JP2000508527A

JP2000508527A - 単球走化性タンパク質―５物質及び方法

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Publication number: JP2000508527A
Application number: JP9534600A
Authority: JP
Inventors: ゴディスカ，ロナルド; グレイ，パトリック，ダブリュ．
Original assignee: アイコスコーポレイション
Priority date: 1996-03-27
Filing date: 1997-03-26
Publication date: 2000-07-11
Also published as: US20020102642A1; AU2547797A; AU733925B2; AU733925C; EP0889961A2; CA2250576A1; WO1997035982A2; WO1997035982A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＭＣＰ−５と命名された、マクロファージ由来の新規ヒトＣ−Ｃケモカインをコードする、精製及び単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。さらに提供されるのは、精製及び単離されたケモカインタンパク質、その断片及びポリペプチド類似体、それらに対する抗体、そしてそれらの組換え製造のための物質及び方法である。これらの産物は、治療、診断及び医学画像などの適用において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】単球走化性タンパク質−５物質及び方法本出願は、概してケモカインに関し、さらに詳細には、単球走化性タンパク質 −５（ＭＣＰ−５）と命名された、新規ヒトＣ−Ｃケモカイン及びその類似体をコードする、精製及び単離されたポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドによってコードされる精製及び単離されたケモカインポリペプチド、ならびにこれらポリペプチドの組換え製造のための物質及び方法に関する。発明の背景「インタークライン（intercline）」及び「ＳＩＳサイトカイン」としても知られるケモカインは、分泌小タンパク質（およそ７０〜１００アミノ酸であり８〜１０キロダルトンのサイズのもの）のスーパーファミリーを含むものであり、これらタンパク質は主として白血球を誘引及び活性化し、それによって免疫系の刺激及び調節を補助する。「ケモカイン」の名は走化性サイトカインの語に由来しており、これらのタンパク質が白血球の走化性を刺激する能力に基づいている。実際、ケモカインは、炎症細胞に対する病理組織への主な誘引物を構成している。一般に、Baggioliniら、Advences in Immunol．55巻、97〜179頁(1994)を参照されたい。白血球がケモカインの豊富な供給源を構成している一方で、いくつかのケモカインは、多くの組織に発現されている。Baggioliniら、前出、表ＩＩ。いくつかのケモカインは、白血球に加えて、内皮細胞及び繊維芽細胞などの様々な細胞も活性化または誘引する。これまでに同定されたケモカインは一般に、互いに２０〜７０％のアミノ酸同一性を呈し、そして高度に保存された４つのシステイン残基を含んでいる。これらシステイン残基の最初の２つの相対的な位置に基づいて、ケモカインはさらに２つのサブファミリーに分類されている。ヒト第４染色体に局在する遺伝子によってコードされる、「Ｃ−Ｘ−Ｃ」あるいは「α」サブファミリーでは、最初の２つのシステインは１つのアミノ酸によって最初の２つのシステインが分かたれている。ヒト第１７染色体によってコードされる「Ｃ−Ｃ」あるいは「β」サブファミリーでは、最初の２つのシステインが隣接している。いくつかのケモカインのＸ線結晶及びＮＭＲによる研究の結果、各ファミリーにおいて、第１及び第３番目のシステインが第１のジスルフィド結合を形成し、そして第２及び第４番目のシステインが第２のジスルフィド結合を形成しており、タンパク質の天然のコンフォメーションに強い影響を及ぼしていることが示されている。ヒトだけで、各ケモカインサブファミリーについてほぼ１０の異なる配列が報告されている。双方のサブファミリーに属するケモカインは、２０〜２２アミノ酸の特徴的なリーダー配列を有している。Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（ＩＬ−８、ＧＲＯα／β／γ、血小板塩基性タンパク質、血小板因子４（ＰＦ４）、ＩＰ−１０、その他を含む）は、そのうちいずれか２つのアミノ酸配列を比較した場合におよそ２５〜６０％の同一性を有している（互いに８４〜８８％の同一性を有するＧＲＯα／β・γメンバーは例外である）。サブファミリーのメンバーのほとんど（ＩＰ−１０及び血小板因子４を除く）が、最初の２つのシステイン残基の上流に、共通のＥ−Ｌ−Ｒトリペプチド・モチーフを有している。Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインは一般に、好中球の強力な刺激物質であり、速やかな形状変化、走化性、レスピラトリーバースト、及び脱顆粒を引き起こす。これらの効果は、７つの膜貫通ドメインを有するロドプシン様Ｇタンパク質が結合した受容体によって媒介される。ＩＬ−８に対して特異的な受容体は、Holmesら、Science、253巻、1278〜80頁(1991)によってクローニングされており、一方、ＩＬ−８、ＧＲＯ及びＮＡＰ２を認識する類似の受容体（７７％の同一性）が、 Murphy及びTiffany、Science、253巻、1280〜1283頁(1991)によってクローニングされている。ＩＬ−８を含む特定のＣ−Ｘ−ＣケモカインのＮ−末端アミノ酸配列の特異的な切除は、活性の顕著な増加を伴う。Ｃ−Ｃケモカイン（マクロファージ炎症性タンパク質、ＭＩＰ−１α［Nakao ら、Mol.Cell Biol.、10巻、3646頁(1990)及びＭＩＰ−１β［Brownら、J.Immun ol．142巻、679頁(1989)］、単球走化性タンパク質ＭＣＰ−１［Matsushimaら、 J.Exp.Med.、169巻、1485頁(1989)］、ＭＣＰ−２［Van Dammeら、J.Exp.Med.、 176巻、59頁(1992)及びChangら、Int.Immunol.、１巻、388頁(1989)］、ＲＡＮＴＥＳ［Schallら、J.Immunol.、141巻、1018頁(1988)］、Ｉ−３０９［Miller ら、J.Immunol.、143巻、2907頁(1989)］、エオタキシン［Rothenbergら、J.Exp .Med.、181巻、1211〜1216頁(1995)］その他を含む）は、互いに２５〜７０％のアミノ酸の同一性を有している。ケモカインのこのサブファミリーは、一般に単球、白血球、好塩基球及び好酸球を活性化するが、好中球の活性化は行わない。エオタキシンを除き、これまでに報告されたＣ−Ｃケモカインのすべてが単球を活性化して、カルシウムの流入と走化性を引き起こす。さらに選択的な効果が、例えば、ＲＡＮＴＥＳに対して最も強く応答するＴリンパ球などのリンパ球に対して認められる。Ｃ−Ｃケモカインに対する、７つの膜貫通ドメインを有するＧタンパク質結合受容体４つが、今日までに報告されている。すなわち、ＭＩＰ−１α及びＲＡＮＴＥＳを認識するＣ−Ｃケモカイン受容体−１［Neoteら、Cell、72巻、415〜42 5頁(1993)］、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−１に対する受容体−１［Powerら、J.Biol.Chem.、270巻、19495〜19500頁(1995)］、ＭＣＰ−１受容体 −１［Charoら、Proc.Nat.Acad.Sci.、91巻、2752〜56頁(1994)］、ならびにエオタキシン受容体［Combadiereら、J.Biol．Chem.、270巻、16491〜16494頁(199 5)］。ＭＣＰは、線維芽細胞、内皮細胞、及び単核白血球などの多くの細胞型によって生産される。これらの細胞は、サイトカイン、リポ多糖、及び感染性物質などの様々な刺激に応答してケモカインをつくり出すのである。ＭＣＰは、単球の炎症部位への移動を調節するのに大きく関与していると考えられており、かかる部位において、これらの細胞が炎症、修復及び繊維形成における役割を果たすのである。ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−１及びＭＣＰ−３は構造的及び機能的類似性を大いに共有しているものの、それらは独特の特徴も有している。ＭＣＰ−１の生産はは、ほとんどの細胞系においてＭＣＰ−２及びＭＣＰ−３の生産の約１０倍である。［Van Dammeら、J.Immunol.、152巻、5495〜5502頁(1994)］。ＭＣＰ−１受容体は、ＭＣＰ−１及びＭＣＰ−３を認識するが、ＭＣＰ−２には結合しない。［Franciら、J.Immunol.、154巻、6511〜6517頁(1995)］。これら３つのＭＣＰの発現パターンもまた、相違している。ＭＣＰ−１及びＭＣＰ−３の双方は、導入されている（recruiting）単球に加えて、好塩基球も誘引及び活性化する。ＭＣＰ−３は好酸球に対して主たる活性を有しており、一方ＭＣＰ−１は生理学的関連濃度では好酸球を活性化することはない。ＭＣＰ−２は、好酸球及び好塩基球の双方で、弱い移動応答を導き出す。［Webesら、J.Immunol.、154巻、41 66〜4172頁(1995)］。最近、ＭＣＰ、ＭＣＰ−４を目的とした単離が、１９９５年１１月２３日付のＰＣＴ公開番号第WO95/31467号に報告されている。特にＩＬ−８などの、数多くのケモカイン類の役割が、様々な病態につき多く報告されている。一般的には、Baggioliniら、前出、表ＶＩＩを参照されたい。例えば、乾癬は、ＩＬ−８の過剰生産に関連しており、そして多くの研究で、リウマチ性疾患、骨関節炎、及び通風に罹患している患者の炎症している関節の滑液中でＩＬ−８のレベルが高いことが観察された。病態におけるＣ−Ｃケモカインの役割も、ＩＬ−８の役割ほどに総括的ではないにせよ報告されている。例えば、他の関節炎疾患に罹患している患者よりも、慢性関節リウマチに罹患している患者の滑液中で、ＭＣＰ−１の濃度は高い。単核食細胞のＭＣＰ−１依存性の流入は、特発性肺繊維症の発症における重要な事象であるかもしれない。アテローム性動脈硬化の領域への単球の導入におけるＣ −Ｃケモカインの役割が現在のところ興味をもたれており、マクロファージに富む動脈壁領域でＭＣＰ−１発現の増強が検出されているが、正常の動脈組織ではそのようなことはない。ＭＣＰはまた、脈管形成及び腫瘍の成長または転移の誘導にも関係している。悪性細胞におけるＭＣＰ−１の発現は、in vivoで腫瘍を形成する細胞の能力を抑制することが示されている。（米国特許第5,179,078号を参照されたい（引用することにより本明細書に組み入れることとする）。）近年の証拠によって、様々なケモカインがＡＩＤＳの処置に役割を果たしうることも暗示されている。加えて、ケモカインは脊髄造血にも関わっているかもしれない。従って、病態におけるこの重要なファミリーの役割をさらに解明し、そしてケモカインに由来するペプチドを利用する、かような病態のための改善された処置法を開発するために、さらなるＣ−Ｃケモカイン、特にＭＣＰケモカインの同定及び特徴付けに対する要求が現存している。Ｃ−Ｃサブファミリーのケモカインは、医学画像における、例えば感染、炎症、及びＣ−Ｃケモカイン受容体分子を有するその他の部位などの画像化に対する用途を有することが示されている。例えば、Kunkelら、米国特許第5,413,778号（引用することにより本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。このような方法には、当該技術分野で認められた技術（例えば、米国特許第4,965,39 2号及び5,037,630号を参照されたい（引用することにより本明細書に組み入れることとする））を使用して、Ｃ−Ｃケモカインに標識物質（例えば、放射活性同位体）を化学的に接着させて、被験者に医薬上容認されうる担体に含まれる、標識されたケモカインを投与して、標識されたケモカインを標的部位に蓄積させて、そして標的部位にてin vivoで、標識されたケモカインを画像化することが包含される。医学画像のツール使用可能な蓄積を増やすために、さらなる新しいＣ −Ｃケモカインに対する要求が、当該技術分野で現存している。さらに一般的に、走化性及び炎症のメディエーターとしてのケモカインの重要性のゆえに、炎症及び免疫応答のモジュレーションを容易ならしめるために、ケモカインファミリーの新しいメンバーの同定及び単離に対する要求が現存している。例えば、免疫応答を促進する物質は、創傷の治癒や、肺炎などの感染性疾患からの回復の速度を促進するかもしれない。炎症を低下させる物質は、関節炎、クローン病、及び他の自己免疫疾患などの、炎症によって媒介される病態を処置するために有用でありうる。また、ケモカイン発現と、炎症状態及び疾患状態との間の相関の確認から、ケモカインの用途に対する、診断及び予後の指標が提供され、さらにケモカインに特異的に免疫反応性を有する抗体物質に対する同様の指標が提供されるので、かかる診断及び予後の指標などを容易ならしめるために、新しいケモカインの同定及び単離に対する要求が現存している。前記したすべての理由のため、新しく発見されたケモカインの製造の組換え法に対する要求が現存し、この方法は、ケモカイン及びケモカイン阻害剤に関する臨床上の適用を容易ならしめるものである。発明の要約本発明は、単球走化性ケモカインタンパク質−５（ＭＣＰ−5）と命名された新規のヒトＣ−Ｃケモカインをコードする、精製及び単離されたポリヌクレオチド、その断片及び類似体、精製及び単離されたポリペプチド、その断片及び類似体、これらポリペプチドの組換え製造のための物質及び方法、かかるＭＣＰ−５ポリペプチド及び類似体に対する抗体、ならびにこれらのポリペプチド、断片、類似体、または抗体を含む医薬組成物を提供することによって、概説した如上の要求の一つ以上を満たすものである。本発明は特に、配列番号：２に示されるＭＣＰ−５アミノ酸配列をコードする、精製されたポリヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、双方ともセンス及びアンチセンス鎖）、特に配列番号：１に示されるＭＣＰ−５ヌクレオチド配列のタンパク質をコードする部分からなるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；配列番号：２のアミノ酸第１〜７５位をコードする、精製されたポリヌクレオチド、特に配列番号：１のヌクレオチド第７０〜２９７位からなるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；ならびに（ａ）配列番号：１のＤＮＡ；（ｂ）配列番号：１のＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズするポリヌクレオチド、または遺伝コードの縮重なしに同相補鎖にストリンジェントな条件下にハイブリダイズすると考えられるポリヌクレオチド；ならびに（ｃ）配列番号：１のＤＮＡと同じＭＣＰ−５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、このようなポリヌクレオチドを含むベクター、特にＭＣＰ−５をコードするＤＮＡが発現制御ＤＮＡ配列に作動可能に連結された発現ベクター、かかるポリヌクレオチドＤＮＡで安定に形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞、ならびにこれら宿主細胞を培養し、そしてその宿主細胞またはその普通培地からＭＣＰ−５を単離することによってＭＣＰ−５を製造するための、対応する方法も提供するものである。本発明はさらに、精製されたＭＣＰ−５ポリペプチド、特に配列番号：２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号：２のアミノ酸第１〜７５位を含むポリペプチドを提供する。本発明はさらに、ＭＣＰ−５と特異的な反応性を有する抗体（モノクローナル抗体を包含する）及びかかるモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞系を提供することを特徴とする。本発明を以下にさらに詳説する。本発明は、ＭＣＰ−５をコードする、精製及び単離されたポリヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡ、双方ともセンス及びアンチセンス鎖）を提供する。本発明の好ましいＤＮＡ配列には、ゲノム及びｃＤＮＡ配列ならびに化学合成されたＤＮＡ配列が包含される。このＭＣＰ−５ケモカインをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、配列番号：１に示す。ＭＣＰ−５をコードするが、５’及び３’非翻訳配列も含む、さらに大きなｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、配列番号：３に示す。本発明の好ましいＤＮＡは、配列番号：１のヌクレオチド第７０〜２９７位を含んでおり、これは、シグナル配列を含まない、成熟した分泌型のＭＣＰ−５の推定コード配列を含むものである。ケモカインＭＣＰ−５のアミノ酸配列を、配列番号：２に示す。本発明の好ましいポリヌクレオチドには、前記したポリヌクレオチドに加えて、配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、そして周知の遺伝コードの縮重のみに起因して、上記にて説明したポリヌクレオチドと相違するポリヌクレオチドが包含される。同様に、配列番号：２の２３アミノ酸（第−２３〜−１位）は切断されて成熟ＭＣＰ−５ケモカインを生じるシグナルペプチドを構成するので、好ましいポリヌクレオチドには、配列番号：２のアミノ酸第１〜７５位をコードするものが包含される。かように、好ましいポリヌクレオチドは、配列番号：２のアミノ酸第１〜７５位を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、精製されたポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドの用途には、ヒトＭＣＰ−５をコードするゲノムＤＮＡ（この遺伝子はＣ−Ｃケモカイン遺伝子に特徴的な３つのエクソン／２つのイントロンを有しているらしい）を同定及び単離するための；ＭＣＰ−５と相同のタンパク質をコードするヒト以外の遺伝子を同定及び単離するための；ＭＣＰ −５と類似性を有する、ヒト及びヒト以外のケモカインを同定するための；そしてＭＣＰ−５を発現する細胞を同定するため、及びタンパク質の発現条件を同定するための、ハイブリダイゼーションプローブがある。しかして、別の特徴において、本発明は配列番号：１のＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下ハイブリダイズする、精製されたポリヌクレオチドを提供する。同様に、本発明は、遺伝コードの縮重なしに、配列番号：１のＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするであろう、精製されたポリヌクレオチドを提供する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、以下の通りである。すなわち、42℃にて、5X SSC、20mM NaPO₄、ｐＨ 6.8 、50％ホルムアミドでハイブリダイゼーションを行い、そして42℃にて、0.2X S SCで洗浄する。当業者には、ハイブリダイズされるべき配列の長さ及びＧＣヌクレオチド含量に基づいて経験的にこれらの条件を変更すること、そしてかような変更を決定するための常則が存在することが理解されよう。［例えば、Sambrook ら、Molecular Cloning:a Laboratoryl Vanual.、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor）ニューヨーク(1989)を参照されたい。］他の特徴において、本発明は、如上のあらゆるＤＮＡを含め、本発明のＤＮＡを組み込んだ、プラスミド及びウイルスＤＮＡベクターを包含する。好ましいベクターには、組み込まれたＭＣＰ−５をコードするｃＤＮＡが内在性または異種性の発現制御配列に作動可能に連結されている発現ベクターが包含される。かかる発現ベクターはさらに、ＭＣＰ−５をコードするＤＮＡ配列と作動性に連結されたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をさらに包含してもよく、かようなベクターは、発現されて目的のＭＣＰ−５ポリペプチドを含む融合タンパク質を生じるのである。他の特徴において本発明は、本発明のＤＮＡまたはベクターで安定にトランスフェクトまたは形質転換された原核性または真核性の宿主細胞を包含する。好ましい宿主細胞において、本発明のＤＮＡまたはベクターによってコードされるＭＣＰ−５ポリペプチドが発現される。本発明のＤＮＡ、ベクター、及び宿主細胞は、例えば、本発明のＭＣＰ−５ポリペプチドの組換えによる大量生産のための方法などにおいて有用である。かかる方法自体も、本発明の特徴に含まれる。例えば、本発明は、ＭＣＰ−５を製造するための方法を包含し、この方法は、以下の工程すなわち、好適な普通培地中で本発明の宿主細胞を生育し、そしてその細胞または培地からＭＣＰ−５タンパク質を単離する工程を含む。さらに他の特徴において、本発明は、精製及び単離されたＭＣＰ−５ポリペプチドを包含する。好ましいペプチドは、配列番号：２のアミノ酸第１〜７５位を含むアミノ酸配列を有する、精製されたケモカインポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、天然の供給源から精製されてもよいが、好ましくは、本発明のＤＮＡ、ベクター、及び／または宿主細胞を使用して組換え法により製造され、あるいは化学的に合成することもできる。本発明の精製されたポリペプチドは、選択された宿主細胞、組換え製造法、単離方法、プロセッシング、保存用緩衝液等によって、グリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよく、水溶性でも不溶性でも、酸化されていても還元されていてもよいなど、種々可能である。あるいは、ＭＣＰ−５ポリペプチドは、ＩＬ−８［Clark-Lewisら、J.B iol.Chem.、266巻、23128〜34頁(1991)］及びＭＣＰ−１などの他のケモカインの製造に対して成功裡に用いられている技術を使用して、化学ペプチド合成によって調製してもよい。本発明はまた、１以上のＮ−末端またはＣ−末端アミノ酸残基が欠失していて、且つＣ−Ｃケモカインに特徴的な生物学的活性の一つ以上を保持している、ＭＣＰ−５ポリペプチド断片も企図する。本発明のさらなる特徴には、本発明のＭＣＰ−５から、１以上のアミノ酸残基が付加、ケッシルまたは置換されており、且つＣ−Ｃケモカインに特徴的な生物学的活性の一つ以上を保持している、ＭＣＰ−５ポリペプチド類似体を包含している。かかる類似体は、例えば、前記の医学画像法、または下記の処置方法にとって有用なものである。それら類似体は、当該技術分野にて知られている種々の組換え法または合成法のいずれによってでも調製されえ、これら方法には、実施例６に後述する方法も含まれる。本発明に関連する特徴に、ＭＣＰ−５の生物学的活性は欠くが、Ｃ−Ｃケモカインとその受容体（１以上）との結合を競合的または非競合的に阻害することができる類似体が包含される。かかる類似体は、例えば、宿主内の内在性ＭＣＰ− ５または他のケモカインの生物学的活性を阻害するための治療用組成物または治療法などにおいて有用である。このようなＭＣＰ−５ポリペプチド類似体は、ＭＣＰ−５をその受容体に呈示するうえで重要であると考えられる、ケモカイン受容体及び／または他の分子（例えば、ヘパリン、グリコサミノグリカン、赤血球ケモカイン受容体など）へのＭＣＰ−５の結合特性をモジュレートするために、特に企図されるものである。関連する特徴において、本発明はかかるＭＣＰ−５ポリペプチド類似体をコードする、精製及び単離されたポリヌクレオチドを提供し、このポリヌクレオチドは、例えば、ＭＣＰ−５ポリペプチド類似体の組換え製造；かかるポリヌクレオチドをを組み込んだプラスミド及びウイルスベクター；ならびにかかるベクターまたはプラスミドで安定に形質転換された原核性及び真核性の宿主細胞などのために有用である。他の特徴において、本発明は、本発明のＭＣＰ−５ポリペプチド及びポリペプチド類似体と特的な免疫反応性を有する抗体物質（例えば、モノクローナル及びポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラまたはヒト化抗体等）を包含する。本発明はさらに、本発明の抗体物質を生産するハイブリドーマ細胞系を包含する。かかる抗体は、例えば、本発明のポリペプチドを精製するため、例えば周知のＥＬＩＳＡ技術などを用いた、液体または組織試料中のＭＣＰ−５の検出または定量的測定のため、そしてＭＣＰ−５の受容体（１以上）への結合をモジュレートするために有用である。あるケモカイン抗体（例えば、抗ＩＬ−８抗体）は、劇的な抗炎症効果を有することが示されている。本発明の組換えＭＣＰ−５ポリペプチド及びポリペプチド類似体を、結合反応で抗体に対するように利用して、ＭＣＰ−５の受容体を発現している細胞を同定したり、受容体をコードするポリヌクレオチドを単離するための標準的な発現クローニングに利用してもよい。例えば、以下の実施例１６と、Holmesら、前出、及びCharoら、前出にそれぞれ記載されるＩＬ−８及びＭＣＰ−１受容体のクローニングを参照されたい。かようなＭＣＰ−５ポリペプチド、ＭＣＰ−５ポリペプチド類似体、及びＭＣＰ−５受容体ポリペプチドは、ＭＣＰ−５ケモカイン活性のモジュレーションのために、そしてポリペプチド及び化学（例えば、小分子）ＭＣＰ−５アゴニスト及びアンタゴニストの同定のために有用である。本発明はまた、創傷または感染性疾患に罹患している哺乳動物における免疫応答を増強するための方法において使用されるための、ＭＣＰ− ５ポリペプチド、断片、またはそれらの類似体を含む医薬組成物も企図するものである。さらに企図されるのは、関節炎、クローン病、または他の自己免疫疾患などの、炎症によって媒介される病態で炎症を減少させるための方法において使用されるための、ＭＣＰ−５ポリペプチド、断片、またはそれらの類似体を含む医薬組成物である。さらにまた企図されるのは、アテローム性動脈硬化、脈管形成または腫瘍成長もしくは転移の低減に使用するための医薬組成物である。かかる医薬組成物は、生理学的に容認しうる希釈剤または担体と共に、ＭＣＰ−５ポリペプチドまたはその断片もしくは類似体、またはそれらに対する抗体を含んでなり、そして例えば抗炎症剤などの他の適切な治療剤を適宜に含んでもよい。ＭＣＰ−５の投与量は、処置すべき病態に依存して、約１μｇから10mg/kg体重の間で変化する。かかる組成物は、処置すべき病態によって、皮下、筋肉内、静脈内、経肺、経皮、髄腔内、経口、または座剤による投与などを含む様々な経路によって投与するとよい。如上のＭＣＰ−５物質及び方法は、臨床応用にて用いるとよい。第１に、ケモカイン類は単球及びマクロファージを誘引及び活性化する（Baggioliniら、前出）ので、病原性炎症の背景におけるＭＣＰ−５の発現は、疾患部位にさらなる単球及びマクロファージまたは他の白血球を補給すること、既存の白血球を活性化すること、またはその部位への白血球の残存を誘導することによって、その疾患を悪化させるかもしれない。かくして、ＭＣＰ−５の走化性活性を阻害することが、有害な炎症プロセスを緩和するものと期待されうる。重要なことに、好中球を誘引及び活性化するＣ−Ｘ−ＣケモカインであるＩＬ−８に関する実験において、このようなアプローチの潜在的な有益性が直接的に立証されている。ＩＬ−８に対して作製された抗体は、好中球によって媒介される炎症性疾患を阻害する際だった能力を有している［Haradaら、J.Leukoc.Biol.、56巻、559頁(1994)］。ＭＣＰ−５の阻害剤は、例えば、クローン病、慢性関節リウマチ、またはアテローム性動脈硬化などの、単球またはマクロファージが役割を果たすと推定される疾患において同様の効果を有すると考えられる。あるいは、ケモカイン類が創傷治癒や脈管形成にポジティブな効果を有することも示されているので、ＭＣＰ−５の効果を増大させることが疾患に対して好結果をもたらす役割を有するかもしれない。かように、外来性のＭＣＰ−５またはＭＣＰ−５アゴニストは、如上の疾患からの回復を促進するのに好都合でありうる。加えて、Ｃ−ＣケモカインのＭＩＰ−１αについて立証された骨髄抑制効果（ Mazeら、前出）により、ＭＣＰ−５が同様の活性を有するかもしれないことが示唆される。ＭＣＰ−５またはＭＣＰ−５アゴニストによって提供されるこのような活性は、化学療法または放射線療法を受けている患者に対して、その患者の骨髄前駆細胞へのそれら療法の有害な効果を減少させて、実質的な恩恵をもたらしうるものである。ＭＣＰ−５、ＭＣＰ−５アゴニストはさらに、Ｃ−ＣケモカインのＴＣＡ３がマウスで腫瘍形成を阻害する能力によって示唆される（Laningら、前出を参照のこと）ように、腫瘍の処置において臨床的に重要であることも明らかである。ＭＣＰ−５は例えば、腫瘍部位に様々な非特異的エフェクタ細胞を誘引して活性化することにより、または特異的な抗腫瘍免疫性を刺激することにより、直接的または間接的に腫瘍の形成を阻害するように作用しうる。さらには、Ｃ−ＣケモカインのＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１β は、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ−１の複製を抑制することが示されており［Co cchiら、Science、270巻、1811〜1815頁(1995)］、それらをＡＩＤＳの予防または処置における療法剤として利用可能なことが示唆されている。これらのケモカインにＭＣＰ−５が類似していることより、ＭＣＰ−５がＡＩＤＳ患者の処置やこの疾患の発症の予防にＭＣＰ−５が役割を果たしうることも明らかであろう。加うるに、ケモカイン発現と炎症状及び病態との相関を確認することで、ＭＣＰ−５物質（ＭＣＰ−５に特異的な免疫反応性を有する抗体物質を含む）の使用に対する診断及び予後の指標が提供される。かかるＭＣＰ−５物質は、炎症状態及び病態を診断及び予後評価するため、さらにはこのような炎症状態及び病態に関係する領域の医学画像処理のための方法においても有用である。本発明の数多くの特徴及び利点は、現在のところ好ましい実施態様を記載した、以下の実施例を考慮すれば、当業者に明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１は、これまでにその特徴が示された他のＣ−ＣケモカインであるＭＣＰ− １（配列番号：１１）、ＭＣＰ−３（配列番号：１２）、ＭＣＰ−２（配列番号：１３）。ＭＩＰ−１α（配列番号：１４）、ＭＩＰ−１β（配列番号：１５）、ＲＡＮＴＥＳ（配列番号：１６）、及びＩ−３０９（配列番号：１７）のアミノ酸配列と、ヒトＭＣＰ−５のアミノ酸配列との比較を示す図である。スラッシュ「／」は、推定されるシグナルペプチドが切断される部位を示すものである。強調文字で示す残基は、ＭＣＰファミリー間で保存されている。配列のアラインメントを至適化するためにダッシュ（− ）を挿入している。図２には、in vitro走化性アッセイにおける、単球細胞系ＴＨＰ−１に対するＭＣＰ−５及びＭＣＰ−１の効果を示す図である。図３Ａ及び３Ｂは、単球細胞系ＴＨＰ−１の活性化に対するＭＣＰ−５及びＭＣＰ−１の効果を示す図である。図３Ｃ及び３Ｄは、ＭＣＰ−１受容体のＣＣＲ −２Ｂを発現している２９３細胞系（Charoら、前出）の活性化に対する、これらのケモカインの効果を示す図である。発明の詳細な説明本発明は、ＭＣＰ−５をコードする全長のｃＤＮＡ配列の単離に基づいて成し遂げられたものである。このｃＤＮＡより導かれるアミノ酸配列は、９２アミノ酸の長さで、このうち初めの２３のＮ−末端残基がシグナル配列を構成している。表１及び図１に示す、既知ケモカイン類の配列と、上記導かれたＭＣＰ−５アミノ酸配列とのマニュアルによる比較から、ＭＣＰ−５が、他のＣ−Ｃケモカイン類と３０〜６４％のアミノ酸同一性を有していることが示唆される。ＭＣＰ− ５のアミノ酸配列は、ＭＣＰ−１及びＭＣＰ−３と最も類似しているようである。ＭＣＰ−５の構造は、様々な面で既知のＣ−Ｃケモカイン類の構造に強く適合している。類似点には、タンパク質のサイズ；シグナル配列切断の部位；４つの必須システイン残基の位置；そしてＣ−Ｃケモカインに特徴的ないくつかの他のアミノ酸（図１参照）が含まれる。既知のＣ−Ｃケモカイン類の各々と、予測されたタンパク質とを対合して比較すると、これらタンパク質のほとんどとおよそ３０％同一であること、そしてＭＣＰ−１及びＭＣＰ −３と６０％を越えて同一であることが示される（表１参照）。系統樹分析によって、ＭＣＰはＣ−Ｃケモカイン類のサブファミリーを形成していることが立証されている。この明瞭な構造上の類似性にも関わらず、ＭＣＰ−５の機能的特性及び発現パターンは、ＭＣＰ−１の場合と異なっている。ＭＣＰ−５は、in vitroの走化性及びカルシウム流入アッセイにおいて、ＭＣＰ誘引及び活性化の生物学的活性を呈する。しかしながら、Ｃ−Ｃケモカイン類は、伝統的に、前炎症性（proinflammatory）刺激に応答した迅速な誘導によって特徴付けられているが、ＭＣＰ−５についてはこれがあてはまらないのである。ＭＣＰ−５の発現は、休止しているＰＢＭＣまたは新しく単離された単球中では低く、そしてＬＰＳまたはＰＭＡを用いた処置によって増加されえなかった。内皮細胞または繊維芽細胞において、ＭＣＰ−１のこれらの細胞による速やかな誘導を引き起こすはずの条件下に、ＴＮＦαを用いてこれらの細胞を処理することによっても、ＭＣＰ−５の発現は誘導されえなかった。さらに、ＭＣＰ−５のｍＲＮＡは、多くの正常組織、特に小腸及び結腸に構成的に発現されている。ＭＣＰ−５は、これらの、またはそれ以外の組織部位への白血球の正常な運搬において役割を果たしているのかもしれない。ＭＣＰ−５は、ＭＣＰ−１に対してＴＨＰ−１細胞による走化性を低いレベルで導出する。しかしながら、カルシウム流入アッセイによるデータからは、ＭＣＰ−１とＭＣＰ−５とが共通の受容体と相互作用することが示唆されている。ＴＨＰ−１細胞をＭＣＰ−１またはＭＣＰ−３で前処理しておくと、カルシウム流入アッセイにおけるＭＣＰ−５の効果が阻止されるが、ＭＣＰ−５で前処理した場合にＭＣＰ−１またはＭＣＰ−３に対する応答性が完全に組成されるわけではない。ヒトＭＣＰ−１受容体でトランスフェクトされた２９３細胞を、これらのケモカイン類を用いて処理した場合に、同様のカルシウム流入アッセイの結果が得られた。従って、ＭＣＰ−５はＭＣＰ−１受容体に対する弱いアゴニストであるらしく、そして別のＭＣＰ−５受容体とさらに強く相互作用するのかもしれない。本発明の他の特徴及び利点は、以下の例証的な実施例を考慮すれば明らかになるはずである。実施例１には、ヒトマクロファージｃＤＮＡライブラリーからの全長のＭＣＰ−５ｃＤＮＡの単離を記載する。実施例２には、様々なヒト細胞系及び組織におけるＭＣＰ−５遺伝子発現のパターンを調べる実験を記載する。実施例３には、哺乳動物細胞におけるＭＣＰ−５遺伝子の組換え発現と、この結果得られたタンパク質の精製を記載する。実施例４は、原核細胞におけるＭＣＰ −５遺伝子の発現と、その結果得られたタンパク質の精製についてのプロトコルを提供するものである。実施例５は、酵母におけるＭＣＰ−５の組換え生産についてのプロトコルを提供する。実施例６には、ペプチド合成または組換え製造方法による、ＭＣＰ−５及びＭＣＰ−５ポリペプチド類似体の製造を記載する。実施例７は、ＭＣＰ−５と特異的に免疫反応性を有するモノクローナル抗体を作製するためのプロトコルを提供する。実施例８〜１５は、ＭＣＰ−５の生物学的活性を調べるためのプロトコルを提供するものである。実施例８では、in vitroでの単球走化性に対するＭＣＰ−５とＭＣＰ−１の効果を比較し、そして実施例９ではカルシウム流出（flux）アッセイにおける単球の活性化に対するＭＣＰ−５とＭＣＰ−１の効果を比較している。実施例１０及び１１は、好塩基球、肥満細胞、好酸球、単球、マクロファージ及び好中球に対するケモカインの効果についてのアッセイを提供するものである。実施例１２、１３、１４及び１５は、腫瘍成長阻害、腹腔内または皮下注射後の白血球活性化、及び骨髄抑制活性の、in v ivoでのアッセイを提供するものである。実施例１６には、他のＭＣＰ−５受容体のクローニングを記載する。実施例１ＭＣＰ−５をコードする全長のｃＤＮ配列のクローニングＭＣＰ−５の不完全な断片をコードするＤＮＡ配列を、ＧｅｎＢａｎｋのＢＬＡＳＴサービスを使用して、ＭＣＰ−１のコード領域（Matsushimaら、前出）をＧｅｎＢａｎｋの発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースのランダムな配列と比較することによって同定した。以前には特徴付けがなされていないＮＣＢＩＩＤ# 118741が、ＭＣＰ−１及びＭＣＰ−３をコードする遺伝子の部分と６０％の相同性を呈することが観察されたが、これら欠切しているようであった。データベースの記載によれば、このＥＳＴは、正常ヒト肺組織ｃＤＮＡライブラリーから、オリゴｄＴプライマーを使用してクローニングされたものであることが報告されていた。このＥＳＴ断片の端部に相補的な配列を含む合成オリゴヌクレオチドの ell8-F1（5'-TAT AAG CTT CCT TTC AAC ATG AAA GTC TC、配列番号：４）及びel l8-R2（5'-TAT TCT AGA TCA TGT CTT TGG TGT GAA CTT TCC GGC CC、配列番号：５)を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーとして使用して、ヒトマクロファージ由来の異なるｃＤＮＡライブラリーからＥＳＴ配列を増幅した［Tjoelkerら、Nature、374巻、549〜552頁(1995)］。手短に説明すると、ｃＤＮＡライブラリーを以下のとおりに調製した。ポリＡ⁺ ＲＮＡを末梢血単球由来のマクロファージから採収した。二本鎖の平滑末端としたｃＤＮＡを、Invitrogen Copy Kit（San Diego、カリホルニア州）を用いて作製し、そして哺乳類発現ベクターのpRc/CMV（Invitrogen）に挿入する前に、そのｃＤＮＡにBstXIアダプターを連結した。そのプライマーｃＤＮＡライブラリーで、大腸菌XL1-Blue細菌（Staratagene、La Jolla、カリホルニア州）をエレクトロポレーションによって形質転換し、そして100μg/mlのカルベニシリンを含有する９８６枚のプレートに播種した（プレート当たり、およそ３０００の形質転換体）。３７℃にて終夜生育した後、各プレートから細菌を剥取し、９８６の細菌プールを得た。Wi zard Miniprep ＤＮＡ精製システム（Promega、Madison、ウイスコンシン州）を使用して、９８６の細菌プールの各々からプラスミドＤＮＡを単離した。ＭＣＰ−５ｃＤＮＡを担持しているプラスミドを含むＤＮＡプールを同定するために、ＰＣＲ増幅を使用して６０の個々のＤＮＡプールをスクリーニングした。各ＰＣＲ反応混液は、単一のＤＮＡプールからのＤＮＡ0.2μｇ、1.5mM ＭｇＣｌ₂、10mMトリスｐＨ 8.4、0.2mM各ｄＮＴＰ、10μg/mlの各プライマーell8 -F1及びell8-R2、ならびに0.5μｌ Taqポリメラーゼ（５U/μl）（Boehringer M annheim Biochemicals、Indiana-polis、インディアナ州）を含んでいた。反応液を９４℃にて４分間インキュベートし、次いで、９４℃で１５秒間変性、６０ ℃で１５秒間アニーリング、７２℃で６０秒間伸長の３５サイクルを行った。ＰＣＲ反応産物は、0.5X ＴＢＥ緩衝液中で２％アガロースゲルにて電気泳動により分画し［Sambrookら、Molecular Cloning:a Laboratory Manual.、Cold Sprin g Harbor Laboratory(1987)］、そしてエチジウムブロマイドを用いて可視化した。スクリーニングを行った６０のプールのうち１２が、0.3キロベースの予測されたサイズに明瞭に染色しているバンドを形成し、ＭＣＰ−５ｃＤＮＡに密接に関連している配列を含む１以上のプラスミドの存在が示唆された。かかる関連クローンを単離するために、６つの陽性のプラスミドプールからのアリコートを、大腸菌XLI1-Blue細胞へエレクトロポレーションし、これを100μ g/mlのカルベニシリンを含有するアガロースプレートに播種して終夜生育した。コロニーをニトロセルロースに転写し、そして標準のプロトコルに従って（Sambrookら、前出）、ハイブリダイゼーション用に調製した。フィルターをスクリーニングするための、放射標識されたＭＣＰ−５プローブは、２つの合成オリゴヌクレオチドから調製した。オリゴヌクレオチドell8-L1 は、配列番号：１のヌクレオチド第７３〜１３５位からなり、オリゴヌクレオチドell8-L2の配列は、配列番号：１のヌクレオチド第１８４〜１２１位に相補的であった。これらのオリゴヌクレオチドの３’端の１５ヌクレオチドを、0.5μg の各オリゴヌクレオチドと、さらにｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、及びRandom Prime ＤＮＡラベリングキット（Boehringer Mannheim）からのクレノウ緩衝液を含有する反応液中で互いにアニーリングさせた。反応混液を瞬間的に６５℃に加熱し、そして３７℃にまで冷却させた。放射標識されたｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ（DuPont /New England Nuclear、Boston、マサチューセッツ州）を反応液に添加し、そしてクレノウポリメラーゼ（ＢＭＢ）によって対を形成したオリゴヌクレオチドに取り込ませた。取り込まれなかったヌクレオチドは、反応産物をセファデックスＧ−２５クイックスピンカラム（ＢＭＢ）に通すことによって除去した。標識したプローブをフィルターにハイブリダイズさせ、標準プロトコル（Samb rookら、前出）に従って洗浄した。増感スクリーン（Lightening Plus、DuPont 、デラウェア）と共に、フィルターにコダックＸＡＲ−５フィルムを−８０℃にて３時間露光させることによって、ハイブリダイゼーションを検出した。ハイブリダイズするコロニーから培養物を生育し、そしてWizard ＤＮＡ精製キット（P romega）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドのインサートを、Applied Biosystemsの自動化ＤＮＡ配列決定装置（モデル３７３、Foster City、カリホルニア州）を用いて配列決定した。完全なコード配列（配列番号：３）を含む８６０塩基対のクローンを回収し、それによってコードされているタンパク質をＭＣＰ−５と命名した。配列番号：３のヌクレオチド第５８〜３５８位は、ＥＳＴ配列ＮＣＢＩＩＤ#118741に対応しているが、以下の例外が含まれていた。すなわち、ＮＣＢＩＩＤ#118741は配列番号：３の第７０位のヌクレオチドの後にさらに挿入された「Ｔ」を含んでおり；ＮＣＢＩＩＤ#118741は配列番号：３のヌクレオチド第２８２位の後にさらに「Ｇ」を含んでおり；ＮＣＢＩＩＤ#118741は配列番号：３のヌクレオチド第３４４位の後にさらに２つの「Ｇ」を含んでおり；そしてＮＣＢＩＩＤ＃11874 1は配列番号：３のヌクレオチド第３５３位にある「Ｃ」の代わりに「Ｔ」を含んでいた。ＥＳＴ配列と配列番号：３のヌクレオチド第５８〜３５８位との間のこれらの食い違いの結果として、２つのフレームシフトが生じ、これは予測されるタンパク質配列の相違を産み出すものであった。実施例２細胞系及び組織におけるＭＣＰ−５遺伝子発現パターン様々なヒト組織及び細胞系から抽出されたｍＲＮＡのノザンブロッティングによって、ＭＣＰ−５ｍＲＮＡ発現のパターンを調べた。Ａ．ヒト組織におけるＭＣＰ−５遺伝子発現様々なヒト組織におけるＭＣＰ−５ｍＲＮＡの発現を、ＭＣＰ−５ｃＤＮＡの断片を用いてノザンブロットをプローブ探針することによって調べた。断片は、全長のＭＣＰ−５クローンならびに以下のプライマーell8-5B（配列番号：６）及びell8-4R（配列番号：７）0.2μgを含むＰＣＲ反応にて作製した。 ell8-5B：5'-AAT CGG ATC CGG CGG AAC AGC CAG AGG AG-3' ell8-4R：5'-CAG CAA CCT ACT TGC TCA AG-3' プライマーのell8-5Bは、BamHI制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接して配列番号：３のヌクレオチド第９〜２７位を含んでおり、そしてプライマ−ell8-4Rは、配列番号：３のヌクレオチド第６００〜６１９位に相補的なヌクレオチドからなるものである。反応条件は、実施例１に示した通りである。ＰＣＲ反応産物は、ＴＡＥ緩衝液中で２％アガロースゲルに流し（Sambrookら、前出）、そしてエチジウムブロマイドを用いて可視化した。0.6kbの予測されたサイズにある単一の濃いバンドを切り出し、ＴＡＥ緩衝液中で電気的に溶出し、そして標準のプロトコルに従ってエタノール中で沈殿させた（Sambrookら、前出）。断片をRandom Prime ＤＮＡラベリングキット（ＢＭＢ）で標識付けし、そして製造業者の指示に従って、Multiple Tissue Northern Blot（Clontech、P alo Alto）カリホルニア州）にハイブリダイズさせた。最高のＭＣＰ−５の発現は、小腸及び結腸に認められ、肺、心臓、胎盤、及び胸腺には、より低レベルの発現が観察された。フィルムを過度に露光すると、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、前立腺、精巣、子宮、及び末梢血白血球において極めて低い発現が検出可能であったが、脳及び脾臓では検出できなかった。Ｂ．マクロファージ成熟の際のＭＣＰ−５遺伝子発現ヒト単球及び分化したマクロファージによるＭＣＰ−５発現を調べた。一人のドナー由来のヒト単球を、プラスチックへの接着によって単離し、そして100ng/mlのＬＰＳの存在下または非存在下に８時間培養するか、または刺激（stimulation）を加えずに６日間培養した（これらの条件下に、単球はマクロファージへ分化する。Tjoelker、前出）。これらの細胞から単離したＲＮＡ（１レーン当たり20μg）のノザンブロットを調製し、本実施例のＡ項に記載したＭＣＰ−５に対するプローブを使用して、プローブ探針した。ＭＣＰ−５は刺激していない単球にて、及び分化したマクロファージにて低レベルに発現していた。その発現が、単球をＬＰＳ（ＭＣＰ−１の強力な誘導剤）で処理することによって増加することはなかった。ＭＣＰ−５の発現は休止しているＰＢＭＣまたは新しく単離された単球では低く、そしてＬＰＳを用いた処理によって増加されえなかった。内皮細胞、上皮細胞（Ａ５４９）、または繊維芽細胞（ＩＭＲ９０）のいずれでも、ＴＮＦαを用いた処理によってＭＣＰ−５の発現が誘導されることもなかった。同じ条件下に、これらの細胞型によるＭＣＰ−１発現の迅速且つ持続的な増加が観察された。実施例３哺乳動物細胞における組換えＭＣＰ−５の製造ＭＣＰ−５ｃＤＮＡをＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクトすることによって、組換えＭＣＰ−５を製造した。ＰＣＲを用いて配列番号：３のヌクレオチド第９〜３８３位（６７bpの５’非翻訳領域と１１bpの３’非翻訳領域を含んでいる）を増幅した。反応のために使用した鋳型は、全長のＭＣＰ−５ｃＤＮＡクローンであり、そしてプライマーはell8-5B（実施例２Ａにて前記）及びell8-te rm（5'-CCA TGA ATT CGG TAG CAG AGT TCA AGT C-3'、配列番号：８）であって、このell8-termはEcoRI 制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接して配列番号：３のヌクレオチド第３６６〜３８３に対して相補的な配列を含むものである。反応条件は、サイクルの伸長工程の部分が３０秒に減じられたことを除いては実施例１に記載のものと同様であった。実施例２Ｂに前記した通りに、ＰＣＲ産物を電気泳動及び沈殿によって精製した。得られた断片をBamHI及びEcoRIで消化し、そして、BglII及びEcoRIで消化しておいたベクターｐＤＣ１へ挿入した。このベクターは、インサートの発現を容易ならしめるためにクローニング部位に隣接してＣＭＶ初期直接プロモーターを含んでいる。さらにこのベクターは、細菌及び哺乳動物細胞でのプラスミドの選択を許容するために、それぞれ細菌ベーターラクタマーゼ遺伝子及びネズミジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子も含んでいる（Sambrookら、前出）。この断片をベクターｐＤＣ１にクローニングした。エレクトロポレーションのために、１０⁷のＣＨＯ細胞を洗浄し、１mlのＰＢＳに再懸濁して、線状にした3 0μgのプラスミドと混合し、そして0.4cmのキュベットに移した。懸濁液をBiora d Gene Pulser（Richmond、カリホルニア州）を用いて２９０ボルトにて９６０ μＦでエレクトロポレーションした。ヒポキサンチン及びチミジンを欠くα^-培地（Gibco Alpha、カタログ番号12000に、10％透析済胎児ウシ血清、2mMＬ−グルタミン、1mMピルピン酸ナトリウム、100単位／mlのペニシリン、及び100μg/m lのストレプトマイシンを添加したもの）中で選択することによって形質転換体を選択した。数百の形質転換されたコロニーからの細胞を集めて、20nMメトトレキセートを含有するα^-培地に再度播種した。この度の選択で生存しているコロニーを単離して、殖やした。クローンは、α^-培地にておよそ９０％の周密度にまで生育し、次いで0.5％血清を含有するα^-培地中でさらに３〜４日かけて生育した。上清をｐＨ６．８にし、そしてヘパリン−セファロースカラム（Pharmacia、Piscata way、ニュージャージー州に付した。カラムを0.2Ｍ NaClで洗浄し、そして0.6M NaClでケモカインを溶出した。溶出された物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（18％アクリルアミド、トリス−グリシンゲル、NOVEX、San Diego、カリホルニア州）によって分画して、ＰＶＤＦ膜に転写した。トランスフェクト体に独自に存在し、トランスフェクトされなかった対照に存在しない6.4kDのバンドが、ＭＣＰ−５の予測されたサイズに対応していた。このバンドを切り出し、そしてApplied Biosys temsモデル４７３Ａ、Foster City、カリホルニア州の自動配列決定装置にてＮ −末端の配列決定を行った。最初の９つのＮ−末端アミノ酸の配列決定の結果、精製されたタンパク質が、Ｇｌｎ２４で始まるＭＣＰ−５の成熟型であることが示された。この切断部位は、ＭＣＰ−１及びＭＣＰ−３のプロセッシング部位に一致している。実施例４細菌における組換えＭＣＰ−５の製造タンパク質のリーダー配列の一部及び成熟型をコードＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅し、そしてベクターｐＧＥＸ-3X（Pharmacia、Piscataway）ニュージャージー州）へクローニングした。ｐＧＥＸベクターはベクターによってコードされるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と、ベクターのクローニング部位に挿入されたＤＮＡ断片によってコードされたタンパク質との融合タンパク質を生産するように設計されている。ＰＣＲのためのプライマーは、ell8-t erm（実施例３に前記）及びll8-TF2（5'-TAT CGG ATC CTG GTT CCG CGT CAG GG A CTT GCT CAG CCA G-3'、配列番号：９）であって、このll8-TF2は、BamHI制限部位、トロンビン切断部位［Chang、Eur.J.Biochem.、151巻、217頁(1985)］、及び配列番号：１のヌクレオチド第５８〜７６位を含むものである。この結果得られたＰＣＲ産物をBamHI及びEcoRIで消化し、そしてBglII及びEcoRIで消化されたｐＧＥＸ-3Xプラスミドへ挿入する。組換え融合タンパク質をトロンビンまたは第Ｘａ因子（Pharmacia、Piscata-way、ニュージャージー州）で処理すると、融合タンパク質が切断されることが期待され、ＧＳＴ部分からケモカインが遊離する。ｐＧＥＸ-3X/ＭＣＰ−５構築体を、大腸菌XL-1 Blue細胞（Stratagene、La Jolla、カリホルニア州）へ形質転換し、そして個々の形質転換体を単離して生育した。個々の形質転換体由来のプラスミドＤＮＡを精製し、そして自動配列決定装置を用いて部分的に配列決定して正しい方向に所望のＭＣＰ−５遺伝子インサートが存在することを確認した。形質転換されたXL-1 Blue 培養物をＬＢ培地（カルベニシリンを補充）にて３７℃で600nmでの吸光度が0.4 になるまで生育し、次いでさらに0.5mMイソプロピルβ-Ｄ-チオガラクトピラノシド（Sigma Chemical Co.、St.Louis、ミズーリ州）の存在下に４時間インキュベートすることによって、ＧＳＴ／ＭＣＰ−５融合タンパク質の誘導を行った。細菌において不溶性の包含体として生産される融合タンパク質を、以下の通りに精製した。細胞を遠心分離によって採収し、0.15M NaCl、10mMトリス、ｐＨ８、1mM ＥＤＴＡにて洗浄し、そして室温にて１５分間、0.1mg/mlのリゾチーム（ Sigma Chemical Co.）で処理した。溶解液を超音波処理によって清澄化し、そして12,000xgにて10分間遠心分離することによって細胞デブリスをペレット化した。融合タンパク質を含むペレットを、 50mMトリス、ｐＨ８、及び10mM ＥＤＴＡに再懸濁し、50％グリセロールを重層し、そして6000xgにて３０分間遠心分離した。ペレットを、Ｍｇ⁺⁺及びＣａ⁺⁺不含の標準リン酸塩緩衝性生理食塩水溶液（ＰＢＳ）に再懸濁した。再懸濁したペレットを変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにて分画することにより、融合タンパク質をさらに精製した（Sambrookら、前出）。このゲルを、タンパク質を可視化するために0.4M KClに浸漬し、切り出して、ＳＤＳを含まないゲル実行用緩衝液にて電気的に溶出した。標準プロトコルに従って、抗ＭＣＰ− ５抗体をつくるために、得られたタンパク質をウサギに注射した（Sambrookら、前出、第１８章）。このタンパク質を、実施例７に記載するようにモノクローナル抗体を作製するために使用してもよい。成熟ＭＣＰ−５タンパク質も、同様に製造できる。ＰＣＲ増幅は、プライマ− ell8-term及びell8-TF3（5'-TAT CGG ATC CTG GTT CCG CGT CAG CCA GAT GCA CT C AAC GTC-3’、配列番号：１０）を用いて行い、このell8-TF3は、BamHI制限部位、トロンビン切断部位、及び配列番号：１のヌクレオチド第７０〜８７位を含んでいる。得られるＰＣＲ産物をBamHI及びEcoRIで消化し、そしてBglII及びEco RIで消化しておいたｐＧＥＸ-3Xプラスミドへ挿入し、次いでこれを細菌へ形質転換して前記のごとくに生育する。融合タンパク質をトロンビン消化に供し、成熟ＭＣＰ−５タンパク質からＧＳＴを切断する。消化反応液（20〜40μgの融合タンパク質、20〜30単位のヒトトロンビン（4000U/mg（Sigma）を含む0.5mlのＰＢＳ））を、室温にて１６〜４８時間インキュベートし、そして反応産物を分画するために変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに付す。このゲルを、タンパク質のバンドを可視化するために0.4M KClに浸漬する。ＭＣＰ−５の予測分子量に対応するタンパク質バンドの同一性を、自動配列決定装置（Applied Biosystemsモデル４７３Ａ、Foster City、カリホルニア州）を使用して、部分的なアミノ酸配列分析により確認してもよい。あるいは、予測された成熟ＭＣＰ−５タンパク質及び適宜に、リーダー配列をコードするＤＮＡ配列を、所望のプロモーターを含むプラスミドヘクローニングしてもよい［例えば、Betterら、Science、240巻、1041〜43頁(1998)を参照されたい］。この構築体の配列は自動配列決定によって確認してもよい。次いで、細菌のＣａＣｌ₂インキュベーション及び熱ショック処理を用いた標準法（Sambroo kら、前出）を用いて、大腸菌株ＭＣ１０６１へプラスミドを形質転換する。形質転換された細菌を、カルベニシリンを添加したＬＢ培地にて生育し、そして発現されるタンパク質の生産を、好適な培地で生育することにより誘導する。存在するなら、リーダー配列がＭＣＰ−５タンパク質の分泌をもたらし、これは分泌の際に切断されるはずである。分泌された組換えタンパク質は、実施例３に前記した方法、または、例えば組換えにより製造されたＲＡＮＴＥＳケモカイン［Kunaら、J.Immunol.、149巻、6 36〜642頁(1992)］、ＭＧＳＡケモカイン「Horukら、J.Biol.Chem.、268巻、541 〜46頁(1993)」、及びＩＰ−１０ケモカイン（昆虫細胞にて発現された）［Sarr isら、J.Exp.Med.、178巻、1127〜1132頁(1993)］の精製について以前報告された方法を適用することにより、細菌培養培地から精製される。実施例５酵母における組換えＭＣＰ−５の製造酵母におけるＭＣＰ−５の組換え発現及びそれにより得られた組換えタンパク質の精製のためのプロトコルの例を、以下に述べる。ＭＣＰ−５ｃＤＮＡのコード領域を、ＰＣＲによって増幅する。酵母のプレープロ−アルファ・リーダー配列をコードするＤＮＡを、アルファ交配因子遺伝子のヌクレオチド第１〜２０位を含む１つのプライマーと、この遺伝子のヌクレオチド第２５５〜２３５位に相補的な他のプライマーを使用したＰＣＲ反応［Ku rjan及びHerskowitz、Cell、30巻、933〜943頁(1982)］で、酵母ゲノムＤＮＡより増幅する。プレープローアルファ・リーダーをコードする配列及びＭＣＰ−５をコードする配列の断片を、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）プロモーターを含むプラスミドへ、成熟ＭＣＰ−５ポリペプチドに融合されたプレ− プロ−アルファ因子からなる融合タンパク質の発現をプロモーターが駆動するように連結する。Rose及びBroach、Meth.Enz.、185巻、234〜279頁、D.Goeddel編、Academic Press，Inc.、San Diego、カリホルニア州(1990)に教示されるように、ベクターはさらに、クローニング部位の下流にＡＤＨ２転写ターミネーター、酵母「２−ミクロン」複製起点、酵母leu-2d遺伝子、酵母ＲＥＰ１及びＲＥＰ２遺伝子、大腸菌ベーターラクタマーゼ遺伝子、ならびに大腸菌複製起点を含んでいる。ベーターラクタマーゼ及びleu-2d遺伝子によって、それぞれ、細菌及び酵母における選択が可能となる。このleu-2d遺伝子はまた、酵母におけるプラスミドのコピー数の増加を容易ならしめ、高レベルの発現を誘導する。ＲＥＰ１及びＲＥＰ２遺伝子は、プラスミドコピー数の調節に関わるタンパク質をコードする。前段落に記載のＤＮＡ構築体を、既知の方法、例えば、リチウムアセテート処理［Stearnsら、Meth.ERz.、前出、第280〜297頁］などを用いて酵母細胞へ形質転換する。ＡＤＨ２プロモーターは、生育培地中のグルコースの枯渇に際して誘導される［Priceら、Gene、55巻、287頁(1987)］。プレ−プロ−アルファ配列は、細胞からの融合タンパク質の分泌をもたらす。同時に、酵母ＫＥＸ２タンパク質が、成熟ＭＣＰ−５ケモカインからそのプレ−プロ配列を切断する［Bitterら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）81巻、5330〜5334頁(1984)］。あるいは、ＭＣＰ−５は市販の発現系、例えば、Pichia Expression System（ Invitrogen、San Diego）カリホルニア州）等を使用し、製造業者の説明書に従って、酵母において組換え発現される。この系もまた、分泌を行わせるためにプレ−プロ−アルファ配列を利用しているが、インサートの転写は、メタノールによる誘導に際し、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターによって駆動される。分泌された組換えＭＣＰ−５は、酵母の生育培地から、例えば細菌及び哺乳動物細胞上清からＭＣＰ−５を精製するのに使用した方法など（前記実施例３及び４を参照されたい）によって精製される。実施例６ＭＣＰ−５類似体の製造ＭＣＰ−５ポリペプチド類似体を調製するために、これまでの実施例にて述べたような組換え技術を使用することができる。さらに詳細には、ＭＣＰ−５をコードするポリヌクレオチドを、周知の技術、例えば部位特異的突然変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応などを用いて、目的とするポリペプチド類似体をコードするように修飾する。一般的には、Sambrookら、前出、第１５章を参照されたい。修飾されたポリヌクレオチドは組換え法によって発現され、そして組換えポリペプチド類似体は、これまでの実施例に記載したように精製される。ＭＣＰ−５活性にとって決定的な残基が、例えば、他のケモカイン類との相同性によって、及び元来のＭＣＰ−５アミノ酸残基をアラニンに置換することによって同定される。システインは、それがジスルフィド結合を形成する能力のゆえに、タンパク質の機能的完全性にとって決定的なものであることが多い。ＭＣＰ −５に含まれる４つのシステインのいずれが酵素活性にとって決定的なものなのかを調べるために、各システインを個々にセリンに変異させる。例えば、ＭＣＰ−５をコードする配列の３’端をエクソヌクレアーゼIIIで様々な時間消化し、次いで３つすべての読み取り枠に終始コドンをコードするプラスミドＤＮＡへ、短くしたコード配列を連結することなどによって、Ｃ−末端欠失体を調製する。Ｎ−末端欠失体は、コード配列の５’端を消化し、次いで消化された断片を、プロモーター配列及びプロモーター部位のすぐ上流に開始のメチオニンを含むプラスミドへ連結することによって同様に調製される。あるいは、ＭＣＰ−５ポリペプチド類似体は、ＩＬ−８［Clark−Lewisら、J. Biol.Chem.、266巻、23128〜34頁(1991)］及びＭＣＰ−１などの他のケモカインの生産のために成功裡に用いられている技術を用いた化学ペプチド合成によっても調製することができる。このような方法は、迅速であり、ケモカインのような短い配列に関しては信頼性が高く、それに新規の非天然アミノ酸及び他の化学修飾の選択的な導入を許容するので、好都合である。炎症プロセスに関わる１以上の細胞型（例えば、Ｔリンパ球、単球、マクロファージ、好塩基球、好酸球、好中球、肥満細胞、内皮細胞、上皮細胞その他）に対するＭＣＰ−５ポリペプチド類似体の走化性及び／または細胞活性化の特性は、以下の実施例８〜１５に記載されるもののような、多くの他のケモカインの特性をアッセイするために使用されている、当該技術分野にて認識されている技術によってアッセイされる。実施例７ＭＣＰ−５に対するモノクローナル抗体の調製ＭＣＰ−５に対するモノクローナル抗体を作製するためのプロトコルを記載する。実施例３から６のいずれかに記載されたようにして得られた組換えＭＣＰ− ５（例えば、フロインド完全アジュバント中に、10〜20μgを乳化させたもの）を、マウスに定期的に注射する。ＰＢＳに含まれるＭＣＰ−５で、最終の融合前追加抗原刺激をマウスに施し、そして４日後にマウスを屠殺して脾臓を摘出する。脾臓を、10mlの無血清ＲＰＭＩ1640中に入れ、2mM Ｌ-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、100単位/mlペニシリン、及び100μg/mlストレプトマイシン（ＲＰＭＩ）（Gibco、カナダ）を補った、無血清のＲＰＭＩ1640の中に沈めた２枚の顕微鏡スライドガラスの氷結させた端部間でその脾臓を粉砕することにより、単一細胞懸濁液を形成させる。細胞懸濁液は、無菌の70−メッシュ Nitexセルストレーナー（Becton Dickinson、Parsippany、ニュージャージー州）を通して濾過し、200gで５分間遠心し、そのペレットを20mlの無血清ＲＰＭＩ中に再懸濁することにより２回の洗浄を行う。投薬を受けたことがない３匹のＢａｌｂ／ｃマウスから取った胸腺細胞を同様に調製して、対照として用いる。11％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Hyclone Laboratories，Inc.、Logan、ユタ州）を含むＲＰＭＩ中で、融合前の３日間対数増殖期に保ったＮＳ−１ミエローマ細胞を、200ｇで５分間遠心して、ペレットを前の段落に記載したように２回洗浄する。 1×10⁸の脾臓細胞を、2.0×10⁷のＮＳ−１細胞と合わせ、遠心して、上清は吸引する。細胞ペレットを、チューブを軽く叩くことによって動かし(dislodged) 、37℃のＰＥＧ１５００（75mMへペス、ｐＨ8.0中、50％）(Boehringer Mannh eim)１mlを、１分間にわたって撹拌しながら添加し、引き続き、７分にわたって 7mlの無血清ＲＰＭＩを添加する。追加に8mlのＲＰＭＩを添加し、細胞を200gで 10分間遠心する。上清を廃棄した後、ペレットを、15％ＦＢＳ、100μMヒポキサンチンナトリウム、0.4μMアミノプテリン、16μMチミジン（ＨＡＴ）（ギブコ社）、25単位/ml ＩＬ−６（Boehringer Mannheim）、及び1.5×10⁶胸腺細胞/ mlを含むＲＰＭＩ 200ml中に再懸濁して、１０枚のコーニング平底96ウェル組織培養プレート（Corning、Corning、ニューヨーク州）の中に播種する。融合後第２、４及び６日に、100μlの培地を融合プレートのウェルから除去し、新鮮な培地に置き換える。第８日目に、ＥＬＩＳＡによって融合をスクリーニングし、以下のようにＭＣＰ−５へのマウスＩｇＧの結合の存在について調べる。Immulon ４プレート（Dynatech、Cambridge、マサチューセッツ州）を、25mM トリス、ｐＨ7.5中に希釈したＭＣＰ−５、100ng/ウェルで、37℃にて２時間被覆する。被覆用溶液を吸引し、200μl/ウェルのブロッキング溶液（ＣＭＦ−ＰＢＳ中に希釈した0.5％フィッシュスキンゼラチン（Sigma）を添加して、37℃にて３０分間インキュベートする。0.05％ツイーン20を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）でプレートを３回洗浄し、50μlの培養上清を加える。37 ℃にて３０分間インキュベートし、前記のように洗浄した後、ＰＢＳＴで1：350 0に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ(fc) （Jackson ImmunoResearch、West Grove、ペンシルベニア州）50μlを添加する。前記のようにプレートをインキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄して、100mM クエン酸塩、ｐＨ4.5中、1mg/ml o-フェニレンジアミン（Sigma）及び0.1μl/ml の30％H₂O₂で構成される基質100μＬを添加する。50μlの15％H₂SO₄を添加して、５分で呈色反応を停止する。プレートリーダー（Dynatech）でＡ₄₉₀を読み取る。選択した融合ウェルを、96ウェルプレートの中で希釈し、５日後にコロニー数／ウェルを目視的に評価することにより、２回のクローン化を行う。ハイブリドーマにより生産されるモノクローナル抗体は、Isostripシステム（Boehringer M annheim、Indianapolis、インディアナ州）を用いてイソタイプを判別する(isot yped)。実施例８移動に対するＭＣＰ−５の効果 in vitroの走化性アッセイを用いて、移動（トランスミグレーション）に対する組換えＭＣＰ−５の効果を評価し、そしてその活性を、ＣＨＯ細胞にて同様に製造及び精製した組換えＭＣＰ−１（Matsushimaら、前出）の活性と比較した。ヒト単球由来の細胞系ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ受託番号TIB202）の走化性応答を、 Casaleら、Am.J.Resp.Cell Mol.Biol.、７巻、112〜117頁(1992)に報告されている通りに、トランスウェルアッセイにて測定した。トランスミグレーション・チャンバー（ポリカーボネート膜、8um孔径）は、Costar（Cambridge、マサチューセッツ州）より購入した。手短に説明すると、⁵¹Ｃｒで標識した10⁶細胞をＲＰＭＩ培地に再懸濁して上方のチャンバーに添加し、試験すべきケモカインを含む0.5mlのＲＰＭＩを下方のチャンバーに添加した。37℃にて６０〜９０分間インキュベートした後、フィルターを通過して下面に付着した細胞を、５mM ＥＤＴＡを含むＰＢＳで洗い出し、そして下方のチャンバーに落下していた細胞に加えた。その結果得られたデータを図２に示す。白抜きの四角はＭＣＰ−５に対する走化性応答を示し、黒塗りの四角はＭＣＰ−１に対する応答を示す。黒塗りのダイアモンド型は、50ng/mlの濃度での、市販されているＭＣＰ−１（Peprotech、Ro cky Hill、ニュージャージー州）に対する応答を示している。点線は、ケモカインを添加しない場合の、基線のcpm値を示す。ＴＨＰ−１細胞は、ＭＣＰ−５に対して顕著な応答性を呈したが、その応答は 1μg/mlの濃度までにピークを過ぎ、ＭＣＰ−５がこの細胞系の受容体に弱く相互作用していることが示唆された。これと対照的に、ＭＣＰ−１は、多くのケモカインに典型的な用量応答曲線を誘導し、40〜80ng/mlで強い最高の応答を示した。実施例９単球細胞の活性化に対するＭＣＰ−５の効果ＭＣＰ−１及びＭＣＰ−５の、単球細胞との、そしてＭＣＰ−１受容体との相互作用を、カルシウム流出アッセイによってさらに検討した。細胞内カルシウムの流出は、Fura-2／ＡＭ（Molecular Probes、Eugene、オレゴン）を含有する１ mlの完全培地中で、細胞を室温にて３０分間インキュベートすることによりモニターした。細胞は、ＰＢＳで１度洗浄し、そして、およそ10⁵細胞数/ mlの濃度で再度懸濁した。懸濁したＴＨＰ−１細胞2mlを、蛍光計（AMINCO-Bowm an Series 2、Rochester、ニューヨーク）で、37℃にて持続的に攪拌されているキュベットに入れた。ケモカインを連続的に細胞に添加した。対照を得るために、次いで細胞をイオノマイシン（1μg/ml、Sigma Chemical Co.、St．Loius、ミズーリ州）で処理して可能なカルシウム増大の最高値にまで誘導し、そして1mM エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）で処理して存在しうるカルシウムをキレート形成させた。添加されたケモカインに応答した細胞内カルシウム濃度の変化は、処理された細胞の蛍光の変化に反映される。蛍光は、発光波長510nmで、励起波長を0.5秒毎に34 0nmから380nmの間で切り替えてモニターした。340nmと380nmの励起スペクトルの比で表したデータを、図３Ａ（ここで、ＭＣＰ−５を５０秒で添加し、続いて１１０秒でＭＣＰ−１を、２４０秒でイオノマイシンを、そして３１０秒でＥＧＴＡを添加した）及び図３Ｂ（ここで、ＭＣＰ−１を５０秒で添加し、続いて１２０秒でＭＣＰ−５を、２００秒でイオノマイシンを、そして２６０秒でＥＧＴＡを添加した）に示す。ＴＨＰ−１細胞は、ＭＣＰ−５に応答して有意なカルシウム流出を行った（図３Ａ参照）が、この効果は、予めＭＣＰ−１で活性化しておいた細胞においては阻止された（図３Ｂ参照）。これと対照的に、ＭＣＰ−１に対する応答は、ＭＣＰ−５で細胞を前処理することによって減じられはしたものの、阻止されはしなかった。同様の結果が、新鮮に単離された末梢血単核細胞及び単球細胞を用いて場合にも得られた。これらの結果は、ＭＣＰ−５は、ＭＣＰ−１によって認識される受容体の亜集合と相互作用するのか、あるいはＭＣＰ−１受容体を介するある程度至適な（su b-optimal）シグナルのトランスダクションを行い、ＭＣＰ−１の結合に際してのさらなる応答を許容するかのいずれかであることを含意していた。これら２つの可能性を識別するために、ＭＣＰ−１受容体のＣＣＲ−２Ｂ（Ch aroら、前出）でトランスダクションしておいたヒト胎児腎臓細胞系２９３について、ＭＣＰ−１及びＭＣＰ−５の試験を行った。イオノマイシン及びＥＧＴＡ対照に加え、これらの細胞に元来存在するトロンビン受容体の活性化に起因する応答を示すため、細胞にはトロンビン（Sigma、St.Louis、ミズーリ州）での処理も施した。その結果を、図３Ｃ（ここで、ＭＣＰ−５を６０秒で添加し、１２０秒でＭＣＰ−１を、２００秒でトロンビンを、２８０秒でイオノマイシンを、そして３５０秒でＥＧＴＡを添加した）及び図３Ｄ（ここで、ＭＣＰ−１を６０秒で添加し、１２０秒でＭＣＰ−５を、２００秒でトロンビンを、２８０秒でイオノマイシンを、そして３５０秒でＥＧＴＡを添加した）に示す。ＭＣＰ−１受容体でトランスフェクトされた２９３細胞の、ＭＣＰ−１及びＭＣＰ−５に対する応答は類似していたが、ＴＨＰ−１細胞に対する応答よりもさらに顕著であり、ＭＣＰ−１及びＭＣＰ−５が、単一の受容体を介して異なる効率にて相互作用していることが示唆された。トランスフェクトされていない２９３細胞は、これらのケモカインのいずれに対しても応答を示さなかった。しかして、ＭＣＰ−５は、ＭＣＰ−１受容体に対する弱いアゴニストであると考えられる。実施例１０好塩基球、肥満細胞、及び好酸球好塩基球、肥満細胞、及び好酸球に対するＭＣＰ−５の効果を、例えば、Webe rら、J.Immunol.、154巻、4166〜4172頁(1995)により報告された、ＭＣＰ−１／２／３活性のアッセイに対する方法などによってアッセイする。これらの方法において、遊離の細胞質カルシウム及び前炎症性メディエータ（ヒスタミン及びロイコトリエンなど）の放出が測定される。これらの細胞型の、ケモカインによって媒介される活性化を阻止することは、前炎症性メディエータの分泌が重要な役割を果たしている遅延型アレルギー反応［Weberら、前出］の処置における適用可能性を含意するものである。実施例１１ヒト単球／マクロファージ及びヒト好中球に対するＭＣＰ−５の走化性及び細胞活性化特性のアッセイヒト単球／マクロファージまたはヒト好中球に対するＭＣＰ−５の効果を、例えば、Deviら、J.Immunol.、153巻、5376〜5383頁(1995)によって報告された、好中球及びマクロファージの、ＴＣＡ３によって誘導される活性化を評価するための方法などにより評価する。このような実験で測定される活性化の指標には、インテグリン活性化に起因するフィブリノーゲンへの接着の増大、走化性、反応性チッ素中間体の誘導、レスピラトリーバースト（スーパーオキシド及び過酸化水素の生産）、ならびにサイトカラシンＢの存在下でのリゾチーム及びエラスターゼのエキソサイトーシスが含まれる。Deviらにより論じられている通り、これらの活性は炎症に対する白血球の応答のいくつかの段階に相関している。この白血球応答は、Springer、Cell、76巻、301〜314頁(1994)に総説が述べられており、血管の内皮細胞への白血球の接着、内皮層を通過した移動、ケモカインの供給源に対する走化性、及び炎症性メディエータの部位特異的な放出を包含するものである。これらの段階のいずれか１つにおけるＭＣＰ−５の関与が示されるによって、炎症性応答をモジュレートすることによる臨床的介入のための重要な標的が定まることになる。実施例１２ＭＣＰ−５のin Vivo腫瘍成長阻害アッセイＭＣＰ−５の腫瘍成長阻害特性を、例えば、ネズミ Laningら、J.Immunol.、153巻、4625〜4635頁(1994)によって報告された、ネズミＴＣＡ３の腫瘍成長阻害特性をアッセイするためのプロトコルの変法によってアッセイする。ＭＣＰ−５をコードするｃＤＮＡをミエローマ由来の細胞系Ｊ５５８（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Rockville、メリーランド州）へ、エレクトロポレーションによってトランスフェクトする。トランスフェクト体は、実施例７に詳説した通りにＭＣＰ−５に対して作製したモノクローナル抗体を使用したＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸収アッセイ）などの標準的技術により、ＭＣＰ−５の生産についてスクリーニングする。ＭＣＰ−５を生産しているクローン由来の１千万の細胞数の集塊を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの右下４分の１区（quadrant）へ皮下注射する。比較のため、トランスフェクトしていない１千万個の細胞を対照のマウスに注射する。２つの群における腫瘍形成の速度及び頻度を比較し、腫瘍の成長阻害へのＭＣＰ−５の有効性を調べる。腫瘍細胞に続いて関係する細胞浸潤の性質を、組織学的手段によって同定する。加うるに、組換えＭＣＰ−５（20ng）を、トランスフェクトしていないＪ５５８細胞と混合し、そしてかかる細胞に由来する腫瘍へ注射（１日当たり20ng）して、腫瘍細胞へ外来的に投与されたＭＣＰ−５の効果をアッセイする。実施例１３腹腔内注射アッセイ in vivoでＭＣＰ−５に応答する細胞を、Luoら、J.Immunol.、153巻、4616〜4 624頁(1994)により報告されたように、マウスの腹腔内へ精製ＭＣＰ−５を1〜10 0ng注射することによって判定する。注射した後に、末梢血及び腹腔から白血球を単離して、Diff Quickキット（Baxter、McGraw、イリノイ州）を用いて染色することにより同定する。異なる細胞型の出現の動態を評価するために、様々な時間で白血球の外形（profile）を測定する。別の実験で、ＭＣＰ−５に対して作製された中和抗体（実施例７）をＭＣＰ−５と共に注射して、白血球の浸潤がＭＣＰ−５の活性に起因することを確認する。実施例１４ In vivo 活性アッセイ−皮下注射ＭＣＰ−５の化学誘引特性を、Meurerら、J.Exp.Med.、178巻、1913〜1921頁( 1993)により報告されたプロトコルを適用することによつて、in vivoでアッセイする。組換えＭＣＰ−５（１箇所当たり10〜500pmol）を、好適な哺乳動物、例えばイヌまたはウサギの皮内に注射する。４時間から２４時間で、注射した部位における細胞浸潤を組織学的方法によって評価する。ＭＣＰ−５の存在は、ＭＣＰ−５に対して作製した抗体を使用する免疫細胞化学的手法によって確認する。細胞浸潤の特性は、BaxterのDiff Quickキットで染色することによって同定する。実施例１５ In Vivo 骨髄抑制活性のアッセイＭＣＰ−５の骨髄抑制活性を、例えば、ＭＩＰ−１αの骨髄抑制作用の測定のため、Mazeら、J.Immunol.、149巻、1004〜1009頁(1992)により報告されたように、ＭＣＰ−５をマウスに注射することによってアッセイする。単回用量0.2〜1 0ugの組換えＭＣＰ−５を、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス（Jackson Laboratories、Bar Harbor、メイン州）へ静脈内注射する。ケモカインの骨髄抑制効果は、大腿骨骨髄及び脾臓における骨髄前駆細胞の循環率を測定することによって測定する。前駆細胞の成長及び分裂の抑制は、化学療法または放射線療法を受けている患者の処置において臨床的意義を示すものである。このようなケモカイン処置の骨髄保護効果は、Dunlopら、Blood、79巻、2221頁(1992)による前臨床モデルによって立証されている。実施例１６さらなるＭＣＰ−５受容体のクローニングＭＣＰ−５受容体をコードするＤＮＡを、ＩＬ−８受容体遺伝子の単離（Holm esら、前出）、及びＭＣＰ−１受容体遺伝子の単離（Charoら、前出）について以前報告された方法を適用することによってクローニングする。ｃＤＮＡライブラリーを、好ましくは走化性及び活性化によってＭＣＰ−５に応答する細胞から調製する。ＭＣＰ−５に対する受容体を高レベルで発現している細胞型を同定するために、放射線で標識付けしたＭＣＰ−５を使用することもできる。ＭＩＰ−１もしくはＭＣＰ−３に応答しない細胞、またはこれらのリガンドに応答して異なる（クローニングされたＭＣＰ−１受容体について認められるものと比べて）パターンの受容体減感を示す細胞が、特に目的の細胞として好ましい。ｃＤＮＡライブラリーの、トランスフェクトされたクローンのプールをオートラジオグラフィーによって、放射線標識付けされたＭＣＰ−５の結合についてスクリーニングする。陽性のプールを連続的に亜分画して、個々の陽性クローンが得られるまで再スクリーニングする。あるいは、ＰＣＲプライマーの配列が既知のケモカイン受容体の配列の保存領域に基づくものである、縮重ＰＣＲストラテジーを使用してもよい。プライマーは、ＭＣＰ−５と相互作用するＭＣＰ−１受容体をコードする配列に偏向するものでも、または偏向しないものでもよい。ＭＣＰ−５受容体を単離する可能性を高めるために、反応に使用する鋳型ＤＮＡは、ＭＣＰ−５に応答性を有する細胞型に由来するｃＤＮＡであるとよい。本発明を、特定の実施態様に関して記載しているが、当業者にあっては変更及び修飾が想起されるであろうことが理解される。従って、本発明は請求の範囲によってしか限定を受けるべきではない。

【手続補正書】【提出日】１９９９年５月１４日（１９９９．５．１４）【補正内容】２．特許請求の範囲（１）配列番号：２に示される単球走化性タンパク質−５（ＭＣＰ−５）アミノ酸配列をコードする、精製されたポリヌクレオチド。（２）前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求の範囲第１項記載のポリヌクレオチド。（３）前記ＤＮＡが、配列番号：１に示されるヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列を含む請求の範囲第２項記載のポリヌクレオチド。（４）配列番号：２のアミノ酸第１〜７５位をコードする、精製されたポリヌクレオチド。（５）前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求の範囲第４項記載のポリヌクレオチド。（６）前記ＤＮＡが配列番号：１のヌクレオチド第７０〜２９７位からなるヌクレオチド配列を含む請求の範囲第５項記載のポリヌクレオチド。（７）配列番号：１のＤＮＡの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、全長のＭＣＰ−５をコードする精製されたポリヌクレオチド。（８）前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求の範囲第７項記載のポリヌクレオチド。（９）請求の範囲第２、３、５、６または８項記載のＤＮＡを含むベクター。（10）前記ＤＮＡが、発現制御ＤＮＡ配列と作動可能に連結されている、発現ベクターである請求の範囲第９項記載のベクタ。（11）請求の範囲第２、３、５、６または８項記載のＤＮＡを用いて安定に形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞であって、該宿主細胞におけるＭＣＰ−５の発現が許容されるように形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。（12）ＭＣＰ−５を製造するための方法であって、以下の工程すなわち、請求の範囲第１１項記載の宿主細胞を普通培地中で生育し、そして該細胞または該普通培地からＭＣＰ−５を単離する工程を含む方法。（13）請求の範囲第１２項記載の方法によって製造される、精製されたポリペプチド。（14）配列番号：２に示されるＭＣＰ−５アミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド。（15）配列番号：２の第１〜７５位のＭＣＰ−５アミノ酸を含む、精製されたポリペプチド。（16）請求の範囲第１５項記載のポリペプチドと特異的な反応性を有するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞系。（17）請求の範囲第１６項記載のハイブリドーマによって製造されたモノクローナル抗体。（18）抗ＭＣＰ−５抗体を含む、アテローム性動脈硬化処置用の医薬組成物。（19）前記抗ＭＣＰ−５抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第１８項記載の医薬組成物。（20）ＭＣＰ−５を含む、ＨＩＶ感染症処置用の医薬組成物。（21）アテローム性動脈硬化を処置するための方法であって、ヒトを除く被験者に、アテローム性動脈硬化の症候を緩和するに有効な量の抗ＭＣＰ−５抗体を投与する工程を含む方法。（22）前記抗ＭＣＰ−５抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第２１項記載の方法。（23）ＨＩＶ感染症を処置するための方法であって、ヒトを除く被験者に、ＨＩＶ感染症の症候を緩和するに有効な量のＭＣＰ−５を投与する工程を含む方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/02 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｐ 21/08 33/577 ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 31/00 ６０１ 33/577 ６０９Ｆ // Ａ６１Ｐ 1/00 ６１９Ａ 9/10 ６２９ 19/02 ６３５ 29/00 ６３７Ｄ 35/00 ６４３Ｄ 37/06 39/395 Ｄ 43/00 ＮＡ６１Ｋ 38/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ 39/395 5/00 ＡＡ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：２に示される単球走化性タンパク質−５（ＭＣＰ−５）アミノ酸配列をコードする、精製されたポリヌクレオチド。２．前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求の範囲第１項記載のポリヌクレオチド。３．前記ＤＮＡが、配列番号：１に示されるヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列を含む請求の範囲第２項記載のポリヌクレオチド。４．配列番号：２のアミノ酸第１〜７５位をコードする、精製されたポリヌクレオチド。５．前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求の範囲第４項記載のポリヌクレオチド。６．前記ＤＮＡが配列番号：１のヌクレオチド第７０〜２９７位からなるヌクレオチド配列を含む請求の範囲第５項記載のポリヌクレオチド。７．配列番号：１のＤＮＡの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、全長のＭＣＰ−５をコードする精製されたポリヌクレオチド。８．前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求の範囲第７項記載のポリヌクレオチド。９．請求の範囲第２、３、５、６または８項記載のＤＮＡを含むベクター。１０．前記ＤＮＡが、発現制御ＤＮＡ配列と作動可能に連結されている、発現ベクターである請求の範囲第９項記載のベクター。１１．請求の範囲第２、３、５、６または８項記載のＤＮＡを用いて安定に形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞であって、該宿主細胞におけるＭＣＰ−５の発現が許容されるように形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。１２．ＭＣＰ−５を製造するための方法であって、以下の工程すなわち、請求の範囲第１１項記載の宿主細胞を普通培地中で生育し、そして該細胞または該普通培地からＭＣＰ−５を単離する工程を含む方法。１３．請求の範囲第１２項記載の方法によって製造される、精製されたポリペプチド。１４．配列番号：２に示されるＭＣＰ−５アミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド。１５．配列番号：２の第１〜７５位のＭＣＰ−５アミノ酸を含む、精製されたポリペプチド。１６．請求の範囲第１５項記載のポリペプチドと特異的な反応性を有するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞系。１７．請求の範囲第１６項記載のハイブリドーマによって製造されたモノクローナル抗体。