ES2287601T3 - Rantes truncados en el animo terminal como antagonistas de quimioquina. - Google Patents
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Abstract
Utilización de CD26/DPP IV para preparar un medicamento para la terapia y/o diagnóstico de infección por VIH.
Description
Rantes truncados en el amino terminal como
antagonistas de quimioquina.
La presente invención se refiere a CD26/DPP IV
para su utilización en terapia o diagnóstico y a la utilización de
CD26/DPP IV para preparar un medicamento para la terapia y/o el
diagnóstico de la infección por VIH.
Las quimioquinas constituyen una familia de
citoquinas pequeñas proinflamatorias con propiedades quimiotácticas
y activadoras de leucocitos. Dependiendo de la posición de las
primeras cisteínas, la familia de las quimioquinas puede dividirse
en quimioquinas C-C,
C-X-C y
C-X_{3}-C (Baggiolini M. et
al., 1994; Baggiolini M. et al., 1997 y Taub D. et
al., 1996).
Muchas quimioquinas
C-X-C como la interleuquina 8
(IL-8) son quimiotácticas para neutrófilos, mientras
que las quimioquinas C-C, como la proteína
quimiotáctica para monocitos 3 (MCP-3), son activas
en varios leucocitos incluyendo monocitos, linfocitos, eosinófilos,
basófilos, células NK y células dendríticas.
El dominio NH_{2} terminal de las quimioquinas
está implicado en la unión al receptor y el procesamiento NH_{2}
terminal puede activar a las quimioquinas, reducir su actividad
quimioquina o dar lugar a quimioquinas completamente inactivas.
La proteína básica de plaquetas quimioquina
C-X-C, resulta un péptido
quimiotáctico para neutrófilos (NAP-2) únicamente
después de la eliminación de los 24 restos NH_{2} terminales (Walz
A. et al., 1989 y Van Damme J. et al., 1990).
La eliminación de hasta 8 restos NH_{2}
terminales de IL-8 resulta en una actividad
quimiotáctica incrementada, pero una eliminación adicional de la
secuencia Glu-Leu-Arg, que está
localizada delante de la primera Cys en todas las quimioquinas
C-X-C quimiotácticas para
neutrófilos, produce una inactivación completa
(Clark-Lewis I. et al.,
1991).
1991).
Una proteolisis NH_{2} terminal similar (hasta
8 aminoácidos) de otra quimioquina
C-X-C, la proteína quimiotáctica
para granulocitos-2 (GCP-2), no
tiene efecto en la actividad quimiotáctica para neutrófilos (Proost
P. et al., 1993a).
RANTES (es un acrónimo de "Regulado por
Activación, Normalmente Expresado en T, y presumiblemente
Secretado") es una quimioquina C-C, cuyo clon de
ADNc ha sido aislado de una biblioteca de ADNc enriquecida en
secuencias específicas de células T (Schall T.J. et al.,
1988).
Las quimioquinas C-C sintéticas
MCP-1, MCP-3 y RANTES que no
presentan los aminoácidos NH_{2} terminales 8 a 9 son inactivas
para monocitos y resultan útiles como antagonistas de receptor (Gong
J. et al., 1996; y Gong J. et al., 1995).
La extensión de RANTES con una metionina resulta
en la completa inactivación de la molécula y
Met-RANTES se comporta como un antagonista del
RANTES auténtico (Proudfoot A.E. et al., 1996).
La presente invención se encuentra en el área de
RANTES truncados en el extremo amino terminal, que carecen de los
aminoácidos NH_{2} terminales que corresponden a los restos de
aminoácidos 1, 1-2, 1-3 ó
1-4 del RANTES natural y que presentan actividad
antagonista de quimioquina.
Un asunto particular de la presente invención se
refiere a RANTES (3-68), que es RANTES que carece de
los 2 primeros aminoácidos, como se muestra en la Figura 1 y en SEQ
ID NO: 2.
Los RANTES truncados en el extremo amino
terminal de la invención pueden estar en forma glicosilada o no
glicosilada.
El término "antagonista de quimioquina"
significa "que actúa como antagonista de las quimioquinas
naturales maduras de longitud completa".
Otro asunto de la invención se refiere a
moléculas de ADN que comprenden las secuencias de ADN que codifican
los RANTES truncados en el extremo amino terminal de la invención,
incluyendo secuencias de nucleótidos sustancialmente iguales. La
secuencia de ADNc de RANTES intacto se describe en Schall T.J. et
al. (1988) y el ADNc de los RANTES truncados puede deducirse
fácilmente.
"Las secuencias de nucleótidos sustancialmente
iguales" incluyen todas las secuencias de ácido nucleico que, en
virtud de la degeneración del código genético, también codifican las
secuencias de aminoácidos dadas.
Se ha purificado CD26/dipeptidil peptidasa IV
humana (CD26/DPP IV; EC 3.4.14.5) (De Meester et al. Journal
of Immunological Methods, 189 (1996) p. 99-105).
La invención también ilustra vectores de
expresión que comprenden los ADN anteriores, células anfitrionas
transformadas con dichos vectores y un procedimiento para la
preparación de los RANTES truncados en el extremo amino terminal de
la invención, mediante el cultivo de las mencionadas células
transformadas en medios de cultivo apropiados.
La secuencia de ADN que codifica las proteínas
ilustradas por la invención puede insertarse y ligarse en un
plásmido apropiado. Una vez formado, el vector de expresión se
introduce en una célula anfitriona apropiada que expresa entonces
el o los vectores para rendir la proteína deseada.
La expresión de cualquiera de las proteínas
recombinantes deseadas ilustradas, como se menciona en la presente
memoria, puede realizarse en células eucariotas (e.j. levaduras,
células de insecto o de mamífero) o células procariotas, utilizando
los vectores de expresión apropiados. Puede utilizarse cualquier
método conocido en la
técnica.
técnica.
Por ejemplo, las moléculas de ADN que codifican
las proteínas obtenidas mediante cualquiera de los métodos
anteriores se insertan en vectores de expresión construidos de
manera apropiada mediante técnicas conocidas en la técnica (véase
Sambrook et al., 1989). Se une ADNc de doble cadena a
vectores plasmídicos por adición de colas homopoliméricas o por
unión de restricción que implica la utilización de ligandos de ADN
sintéticos o técnicas de ligado de extremos romos: se utilizan ADN
ligasas para ligar las moléculas de ADN y las uniones no deseadas
se evitan mediante tratamiento con fosfatasa alcalina.
Con el fin de ser capaz de expresar la proteína
deseada, un vector de expresión debe comprender además secuencias
de nucleótidos específicas que contengan información de regulación
de la transcripción y la traducción unidas al ADN que codifica la
proteína deseada, de manera tal que se permita la expresión génica y
la producción de la proteína. En primer lugar, para que el gen se
transcriba, debe estar precedido de un promotor que sea reconocible
por la ARN polimerasa, al que la polimerasa se una y se inicie de
esta manera el proceso de transcripción. Actualmente, se están
utilizando varios promotores de estas características que funcionan
con diferentes eficacias (promotores fuertes y débiles).
Para anfitriones eucariotas, se pueden utilizar
diferentes secuencias reguladoras de la transcripción y la
traducción, dependiendo de la naturaleza del anfitrión. Pueden
obtenerse de fuentes víricas, como adenovirus, virus de papiloma
bovino, virus de Simio o semejantes, en los que las señales
reguladoras están asociadas con un gen particular que presenta un
nivel de expresión alto. Como ejemplos están el promotor TK del
virus del Herpes, el promotor temprano de SV40, el promotor del gen
gal4 de levaduras, etc. Las señales de regulación de la iniciación
de la transcripción pueden seleccionarse de forma que permitan
represión y activación, de manera que pueda modularse la expresión
de los genes.
La molécula de ADN que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica la proteína ilustrada por la invención, se
inserta en vectores que presentan las señales reguladoras de la
transcripción y la traducción unidas de manera operativa, que son
capaces de integrar las secuencias del gen deseado en la célula
anfitriona.
Las células que han sido transformadas de manera
estable con el ADN introducido pueden seleccionarse si se
introducen también uno o más marcadores que permitan la selección de
las células anfitrionas que contengan el vector de expresión. El
marcador también puede conferir prototrofía a un anfitrión
auxotrófico, resistencia a biocidas, e.j. a antibióticos, o metales
pesados como el cobre, o semejantes. El gen marcador que permite la
selección puede unirse directamente a las secuencias de genes de ADN
que se quieren expresar, o puede introducirse en la misma célula
mediante cotransfección. Para la síntesis óptima de proteínas de la
invención pueden necesitarse también elementos adicionales.
En la selección de un plásmido particular o de
un vector vírico, existen factores de importancia, que incluyen: la
facilidad con la que las células receptoras, que contienen el
vector, pueden ser reconocidas y seleccionadas de las células
receptoras que no contienen el vector; el número de copias del
vector que se desean en un anfitrión particular; y si resulta
deseable tener la capacidad de "intercambiar" el vector entre
células anfitrionas de diferentes
especies.
especies.
Una vez que el vector o vectores o la secuencia
de ADN que contiene la o las construcciones se ha preparado para la
expresión, la o las construcciones de ADN pueden introducirse en una
célula anfitriona apropiada mediante cualquiera de los diferentes
medios adecuados: transformación, transfección, conjugación, fusión
de protoplasto, electroporación, precipitación calcio fosfato,
microinyección directa, etc.
Las células anfitrionas pueden ser procariotas o
eucariotas. Los anfitriones eucariotas son preferidos, e.j. células
de mamífero, como células humanas, de mono, ratón, y células de
ovario de hamster chino (CHO), debido a que proporcionan
modificaciones posteriores a la traducción de las moléculas de
proteína, incluyendo plegamiento correcto o glicosilación en los
sitios correctos. Las células de levadura también pueden llevar a
cabo modificaciones posteriores a la traducción de péptidos
incluyendo glicosilación. Existen varias estrategias de ADN
recombinante que utilizan secuencias de promotor fuertes y un
número alto de copias de plásmidos que pueden utilizarse para la
producción de las proteínas deseadas en levaduras. Las levaduras
reconocen secuencias líder en productos génicos de mamífero
clonados y secretan péptidos que presentan secuencias líder (es
decir, prepéptidos).
Después de la introducción del vector o de los
vectores, se crecen las células anfitrionas en un medio selectivo
que selecciona el crecimiento de las células que contienen el
vector. La expresión de la o las secuencias génicas clonadas
resulta en la producción de las proteínas deseadas.
Los RANTES truncados en el extremo amino
terminal ilustrados por la invención, pueden prepararse por
cualquier método conocido en la técnica, en particular, mediante
los procedimientos de síntesis química conocidos, utilizando
sintetizadores de péptidos en fase sólida automatizados seguidos de
purificación cromatográfica.
Las quimioquinas ilustradas por la invención
pueden ser sintetizadas, por ejemplo, por Fmoc
(9-fluorenilmetoxicarbonil), tBoc
(t-butoxicarbonil) o por cualquier otra síntesis
química comparable con o sin grupos de protección apropiados de la
cadena lateral en los diferentes aminoácidos. Los aminoácidos con o
sin grupos de protección apropiados de la cadena lateral se
preactivan - e.j. con HBTU/HOBt [hexafluorofosfato de
2-(1H-Benzotriazol-1il)-1,1,3,3-tetrametiluromio/1-hidroxibenzotriazol)-
y se acoplan a la cadena peptídica en crecimiento. Antes de la
adición del siguiente resto, el grupo de protección (e.j. Fmoc) se
elimina del grupo \alpha-amino. Después de la
síntesis, se eliminan todos los grupos de protección, se purifican
los péptidos intactos de longitud completa y se pliegan por medios
químicos o enzimáticos (incluyendo la formación de puentes
disulfuro entre las cisteínas) en las quimioquinas correspondientes
de la invención.
La purificación de las proteínas naturales,
sintéticas o recombinantes, se lleva a cabo por cualquiera de los
métodos conocidos para este fin, es decir, cualquier procedimiento
convencional que implique extracción, precipitación, cromatografía,
electroforesis, o semejantes (véase por ejemplo Proost P. et
al., 1996). Un procedimiento de purificación adicional que
puede utilizarse preferentemente para purificar la proteína de la
invención, es la cromatografía de afinidad utilizando anticuerpos
monoclonales, o afinidad por heparina, que unen la proteína diana y
que son producidos e inmovilizados en una matriz de gel contenida en
una columna. Las preparaciones impuras que contienen las proteínas
se pasan a través de la columna. La proteína se unirá a la columna
mediante el anticuerpo específico, mientras que las impurezas
eluirán. Después de lavar, la proteína se eluye del gel por un
cambio en el pH o en la fuerza iónica.
Los RANTES truncados en el extremo amino
terminal son útiles en la terapia y/o diagnóstico de las
enfermedades en las que se requiere una actividad antagonista de
los efectos de las quimioquinas. Ejemplos de estas enfermedades
incluyen: enfermedades inflamatorias, enfermedades relacionadas con
angiogénesis y hematopoyesis, tumores, enfermedades infecciosas,
incluyendo VIH, enfermedades autoinmunes, aterosclerosis,
enfermedades pulmonares y trastornos de la piel. La utilización
preferida es en el campo de la infección por VIH.
También se ha visto que CD26/DPP IV es capaz de
generar RANTES truncados en el extremo NH_{2} terminal in
vitro. RANTES es la primera citoquina que se conoce cuya
actividad biológica puede modificarse por CD26/DPP IV.
Por lo tanto, la presente invención está
dirigida a CD26/DPP IV para su utilización en la terapia y/o
diagnóstico de las enfermedades, preferiblemente en las que se
requiere una actividad antagonista de los efectos de las
quimioquinas, con atención particular a enfermedades inflamatorias,
inmunes e infecciosas.
Esto representa el primer ejemplo de un
mecanismo identificado, regulado de manera endógena, para la
modificación de quimioquinas en un antagonista, semejante al
procesamiento fisiológico pero mediado por otros factores
(proteasas). La utilización de dichos factores (proteasas) en la
terapia y/o diagnóstico de las enfermedades anteriores también se
ilustra en esta invención.
La invención se describirá a continuación por
medio de los Ejemplos siguientes, que no deben considerarse en
ningún modo limitativos de la presente invención. La invención se
refleja mediante las reivindicaciones adjuntas. Los Ejemplos se
referirán a las Figuras especificadas más abajo.
Figura 1: muestra las secuencias de aminoácidos
de RANTES. Las secuencias señal se muestran en cursiva,
mientras que los restos C aparecen en negrita. Las flechas
indican los primeros aminoácidos del RANTES truncado en el extremo
amino terminal de la invención, también denominado RANTES
(3-68).
Figura 2: Se compararon las potencias
quimiotácticas de las formas intactas y truncadas en el extremo
amino terminal de RANTES natural o recombinante en células
monocíticas THP-1 en el ensayo Boyden con
microcámara: RANTES natural (1-68) (\Delta),
RANTES natural truncado (3-68) (\Box), RANTES
recombinante intacto (1-68) (\blacktriangle) y
RANTES recombinante (3-68) tratado con CD26/DPP IV
(\blacksquare). Los resultados representan el índice
quimiotáctico medio \pm EE de cuatro o más experimentos
independientes.
Figura 3: Efecto de RANTES natural
(3-68) (\Box), RANTES natural
(1-68) (\Delta), RANTES recombinante
(1-68) (\blacktriangle) y RANTES recombinante
(3-68) tratado con CD26/DPP IV (\blacksquare) en
la [Ca^{2+}]_{i} en células THP-1. Los
resultados representan el incremento medio en
[Ca^{2+}]_{i} \pm EE de tres o más experimentos
independientes.
Figura 4: Muestra la desensibilización de la
actividad movilizadora de Ca^{2+} de RANTESrec intacto
(1-68) por RANTES (3-68). Las
células THP-1 se estimularon en primer lugar con
tampón o con diferentes concentraciones de RANTES recombinante
(1-68) o con RANTES (3-68). Los
resultados representan el incremento medio en
[Ca^{2+}]_{i}
\pm EE (tres o más experimentos independientes) en respuesta a 30 ng/ml de RANTES recombinante intacto como segundo estímulo.
\pm EE (tres o más experimentos independientes) en respuesta a 30 ng/ml de RANTES recombinante intacto como segundo estímulo.
Figura 5: Comparación de la potencia
quimiotáctica de RANTES truncado (3-68) con respecto
a la de RANTES intacto (1-68). Se determinó la
actividad quimiotáctica para granulocitos eosinofílicos de RANTES
natural (nat) y recombinante (rec) truncado, de RANTES intacto y de
MCP-3 sintética en el ensayo en microcámara. Los
resultados representan el índice quimiotáctico medio (CI) \pm EE
de dos o más experimentos independientes (cada uno realizado en
triplicado).
Figura 6: Desensibilización de la movilización
de calcio por RANTES intacto en transfectantes CCR. Los experimentos
de movilización de calcio se llevaron a cabo en células HOS
transfectadas con CD4 y con los receptores de quimioquina CC, CCR1
o CCR5. Las células se estimularon en primer lugar con diferentes
concentraciones de RANTES intacto o truncado, seguido de
estimulación con 100 ng/ml de RANTES intacto. Se muestra el
porcentaje de inhibición del incremento de [Ca^{2+}]_{i}
inducido por el segundo estímulo. Este porcentaje se calculó
comparando la respuesta de 100 ng/ml de RANTES intacto después de la
adición de RANTES (1-68) o RANTES
(3-68), con la respuesta después de la estimulación
con tampón (100%). Los resultados representan el porcentaje de
inhibición medio \pm EE de dos o más experimentos.
Figura 7: Efecto inhibitorio potente de RANTES
(3-68) en la infección de células mononucleares por
VIH-1. Se infectaron PBMC activadas con PHA con la
cepa Ba-L M-trópica de
VIH-1 en presencia de diferentes concentraciones de
RANTES (1-68) o RANTES (3-68) (0 a
1.000 ng/ml añadidos en el momento de la infección). Después de diez
días, se evaluó la producción vírica en el sobrenadante celular
mediante un ELISA Ag p-24 (se muestra un experimento
representativo de cuatro).
Figura 8: Efectos de RANTES
(1-68) y RANTES (3-68) en la
infección por la cepa SF162 de VIH-1 de PBMC
activadas con PHA. Las producciones de virus se evaluaron 10 días
después de la infección en el sobrenadante celular mediante un
ELISA Ag p24. Se muestran los resultados de un experimento
representativo de tres. * Por debajo del límite de detección del
ELISA Ag p24 (<5 pg/ml).
Figura 9: Expresión de CD26 en células
HOS.CD4.CCR5, células U87.CD4.CCR5 y PBMC recién aisladas. El
porcentaje (%) de células CD26 positivas se indica en cada
histograma.
Figura 10: Efectos de RANTES
(1-68), RANTES (1-68) más CD26s (50
U/L), y RANTES (3-68) en la infección de células
HOS.CD4.CCR5 por la cepa BaL de VIH-1. Las
producciones de virus se evaluaron en el sobrenadante celular 8
días después de la infección mediante un ELISA Ag p24. Se muestran
los resultados de un experimento representativo de tres.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El RANTES humano natural fue producido por
células humanas Malavu de hepatosarcoma, células
MG-63 de osteosarcoma o leucocitos de sangre
periférica (Centros de transfusión sanguínea de Amberes y Leuven) y
se purificó como se ha descrito previamente (Proost P. et
al., 1996 y Proost P. et al., 1993).
MCP-2, MCP-3 y GCP-2
se sintetizaron por química Fmoc (Proost P. et al., 1995 y
Wuyts A. et al., 1997), el RANTES humano recombinante se
obtuvo de Peprotech (Rocky Hill, NJ) y MCP-1
recombinante fue una donación del Dr. J.J. Oppenheim
(NCI-NIH, Frederick, MD).
Las células de osteosarcoma humano (HOS)
transfectadas con CD4 y con uno de los receptores de quimioquina
CC, CCR1, CCR3 o CCR5 (Deng H. et al., 1996) se crecieron en
DMEM con glutamax. Se añadió al medio puromicina (1 \mug/ml) como
agente de selección. Todos los medios de crecimiento (Gibco BRL/Life
Technologies, Paisley, UK) se enriquecieron con FCS 10%.
\newpage
CD26/DPP IV humana se obtuvo de prostasomas,
orgánulos derivados de la próstata, que aparecen en forma libre en
el plasma seminal. La enzima se purificó a homogeneidad como se ha
descrito anteriormente utilizando intercambio iónico seguido de
cromatografía de afinidad en adenosina desaminasa (De Meester I.
et al., 1996).
Se incubó durante toda la noche un exceso molar
de quimioquina de 100 a 1.000 con CD26/DPP IV en Tris/HCl 100 mM pH
7,7. Las quimioquinas se separaron de CD26/DPP IV por
SDS-PAGE en un sistema de gel Tris/Tricina como se
ha descrito anteriormente (Proost P. et al., 1996).
Las proteínas se transfirieron a membranas de
PVDF poli(fluoruro de vinilideno) (Problott, Perkin Elmer,
Foster City, CA) por transferencia electroforética y se tiñeron con
azul brillante de Coomassie R250. Después de desteñir, las
membranas se lavaron al menos 5 veces con agua ultrapura (MilliQ;
Millipore, Bedford, MA).
Con el fin de obtener cantidades suficientes de
quimioquina pura truncada para los ensayos biológicos, se trataron
alrededor de 50 \mug de quimioquina recombinante con CD26/DPP IV y
el producto de la escisión se acidificó con ácido trifluoroacético
(TFA) 0,1%. Se añadió Tween 20 (0,01%) para prevenir la adherencia
de las quimioquinas a los
tubos.
tubos.
Las quimioquinas se separaron de CD26/DPP IV en
un gradiente de acetonitrilo en una columna C-8
Aquapore RP-300 (1 x 50 mm) (Perkin Elmer). Se
analizaron las fracciones que contenían proteínas por
SDS-PAGE y se tiñeron con plata como se ha
descrito.
Las quimioquinas tratadas con CD26/DPP IV,
purificadas por RP-HPLC u obtenidas de las
transferencias de PVDF, se secuenciaron por secuenciación NH_{2}
terminal por degradación de Edman en un secuenciador de proteínas
en fase líquida 477A/120A (Perkin Elmer) utilizando
N-metilpiperidina como base de acoplamiento.
Se evaluó la potencia quimiotáctica de las
quimioquinas en granulocitos neutrofílicos (10^{6} células/ml)
recién aislados de sangre periférica o en células monocíticas
cultivadas THP-1 (0,5 x 10^{6} células/ml) en la
microcámara Boyden (Proost P. et al., 1996 y Proost P. et
al., 1993).
Después de 45 minutos (granulocitos) o de 2 h
(células THP-1) de incubación a 37ºC, las células se
fijaron y se tiñeron. Las células que migraron a través de las
membranas de policarbonato de tamaño de poro 5 \mum se contaron
microscópicamente en diez campos de inmersión con aceite.
Se calculó el índice quimiotáctico (C.I.) de una
muestra (triplicados en cada cámara) como el número de células que
migraron a la muestra de ensayo dividido por el número de células
que migraron al medio control. En los experimentos de
desensibilización, las células se incubaron con variantes
biológicamente inactivas de quimioquinas durante 10 minutos a 37ºC
antes de ser transferidas a la cámara.
Se calculó el porcentaje de inhibición del C.I.
obtenido por desensibilización con células control tratadas con
HBSS para la evaluación de la desensibilización de la
quimiotaxis.
Se determinaron las concentraciones de Ca^{2+}
intracelulares ([Ca^{2+}]_{i}) como se ha descrito
anteriormente (Wuyts A. et al., 1997). Brevemente, se
incubaron las células purificadas con el indicador fluorescente
fura-2 (2,5 \muM fura-2/AM,
Molecular Probes Europe BV, Leiden, Holanda) y con Pluronic
F-127 0,01% (Sigma, St. Louis, MO).
Después de 30 minutos, las células se lavaron
dos veces, se resuspendieron en HBSS con Ca^{2+} 1 mM y se
incubaron durante 10 minutos a 37ºC antes de medir la fluorescencia
de fura-2 en un espectrofotómetro de luminiscencia
LS50B (Perkin Elmer). Tras excitación a 340 y 380 nm, se detectó la
fluorescencia a 510 nm. La [Ca^{2+}]_{i} se calculó de
la ecuación de Grynkiewicz (Grynkiewicz G. et al., 1985).
Con el fin de determinar R_{max}, las células
se lisaron con digitonina 50 \muM. Posteriormente, el pH se
ajustó a 8,5 con Tris 20 mM y se obtuvo R_{min} por adición a las
células lisadas de EGTA 10 mM. La K_{d} utilizada para la
calibración fue 224 nM. Para los experimentos de desensibilización,
las células se estimularon en primer lugar con tampón o quimioquina
a diferentes concentraciones. Como segundo estímulo, se añadieron
quimioquinas a una concentración que inducía un incremento
significativo de [Ca^{2+}]_{i} después de la
preestimulación con tampón. Se calculó el porcentaje de inhibición
del incremento de [Ca^{2+}]_{i} en respuesta al segundo
estímulo por preestimulación de las
células.
células.
Las cepas de VIH-1
M-trópicas BaL y SF162 se obtuvieron a través del
proyecto MRC AIDS (Herts, UK). Se aislaron células mononucleares de
sangre periférica (PBMC) de donantes sanos por centrifugación en
gradiente de densidad (5,23) y se estimularon con 1 \mug/ml de
PHA (Sigma, Bornem, Bélgica) durante 3 días a 37ºC. Se lavaron las
células activadas (blastos estimulados con PHA) tres veces con PBS,
y se infectaron con un virus como se ha descrito anteriormente
(Schols D. et al., 1997). Los blastos estimulados con PHA
infectados o no con VIH-1 se cultivaron en
presencia de 25 U/ml de IL-2 y de diferentes
concentraciones de RANTES (1-68) o RANTES
(3-68). Se recogió el sobrenadante celular en el día
10 y se analizó el antígeno principal de VIH-1 en el
sobrenadante mediante un kit de ELISA Ag p-24
(DuPont/NEN Life Science Products, Bruselas, Bélgica).
Se ha aislado previamente una forma diferente
truncada en el extremo NH_{2} terminal de GCP-2
humana (Proost P. et al., 1993). La forma
GCP-2 menos truncada se rompió más allá de la Pro de
la penúltima posición
[GCP-2(3-75)]. Utilizando un
procedimiento estándar de purificación similar, se purificó la
quimioquina C-C RANTES de leucocitos de sangre
periférica o de células de sarcoma (Proost P. et al.,
1996).
En particular, se fraccionaron los medios
condicionados de células MG-63 o de células de
sarcoma Malavu inducidas con una mezcla de citoquinas con el fin de
aislar variantes naturales de las quimioquinas. Las quimioquinas se
purificaron por cromatografía de afinidad con anticuerpo o heparina,
cromatografía de intercambio catiónico (mono S FPLC) y
RP-HPLC, y se detectaron las formas inmunorreactivas
por ELISA específicos de quimioquinas. En la columna de intercambio
catiónico, se encontró que IL-8 eluía muy cerca de
RANTES (entre 0,7 y 0,75 M de NaCl). No obstante, las dos
quimioquinas se separaron por RP-HPLC (eluyendo
RANTES e IL-8 a 27,5% y 30% de acetonitrilo,
respectivamente). Los análisis de la secuencia de aminoácidos de las
proteínas puras, confirmaron que IL-8 aparecía en
diferentes formas truncadas en el extremo NH_{2} terminal, que
habían sido aisladas previamente en base a su actividad
quimiotáctica (Van Damme J. et al., 1989). Sin embargo, sólo
se aisló una única forma de RANTES, que no presentaba dos restos
NH_{2} terminales comparado con el RANTES intacto. En vista de su
presencia predominante, se analizó este RANTES
(3-68) con más detalle para verificar su actividad
quimiotáctica para monocitos y eosinófilos. En particular, se ensayó
RANTES (3-68) para determinar su actividad
quimiotáctica y/o su actividad de liberación de Ca^{2+}
intracelular y se comparó su potencia biológica con la de las
quimioquinas intactas
respectivas.
respectivas.
La deleción NH_{2} terminal de dos residuos de
RANTES, resultó en un descenso considerable de la actividad
quimiotáctica para monocitos y de la liberación de Ca^{2+}.
Comparado con el RANTES natural intacto (dosis mínima eficaz
3-10 ng/ml), el RANTES natural
(3-68) resultó totalmente inactivo cuando se ensayó
a concentraciones tan altas como 300 ng/ml en la microcámara Boyden
(Figura 2). Además, se necesitaron concentraciones de RANTES
natural (3-68) 10 veces mayores en comparación con
el RANTES (1-68) para obtener una respuesta de
Ca^{2+} similar
(Figura 3).
(Figura 3).
Con el fin de investigar si la aminopeptidasa
CD26/DPP IV podría ser responsable del truncamiento NH_{2}
terminal de RANTES, se incubó la quimioquina intacta durante toda la
noche con CD26/DPP IV, se transfirió a membranas de PVDF, se tiñó
con azul de Coomassie y se sometió a degradación de Edman
automática. El tratamiento de RANTES con CD26/DPP IV resultó en la
eliminación de los dipéptidos NH_{2} terminales. Una incubación
paralela de la quimioquina con tampón sin CD26/DPP IV no tuvo
efecto.
Como otras quimioquinas contienen la secuencia
consenso para la rotura por CD26/DPP IV y como se ha demostrado que
el extremo NH_{2} terminal de las MCP es crucial para la actividad
biológica (Gong J. et al., 1996 y Gong J. et al.,
1995), también se incubaron con CD26/DPP IV MCP-1,
MCP-2 y MCP-3.
Después del tratamiento, las MCP se
transfirieron a membranas de PVDF y se tiñeron con azul de Coomassie
para confirmar que se había recuperado una cantidad suficiente de
proteína para la degradación de Edman.
Sin embargo, no se detectó ninguna secuencia
NH_{2} terminal, lo que indica que CD26/DPP IV no altera el
extremo NH_{2} terminal de las MCP que es bloqueado para la
degradación de Edman por un ácido piroglutámico.
De manera similar al RANTES natural
(3-68) el RANTES recombinante purificado por
C-8 RP-HPLC y tratado con CD26/DPP
IV resultó inactivo en experimentos de quimiotaxis en microcámaras
Boyden cuando se utilizó en concentraciones de hasta 1 \mug/ml,
mientras que se detectó una respuesta quimiotáctica significativa
para monocitos con RANTES recombinante intacto de 30 a 100 ng/ml en
adelante (Figura 2).
Cuando se ensayó el efecto del truncamiento en
el ensayo de movilización de Ca^{2+}, RANTES
(3-68) indujo un incremento pequeño pero
significativo a 100 ng/ml. Sin embargo, el RANTES intacto resultó ya
activo a 10 ng/ml (Figura 3). En conclusión, aunque sólo se
eliminaron dos restos NH_{2} terminales, la potencia quimiotáctica
para monocitos y la potencia de movilización de Ca^{2+} de RANTES
disminuyeron de 10 a 100 veces.
En vista de la falta de actividad de RANTES
(3-68) en experimentos de quimiotaxis con monocitos,
ensayamos si este RANTES truncado actúa como un antagonista. RANTES
(3-68), a una concentración de 1 \mug/ml,
desensibiliza casi completamente (82%) para el efecto quimiotáctico
de 100 ng/ml de RANTES intacto (Tabla I).
Cuando se añadió al pocillo superior un exceso
de 3 veces de RANTES (3-68), se inhibió la
quimiotaxis de las células THP-1 para el RANTES
intacto aproximadamente un 50-70%. RANTES
(3-68) a una concentración de 300 ng/ml inhibió
alrededor de un 30% la respuesta quimiotáctica frente a una
concentración igual de RANTES
intacto.
intacto.
En experimentos de movilización de Ca^{2+} con
células THP-1 (Figura 4), 30 ng/ml de RANTES intacto
pudieron desensibilizar para el efecto de 30 ng/ml de RANTES
intacto 39 \pm 5%. Resultaron necesarias concentraciones de
aproximadamente 10 veces mayores de RANTES (3-68)
para obtener el mismo nivel de desensibilización. Sin embargo, a
una concentración de 300 ng/ml, RANTES (3-68)
produjo por sí mismo una respuesta significativa de Ca^{2+}. Esta
respuesta de Ca^{2+} fue comparable a la respuesta obtenida con 30
ng/ml de RANTES intacto.
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\vskip1.000000\baselineskip
En la Tabla II se compara la potencia
quimiotáctica de RANTES natural (3-68) con la de la
proteína quimiotáctica de monocitos MCP-3 y con la
de RANTES intacto (1-68). Se puede observar que
MCP-3 y RANTES (1-68) son
quimiotácticos para monocitos recién aislados de sangre periférica,
a concentraciones de 3 ng/ml y 30 ng/ml, respectivamente, mientras
el RANTES natural (3-68) permanece inactivo a 100
ng/ml.
La potencia quimiotáctica reducida de esta
variante natural, se confirmó con RANTES recombinante
(3-68). Aunque resultó débilmente quimiotáctico
para monocitos (a 1 \mug/ml), el RANTES recombinante
(3-68) purificado mostró una actividad específica
10 veces menor que la del RANTES recombinante intacto.
\newpage
Finalmente, se verificó la potencia
quimiotáctica de RANTES (3-68) en eosinófilos
humanos, que respondieron a 100 ng/ml de RANTES intacto y a 30
ng/ml de MCP-3 (Figura 5). De manera similar a los
monocitos, la migración de eosinófilos fue únicamente estimulada
por RANTES (3-68) a 1 \mug/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para explicar la actividad quimiotáctica
reducida de RANTES (3-68), se verificó la capacidad
de esta variante de quimioquina de unir y señalizar a través de los
receptores utilizados por RANTES conocidos.
Se utilizaron células HOS transfectadas con los
receptores de quimioquinas CCR1, CCR3 o CCR5 en un ensayo de
señalización en el que se determinaron incrementos en la
concentración intracelular de calcio. A concentraciones de hasta
300 ng/ml, RANTES (3-68) no incrementó la
[Ca^{2+}]i en células HOS transfectadas con CCR1 (Tabla
III) o con CCR3 (datos no mostrados), mientras 30 ng/ml y 100 ng/ml
de RANTES intacto resultaron suficientes para inducir un incremento
en [Ca^{2+}]i en los transfectantes CCR1 y CCR3,
respectivamente.
Sin embargo, tanto los RANTES intactos como
truncados fueron capaces de inducir un incremento significativo en
[Ca^{2+}]i en los transfectantes CCR5 a 30 ng/ml. Aún más,
mediante una preincubación de las células transfectadas con CCR5
con un exceso de 3 a 10 veces bien de RANTES (3-68)
o de RANTES intacto, se obtuvo una inhibición igual (alrededor del
75%) del incremento en [Ca^{2+}]i por un pulso subsiguiente
con RANTES intacto (100 ng/ml)
(Figura 6).
(Figura 6).
Por el contrario, una concentración de 300 ng/ml
de RANTES (3-68) sólo desensibilizó de manera
marginal la respuesta de calcio de las células transfectadas con
CCR1 y CCR3 para 100 ng/ml de RANTES intacto, mientras que un
exceso de 3 veces de RANTES intacto como primer estímulo inhibió
casi completamente el incremento de [Ca^{2+}]i en estas
células por RANTES (1-68). Se puede concluir, que la
eliminación de dos restos NH_{2} terminales de RANTES tiene un
impacto significativo en la transducción de la señal en el sentido
de que los receptores de quimioquinas CCR1 y CCR3 ya no son
reconocidos de manera funcional. Por lo tanto, la potencia
quimiotáctica disminuida de RANTES (3-68) puede
explicarse por su falta de capacidad de funcionar a través de CCR1
y CCR3. Por el contrario, RANTES (3-68) retiene
completamente la característica de señalizar a través de CCR5 del
RANTES intacto. RANTES (3-68) puede ser
antiinflamatorio por competición con RANTES intacto, pero también
puede funcionar como un inhibidor de VIH al retener su capacidad de
unirse a CCR5.
Para verificar si la inhibición de la
señalización de quimioquina CC por RANTES (3-68)
también ocurre en células monocíticas, se llevaron a cabo
experimentos de inhibición en células THP-1. Resultó
claro que RANTES (3-68) mostró una reducción de 10
veces en la potencia de incrementar [Ca^{2+}]i en células
monocíticas comparado con RANTES intacto (datos no mostrados).
Además, el efecto quimiotáctico del RANTES intacto (30 ng/ml) en
células monocíticas resultó inhibido (71%) por incubación de las
células del ensayo con 300 ng/ml de RANTES (3-68)
como se muestra en la Tabla IV.
Aún más, RANTES (3-68) redujo la
respuesta quimiotáctica para otras quimioquinas CC, incluyendo la
proteína quimiotáctica para monocitos 3 (MCP-3)
(67%), la proteína inflamatoria de macrófagos 1a
(MIP-1\alpha) (61%) y
MIP-1\beta (80%).
Esto demuestra que RANTES (3-68)
funciona como un inhibidor de amplio espectro de la migración de
células monocíticas inducida por otras quimioquinas CC.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Se evaluaron, en primer lugar, los efectos de
las diferentes formas de RANTES frente a dos cepas diferentes
M-trópicas de VIH-1 (BaL y SF162) en
PBMC humanas obtenidas de donantes de sangre sanos. La CI_{50} de
RANTES intacto (1-68) frente a la cepa BaL fue 3,4
nM y para RANTES (3-68) la CI_{50} fue 0,39 nM. El
valor de CI_{90} para RANTES (1-68) fue 71 nM,
que fue aproximadamente 10 veces el valor de CI_{90} para RANTES
(3-68). Cuando se evaluó en PBMC frente a la cepa
SF162, RANTES (1-68) (CI_{50}: 23 nM; CI_{90}:
95 nM) fue más de 10 veces menos activo que RANTES
(3-68) (CI_{50}: 2 nM; CI_{90}: 8,2 nM) (Tabla
V). Los efectos dependientes de la concentración de ambas
quimioquinas a concentraciones que varían desde 133 hasta 0,2 nM
frente a la replicación de VIH-1 SF162 en PBMC se
muestran en la Figura 8. Una concentración de 5,2 nM de RANTES
(3-68) resultó claramente efectiva en la reducción
de la replicación del virus, mientras RANTES (1-68)
resultó inactivo a esta concentración. No se detectó diferencia en
la actividad antiviral entre RANTES intacto obtenido de PeproTech o
de R&D
Systems.
Systems.
La diferencia acusada en la actividad antiviral
entre las dos formas de RANTES resultó todavía más aparente cuando
se ensayaron en las células humanas transfectadas con CCR5. En las
células U78.CD4.CCR5, las CI_{50} para RANTES
(1-68) y RANTES (3-68) frente a la
cepa BaL fueron 21 nM y 0,65 nM, respectivamente. La CI_{90} para
RANTES (1-68) fue más de 133 nM, mientras que la
CI_{90} para RANTES (3-68) fue 63 nM. En la Tabla
V, también se muestra que RANTES (1-68) resultó
virtualmente inactivo en las células HOS.CD4.CCR5 (CI_{50}>133
nM), mientras que RANTES (3-68) es un potente
inhibidor de la replicación de VIH-1 BaL en estas
células (CI_{50}: 5,5 nM). Sin embargo, no se alcanzaron valores
de CI_{90} para ambas formas de RANTES en estas células.
Se evaluó la expresión de CD26 en las dos líneas
celulares diferentes transfectadas con CCR5 y en PBMC recién
aisladas. Los transfectantes HOS resultaron negativos para la
expresión de CD26 determinada por análisis de citometría de flujo,
mientras que los transfectantes U87 se tiñeron débilmente pero de
manera significativamente positiva con el mAb
anti-CD26 (Figura 9). Además, se encontró que una
subpoblación de PBMC recién aislada fue fuertemente positiva para
la expresión de CD26 (Figura 9).
\newpage
El efecto dependiente de la concentración de
RANTES (1-68) y de RANTES (3-68) en
la producción viral de Ag p24 por la cepa BaL en células
transfectadas HOS.CD4.CCR5 en presencia de CD26s se muestra en la
Figura 10. La adición de CD26s junto con RANTES
(1-68) al comienzo de la infección por VIH,
incrementó de manera significativa la actividad antiviral de RANTES
intacto en células HOS.CD4.CCR5. Cuando se añadió CD26s a 50 U/l
junto con RANTES, se obtuvo una CI_{50} de 13 nM de RANTES. La
adición de CD26s sola no tuvo efecto en la replicación del virus.
La adición de CD26s a RANTES (3-68) tampoco cambio
la actividad antiviral de RANTES (3-68) (datos no
mostrados). Por lo tanto, la presencia de CD26 es esencial para que
RANTES intacto tenga actividad
antiviral.
antiviral.
Como la mayoría del
MIP-1\alpha natural está truncado en su extremo
NH_{2} terminal (cuatro aminoácidos), investigamos si este
MIP-1\alpha truncado (5-70)
presentaba una capacidad inhibitoria de VIH-1
alterada. En contraste con los resultados obtenidos para RANTES, no
se detectaron diferencias significativas en los valores de
CI_{50} de MIP-1\alpha intacto y de
MIP-1\alpha (5-70) en células PMBC
o en células transfectadas con CCR5 (Tabla V, Figura 8). Además, se
compararon MIP-1\alpha intacto y
MIP-1\alpha truncado (5-70) en
ensayos de quimiotaxis y de movilización de Ca^{2+} intracelular
en células monocíticas THP-1. La Tabla VI demuestra
que la dosis mínima eficaz de MIP-1\alpha
(5-70) que induce una elevación en la
[Ca^{2+}]_{i} fue sólo ligeramente inferior a la de
MIP-1\alpha. Aún más, aunque la máxima migración
obtenida con 0,13 nM en el ensayo de quimiotaxis fue mayor para el
MIP-1\alpha intacto, las concentraciones mínimas
eficaces de ambas isoformas de MIP-1\alpha fueron
similares. Teniendo en cuenta todos estos datos, se puede concluir
que el procesamiento NH_{2} terminal de
MIP-1\alpha, en contraste con RANTES, debilita
sólo mínimamente su actividad inflamatoria y
anti VIH-1.
anti VIH-1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La producción de virus se evaluó en el
sobrenadante libre de células 8-12 días después de
la infección por ELISA Ag vírico p24. Se muestran las CI_{50} y
CI_{90} medias (en nM). Los datos representan las medias de dos a
cuatro experimentos independientes. El valor marcado con
">130" indica que no se ha alcanzado el 50% o el 90% de
inhibición a 130 nM. ND, no realizado.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (2)
1. Utilización de CD26/DPP IV para preparar un
medicamento para la terapia y/o diagnóstico de infección por
VIH.
2. CD26/DPP IV para utilización en terapia o
diagnóstico.
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| EP97116863 | 1997-09-29 | ||
| EP97122471A EP0905240A1 (en) | 1997-09-29 | 1997-12-19 | Amino-terminally truncated c-c chemokines as chemokine antagonists |
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