JP2001518297A - ケモカインアンタゴニストとしてのアミノ末端切除型ｒａｎｔｅｓ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、天然発生ＲＡＮＴＥＳのアミノ酸１、１−２、１−３または１−４に相当するＮＨ₂-末端アミノ酸を欠き、ケモキンアンタゴニスト活性を有するアミノ末端切除型ＲＡＮＴＥＳ、ならびにそれらをコードするｃＤＮＡ配列、ケモカイン効果のアンタゴニスト活性を必要とする疾病の治療および／または診断へのそれらの使用、ならびにそれらを含む医薬組成物、に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は、天然発生ＲＡＮＴＥＳのアミノ酸残基１、１−２、１−３、または
１−４に相当するＮＨ₂-末端アミノ酸を欠き、ケモカインアンタゴニスト活性を
有するアミノ末端切除型ＲＡＮＴＥＳ、ならびにそれらをコードするｃＤＮＡ配
列、ケモカイン効果のアンタゴニスト活性を必要とする疾病の治療および／また
は診断へのそれらの使用、およびそれらを含む医薬組成物、に関する。発明の背景 ケモカインは、白血球の走化性および活性化の性質と共に、小さい前炎症性サ
イトカインファミリーを構成する。第一のシステインの位置によって、サイトカ
インファミリーは、Ｃ−Ｃ、Ｃ−Ｘ−ＣおよびＣ−Ｘ₃ −Ｃケモカインに分ける
ことができる（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ Ｍ．ら、１９９４；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎ
ｉ Ｍ．ら、１９９７およびＴａｕｂ Ｄ．ら、１９９６）。

【０００２】 インターロイキン−８（ＩＬ−８）の様な数多くのＣ−Ｘ−Ｃケモカインは、
好中球に対して走化性であるが、単球走化性タンパク質−３（ＭＣＰ−３）の様
なＣ−Ｃケモカインは、単球、リンパ球、好酸球、好塩基球、ＮＫ細胞および樹
状突起細胞を含む、様々な白血球に活性である。

【０００３】 ケモカインのＮＨ₂-末端ドメインは、レセプター結合ドメイン内に含まれ、Ｎ
Ｈ₂-末端のプロセシングは、ケモカインを活性化できる場合もあるが、活性を減
少させるか、または完全に不活性化する場合もある。

【０００４】 Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン血小板塩基性タンパク質は、２４のＮＨ₂-末端残基を除
去した後にのみ、好中球走化性ペプチド(neutrophil chemotactic peptide)（Ｎ
ＡＰ−２）になる（Ｗａｌｚ Ａ．ら、１９８９およびＶａｎ Ｄａｍｍｅ Ｊ
．ら、１９９０）。

【０００５】 ＩＬ−８からの８残基までのＮＨ₂-末端の欠損は、走化性活性を強化するが、
すべての好中球走化性Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインの最初のＣｙｓの前に位置するＧｌ
ｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇモチーフのさらなる切断は、完全な不活性化の原因となる。
（Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉ．ら、１９９１）。

【０００６】 別のＣ−Ｘ−Ｃケモカイン、顆粒球走化性タンパク質−２(Granulocyte chemo
tactic protein-2)（ＧＣＰ−２）、の同様のＮＨ₂−末端タンパク質分解（最大
で８アミノ酸）は、好中球走化性活性に影響を与えなかった（Ｐｒｏｏｓｔ Ｐ
．ら、１９９３ａ）。

【０００７】 ＲＮＡＴＥＳ［「活性化時に調節され、通常Ｔ細胞を発現し、多分分泌される
」("Regulated upon Activation,Normally T Expressed,and Presumably Secret
ed")アクロニン(acronum) である］は、Ｃ−Ｃケモカインであり、そのｃＤＮＡ
クローンは、Ｔ細胞特異的配列に富むｃＤＮＡライブラリーより単離された（Ｓ
ｃｈａｌｌ，Ｔ．Ｊ．ら、１９８８）。

【０００８】 ８−９のＮＨ₂-末端アミノ酸を欠いた合成Ｃ−ＣケモカインＭＣＰ−１、ＭＣ
Ｐ−３およびＲＡＮＴＥＳは、単球に不活性であるが、レセプターアンタゴニス
トとしては有効である（Ｇｏｎｇ Ｊ．ら、１９９５およびＧｏｎｇ，Ｊ．ら、
１９９５） ＲＡＮＴＥＳに一つのメチオニンを延長すると、分子は完全に不活性化される
が、Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳは、標準のＲＡＮＴＥＳのアンタゴニストとして働く
。（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ Ａ．Ｅ．ら、１９９６）。発明の説明 本発明の主な目的は、天然発生ＲＡＮＴＥＳのアミノ酸残基１、１−２、１−
３、または１−４に相当するＮＨ₂-末端アミノ酸を欠き、ケモカインアンタゴニ
スト活性を有する、アミノ末端切除型ＲＡＮＴＥＳである。

【０００９】 本発明の一つの特別な目的は、図１および配列番号２に示すような、最初の２
つのアミノ酸を欠くＲＡＮＴＥＳである、ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）である。

【００１０】 本発明のアミノ末端切除型ＲＡＮＴＥＳは、グリコシル化または非グリコシル
化型で存在することができる。

【００１１】 用語「ケモカインアンタゴニスト」とは、「成熟型の全長の天然発生ケモカイ
ンに対してアンタゴニストとして作用する」ことを意味する。

【００１２】 本発明のもう一つの目的は、本発明のアミノ末端切除型ＲＡＮＴＥＳをコード
するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子であり、実質的に同一のヌクレオチド配列を含
む。完全なＲＡＮＴＥＳのｃＤＮＡ配列は、Ｓｃｈａｌｌ Ｔ．Ｊ．ｒａ（１９
８８）に開示されており、切除型ＲＡＮＴＥＳのｃＤＮＡを容易に誘導すること
ができる。

【００１３】 「実質的に同一のヌクレオチド配列」には、遺伝子コードの縮重により、与え
られたアミノ酸配列をコードする、その他のすべての核酸配列が含まれる。

【００１４】 また、本発明は、上記のＤＮＡｓを含む発現ベクター、そのようなベクターで
トランスフォームされた宿主細胞、および、上記の形質転換細胞の適当な培養基
内での培養を通して、本発明のそのようなアミノ末端切除型ＲＡＮＴＥＳを調製
する方法を含む。

【００１５】 本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、適当なプラスミド内に挿入し
連結することができる。できあがると、発現ベクターは適当な宿主細胞内に導入
され、次にベクター（類）を発現させて、所望のタンパク質を得ることができる
。

【００１６】 本明細書中に取り上げた本発明の任意の組換えタンパク質の発現は、適当な発
現ベクターを用いて、真核生物細胞（例えば酵母、昆虫または哺乳動物細胞）ま
たは原核生物細胞内で達成することができる。この技術分野で既知の任意の方法
を用いることができる。

【００１７】 例えば、任意の上記の方法によって得られたタンパク質をコードするＤＮＡ分
子は、この技術分野で周知の技術によって、適当な構築発現ベクター内に挿入さ
れる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照のこと）。二本鎖ｃＤＮＡを、ホモ
ポリマーテイリングによって、または合成ＤＮＡリンカーの使用またはブラント
エンド連結反応技術を含む制限連結法によって、プラスミドベクターに連結し：
ＤＮＡリガーゼを用いてＤＮＡ分子を連結し、望ましくない結合をアルカリホス
ファターゼ処理により除去する。

【００１８】 所望のタンパク質を発現する能力を持たせるために、発現ベクターは、遺伝子
の発現およびタンパク質の生成を許すような方法で所望のタンパク質をコードす
るＤＮＡと連結した転写および翻訳調節情報を含む具体的ヌクレオチド配列も含
まねばならない。最初に、遺伝子が転写されるためには、ＲＮＡポリメラーゼに
よって認識されうるプロモーターが先行しなければならず、それにポリメラーゼ
が結合し、それによって転写プロセスが開始される。用いられるそのようなプロ
モーターは様々であり、異なる効率（強いプロモーターおよび弱いプロモーター
）で働く。

【００１９】 真核生物宿主では、宿主の姿に依存して、異なる転写および翻訳調節配列を用
いることができる。それらは、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サル
ウイルスまたはその類似ウイルス等のような、ウイルス源より誘導することがで
き、調節シグナルは、高レベルで発現する特定の遺伝子と関連する。例として、
ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、酵母ｇａｌ
４遺伝子プロモーター等があげられる。抑制および活性化を可能にする転写開始
調節シグナルを選択することができ、そうすることによって遺伝子の発現を調節
することができる。

【００２０】 本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子は、機能
し得るように連結された転写および翻訳調節シグナルを持ち、宿主細胞に所望の
遺伝子配列を組み込む能力を持つ、ベクター内に挿入される。

【００２１】 導入されたＤＮＡによって安定にトランスフォームされた細胞は、発現ベクタ
ーを含む宿主細胞の選択を可能にする一つ以上のマーカーを導入することによっ
て、選択することができる。また、マーカーは、独立栄養宿主に、光栄養性、生
命破壊耐性、例えば抗生物質あるいは銅のような重金属、またはその類似物を提
供することができる。選択可能マーカー遺伝子を、発現されるＤＮＡ遺伝子配列
に直接連結させるか、またはコトランスフェクションにより同一細胞内に導入す
ることができる。さらなるエレメントもまた、本発明のタンパク質の最適な合成
に必要とされるであろう。

【００２２】 特定のプラスミドまたはウイルスベクターの選択に重要な因子には：ベクター
を含むレシピエント細胞を認識し、ベクターを含まないそのようなレシピエント
細胞から選択する安易さ；特定の宿主に望ましいベクターのコピー数；および、
異なる種の宿主細胞間をベクターがシャトルできることが望ましいか否か：が含
まれる。

【００２３】 ひとたび、構築物（類）を含むベクター（類）またはＤＮＡ配列が発現用に調
製されると、ＤＮＡ構築物（類）は、任意の様々な適当な方法：トランスフォー
メーション、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合
、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接ミクロインジェクショ
ン等；によって、適当な宿主細胞内に導入される。

【００２４】 宿主細胞は、原核生物細胞または真核生物細胞のいずれかであろう。正確な折
り畳み又は適当な位置のグリコシル化を含む翻訳後修飾をタンパク質分子に提供
するためには、真核生物宿主、例えば、ヒト、サル、マウスおよびチャイニーズ
ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳動物細胞が好ましい。また、酵母細
胞は、グリコシル化を含む翻訳後ペプチド修飾を遂行することができる。酵母内
で、所望のタンパク質の生成に利用することのできる、強力なプロモーター配列
および高コピー数のプラスミドを利用する、数多くの組換えＤＮＡストラテジー
が存在する。酵母は、クローン化された哺乳動物遺伝子生成物上のリーダー配列
を認識し、リーダー配列を持つペプチド（即ちプレペプチド）を分泌する。

【００２５】 ベクター（類）導入後、宿主細胞を選択培地内で増殖させ、ベクター含有細胞
の増殖について選択する。クローン化された遺伝子配列（類）の発現は、結果と
して、所望のタンパク質を生成する。

【００２６】 本発明のアミノ末端切除型ＲＡＮＴＥＳは、本技術分野で周知の任意のその他
の方法によって、特に、自動固相ペプチドシンセサイザー次にクロマトグラフ精
製を用いる、充分に確立された化学合成方法によって、調製することができる。

【００２７】 本発明のケモカインは、例えば、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボ
ニル）、ｔＢｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）、または、異なるアミノ酸上に適
当な側鎖保護基を持つ或いは持たない、任意のその他の比較しうる化学合成によ
って、合成することができる。適当な側鎖保護基を持つまたは持たないアミノ酸
を、例えばＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ［２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）
−１，１，３，３−テトラメチル−ウロミウム ヘキサフルオロホスフェート／
１−ヒドロキシベンゾチアゾール）で−、前もって活性化し、成長するペプチド
鎖に結合する。次の残基を加える前に、保護基（例えばＦｍｏｃ）をα−アミノ
基から除去する。合成後、すべての保護基を除去し、完全な全長ペプチドを精製
し、本発明の相当するケモカインに化学的または酵素的に折り畳まれる（その中
にはシステイン間のジスルフィド架橋の形成も含まれる）。

【００２８】 天然、合成または組換えタンパク質の精製は、この目的で既知の任意の一つの
方法、即ち、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動、またはその類似法（
例えばＰｒｏｏｓｔ Ｐ．ら、１９９６を参照のこと）を含む任意の慣用的方法
、によって遂行される。本発明のタンパク質を精製するために選択して用いるこ
とのできるさらなる精製方法は、標的タンパク質と結合する、およびカラム内に
含まれるゲルマトリックス上で生成され固定化される、モノクローナル抗体また
はヘパリンに対するアフィニティーを用いるアフィニティークロマトグラフィー
である。タンパク質を含むが純粋でない調製物をカラムに通す。タンパク質は、
特異的抗体によって、カラムに結合されるが、不純物は通過するであろう。洗浄
後、ｐＨまたはイオン強度を変化させることにより、タンパク質をゲルから溶出
する。

【００２９】 本発明のアミノ末端切除型ＲＡＮＴＥＳは、ケモカイン効果のアンタゴニスト
活性を必要とする、疾病の治療および／または診断に有用である。そのような疾
病の例として、炎症性疾患、脈管形成−および造血−関連疾患、腫瘍、ＨＩＶを
含む感染病、自己免疫病、アテローム性動脈硬化症、肺動脈疾患、および皮膚障
害；が含まれる。

【００３０】 従って、さらなる態様では、本発明は、上記疾病を治療するための薬剤製造で
の本発明のタンパク質の使用を提供する。

【００３１】 好ましくは、薬剤は、本発明のタンパク質を、一つ以上の医薬として許容しう
るキャリヤーおよび／または賦形剤と共に含む、医薬組成物の形で存在する。そ
のような医薬組成物は、本発明のさらなる態様を形成する。

【００３２】 本発明のさらなる実施態様は、そのような疾病を発病する危険性を持つ患者ま
たはそのような病状を既に示している患者に、薬理学的に活性な量の本発明のア
ミノ末端切除型ＲＡＮＴＥＳを投与することを含む、上記の疾病の治療方法であ
る。

【００３３】 また、ＣＤ２６／ＤＰＰ ＩＶは、インビトロでＮＨ₂-末端切除型ＲＡＮＴＥ
Ｓを生成できることが、分かった。ＲＡＮＴＥＳは、その生物活性をＣＤ２６／
ＤＰＰ ＩＶによって修飾されると報告された最初のサイトカインである。

【００３４】 それ故、本発明のもう一つの目的は、炎症性疾患、免疫性疾患および伝染性疾
病に特に焦点を合わせた、ケモカイン効果のアンタゴニスト活性を必要とする、
疾病の治療および／または診断でのＣＤ２６／ＤＰＰ ＩＶの使用である。

【００３５】 これは内因的に調節されたケモカイン修飾について始めて同定されたメカニズ
ムの例を示しているが、同様の生物学的プロセシングも、他の因子（プロテアー
ゼ）によって仲介されていた。上記疾病の治療および／または診断でのそのよう
な因子（プロテアーゼ）の使用もまた、本発明に含まれる。

【００３６】 上記の疾病の治療および／または診断でのそのようなファクター（プロテアー
ゼ）の使用もまた、この発明に含まれる。

【００３７】 以下の実施例によって、本発明はここに説明されるコトニナルが、如何なる場
合も本発明を制限するものとして解釈されるべきではない。実施例は以下に示す
図面を言及することになる。実施例 実施例１：アミノ末端切除型ＲＡＮＴＥＳ 材料および方法 試薬 天然のヒトＲＡＮＴＥＳを、ヒトＭａｌａｖｕ肝臓肉腫細胞、ＭＧ−６３骨肉
腫細胞または末梢血液白血球（Ｂｌｏｏｄ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｃｅｎｔ
ｅｒｓ ｏｆ Ａｎｔｗｅｒｐ ａｎｄ Ｌｅｕｖｅｎ）によって作り出し、前
記の方法に従って精製した（Ｐｒｏｏｓｔ Ｐ．ら、１９９６およびＰｒｏｏｓ
ｔ Ｐ．ら、１９９３）。ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３およびＧＣＰ−２を、Ｆｍｏ
ｃ化学により合成し（Ｐｒｏｏｓｔ Ｐ．ら、１９９５およびＷｕｙｔｓ Ａ．
ら、１９９７）、組換えヒトＲＡＮＴＥＳをＰｅｐｔｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ
Ｎｉｌｌ，ＮＪ）から得た。組換えＭＣＰ−１はＪ．Ｊ．Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ博
士（ＮＣＩ−ＮＩＨ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）からのギフトである。

【００３８】 ＣＤ４でトランスフェクトされたヒト骨肉腫（ＨＯＳ）(Human osteosarcoma)
細胞および一つのＣＣケモカインレセプターＣＣＲ１、ＣＣＲ３またはＣＣＲ５
（Ｄｅｎｇ，Ｈ．ら、１９９６）を、ｇｌｕｔａｍａｘを含むＤＭＥＭ中で増殖
させた。プロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を選択試薬として培養基に加えた。１０
％ＦＣＳを加えて、全培養基（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）の栄養価を高めた。

【００３９】 ヒトＣＤ２６／ＤＰＰ ＩＶは、プロスタソーム(prostasomes) (前立腺誘導 オルガネラ）から得られ、精漿内に惜しげなく発生する。酵素は、イオン交換、
次いで、アデノシンデアミナーゼ上でのアフィニティークロマトグラフィーを用
いる前記の方法に従って、均一になるまで精製した（Ｄｅ Ｍｅｅｓｔｅｒ Ｉ
．ら、１９９６）。ケモカインとＣＤ２６／ＤＰＰ ＩＶとのインキュベーションおよびタンパク質 分解プロセシングの検出。

【００４０】 １００−１０００モル過剰のケモカインを１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐ
Ｈ７．７中、ＣＤ２６／ＤＰＰ ＩＶと共に一晩インキュベートした。ケモカイ
ンを、前記の方法（Ｐｒｏｏｓｔ Ｐ．ら、１９９６）に従って、Ｔｒｉｓ／Ｔ
ｒｉｃｉｎｅゲルシステムのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＣＤ２６／ＤＰＰ Ｉ
Ｖから分離した。

【００４１】 タンパク質を、ＰＶＤＦ（フッ化ポリビニリデン）(polyvinylidene fluoride
)膜（Ｐｒｏｂｌｏｔｔ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ，ＣＡ）上にエレクトロブロットし、クーマシーブリリアントブルーＲ２５０で
染色した。脱染後、膜を、超純水(ultrapure water) （Ｍｉｌｌｉ Ｑ；Ｍｉｌ
ｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で、少なくとも５回、リンスした。

【００４２】 生物アッセイ用に充分な量の純粋な切除型ケモカインを得るために、約５０μ
ｇの組換えケモカインを、ＣＤ２６／ＤＰＰ ＩＶで処理し、切断生成物を０．
１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で酸性化した。Ｔｗｅｅｎ２０（０．０１％）
を加え、ケモカインがチューブに粘着することを防ぐ。

【００４３】 ケモカインを、Ｃ−８ Ａｑｕａｐｏｒｅ ＲＰ−３００カラム（１ｘ５０ｍ
ｍ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上、アセトニトリル勾配で、ＣＤ２６／ＤＰ
Ｐ ＩＶから分離した。タンパク質を含むフラクションは、前記の方法に従って
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、銀染色した。

【００４４】 ケモカインを処理し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した、またはＰＶＤＦブロットか
ら削りだした、ＣＤ２６／ＤＰＰ ＩＶについて、カップリング塩基としてＮ−
メチルピペリジンを用い、パルス液相４７７Ａ／１２０Ａタンパク質シークエン
サー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上のＥｄｍａｎ分解によって、ＮＨ₂-末端配
列を分析した。走化性活性の検出 Ｂｏｙｄｅｎミクロチャンバー内で、新たに単離した末梢血液好中球顆粒球（
１０⁶細胞／ｍｌ）または培養された単球ＴＨＰ−１細胞（０．５ｘ１０⁶細胞／
ｍｌ）へのケモカインの走化性潜在力について、ケモカインを試験した（Ｐｒｏ
ｏｓｔ Ｐ．ら、１９９６およびＰｒｏｏｓｔ Ｐ．ら、１９９３）。

【００４５】 ３７゜Ｃで４５分（顆粒球）または２時間（ＴＨＰ−１細胞）インキュベーシ
ョンした後、細胞を、固定し染色した。５μｍポアサイズのポリカルボネート膜
を通して移動した細胞を、１０倍の油浸場内、顕微鏡で計数した。

【００４６】 サンプルの走化性指数（ＣＩ）(chemotactic index) （個々のチャンバー当た
り３通り）は、［試験サンプルに移動する細胞数］÷［対照培地に移動する細胞
数］として計算された。脱感作実験では、細胞を、チャンバーに移す前に、生物
学的に不活性なケモカイン変異体と共に、３７゜Ｃで１０分間、インキュベート
した。

【００４７】 ＨＢＳＳ処理対照細胞での脱感作により得られたＣＩの阻害率（％）を、走化
性脱感作の評価として計算した。細胞内Ｃａ²⁺濃度の検出 細胞内Ｃａ²⁺濃度（［Ｃａ²⁺）_i ］を、前記の方法に従って、測定した（Ｗｕ
ｙｔｓ Ａ．ら、１９９７）。簡単に言えば、精製された細胞を、蛍光指示薬ｆ
ｕｒａ−２（２．５μＭ ｆｕｒａ−２／ＡＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂ
ｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＢＶ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）
および０．０１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕ
ｉｓ ＭＯ）と共に、インキュベートした。

【００４８】 ３０分後、細胞を２度洗浄し、１ｍＭ Ｃａ²⁺を含むＨＢＳＳ内に再縣濁し、
３７゜Ｃで１０分間インキュベートし、その後、ｆｕｒａ−２蛍光をＬＳ５０Ｂ
発光分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定した。 ３４０ｎｍおよび
３８０ｎｍで励起時、蛍光を５１０ｎｍで検出した。［Ｃａ²⁺］_i をＧｒｙｎｋ
ｉｅｗｉｃｚ方程式（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚら、１９８５）から計算した。

【００４９】 Ｒ_max を測定するため、細胞を５０μＭジギトニンで溶解した。次に、ｐＨを
２０ｍＭ ＴｒｉｓでｐＨを８．５に調整し、溶解細胞に１０ｍＭ ＥＧＴＡを
加えることによって、Ｒ_min を得た。計算に用いられたＫ_d は、２２４ｎＭであ
った。脱感作実験では、最初に、細胞を、バッファーまたは異なる濃度のケモカ
インで刺激した。第二の刺激として、バッファーで前刺激した後、［Ｃａ²⁺］_i の有意の増加を誘導する濃度で、ケモカインを加えた。細胞の前刺激に対して第
二の刺激に感応する［Ｃａ²⁺］_i 増加の阻害率（％）を、計算した。ＨＩＶ−１感染の阻害 ＨＩＶ−１ Ｍ−ｔｒｏｐｉｃ株ＢａＬおよびＳＦ１６２を、ＭＲＣ ＡＩＤ
Ｓ ｒｅａｇｅｎｔ ｐｒｏｊｅｃｔ（Ｈｅｒｔｓ，ＵＫ）を通して得た。健康
なドナーからの末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）(peripheral blood mononuclear
cells)を、密度勾配遠心分離（５、２３）により単離し、３７゜Ｃで３日間、Ｐ
ＨＡ １μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｂｏｒｎｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）で刺激した
。活性化された細胞（ＰＨＡ−刺激芽球）をＰＢＳで３回洗浄し、前記の方法に
従って（Ｓｃｈｏｌｓ，Ｄ．，１９９７）、ウイルスを感染させた。ＨＩＶ−１
感染または偽感染ＰＨＡ−刺激芽球を、２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２存在下、ＲＡＮ
ＴＥＳ（１−６８）またはＲＡＮＴＥＳ（３−６８）の濃度を変化させて、培養
した。細胞上清を、１０日目に集め、上清内のＨＩＶ−１コア抗原をｐ−２４
Ａｇ ＥＬＩＳＡキット（ＤｕＰｏｎｔ／ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって分析した。結果 天然のＮ−末端切除型ＲＡＮＴＥＳの単離および生物学的特徴 異なるＮＨ₂-末端切除型のヒトＧＣＰ−２が、以前に単離されている（Ｐｒｏ
ｏｓｔ Ｐ．ら、１９９３）。最少の切除型ＧＣＰ−２は、終わりから２番目の
位置のＰｒｏの向こう側で切断されていた［ＧＣＰ−２（３−７５）］。Ｃ−Ｃ
ケモカインＲＡＮＴＥＳは、同様の標準精製法を用いて末梢血液白血球または肉
腫細胞から精製されている（Ｐｒｏｏｓｔ Ｐ．１９９６）。

【００５０】 特に、サイトカイン混合物で誘導されたＭＧ−６３またはＭａｌａｖｕ肉腫細
胞からの順化培地を分画し、天然型ケモカイン変異体を単離した。ケモカインは
、順番に、抗体またはヘパリンアフィニティークロマトグラフィー、カチオン交
換クロマトグラフィー（モノ−Ｓ ＦＰＬＣ）およびＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、
免疫反応型を特異的ケモカインＥＬＩＳＡｓによって検出した。カチオン交換カ
ラム上、ＩＬ−８は、ＲＡＮＴＥＳと非常に近い位置で溶出される（０．７−０
．７５Ｍ ＮａＣｌ）ことが分かった。が、両ケモカインは、ＲＰ−ＨＰＬＣに
よって互いに分離された（ＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−８はそれぞれ、２７．５％
および３０％のアセトニトリルで溶出される）。純粋タンパク質のアミノ酸配列
分析より、ＩＬ−８は、異なるＮＨ₂-末端切除型であり、以前からそれらの走化
性活性を基に単離されていた（Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ Ｊ．ら、１９８９）ことが
、確認された。しかしながら、ＲＡＮＴＥＳについては、一つの単一型のみが単
離されており、それは、完全なＲＡＮＴＥＳと比較して２つのＮＨ₂-末端残基が
欠けていた。その顕著な出現から見て、このＲＡＮＴＥＳ（３−６８）をより詳
細に分析して、単球および好酸球についてのその走化性活性を確かめた。特に、
走化性および／または細胞内Ｃａ²⁺−放出活性について、ＲＡＮＴＥＳ（３−６
８）を試験し、その生物学的能力を、相当する完全なケモカインのそれと比較し
た。

【００５１】 ＲＡＮＴＥＳからの２つの残基のＮＨ₂-末端欠損は、結果として、単球走化性
およびＣａ²⁺−放出活性をかなり減少させる。完全な天然ＲＡＮＴＥＳ（最小有
効投与量３−１０ｎｇ／ｍｌ）と比較して、天然ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）は、
Ｂｏｙｄｅｎミクロチャンバー内、３００ｎｇ／ｍｌ程の濃度で試験した場合、
全体的に不活性であった（図２）。さらに、同様のＣａ²⁺−応答を得るためには
、ＲＡＮＴＥＳ（１−６８）と比較して、天然ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）では、
１０倍高い濃度が必要であった（図３）。ＣＤ２６／ＤＰＰ ＩＶは、ケモカインのＮＨ₂-末端ジペプチドを除去する アミノペプチダーゼＣＤ２６／ＤＤＰ ＩＶがＮＨ₂-末端切除型ＲＡＮＴＥＳ
に応答することができるか否かを研究するため、完全なケモカインを、一晩ＣＤ
２６／ＤＰＰ ＩＶと共にインキュベートし、ＰＶＤＦ膜にブロットし、クマー
シーブルーで染色し、自動エドマン分解にかけた。ＲＡＮＴＥＳをＣＤ２６／Ｄ
ＰＰ ＩＶで処理すると、結果としてＮＨ₂-末端ジペプチドが除去された。ＣＤ
２６／ＤＰＰ ＩＶを含まないバッファーでのケモカインの平衡インキュベーシ
ョンは、影響を受けなかった。

【００５２】 その他のケモカインもＣＤ２６／ＤＰＰ ＩＶに切断される共通配列を含むた
め、また、ＭＣＰｓのＮＨ₂-末端は生物活性に極めて重要であることが分かった
（Ｇｏｎｇ Ｊ．ら、１９９６およびＧｏｎｇ Ｊ．ら、１９９５）ため、ＭＣ
Ｐ−１、ＭＣＰ−２およびＭＣＰ−３もまた、ＣＤ２６／ＤＰＰ ＩＶと共に、
インキュベートした。

【００５３】 処理後、ＭＣＰｓをＰＶＤＦ膜上にブロットし、クマーシーブルー染色を行い
、充分量のタンパク質をエドマン分解用に回収したことを確認した。

【００５４】 ＮＨ₂-末端配列を検出することができなかったが、ＣＤ２６／ＤＰＰ ＩＶは
、ピログルタミン酸によってエドマン分解用にブロックされたＭＣＰｓのＮＨ₂-
末端を変化させなかったことが分かった。完全−およびＣＤ２６／ＤＰＰ ＩＶ処理−ＲＡＮＴＥＳの生物活性の比較 天然ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）と同様に、Ｃ−８ ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した
ＣＤ２６／ＤＰＰ ＩＶ処理−組換えＲＡＮＴＥＳは、Ｂｏｙｄｅｎミクロチャ
ンバー走化性実験で、最大で１μｇ／ｍｌまでの濃度を用いた場合、不活性であ
ったが、これに対して、有意の単球走化性応答が、３０−１００ｎｇ／ｍｌの完
全な組換えＲＡＮＴＥＳで検出された（図２）。

【００５５】 切除による影響をＣａ²⁺−移動アッセイで試験したところ、ＲＡＮＴＥＳ（３
−６８）は、１００ｎｇ／ｍｌで低いが有意な増加を誘導した。しかしながら、
完全なＲＡＮＴＥＳは、１０ｎｇ／ｍｌで既に活性であった（図３）。結論とし
て、２つのＮＨ₂-末端残基を除去しただけで、ＲＡＮＴＥＳの単球走化性および
Ｃａ²⁺−移動能力は、１０−１００倍、減少した。ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）は、完全なＲＡＮＴＥＳに対する天然の走化性アンタ ゴニストである。

【００５６】 単球走化性実験で不活性であったＲＡＮＴＥＳ（３−６８）から見て、この切
除型ＲＡＮＴＥＳがアンタゴニストとして作用することができるか否かについて
試験した。ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）は、１μｇ／ｍｌで、１００ｎｇ／ｍｌの
完全なＲＡＮＴＥＳの走化性効果をほぼ完全に（８２％）脱感作した（表１）。

【００５７】 ３倍過剰量のＲＡＮＴＥＳ（３−６８）を上壁に加えた場合、完全なＲＡＮＴ
ＥＳに対するＴＨＰ−１細胞の走化性は、約５０−７０％、阻害された。ＲＡＮ
ＴＥＳ（３−６８）は、３００ｎｇ／ｍｌで、尚、同濃度の完全なＲＡＮＴＥＳ
に対する走化性応答の約３０％を阻害することができた。

【００５８】 ＴＨＰ−１細胞でのＣａ²⁺−移動実験では（図４）、３０ｎｇ／ｍｌの完全な
ＲＡＮＴＥＳは、３０ｎｇ／ｍｌの完全なＲＡＮＴＥＳを３９±５％の影響で脱
感作できた。同量の脱感作を得るためには、約１０倍高濃度のＲＡＮＴＥＳ（３
−６８）が必要であった。しかしながら、３００ｎｇ／ｍｌで、ＲＡＮＴＥＳ（
３−６８）それ自身は、有意のＣａ²⁺−応答を与えた。このＣａ²⁺−応答は、３
０ｎｇ／ｍｌの完全なＲＡＮＴＥＳで得られる応答に匹敵した。

【００５９】

【表１】

【００６０】ヒトの単球および好中球でのＲＡＮＴＥＳ（３−６８）の走化性活性阻害 表IIでは、天然型ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）の走化性能力を、単球走化性タン
パク質ＭＣＰ−３および完全なＲＡＮＴＥＳ（１−６８）のそれと比較している
。ＭＣＰ−３およびＲＡＮＴＥＳ（１−６８）は、それぞれ３ｎｇ／ｍｌおよび
３０ｎｇ／ｍｌで、新たに単離された末梢血液単球に走化性であることが分かっ
たが、天然型ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）は１００ｎｇ／ｍｌでも不活性のままで
あった。

【００６１】 この天然変異体の走化性能力の減少は、組換えＲＡＮＴＥＳ（３−６８）で確
認された。単球への走化性は（１μｇ／ｍｌで）弱いが、精製された組換えＲＡ
ＮＴＥＳ（３−６８）は、完全な組換えＲＡＮＴＥＳのそれより１０倍低い比活
性を示した。

【００６２】 最終的に、ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）の走化性能力は、ヒト好酸球上で確かめ
られ、１００ｎｇ／ｍｌの完全なＲＡＮＴＥＳおよび３０ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ−
３になお応答した（図５）。単球と同様に、好酸球の遊走は、ＲＡＮＴＥＳ（３
−６８）１μｇ／ｍｌでのみ刺激された。

【００６３】

【表２】

【００６４】ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）は、ＣＣＲ５を通してＲＡＮＴＥＳ（１−６８）に信 号を送り脱感作するが、ＣＣＲ１およびＣＣＲ３を通しては信号を送らず脱感作 もされない。

【００６５】 ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）の走化性活性の減少を説明するために、ＲＡＮＴＥ
Ｓによって用いられる既知のレセプターを通して結合し信号を起こるこのケモカ
イン変異体の能力を確かめた。

【００６６】 ケモカインレセプターＣＣＲ１、ＣＣＲ３またはＣＣＲ５でトランスフェクト
されたＨＯＳ細胞を、シグナル化アッセイに用い、細胞内カルシウム濃度の増加
を測定した。最大で３０ｎｇ／ｍｌまでの濃度では、ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）
は、ＣＣＲ１（表III ）またはＣＣＲ３（データは示していない）でトランスフ
ェクトされたＨＯＳ細胞内の［Ｃｓ²⁺］_i を増加しなかったが、３０ｎｇ／ｍｌ
および１００ｎｇ／ｍｌの完全ＲＡＮＴＥＳは、それぞれ、ＣＣＲ１およびＣＣ
Ｒ３トランスフェクタント内の［Ｃａ²⁺］_i の増加を誘導するに充分であった。

【００６７】 しかしながら、完全型および切除型のＲＡＮＴＥＳは両方共、３０ｎｇ／ｍｌ
でＣＣＲ５トランスフェクタント内の［Ｃａ²⁺］_i の充分な上昇を誘導すること
ができた。さらに、３−２０倍過剰量のＲＡＮＴＥＳ（３−６８）または完全Ｒ
ＡＮＴＥＳのいずれかでＣＣＲ５トランスフェクト細胞をプレインキュベーショ
ンすると、その後、完全なＲＡＮＴＥＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）による挑戦を受け
ても、［Ｃａ²⁺］_i の上昇が等しく阻害された（約７５％）（図６）。

【００６８】 それとは対照的に、３００ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＴＥＳ（３−６８）は、１００
ｎｇ／ｍｌの完全なＲＡＮＴＥＳへのＣＣＲ１およびＣＣＲ３−トランスフェク
ト細胞のカルシウム応答を、僅かに脱感作したのみであるが、第一の刺激として
３倍過剰量の完全なＲＡＮＴＥＳを用いると、次のＲＡＮＴＥＳ（１−６８）に
よるこれらの細胞内の［Ｃａ²⁺］_i 上昇をほぼ完全に阻害した。ＲＡＮＴＥＳか
ら２つのＮＨ₂-末端残基を除去すると、ケモカインレセプターＣＣＲ１およびＣ
ＣＲ３をもはや機能的に認識しないと言う、シグナルトランスダクションに有意
のインパクトを持つ、と結論付けられるに違いない。それ故、ＲＡＮＴＥＳ（３
−６８）の走化性能力が害されることは、ＣＣＲ１およびＣＣＲ３を通して機能
できないことによって説明できる。対照的に、ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）は、完
全なＲＡＮＴＥＳのＣＣＲ５シグナル化特徴を完全に残している。ＲＡＮＴＥＳ
（３−６８）は、完全なＲＡＮＴＥＳと競合することによって抗炎症性であるこ
とができるが、ＣＣＲ５と結合するその能力を保持していることによって、ＨＩ
Ｖ−阻害剤として機能することができる。

【００６９】

【表３】

【００７０】ヒト単球細胞内でのＲＡＮＴＥＳ（３−６８）によるＣＣケモカイン誘導走化性 の阻害 ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）によるＣＣケモカインシグナル化の阻害が、単球細
胞内でも起こるか否かについて確かめるため、ＴＨＰ−１細胞内で阻害実験を行
った。ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）は、完全なＲＡＮＴＥＳと比較して、単球細胞
内で［Ｃａ²⁺］_i を増加する能力を１０倍減少させることが証明された（データ
には示されていない）。さらに、単核細胞上での完全なＲＡＮＴＥＳ（３０ｎｇ
／ｍｌ）の走化性効果は、表ＩＶに示すように、３００ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＴＥ
Ｓと共に試験細胞をインキュベートすることによって、阻害された（７１％）。

【００７１】 さらに、ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）は、単球走化性タンパク質−３（ＭＣＰ−
３）(monocyte chemotactic protein-3)、マクロファージ炎症性タンパク質−１
ａ（ＭＩＰ−１α）(Macrophage inflammatory protein-1a)（６１％）およびＭ
ＩＰ−１β（８０％）を含む、その他のＣＣケモカインへの走化性応答を減少さ
せる。

【００７２】 このことは、単球細胞遊走の幅広いスペクトル阻害剤としてのＲＡＮＴＥＳ（
３−６８）の機能が、その他のＣＣケモカインによって誘導されたことを、説明
している。

【００７３】

【表４】

【００７４】ＣＤ２６−特異的切除型ＲＡＮＴＥＳは、その抗ウイルス活性に必要である。 最初、異なる型のＲＡＮＴＥＳによる影響を、健康なドナー血液から誘導され
たヒトＰＢＭＣ内の２つの異なるＭ−ｔｒｏｐｉｃ ＨＩＶ−１株（ＢａＬおよ
びＳＦ１６２）に対して評価した。ＢａＬ株に対する完全なＲＡＮＴＥＳ（１−
６８）のＩＣ₅₀は、３．４ｎＭであり、ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）についてのＩ
Ｃ₅₀は、０．３９ｎＭであった。ＲＡＮＴＥＳ（１−６８）についてのＩＣ₉₀値
は、７１ｎＭであり、ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）についてのＩＣ₉₀の約１０倍で
あった。ＳＦ１６２株に対してＰＢＭＣ内で評価した場合、ＲＡＮＴＥＳ（１−
６８）（ＩＣ₅₀：２３ｎＭ；ＩＣ₉₀：９５ｎＭ）は、ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）
（ＩＣ₅₀：２ｎＭ；ＩＣ₉₀：８．２ｎｍ）より１０倍以上少ない活性であった（
表Ｖ）。ＰＢＭＣ内でのＨＩＶ−１ ＳＦ１６２複製に対する１３３から０．２
ｎｍの範囲の濃度での両ケモカインの濃度依存効果を図８に示す。濃度５．２ｎ
ＭのＲＡＮＴＥＳ（３−６８）は、ウイルス複製の減少に明らかに効果があった
が、これに対してＲＡＮＴＥＳ（１−６８）は、この濃度では不活性であった。
抗ウイルス活性での違いは、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈまたはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ
から得られた完全なＲＡＮＴＥＳ間では、認められなかった。

【００７５】 ２つの型のＲＡＮＴＥＳ間での抗ウイルス活性の顕著な違いは、ヒトＣＣＲ５
トランスフェクト細胞で試験した場合、より一層、明らかになった。Ｕ７８．Ｃ
Ｄ４．ＣＣＲ５細胞では、ＢａＬ株に対するＲＡＮＴＥＳ（１−６８）およびＲ
ＡＮＴＥＳ（３−６８）のＩＣ₅₀は、それぞれ、２１ｎＭおよび０．６５ｎＭで
あった。ＲＡＮＴＥＳ（１−６８）のＩＣ₉₀は、１３３ｎＭより大きいが、これ
に対してＲＡＮＴＥＳ（３−６８）のＩＣ₉₀は、６３ｎＭであった。また、表Ｖ
では、ＲＡＮＴＥＳ（１−６８）は、ＨＯＳ．ＣＤ４．ＣＣＲ５細胞内で事実上
不活性であった（ＩＣ₅₀＞１３３ｎＭ）が、これに対してＲＡＮＴＥＳ（３−６
８）は、これら細胞内でのＨＩＶ−１ ＢａＬ複製の潜在的阻害剤である（ＩＣ ₅₀ ：５．５ｎＭ）ことを、示している。しかしながら、ＩＣ₉₀値は、これら細胞
内の両方の型のＲＡＮＴＥＳでは、達成されなかった。ＲＡＮＴＥＳの抗ウイルス活性は、膜結合または可溶性のＣＤ２６（ｓＣＤ２６ ）の存在に依存する。

【００７６】 ２つの異なるＣＣＲ５−トランスフェクト細胞系上および新たに分離したＰＢ
ＭＣ上でのＣＤ２６発現を評価した。ＨＯＳトランスフェクタントは、フローサ
イトメトリー分析によって定量したところ、ＣＤ２６発現（−）であったが、Ｕ
８７トランスフェクタントは、抗−ＣＤ２６ ｍＡｂで弱いが有意に（＋）に染
色された（図９）。さらに、新たに単離されたＰＭＢＣの亜集団は、ＣＤ２６発
現に強陽性であることが分かった（図９）。

【００７７】 ｓＣＤ２６の存在下でのＨＯＳ．ＣＤ４．ＣＣＲ５トランスフェクト細胞内の
ＢａＬ株によるウイルスｐ２４ Ａｇ生成へのＲＡＮＴＥＳ（１−６８）および
ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）の濃度依存性影響を表１０に示す。ＨＩＶ感染開始時
に、ＲＡＮＴＥＳ（１−６８）と共にｓＣＤ２６を加えると、ＨＯＳ．ＣＤ４．
ＣＣＲ５細胞内の完全なＲＡＮＴＥＳの抗ウイルス活性を有意に強化した。５０
Ｕ／ＩのｓＣＤ２６をＲＡＮＴＥＳと共に加えた場合、ＲＡＮＴＥＳのＩＣ₅₀＝
１３ｎＭであった。ｓＣＤ２６を単独で加えても、ウイルス複製に影響を与えな
かった。また、ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）へのｓＣＤ２６の付加は、ＲＡＮＴＥ
Ｓ（３−６８）の抗ウイルス活性を変化させなかった（データには示していない
）。このように、ＣＤ２６の存在は、完全なＲＡＮＴＥＳに重要であり、抗ウイ
ルス活性になる。アミノ末端切除型の天然ＭＩＰ−１αは、その抗−ＨＩＶ−１走化性活性および Ｃａ²⁺移動活性に影響を与えない。

【００７８】 大部分の天然型ＭＩＰ−１αは、ＮＨ₂-末端切除型（４アミノ酸）であるので
、我々は、この切除型ＭＩＰ−１α（５−７０）が別のＨＩＶ−１阻害能力を持
つか否かについて研究した。ＲＡＮＴＥＳで得られた結果とは対照的に、ＰＭＢ
ＣまたはＣＣＲ５−トランスフェクト細胞内での完全なＭＩＰ−１αおよびＭＩ
Ｐ−１α（５−７０）のＩＣ₅₀値に有意の違いは、検出されなかった（表５、図
８）。さらに、完全なＭＩＰ−１αおよび切除型ＩＰ−１α（５−７０）を、Ｔ
ＨＰ−１単球細胞上での走化性および細胞内Ｃａ²⁺−移動アッセイで比較した。
表ＶＩは、［Ｃａ²⁺］_i の上昇を誘導するＭＩＰ−１α（５−７０）の最小有効
投与量が、完全なＭＩＰ−１αより僅かに低いのみであったことを示している。
さらに、走化性アッセイで０．１３ｎＭと得られた最大遊走は、完全なＭＩＰ−
１αでより高かったが、ＭＩＰ−１αのイソ型の両方の最少影響濃度は、むしろ
類似していた。一緒にすると、ＲＡＮＴＥＳとは対照的にＭＩＰ−１αのＮＨ₂-
末端プロセシングは、その炎症性活性および抗−ＨＩＶ−１活性を最少限、弱め
るのみであると断定されるはずである。

【００７９】

【表５】

【００８０】

【表６】

【００８１】

【表７】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＲＡＮＴＥＳのアミノ酸配列を示している。シグナル配列を、イタリック体で
、Ｃ−末端を太字で示している。矢印は、ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）と呼ばれる
、本発明のアミノ末端切除型ＲＡＮＴＥＳの最初のアミノ酸を示している。

【図２】 単球ＴＨＰ−１細胞に対する完全、および天然または組換えのＮＨ₂-末端切除
型のＲＡＮＴＥＳの走化性能力を、Ｂｏｙｄｅｎミクロチャンバーアッセイで比
較している：天然のＲＡＮＴＥＳ（１−６８）（△）、天然の切除型ＲＡＮＴＥ
Ｓ（３−６８）（□）、完全な組換えＲＡＮＴＥＳ（１−６８）（▲）およびＣ
Ｄ２６／ＤＰＰ ＩＶ切断組換えＲＡＮＴＥＳ（３−６８）（黒四角）。結果は
、４回以上の独立した実験からの平均走化性指数（ＣＩ）(chemotactic index)
±ＳＥＭで表す。

【図３】 ＴＨＰ−１細胞内の［Ｃａ²⁺］_i への天然ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）（□）、
天然ＲＡＮＴＥＳ（１−６８）（△）、組換えＲＡＮＴＥＳ（１−６８）（▲）
および組み換えＣＤ２６／ＤＰＰ ＩＶ処理ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）（黒四角
）の影響。

【図４】 完全なｒｅｃＲＡＮＴＥＳ（１−６８）対ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）のＣａ²⁺ −移動活性の脱感作を示している。最初に、ＴＨＰ−１細胞をバッファーまたは
異なる濃度の組換えＲＡＮＴＥＳ（１−６８）またはＲＡＮＴＥＳ（３−６８）
で刺激した。第二の刺激として３０ｎｇ／ｍｌの完全な組換えＲＡＮＴＥＳに応
答する結果を、［Ｃａ²⁺］_i の増加として、平均±ＳＥＭ（三回以上の独立した
実験）で表す。

【図５】 完全なＲＡＮＴＥＳ（１−６８）と切除型ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）との走化
性能力の比較。天然（ｎａｔ）および組換え（ｒｅｃ）の切除型ＲＡＮＴＥＳ、
完全なＲＡＮＴＥＳおよび合成ＭＣＰ−３の好酸性顆粒球走化性活性を、ミクロ
チャンバーアッセイで定量した。結果は、２回以上の独立した実験（それぞれ３
回づつ行った）からの平均走化性指数（ＣＩ）±ＳＥＭで表す。

【図６】 ＣＣＲトランスフェクタントでの完全なＲＡＮＴＥＳによるカルシウム移動性
の脱感作。カルシウム移動実験は、ＣＤ４およびＣＣケモカインレセプターＣＣ
Ｒ１またはＣＣＲ５でトランスフェクトされたＨＯＳ細胞で行った。細胞は、最
初に、異なる濃度の完全または切除型ＲＡＮＴＥＳで、次に１００ｎｇ／ｍｌの
完全なＲＡＮＴＥＳで、刺激した。第二刺激により誘導される［Ｃａ²⁺］_i の阻
害率（％）を示す。この割合（％）は、バッファー（１００％）での刺激後に対
するＲＡＮＴＥＳ（１−６８）またはＲＡＮＴＥＳ（３−６８）付加後の、１０
０ｎｇ／ｍｌの完全なＲＡＮＴＥＳの応答を比較することによって、計算した。
結果を平均阻害率（％）±ＳＥＭ（２回以上の実験）で表す。

【図７】 ＨＩＶ−１による単核細胞感染へのＲＡＮＴＥＳ（３−６８）の潜在的阻害効
果。様々な濃度のＲＡＮＴＥＳ（１−６８）またはＲＡＮＴＥＳ（３−６８）（
１−１，０００ｎｇ／ｍｌを感染時に加える）の存在下で、ＰＨＡ−活性化ＰＢ
ＭＣを、Ｍ−ｔｒｏｐｉｃ ＨＩＶ−１ Ｂａ−Ｌ株に感染させた。１０日後、
ウイルス収率を、ｐ−２４ Ａｇ ＥＬＩＳＡ（４回の実験の内一回の実験を示
す）により、細胞上澄液でモニターした。

【図８】 ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣ内へのＨＩＶ−１ ＳＦ１６２株による感染へのＲＡ
ＮＴＥＳ（１−６８）およびＲＡＮＴＥＳ（３−６８）の影響。ウイルス収率は
、感染１０日後、細胞上澄み液をｐ２４ Ａｇ ＥＬＩＳＡによりモニターした
。３回の実験の内１回の実験結果を示す。^* ｐ２４ Ａｇ ＥＬＩＳＡの検出限
界以下（＜５ｐｇ／ｍｌ）。

【図９】 ＨＯＳ．ＣＤ４．ＣＣＲ５細胞、Ｕ８７．ＣＤ４．ＣＣＲ５細胞および新たに
単離されたＰＢＭＣ上でのＣＤ２６の発現。ＣＤ２６陽性細胞の割合（％）を個
々のヒストグラムに示す。

【図１０】 ＨＩＶ−１ ＢａＬ株によるＨＯＳ．ＣＤ４．ＣＣＲ５細胞の感染へのＲＡＮ
ＴＥＳ（１−６８）、ＲＡＮＴＥＳ（１−６８）＋ｓＣＤ２６（５０Ｕ／Ｌ）、
およびＲＡＮＴＥＳ（３−６８）の影響。ウイルス収率は、ｐ２４Ａｇ ＥＬＩ
ＳＡにより、感染８日後の細胞上澄み液をモニターした。３回行った実験の内１
回の実験結果を示している。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年１２月１３日（２０００．１２．１３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２】

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３

【補正方法】変更

【補正内容】

【図３】

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】

【手続補正４】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５】

【手続補正５】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図６

【補正方法】変更

【補正内容】

【図６】

【手続補正６】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図７

【補正方法】変更

【補正内容】

【図７】

【手続補正７】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図８

【補正方法】変更

【補正内容】

【図８】

【手続補正８】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図９

【補正方法】変更

【補正内容】

【図９】

【手続補正９】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１０

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１０】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ Ａ６１Ｐ 37/02 29/00 43/00 １０７ 31/00 １１１ 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/52 43/00 １０７ Ｃ１２Ｎ 1/15 １１１ 1/19 Ｃ０７Ｋ 14/52 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｇ０１Ｎ 33/68 1/19 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/02 5/10 37/54 Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (31)優先権主張番号 ９８１０４２１６．１ (32)優先日 平成10年３月10日(1998．3．10) (33)優先権主張国 欧州特許庁（ＥＰ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＵ ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＨＵ，ＩＬ， ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＳＧ，Ｓ Ｋ，ＵＡ，ＵＳ (72)発明者 ストルーフ，ソフィー ベルギー王国ベー−2841 ルムスト，モレ ンストラート 66 (72)発明者 ファン・ダンメ，ヨ ベルギー王国ベー−1000 ブリュッセル, ティントレットストラート 32

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 天然発生ＲＡＮＴＥＳのアミノ酸末端１、１−２、１−３、
   または１−４に相当するＮＨ₂-末端アミノ酸を欠き、ケモカインアンタゴニスト
   活性を有する、アミノ末端切除型ＲＡＮＴＥＳ。
2. 【請求項２】 天然発生ＲＡＮＴＥＳのアミノ酸末端１−２に相当するＮＨ ₂ -末端アミノ酸を欠き、ケモカインアンタゴニスト活性を有する、請求項１記載
   のアミノ末端切除型ＲＡＮＴＥＳ。
3. 【請求項３】 配列番号２のアミノ酸配列を持つ、請求項１記載のアミノ末
   端切除型ＲＡＮＴＥＳ。
4. 【請求項４】 グリコシル化型の、一つ以上の前記請求項に記載のアミノ末
   端切除型ＲＡＮＴＥＳ。
5. 【請求項５】 実質上同一のヌクレオチド配列を含む、一つ以上の前記請求
   項のいずれか一項に記載の本発明のアミノ末端切除型ＲＡＮＴＥＳをコードする
   ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子。
6. 【請求項６】 任意の請求項５記載のＤＮＡ分子を含む、発現ベクター。
7. 【請求項７】 請求項６の発現ベクターを含む宿主細胞。
8. 【請求項８】 請求項７記載の細胞を適当な培養基内で培養することを含む
   、請求項１から４のいずれか一項に記載の任意のタンパク質を調製するための組
   換え方法。
9. 【請求項９】 薬として用いるための、請求項１から４のいずれか一項に記
   載のタンパク質。
10. 【請求項１０】 ケモカイン効果のアンタゴニスト活性を必要とする、疾病
    を治療および／または診断するための薬剤製造における、請求項１から４のいず
    れか一項に記載のタンパク質の使用。
11. 【請求項１１】 炎症性疾病、ＨＩＶ−感染、脈管形成−および造血−関連
    疾病ならびに腫瘍を治療するための薬剤製造における、請求項１０記載の使用。
12. 【請求項１２】 医薬として許容しうる一つ以上のキャリヤーおよび／また
    は賦形剤と共に請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質を含む、医薬
    組成物。
13. 【請求項１３】 ケモカイン効果のアンタゴニスト活性を必要とする、疾病
    の治療および／または診断へのＣＤ２６／ＤＰＰ ＩＶの使用。
14. 【請求項１４】 炎症性疾患、免疫性疾患および感染性疾患の治療への、請
    求項１３記載の使用。