JPH10136983A - 新規なポリペプチド、その製造方法、そのポリペプチドをコードするｄｎａ、そのｄｎａからなるベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、そのポリペプチドの抗体、およびそのペプチドまたは抗体を含有する薬学的組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 マウス骨髄ストローマ細胞が産生する２９５
アミノ酸からなるポリペプチド及びその製造法、そのポ
リペプチドをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡ配列に選択
的にハイブリダイズするフラグメント、そのＤＮＡから
なる複製又は発現ベクター、そのベクターで形質転換さ
れた宿主細胞、そのポリペプチドの抗体、及びそのペプ
チドまたは抗体を含有する薬学的組成物。 【効果】 本発明のポリペプチドは、骨代謝異常の予防
又は治療、造血系細胞の発育不全や異常増殖、神経系機
能の亢進や低下、免疫系機能の亢進や低下に関する疾
患、例えば炎症性疾患、骨髄移植後の造血幹細胞の減
少、放射線治療後等の白血球、血小板、Ｂ細胞又はＴ細
胞の減少、貧血又は感染症の予防又は治療、ガン、白血
病又はＡＩＤＳの予防又は治療、各種変性疾患、神経損
傷の予防又は治療、及び組織修復等のために用いること
ができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なポリペプチド、
その製造方法、そのポリペプチドをコードするＤＮＡ、
そのＤＮＡからなるベクター、そのベクターで形質転換
された宿主細胞、そのポリペプチドの抗体、およびその
ペプチドまたは抗体を含有する薬学的組成物に関する。
更に詳細に述べると、ある種のマウスストローマ細胞株
が産生する新規なポリペプチド、それらポリペプチドの
製造方法、それらポリペプチドをコードするＤＮＡ、そ
れらＤＮＡからなるベクター、それらベクターで形質転
換された宿主細胞、それらポリペプチドの抗体、および
それらポリペプチドまたは抗体を含有する薬学的組成物
に関する。

【０００２】

【発明の背景】骨髄ストローマ細胞は、免疫系、造血系
等の骨髄微小環境を形作り、それらの幹細胞の増殖分化
誘導に欠かせない因子、例えば、ＩＬ−７、ＳＣＦ、Ｉ
Ｌ−１１、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｉ
Ｌ−６、ＴＧＦ−β、ＬＩＦ等の因子を産生、分泌して
いることが知られている。また、骨髄ストローマ細胞の
あるものは、骨代謝に関与することが明らかとなってい
る（Kenneth DorshkindAnnu. Rev. Immunol. 8, 111-13
7, 1990）。しかしながら、これまでに単離された因子
群のみでは、ストローマ細胞の役割を完全に担うことが
できない。このことは、まだ単離されていない因子が存
在することを示唆している。

【０００３】

【発明の目的】本発明者らは、この点に注目し、ある種
のストローマ細胞が産生している新規な因子（ポリペプ
チド）、特に分泌タンパクおよび膜蛋白に着目してそれ
を見出すべく、鋭意検討を行なった。

【０００４】従来、ある特定のポリペプチドまたはそれ
をコードするＤＮＡを得ようとする場合、組織や細胞培
養液中に目的とする生物活性を確認し、次いでポリペプ
チドの単離精製を経て、遺伝子をクローニングする方
法、あるいは、その生物活性を指標として遺伝子を発現
クローニングする方法が一般的に用いられていた。しか
し、生体内生理活性ポリペプチドは、多様な生物活性を
有している場合が多いので、あるひとつの活性を指標に
して遺伝子をクローニングした結果、それが既知のポリ
ペプチドと同一であることが後になって判明するという
事例が増えている。また、骨髄ストローマ細胞が産生す
る因子はほとんどのものが微量しか産生されず、そのこ
とが単離、精製および生物活性の確認を困難なものとし
ている。

【０００５】近年、ｃＤＮＡの作製技術やシークエンス
技術は急速に発展し、大量のｃＤＮＡのシークエンスを
迅速に行なうことができるようになった。そこでこれら
の技術を利用して、様々な細胞や組織からｃＤＮＡライ
ブラリーを作製し、ランダムにｃＤＮＡをクローニング
して塩基配列を決定し、相当するポリペプチドを発現さ
せた後、その生理機能を解析していくという方法が発展
しつつある。この方法は、生化学的、遺伝子学的な解析
を一切必要とせずに遺伝子をクローニングし、その塩基
配列の情報を得ることができるという特徴を有している
が、目的とする遺伝子の発見は偶発的要素が大きい。

【０００６】本発明者らは、これまで造血系や免疫系で
働く増殖分化因子の遺伝子のクローニングを研究してき
た。そして、増殖分化因子（例えば、各種サイトカイン
等）のような分泌タンパクやそのレセプターのような膜
タンパク（以下、これらをまとめて分泌タンパク等と呼
ぶ。）の大部分がそのＮ末端にシグナルペプチドと呼ば
れる配列を有していることに着目して、シグナルペプチ
ドをコードする遺伝子を効率的かつ選択的にクローニン
グする方法を鋭意検討した。その結果、Ｎ末端断片を効
率的に増幅させ、シグナルペプチドの有無を簡単に検索
できる方法を見出し（特開平６−３１５３８０号参
照）、その方法を用いて、骨髄ストローマ細胞が産生し
ている新規な因子（ペプチド）およびそれをコードする
ＤＮＡを見出すことに成功し、本発明を完成した。

【０００７】スイスプロット（Swiss Prot Release 3
3）に登録されている既知のポリペプチドのアミノ酸配
列を調査した結果、本発明のポリペプチドは未知であっ
たが、ショウジョウバエ Ｆｒｉｚｚｌｅｄ 蛋白及び
その哺乳類カウンターパートがもつ細胞外のＣｙｓ−ｒ
ｉｃｈな領域と有意な相同性を示した。このことから、
本発明のポリペプチドは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ Ｃｙｓ−
ｒｉｃｈ モチーフを有する新規の分泌蛋白であること
が確認された。

【０００８】

【発明の構成】本発明は、（１）配列番号１で示される
アミノ酸配列からなるポリペプチド、（２）前記（１）
に記載したポリペプチドをコードするＤＮＡ、（３）配
列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ、（４）配
列番号３で示される塩基配列を有するＤＮＡ、に関す
る。

【０００９】本発明は、実質的に純粋な形である配列番
号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そ
のホモローグ、その配列のフラグメントおよびそのホモ
ローグに関する。本発明はさらにそれらのポリペプチド
をコードするＤＮＡに関する。より具体的には、配列番
号２または３で示される塩基配列を有するＤＮＡ、およ
び配列番号２または３で示される塩基配列に選択的にハ
イブリダイズするフラグメントを有するＤＮＡに関す
る。

【００１０】実質的に純粋な形である配列番号１で示さ
れるアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、一般に、
生産時のポリペプチドの９０％以上、例えば、９５、９
８または９９％が配列番号１で示されるアミノ酸配列を
有するポリペプチドであることを意味する。

【００１１】配列番号１で示されるアミノ酸配列からな
るポリペプチドのホモローグとは、一般に少なくとも２
０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０
または１００個の連続したアミノ酸領域で、少なくとも
７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より
好ましくは９５％以上相同性であるものであり、そのよ
うなホモローグは、以後本発明のポリペプチドとして記
載される。

【００１２】さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配
列からなるポリペプチドのフラグメント、またはそれら
のホモローグのフラグメントとは、少なくとも１０アミ
ノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、例えば２
０、２５、３０、４０、５０または６０アミノ酸部分を
意味する。

【００１３】配列番号２または3で示される塩基配列を
有するＤＮＡに選択的にハイブリダイズするＤＮＡと
は、一般に、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも
３０個、例えば４０、６０または１００個の連続した塩
基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくと
も８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性
であるものであり、そのようなＤＮＡは、以後本発明の
ＤＮＡとして記載される。

【００１４】配列番号２または3で示される塩基配列を
有するＤＮＡのフラグメントとは、少なくとも１０塩
基、好ましくは少なくとも１５塩基、例えば２０、２
５、３０または４０塩基部分を意味し、そのようなフラ
グメントも本発明のＤＮＡに含まれる。

【００１５】さらに、本発明には、本発明のＤＮＡから
なる複製または発現ベクターが含まれる。ベクターとし
ては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ＤＮＡの
発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子な
どからなるプラスミド、ウィルスまたはファージベクタ
ーが挙げられる。ベクターはひとつまたはそれ以上の選
択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子を
含んでいてもよい。ベクターは、イン・ビトロ（in vit
ro）において、例えばＤＮＡに対応するＲＮＡの製造、
宿主細胞の形質転換に用いることができる。

【００１６】さらに、本発明には、配列番号２または３
で示される塩基配列、またはそれらのオープンリーディ
ングフレームを有するＤＮＡを含む本発明のＤＮＡを複
製または発現させるためのベクターで形質転換された宿
主細胞も含まれる。細胞としては、例えば細菌、酵母、
昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。

【００１７】さらに、本発明には、本発明のポリペプチ
ドを発現させるための条件下で、本発明の宿主細胞を培
養することからなる本発明のポリペプチドの製造方法も
含まれる。培養は、本発明のポリペプチドが発現し、宿
主細胞より製造される条件下で行われることが好まし
い。

【００１８】本発明のＤＮＡは、上記のようなベクター
のアンチセンス領域に挿入することでアンチセンスＲＮ
Ａを製造することもできる。このようなアンチセンスＲ
ＮＡは、細胞中の本発明のポリペプチドのレベルを制御
することに用いることもできる。

【００１９】本発明は、本発明におけるポリペプチドの
モノクローナルまたはポリクローナル抗体も含む。さら
に本発明におけるポリペプチドのモノクローナルまたは
ポリクローナル抗体の製造方法も含む。モノクローナル
抗体は、本発明のペプチドまたは、その断片を抗原とし
て用い、通常のハイブリドーマの技術により製造するこ
とができる。ポリクローナル抗体は、宿主動物（例え
ば、ラットやウサギ等）に本発明のポリペプチドを接種
し、免疫血清を回収する、通常の方法により製造するこ
とができる。

【００２０】本発明には、本発明のポリペプチド、その
抗体と薬学的に許容される賦形剤および／または担体を
含有する薬学的組成物も含まれる。

【００２１】（１）の本発明のポリペプチドとしては、
配列番号１で示されたアミノ酸配列を有するもの以外
に、その一部が欠損したもの（例えば、配列番号１中、
生物活性の発現に必須な部分だけからなるポリペプチド
等）、その一部が他のアミノ酸と置換したもの（例え
ば、物性の類似したアミノ酸に置換したもの）、および
その一部に他のアミノ酸が付加または挿入されたものも
含まれる。よく知られているように、ひとつのアミノ酸
をコードするコドンは１〜６種類（例えば、Ｍｅｔは１
種類、Ｌｅｕは６種類）知られている。従って、ポリペ
プチドのアミノ酸配列を変えることなくＤＮＡの塩基配
列を変えることができる。

【００２２】（２）で特定される本発明のＤＮＡには、
（１）の配列番号１で示されるポリペプチドをコードす
るすべての塩基配列群が含まれる。塩基配列を変えるこ
とによって、ポリペプチドの生産性が向上することがあ
る。 （３）で特定されるＤＮＡは、（２）で示されるＤＮＡ
の一態様であり、天然型配列を表わす。 （４）に示されるＤＮＡは、（３）で特定されるＤＮＡ
に天然の非翻訳部分を加えた配列を示す。

【００２３】配列番号３で示される塩基配列を有するＤ
ＮＡの作製は、以下の方法に従って行なわれる。

【００２４】シグナルペプチドのｃＤＮＡライブラリー
の作製 （１） 対象となる細胞より単離したｍＲＮＡに対する
一本鎖ＤＮＡを、ランダムプライマーを用いて合成した
後、得られた一本鎖ＤＮＡの３′末端にオリゴｄＧを付
加し、（２） （１）で得られた一本鎖ＤＮＡに対する
二本鎖ＤＮＡを、特定の制限酵素（酵素Ｉ）サイトを連
結したポリＣオリゴマーをプライマーとして用いて合成
し、（３） （２）で得られた二本鎖ＤＮＡを分断し、
断片のサイズで分画後、酵素Ｉとは異なる特定の制限酵
素（酵素ＩＩ）サイトを含むリンカーを連結し、再度分
画し、（４） 酵素Ｉサイトを含むプライマーと酵素Ｉ
Ｉサイトを含むプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反
応（以下、ＰＣＲと略記する。）に付し、増幅されたｃ
ＤＮＡを酵素Ｉ−酵素ＩＩで消化した後分画し、（５）
得られたｃＤＮＡ断片を、シグナルペプチドを削除し
た公知の分泌タンパク等の遺伝子の上流に連結し、真核
細胞発現プラスミドベクターに組み込んだ後形質転換す
る工程よりなる。

【００２５】各工程を詳しく説明すると、工程（１）で
は、対象となる細胞より、必要により適当な刺激剤で刺
激した後、オカヤマ（Okayama H.）等の方法（Method i
n Enzymology, 154, 3 (1987) に記載）に従ってｍＲＮ
Ａの単離が行なわれる。対象となる細胞としては、分泌
タンパク等を産生している可能性のある細胞なら何でも
よい。例えば、神経系細胞や造血系細胞が挙げられる。
ランダムプライマーを用いる一本鎖ｃＤＮＡの合成は公
知の方法により行なわれる。ランダムプライマーは市販
のものが用いられる。続いて、ターミナルデオキシトラ
ンスフェレースにより一本鎖ｃＤＮＡの３′末端にオリ
ゴｄＣが付加される。

【００２６】工程（２）の二本鎖ＤＮＡの合成も、公知
の方法により行なわれる。プライマーとなるポリＧオリ
ゴマーに連結される制限酵素（酵素Ｉ）サイトと次の工
程（３）で用いられる制限酵素（酵素ＩＩ）サイトは、
互いに異なるものであれば何を用いてもよい。好ましく
は、酵素ＩとしてＳａｌ Ｉ、酵素ＩＩとしてはＳａｃ
Ｉが用いられる。

【００２７】工程（３）は、超音波処理によりｃＤＮＡ
長が平均５００ｂｐになるように断片化し、アガロース
電気泳動（ＡＧＥ）により４００〜８００ｂｐのｃＤＮ
Ａに分画した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑
化し、酵素ＩＩアダプターを連結し、再度アガロース電
気泳動により４００〜８００ｂｐのＤＮＡに分画するこ
とにより行なわれる。酵素ＩＩは、前記したように酵素
Ｉと異なるものなら何でもよい。本工程によって、シグ
ナルペプチドを含むｃＤＮＡ断片は、酵素Ｉと酵素ＩＩ
によって挟まれた部分に存在する可能性が高まる。

【００２８】工程（４）では、シグナルペプチドを含む
可能性のある酵素Ｉと酵素ＩＩで挟まれた部分の存在確
立をさらに高めるためにＰＣＲに付す。ＰＣＲはよく知
られた方法であり、そのための自動化装置も市販されて
いる。２５〜３０回の増幅で十分である。増幅されたｃ
ＤＮＡは酵素Ｉ−酵素ＩＩで消化し、アガロース電気泳
動により４００〜８００ｂｐのｃＤＮＡに分画される。

【００２９】工程（５）は、真核細胞発現用プラスミド
ベクターにシグナルペプチドを削除した公知の分泌タン
パク等の遺伝子（レポーター遺伝子という。）と、その
上流に（４）で得られたｃＤＮＡ断片とを組み込んで形
質転換する工程である。ここで真核細胞発現用プラスミ
ドベクターとしては種々のものが知られているが、例え
ば、大腸菌内で機能するｐｃＤＬ−ＳＲαやｐｃＥＶ−
４が用いられる。

【００３０】また、レポーター遺伝子としては、あらゆ
る種類の可溶性分泌タンパクおよび膜タンパクの成熟タ
ンパク部分の遺伝子が用いられる。さらに、これらのレ
ポーター遺伝子は、抗体法などの何らかの方法でその発
現が確認できるものでなければならない。好適にはヒト
ＩＬ−２レセプターα遺伝子が用いられる。形質転換の
ための宿主大腸菌株はすでに多くのものが知られてお
り、いずれを用いてもよいが、好ましくはＤＨ５のコン
ピテントセル（Gene, 96, 23 (1990) に記載）である。
形質転換体は常法により培養され、本発明のｃＤＮＡラ
イブラリーが得られる（図１にその概念図を示す。）。

【００３１】本発明のｃＤＮＡライブラリー作製方法で
は、ライブラリー中にシグナルペプチドをコードする遺
伝子断片を含む可能性は高いが、すべてのクローンが該
断片を含んでいる訳ではないし、またすべてが未知の
（新規の）シグナルペプチドをコードする遺伝子断片と
は限らない。そこで、次に該ライブラリーから未知のシ
グナルペプチドをコードする遺伝子断片をスクリーニン
グする必要がある。

【００３２】すなわち、ｃＤＮＡライブラリーを適当な
サイズのプールに細分化し、発現系に組み込む。ポリペ
プチドを生産するための発現系としては、哺乳動物細胞
（例えば、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスタ
ーＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞等）が挙げられる。トラン
スフェクションは公知の方法、例えばＤＥＡＥ−デキス
トラン法によって行なわれる。培養後、レポーター遺伝
子の発現の有無を判定する。

【００３３】レポーター遺伝子は、シグナルペプチドが
他の分泌タンパクに固有のものであっても発現すること
が知られている。すなわち、レポーター遺伝子が発現さ
れたということは、ライブラリー中に何らかの分泌タン
パクのシグナルペプチドが組み込まれていたことを示し
ている。陽性を示すプールについてはさらに細分化を行
ない、シングルクローンを得るまで発現と判定を繰り返
す。レポーター遺伝子の発現の判定は、レポーター遺伝
子の種類によって異なるが、蛍光標識抗体法、酵素標識
抗体法（ＥＬＩＳＡ法）、放射性標識抗体法（ＲＩＡ
法）などにより行なわれる。

【００３４】次に、単離した陽性クローンについて、塩
基配列を決定し、未知のタンパク質をコードすることが
明らかになったｃＤＮＡについては、それをプローブと
して全長クローンを単離し、全長の塩基配列を決定する
ことができる。これらの操作は、当業者にとってすべて
公知の方法で行なわれる。例えば、塩基配列の決定はマ
キサム・ギルバート（Maxam-Gilbert）法やジデオキシ
・ターミネーター法により行なわれる。また、全長のシ
ークエンスは Molecular Cloning（Sambrook,J., Frits
ch, E. F.および Maniatis, T. 著、 Cold Spring Harb
or LaboratoryPressより1989年に発刊）に記載の方法に
従って行なわれる。

【００３５】配列番号２および３で示される塩基配列
が、一部、好ましくは全てが確定されると哺乳類に存在
する本発明のタンパクをコードするＤＮＡもしくは本発
明タンパクのホモローグおよびサブセットをコードする
ＤＮＡを得ることができる。適当な該マウス塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドを合成し、それを用いて、哺
乳類由来のｃＤＮＡライブラリーあるいはｍＲＮＡから
ＰＣＲ法により、あるいは適当な該マウス塩基配列の断
片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、
哺乳類ｃＤＮＡライブラリーあるいは該ゲノムライブラ
リーから、哺乳類型の当該タンパクをコードするＤＮＡ
を得ることができる。

【００３６】このようにして得られたｃＤＮＡは、該ｃ
ＤＮＡが全長、またはほぼ全長であることを確認する必
要がある。この確認は、該ｃＤＮＡをプローブとして、
ノーザン(Northern)解析により行なわれる（前記のMole
cular Cloning 参照）。ハイブリダイズしたバンドから
得られるｍＲＮＡのサイズと該ｃＤＮＡのサイズを比較
し、ほぼ同じであれば該ｃＤＮＡはほぼ全長であると考
えられる。

【００３７】配列番号２および３で示される塩基配列が
一旦確定されると、その後は、化学合成によって、ある
いは該塩基配列の断片を化学合成し、これをプローブと
してハイブリダイズさせることにより、本発明のＤＮＡ
を得ることができる。さらに、本ＤＮＡを含有するベク
ターＤＮＡを適当な宿主に導入し、これを増殖させるこ
とによって、目的とするＤＮＡを必要量得ることができ
る。

【００３８】本発明のポリペプチドを取得する方法とし
ては、（１） 生体または培養細胞から精製単離する方
法、（２） ペプチド合成する方法、または（３） 遺
伝子組み換え技術を用いて生産する方法、などが挙げら
れるが、工業的には（３）に記載した方法が好ましい。

【００３９】遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチド
を生産するための発現系（宿主−ベクター系）として
は、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞
の発現系が挙げられる。

【００４０】例えば、大腸菌で発現させる場合には、成
熟タンパク部分をコードするＤＮＡの５′末端に開始コ
ドン（ＡＴＧ）を付加し、得られたＤＮＡを、適当なプ
ロモーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロ
モーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）
の下流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例え
ば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入
して発現ベクターを作製する。

【００４１】次に、この発現ベクターで形質転換した大
腸菌（例えば、E. Coli ＤＨ１、E.Coli ＪＭ１０９、
E. Coli ＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養して、そ
の菌体より目的とするポリペプチドを得ることができ
る。また、バクテリアのシグナルペプチド（例えば、ｐ
ｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリプラズ
ム中に目的とするポリペプチドを分泌することもでき
る。さらに、他のポリペプチドとのフュージョン・プロ
テイン（fusion protein）を生産することもできる。

【００４２】また、哺乳動物細胞で発現させる場合に
は、例えば、配列番号３で示される塩基配列をコードす
るＤＮＡを適当なベクター（例えば、レトロウイルスベ
クター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイ
ルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロ
モーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロ
モーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に
挿入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現
ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば，サルＣＯＳ−
７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ
細胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養
することによって、その培養液中に目的とするポリペプ
チドが分泌される。以上のようにして得られたポリペプ
チドは、一般的な生化学的方法によって単離精製するこ
とができる。

【００４３】

【発明の効果】本発明のポリペプチドは、Ｆｒｉｚｚｌ
ｅｄ 蛋白（Charlees R. Vinson et.al. Nature, 338,
263-264 (1989), Yanshu Wang et. al., J. Biol. Che
m., 271, 4468-4476 (1996)）と有為な相同性を示し、
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ 蛋白の細胞外ドメインに存在する１
０ヵ所のシステイン残基（Ｃｙｓ−ｒｉｃｈモチーフ）
が保存されている（図２）。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ 蛋白は
７回膜貫通型の受容体蛋白であり、形態形成（特に組織
の極性の決定）に重要な働きをしていること、Ｎ末側の
Ｃｙｓ−ｒｉｃｈモチーフがリガンドとの結合領域であ
ることが知られている（Purnima et. al., Nature, 38
2, 225-230 (1996)) 。したがって本ポリペプチドも
Ｃｙｓ−ｒｉｃｈモチーフを介して形態形成に関与する
ことが予想され、各器官および組織の形成、修復等に関
連した生物活性を有していると考えられる。さらに、本
発明のポリペプチドは、ストローマ細胞株が生産・分泌
するものであるので、造血系細胞の分化、増殖、成長ま
たは生存維持に関連した生物活性、免疫系の機能に関連
した生物活性、腫瘍の増殖、成長あるいは炎症に関連し
た生物活性、また骨代謝に関連した生物活性を有してい
ると考えられる。

【００４４】例えば、間葉系幹細胞からの骨芽細胞、軟
骨細胞への分化促進または増殖、あるいは破骨細胞の活
性化や単球から破骨細胞への分化促進による骨吸収の促
進、さらにＢ細胞、Ｔ細胞、肥満細胞の増殖、免疫グロ
ブリンのクラススイッチ促進によるクラス特異的誘導、
Ｂ細胞の抗体産生細胞への分化、顆粒球前駆細胞の増殖
または分化、単球・マクロファージ前駆細胞の増殖また
は分化、好中球、単球・マクロファージ、好酸球、好塩
基球の増殖または機能亢進、巨核球前駆細胞の増殖、好
中球前駆細胞の増殖または分化、ＢまたはＴ前駆細胞の
増殖または分化、赤血球の産生促進、赤血球、好中球、
好酸球、好塩基球、単球・マクロファージ、肥満細胞、
巨核球前駆細胞の増殖支持、好中球、単球・マクロファ
ージ、Ｂ細胞またはＴ細胞の遊走促進、胸腺細胞の増
殖、脂肪細胞の分化抑制、ナチュラルキラー細胞の増
殖、造血幹細胞の増殖、幹細胞および各種造血前駆細胞
の増殖抑制の作用を本ポリペプチドのみで、あるいは他
のサイトカインと相乗的に働くことにより有する可能性
がある。

【００４５】またこれら以外にも、神経系細胞の発生に
もある種のＦｒｉｚｚｌｅｄ 蛋白が関与することから
本ポリペプチドは神経系にも作用することが予測される
ので、各種神経伝達物質作動性神経細胞への分化ならび
にそれらの生存維持、グリア細胞の増殖促進、神経突起
の伸展、神経節細胞の生存維持、アストロサイトの増殖
または分化促進、末梢神経の増殖または生存維持、シュ
ワン細胞の増殖、運動神経の増殖または生存維持の作用
もある可能性がある。

【００４６】さらに、本ポリペプチドは初期胚の発生過
程において、外胚葉誘導作用による表皮、脳、背骨、神
経の器官形成、中胚葉誘導作用による背索結合組織
（骨、軟骨、筋肉、腱）、血球細胞、心臓、腎臓、生殖
巣の器官形成、あるいは内胚葉誘導作用による消化器系
臓器（胃、腸、肝臓、膵臓）、呼吸器系（肺、気管）の
形成に促進的または抑制的に作用する可能性があるとと
もに、生体においても上記器官の増殖あるいは増殖抑制
作用を有する可能性がある。

【００４７】従って、本発明のポリペプチドはそれ自身
で、骨代謝または免疫系もしくは神経系の機能の低下ま
たは亢進に関する疾患、または造血系細胞の発育不全ま
たは異常増殖、例えば、骨代謝異常（骨粗鬆症等）の予
防または治療薬、炎症性疾患（リウマチ、潰瘍性大腸炎
等）、骨髄移植後の造血幹細胞の減少症、ガン、白血病
に対する放射線照射または化学療法剤投与後の白血球、
血小板、Ｂ細胞またはＴ細胞の減少症、貧血、感染症、
ガン、白血病、ＡＩＤＳ、各種変性疾患（アルツハイマ
ー病、多発性硬化症等）、あるいは神経損傷の治療薬と
して用いることが期待される。

【００４８】また本ポリペプチドは、外胚葉、中胚葉ま
たは内胚葉由来器官の分化または増殖作用を有する可能
性があるので、各器官（表皮、骨、歯、筋肉、腱、心
臓、腎臓、胃、腸、肝臓、膵臓、肺、気管等）の組織修
復剤として用いることも期待される。

【００４９】また、該ポリペプチドのポリクローナル抗
体またはモノクローナル抗体を用いて、生体における該
ポリペプチドの定量が行なえ、これによって該ポリペプ
チドと疾患との関係の研究あるいは疾患の診断等に利用
することができる。ポリクローナル抗体およびモノクロ
ーナル抗体は該ポリペプチドあるいはその断片を抗原と
して用いて常法により作製することができる。さらに、
該ポリペプチドを用いることにより本ポリペプチドと結
合する蛋白（受容体）の精製あるいは遺伝子クローニン
グをすることができる。また本ポリペプチドのアゴニス
ト、アンタゴニストの検索に用いることもできる。

【００５０】本発明のＤＮＡは、多大な有用性が期待さ
れる本発明のポリペプチドを生産する際の重要かつ必須
の鋳型となるだけでなく、遺伝病の診断や治療（遺伝子
欠損症の治療またはアンチセンスＤＮＡ（ＲＮＡ）によ
って、ポリペプチドの発現を停止させることによる治療
等）に利用できる。また、本発明のＤＮＡをプローブと
してジェノミック（genomic）ＤＮＡを分離できる。同
様にして、本発明ＤＮＡと相同性の高いヒトの関連ポリ
ペプチドの遺伝子、またマウス以外の生物における本発
明ポリペプチドと相同性の高いポリペプチドの遺伝子を
分離することも可能である。

【００５１】

【医薬品への適用】造血系細胞の発育不全や異常増殖、
神経系機能の亢進や低下、免疫系機能の亢進や低下に関
する疾患、例えば炎症性疾患（リウマチ、潰瘍性大腸炎
等）、骨髄移植後の造血幹細胞の減少症、放射線治療後
または化学療法剤投与後の白血球、血小板、Ｂ細胞また
はＴ細胞の減少症、貧血、感染症、ガン、白血病、ＡＩ
ＤＳ、各種変性疾患（アルツハイマー病、多発性硬化症
等）、または神経損傷の予防または治療、骨代謝異常
（骨粗鬆症等）の予防または治療薬、あるいは組織修復
等のために、本発明のポリペプチドは通常、全身的又は
局所的に、一般的には経口または非経口の形で投与され
る。好ましくは、経口投与、静脈内投与および脳室内投
与である。

【００５２】投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、
投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人
あたり、一回につき、１００μｇから１００ｍｇの範囲
で、一日一回から数回経口投与されるかまたは、成人一
人当り、一回につき、１０μｇから１００ｍｇの範囲
で、一日一回から数回非経口投与される。もちろん前記
したように、投与量は、種々の条件により変動するの
で、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、ま
た範囲を越えて必要な場合もある。

【００５３】本発明化合物を投与する際には、経口投与
のための固体組成物、液体組成物およびその他の組成
物、非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤等として
用いられる。経口投与のための固体組成物には、錠剤、
丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。カプセ
ルには、ソフトカプセルおよびハードカプセルが含まれ
る。

【００５４】このような固体組成物においては、一つま
たはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な
希釈剤（例えば、ラクトース、マンニトール、グルコー
ス、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロー
ス、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アル
ミン酸マグネシウム等）と混合される。組成物は、常法
に従って、不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、潤滑
剤（ステアリン酸マグネシウム等）、崩壊剤（繊維素グ
リコール酸カルシウム等）、安定化剤（ヒト血清アルブ
ミン、ラクトース等）、溶解補助剤（アルギニン、アス
パラギン酸等）を含有していてもよい。

【００５５】錠剤または丸剤は、必要により白糖、ゼラ
チン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロ
ピルメチルセルロースフタレート等の胃溶性あるいは腸
溶性のフィルムで皮膜してもよいし、また２以上の層で
皮膜してもよい。さらにゼラチンのような吸収されうる
物質のカプセルも包含される。

【００５６】経口投与のための液体組成物は、薬学的に
許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリ
キシル剤等を含み、一般に用いられる不活性な希釈剤
（例えば、精製水、エタノール等）を含んでいてもよ
い。この様な組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、
懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐
剤を含有していてもよい。

【００５７】経口投与のためのその他の組成物として
は、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、それ自体
公知の方法により処方されるスプレー剤が含まれる。こ
の組成物は不活性な希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリウム
のような安定剤と等張性を与えるような安定化剤、塩化
ナトリウム、クエン酸ナトリウムあるいはクエン酸のよ
うな等張剤を含有していてもよい。スプレー剤の製造方
法は、例えば米国特許第2,868,691号および同第3,095,3
55号明細書に詳しく記載されている。

【００５８】本発明による非経口投与のための注射剤と
しては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳
濁剤を包含する。水性または非水性の溶液剤、懸濁剤と
しては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも
一つの不活性な希釈剤と混合される。水性の希釈剤とし
ては、例えば注射用蒸留水および生理食塩水が挙げられ
る。非水性の希釈剤としては、例えばプロピレングリコ
ール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植
物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベー
ト８０（登録商標）等が挙げられる。

【００５９】このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤
剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、ヒト血清アル
ブミン、ラクトース等）、溶解補助剤（例えば、アルギ
ニン、アスパラギン酸等）のような補助剤を含んでいて
もよい。

【００６０】これらはバクテリア保留フィルターを通す
ろ過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化される。
これらはまた無菌の固体組成物を製造し（例えば、凍結
乾燥法等により）、使用前に無菌の注射用蒸留水または
他の溶媒に溶解して使用することもできる。

【００６１】非経口投与のためのその他の組成物として
は、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、常法によ
り処方される外用液剤、軟膏、塗布剤、直腸内投与のた
めの坐剤およびペッサリー等が含まれる。

【００６２】

【実施例】以下に実施例および参考例を挙げて本発明を
より具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限
するものではない。

【００６３】実施例１：発現ベクター作製用プラスミド
の構築 武部らの作製したｐｃＤ−ＳＲα２９６ベクター（Mol.
Cell. Biol., 8, 966(1988) に記載）は、ＳＶ４０初
期プロモーターとＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲのＲ領域とＵ５
配列の一部から構成されるプロモーターシステム（ＳＲ
α）を有する、優れた哺乳動物細胞用の発現ベクターで
ある。しかし、（１）インサートのクローニングサイト
がＥｃｏＲＩひとつである、（２）ｐＢＲ３２２ベクタ
ーをベクター領域の骨格としているので、大腸菌からの
ベクター回収量が低い、等の欠点がある。そこで、大腸
菌からの収量が多いｐＵＣ１９ベクターを骨格とし、イ
ンサートのマルチクローニングサイトを有するｐｃＤ−
ＳＲα２９６改変ベクターを、以下の方法により作成し
た。

【００６４】ｐｃＤ−ＳＲα２９６ベクター（国立予防
衛生研究所、武部氏より譲与された。）をＳａｌＩで切
断し、ＳＲαプロモーターを含む 1.7ｋｂｐの切断をア
ガロース電気泳動法を用いて分離回収し、続いて、この
断片をKlenow処理し平滑末端とした。ｐＵＣ１９ベクタ
ーを、Ｎｄｅ ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断後、Ａｍ
ｐＲおよびｐＵＣori の領域を含む 2.4ｋｂｐの断片を
アガロース電気泳動法を用いて分離回収し、Klenow処理
して平滑末端とした後、さらにＢＡＰ（バクテリアルア
ルカリフォスファターゼ）処理して、５′末端のリン酸
基を除いた。

【００６５】こうして得られたＳＲαプロモーターを含
む 1.7ｋｂｐ断片とｐＵＣori を含む 2.4ｋｂｐ断片を
ライゲーションにより環状化し、新しいベクターを構築
した。得られたベクターよりＰｓｔＩ−ＫｐｎＩ断片を
除去し、下記のＴ７およびＳＰ６プロモーターを有する
合成ポリリンカー、

【００６６】

【化１】

【００６７】と入れ換えた。このようにして構築したプ
ラスミドベクター（約 3.9ｋｂｐ、図３に示す。）をｐ
ＵＣＳＲαＭＬ２と命名した。

【００６８】ｐＵＣＳＲαＭＬ２は、多目的プラスミド
ベクターとして以下のような特徴を有する。 １．岡山−Berg法および Gubler ＆ Hoffman法が適用で
きる。 ２．培養菌当りのプラスミド収量が多い。 ３．一本鎖ＤＮＡも調製することができる。 ４．ｃＤＮＡインサートの切り出しが容易である。 ５．シークエンスのためのデレーション・ミュータント
(Deletion mutant)の作製が容易である。 ６．イン・ビトロ(in vitro)での転写が可能である。 ７．哺乳動物細胞にて発現するプロモーターを有する。

【００６９】実施例２：シグナルペプチドに対して選択
性のあるｃＤＮＡライブラリー作製用ベクターの構築 次に、ｈＴａｃ（ヒトＩＬ−２レセプターα、レポータ
ー遺伝子として使用）のシグナルシーケンスを除去した
タンパクをコードするｃＤＮＡを前記のｐＵＣＳＲαＭ
Ｌ２に組み込んだプラスミドを構築し、ｐＵＣＳＲα−
ｈＴａｃと命名した。該ベクターのＳＲαプロモーター
の下流、ｈＴａｃ遺伝子の上流にｃＤＮＡを組み込み、
シグナルシークエンスを持つｃＤＮＡからタンパクが翻
訳されることでｈＴａｃと融合タンパクを形成すれば、
膜上に該融合タンパクが発現することとなる。

【００７０】（１）すなわち、pBluescript ＳＫ（＋）
（Stratagene社より販売、ｐＢＳ）のＨｉｎｄＩＩＩサ
イトにｈＴａｃのｃＤＮＡを組み込んだｐＢＳ−ｈＴａ
ｃをＫｐｎＩで消化後、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平
滑化し、次にＳａｃＩで消化し、リーダーシーケンスを
除去した後、ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩアダプターをライゲ
ートし、ＥｃｏＲＩ−平滑末端断片を得た。この断片を
ＳａｃＩサイトを壊したｐＵＣＳＲαＭＬ２のＥｃｏＲ
Ｉ−ＳｍａＩサイトに組み込んでｐＵＣＳＲαＭＬ２−
ｈＴａｃを得た（図４に示す。）。

【００７１】実施例３：シグナルペプチドに対して選択
性のあるｃＤＮＡライブラリーの作製 マウスストローマ細胞株ＳＴ２（造血幹細胞の生存増殖
およびＢ細胞やミエロイド細胞系の増殖分化を支持する
細胞であって、EMBO J., 7,1337 (1988)に記載されてい
る。）より、ＡＧＰＣ（アシッドグアニジン−フェノー
ル−クロロホルム）法（細胞工学実験プロトコール（秀
潤社より発刊）、２８〜３１ページに詳しく記載されて
いる。）によって全ＲＮＡを抽出し、さらにオリゴ（ｄ
Ｔ）−ラテックス（Oligotex-dT30 （商品名、宝酒造
（株）より販売））を用いてポリＡ−ＲＮＡを精製し
た。ランダムヘキサマーをプライマーとして、逆転写酵
素により一本鎖のｃＤＮＡを合成し、ターミナルデオキ
シトランスフェラーゼによりその３′末端にｄＣを付加
した。ＳａｌＩを含む制限酵素部位を連結した１７ｍｅ
ｒのｄＣ、

【００７２】

【化２】

【００７３】をアニールさせ、それをプライマーとして
二本鎖のｃＤＮＡを合成した。平均長が５００ｂｐにな
るように超音波処理してｃＤＮＡを断片化した後、アガ
ロース電気泳動で４００〜８００ｂｐのｃＤＮＡを分画
した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑化した後、
ＳａｃＩ部位を含むローンリンカー、

【００７４】

【化３】

【００７５】（Nucreic Acids Res., 18, 4293(1990)参
照のこと）を連結し、再度アガロース電気泳動により４
００〜８００ｂｐのｃＤＮＡを分画した。ＳａｌＩサイ
トを含むプライマー（ＮＬＣ）、

【００７６】

【化４】

【００７７】とＳａｃＩサイトを含むプライマー（ＬＬ
ＨＥＳ）、

【００７８】

【化５】

【００７９】を用いて、９４℃で１分間、５０℃で２分
間、７２℃で２分間の条件で２５サイクルのＰＣＲを行
なった。増幅されたｃＤＮＡをＳａｃＩとＥｃｏＲＩで
消化して、アガロース電気泳動により４００〜８００ｂ
ｐのｃＤＮＡを分画した。このｃＤＮＡと、ｐＵＣＳＲ
αＭＬ２−ｈＴａｃ（実施例２で作製した。）をＳａｃ
ＩとＳａｌＩで消化したプラスミドとをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで連結し、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換して、シグ
ナルペプチドに対して選択性のあるｃＤＮＡライブラリ
ーを得た。

【００８０】実施例４：シグナルペプチドをコードする
ｃＤＮＡのスクリーニングおよび解析 実施例３で作製したライブラリーで得られたコロニーを
プール（約５０コロニー／プール）に細分化した。各プ
ールごとに、プラスミドをミニプレット法で単離し、Ｄ
ＥＡＥ−デキストラン法（Current Protocol in Molecu
lar Biology,§9.2.1 ）によりＣＯＳ−７細胞にトラン
スフェクションした。４８時間後、細胞をディッシュか
らはがし、マウス抗Ｔａｃ ＩｇＧ抗体と氷上で２０分
間インキュベーションした。フリーの抗体を除去した
後、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）で
ラベルしたヤギ抗マウス ＩｇＧ抗体と氷上で２０分間
インキュベーションし、再度フリーの抗体を除去して、
細胞表面のＴａｃに対する蛍光染色を行なった。次い
で、蛍光顕微鏡を用いて、陽性を示すプールを選択し
た。そのうち１プールについて、さらにコロニーを細分
化し、単一クローンを得るまで同様の方法を繰り返し、
１個の陽性クローン（ＳＴ−ＮＴ５）を得た。次にｐＵ
ＣＳＲαＭＬ２−ｈＴａｃベクターに特異的な２種類の
合成プライマー

【００８１】

【化６】

【００８２】を用いて、ＳＴ−ＮＴ５インサートの塩基
配列を決定した。ＤＮＡのシークエンシングは、サンガ
ー（Sanger, F）らのジデオキシ・ターミネーター法に
基づいた、ＡＢＩ社（Applied Biosystems Inc.）の蛍
光ダイ−ターミネーターを用いるサイクルシークエンス
法により行なった。またシークエンスの読みとりには、
ＡＢＩ社のＤＮＡシークエンサー（Model 373A）を用い
た。ＤＮＡおよびアミノ酸レベルでデータベースとのホ
モロジー検索を行なった結果、ＳＴ−ＮＴ５は、未知の
タン白質をコードすることが明らかとなった。

【００８３】実施例５：全長ｃＤＮＡのスクリーニング
および塩基配列の決定 ｃＤＮＡライブラリーの作製は、マウスストローマ細胞
株ＳＴ２由来のｍＲＮＡよりスーパースクリプト（Supe
r Script、登録商標）ラムダシステム（BRL 社より販
売）を用いて行なった。このｃＤＮＡをホスファターゼ
処理済みのＳａｌＩ、ＮｏｔＩアーム（ａｒｍ）を持つ
λｇｔ２２Ａ（BRL 社より販売）と連結した。インビト
ロパッケージングは、イン・ビトロ・パッケジング・キ
ット（in vitro Packaging Kit） LAMDA INN（日本ジー
ン）のプロトコールに従って行ない、その組換えファー
ジを宿主大腸菌Ｙ１０９０（ｒ−）（BRL 社より販売）
に感染させた。その結果１００万のプラークからなるｃ
ＤＮＡライブラリーが得られた。次に、ＳＴ−ＮＴ５の
入ったプラスミドを SalＩとNotＩで消化し、アガロー
ス電気泳動でＳＴ−ＮＴ５断片を調製した。オリゴラベ
ルしたＳＴ−ＮＴ５ｃＤＮＡ断片をプローブとしてライ
ブラリーのスクリーニングを行ない、多数の陽性クロー
ンを得た。その中でインサートが約 1.８ｋｂｐのクロ
ーンについて、λｇｔ２２Ａベクターから切り出したＳ
ａｌＩ−ＮｏｔＩ断片をｐＵＣＳＲαＭＬ２にサブクロ
ーニングし、全長クローンを含むと考えられるプラスミ
ドを得、その全長ｃＤＮＡをＳＤＦ５と命名した。Ｔ７
プライマーを使ってＳＤＦ５ｃＤＮＡの５′側３００ｂ
ｐの塩基配列を決定して、プローブのＳＴ−ＮＴ５と一
致する配列がファージライブラリー由来のＳＤＦ５ｃＤ
ＮＡの最も５′側に存在することをまず確認した。

【００８４】実施例６：ｃＤＮＡ全長のシークエンスと
オープンリーディングフレームの決定 ｃＤＮＡの全長のシークエンスは、Molecular Cloning
（Sambrook, J., Fritsch, E. F.および Maniatis, T.
著、Cold Spring Harbor Laboratory Press より1989年
に発刊）に記載の方法に従って、ランダムシークエンシ
ングを行なって決定した。

【００８５】すなわち、プラスミド ｐＢＳ−ＳＤＦ５
からＳａｌＩ−ＮｏｔＩ消化によりＳＤＦ５ｃＤＮＡイ
ンサートを分離精製した。これをライゲーションおよび
フラグメンテーションし、Ｔ４ポリメラーゼによりＤＮ
Ａ断片の末端を平滑化し、４００ｂｐ付近の長さのＤＮ
Ａ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片をプラスミドベ
クター、BLUESCRIPT ＩＩ （Stratagene社より販売）の
ＳｍａＩサイトにクローニングした後、大腸菌(E. Col
i) に形質転換した。２０個のコロニーをランダムにピ
ックアップし、プラスミドＤＮＡを調製後、これら２０
個のプラスミド（これらはすべてＳＤＦ５のｃＤＮＡの
断片をインサートとして持っている。）のＤＮＡシーク
エンシングを行なった。ＤＮＡのシークエンシングとシ
ークエンスの読み取りは実施例４に記載した方法により
行なった。

【００８６】ＳＤＦ５のｃＤＮＡ断片のシークエンスデ
ータは、ＤＮＡＳＩＳのＤＮＡシークエンス連結プログ
ラムを用いて、連続したシークエンスに編集し、配列番
号３に示す塩基配列を得た。このｃＤＮＡ全長シークエ
ンスデータからオープンリーディングフレームを決定
し、さらにアミノ酸配列に翻訳して、配列番号１に示す
配列を得た。

【００８７】

【配列表】配列番号: １ 配列の長さ: ２９５ 配列の型: アミノ酸 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: タンパク質 配列 Met Pro Arg Gly Pro Ala Ser Leu Leu Leu Leu Val Leu Ala Ser His 1 5 10 15 Cys Cys Leu Gly Ser Ala Arg Gly Leu Phe Leu Phe Gly Gln Pro Asp 20 25 30 Phe Ser Tyr Lys Arg Ser Asn Cys Lys Pro Ile Pro Ala Asn Leu Gln 35 40 45 Leu Cys His Gly Ile Glu Tyr Gln Asn Met Arg Leu Pro Asn Leu Leu 50 55 60 Gly His Glu Thr Met Lys Glu Val Leu Glu Gln Ala Gly Ala Trp Ile 65 70 75 80 Pro Leu Val Met Lys Gln Cys His Pro Asp Thr Lys Lys Phe Leu Cys 85 90 95 Ser Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Asp Leu Asp Glu Thr Ile Gln 100 105 110 Pro Cys His Ser Leu Cys Met Gln Val Lys Asp Arg Cys Ala Pro Val 115 120 125 Met Ser Ala Phe Gly Phe Pro Trp Pro Asp Met Leu Glu Cys Asp Arg 130 135 140 Phe Pro Gln Asp Asn Asp Leu Cys Ile Pro Leu Ala Ser Ser Asp His 145 150 155 160 Leu Leu Pro Ala Thr Glu Glu Ala Pro Lys Val Cys Glu Ala Cys Lys 165 170 175 Thr Lys Asn Glu Asp Asp Asn Asp Ile Met Glu Thr Leu Cys Lys Asn 180 185 190 Asp Phe Ala Leu Lys Ile Lys Val Lys Glu Ile Thr Tyr Ile Asn Arg 195 200 205 Asp Thr Lys Ile Ile Leu Glu Thr Lys Ser Lys Thr Ile Tyr Lys Leu 210 215 220 Asn Gly Val Ser Glu Arg Asp Leu Lys Lys Ser Val Leu Trp Leu Lys 225 230 235 240 Asp Ser Leu Gln Cys Thr Cys Glu Glu Met Asn Asp Ile Asn Ala Pro 245 250 255 Tyr Leu Val Met Gly Gln Lys Gln Gly Gly Glu Leu Val Ile Thr Ser 260 265 270 Val Lys Arg Trp Gln Lys Gly Gln Arg Glu Phe Lys Arg Ile Ser Arg 275 280 285 Ser Ile Arg Lys Leu Gln Cys 290 295

【００８８】配列番号：２ 配列の長さ：８８５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATGCCGCGGG GCCCTGCCTC GCTGCTGCTG CTAGTCCTCG CCTCGCACTG CTGCCTGGGC 60 TCGGCGCGTG GGCTCTTCCT CTTCGGCCAG CCCGACTTCT CCTACAAGCG CAGCAACTGC 120 AAGCCCATCC CCGCCAACCT GCAGCTGTGC CACGGCATCG AGTACCAGAA CATGCGGCTG 180 CCCAACCTGC TGGGCCACGA GACCATGAAG GAGGTGCTGG AGCAGGCGGG CGCCTGGATT 240 CCGCTGGTCA TGAAGCAGTG CCACCCGGAC ACCAAGAAGT TCCTGTGCTC GCTCTTCGCC 300 CCTGTCTGTC TCGACGACCT AGATGAGACC ATCCAGCCGT GTCACTCGCT CTGCATGCAG 360 GTGAAGGACC GCTGCGCCCC GGTCATGTCC GCCTTCGGCT TCCCCTGGCC AGACATGCTG 420 GAGTGCGACC GTTTCCCGCA GGACAACGAC CTCTGCATCC CCCTCGCTAG TAGCGACCAC 480 CTCCTGCCGG CCACAGAGGA AGCTCCCAAG GTGTGTGAAG CCTGCAAAAC CAAGAATGAG 540 GACGACAACG ACATCATGGA AACCCTTTGT AAAAATGACT TCGCACTGAA AATCAAAGTG 600 AAGGAGATAA CGTACATCAA CAGAGACACC AAGATCATCC TGGAGACAAA GAGCAAGACC 660 ATTTACAAGC TGAACGGCGT GTCCGAAAGG GACCTGAAGA AATCCGTGCT GTGGCTCAAA 720 GACAGCCTGC AGTGCACCTG TGAGGAGATG AACGACATCA ACGCTCCGTA TCTGGTCATG 780 GGACAGAAGC AGGGCGGCGA GCTGGTGATC ACCTCCGTGA AACGGTGGCA GAAGGGCCAG 840 AGAGAGTTCA AGCGCATCTC CCGCAGCATC CGCAAGCTGC AATGC 885

【００８９】配列番号：３ 配列の長さ：１７９９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 TCACTAGTCC ACGATGCCGC GGGGCCCTGC CTCGCTGCTG CTGCTAGTCC TCGCCTCGCA 60 CTGCTGCCTG GGCTCGGCGC GTGGGCTCTT CCTCTTCGGC CAGCCCGACT TCTCCTACAA 120 GCGCAGCAAC TGCAAGCCCA TCCCCGCCAA CCTGCAGCTG TGCCACGGCA TCGAGTACCA 180 GAACATGCGG CTGCCCAACC TGCTGGGCCA CGAGACCATG AAGGAGGTGC TGGAGCAGGC 240 GGGCGCCTGG ATTCCGCTGG TCATGAAGCA GTGCCACCCG GACACCAAGA AGTTCCTGTG 300 CTCGCTCTTC GCCCCTGTCT GTCTCGACGA CCTAGATGAG ACCATCCAGC CGTGTCACTC 360 GCTCTGCATG CAGGTGAAGG ACCGCTGCGC CCCGGTCATG TCCGCCTTCG GCTTCCCCTG 420 GCCAGACATG CTGGAGTGCG ACCGTTTCCC GCAGGACAAC GACCTCTGCA TCCCCCTCGC 480 TAGTAGCGAC CACCTCCTGC CGGCCACAGA GGAAGCTCCC AAGGTGTGTG AAGCCTGCAA 540 AACCAAGAAT GAGGACGACA ACGACATCAT GGAAACCCTT TGTAAAAATG ACTTCGCACT 600 GAAAATCAAA GTGAAGGAGA TAACGTACAT CAACAGAGAC ACCAAGATCA TCCTGGAGAC 660 AAAGAGCAAG ACCATTTACA AGCTGAACGG CGTGTCCGAA AGGGACCTGA AGAAATCCGT 720 GCTGTGGCTC AAAGACAGCC TGCAGTGCAC CTGTGAGGAG ATGAACGACA TCAACGCTCC 780 GTATCTGGTC ATGGGACAGA AGCAGGGCGG CGAGCTGGTG ATCACCTCCG TGAAACGGTG 840 GCAGAAGGGC CAGAGAGAGT TCAAGCGCAT CTCCCGCAGC ATCCGCAAGC TGCAATGCTA 900 GTTTCCCAGT GGGGTGGCTT CTCTCCATCC AGGCCCTGAG CTCTGTAGAC CACTTCCGCT 960 CCGCGACCTC ATTTCCGGTT TCCCAAGCAC AGTCCGGGAA AGCTACAGCC CCAGCTTGGA 1020 GCCGCTTGCC CTGCCTCCTG CATGTGTGTA TCCCTAACAT GTCCTGAGTT ATAAGGCCCT 1080 AGGAGGCCTT GGAAACCCAT AGCTGTTTTC ACGGAAAGCG AAAAGCCCAT CCAGATCTTG 1140 TACAAATATT CAAACTAATA AAATCATGAC TATTTTTATG AAGTTTTAGA ACAGCTCGTT 1200 TTAAGGTTAG TTTTGAATAG CTGTAGTACT TTGACCCGAG GGGCATTTTC TCTCTTTGGT 1260 CAGTCTGTTG GCTTATACCG TGCACTTAGG TTGCCATGTC AGGCGAATTG TTTCTTTTTT 1320 TTTTTTTTTT TCCCTCTGTG GTCTAAGCTT GTGGGTCCCA GACTTAGTTG AGATAAAGCT 1380 GGCTGTTATC TCAAAGTCTT CCTCAGTTCC AGCCTGAGAA TCGGCATCTA AGTCTTCAAA 1440 CATTTCGTTG CTCGTTTTAT GCCCTCATGA GCTCTGACCA TTGCATGCGT TCCCATCCCA 1500 GCTACAGAAC TTCAGTTTAT AAGCACACAG TAACCATTCC TCATTGCATG ATGCCCTCAA 1560 ATAAAAAGTG AATACAGTCT ATAAATTGAC GAGTATTTTA AGCTTTGTTT AAAACATCTT 1620 TTAATTCAAT TTTTTAATCA TTTTTTTTGC AAACTAAATC ATTGTAGCTT ACCTGTAATA 1680 TACGTAGTAG TTGACCTGGA AAAGTTGTAA AAATATTGCT TTAACCGACA CTGTAAATAT 1740 TTCAGATAAA CATTATATTC TTTGTATATA AACTTTAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAA 1799

【００９０】配列番号：４ 配列の長さ：１７９９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：Mouse セルライン：ＳＴ２ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：14..898 特徴を決定した方法：Ｐ 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：14..73 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：74..898 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 TCACTAGTCC ACG ATG CCG CGG GGC CCT GCC TCG CTG CTG CTG CTA GTC 49 Met Pro Arg Gly Pro Ala Ser Leu Leu Leu Leu Val -20 -15 -10 CTC GCC TCG CAC TGC TGC CTG GGC TCG GCG CGT GGG CTC TTC CTC TTC 97 Leu Ala Ser His Cys Cys Leu Gly Ser Ala Arg Gly Leu Phe Leu Phe -5 1 5 GGC CAG CCC GAC TTC TCC TAC AAG CGC AGC AAC TGC AAG CCC ATC CCC 145 Gly Gln Pro Asp Phe Ser Tyr Lys Arg Ser Asn Cys Lys Pro Ile Pro 10 15 20 GCC AAC CTG CAG CTG TGC CAC GGC ATC GAG TAC CAG AAC ATG CGG CTG 193 Ala Asn Leu Gln Leu Cys His Gly Ile Glu Tyr Gln Asn Met Arg Leu 25 30 35 40 CCC AAC CTG CTG GGC CAC GAG ACC ATG AAG GAG GTG CTG GAG CAG GCG 241 Pro Asn Leu Leu Gly His Glu Thr Met Lys Glu Val Leu Glu Gln Ala 45 50 55 GGC GCC TGG ATT CCG CTG GTC ATG AAG CAG TGC CAC CCG GAC ACC AAG 289 Gly Ala Trp Ile Pro Leu Val Met Lys Gln Cys His Pro Asp Thr Lys 60 65 70 AAG TTC CTG TGC TCG CTC TTC GCC CCT GTC TGT CTC GAC GAC CTA GAT 337 Lys Phe Leu Cys Ser Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Asp Leu Asp 75 80 85 GAG ACC ATC CAG CCG TGT CAC TCG CTC TGC ATG CAG GTG AAG GAC CGC 385 Glu Thr Ile Gln Pro Cys His Ser Leu Cys Met Gln Val Lys Asp Arg 90 95 100 TGC GCC CCG GTC ATG TCC GCC TTC GGC TTC CCC TGG CCA GAC ATG CTG 433 Cys Ala Pro Val Met Ser Ala Phe Gly Phe Pro Trp Pro Asp Met Leu 105 110 115 120 GAG TGC GAC CGT TTC CCG CAG GAC AAC GAC CTC TGC ATC CCC CTC GCT 481 Glu Cys Asp Arg Phe Pro Gln Asp Asn Asp Leu Cys Ile Pro Leu Ala 125 130 135 AGT AGC GAC CAC CTC CTG CCG GCC ACA GAG GAA GCT CCC AAG GTG TGT 529 Ser Ser Asp His Leu Leu Pro Ala Thr Glu Glu Ala Pro Lys Val Cys 140 145 150 GAA GCC TGC AAA ACC AAG AAT GAG GAC GAC AAC GAC ATC ATG GAA ACC 577 Glu Ala Cys Lys Thr Lys Asn Glu Asp Asp Asn Asp Ile Met Glu Thr 155 160 165 CTT TGT AAA AAT GAC TTC GCA CTG AAA ATC AAA GTG AAG GAG ATA ACG 625 Leu Cys Lys Asn Asp Phe Ala Leu Lys Ile Lys Val Lys Glu Ile Thr 170 175 180 TAC ATC AAC AGA GAC ACC AAG ATC ATC CTG GAG ACA AAG AGC AAG ACC 673 Tyr Ile Asn Arg Asp Thr Lys Ile Ile Leu Glu Thr Lys Ser Lys Thr 185 190 195 200 ATT TAC AAG CTG AAC GGC GTG TCC GAA AGG GAC CTG AAG AAA TCC GTG 721 Ile Tyr Lys Leu Asn Gly Val Ser Glu Arg Asp Leu Lys Lys Ser Val 205 210 215 CTG TGG CTC AAA GAC AGC CTG CAG TGC ACC TGT GAG GAG ATG AAC GAC 769 Leu Trp Leu Lys Asp Ser Leu Gln Cys Thr Cys Glu Glu Met Asn Asp 220 225 230 ATC AAC GCT CCG TAT CTG GTC ATG GGA CAG AAG CAG GGC GGC GAG CTG 817 Ile Asn Ala Pro Tyr Leu Val Met Gly Gln Lys Gln Gly Gly Glu Leu 235 240 245 GTG ATC ACC TCC GTG AAA CGG TGG CAG AAG GGC CAG AGA GAG TTC AAG 865 Val ILe Thr Ser Val Lys Arg Trp Gln Lys Gly Gln Arg Glu Phe Lys 250 255 260 265 CGC ATC TCC CGC AGC ATC CGC AAG CTG CAA TGC TAGTTTCCCA GTGGGGTGGC 918 Arg Ile Ser Arg Ser Ile Arg Lys Leu Gln Cys 270 275 TTCTCTCCAT CCAGGCCCTG AGCTCTGTAG ACCACTTCCG CTCCGCGACC TCATTTCCGG 978 TTTCCCAAGC ACAGTCCGGG AAAGCTACAG CCCCAGCTTG GAGCCGCTTG CCCTGCCTCC 1038 TGCATGTGTG TATCCCTAAC ATGTCCTGAG TTATAAGGCC CTAGGAGGCC TTGGAAACCC 1098 ATAGCTGTTT TCACGGAAAG CGAAAAGCCC ATCCAGATCT TGTACAAATA TTCAAACTAA 1158 TAAAATCATG ACTATTTTTA TGAAGTTTTA GAACAGCTCG TTTTAAGGTT AGTTTTGAAT 1218 AGCTGTAGTA CTTTGACCCG AGGGGCATTT TCTCTCTTTG GTCAGTCTGT TGGCTTATAC 1278 CGTGCACTTA GGTTGCCATG TCAGGCGAAT TGTTTCTTTT TTTTTTTTTT TTTCCCTCTG 1338 TGGTCTAAGC TTGTGGGTCC CAGACTTAGT TGAGATAAAG CTGGCTGTTA TCTCAAAGTC 1398 TTCCTCAGTT CCAGCCTGAG AATCGGCATC TAAGTCTTCA AACATTTCGT TGCTCGTTTT 1458 ATGCCCTCAT GAGCTCTGAC CATTGCATGC GTTCCCATCC CAGCTACAGA ACTTCAGTTT 1518 ATAAGCACAC AGTAACCATT CCTCATTGCA TGATGCCCTC AAATAAAAAG TGAATACAGT 1578 CTATAAATTG ACGAGTATTT TAAGCTTTGT TTAAAACATC TTTTAATTCA ATTTTTTAAT 1638 CATTTTTTTT GCAAACTAAA TCATTGTAGC TTACCTGTAA TATACGTAGT AGTTGACCTG 1698 GAAAAGTTGT AAAAATATTG CTTTAACCGA CACTGTAAAT ATTTCAGATA AACATTATAT 1758 TCTTTGTATA TAAACTTTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A 1799

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のｃＤＮＡライブラリーの作製方法の
概念図である。

【図２】 マウスＳＤＦ５とショウジョウバエＦｒｉｚ
ｚｌｅｄ蛋白（d−Fz）のＣｙｓ−ｒｉｃｈドメインの
アミノ酸配列上の相同性を示した図である。

【図３】 プラスミドベクター ｐＵＣＳＲαＭＬ２の
構築図である。

【図４】 ｐＵＣＳＲαＭＬ２−ｈＴａｃの構築図であ
る。 25

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＦ Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＣＣ ＡＤＴ ＡＤＵ ＡＤＹ ＡＤＶＤ 39/395 ＡＡＢ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ ＡＡＭ Ｃ０７Ｋ 14/47 ＡＢＡ 16/18 ＡＢＤ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＥ ＡＣＣ ＡＢＧ ＡＤＵ ＡＢＪ ＡＤＶ ＡＣＬ Ｃ０７Ｈ 21/04 ＡＤＦ Ｃ０７Ｋ 14/47 ＡＤＴ 16/18 ＡＤＹ (54)【発明の名称】 新規なポリペプチド、その製造方法、そのポリペプチドをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡからな るベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、そのポリペプチドの抗体、およびそのペ プチドまたは抗体を含有する薬学的組成物

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 実質的に純粋な形である配列番号１で示
   されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのホモロ
   ーグ、そのフラグメントまたはそのフラグメントのホモ
   ローグ。
2. 【請求項２】 配列番号１で示されるアミノ酸配列から
   なる請求項１記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】 請求項２に記載されたポリペプチドをコ
   ードするＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列番号２で示される塩基配列を有する
   請求項３記載のＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイ
   ブリダイズするフラグメント。
5. 【請求項５】 配列番号３で示される塩基配列を有する
   請求項３記載のＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイ
   ブリダイズするフラグメント。
6. 【請求項６】 請求項３から５のいずれかの項に記載の
   ＤＮＡからなる複製または発現ベクター。
7. 【請求項７】 請求項６記載の複製または発現ベクター
   で形質転換された宿主細胞。
8. 【請求項８】 請求項１または２に記載されたポリペプ
   チドを発現させるための条件下で請求項７記載の宿主細
   胞を培養することからなる該ポリペプチドの製造方法。
9. 【請求項９】 請求項１または２に記載されたポリペプ
   チドのモノクローナルまたはポリクローナル抗体。
10. 【請求項１０】 請求項１または２に記載されたポリペ
    プチドまたは請求項９記載の抗体および薬学的に許容さ
    れる賦形剤および／または担体を含有することを特徴と
    する薬学的組成物。