PL196427B1 - Białko RANTES skrócone na końcu aminowym, rekombinacyjny sposób jego wytwarzania oraz jego zastosowanie, cząsteczki DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza i kompozycja farmaceutyczna, oraz zastosowanie CD26/DPP IV - Google Patents
Białko RANTES skrócone na końcu aminowym, rekombinacyjny sposób jego wytwarzania oraz jego zastosowanie, cząsteczki DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza i kompozycja farmaceutyczna, oraz zastosowanie CD26/DPP IVInfo
- Publication number
- PL196427B1 PL196427B1 PL339545A PL33954598A PL196427B1 PL 196427 B1 PL196427 B1 PL 196427B1 PL 339545 A PL339545 A PL 339545A PL 33954598 A PL33954598 A PL 33954598A PL 196427 B1 PL196427 B1 PL 196427B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- rantes
- cells
- amino
- protein
- chemokine
- Prior art date
Links
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 title claims abstract 6
- 102000001327 Chemokine CCL5 Human genes 0.000 title claims 5
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 title abstract description 48
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 title abstract description 48
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 title description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- 241000410536 Esme Species 0.000 claims 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 21
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 14
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 10
- 102000001902 CC Chemokines Human genes 0.000 abstract description 9
- 108010040471 CC Chemokines Proteins 0.000 abstract description 9
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 8
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 abstract description 6
- AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N mcp 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N 0.000 abstract description 4
- 102100034871 C-C motif chemokine 8 Human genes 0.000 abstract description 3
- 101710155833 C-C motif chemokine 8 Proteins 0.000 abstract description 3
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 abstract 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 74
- 102100025012 Dipeptidyl peptidase 4 Human genes 0.000 description 55
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 50
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 43
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 42
- 101000908391 Homo sapiens Dipeptidyl peptidase 4 Proteins 0.000 description 34
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 34
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 23
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 23
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 21
- 108010067722 Dipeptidyl Peptidase 4 Proteins 0.000 description 19
- 108010055124 Chemokine CCL7 Proteins 0.000 description 15
- 102100032366 C-C motif chemokine 7 Human genes 0.000 description 14
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 14
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 14
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 13
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 11
- 102100031172 C-C chemokine receptor type 1 Human genes 0.000 description 10
- 101710149814 C-C chemokine receptor type 1 Proteins 0.000 description 10
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 9
- 102100024167 C-C chemokine receptor type 3 Human genes 0.000 description 8
- 101710149862 C-C chemokine receptor type 3 Proteins 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 101710205625 Capsid protein p24 Proteins 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 7
- 101710149279 Small delta antigen Proteins 0.000 description 7
- 102100022563 Tubulin polymerization-promoting protein Human genes 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 7
- 239000002559 chemokine receptor antagonist Substances 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 6
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 6
- 101710151805 Mitochondrial intermediate peptidase 1 Proteins 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 6
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 102100036153 C-X-C motif chemokine 6 Human genes 0.000 description 5
- 108010014423 Chemokine CXCL6 Proteins 0.000 description 5
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 5
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 5
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 3
- -1 9-fluorenylmethoxycarbonyl Chemical group 0.000 description 3
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 3
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 3
- 108700012434 CCL3 Proteins 0.000 description 3
- 102000000013 Chemokine CCL3 Human genes 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 3
- 101000684208 Homo sapiens Prolyl endopeptidase FAP Proteins 0.000 description 3
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 102100039373 Membrane cofactor protein Human genes 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N fura-2 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=3OC(=CC=3C=2)C=2OC(=CN=2)C(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 3
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000027425 release of sequestered calcium ion into cytosol Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PAMIQIKDUOTOBW-UHFFFAOYSA-N 1-methylpiperidine Chemical compound CN1CCCCC1 PAMIQIKDUOTOBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108050006947 CXC Chemokine Proteins 0.000 description 2
- 102000019388 CXC chemokine Human genes 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 102000014962 Monocyte Chemoattractant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010064136 Monocyte Chemoattractant Proteins Proteins 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 206010006007 bone sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 230000001275 ca(2+)-mobilization Effects 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000028550 monocyte chemotaxis Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 101710091342 Chemotactic peptide Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N Digitonin Natural products CC1CCC2(OC1)OC3C(O)C4C5CCC6CC(OC7OC(CO)C(OC8OC(CO)C(O)C(OC9OCC(O)C(O)C9OC%10OC(CO)C(O)C(OC%11OC(CO)C(O)C(O)C%11O)C%10O)C8O)C(O)C7O)C(O)CC6(C)C5CCC4(C)C3C2C QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 1
- VSRCAOIHMGCIJK-SRVKXCTJSA-N Glu-Leu-Arg Chemical group OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O VSRCAOIHMGCIJK-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000797762 Homo sapiens C-C motif chemokine 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000947177 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 6 Proteins 0.000 description 1
- 101001058904 Homo sapiens Gamma-tubulin complex component 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 102000009571 Macrophage Inflammatory Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010009474 Macrophage Inflammatory Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010023347 Met- RANTES Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102100036154 Platelet basic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710195957 Platelet basic protein Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N Pyroglutamic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N acide pyroglutamique Natural products OC(=O)C1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000034196 cell chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 1
- PRQROPMIIGLWRP-BZSNNMDCSA-N chemotactic peptide Chemical compound CSCC[C@H](NC=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PRQROPMIIGLWRP-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N digitonin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)C[C@@H](O)[C@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO7)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@@H](CO)O5)O)C[C@@H]4CC[C@H]3[C@@H]2[C@@H]1O)C)[C@@H]1C)[C@]11CC[C@@H](C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N digitonine Natural products CC1C(C2(CCC3C4(C)CC(O)C(OC5C(C(O)C(OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)CO7)O)C(O)C(CO)O6)OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)C(CO)O7)O)C(O)C(CO)O6)O)C(CO)O5)O)CC4CCC3C2C2O)C)C2OC11CCC(C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001210 effect on neutrophils Effects 0.000 description 1
- 230000000531 effect on virus Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000000222 eosinocyte Anatomy 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 102000045341 human CCL5 Human genes 0.000 description 1
- 102000045598 human DPP4 Human genes 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N norethisterone Chemical compound O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 101150003509 tag gene Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/4813—Exopeptidases (3.4.11. to 3.4.19)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/521—Chemokines
- C07K14/523—Beta-chemokines, e.g. RANTES, I-309/TCA-3, MIP-1alpha, MIP-1beta/ACT-2/LD78/SCIF, MCP-1/MCAF, MCP-2, MCP-3, LDCF-1, LDCF-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
1. Bia lko RANTES skrócone na ko ncu aminowym o sekwencji aminokwasowej Id. Sekw. nr 2 i aktywno sci antagonistycznej wzgl edem chemokin. 2. Bia lko RANTES skrócone na ko ncu aminowym, wed lug zastrz. 1, znamienne tym, ze jest w po- staci glikozylowanej. 8. Zastosowanie bia lka okre slonego w zastrz. 1 albo 2 do wytwarzania leku do leczenia i/lub dia- gnostyki choroby, w której konieczna jest aktywno sc antagonistyczna wobec dzia lania chemokin, ko- rzystnie chorób zapalnych, zaka zenia HIV, chorób zwi azanych z angiogenez a i hematopoez a oraz nowo- tworów. 9. Kompozycja farmaceutyczna zawieraj aca substancj e czynn a wraz z jednym albo wieloma do- puszczalnymi farmaceutycznie no snikami i/lub zaróbkami, znamienna tym, ze jako substancj e czynn a obejmuje bia lko okre slone w zastrz. 1 albo 2. 10. Zastosowanie CD26/DPP IV do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia i/lub dia- gnozowania chorób, w których aktywno sc antagonistyczna wobec dzia lania chemokin jest wymagana. PL PL PL PL PL
Description
(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 196427 B1 (21) Numer zgłoszema: 339545 (22) Data zgłoszenia: 28.09.1998 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
28.09.1998, PCT/EP98/06143 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
08.04.1999, WO99/16877 PCT Gazette nr 14/99 (51) Int.Cl.
C12N 15/19 (2006.01) C07K 14/52 (2006.01) A61K 38/19 (2006.01) A61K 38/48 (2006.01) G01N 33/68 (2006.01)
| Białko RANTES skrócone na końcu aminowym, rekombinacyjny sposób jego (54) wytwarzania oraz jegozastosowanie, cząsteczki DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza i kompozycja farmaceutyczna, oraz zastosowanie CD26/DPP IV | |
| (30) Pierwszeństwo: 29.09.1997,EP,97116863.8 19.12.1997,EP,97122471.2 | (73) Uprawniony z patentu: APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V.,Curacao,AN |
| 10.03.1998,EP,98104216.1 | (72) Twórca(y) wynalazku: |
| (43) Zgłoszenie ogłoszono: 18.12.2000 BUP 26/00 | Paul Proost,Heverlee-Leuven,BE Sofie Struyf,Rumst,BE Jo Van Damme,Bruksela,BE |
| (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.01.2008 WUP 01/08 | (74) Pełnomocnik: Janina Kossowska, PATPOL Sp. z o.o. |
(57) 1. Białko RANTES skrócone na końcu aminowym o sekwencji aminokwasowej Id. Sekw. nr 2 i aktywności antagonistycznej względem chemokin.
2. Białko RANTES skrócone na końcu aminowym, według zastrz. 1, znamienne tym, że jest w postaci glikozylowanej.
8. Zastosowanie białka określonego w zastrz. 1 albo 2 do wytwarzania leku do leczenia i/lub diagnostyki choroby, w której konieczna jest aktywność antagonistyczna wobec działania chemokin, korzystnie chorób zapalnych, zakażenia HIV, chorób związanych z angiogenezą i hematopoezą oraz nowotworów.
9. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynną wraz z jednym albo wieloma dopuszczalnymi farmaceutycznie nośnikami i/lub zaróbkami, znamienna tym, że jako substancję czynną obejmuje białko określone w zastrz. 1 albo 2.
10. Zastosowanie CD26/DPP IV do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia i/lub diagnozowania chorób, w których aktywność antagonistyczna wobec działania chemokin jest wymagana.
PL 196 427 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest białko RANTES skrócone na końcu aminowym, sposób rekombinacyjny jego wytwarzania oraz jego zastosowanie, cząsteczki DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza i kompozycja farmaceutyczna, oraz zastosowanie CD26/DPP IV.
Wynalazek dotyczy białka RANTES skróconego na końcu aminowym, wykazującego aktywność antagonistyczną względem chemokin, jak również kodujących go sekwencji cDNA, ich zastosowania w leczeniu lub diagnostyce chorób, w których pożądana jest aktywność antagonistyczna względem chemokin oraz zawierających je kompozycji farmaceutycznych.
Chemokiny stanowią rodzinę małych, prozapalnych cytokin o właściwościach chemotaktycznych i aktywujących wobec leukocytów. Zależnie od położenia pierwszych cystein, rodzinę chemokin można podzielić na chemokiny C-C, C-X-C i C-X3-C (Baggiolini i in., 1994; Baggiolini i in., 1997 i Taub i in., 1996).
Wiele chemokin C-X-C, takich jak interleukina 8 (IL-8) działa chemotaktycznie względem neutrofili, podczas gdy chemokiny C-C, takie jak białko chemotaktyczne monocytów 3 (MCP-3), aktywują różne leukocyty, w tym monocyty, limfocyty, eozynofile, bazofile, komórki NK i komórki dendrytyczne.
Domena końca NH2 chemokin warunkuje wiązanie receptora, zaś obróbka końca NH2 może aktywować chemokiny albo całkowicie je unieczynnić.
Chemokina C-X-C, zasadowe białko płytek, staje się peptydem chemotaktycznym neutrofili (NAP-2) tylko po usunięciu 24 reszt końca NH2 (Walz i in., 1989; Van Damme i in., 1990).
Usunięcie do 8 reszt końca NH2 z IL-8 powoduje zwiększoną aktywność chemotaktyczną, ale odcięcie motywu Glu-Leu-Arg, który jest zlokalizowany przed pierwszą Cys we wszystkich chemokinach C-X-C chemotaktycznych dla neutrofili, powoduje całkowitą jej inaktywację (Clark-Lewis i in., 1991).
Podobna proteoliza końca NH2 (do 8 reszt aminokwasowych) innej chemokiny C-K-C, białka chemotaktycznego granulocytów 2 (GCP-2) nie wywiera wpływu na aktywność chemotaktyczną wobec neutrofili (Proost i in., 1993a).
RANTES (skrót od angielskiej nazwy „Regulated upon Activation, Normally T Expressed and presumably Secreted, tj. regulowana przez aktywację, wyrażana i przypuszczalnie wydzielana przez prawidłowe limfocyty T) jest chemokiną C-C, której klon cDNA wyizolowano z biblioteki cDNA wzbogaconej o sekwencje swoiste wobec limfocytów T (Schall i in., 1988). Syntetyczne chemokiny C-C MCP-1, MCP-3 i RANTES pozbawione 8 do 9 aminokwasów końca NH2 są nieaktywne wobec monocytów i są przydatne jako antagoniści receptorów (Gong i in., 1996; Gong i in., 1995).
Wydłużenie RANTES jedną metioniną powoduje całkowitą inaktywację cząsteczki, zaś MetRANTES zachowuje się jak antagonista naturalnego RANTES (Proudfoot i in., 1996).
Niniejszym opisane zostały RANTES skrócone na końcu aminowym, pozbawione aminokwasów końca NH2 odpowiadających resztom aminokwasowym 1, 1-2, 1-3 albo 1-4 naturalnie występującego RANTES, o aktywności antagonistycznej względem chemokin.
Skrócone na końcu aminowym białko RANTES według wynalazku ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w Id. Sekw. nr 2 i wykazuje aktywność antagonistyczną względem chemokin. Zatem skrócone białko RANTES według wynalazku odpowiada białku RANTES(3-68), które jest chemokiną RANTES pozbawioną pierwszych dwóch aminokwasów, jak to zostało przedstawione na fig. 1 i w Id. Sekw. nr 2.
Opisane niniejszym białka RANTES skrócone na końcu NH2 mogą być w postaci glikozylowanej albo nie-glikozylowanej. Korzystnie białko RANTES według wynalazku jest w postaci glikozylowanej.
Określenie „antagoniści chemokiny oznacza, że działają antagonistycznie względem dojrzałych, naturalnie występujących chemokin pełnej długości.
W zakres wynalazku wchodzą również cząsteczki DNA, które obejmują sekwencje DNA kodujące białko RANTES skrócone na końcu aminowym według wynalazku, w tym sekwencje nukleotydowe zasadniczo takie same. Sekwencje cDNA kompletnego RANTES ujawniono w Schall i in., (1988), zaś cDNA odpowiadające skróconemu RANTES można łatwo ustalić.
Określenie „zasadniczo takie same sekwencje obejmuje wszystkie sekwencje kwasu nukleinowego, które z powodu degeneracji kodu genetycznego kodują również dane sekwencje aminokwasowe.
Przedmiotem wynalazku jest również wektor ekspresyjny, obejmujący cząsteczkę DNA według wynalazku, zawierająca go komórka gospodarza oraz rekombinacyjny sposób wytwarzania skróconego na końcu aminowym białka RANTES według wynalazku, przez hodowanie w odpowiedniej pożywce hodowlanej komórki według wynalazku.
PL 196 427 B1
Sekwencję DNA kodującą białko według wynalazku można wprowadzić i poddać ligacji z odpowiednim plazmidem. Po wytworzeniu wektor ekspresyjny wprowadza się do odpowiedniej komórki gospodarza, która następnie wyraża wektor(y) z wytworzeniem pożądanego białka.
Ekspresję dowolnych białek rekombinowanych, a w tym białka według wynalazku, jak to niniejszym opisano, można przeprowadzić dowolnym sposobem znanym w stanie techniki w komórkach eukariotycznych (np. komórkach drożdży, owadów albo ssaków) albo komórkach prokariotycznych, stosując odpowiednie wektory ekspresyjne.
Przykładowo, cząsteczki DNA kodujące białka otrzymane w powyższy sposób wprowadza się znanymi w dziedzinie technikami do odpowiednio skonstruowanych wektorów ekspresyjnych (patrz, Sambrook i in., 1989). Dwuniciowy cDNA poddaje się ligacji z wektorem plazmidowym przez łączenie homopolimeryczne albo restrykcyjne, obejmujące zastosowanie technik syntetycznych łączników DNA albo ligacji tępych końców, tj. do ligacji cząsteczek DNA stosuje się ligazę DNA, zaś niepożądanemu łączeniu zapobiega się przez traktowanie fosfatazą alkaliczną.
Wektor ekspresyjny, aby był zdolny do ekspresji pożądanego białka, powinien również obejmować swoiste sekwencje nukleotydowe zawierające informację regulującą transkrypcję i translację, połączone z kodującym pożądane białko DNA w taki sposób, aby umożliwić ekspresję genu i wytworzenie białka. Gen, który ma podlegać transkrypcji, musi być poprzedzony przez promotor rozpoznawalny przez polimerazę RNA, z którym polimeraza ta wiąże się, zapoczątkowując proces transkrypcji. Istnieje wiele takich promotorów, które działają z różną wydajnością (promotory słabe i silne).
W przypadku gospodarzy eukariotycznych można zastosować różne sekwencje regulujące transkrypcję i translację, w zależności od natury gospodarza. Mogą one pochodzić ze źródeł wirusowych, takich jak adenowirus, bydlęcy wirus brodawczaka, małpi wirus itp., w których sygnały regulacyjne są powiązane z konkretnym genem wykazującym wysoki poziom ekspresji. Przykładami takich promotorów są: promotor TK wirusa opryszczki, promotor wczesny SV40, promotor drożdżowy genu gal4 itp. Można wybrać sygnały regulacyjne początku transkrypcji, które umożliwiają represję i aktywację, w sposób modulujący ekspresję genów.
Cząsteczka DNA obejmująca sekwencję nukleotydową kodującą białko według wynalazku jest wprowadzana do wektorów, zawierających połączone funkcjonalnie sekwencje sygnałowe regulujące transkrypcję i translację, które są zdolne do integracji sekwencji pożądanego genu z komórką gospodarza.
Komórki, które stabilnie transformowano wprowadzonym DNA, można wybrać przez wprowadzenie jednego albo wielu znaczników umożliwiających selekcję komórek gospodarza zawierających wektor ekspresyjny. Znacznik może dostarczyć fototrofię gospodarzowi auksotroficznemu, oporność na biocydy, np. antybiotyki albo metale ciężkie, takie jak miedź itp. Gen znacznika umożliwiającego selekcję można połączyć bezpośrednio z sekwencją DNA wyrażanego genu, albo wprowadzić do tej samej komórki przez równoczesną transfekcję. Do syntezy białka według wynalazku mogą być również konieczne dodatkowe elementy.
Istotne czynniki wpływające na selekcję konkretnego plazmidu albo wektora obejmują: łatwość rozpoznawania i selekcjonowania komórki biorcy zawierającej wektor spośród komórek, które nie zawierają wektora; liczba kopii wektora, która jest konieczna dla konkretnego gospodarza; oraz, jeżeli to konieczne, zdolność wektora do „wahadłowej wymiany pomiędzy komórkami różnych gatunków.
Gdy wektor(y) albo sekwencje DNA zawierające konstrukt(y) są przygotowane do ekspresji konstruktów DNA, można je wprowadzić do odpowiedniej komórki gospodarza różnymi dostępnymi sposobami: przez transformację, transfekcję, koniugację, fuzję protoplastu, elektroporację, precypitację fosforanem wapnia, bezpośrednie wstrzyknięcie itp.
Komórka gospodarza może być prokariotyczna albo eukariotyczna. Korzystne są komórki eukariotyczne, np. komórki ssaków, takich jak ludzie, małpy, myszy i komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), ponieważ zapewniają one modyfikację potranslacyjną cząsteczek białka, w tym prawidłowe fałdowanie albo glikozylację w prawidłowych miejscach. Również komórki drożdży mogą przeprowadzać potranslacyjną modyfikację peptydów, w tym glikozylację. Istnieje wiele strategii rekombinacji DNA, które wykorzystują sekwencje silnych promotorów i plazmidy o licznych kopiach, które można zastosować do wytwarzania pożądanego białka w drożdżach. Drożdże rozpoznają sekwencje liderowe klonowanych produktów genów ssaków i wydzielają peptydy niosące sekwencje liderowe (tj. pre-peptydy).
PL 196 427 B1
Po wprowadzeniu wektora (wektorów), komórki gospodarza hoduje się w wybiórczej pożywce, która selekcjonuje wzrost komórek zawierających wektor. Ekspresja sekwencji klonowanego genu powoduje wytwarzanie pożądanego białka.
Białko RANTES skrócone na końcu aminowym według wynalazku można wytworzyć dowolną znaną procedurą, w szczególności, dobrze znanymi procedurami syntezy chemicznej, z wykorzystaniem syntezatorów peptydów w fazie stałej, a następnie oczyszczać przez chromatografię.
Chemokiny można, przykładowo, syntetyzować z zastosowaniem Fmoc (9-fluorenylometoksykarbonylu), tBoc (t-butoksykarbonylu) albo inną porównywalną metodą syntezy chemicznej z wykorzystaniem albo bez grup chroniących łańcuchy boczne na różnych aminokwasach. Aminokwasy z odpowiednimi grupami chroniącymi łańcuchy boczne lub bez takich grup poddaje się preaktywacji - np. przy użyciu HBTU/HOBt [heksafluorofosforan 2-(1H-benzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametylouroniowy/1-hydroksybenzotriazol)] - i sprzęga z rosnącym łańcuchem peptydowym. Przed dodaniem kolejnej reszty aminokwasowej, z grupy α-aminowej usuwana jest grupa ochronna (np. Fmoc). Po syntezie, wszystkie grupy ochronne usuwa się, peptyd pełnej długości oczyszcza się i fałduje chemicznie albo enzymatycznie (łącznie z formowaniem mostków disiarczkowych pomiędzy cysteinami), tworząc odpowiednie chemokiny według wynalazku.
Oczyszczanie naturalnych, syntetycznych albo rekombinowanych białek przeprowadza się dowolnym znanym sposobem, tj. dowolną konwencjonalną procedurą obejmującą ekstrakcję, precypitację, chromatografię, elektroforezę itp. (patrz, przykładowo, Proost i in., 1996). Dodatkową procedurą oczyszczania, którą można korzystnie zastosować w celu oczyszczania białka według wynalazku, jest chromatografia powinowactwa z zastosowaniem przeciwciała monoklonalnego albo heparyny wiążących białko docelowe, które są wytwarzane i unieruchamiane na matrycy żelowej znajdującej się w kolumnie. Preparaty zawierające zanieczyszczenia są przepuszczane przez kolumnę. Białko będzie wiązane przez heparynę albo swoiste przeciwciało, zaś zanieczyszczenia będą przechodzić przez kolumnę. Po płukaniu, białko eluuje się z żelu przez zmianę pH albo siły jonowej.
Białka RANTES skrócone na końcu aminowym według wynalazku są przydatne w leczeniu i/lub diagnostyce chorób, w których pożądana jest aktywność antagonistyczna względem chemokin. Przykłady takich chorób obejmują choroby zapalne, choroby związane z angiogenezą i hematopoezą, nowotwory, choroby zakaźne, w tym HIV, choroby autoagresyjne, miażdżycę, choroby płuc i skóry.
Stąd, przedmiotem wynalazku jest białko według wynalazku do zastosowania jako lek oraz zastosowanie białka według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia i/lub diagnostyki choroby, w której konieczna jest aktywność antagonistyczna wobec działania chemokin, korzystnie chorób zapalnych, zakażenia HIV, chorób związanych z angiogenezą i hematopoezą oraz nowotworów.
Lek otrzymany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku może być w postaci kompozycji farmaceutycznej. Przedmiotem wynalazku jest więc kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynną wraz z jednym albo wieloma dopuszczalnymi farmaceutycznie nośnikami i/lub zaróbkami, przy czym jako substancję czynną zawiera białko według wynalazku.
Niniejszym opisany został również sposób leczenia wyżej wskazanych chorób obejmujący podawanie farmakologicznie skutecznej ilości RANTES skróconego na końcu aminowym według wynalazku osobnikowi narażonemu na ryzyko rozwinięcia takich chorób albo osobnikowi wykazującemu taką patologię.
Stwierdzono również, że CD26/DPP IV jest zdolna do wytwarzania RANTES skróconego na końcu NH2 in vitro. RANTES jest pierwszą opisaną cytokiną, której aktywność biologiczną można modyfikować przez CD26/DPP IV.
Zatem, przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie CD26/DPP IV do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia i/lub diagnozowania chorób, w których aktywność antagonistyczna wobec działania chemokin jest wymagana. Korzystnie kompozycja uzyskana zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczona do leczenia chorób zapalnych, odpornościowych oraz zakaźnych.
Stanowi to pierwszy przykład zidentyfikowanego mechanizmu endogennie regulowanej modyfikacji chemokiny w antagonistę, podobnej do obróbki fizjologicznej, ale zachodzącej przez inne czynniki (proteazy). Zastosowanie takich czynników (proteaz) w leczeniu i/lub diagnostyce powyższych chorób jest niniejszym ujawnione.
Wynalazek zostanie opisany w oparciu o przykłady, których nie należy uważać za ograniczenie zakresu wynalazku. Przykłady odnoszą się do figur wymienionych poniżej.
PL 196 427 B1
Figura 1 przedstawia sekwencję aminokwasową RANTES. Sekwencje sygnałowe zaznaczone są kursywą, podczas gdy reszty C wytłuszczono. Strzałki wskazują pierwsze aminokwasy skróconego na końcu aminokwasowym białka RANTES według wynalazku, określanego również jako RANTES(3-68).
Figura 2 Siłę chemotaktyczną kompletnych i skróconych na końcu NH2 postaci naturalnych i rekombinowanych białka RANTES wobec komórek monocytarnych THP-1 porównywano w teście z mikrokomorami Boydena: Naturalne RANTES(1-68) (Δ), skrócone, naturalne RANTES(3-68) (□), kompletne, rekombinowane RANTES(1-68) (▲) i rekombinowane RANTES(3-68) cięte przez CD26/DPP IV (). Wyniki stanowią średni wskaźnik chemotaksji ± SEM czterech lub większej liczby niezależnych doświadczeń.
Figura 3 Wpływ naturalnego RANTES(3-68) (□), naturalnego RANTES(1-68) (Δ), rekombinowanego RANTES(1-68) (▲) i rekombinowanego RANTES(3-68) ciętego przez CD26/DPP IV () na [Ca2+]i w komórkach THP-1. Wyniki stanowią średni wzrost [Ca2+]j ±SEM trzech lub większej liczby niezależnych doświadczeń.
Figura 4 przedstawia odczulenie aktywności mobilizującej Ca2+ kompletnego recRANTES(1-68) przez RANTES(3-68). Komórki THP-1 pobudzano najpierw buforem albo różnymi stężeniami rekombinowanego RANTES(1-68) albo RANTES(3-68). Wyniki przedstawiają średnią ±SEM (trzy albo więcej doświadczeń) wzrostu [Ca2+i w reakcji na 30 ng/ml kompletnego rekombinowanego RANTES jako drugiego bodźca.
Figura 5 Porównanie siły chemotaktycznej skróconego RANTES(3-68) z kompletnym RANTES(1-68). Aktywność chemotaktyczna względem granulocytów eozynofilowych naturalnego (nat) i rekombinowanego (rec) skróconego RANTES, kompletnego RANTES i syntetycznego MCP-3 określano w teście z mikrokomorami. Wyniki przedstawiają średni wskaźnik chemotaktyczny (CI)±SEM dwóch albo większej liczby niezależnych doświadczeń (z których każde przeprowadzono w potrójnym powtórzeniu).
Figura 6 Odczulenie mobilizacji wapnia przez kompletne RANTES w transfektantach CCR. Doświadczenia dotyczące mobilizacji wapnia przeprowadzono na komórkach HOS transfekowanych CD4 i receptorami chemokin CCR1 albo CCR5. Komórki najpierw pobudzano różnymi stężeniami kompletnego albo skróconego RANTES, a następnie pobudzano 100 ng/ml kompletnego RANTES. Przedstawiono procent zahamowania wzrostu [Ca2+i wywołany przez drugi bodziec. Procent ten obliczono przez porównanie reakcji na 100 ng/ml kompletnego RANTES po dodaniu RANTES(1-68) albo RANTES(3-68) z reakcją po pobudzeniu samym buforem (100%). Wyniki oznaczają średni procent zahamowania ± SEM z dwóch albo większej liczby doświadczeń.
Figura 7 Silny wpływ hamujący RANTES(3-68) wobec zakażenia komórek jednojądrzastych przez HIV-1. Aktywowane PHA PBMC zakażono M-tropicznym szczepem HIV-1 Ba-L w obecności różnych stężeń RANTES(1-68) albo RANTES(3-68) (0 do 1000 ng/ml dodane w czasie zakażania). Po 10 dniach, miano wirusa monitorowano w nadsączu komórek przez ELISA na antygen p24 (przedstawiono jeden reprezentatywny eksperyment z czterech).
Figura 8 Wpływ RANTES(1-68) i RANTES(3-68) na zakażenie przez szczep HIV-1 SF126 w PBMC aktywowanych PHA. Miano wirusa monitorowano przez 10 dni po zakażeniu przez ELISA na antygen p24 w nadsączu komórek. Przedstawiono wyniki reprezentatywnego doświadczenia spośród trzech. * - poniżej granicy wykrywania przez ELISA dla antygenu p24 (<5 pg/ml).
Figura 9 Ekspresja CD26 w komórkach HOS.CD4.CCR5, U87.CD4.CCR5 i świeżo izolowanych PBMC. Procent (%) komórek CD26-pozytywnych zaznaczono na każdym histogramie.
Figura 10 Wpływ RANTES(1-68), RANTES(1-68) z dodatkiem sCD26 (50 U/l) i RANTES(3-68) na zakażenie komórek HOS.CD4.CCR5 przez szczep HIV-1 Ba-L. Miano wirusa monitorowano w nadsączu komórek przez 8 dni po zakażeniu przy użyciu ELISA na Ag p24. Przedstawiono wyniki reprezentatywnych doświadczeń.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1: RANTES skrócone na końcu aminowym
Materiały i metody
Reagenty
Naturalne ludzkie białko RANTES wytworzone przez ludzkie komórki mięsaka wątroby Malavu, komórki mięsaka kości MG-63 albo leukocyty krwi obwodowej (Blood Transfusion Centers z Antwerpii i Leuven) oczyszczono jak to opisano uprzednio (Proost i in., 1996 i Proost i in., 1993). MCP-2, MCP-3 i GCP-2 syntetyzowano metodą Fmoc (Proost i in., 1995 i Wuyts i in., 1997), rekombinowany, ludzki
PL 196 427 B1
RANTES otrzymano z Peprotech (Rocky Hill, NJ), zaś rekombinowany MCP-1 był darem od Dr Oppenheimera (NCI-NIH, Frederick, MD).
Ludzkie komórki mięsaka kości (HOS, ang. human osteosarcoma) transfekowane CD4 i jednym z receptorów chemokin CC CCR1, CCR3 albo CCR5 (Deng i in., 1996) hodowano w DMEM z glutamax. Puromycynę (1 ąg/ml) dodawano do pożywki jako czynnik selekcyjny. Wszystkie pożywki wzrostowe (Gibco BRL/Life Technologies, Paisley, UK) wzbogacono o 10% FCS.
Ludzką CD26/DPP IV otrzymano z prostasomów, organelli pochodzących z prostaty, które występują w postaci wolnej w osoczu spermy. Enzym oczyszczono do homogenności, jak to opisano uprzednio, stosując wymianę jonową, a następnie chromatografię powinowactwa na dezaminazie adenozyny (De Meester i in., 1996).
Inkubowanie chemokin z CD26/DPPIV i wykrywanie aktywności proteolitycznej
100 do 1000-krotny nadmiar chemokiny inkubowano przez noc z CD26/DPP IV w 100 mM Tris/HCl pH 7,7. Chemokiny oddzielano od CD26/DPP IV przez SDS-PAGE na żelach Tris/Tricyna, jak to opisano uprzednio (Proost i in., 1996).
Białka poddano elektrotransferowi na membrany PVDF (polifluorek winylidenu) (Problott, Perkin Elmer, Foster City, CA) i barwiono brylantowym błękitem Coomassie R250. Po odbarwieniu, membrany płukano przynajmniej 5-krotnie ultraczystą wodą (Milli Q; Millipore, Bedford, MA).
W celu otrzymania odpowiednich ilości czystej, skróconej chemokiny do testów biologicznych, około 50 ąg rekombinowanej chemokiny traktowano CD26/DPP IV, zaś produkty cięcia zakwaszano 0,1% kwasem trifluorooctowym (TFA). Tween 20 (0,01%) dodawano do probówki, aby zapobiec przywieraniu chemokin.
Chemokiny oddzielano od CD26/DPP IV na kolumnie C-8 Aquapore RP-300 (1x50 mm) (Perkin Elmer) w gradiencie acetonitrylu. Frakcje zawierające białka analizowano przez SDS-PAGE i barwiono srebrem, jak to opisano.
Chemokiny traktowane CD26/DPP IV, oczyszczone przez RP-HPLC albo wycięte z membran PVDF, sekwencjonowano od końca NH2 przez degradację Edmana na sekwenatorze białka 477A/120A (Perkin Elmer) z N-metylopiperydyną jako zasadą sprzęgającą.
Wykrywanie aktywności chemotaktycznej
Chemokiny badano pod kątem ich siły chemotaktycznej na świeżo izolowanych granulocytach krwi obwodowej (106 komórek/ml) albo hodowanych komórkach monocytarnych THP-1 (0,5x106 komórek/ml) w mikrokomorach Boydena (Proost i in., 1996 i Proost i in., 1993).
Po 45 minutach (granulocyty) albo 2 godzinach (komórki THP-1) inkubacji w 37°C, komórki utrwalano i barwiono. Komórki, które migrowały przez membranę poliwęglanową z porami o średnicy 5 ąm zliczano mikroskopowo w 10 polach widzenia pod immersją olejową.
Wskaźnik chemotaktyczny (CI) próbki (w potrójnym powtórzeniu dla każdej komory) obliczano jako liczbę komórek, które migrowały do testowanej próbki w stosunku do liczby komórek, które migrowały do pożywki kontrolnej. W doświadczeniach nad odczulaniem, komórki inkubowano z biologicznie nieczynnymi wariantami chemokin przez 10 minut w 37°C, po czym dodawano je do górnej studzienki komory Boydena.
Procentowe hamowanie CI otrzymane przez odczulanie komórek kontrolnych traktowanych HBSS zostało obliczone do oszacowania chemotaksji odczulającej.
Wykrywanie wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+
Wewnątrzkomórkowe stężenia Ca2+ ([Ca2+]j mierzono jak to opisano uprzednio (Wuyts i in., 1997). Oczyszczone komórki inkubowano ze wskaźnikiem fluorescencyjnym fura-2 (fura-2/AM 2,5 μΜ, Molecular Probes Europe BV, Leiden, Holandia) i 0,01% Pluronic F-127 (Sigma, St. Louis, MO).
Po 30 minutach komórki dwukrotnie płukano i zawieszano w HBSS z 1 mM Ca2+ i inkubowano przez 10 min w 37°C, po czym mierzono fluorescencję fura-2 w spektrofotometrze luminescencyjnym LS50B (Perkin Elmer). Po wzbudzeniu przy 340 i 380 nm, fluorescencję wykrywano przy 510 nm. [Ca2+]j obliczano według równania Grynkiewicza (Grynkiewicz i in., 1985).
W celu określenia Rmax, komórki poddano lizie 50 μΜ digitoniną. Następnie, pH doprowadzono do wartości 8,5 przy użyciu 20 mM Tris i otrzymano Rmn przez dodanie 10 mM EGTA do poddanych lizie komórek. K wynosiła 224 nM. W doświadczeniach nad odczulaniem komórki pobudzano najpierw buforem lub chemokiną w różnych stężeniach. Jako drugi bodziec stosowano chemokiny w stężeniach indukujących istotny wzrost [Ca2+], po wstępnej stymulacji buforem. Obliczono procentowe zahamowanie wzrostu [Ca2+], przez wstępną stymulację komórek w odpowiedzi na drugi bodziec.
PL 196 427 B1
Hamowanie zakażenia HIV-1
M-tropowe szczepy HIV-1 BaL i SF162 otrzymano za pośrednictwem MRC AIDS Reagent Project (Herts, UK). Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) od zdrowych dawców wyizolowano przez wirowanie w gradiencie gęstości (5,23) i pobudzano PHA 1 μg/ml (Sigma, Bornem, Belgia) przez 3 dni w 37°C. Aktywowane komórki (blasty aktywowane PHA) płukano trzykrotnie PBS i zakażano wirusem, jak to opisano wcześniej (Schols i in., 1997). Zakażone HIV-1 i pozornie zakażone blasty aktywowane PHA hodowano w obecności 25 U/ml IL-2 i różnych stężeń RANTES(1-68) albo RANTES(3-68). Nadsącz komórek zbierano w 10 dniu i analizowano antygen rdzeniowy HIV-1 przez ELISA na antygen p24 (DuPont/NEN Life Science Products, Bruksela, Belgia).
Wyniki
Identyfikacja i charakterystyka biologiczna naturalnego, okrojonego na końcu NH2 RANTES
Wyizolowano uprzednio inną skróconą na końcu NH2 postać ludzkiego GCP-2 (Proost i in., 1993). Skrócona postać GCP-2 była cięta za Pro w pozycji przedostatniej [GCP-2 (3-75)]. Stosując podobną standardową procedurę oczyszczania, oczyszczono chemokinę C-C RANTES z leukocytów krwi obwodowej albo komórek mięsaka (Proost i in., 1996).
W szczególności, kondycjonowane pożywki z komórek mięsaka MG-63 albo Malavu indukowanych mieszaniną cytokin frakcjonowano w celu wyizolowania naturalnych wariantów chemokin. Chemokiny oczyszczano kolejno przez chromatografię powinowactwa z przeciwciałami albo heparyną, chromatografię kationowymienną (Mono S FPLC) i RP-HPLC, zaś immunoreaktywne postaci wykrywano z zastosowaniem ELISA swoistym wobec chemokin. Na kolumnie kationowymiennej stwierdzono, że IL-8 jest wymywane w bliskim sąsiedztwie RANTES (od 0,7 do 0,75 M NaCl). Mimo to, obie chemokiny rozdzielono przez RP-HPLC (RANTES i IL-8 eluowały przy, odpowiednio, 27,5% i 30% acetonitrylu). Analiza sekwencji aminokwasowej czystych białek potwierdziła, że IL-8 występuje w różnych postaciach skróconych na końcu NH2, które uprzednio wyizolowano na podstawie ich aktywności chemotaktycznej (Van Damme i in., 1989). Jednakże, w przypadku RANTES wyizolowano tylko jedną postać, pozbawioną dwóch reszt końca NH2 w porównaniu z kompletnym RANTES. Ze względu na jego dominujące występowanie, RANTES(3-68) analizowano szczegółowo dalej w celu potwierdzenia jego aktywności chemotaktycznej wobec monocytów i eozynofili. W szczególności, RANTES(3-68) badano pod względem aktywności chemotaktycznej i/lub uwalniania wewnątrzkomórkowego Ca2+ oraz jego siły biologicznej w porównaniu z odpowiednimi chemokinami pełnej długości.
Delecja dwóch reszt na końcu NH2 RANTES powodowała istotne zmniejszenie aktywności chemotaktycznej i uwalniania Ca2+ u monocytów. W porównaniu z kompletnym RANTES (minimalna dawka skuteczna 3-10 ng/ml), naturalne RANTES(3-68) było całkowicie nieaktywne w stężeniach 300 ng/ml w badaniach w komorze Boydena (fig. 2). Oprócz tego, aby uzyskać podobną reakcję Ca2+, konieczne były 10-krotnie wyższe stężenia naturalnego RANTES(3-68) w porównaniu z RANTES(1-68) (fig. 3).
CD26/DPPIV usuwa NH2-końcowe dipeptydy z RANTES
W celu zbadania czy aminopeptydaza CD26/DPP IV może odpowiadać za skracanie RANTES na końcu NH2, kompletną chemokinę inkubowano przez noc z CD26/DPP IV, przenoszono na membranę PVDF, barwiono błękitem Coomassie i poddawano automatycznej degradacji Edmana. Traktowanie RANTES CD26/DPP IV powodowało usunięcie NH2-końcowego dipeptydu. Równoległa inkubacja chemokiny z buforem w nieobecności CD26/DPP IV nie wywierała efektu.
Ponieważ inne chemokiny zawierały sekwencję zgodności wobec cięcia przez CD26/DPP IV, oraz wykazano, że koniec NH2 MCP jest niezbędny dla ich aktywności biologicznej (Gong i in., 1996, Gong i in., 1995), MCP-1, MCP-2 i MCP-3 również inkubowano z CD26/DPP IV.
Po traktowaniu, MCP przenoszono na membrany PVDF i barwiono błękitem Coomassie w celu potwierdzenia, że odzyskano ilość białka niezbędną do degradacji Edmana.
Jednakże, nie można było wykryć sekwencji końca NH2 wskazując, że CD26/DPP IV nie zmienia końca NH2 MCP, co blokuje degradację Edmana przez kwas piroglutaminowy.
Porównanie aktywności biologicznej RANTES kompletnego i traktowanego CD26/DPPIV
Podobnie jak naturalne RANTES(3-68), oczyszczone przez RP-HPLC C-8 rekombinowane RANTES traktowane CD26/DPP IV było nieaktywne w doświadczeniach nad chemotaksją w komorze Boydena, kiedy stosowano stężenia do 1 μg/ml, podczas gdy wykrywano istotną reakcję chemotaktyczną monocytów w reakcji na kompletne, rekombinowane RANTES w stężeniach od 30 do 100 ng/ml (fig. 2).
PL 196 427 B1
Gdy badano wpływ skracania w teście mobilizacji Ca2+, RANTES(3-68) indukowało słaby, ale istotny wzrost przy stężeniu 100 ng/ml. Kompletne RANTES jednakże, było aktywne przy 10 ng/ml (fig. 3). Podsumowując, mimo iż usunięto tylko dwie reszty końca NH2, aktywność chemotaktyczna i mobilizująca Ca2+ RANTES dla monocytów zmniejszała się 10- do 100-krotnie.
RANTES(3-68) jest naturalnym antagonistą chemotaksji dla kompletnego RANTES
W świetle braku aktywności RANTES(3-68) w doświadczeniach nad chemotaksją monocytów, badano czy okrojone RANTES może działać jako antagonista. RANTES(3-68) w stężeniu 1 ng/ml niemal całkowicie (82%) odczulało względem efektu chemotaktycznego 100 ng/ml kompletnego RANTES (tabela I).
Gdy do górnej komory dodano 3-krotny nadmiar RANTES(3-68), chemotaksja komórek THP-1 wobec kompletnego RANTES była hamowana w około 50-70%. RANTES(3-68) w stężeniu 300 ng/ml hamowało około 30% reakcji chemotaktycznej wobec kompletnego RANTES w równym stężeniu.
W do^adczema^ nad mobilizacją Ca2+ w komórkach THp-1 (fig. 4), 30 ng/md kompletnego RANTES odczulało efekt 30 ng/ml kompletnego RANTES do 39±5%. Około 10-krotnie wyższe stężenia RANTES(3-68) konieczne były do osiągnięcia tej samej wielkości odczulenia. Jednakże, przy stężemu 300 ng/mk RANTES (3-68) dawał ^totną o^owtedź Ca2+. Ta o^owtedź Ca2+ była porównywal· na z reakcją otrzymaną dla 30 ng/ml kompletnego RANTES.
T a b e l a I
RANTES(3-68) odczuta chemotaksję monocytów wywołaną przez RANTES (Ί-68)1
| Chemokina (ng/ml) | Reakcja chemotaktyczna (CI) | ||||||
| Dolna studzienka | Górna studzienka | % hamowania | |||||
| RANTES(1-68) | RANTES(3-68) | A | B | C | D | Średnia ±SEM | Średnia ±SEM |
| 300 | 1000 | 12,5 | 7,5 | 27,5 | 50,5 | 25±10 | 67±8 |
| 300 | 22,0 | 20,5 | 72,5 | 79,5 | 49±16 | 31±13 | |
| 0 | 41,0 | 46,0 | 71,5 | 97,0 | 64±13 | 0 | |
| 100 | 1000 | 4,0 | 3,0 | 13,5 | 11,0 | 8±3 | 82±4 |
| 300 | 7,5 | 7,0 | 29,0 | 33,0 | 19±7 | 53±11 | |
| 0 | 24,0 | 21,5 | 50,0 | 44,5 | 35±7 | 0 |
1 Wyniki stanowią wskaźnik chemotaktyczny (CI) czterech (A do D) niezależnych doświadczeń (średnia ± SEM) i procentowe zahamowanie (średnia ± SEM % zahamowania w czterech doświadczeniach) reakcji chemotaktycznej wobec RANTES(1-68) po preinkubacji komórek THP-1 z nieaktywnym RANTES(3-68) albo buforem.
Zaburzona aktywność chemotaktyczna RANTES(3-68) wobec ludzkich monocytów i eozynofili
W tabeli II siłę naturalnego RANTES(3-68) porównano z siłą białka chemotaktycznego monocytów MCP-3 i kompletnym RANTES(1-68). Można zauważyć, że MCP-3 i RANTES(1-68) są wciąż chemotaktyczne wobec świeżo izolowanych monocytów krwi obwodowej w stężeniu 3 ng/ml i 30 ng/ml, podczas gdy naturalne RANTES(3-68) pozostaje nieaktywne w stężeniu 100 ng/ml.
Zredukowaną siłę chemotaktyczną tego naturalnego wariantu potwierdzono rekombinowanym RANTES(3-68). Mimo iż jest słabo chemotaktyczne wobec monocytów (1 ng/ml), oczyszczone, rekombinowane RANTES(3-68) wykazuje aktywność właściwą 10-krotnie niższą niż kompletne, rekombinowane białko RANTES.
Na koniec, siłę chemotaktyczną RANTES(3-68) potwierdzono na ludzkich eozynofilach, które wciąż reagowały na 100 ng/ml kompletnego RANTES i 30 ng/ml MCP-3 (fig. 5). Podobnie do monocytów, migracja eozynofili była tylko pobudzona przez RANTES(3-68) w stężeniu 1 ng/ml.
PL 196 427 B1
T a b e l a II
Porównanie aktywności chemotaktycznej wobec monocytów białka RANTES(3-68) z RANTES(1-68) oraz MCP-3 Aktywność chemotaktyczna wobec monocytówa)
Stężenie (ng/ml) MPC-3 natRANTES(3-68) recRANTES(1-68) recRANTES(3-68)
| 1000 | -b) | - 3,6±0,8 (6) | 3,3 (1) | |
| 300 | 6,0±1,2 (6) | - | - | - |
| 100 | - | 1,1±0,1 (3) | 3,3±0,4 (6) | 1,0 (1) |
| 30 | 6,9±1,0 (6) | 1,7±0,2 (3) | - | - |
| 10 | - | 1,9±0,6 (3) | 1,9±0,4 (6) | <1,0 (1) |
| 3 | 4,1±0,4 (6) | - | - | - |
a średni wskaźnik chemotaktyczny (CI)±SEM (n) na świeżych monocytach krwi obwodowej b) Ne badano
RANTES(3-68) sygnalizuje i odczula wobec RANTES(1-68) przez CCR5, ale nie przez CCR1 i CCR3
W celu wytłumaczenia zmniejszonej aktywności chemotaktycznej RANTES(3-68), sprawdzano zdolność tego wariantu chemokiny do wiązania i sygnalizacji znanych receptorów.
Komórki HOS transfekowane receptorami chemokin CCR1, CCR3 albo CCR5 zastosowano w teście sygnalizacji mierzącym wzrost stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego. W stężeniach do 300 ng/m( RANTES(3-68) me zwiększato [Ca24! w komórkach HOS Tansfekowanycti CCR1 III) lub CCR3 (dane nieprzedstawione), podczas gdy, odpowiednio, 30 ng/ml i 100 ng/ml kompletnego RANTES wystarczało do wywołania wzrostu [Ca2+i w transfektantach CCR1 i CCR3.
Jednakże, zarówno kompletne jak i skrócone RANTES były przy stężeniu 30 ng/ml zdolne do wywołania istotnego wzrostu [Ca2+]i w transfektantach CCR5. Ponadto, przez wstępną inkubację komórek transfekowanych CCR5 z 3- i 10-krotnym nadmiarem RANTES(3-68) albo kompletnego RANTES, uzyskano porównywalne zahamowanie (około 75%) wzrostu [Ca2+i przez późniejszą ekspozycję na kompletne RANTES (100 ng/ml) (fig. 6).
W przeciwieństwie, 300 ng/ml RANTES(3-68) jedynie marginalnie odczulało reakcję wapnia w komórkach transfekowanych CCR1 i CCR3 na 100 ng/ml kompletnego RANTES, podczas gdy 3krotny nadmiar kompletnego RANTES jako pierwszy bodziec całkowicie hamował wzrost [Ca2+i w tych komórkach w odpowiedzi na kolejne działanie RANTES(1-68). Należy wnioskować, że usunięcie dwóch końcowych reszt końca NH2 z RANTES wywiera istotny wpływ na przekazywanie sygnału w ten sposób, że receptory chemokiny CCR1 i CCR3 nie są rozpoznawane funkcjonalnie. Stąd, zaburzenie siły chemotaktycznej RANTES(3-68) można wytłumaczyć przez funkcjonalną niezdolność działania przez CCR1 i CCR3. W przeciwieństwie, RANTES(3-68) w pełni zachowuje charakterystykę sygnalizacji przez CCR5 kompletnego RANTES. RANTES(3-68) może działać przeciwzapalnie przez współzawodnictwo z kompletnym RANTES, ale może też działać jako inhibitor HIV przez zachowanie zdolności do wiązania CCR5.
T a b e l a III
Mobilizacja wapnia przez postaci RANTES u transfektantów CCR1 i CCR5
| Chemokina | Stężenie (ng/ml) | Wzrost [Ca2! (nM)a) | |
| CCR1 | CCR5 | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| RANTES(1-68) | 300 | 133±5 (3) | 96±1 (2) |
| 100 | 100±28 (3) | 60±4 (2) | |
| 30 | 25±8 (3) | 24±2 (2) | |
| 10 | <15 (2) | <15 (1) |
PL 196 427 B1 cd. tabeli III
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| RANTES | 300 | 19±9 (3) | 119±5 (2) |
| 100 | <15±0 (3) | 76±4 (2) | |
| 30 | <15 (2) | 56±13 (2) | |
| 10 | <15 (1) |
a) Pokazano średnią wzrostu [Ca2+] i w nM±SEM w dwóch albo więcej niezależnych doświadczeniach
Zahamowanie chemotaksji wywołanej przez chemokiny CC przez RANTES(3-68) w ludzkich komórkach monocytarnych
W celu sprawdzenia, czy zahamowanie sygnalizacji chemokin CC przez RANTES (3-68) zachodzi również w komórkach monocytarnych, przeprowadzono doświadczenia nad zahamowaniem w komórkach THP-1. Wykazano, że RANTES(3-68) wywoływało 10-krotne zmniejszenie siły zwiększania [Ca2+]i w komórkach monocytarnych w porównaniu z kompletnym RANTES (dane niepokazane). Oprócz tego, efekt chemotaktyczny kompletnego RANTES (30 ng/ml) wobec komórek monocytarnych był zahamowany (71%) przez inkubowanie komórek badanych z 300 ng/ml RANTES(3-68) jak przedstawiono w tabeli IV.
Ponadto, RANTES(3-68) zmniejszał reakcję chemotaktyczną wobec innych chemokin CC, w tym białka chemotaktycznego monocyfów 3 (MCP-3) (67%), białka zapalnego makrofagów 1a (MlP1α) (61%) i MIP-1 β (80%).
Pokazuje to, że RANTES(3-68) działa jako inhibitor o szerokim spektrum migracji monocytów pod wpływem chemokin CC.
T a b e l a IV
Zahamowanie chemotaksji monocytów wobec chemokiny CC przez RANTES(3-68)
| Chemokinaa) | Stężenie (ng/ml) | Zahamowanie chemotaksji komórek THP-1 | ||
| Buforb c) | RANTES(3-68)b’ c | % hamowaniad) | ||
| RANTES | 30 | 19,0±6,6 | 3,7±0,6 | 71±16 |
| MCP-3 | 30 | 48,5±9,3 | 24,9±2,0 | 45±10 |
| MCP-3 | 3 | 7,6±2,5 | 3,1±0,8 | 67±13 |
| MlP-1a | 30 | 6,2±2,4 | 3,0±1,1 | 61±22 |
| MIP-1P | 300 | 4,3±1,0 | 1,9±0,6 | 80±12 |
| kontrola | 1,5±0,5 | 1,0±0,5 |
a) RANTES, MCP-3, MIP-1 α, MIP-1 β i bufor dodawano jako chemoatraktant do dolnej studzienki mikrokomory
b) Górna studzienka mikrokomory została wypełniona komórkami THP-1 prę inkubowanymi (10 min., 37°C) z 300 ng/ml RANTES(3-68) albo buforem
c) średnia CI±SEM czterech niezależnych doświadczeń
d) zahamowanie migracji wywołane kompletną chemokiną w obecności RANTES(3-68) w stężeniu 300 ng/ml
Swoiste skracanie RANTES przez CD26 jest konieczne dla aktywności przeciwwirusowej Działanie różnych postaci RANTES badano wobec dwóch szczepów M-tropowych HIV-1 (BaL i SF162) na ludzkich PBMC pochodzących od zdrowych dawców krwi. IC50 kompletnego RANTES(168) wobec szczepu BaL wynosiło 3,4 nM, zaś dla RANTES(3-68) IC50 wynosiło 0,39 nM. Wartość IC90 dla RANTES(1-68) wynosiło 71 nM, co stanowiło w przybliżeniu 10-krotność wartości IC90 RANTES(368). W stosunku do szczepu SF162 przy badaniu na PBMC, RANTES (1-68) (IC50 23 nM; IC90 95 nM) było 10-krotnie mniej aktywne niż RANTES(3-68) (IC50 2 nM; IC90 8,2 nM) (tabela V). Zależny od stężenia efekt obu chemokin przy stężeniach w zakresie od 133 do 0,2 nM wobec replikacji HIV-1 SF162 w PBMC przedstawiono na figurze 8. Stężenie 5,2 nM RANTES(3-68) było wyraźnie skuteczniejsze w redukowaniu replikacji wirusa, podczas gdy RANTES(1-68) było nieaktywne przy tym stężeniu. Nie zanotowano różnicy w aktywności przeciwwirusowej pomiędzy kompletnym RANTES otrzymanym z Peprotech albo R&D Systems.
PL 196 427 B1
Uderzająca różnica w aktywności przeciwwirusowej pomiędzy dwiema postaciami RANTES stała się jeszcze bardziej uderzająca podczas badania na komórkach transfekowanych CCR5. W komórkach U78.CD4.CCR5, IC50 dla RANTES(1-68) i RANTES(3-68) wobec szczepu BaL wynosiła odpowiednio 21 nM i 0,65 nM. ICg0 dla RANTES(1-68) wynosiła 133 nM, podczas gdy ICg0 dla RANTES(368) wynosiła 63 nM. Również w tabeli V, pokazano, że RANTES(1-68) było praktycznie nieaktywne w komórkach HOS.CD4.CCR5 (IC50>133 nM), podczas gdy RANTES(3-68) jest silnym inhibitorem replikacji BaL HIV-1 w tych komórkach (IC50 5,5 nM). Jednakże, wartości IC90 nie osiągnięto dla obu postaci RANTES w tych komórkach.
Aktywność przeciwwirusowa RANTES jest zależna od obecności związanego z błoną albo rozpuszczalnego CD26 (sCD26)
Oceniano ekspresję CD26 na dwóch różnych liniach transfekowanych CCR5 oraz na świeżo wyizolowanych PBMC.
Transfektanty HOS były negatywne pod względem ekspresji CD26, co określono przez analizę metodą cytometrii przepływowej, podczas gdy transfektanty U87 barwiły się słabo, ale wyraźnie pozytywnie przeciwciałem anty-CD26 (fig. 9). Oprócz tego, stwierdzono, że subpopulacje świeżo izolowanych PBMC są silnie pozytywne pod względem ekspresji CD26 (figura 9).
Zależny od stężenia wpływ RANTES(1-68) i RANTES(3-68) na wytwarzanie wirusowego antygenu p24 przez szczep BaL w komórkach HOS.CD4.CCR5 w obecności sCD26 przedstawiono na figurze 10. Dodanie sCD26, wraz z RANTES(1-68) na początku zakażenia HIV, istotnie zwiększa aktywność przeciwwirusową RANTES w komórkach HOS.CD4.CCR5. Gdy sCD26 w stężeniu 50 U/l dodano wraz z RANTES, uzyskano IC50 równe 13 nM dla RANTES. Dodanie sCD26 samego nie wywoływało działania na replikację wirusa. Dodanie sCD26 do RANTES(3-68) nie zmieniało aktywności przeciwwirusowej RANTES(3-68) (danych nie przedstawiono). Tak więc, obecność CD26 jest istotna dla wywołania aktywności przeciwwirusowej RANTES.
Skracanie końca aminowego naturalnej MIP-1 α nie wpływa na jego aktywność przeciwko HIV-1, ani aktywność chemotaktyczną i mobilizującą Ca2+
Ponieważ większość naturalnego MlP-1 α ulega skróceniu na końcu NH2 (cztery aminokwasy), zbadano czy skrócenie MIP-1a (5-70) zmienia zdolność do hamowania HIV-1. W przeciwieństwie do wyników otrzymanych dla RANTES, nie zaobserwowano różnicy w wartości IC50 pomiędzy kompletnym MlP-1a i MIP-1a(5-70) w PBMC albo w komórkach transfekowanych CCR5 (tabela V, fig. 8). Poza tym, kompletne MlP-1 a i skrócone MIP-1 a (5-70) porównano w testach na komórkach THP-1 pod kątem chemotaksji i mobilizacji wewnątrzkomórkowej Ca2+. Tabela VI pokazuje, że minimalna dawka skuteczna MIP-1 a(5-70) wywołująca wzrost [Ca2+]j była tylko nieco niższa niż w przypadku kompletnego MlP-1 a. Ponadto, mimo, że maksymalna migracja uzyskana przy 0,13 nM w teście chemotaksji była wyższa dla kompletnego MlP-1 a, minimalne stężenie skuteczne obu izoform MlP-1 a było raczej podobne. Podsumowując, należy wnioskować, że obróbka końca NH2 MIP-1 a w przeciwieństwie do RANTES, jedynie minimalnie osłabia aktywność zapalną i anty-HIV-1.
T a b e l a V
Aktywność przeciwko HIV-1 RANTES i MlP-1a w komórkach PBMC pobudzonych PHA, U87.CD4.CCR5
| RANTES(1-68) | RANTES(3-68) | MIP-1a (1-70) | MIP-1 a (5-70) | |||||
| IC50 | IC50 | IC50 | IC90 | IC50 | IC90 | IC50 | IC90 | |
| PBMC | ||||||||
| BaL | 3,4 | 71 | 0,39 | 6,9 | 1,9 | 62 | 1,6 | 13 |
| SF162 | 23 | 95 | 2,0 | 8,2 | 3,1 | 30 | 3,6 | 32 |
| U87.CD4.CCR5 | ||||||||
| BaL | 21 | >130 | 0,65 | 63 | ND | ND | ND | ND |
| HOS.CD4.CCR5 | ||||||||
| BaL | >130 | >130 | 5,5 | >130 | 32 | >130 | 21 | >130 |
Miano wirusa monitorowano przez ELISA na antygen p24 w nadsączu bezkomórkowym 8-12 dni po zakażeniu. Pokazano średnie IC50 i IC90 (w nM). Dane opowiadają średnim z dwóch do czterech niezależnych doświadczeń. Wartość oznaczona jako „>130 wskazuje, że nie osiągnięto zahamowania 50% albo 90% przy stężeniu 130 nM. ND, nie badano.
PL 196 427 B1
T a b e l a VI
Brak różnicy w aktywności biologicznej pomiędzy kompletną i skróconą wersją MlP-1a
| Chemokina | Chemotaksja* | Wzrost | [Ca2+]i+ | |
| nM | CI | nM | nM[Ca2+]i | |
| MIP-1a (1-70) | 1,3 | 8,5±3,3 | 3,9 | 240/195 |
| 0,13 | 22,2±4,4 | 0,39 | 120/130 | |
| 0,013 | 5,7±1,6 | 0,34 | 30/14 | |
| 0,0013 | 4,0±3,1 | |||
| MIP-1a (5-70) | 1,3 | 14,2±0,4 | 4,0 | 196/178 |
| 0,13 | 11,4±2,9 | 0,4 | 71/33 | |
| 0,013 | 3,8±1,4 | 0,04 | 10/<10 | |
| 0,0013 | 2,1 ±0,6 |
‘Migracja monocytów THP-1 przez pory 0,5 μ(τι w mikrokomorze. Wyniki stanowią średnią ± trzech niezależnych doświadczeń. +Detekcja wzrostu [Ca2+] i w komórkach THP-1. Przedstawiono wyniki dwóch niezależnych doświadczeń.
Literatura
Baggiolini M. i in., Ann. Rev. Immunol., 55, 97-179, 1994.
Baggiolini M. i in., Ann. Rev. Immunol., 15, 675-705, 1997.
Clark-Lewis I. i in., J. Biol. Chem., 266, 23128-23134, 1991.
De Meester I. i in., J. Immunol. Methods 189, 99-10526, 1996.
Deng H. i in., Nature, 381,661-666, 1996.
Gong J. i in. J. Exp. Med., 181,631-640, 1995.
Gong J. i in., J. Biol. Chem. 271, 10521-10527, 1996.
Grynkiewicz G. i in., J. Biol. Chem., 260, 3440, 1985.
Proost P. i in., Biochemistry, 32, 10170-10177, 1993a.
Proost P. i in., J. Immunol., 150, 1000-1010, 1993.
Proost P. i in., Cytokine, 7, 97-104, 1995.
Proost P. i in., Methods: A companion to Methods in Enzymol., 10, 82, 1996.
Proudfoot A. E. i in., J. Biol. Chem., 271,2599-2603, 1996.
Sambrook et al, Molecular Cloning: A laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Schall T. J. i in., J. Immunol., 141, 1918-1025, 1988.
Schols D. i in., J. Exp. Med., 186, 1383-1388, 1997.
Sozzani S. i in., J. Immunol., 152, 3615, 1994.
Taub D. i in., Cytokine & Growth Factor Reviews, 7, 335-76, 1996.
Van Damme J. i in., Eur. J. Biochem., 181,337-344, 1989.
Van Damme J. i in., Eur. J. Immunol., 20, 2113-8, 1990.
Van Damme J. i in., J. Exp. Med., 176, 59, 1992.
Walz A. i in., Biochem. Biophys. Res. Commun., 159, 969-75, 1989.
Wuyts A., i in., Biochemistry, 36, 2716-2723, 1997.
PL 196 427 B1
Claims (11)
- Zastrzeżenia patentowe1. BiałkoRANTES skróconena końcu aminowym o sekwencji aminokwasowejld. Sekw. nr2 i sOtywenśoi setsgneiktyozenj względem ohnmnOie.
- 2. Białko RANTES skrócone πο końcu aminewymmwynług zzstrz. 1, zznmieenntym. że jent w pnetsoi glionzmlnwseej.
- 3. Cząsteeozi DNT onejmujecosokweeojekNT kondjecobiałko RANTESskrócońonokońcu smienwym noreślnee w zsetrz. 1, w tym eeoweeoje egolentmdnwe zsesdeiozn tsoie esme.
- 4. Weotnr eoeprekmjem neejmgjcom ozceteozoę NTN noreślnes w zsetrz. 3.
- 5. Knmcros gnepndsrzs neejmgjcos weotnr eoeprekmjem noreślnem w zsetrz. 4.
- 6. epneCb reknmeiesomjem wmtwsrzseis eisłos noreślnoegn w zsetrz. 1, znamienny tym, że neejmgje hndnwseie w ndpnwiedeiej pnemwoe hndnwlseej onmcroi noreślneej w zsetrz. 5.
- 7. Bisłon wedłgg zsetrz. 1 slbn 2 dn zsetnenwseis json leo.
- 8. Zsetnenwseie bisłos noreślnoegn w zsetrz. 1 slbn 2 dn wmtwsrzseis leog dn leozeeis i/lge disgenetmoi ohnrnbm, w otcrej oneieozes jeet sotmwenść setsgneietmozes wnbeo dzisłseis ohemnoie, onrzmeteie ohnrCb zspslemoh, zsoseecis HIV, ohnrCb zwiczsemoh z segingeeezc i hemstnpnezc nrsz enwntwnrCw.
- 9. Komupnzmje 1armusokjymoąo azwierajmco kkgetanoje cozneo wras a j jenom albe wielomu dnpgezozslemmi fsrmsoegtyozeie enśeiosmi i/lge zsrCeosmi, znamienna tym, że json egeetsooję ozmees neejmgje eisłon noreślnee w zsetrz. 1 slen 2.
- 10. ZastokowyrłieCZ22/DNP IV d d wenwerzzniakomupnzmji farr^nusokjymoąoj j d leeozkial/iug disgenznwseis ohnrCe, w otCrmoh sotmwenść setsgneietmozes wneeo dzisłseis ohemnoie jeet wmmsgses.
- 11. Zzstokowenieweeługzzstrz.1 0,z znmieenntym. że komupnzmja s ee przzeąosozńoddlej ozeeis ohnrCe zspslemoh, ndpnrenśoinwmoh nrsz zsosźemoh.RysunkiRANTES-23 1 4MKVSAARLAV ilaatalcap asaspyssdt tpccfayiar plprahikey fytsgkcsnp awftrknr qvcanpekkw vreyinslem s
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97116863A EP0906954A1 (en) | 1997-09-29 | 1997-09-29 | Amino-terminal truncated c-c chemokines as chemokine antagonist |
| EP97122471A EP0905240A1 (en) | 1997-09-29 | 1997-12-19 | Amino-terminally truncated c-c chemokines as chemokine antagonists |
| EP98104216A EP0905241A1 (en) | 1997-09-29 | 1998-03-10 | Amino-terminally truncated c-c chemokines as chemokine antagonists |
| PCT/EP1998/006143 WO1999016877A1 (en) | 1997-09-29 | 1998-09-28 | Amino-terminally truncated rantes as chemokine antagonists |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL339545A1 PL339545A1 (en) | 2000-12-18 |
| PL196427B1 true PL196427B1 (pl) | 2008-01-31 |
Family
ID=8227408
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL339545A PL196427B1 (pl) | 1997-09-29 | 1998-09-28 | Białko RANTES skrócone na końcu aminowym, rekombinacyjny sposób jego wytwarzania oraz jego zastosowanie, cząsteczki DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza i kompozycja farmaceutyczna, oraz zastosowanie CD26/DPP IV |
| PL339559A PL197569B1 (pl) | 1997-09-29 | 1998-09-28 | Skrócone na końcu aminowym białko MCP-2, rekombinacyjny sposób jego wytwarzania oraz jego zastosowanie, cząsteczki DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza i kompozycja farmaceutyczna |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL339559A PL197569B1 (pl) | 1997-09-29 | 1998-09-28 | Skrócone na końcu aminowym białko MCP-2, rekombinacyjny sposób jego wytwarzania oraz jego zastosowanie, cząsteczki DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza i kompozycja farmaceutyczna |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US6905676B2 (pl) |
| EP (6) | EP0906954A1 (pl) |
| JP (2) | JP4233214B2 (pl) |
| KR (2) | KR100560275B1 (pl) |
| CN (3) | CN1148447C (pl) |
| AR (2) | AR013528A1 (pl) |
| AT (3) | ATE263242T1 (pl) |
| AU (2) | AU750606B2 (pl) |
| BG (2) | BG64757B1 (pl) |
| BR (2) | BR9812565A (pl) |
| CA (2) | CA2304827A1 (pl) |
| CY (1) | CY1110927T1 (pl) |
| CZ (2) | CZ299478B6 (pl) |
| DE (3) | DE69838188T2 (pl) |
| DK (3) | DK1439231T3 (pl) |
| EA (2) | EA003940B1 (pl) |
| EE (2) | EE200000151A (pl) |
| ES (3) | ES2215324T3 (pl) |
| HU (2) | HU226468B1 (pl) |
| IL (2) | IL135351A (pl) |
| NO (2) | NO20001584D0 (pl) |
| NZ (3) | NZ516027A (pl) |
| PL (2) | PL196427B1 (pl) |
| PT (3) | PT1019507E (pl) |
| SK (2) | SK286439B6 (pl) |
| UA (2) | UA73080C2 (pl) |
| WO (2) | WO1999016877A1 (pl) |
| ZA (2) | ZA988675B (pl) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7067117B1 (en) | 1997-09-11 | 2006-06-27 | Cambridge University Technical Services, Ltd. | Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response |
| US6989435B2 (en) | 1997-09-11 | 2006-01-24 | Cambridge University Technical Services Ltd. | Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response |
| AU1616499A (en) * | 1997-12-01 | 1999-06-16 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Chemokine variants and methods of use |
| US7238711B1 (en) | 1999-03-17 | 2007-07-03 | Cambridge University Technical Services Ltd. | Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response |
| EP1167527A1 (en) * | 2000-06-22 | 2002-01-02 | Euroscreen S.A. | Processed human chemokines PHC-1 and PHC-2 |
| AU1259501A (en) * | 1999-10-25 | 2001-05-08 | Euroscreen S.A. | Processed human chemokines phc-1 and phc-2 |
| WO2001036459A2 (en) * | 1999-11-15 | 2001-05-25 | Forssmann Wolf Georg | Novel use of hcc-2 |
| CA2316405A1 (en) * | 2000-05-26 | 2001-11-26 | Ian Clark-Lewis | Modulation of inflammation by protease products |
| EP1176200A3 (de) | 2000-06-20 | 2005-01-12 | Switch Biotech Aktiengesellschaft | Verwendung von Polypeptiden oder diese kodierende Nukleinsäuren zur Diagnose oder Behandlung von Hauterkrankung oder Wundheilung sowie ihre Verwendung zur Indentifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen |
| UA77950C2 (en) * | 2000-10-04 | 2007-02-15 | Applied Research Systems | Use of mutants of cc chemokines for treatment of multiple sclerosis |
| GB2373785A (en) * | 2001-03-28 | 2002-10-02 | Rega Inst For Medical Res | Truncating chemokines using dipeptidyl peptidase IV |
| AU2002358144B2 (en) | 2001-12-17 | 2008-10-02 | Laboratoires Serono Sa | Chemokine mutants acting as chemokine antagonists |
| EP1631680A2 (en) * | 2003-05-21 | 2006-03-08 | Bayer HealthCare AG | Diagnostics and therapeutics for diseases associated with dipeptidylpeptidase iv (dpp4) |
| DE102005049637A1 (de) * | 2005-10-14 | 2007-04-26 | Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen | Antagonisten gegen die Interaktion von PF4 und RANTES |
| MX2010001307A (es) | 2007-08-02 | 2010-07-30 | Novimmune Sa | Anticuerpos anti-proteína regulada con la activación, expresada y secretada por los linfocitos t normales y metodos de uso de los mismos. |
| WO2011097567A1 (en) * | 2010-02-08 | 2011-08-11 | Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona, Acting For And On Behalf Of Arizona State University | Rantes multiplexed assay, rantes variants related to disease, and rantes variants related to enzymatice activity |
| JP5975886B2 (ja) | 2010-03-11 | 2016-08-23 | ヘルス リサーチ インコーポレイテッドＨｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ． | Ｆｃ融合タンパク質を含む、免疫応答を増強するための方法および組成物 |
| TW201718851A (zh) * | 2015-09-18 | 2017-06-01 | 通用醫院公司 | 具有抗化學排斥(anti-fugetactic)性質之經修飾自然殺手細胞及其用途 |
| WO2019229615A1 (en) | 2018-05-28 | 2019-12-05 | Université De Genève | Methods of inhibiting cerebral inflammation |
| US11629196B2 (en) | 2020-04-27 | 2023-04-18 | Incelldx, Inc. | Method of treating SARS-CoV-2-associated hypercytokinemia by administering a human monoclonal antibody (PRO-140) that inhibits CCR5/CCL5 binding interactions |
| US11402391B2 (en) | 2020-12-21 | 2022-08-02 | Incelldx, Inc. | Methods of treating a long-hauler subject for chronic COVID-19 by administering a CCR5 or CCL5 antagonist |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0311107A3 (en) | 1987-10-08 | 1990-04-18 | Stichting REGA V.Z.W. | Anti-hiv active 3'-fluoro-purine-2',3'-dideoxyribosides |
| US5739103A (en) * | 1993-11-12 | 1998-04-14 | Dana-Farber Cancer Institute | Chemokine N-terminal deletion mutations |
| JPH10510151A (ja) * | 1994-12-08 | 1998-10-06 | グラクソ、グループ、リミテッド | Ｒａｎｔｅｓペプチドおよびフラグメント並びにそれを含んでなる炎症治療用組成物 |
| AU1532697A (en) * | 1996-01-12 | 1997-08-01 | Genetics Institute Inc. | Beta-chemokine, h1305 (mcp-2) |
| WO1997035982A2 (en) * | 1996-03-27 | 1997-10-02 | Icos Corporation | Monocyte chemotactic protein-5 materials and methods |
| FR2748938B1 (fr) * | 1996-05-22 | 1998-07-31 | Pasteur Institut | Utilisation de molecules antagonistes de chemokines pour leur activite antivirale notamment contre un retrovirus de type vih |
| US6168784B1 (en) * | 1997-09-03 | 2001-01-02 | Gryphon Sciences | N-terminal modifications of RANTES and methods of use |
-
1997
- 1997-09-29 EP EP97116863A patent/EP0906954A1/en not_active Withdrawn
- 1997-12-19 EP EP97122471A patent/EP0905240A1/en not_active Withdrawn
-
1998
- 1998-03-10 EP EP98104216A patent/EP0905241A1/en not_active Withdrawn
- 1998-09-22 ZA ZA9808675A patent/ZA988675B/xx unknown
- 1998-09-22 ZA ZA9808676A patent/ZA988676B/xx unknown
- 1998-09-28 ES ES98947553T patent/ES2215324T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 CN CNB988095726A patent/CN1148447C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-28 NZ NZ516027A patent/NZ516027A/en unknown
- 1998-09-28 DE DE69838188T patent/DE69838188T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 AR ARP980104819A patent/AR013528A1/es active IP Right Grant
- 1998-09-28 EE EEP200000151A patent/EE200000151A/xx unknown
- 1998-09-28 EA EA200000379A patent/EA003940B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 PL PL339545A patent/PL196427B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 PL PL339559A patent/PL197569B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 PT PT98951476T patent/PT1019507E/pt unknown
- 1998-09-28 UA UA2000042496A patent/UA73080C2/uk unknown
- 1998-09-28 HU HU0003563A patent/HU226468B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 NZ NZ503234A patent/NZ503234A/en unknown
- 1998-09-28 EP EP04007579A patent/EP1439231B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 CA CA002304827A patent/CA2304827A1/en not_active Abandoned
- 1998-09-28 UA UA2000042499A patent/UA73081C2/uk unknown
- 1998-09-28 AT AT98951476T patent/ATE263242T1/de active
- 1998-09-28 DK DK04007579T patent/DK1439231T3/da active
- 1998-09-28 HU HU0003505A patent/HU226414B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 AR ARP980104820A patent/AR013529A1/es active IP Right Grant
- 1998-09-28 KR KR1020007003019A patent/KR100560275B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-28 EP EP98951476A patent/EP1019507B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 EA EA200000378A patent/EA003942B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 PT PT98947553T patent/PT1021541E/pt unknown
- 1998-09-28 BR BR9812565-6A patent/BR9812565A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-09-28 CN CNB988095696A patent/CN1145693C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-28 DE DE69823218T patent/DE69823218T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 PT PT04007579T patent/PT1439231E/pt unknown
- 1998-09-28 CZ CZ20001146A patent/CZ299478B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 WO PCT/EP1998/006143 patent/WO1999016877A1/en not_active Ceased
- 1998-09-28 AU AU94420/98A patent/AU750606B2/en not_active Ceased
- 1998-09-28 BR BR9812394-7A patent/BR9812394A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-09-28 SK SK450-2000A patent/SK286439B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 ES ES98951476T patent/ES2218860T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 WO PCT/EP1998/006142 patent/WO1999016876A1/en not_active Ceased
- 1998-09-28 CN CNB031492991A patent/CN1233415C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-28 EE EEP200000152A patent/EE200000152A/xx unknown
- 1998-09-28 DK DK98951476T patent/DK1019507T3/da active
- 1998-09-28 JP JP2000513947A patent/JP4233214B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-28 EP EP98947553A patent/EP1021541B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 CA CA002305017A patent/CA2305017A1/en not_active Abandoned
- 1998-09-28 AT AT04007579T patent/ATE368742T1/de active
- 1998-09-28 DK DK98947553T patent/DK1021541T3/da active
- 1998-09-28 NZ NZ503235A patent/NZ503235A/xx unknown
- 1998-09-28 CZ CZ20001147A patent/CZ299479B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 KR KR1020007003020A patent/KR100542934B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-28 DE DE69822856T patent/DE69822856T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 ES ES04007579T patent/ES2287601T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-28 AT AT98947553T patent/ATE264390T1/de active
- 1998-09-28 SK SK451-2000A patent/SK286495B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-09-28 AU AU97474/98A patent/AU750341B2/en not_active Ceased
- 1998-09-28 JP JP2000513946A patent/JP4230659B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-03-22 BG BG104267A patent/BG64757B1/bg unknown
- 2000-03-22 BG BG104266A patent/BG64679B1/bg unknown
- 2000-03-27 NO NO20001584A patent/NO20001584D0/no not_active Application Discontinuation
- 2000-03-28 NO NO20001609A patent/NO20001609D0/no unknown
- 2000-03-28 US US09/537,859 patent/US6905676B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-28 US US09/537,858 patent/US6977071B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-29 IL IL135351A patent/IL135351A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-03-29 IL IL135352A patent/IL135352A/en not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-03-07 US US11/072,454 patent/US7326411B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-05-06 US US11/123,089 patent/US7338653B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-05-18 US US11/131,221 patent/US20050220790A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-10-08 CY CY20071101290T patent/CY1110927T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL196427B1 (pl) | Białko RANTES skrócone na końcu aminowym, rekombinacyjny sposób jego wytwarzania oraz jego zastosowanie, cząsteczki DNA, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza i kompozycja farmaceutyczna, oraz zastosowanie CD26/DPP IV | |
| EP0869812B1 (en) | C-c chemokines that inhibit retrovirus infection | |
| KR100837898B1 (ko) | 다발성 경화증의 치료에서 사용되는 케모킨 변이체 | |
| MXPA00002881A (en) | Amino-terminally truncated rantes as chemokine antagonists |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20090928 |