian Clark-Lewis | Modulation of inflammation by protease products |
| EP1176200A3 (de) | 2000-06-20 | 2005-01-12 | Switch Biotech Aktiengesellschaft | Verwendung von Polypeptiden oder diese kodierende Nukleinsäuren zur Diagnose oder Behandlung von Hauterkrankung oder Wundheilung sowie ihre Verwendung zur Indentifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen |
| UA77950C2 (en) * | 2000-10-04 | 2007-02-15 | Applied Research Systems | Use of mutants of cc chemokines for treatment of multiple sclerosis |
| GB2373785A (en) * | 2001-03-28 | 2002-10-02 | Rega Inst For Medical Res | Truncating chemokines using dipeptidyl peptidase IV |
| US7553483B2 (en) | 2001-12-17 | 2009-06-30 | Merck Serono Sa | Chemokine mutants acting as chemokine antagonists |
| EP1631680A2 (en) * | 2003-05-21 | 2006-03-08 | Bayer HealthCare AG | Diagnostics and therapeutics for diseases associated with dipeptidylpeptidase iv (dpp4) |
| DE102005049637A1 (de) * | 2005-10-14 | 2007-04-26 | Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen | Antagonisten gegen die Interaktion von PF4 und RANTES |
| MX2010001307A (es) | 2007-08-02 | 2010-07-30 | Novimmune Sa | Anticuerpos anti-proteína regulada con la activación, expresada y secretada por los linfocitos t normales y metodos de uso de los mismos. |
| US20130053257A1 (en) * | 2010-02-08 | 2013-02-28 | Paul E. Oran | RANTES Multiplexed Assay, RANTES Variants Related to Disease, and RANTES Variants Related to Enzymatice Activity |
| JP5975886B2 (ja) | 2010-03-11 | 2016-08-23 | ヘルス リサーチ インコーポレイテッドＨｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ． | Ｆｃ融合タンパク質を含む、免疫応答を増強するための方法および組成物 |
| TW201718851A (zh) * | 2015-09-18 | 2017-06-01 | 通用醫院公司 | 具有抗化學排斥(anti-fugetactic)性質之經修飾自然殺手細胞及其用途 |
| CN112469430A (zh) | 2018-05-28 | 2021-03-09 | 日内瓦大学 | 抑制大脑炎症的方法 |
| US11629196B2 (en) | 2020-04-27 | 2023-04-18 | Incelldx, Inc. | Method of treating SARS-CoV-2-associated hypercytokinemia by administering a human monoclonal antibody (PRO-140) that inhibits CCR5/CCL5 binding interactions |
| US11402391B2 (en) | 2020-12-21 | 2022-08-02 | Incelldx, Inc. | Methods of treating a long-hauler subject for chronic COVID-19 by administering a CCR5 or CCL5 antagonist |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0311107A3 (en) | 1987-10-08 | 1990-04-18 | Stichting REGA V.Z.W. | Anti-hiv active 3'-fluoro-purine-2',3'-dideoxyribosides |
| US5739103A (en) * | 1993-11-12 | 1998-04-14 | Dana-Farber Cancer Institute | Chemokine N-terminal deletion mutations |
| PL182786B1 (pl) * | 1994-12-08 | 2002-02-28 | Glaxo Group Ltd | Polipeptyd, sekwencja kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza, środek farmaceutyczny, oraz sposób otrzymywania polipeptydu |
| WO1997025427A1 (en) * | 1996-01-12 | 1997-07-17 | Genetics Institute, Inc. | Beta-chemokine, h1305 (mcp-2) |
| JP2000508527A (ja) * | 1996-03-27 | 2000-07-11 | アイコス コーポレイション | 単球走化性タンパク質―５物質及び方法 |
| FR2748938B1 (fr) * | 1996-05-22 | 1998-07-31 | Pasteur Institut | Utilisation de molecules antagonistes de chemokines pour leur activite antivirale notamment contre un retrovirus de type vih |
| US6168784B1 (en) * | 1997-09-03 | 2001-01-02 | Gryphon Sciences | N-terminal modifications of RANTES and methods of use |
-
1997
- 1997-09-29 EP EP97116863A patent/EP0906954A1/en not_active Withdrawn
- 1997-12-19 EP EP97122471A patent/EP0905240A1/en not_active Withdrawn
-
1998
- 1998-03-10 EP EP98104216A patent/EP0905241A1/en not_active Withdrawn
- 1998-09-22 ZA ZA9808676A patent/ZA988676B/xx unknown
- 1998-09-22 ZA ZA9808675A patent/ZA988675B/xx unknown
- 1998-09-28 HU HU0003505A patent/HU226414B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 NZ NZ503235A patent/NZ503235A/xx unknown
- 1998-09-28 BR BR9812394-7A patent/BR9812394A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-09-28 EP EP04007579A patent/EP1439231B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 EP EP98951476A patent/EP1019507B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 DE DE69823218T patent/DE69823218T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 AU AU97474/98A patent/AU750341B2/en not_active Ceased
- 1998-09-28 WO PCT/EP1998/006143 patent/WO1999016877A1/en active IP Right Grant
- 1998-09-28 EA EA200000379A patent/EA003940B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 NZ NZ516027A patent/NZ516027A/en unknown
- 1998-09-28 UA UA2000042496A patent/UA73080C2/uk unknown
- 1998-09-28 AT AT98947553T patent/ATE264390T1/de active
- 1998-09-28 ES ES04007579T patent/ES2287601T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 AU AU94420/98A patent/AU750606B2/en not_active Ceased
- 1998-09-28 KR KR1020007003020A patent/KR100542934B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 ES ES98947553T patent/ES2215324T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 BR BR9812565-6A patent/BR9812565A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-09-28 DE DE69838188T patent/DE69838188T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 PT PT98947553T patent/PT1021541E/pt unknown
- 1998-09-28 CA CA002304827A patent/CA2304827A1/en not_active Abandoned
- 1998-09-28 SK SK451-2000A patent/SK286495B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 AR ARP980104819A patent/AR013528A1/es active IP Right Grant
- 1998-09-28 ES ES98951476T patent/ES2218860T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 PT PT04007579T patent/PT1439231E/pt unknown
- 1998-09-28 JP JP2000513946A patent/JP4230659B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-28 WO PCT/EP1998/006142 patent/WO1999016876A1/en active IP Right Grant
- 1998-09-28 DK DK98947553T patent/DK1021541T3/da active
- 1998-09-28 DK DK04007579T patent/DK1439231T3/da active
- 1998-09-28 CZ CZ20001146A patent/CZ299478B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 DK DK98951476T patent/DK1019507T3/da active
- 1998-09-28 PL PL339545A patent/PL196427B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 CN CNB031492991A patent/CN1233415C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-28 PT PT98951476T patent/PT1019507E/pt unknown
- 1998-09-28 HU HU0003563A patent/HU226468B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 AT AT98951476T patent/ATE263242T1/de active
- 1998-09-28 UA UA2000042499A patent/UA73081C2/uk unknown
- 1998-09-28 KR KR1020007003019A patent/KR100560275B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 NZ NZ503234A patent/NZ503234A/en unknown
- 1998-09-28 SK SK450-2000A patent/SK286439B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 CN CNB988095726A patent/CN1148447C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-28 AR ARP980104820A patent/AR013529A1/es active IP Right Grant
- 1998-09-28 PL PL339559A patent/PL197569B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 EE EEP200000152A patent/EE200000152A/xx unknown
- 1998-09-28 JP JP2000513947A patent/JP4233214B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-28 EE EEP200000151A patent/EE200000151A/xx unknown
- 1998-09-28 CN CNB988095696A patent/CN1145693C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-28 CA CA002305017A patent/CA2305017A1/en not_active Abandoned
- 1998-09-28 EP EP98947553A patent/EP1021541B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 CZ CZ20001147A patent/CZ299479B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 EA EA200000378A patent/EA003942B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 DE DE69822856T patent/DE69822856T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 AT AT04007579T patent/ATE368742T1/de active
-
2000
- 2000-03-22 BG BG104266A patent/BG64679B1/bg unknown
- 2000-03-22 BG BG104267A patent/BG64757B1/bg unknown
- 2000-03-27 NO NO20001584A patent/NO20001584D0/no not_active Application Discontinuation
- 2000-03-28 NO NO20001609A patent/NO20001609D0/no unknown
- 2000-03-28 US US09/537,859 patent/US6905676B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-28 US US09/537,858 patent/US6977071B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-29 IL IL135351A patent/IL135351A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-03-29 IL IL135352A patent/IL135352A/en not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-04-25 HK HK01102962A patent/HK1032426A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2001-04-25 HK HK01102961A patent/HK1032425A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2001-04-25 HK HK04105182A patent/HK1062637A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-03-07 US US11/072,454 patent/US7326411B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-05-06 US US11/123,089 patent/US7338653B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-05-18 US US11/131,221 patent/US20050220790A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-10-08 CY CY20071101290T patent/CY1110927T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7326411B2 (en) | Use of amino-terminally truncated RANTES to inhibit HIV viral replication | |
| MXPA00002881A (en) | Amino-terminally truncated rantes as chemokine antagonists |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |