SK286439B6

SK286439B6 - MCP-2 skrátený na aminokonci, DNA molekuly, expresný vektor, hostiteľská bunka, rekombinantný spôsob jeho prípravy, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie

Info

Publication number: SK286439B6
Application number: SK450-2000A
Authority: SK
Inventors: Paul Proost; Sofie Struyf; Damme Jo Van
Original assignee: Laboratoires Serono Sa
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-28
Publication date: 2008-10-07
Also published as: IL135352A; US7326411B2; ZA988676B; EE200000151A; DK1439231T3; DE69823218D1; PL197569B1; HUP0003505A3; SK4512000A3; CZ299479B6; UA73081C2; CY1110927T1; AR013529A1; DK1019507T3; JP4230659B2; EE200000152A; AU9747498A; EP1021541B1; EP1439231B1; NZ503234A

Abstract

Je opísaný monocytový chemotaktický proteín MCP-2, skrátený na aminokonci, ktorému chýbajú NH2-koncové aminokyseliny zodpovedajúce aminokyselinovým zvyškom 1 až 5 prirodzene sa vyskytujúcich MCP-2 a ktorý má chemokínový antagonistický účinok. Ďalej vynález poskytuje cDNA sekvencie, ktoré ich kódujú, ich použitie na liečbu a/alebo diagnostiku ochorení, pri ktorých je nutná antagonistická aktivita proti účinkom chemokínov, a farmaceutické prostriedky s ich obsahom.

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka monocytových chemotaktických proteínov MCP-2, skrátených na aminokonci, ktorým chýbajú NH₂-koncové aminokyseliny zodpovedajúce aminokyselinovým zvyškom 1 až 5 prirodzene sa vyskytujúcich MCP-2, a majú chemokinový antagonistický účmok, ako aj cDNA sekvencií, ktoré ich kódujú, ich použitia na liečbu a/alebo diagnostiku ochorení, pri ktorých je nutná antagonistická aktivita proti účinkom chemokínov a farmaceutických prostriedkov s ich obsahom,

Doterajší stav techniky

Chemokíny predstavujú rodinu malých prozápalových cytokínov s leukocytovými chemotaktickými a aktivačnými vlastnosťami. V závislosti od polohy prvých cysteínov, je možné chemokínovú rodinu rozdeliť na C-C, C-X-C a C-X3-C chemokíny (Baggiolini M. a ďalší, 1994; Baggiolini M. a ďalší, 1997 a Taub D. a ďalší, 1996).

Mnohé C-X-C chemokíny, ako interleukín-8 (IL-8), sú chemotaktické pre neutrofily, zatiaľ čo C-C chemokíny, ako monocytový chemotaktický proteín-3 (MCP-3) majú vplyv na rôzne leukocyty, vrátane monocytov, lymfocytov, eozinofilov, bazofilov, NK buniek a dentrických buniek.

NH₂-koncová doména chemokínov sa podieľa na viazaní receptora a spracovanie NH₂-konca môže buď aktivovať chemokíny, znižovať ich chemokinový účinok, alebo chemokíny úplne inaktivovať.

C-X-C chemokinový trombocytový základný proteín sa stáva neutrofilným chemotaktickým peptidom (NAP-2) až po odstránení 24 NH₂-koncových zvyškov (Walz A. a ďalší, 1989 a Van Damme J. a ďalší, 1990).

Výsledkom odstránenia až 8 NH₂-koncových zvyškov z IL-8 je posilnenie chemotaktickej aktivity, ale ďalšie štiepenie Glu-Leu-Arg motívu, ktorý je umiestený pred prvým Cys vo všetkých neutrofilných chemotaktických C-X-C chemokínoch, spôsobuje úplnú inaktiváciu (Clark-Lewis I a ďalší, 1991).

Podobná NH₂-koncová proteolýza (do 8 aminokyselín) iného C-X-C chemokínu, granulocytového chemotaktického proteínu-2 (GCP-2), nemá žiadny vplyv na neutrofilný chemotaktický účinok (Proost P. et al, 1993a).

Syntetické C-C chemokíny MCP-1, MCP-3 a RANTES, ktorým chýba 8 až 9 NH₂-koncových aminokyselín, nemajú účinok na monocyty a sú užitočné ako antagonisty receptorov (Gong J. a ďalší, 1996; a Gong J. a ďalší, 1995).

Výsledkom predĺženia RANTES o jeden metionin je úplná inaktivácia molekuly a Met-RANTES sa správa ako antagonista autentického RANTES (Proudfoot A. E. a ďalší, 1996).

Prehľadávaním rôznych knižníc odvodených od stimulovaných periférnych krvných lymfocytov (PBL) versus od PBL v pokoji, cDNA sondami sa izoloval kloň ľudského MCP-2 (monocytový chemotaktický proteín-2) (najprv bol nazývaný „HC14“, Chang H. C. a ďalší, 1989). Proteínová sekvencia odvodená od cDNA bola rovnaká ako sekvencia purifikovaného prirodzeného MCP-2. Izolovali sa však aj predpokladané alelické varianty, v ktorých bol Gln46 nahradený Lys46 (Van Coillie a ďalší, 1997).

MCP-2 sa syntetizoval aj chemickou technikou na tuhom základe (Proost P. a ďalší, 1995).

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu sú monocytové chemotaktické proteíny MCP-2, skrátené na aminokonci, ktorým chýbajú NH₂-koncové aminokyseliny zodpovedajúce aminokyselinovým zvyškom 1 až 5 prirodzene sa vyskytujúceho MCP-2, a ktoré majú antagonistický účinok proti chemokínom.

Podľa jedného uskutočnenia je poskytnutý MCP-2 (6 až 76), ktorý je MCP-2 bez 1 až 5 NH₂-koncových aminokyselín, ako je znázornené na obrázku 1 a v sekvencií č. 3 alebo sekvencií č. 4.

Takéto MCP-2 skrátené na aminokonci podľa vynálezu môžu byť v glykozylovanej alebo v neglykozylovanej forme.

Výraz „antagonista chemokínu“ znamená činidlo, „ktoré účinkuje ako antagonista na zrelé, kompletné, prirodzene sa vyskytujúce chemokíny“.

Ďalším predmetom vynálezu sú DNA molekuly, ktoré obsahujú DNA sekvencie kódujúce MCP-2 skrátené na aminokonci podľa vynálezu, vrátane v podstate rovnakých nukleotidových sekvencií.

„V podstate rovnaké nukleotidová sekvencie“ zahŕňajú všetky iné sekvencie nukleových kyselín, ktoré vďaka degenerácii genetického kódu tiež kódujú dané aminokyselinové sekvencie.

Vynález zahŕňa aj expresné vektory, ktoré obsahujú uvedené DNA, hostiteľské bunky transformované takýmito vektormi a spôsob prípravy takýchto MCP-2 skrátených na aminokonci podľa vynálezu, prostredníctvom kultivácie uvedených transformovaných buniek vo vhodnom kultivačnom médiu.

DNA sekvencia kódujúca proteíny podľa vynálezu môže byť začlenená a ligovaná do vhodného plazmidu. Keď sa vytvorí expresný vektor, začlení sa do vhodnej hostiteľskej bunky, ktorá potom exprimuje vektor (vektory), čím sa vytvorí požadovaný proteín.

Expresia ktoréhokoľvek z rekombinantných proteínov podľa vynálezu, ako bolo uvedené, sa môže uskutočňovať v eukaryotických bunkách (napr. kvasinkách, hmyzích alebo cicavčích bunkách) alebo v prokaryotických bunkách, použitím príslušných expresných vektorov. Je možné použiť akúkoľvek metódu známu z doterajšieho stavu techniky.

DNA molekuly kódujúce proteíny, ktoré boli získané ktorýmkoľvek z uvedených spôsobov, sa napríklad začlenia do príslušne skonštruovaných expresných vektorov technikami známymi v oblasti (pozri Sambrook a ďalší, 1989). Dvojvláknová cDNA sa spája s plazmidovými vektormi spájaním homopolymémych koncov alebo reštrikčným spájaním zahŕňajúcim použitie syntetických DNA spojovníkov, alebo technikami ligácie zatupených koncov. Na ligáciu DNA sú použité DNA ligázy a nežiaducemu spájaniu sa predchádza ošetrením alkalickou fosfatázou.

Aby bol expresný vektor schopný exprimovať požadovaný proteín, mal by obsahovať aj špecifické nukleotidové sekvencie, ktoré obsahujú transkripčné a translačné regulačné informácie spojené s DNA kódujúcou požadovaný proteín takým spôsobom, že dovoľujú expresiu génu a výrobu proteínu. Aby sa gén transkriboval, musí byť pred ním promótor, ktorý rozoznáva RNA polymeráza, a na ktorý sa polymeráza viaže a tak iniciuje transkripčný proces. Existuje množstvo takýchto promótorov, ktoré sa používajú, a ktoré pracujú s rozličnou účinnosťou (silné a slabé promótory).

Pre eukaryotických hostiteľov môžu byť použité rôzne transkripčné a translačné regulačné sekvencie, v závislosti od povahy hostiteľa. Môžu byť odvodené z vírusových zdrojov, ako napríklad adenovírusov, hovädzieho papiloma vírusu, opičieho vírusu alebo podobne, pri ktorých sú regulačné signály spojené s konkrétnym génom, ktorý má vysokú hladinu expresie. Príkladmi sú TK promótor Herpes vírusu, SV40 skorý promótor, kvasinkový gal4 génový promótor atď. Môžu sa vybrať transkripčné iniciačné regulačné signály, ktoré umožňujú inhibovanie a aktiváciu, takže je možné modulovať expresiu génov.

DNA molekuly obsahujúce nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje proteín podľa vynálezu, sa začleňujú do vektora (vektorov), ktoré majú operačne spojené transkripčné a translačné regulačné signály, ktoré sú schopné interagovať s požadovanými génovými sekvenciami v hostiteľskej bunke.

Bunky, ktoré boli stabilne transformované zavedením DNA, sa môžu vybrať zavedením aj jedného alebo viacerých markerov, ktoré umožňujú výber hostiteľských buniek, ktoré obsahujú expresný vektor. Markér môže poskytovať fototrofiu auxotrofickému hostiteľovi, biocídnu rezistenciu, napríklad proti antibiotikám alebo ťažkým kovom, ako napríklad medi a podobne. Gén selektovateľného markera môže byť buď priamo spojený s DNA génovou sekvenciu, ktorá sa má exprimovať, alebo môže byť zavedený do rovnakej bunky kotransfekciou. Na optimálnu syntézu proteínu podľa vynálezu môžu byť potrebné aj ďalšie elementy.

Dôležité faktory pri výbere konkrétneho plazmidového alebo vírusového vektora zahŕňajú: jednoduchosť, s ktorou sa recipientné bunky, ktoré obsahujú vektor, dajú rozoznať a odselektovať od tých recipientných buniek, ktoré neobsahujú vektor; množstvo kópií vektora, ktoré sú potrebné pre konkrétneho hostiteľa; a či sa požaduje prenos vektora medzi hostiteľskými bunkami rôznych druhov.

Po príprave vektora (vektorov) alebo DNA sekvencie, ktorá obsahuje konštrukt (konštrukty) môže byť táto zavedená na expresiu DNA konštruktu (konštruktov) do hostiteľskej bunky ktorýmkoľvek z rôznych vhodných prostriedkov: transformáciou, transfekciou, konjugáciou, fúziou protoplastov, elektroporáciou, precipitáciou s fosforečnanom vápenatým, priamou mikroinjekciou atď.

Hostiteľské bunky môžu byť buď prokaryotické alebo eukaryotické. Výhodní sú eukaryotickí hostitelia, napr. cicavčie bunky, ako ľudské, opičie, myšie a bunky vajíčok čínskeho škrečka (CHO), pretože poskytujú proteínovým molekulám post-translačné modifikácie, vrátene správneho vyformovania alebo glykozylácie na správnych miestach. Tiež kvasinkové bunky uskutočňujú post-translačné peptidové modifikácie vrátane glykozylácie. Existuje množstvo rekombinantných DNA stratégií, ktoré využívajú silné promótorové sekvencie a plazmidy s vysokým počtom kópií, ktoré môžu byť použité na výrobu požadovaných proteínov v kvasinkách. Kvasinky rozoznávajú vedúce sekvencie klonovaných cicavčích génových produktov a vylučujú peptidy obsahujúce vedúce sekvencie (t. j. pre-peptidy).

Po zavedení vektora (vektorov) rastú hostiteľské bunky v selekčnom médiu, ktoré je selektívne pre rast buniek obsahujúcich vektor. Výsledkom expresie klonovanej génovej sekvencie (sekvencií) je výroba požadovaných proteínov.

MCP-2 skrátené na aminokonci podľa vynálezu, môžu byť pripravené akýmkoľvek iným postupom známym v oblasti, najmä dobre zavedenými postupmi chemickej syntézy, využívajúcej automatizované peptidové syntezátory na tuhej fáze a následne chromatografickou purifikáciou.

Chemokiny podľa vynálezu môžu byť syntetizované napríklad prostredníctvom Fmoc (9-fluorenylmetoxykarbonyl), tBoc (terc-butoxykarbonyl) alebo inou porovnateľnou chemickou syntézou s alebo bez príslušných ochranných skupín bočných reťazcov na rôznych aminokyselinách. Aminokyseliny s alebo bez príslušných ochranných skupín bočných reťazcov sú vopred aktivované - napr. s HBTU/HOBt [2-(lH-benzo triazol-lyl)-l,l,3,3-tetrametyl-uronium hexafluórfosfát/l-hydroxybenzotriazol)] - a pripájajú sa na rastúci peptidový reťazec. Pred pridaním nasledujúceho zvyšku sa odstráni ochranná skupina (napr. Fmoc) z cc-amino-skupiny. Po syntéze sa odstránia všetky ochranné skupiny a intaktné kompletné peptidy sa purifikujú a chemicky alebo enzymaticky formujú (vrátane vytvárania disulfidových mostíkov medzi cysteínmi) na zodpovedajúce chemokíny podľa vynálezu.

Purifikácia prirodzených, syntetických alebo rekombinantných proteínov sa uskutočňuje ktorýmkoľvek zo spôsobov známych na tento účel, t. j. akýmkoľvek bežným postupom vrátane extrakcie, precipitácie, chromatografie, elektroforézy alebo podobne (pozri napríklad Proost P. a ďalší, 1996). Ďalším purifikačným postupom, ktorý môže byť výhodne použitý na purifikáciu proteínu podľa vynálezu, je afinitná chromatografia s využitím monoklonálnych protilátok alebo afinity ku heparínu, ktorý viaže cieľový proteín, a ktorý sa vytvára a je imobilizovaný na gélovej matrici nachádzajúcej sa vnútri kolóny. Nečisté prípravky obsahujúce proteíny prechádzajú kolónou. Proteín sa naviaže na kolónu prostredníctvom heparínu alebo prostredníctvom špecifickej protilátky, zatiaľ čo nečistoty prejdú. Po premytí sa proteín eluuje z gélu zmenou pH alebo zmenou iónovej sily.

MCP-2, skrátené na aminokonci podľa vynálezu sú užitočné na liečbu a/alebo diagnostiku chorôb, pri ktorý je potrebný antagonistický vplyv na účinok chemokínov. Príklady takýchto ochorení zahŕňajú: zápalové ochorenia, ochorenia týkajúce sa angiogenézy a hematopoézy, nádory, infekčné ochorenia, vrátane HIV, auto-imunitné ochorenia, artériosklerózu, pľúcne ochorenia a kožné poruchy.

Preto ďalšie uskutočnenie predloženého vynálezu predstavuje použitie proteínu podľa vynálezu na výrobu liečiva na liečbu uvedených ochorení.

Liečivo je výhodne vo forme farmaceutického prostriedku, ktorý obsahuje proteíny podľa vynálezu spolu s jedným alebo viacerými farmaceutický prijateľnými nosičmi a/alebo vehikulmi. Takéto farmaceutické prostriedky predstavujú ďalšie uskutočnenie predloženého vynálezu.

Ďalším uskutočnením vynálezu je spôsob liečby uvedených ochorení, ktorý zahŕňa podávanie farmakologicky účinného množstva MCP-2, skrátených na aminokonci podľa vynálezu, jedincom, u ktorých je riziko rozvinutia takýchto ochorení alebo jedincom, ktorí už majú takého patológie.

Vynález bude teraz opísaný prostredníctvom nasledujúcich príkladov, ktoré nemajú byť považujúce za príklady akýmkoľvek spôsobom obmedzujúce predložený vynález. Príklady sa budú odvolávať na opísané obrázky.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 znázorňuje aminokyselinovú sekvenciu MCP-2 a jeho známeho variantu. Signálne sekvencie sú znázornené kurzívou, zatiaľ čo C-zvyšky sú vytlačené tučné. Šípky označujú prvé aminokyseliny MCP-2(6-76) skrátených na aminokonci podľa vynálezu. Podčiarknutá je aminokyselina, ktorou sa MCP-2 variant líši.

Obrázok 2: SDS-PAGE MCP-2 (6-76) skrátených na aminokonci: dráha 1: prirodzený MCP-2 (1-76, 100 ng/dráhu); dráha 2: prirodzený MCP-2 (1-76, 30 ng/dráhu); dráha 3: prirodzený MCP-2 (6-76, 30 ng/dráhu) a dráha 4; syntetický MCP-2 (1-76, 60 ng/dráhu).

Gély bežali v redukujúcich podmienkach a proteíny sa farbili striebrom.

Obrázok 3 znázorňuje porovnanie chemotaktickej potencie modifikovaných MCP-2 foriem. Z hľadiska chemotaktického účinku na THP-1 bunky sa testovali nemodifikovaný prirodzený (nat) a syntetický (syn) MCP-2(l-76), prirodzený MCP-2(6-76) skrátený na NH₂-konci a syntetický MCP-2(l-74) skrátený na COOH-konci. Výsledky predstavujú priemer Cl ± SEM štyroch alebo viacerých nezávislých experimentov.

Obrázok 4: Prirodzený MCP-2 je slabší agonista ako MCP-1, čo sa týka mobilizácie vápnika v monocytoch. Nemodifikovaný MCP-2 (15, 50 a 150 ng/ml) zvyšuje, v závislosti od dávky, [Ca⁺]j v THP-1 bunkách. Znázornený je výsledok jedného reprezentatívneho experimentu z dvoch.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

MCP-2 skrátený na aminokonci

Materiály a metódy

Chemokínový a imunotest

MCP-2 sa syntetizoval a purifikoval, ako už bolo opísané (Proost P. a ďalší, 1995).

Z myší sa získali špecifické anti-ľudské MCP-2 protilátky a afinitne sa purifikovali na Sepharose kolóne, na ktorú bol naviazaný syntetický MCP-2 v podmienkach odporúčaných výrobcom (CNBr aktivovaná Sepharose 4B, Pharmacia, Uppsala, Švédsko).

ELISA platne sa pokryli afinitne purifikovaným anti-ľudským MCP-2 a ako zachytávacia protilátka sa použil biotinylovaný anti-MCP-2. Detekcia sa uskutočňovala peroxidázou značeným streptavidínom a TMB. Detekčný limit pre MCP-2 ELISA bol približne 0,1 ng/ml.

Výroba a purifikácia MCP-2

Monocytové chemotaktické proteíny sa purifikovali z upraveného média odvodeného periférnych krvných mononukleámych buniek od 132 darcov krvi, ktoré sa získalo od Blood Transfusion Centers of Antwerp and Leuven (Proost P. a ďalší, 1996).

Erytrocyty a granulocyty sa odstránili sedimentáciou v hydroxyetylovom škrobe (Fresenius AG, Bad Homburg, Nemecko) a centrifugáciou v gradiente roztoku metriazoátu sodného (Lymphoprep; Nyegaard, Oslo, Nórsko).

Mononukleáme bunky (60 x 10⁹ buniek) sa inkubovali (5 x 10⁶ buniek/ml) s 10 pg/ml Noc A a 2 pg/ml LPS. Po 48 až 120 hodinách sa zozbieralo upravené médium a udržiavalo sa pri -20 °C až do purifikácie.

Prirodzený MCP-2 sa purifikoval štvorstupňovým purifikačným postupom, ako bolo predtým opísané (Proost P. a ďalší, 1996).

Stručne, upravené médium sa koncentrovalo na skle so stanovenými otvonni alebo kyseline kremičitej a čiastočne sa purifikovalo afinitnou chromatografiou na Heparín-Sepharose kolóne (Pharmacia).

Frakcie majúce MCP-2 imunoreaktivitu sa ďalej purifikovali Mono S (Pharmacia) katiónovou výmennou chromatografiou a eluovali sa v NaCl gradiente pri pH 4,0.

Prirodzené MCP-2 sa purifikovali, až kým neboli homogénne, prostredníctvom RP-HPLC na C-8 Aquapore RP-300 kolóne (Perkin Elmer, Norwalk CT) ekvilibrovanej s 0,1 % kyselinou trifluóroctovou TFA. Proteíny sa eluovali v acetonitrilovom gradiente.

Biochemická charakterizácie MCP-foriem prostredníctvom SDS-PAGE, aminokyselinovej sekvenčnej analýzy a hmotnostnej spektroskopie

Čistota frakcií z kolóny sa skúmala prostredníctvom SDS-PAGE v redukujúcich podmienkach na Tris/tricínových géloch (Proost P. a ďalší, 1996). Proteíny sa farbili striebrom a boli použité nasledujúce proteínové markery relatívnej molekulovej hmotnosti (Mr): OVA (Mr 45 000), anhydráza kyseliny karboxylovej (Mr 31 000), sójový trypsínový inhibítor (Mr 21 500), β-laktoglobulín (Mr 18 400), lyzozým (Mr 14 400) a aprotinín (Mr 6 500).

NHj-koncová sekvencia purifikovaných chemokínov sa stanovila Edmanovou degradáciou na pulznom kvapalnom 477A/120A proteínovom sekvenátore (Perkin Elmer) s N-metylpiperidínom ako spájacou bázou. Blokované proteíny sa štiepili medzi Asp a Pro v 75 % kyseline mravčej počas 50 hodín. Fragmenty poštiepené kyselinou mravčou sa sekvenovali bez ďalšej purifikácie.

Molekulová hmotnosť MCP-2 sa stanovila pomocou laserovej desorpčnej ionizácie s použitím matrice v závislosti od času v hmotnostnom spektrometri (by matrix-assisted laser desorption ionization/time of flight-mass spektromery -MALDI/TOF-MS) (Micromass TofSpec, Manchester, UK). Kyselina a-kyano-4-hydroxyškoricová bola použitá ako matrica a cytochróm C ako vnútorný štandard.

Detekcia chemotaktického účinku

MCP-2 sa testoval z hľadiska jeho chemotaktickej potencie na čerstvo purifikovaných monocytoch (2 x x 10⁶ buniek/ml) alebo monocytových THP-1 bunkách (0,5 x 10⁶ buniek/ml; 2 dni po subkultivácii) v Boydenovej mikrokomôrke použitím polykarbonátových membrán ošetrených polyvinylpyrolidónom s priemerom pórov 5 pm.

Vzorky a bunky sa nariedili v HBSS (Life technologies/Gibco BRL, Paisley, Škótsko), do ktorého bol doplnený 1 mg/ml ľudský sérový albumín (Red Cross Belgium). Po dvoch hodinách inkubácie pri 37 °C sa bunky fixovali a farbili Diff-Quick farbiacimi roztokmi (Harleco, Gibbstown, NJ), a potom sa bunky nechali prechádzať cez membrány, kde sa mikroskopicky spočítavali v desiatich olejových imerzných poliach pri 500-násobnom zväčšení.

Chemotaktický index (Cl) vzorky (trojmo v každej komôrke) sa vypočítal ako počet buniek, ktoré prechádzali do vzorky, delený počtom buniek, ktoré prechádzali do kontrolného média (Van Damme J. a ďalší, 1992).

Na desenzibilizujúce experimenty sa bunky inkubovali s biologicky neúčinnými chemokínovými variantmi počas 10 minút pri 37 “C pred tým, ako sa umiestnili do hornej priehradky Boydenovej mikrokomôrky. % inhibície Cl sa vypočítalo použitím Cl z HBSS ošetrených buniek vo vzťahu ku vzorke ako referenčnej hodnote.

Detekcia vnútrobunkových Ca²⁺ koncentrácií

Vnútrobunkové koncentrácie vápnika ([Ca²⁺]j) sa merali tak, ako už bolo opísané (Wuyts A. a ďalší, 1997). Purifikované monocyty alebo THP-1 bunky (10⁷ buniek/ml) sa inkubovali vEagle's minimálnom esenciálnom médiu (EMEM, Gibco) + 0,5 % FCS s indikátorom fluorescencie fura-2 (fura-2/AM 2,5 μΜ; Molecular Probes Európe BV, Leiden, Holandsko) a 0,01 % Pluronic F-127 (Sigma, St Louis MO).

Po 30 minútach pri 37 °C sa bunky dvakrát premyli a znovu sa rozsuspendovali v koncentrácii 10⁶ buniek/ml v HBSS s 1 mM Ca²⁺ a 0,1 % FCS (tlmené 10 mM Hepes/NaOH pri pH 7,4). Predtým, ako sa merala fura-2 fluorescencia v LS50B luminiscenčnom spektrofotometri (Perkin Elmer), ekvilibrovali sa bunky pri 37 °C počas 10 minút.

Po excitácii pri 340 a 380 nm sa detegovala fluorescencia pri 510 nm. [Ca²~J, sa vypočítal z Grynkiewiczovej rovnice (Grynkiewicz a ďalší, 1985). Na stanovenie R,_Ililx sa bunky lyžovali s 50 μΜ digitonínu. Následne sa nastavila hodnota pH na 8,5 20 mM Tris a R_rnm sa získala pridaním 10 mM EGTA do lyzovaných buniek. Použitá K_d bola 224 nM.

Pri desenzibilizačných experimentoch sa monocyty alebo THP-1 bunky najprv stimulovali tlmivým roztokom, chemokínom alebo antagonistom chemokínu v rôznych koncentráciách. Ako druhý stimulant sa použil MCP-2 v koncentrácii, ktorá indukuje významný nárast koncentrácie [Ca²⁺]j po predchádzajúcej stimulácii tlmivým roztokom. Druhý stimulant sa aplikoval 2 minúty po pridaní prvého stimulantu. % inhibície zvýšenia koncentrácie [Ca²⁺]; ako odpovede na druhý stimulant sa vypočítalo porovnaním signálu po predstimulácii s chemokínom alebo antagonistom chemokínu so signálom po pridaní tlmivého roztoku.

Výsledky

Izolácia post-translačne modifikovaných MCP-2 foriem

Špecifická a citlivá ELISA bola použitá na sledovanie rôznych MCP-2 foriem vytvorených periférnymi krvnými mononukleámymi bunkami stimulovanými mitogénom a endotoxínom.

Upravené médium sa purifikovalo v súlade so štandardným izolačným postupom (Proost P. a ďalší, 1996), vrátane adsorpcie na sklo so stanovenými pórmi a heparínovej Sepharose chromatografie.

Následne sa uskutočnila purifikácia prostredníctvom FPLC mono S katiónovej výmennej chromatografie a potom sa aplikoval ďalší purifikačný krok s C-8 RP HPLC. Prostredníctvom SDS-PAGE a MALDI/TOFMS sa zmerali molekulové hmotnosti.

Izolovali sa rôzne formy MCP-2: okrem autentického 7,5 kD MCP-2(l-76) sa do homogenity purifikovala 7 kDa forma MCP-2 skrátená na NH₂-konci, ktorej chýba päť zvyškov (MCP-2(6-76)] prostredníctvom RP-HPLC a identifikovala sa prostredníctvom analýzy aminokyselinovej sekvencie (obrázok 2). Výsledkom MALDI/TOF-MS (tabuľka 1) bola molekulová hmotnosť 8881 Da pre intaktný MCP-2 (teoretická Mr má hodnotu 8893 Da), zatiaľ čo pre MCP-2(6-76) sa namerala molekulová hmotnosť 8365 Da, čo potvrdilo deléciu piatich NH₂-koncových aminokyselín (teoretická Mr má hodnotu 8384 Da). Funkčné porovnanie týchto prirodzených MCP-2 foriem v THP-1 chemotaktickom teste ukázalo, že intaktný MCP 2 je účinný ešte pri 5 ng/ml, zatiaľ čo skrátený MCP-2(2-76) je zbavený chemotaktického účinku, keď sa testuje v koncentrácii v rozsahu od 0,6 do 60 ng/ml (obrázok 3). Intaktný prirodzený MCP-2 sa porovnával aj z hľadiska potencie so syntetickým MCP-2(l-76) a syntetickou formou skrátenou na COOH-konci (Proost P. a ďalší, 1995), ktorej chýbajú dva zvyšky - MCP-2(l-74).

Zistilo sa, že minimálna chemotaktická koncentrácia týchto foriem je tiež 5 ng/ml (obrázok 3). Hoci je v chemotaktických testoch špecifický účinok prirodzených intaktných MCP-1 a MCP-2 porovnateľný (Van Damme J, a ďalší, 1992), schopnosť MCP-2 mobilizovať vápnik je diskutabilná.

Ale v experimentoch s mobilizáciou Ca²⁺ bola minimálna účinná dávka pre tak prirodzený, ako aj syntetický MCP-2(l-76) desaťnásobne vyššia v porovnaní s dávkou prirodzeného intaktného MCP-l(l-76) (obrázok 4), zatiaľ čo MCP-2(6-76) ostával neaktívny.

Napriek tomu bol intaktný MCP-2 (50 ng/ml) schopný znižovať účinok MCP-2 (15 ng/ml) a MCP-3 (10 ng/ml), čoho výsledkom bola 52 %, respektíve 45 % inhibícia chemotaxie.

Z dôvodu tohto nižšieho špecifického účinku MCP-2 v Ca²⁺ teste, uskutočňovala sa desenzibilizácia chemotaxie prostredníctvom MCP-2(6-76) v Boydenovej mikrokomôrke. Keďže je známe, že MCP-2 desenzibilizuje krížovo s MCP-1, MCP-2 a MCP-3 v monocytovom chemotaktickom teste (Sozzani S. a ďalší, 1994), skúmali sme, či prirodzený intaktný MCP-2(6-76) môže tiež znižovať účinok MCP-1, MCP-2, MCP-3 a RANTES (tabuľka 2). Už preinkubácia THP-1 buniek so 100 ng/ml neaktívneho MCP-2(6-76) mohla významne inhibovať chemotaxiu indukovanú 10 ng/ml MCP-1 (63 %), 5 ng/ml MCP-2 (75 %), 30 ng/ml MCP-3 (62 %) a 100 ng/ml RANTES (75 %). Navyše 100 ng/ml MCP-2(6-76) sa úplne (91-100 %) inhibovala chemotaxia indukovaná trojnásobne nižšími koncentráciami príslušných MCP. MCP-2(6-76) bol navyše ešte v tak malej koncentrácii, ako je 10 ng/ml, schopný významne inhibovať chemotaktický účinok vyvolaný MCP-1 (3 ng/ml), MCP-2 (1,5 ng/ml) alebo MCP 3 (10 ng/ml) a RANTES (30 ng/ml). Je možné zhrnúť, že MCP-2(6-76) sa vyrába prirodzene, je neúčinný ako chemoatraktant a antagonizuje niekoľko C-C chemokínov, pričom tento účinok je najväčší pri MCP-3.

Tabuľka 1

Biochemická charakterizácia prirodzených foriem MCP-2. Analýza NľL-koncových aminokyselín a porovnanie experimentálnych (SDS-PAGE a MALDI/TOF-MS) a teoretických Mr C-8 RP-HPLC purifikovaných prirodzených MCP-izoforiem

MCP-forma	NH₂-koncová sekvencia	Mr (Da)
	teoretická neglykozylovaný	SDS-PAGE	MALDI/TOF-MS
MCP-2 (1-76)	blokovaná	8893	7500	8881
MCP-2 (2-76)	SIPITCC	8384	7000	8365

Tabuľka 2

MCP-2(6-76) znižuje účinok monocytových chemotaktických odpovedí MCP-1, MCP-2, MCP-3 a RANTES v mikrokomôrke

Chemokín³	Koncentrácia	Antagonizácia chemotaktickej odpovede ^,c	% Inhibície chemotaxie
		tlmivý roztok	100 ng/ml MCP-2(6-76)
MCP-1	10	22,3 ± 7,9	8,3 ±3,8	63 ±21
	3	15,0 + 8,0	1,3 ±0,3	99 ±1,0
MCP-2	5	36,0 ± 12,6	10,8 ±6,1	75 ± 8,0
	1,5	6,7 ±1,4	1,5 ±0,3	91 ±7,0
MCP-3	30	13,2 + 0,4	6,0 ± 4,0	62 ±31
	10	3,0 ±1,5	<1	100 ±0,0
RANTES	100	6,3 ±0,8	2,6 ± 1,3	75 ±19
	30	4,0 ± 0,8	1,5 ±0,3	77 ± 16
MCP-1	10	12,7 ±2,3	10,5 ±3,8	24 ± 1,8
	3	7,5 ± 0,0	3,0 ±0,3	69 ± 4,0
MCP-2	5	38,0 ± 5,3	27,2 ± 4,9	30 ± 6,0
	1,5	18,3 ±4,6	9,2 ± 1,4	45 ±23
MCP-3	30	13,2 ± 1,9	8,0 ± 1,0	37 ± 19
	10	7,7 ±1,4	1,7 ±0,3	90 ± 6,0
RANTES	100	5,5 ±0,6	5,8 ±0,9	17 ±7,0
	30	3,2 ±0,7	2,5 ±0,5	39 ± 18

^a MCP-1, MCP-2, MCP-3 alebo RANTES sa pridali ako chemotaktické faktory do spodných priehradok ^b vrchné priehradky mikrokomôrky sa naplnili THP-1 bunkami pedinkubovanými sMCP2(6-76) alebo s tlmivým roztokom ^c priemer Cl ± SEM troch nezávislých experimentov

Zoznam sekvencií (1) Všeobecné informácie:

(i) Prihlasovateľ:

(A) Meno: APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V.

(B) Ulica: 14 JOHN B. GORSIRAWEG (C) Mesto: CURACAO (E) Krajina: Holandské Antily (F) Poštový kód (ZIP): žiadny (G) Telefón: 639300 (H) Telefax: 614129 (ii) Názov vynálezu: MCP-2 skrátené na aminokonci ako antagonisty chemokínov (iii) Počet sekvencií: 4 (iv) Forma snímateľná počítačom:

(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: kompatibilný s IBM PC (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTVÉR: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (2) Informácie pre sekv. č.: 1:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 99 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Počet vlákien:

(D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (iii) Hypotetická: nie (ix) Znaky:

(A) Meno/Kľúč: proteín (B) Poloha:1..76 (xi) Opis sekvencie: sekv. č.: 1:

Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Met Ala Ala Thr -20 -15-10

Phe Ser Pro Gin Gly Leu Ala Gin Pro Asp Ser Val Ser íle Pro íle -5 15

Thr Cys Cys Phe Asn Val íle Asn Arg Lys íle Pro íle Gin Arg Leu 10 15 2025

Glu Ser Tyr Thr Arg íle Thr Asn íle Gin Cys Pro Lys Glu Ala Val 30 3540 íle Phe Lys Thr Lys Arg Gly Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu 45 5055

Arg Trp Val Arg Asp Ser Met Lys His Leu Asp Gin íle Phe Gin Asn 60 6570

Leu Lys Pro (2) Informácie o sekv. č.: 2:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 99 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Počet vlákien:

(A) Meno/Kľúč: proteín (B) Poloha:1..76 (xi) Opis sekvencie: sekv. č.: 2:

Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Met Ala Ala Thr -20 -15-10

Phe Ser Pro Gin Gly Leu Ala Gin Pro Asp Ser Val Ser íle Pro íle -5 15

Thr Cys Cys Phe Asn Val íle Asn Arg Lys íle Pro íle Gin Arg Leu 10 15 2025

Glu Ser Tyr Thr Arg íle Thr Asn íle Gin Cys Pro Lys Glu Ala Val 30 3540 íle Phe Lys Thr Gin Arg Gly Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu 45 5055

Arg Trp Val Arg Asp Ser Met Lys His Leu Asp Gin íle Phe Gin Asn 60 6570

Leu Lys Pro (2) Informácie o sekv. č.: 3:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 71 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Počet vlákien:

(D) Topológia: lineárna (ii) Type molekuly: proteín (iii) Hypotetická: nie (xi) Opis sekvencie: sekv. č.: 3:

Ser íle Pro íle Thr Cys Cys Phe Asn Val íle Asn Arg Lys íle Pro 15 1015 íle Gin Arg Leu Glu Ser Tyr Thr Arg íle Thr Asn íle Gin Cys Pro

2530

Lys Glu Ala Val íle Phe Lys Thr Lys Arg Gly Lys Glu Val Cys Ala

4045

Asp Pro Lys Glu Arg Trp Val Arg Asp Ser Met Lys His Leu Asp Gin

5560 íle Phe Gin Asn Leu Lys Pro

6570 (2) Informácie o sekv. č.: 4:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 71 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Počet vlákien:

(D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (iii) Hypotetická: nie (xi) Opis sekvencie: sekv. č.: 4:

Ser íle Pro íle Thr Cys Cys Phe Asn Val íle Asn Arg Lys íle Pro

1015 íle Gin Arg Leu Glu Ser Tyr Thr Arg íle Thr Asn íle Gin Cys Pro

2530

Lys Glu Ala Val íle Phe Lys Thr Gin Arg Gly Lys Glu Val Cys Ala

4045

Asp Pro Lys Glu Arg Trp Val Arg Asp Ser Met Lys His Leu Asp Gin

5560 íle Phe Gin Asn Leu Lys Pro

Claims

1. Monocytový chemotaktický proteín-2, MCP-2, skrátený na aminokonci, ktorému chýbajú NH₂koncové aminokyseliny zodpovedajúce aminokyselinovým zvyškom 1 až 5 prirodzene sa vyskytujúceho MCP-2, a ktorý má antagonistický účinok proti chemokínom.

2. MCP-2, skrátený na aminokonci podľa nároku 1, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu rovnakú ako sekvencia č. 3 alebo sekvencia č. 4.

3. MCP-2, skrátený na aminokonci podľa jedného alebo viacerých predchádzajúcich nárokov v glykozylovanej forme.

4. DNA molekuly, ktoré obsahujú DNA sekvencie kódujúce MCP-2, skrátené na aminokonci podľa jedného alebo viacerých predchádzajúcich nárokov, zahŕňajúce všetky iné sekvencie nukleových kyselín, ktoré vďaka degenerácii genetického kódu tiež kódujú dané MCP-2, skrátené na aminokonci.

5. Expresný vektor, ktorý obsahuje DNA molekulu podľa nároku 4.

6. Hostiteľská bunka, ktorá obsahuje expresný vektor podľa nároku 5.

7. Rekombinantný spôsob prípravy proteínov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až3,vyznačuj ú c i sa t ý m , že zahŕňa kultiváciu buniek podľa nároku 6 v príslušnom kultivačnom médiu.

8. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 spolu s jedným alebo viacerými farmaceutický prijateľnými nosičmi a/alebo vehikulmi.

9. Proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 na použitie ako liečivo.

10. Použitie proteínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 na výrobu liečiva na liečbu a/alebo diagnos5 tiku chorôb, pri ktorých sa vyžaduje antagonizovanie účinkov chemokínov.

11. Použitie podľa nároku 10 na výrobu liečiva na liečbu zápalových chorôb, HlV-infekcie, chorôb týkajúcich sa angiogenézy a hematopoézy a nádorov.