JPH07145198A - 新規なポリペプチド、その製造方法、そのポリペプチドをコードするｄｎａ、そのｄｎａからなるベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、そのポリペプチドの抗体、およびそのポリペプチドまたは抗体を含有する薬学的組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒトグリア芽細胞腫細胞株が産生する、１７
０アミノ酸からなる新規なポリペプチド、その製造方
法、そのポリペプチドをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡ
配列に選択的にハイブリダイズするフラグメント、その
ＤＮＡからなる複製または発現ベクター、そのベクター
で形質転換された宿主細胞、そのポリペプチドの抗体、
およびそのペプチドまたは抗体を含有する薬学的組成
物。 【効果】 本発明のポリペプチドは、細胞の発育不全ま
たは異常増殖、機能の低下または亢進、あるいは腫瘍等
の予防あるいは治療剤として用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ある種のグリア芽細胞
腫細胞株が産生する新規なポリペプチド、その製造方
法、そのポリペプチドをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡ
からなるベクター、そのベクターで形質転換された宿主
細胞、そのポリペプチドの抗体、およびそのペプチドま
たは抗体を含有する薬学的組成物に関する。

【０００２】

【発明の背景】脳を構成する細胞には、大別して神経細
胞とグリア細胞が存在する。神経細胞は、脳内情報の伝
達、処理の主役である。一方、グリア細胞は神経細胞の
働きを支持する。具体的には神経細胞の保護および支持
作用、ミエリン鞘の形成、血液脳関門の形成、神経細胞
への栄養補給、神経伝達物質の代謝、さらには脳発育過
程における神経細胞の増殖および分化作用の制御等が考
えられている。グリア細胞には多種多様な細胞が含まれ
る。中枢神経系ではアストロサイト、オリゴデンドロサ
イト、ミクログリアなどがあり、末梢神経系にはシュワ
ン(Schwann) 細胞、マントル(mantle)細胞などがあり、
また脳室内皮に存在するエペンダイマル(ependymal) 細
胞もグリア細胞のひとつである。

【０００３】

【従来の技術】近年、神経細胞やグリア細胞の分化、増
殖および成長に係わる多くの液性因子が見出されている
が、そのうち、大部分はグリア細胞または癌化したグリ
ア細胞（以下、まとめてグリア細胞等という。）から産
生されるものである。例えば、神経細胞のみに作用する
因子として知られている神経成長因子（ＮＧＦ、分子量
約13.5ｋｄ（ヒト））、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮ
Ｆ、分子量約13.5ｋｄ（ヒト））、神経芽細胞腫増殖抑
制因子（ＮＧＩＦ、分子量約５ｋｄ（ヒト））およびグ
リア由来神経発育因子（分子量約５００ｋｄのものと約
１１０ｋｄのものがある（いずれもラット））、および
グリア細胞のみに作用するグリア細胞由来グリア細胞増
殖抑制因子（ＧｄＧＧＩＦ、分子量約１００ｋｄ以上
（ラット））および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ、分
子量約３２ｋｄ（ヒト））、さらに、神経突起伸展促進
作用とグリア細胞の増殖促進作用を併せ持つグリア由来
神経突起伸展因子（ＧｄＮＴＦ、分子量約４３ｋｄ（ラ
ット））、神経突起伸展促進作用とグリア芽細胞の増殖
と分化を促進するグリア細胞成長因子（ＧＭＦ、分子量
約16.5ｋｄ（ウシ））、神経節細胞の生存維持作用、交
感神経節細胞の増殖抑制および分化促進作用、およびア
ストロサイトの分化促進作用を有する毛様体神経発育因
子（ＣＮＴＦ、分子量約２３ｋｄ（ウサギおよびラッ
ト））および神経細胞とアストロサイトに対して増殖促
進活性を有する線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ、分子量約
１６〜１７ｋｄ（ヒト））は、いずれもアストロサイト
から産生される。さらに神経細胞に作用するシュワン細
胞由来神経発育因子（ＳｃｈＮＴＦ、分子量８ｋｄ以上
（ラット））はシュワン細胞から産生される［詳細につ
いては、蛋白質核酸酵素，36（No.7），260 （1991）参
照のこと］。また、これまでは、免疫系の細胞が主に分
泌すると考えられていたインターロイキン類（ＩＬ−
１、ＩＬ−６等）がグリア細胞からも分泌されているこ
とが知られるようになった。これらの因子は、既に大部
分アミノ酸配列の解明がなされており、現在では単に研
究対象としてだけでなく、医薬への応用に向けた開発研
究がなされている。

【０００４】

【発明の目的】前記したように、グリア細胞等からは、
神経細胞やグリア細胞の分化、増殖および成長に関連し
た多くの液性因子および免疫に関連した液性因子が産生
されていることがわかる。これらの事実は、上記以外に
も同様の作用を有するいくつかの因子がグリア細胞等か
ら産生されている可能性を示唆している。本発明者ら
は、この点に注目しグリア細胞等が産生している新規な
因子（ポリペプチド）を見出すべく鋭意検討を行なっ
た。従来、ある特定のポリペプチドまたはそれをコード
するＤＮＡを得ようとする場合、組織や細胞培養液中に
目的とする生物活性を確認し、次いでポリペプチドの単
離精製を経て、遺伝子をクローニングするという方法、
あるいはその生物活性を指標として遺伝子を発現クロー
ニングする方法が一般的に用いられていた。

【０００５】しかし、生体内生理活性ポリペプチドは多
様な生物活性を有している場合が多いので、あるひとつ
の活性を指標にして遺伝子をクローニングした結果、そ
れが既知のポリペプチドと同一であることが後になって
判明するという事例が増えている。また、グリア細胞が
産生する因子はいずれもごく微量であり、そのことが単
離、精製および生物活性の確認を困難なものとしてい
る。一方、ｃＤＮＡの作製技術やシークエンス技術は急
速に発展し、大量のｃＤＮＡのシークエンスを迅速に行
なうことができるようになった。また、遺伝子からその
遺伝子の機能を同定するリバース・ジェネティクス (Re
verse Genetics) の諸方法の発展も著しい。

【０００６】そこで、本発明者らは、この方法を用いて
新規なポリペプチドを見出すことにした。すなわち、グ
リア細胞等からｍＲＮＡを単離し、これを出発材料とし
てｃＤＮＡを得、その塩基配列を決定し、アミノ酸配列
を推定した。その結果、まったく新規なポリペプチドお
よびそれをコードするＤＮＡを見出すことに成功し、本
発明を完成した。スイスプロット(Swiss Prot Release
2.0)に登録されている既知のポリペプチドのアミノ酸配
列を調査したが、本発明のポリペプチドのそれと同一あ
るいは相同性の高い配列を有しているものはまったく無
かった。さらに、ジーンバンク(GenBank Release 70.0)
に登録されているヌクレオチド配列も調査したが、本発
明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡと同一あるいは
相同性の高い配列を有しているものはまったく無かっ
た。従って、本発明のポリペプチドはまったく新規なも
のであることが確認された。

【０００７】

【発明の構成】本発明は、実質的に純粋な形である配列
番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
そのホモローグ、その配列のフラグメントおよびそのホ
モローグに関する。本発明はさらにそれらのポリペプチ
ドをコードするＤＮＡに関する。より具体的には、配列
番号２または３で示される塩基配列を有するＤＮＡ、お
よび配列番号２または３で示される塩基配列に選択的に
ハイブリダイズするフラグメントを有するＤＮＡに関す
る。

【０００８】特に本発明は、（１）配列番号１で示され
るアミノ酸配列からなるポリペプチド、（２）前記
（１）に記載したポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（３）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
および（４）配列番号３で示される塩基配列を有するＤ
ＮＡに関する。

【０００９】実質的に純粋な形である配列番号１で示さ
れるアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、一般に、
生産時のポリペプチドの９０％以上、例えば、９５、９
８または９９％が配列番号１で示されるアミノ酸配列を
有するポリペプチドであることを意味する。

【００１０】配列番号１で示されるアミノ酸配列からな
るポリペプチドのホモローグとは、一般に少なくとも２
０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０
または１００個の連続したアミノ酸領域で、少なくとも
７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より
好ましくは９５％以上相同性であるものであり、そのよ
うなホモローグは、以後本発明のポリペプチドとして記
載される。さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配列
からなるポリペプチドのフラグメント、またはそれらの
ホモローグのフラグメントとは、少なくとも１０アミノ
酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、例えば２０、
２５、３０、４０、５０または６０アミノ酸部分を意味
する。

【００１１】配列番号２または３で示される塩基配列を
有するＤＮＡに選択的にハイブリダイズするＤＮＡと
は、一般に、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも
３０個、例えば４０、６０または１００個の連続した塩
基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくと
も８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性
であるものであり、そのようなＤＮＡは、以後本発明の
ＤＮＡとして記載される。配列番号２または３で示され
る塩基配列を有するＤＮＡのフラグメントとは、少なく
とも１０塩基、好ましくは少なくとも１５塩基、例えば
２０、２５、３０または４０塩基部分を意味し、そのよ
うなフラグメントも本発明のＤＮＡに含まれる。

【００１２】さらに、本発明には、本発明のＤＮＡから
なる複製または発現ベクターが含まれる。ベクターとし
ては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ＤＮＡの
発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子な
どからなるプラスミド、ウィルスまたはファージベクタ
ーが挙げられる。ベクターはひとつまたはそれ以上の選
択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子を
含んでいてもよい。ベクターは、イン・ビトロ (in vit
ro) において、例えばＤＮＡに対応するＲＮＡの製造、
宿主細胞の形質転換に用いることができる。さらに、本
発明には、配列番号２または３で示される塩基配列、ま
たはそれらのオープンリーディングフレームを有するＤ
ＮＡを含む本発明のＤＮＡを複製または発現させるため
のベクターで形質転換された宿主細胞も含まれる。細胞
としては、例えば細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物
細胞が挙げられる。

【００１３】さらに、本発明には、本発明のポリペプチ
ドを発現させるための条件下で、本発明の宿主細胞を培
養することからなる本発明のポリペプチドの製造方法も
含まれる。培養は、本発明のポリペプチドが発現し、宿
主細胞より製造される条件下で行われることが好まし
い。本発明のＤＮＡは、上記のようなベクターのアンチ
センス領域に挿入することでアンチセンスＲＮＡを製造
することもできる。このようなアンチセンスＲＮＡは、
細胞中の本発明のポリペプチドのレベルを制御すること
に用いることもできる。

【００１４】本発明は、本発明におけるポリペプチドの
モノクローナルまたはポリクローナル抗体も含む。さら
に本発明におけるポリペプチドのモノクローナルまたは
ポリクローナル抗体の製造方法も含む。モノクローナル
抗体は、本発明のペプチドまたは、その断片を抗原とし
て用い、通常のハイブリドーマの技術により製造するこ
とができる。ポリクローナル抗体は、宿主動物（例え
ば、ラットやウサギ等）に本発明のポリペプチドを接種
し、免疫血清を回収する、通常の方法により製造するこ
とができる。本発明には、本発明のポリペプチド、その
抗体と薬学的に許容される賦形剤および／または担体を
含有する薬学的組成物も含まれる。本発明のポリペプチ
ドとしては、配列番号１で示されたアミノ酸配列を有す
るもの以外に、その一部が欠損したもの（例えば、配列
番号１中、生物活性の発現に必須な部分だけから成るポ
リペプチド）、その一部が他のアミノ酸と置換したもの
（例えば、物性の類似したアミノ酸に置換したもの）、
およびその一部に他のアミノ酸が付加または挿入された
ものも含まれる。

【００１５】よく知られているように、ひとつのアミノ
酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、Ｍｅｔは
１種類、Ｌｅｕは６種類）知られている。従って、ポリ
ペプチドのアミノ酸配列を変えることなくＤＮＡの塩基
配列を変えることができる。（２）で特定される本発明
のＤＮＡには、（１）の配列番号１で示されるポリペプ
チドをコードするすべての塩基配列群が含まれる。塩基
配列を変えることによって、ポリペプチドの生産性が向
上することがある。（３）で特定されるＤＮＡは、
（２）で示されるＤＮＡの一態様であり、天然型配列を
表わす。（４）に示されるＤＮＡは、（３）で特定され
るＤＮＡに天然の非翻訳部分を加えた配列を示す。配列
番号３で示される塩基配列を有するＤＮＡの作製は、以
下の方法に従って行なわれる。

【００１６】すなわち、(i)本発明のポリペプチドを産
生する細胞、例えば、ヒトグリア芽細胞腫細胞株からｍ
ＲＮＡを分離し、（ii）該ｍＲＮＡからファーストスト
ランド（１本鎖ＤＮＡ）、次いでセカンドストランド
（２本鎖ＤＮＡ）を合成し（ｃＤＮＡの合成）、（iii)
該ｃＤＮＡを適当なプラスミドベクターに組み込み、
（iv）得られた組み換えベクターで宿主細胞を形質転換
し（ｃＤＮＡライブラリーの作製）、（v)得られたｃＤ
ＮＡライブラリーより、大量のクローニングおよび５′
側から平均３００ベースのシークエンシングを行ない、
（vi）塩基配列の新規なクローンについて、その全長を
シークエンスすることによって作製することができる。

【００１７】より詳細に説明すると、工程（i)は、ヒト
グリア芽細胞腫細胞株を適当な刺激剤（例えば、ＩＬ−
１等）で刺激した後、Okayama, H. 等の方法［Methods
in Enzymology, 154, 3 (1987)に記載］に従って行なわ
れる。本ポリペプチドを産生する細胞としては、好まし
くはヒトグリア芽細胞腫細胞株Ｔ９８Ｇ（ＡＴＣＣ株番
号、ＣＲＬ−１６９０）が挙げられる。（ii）、（iii)
および（iv）の工程はｃＤＮＡライブラリー作製の工程
であり、改変した Gubler ＆ Hoffman法［Gene, 25, 26
3 (1983)に記載］に準じて行なわれる。

【００１８】（iii)の工程で用いられるプラスミドベク
ターとしては大腸菌内で機能するもの（例えば、ｐＢＲ
３２２）や枯草菌内で機能するもの（例えば、ｐＵＢ１
１０）が多数知られているが、好適には、大腸菌内で機
能するｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）［３１９９ｂｐ、プロメ
ガ社より販売。］より作製したｐＶｆＣＳ−１（後記実
施例に詳しく記載されている。）が用いられる。(iv)
の工程で用いられる宿主細胞は既に多くのものが知られ
ており、いずれを用いてもよいが、好ましくはＤＨ５の
コンピテントセル［Gene, 96, 23 (1990) 記載の方法に
より調製される。］である。

【００１９】工程 (v)のクローニングは公知の方法によ
り行なわれる。またシークエンシングはマキサム・ギル
バート（Maxam-Gilbert ）法やジデオキシ・ターミネー
ター法により行なわれる。(vi)の工程は、Molecular Cl
oning ［Sambrook, J., Fritsch, E.F. およびManiati
s, T.著、Cold Spring Harbor Laboratory Press より1
989年に発刊］に記載の方法に従って行なわれる。

【００２０】このようにして得られたＤＮＡは、(I)Ｄ
ＮＡシークエンスを可能なフレームにおいてアミノ酸配
列に変換し、(II) 得られたアミノ酸配列から、疎水性
プロファイルの調製し、そして開始コドン（ＡＴＧ）の
ちょうど後ろにある（分泌蛋白は、そのＮ端末に高疎水
性領域のシグナルペプチドを有している）高疎水性領域
の存在を確認し、そして、(III)該ＤＮＡが全長あるい
はほぼ全長であることを確認する必要がある。これらの
確認は、工程(vi)の後に行なってもよいが、(v) の工程
と(vi)の工程の間に行なうとより効率的である。上記の
検討中、(III) の確認はノーザン（Northern）解析によ
り行なわれる。

【００２１】配列番号２および３で示される塩基配列
が、一旦確定されると、その後は、化学合成によって、
またはＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction)法によっ
て、あるいは該塩基配列の断片をプローブとしてハイブ
リダイズさせることにより、本発明のＤＮＡを得ること
ができる。さらに、本ＤＮＡを含有するベクターＤＮＡ
を適当な宿主に導入し、これを増殖させることによっ
て、目的とする本発明ＤＮＡを必要量得ることができ
る。

【００２２】本発明のポリペプチドを取得する方法とし
ては、（１）生体または培養細胞から精製単離する方
法、（２）ペプチド合成する方法、または（３）遺伝子
組み換え技術を用いて生産する方法、などが挙げられる
が、工業的には（３）に記載した方法が好ましい。

【００２３】遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチド
を生産するための発現系（宿主−ベクター系）として
は、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞
の発現系が挙げられる。例えば、大腸菌で発現させる場
合には、配列番号３で示される塩基配列をコードするＤ
ＮＡの５′末端に開始コドン（ＡＴＧ）を付加し、得ら
れたＤＮＡを、適当なプロモーター（例えば、ｔｒｐプ
ロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモータ
ー、Ｔ７プロモーター等）の下流に接続し、大腸菌内で
機能するベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１
８、ｐＵＣ１９等）に挿入して発現ベクターを作製す
る。次に、この発現ベクターで形質転換した大腸菌（例
えば、E.ColiＤＨ１、E. Coli ＪＭ１０９、E. Coli Ｈ
Ｂ１０１株等）を適当な培地で培養して、その菌体より
目的とするポリペプチドを得ることができる。また、バ
クテリアのシグナルペプチド（例えば、ｐｅｌＢのシグ
ナルペプチド）を利用すれば、ペリプラズム中に目的と
するポリペプチドを分泌することもできる。さらに、他
のポリペプチドとのフュージョン・プロテイン (fusion
protein) を生産することもできる。

【００２４】また、哺乳動物細胞で発現させる場合に
は、例えば、配列表３で示される塩基配列をコードする
ＤＮＡを適当なベクター（例えば、レトロウイルスベク
ター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイル
スベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモ
ーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモ
ーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に挿
入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現ベ
クターで適当な哺乳動物細胞（例えば、サルＣＯＳ−７
細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細
胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養す
ることによって、その細胞中に目的とするポリペプチド
が生産される。以上のようにして得られたポリペプチド
は、一般的な生化学的方法によって単離精製することが
できる。

【００２５】

【発明の効果】本発明のポリペプチドはヒトグリア芽細
胞腫細胞株から生産、分泌されるものであるので、グリ
アやニューロンの分化、増殖、成長または生存維持に関
連した生物活性、免疫機能に関連した生物活性あるいは
腫瘍の増殖、成長に関連した生物活性を有していると予
測される。従って、本発明のポリペプチドはそれ自身
で、グリアやニューロンの発育不全または異常増殖、免
疫機能の低下または亢進、あるいは腫瘍等の予防あるい
は治療剤として用いることができる。また、該ポリペプ
チドのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を
用いて、生体における該ポリペプチドの定量が行なえ、
これによって該ポリペプチドと疾患との関係の研究ある
いは疾患の診断等に利用することができる。ポリクロー
ナル抗体およびモノクローナル抗体は該ポリペプチドあ
るいはその断片を抗原として用いて常法により作製する
ことができる。

【００２６】本発明のＤＮＡは、多大な有用性が期待さ
れる本発明のポリペプチドを生産する際の重要かつ必須
の鋳型となるだけでなく、遺伝病の診断や治療（遺伝子
欠損症の治療またはアンチセンスＤＮＡ（ＲＮＡ）によ
って、ポリペプチドの発現を停止させることによる治療
等）に利用できる。また、本発明のＤＮＡをプローブと
してジェノミック(genomic) ＤＮＡを分離できる。同様
にして、本発明ＤＮＡと相同性の高いヒトの関連ポリペ
プチドの遺伝子、またヒト以外の生物における本発明ポ
リペプチドと相同性の高いポリペプチドの遺伝子を分離
することも可能である。

【００２７】

【医薬品への適用】本発明の目的、またはグリア細胞、
神経細胞の発育不全や異常増殖、免疫機能の亢進や低
下、あるいは腫瘍、糖尿病、糖代謝異常による疾患の治
療等のために本発明のポリペプチドは通常、全身的又は
局所的に、一般的には経口又は非経口の形で投与され
る。好ましくは、経口投与、静脈内投与および脳室内投
与である。

【００２８】投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、
投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人
あたり、一回につき、１００μｇから１００ｍｇの範囲
で、一日一回から数回経口投与されるか、または成人一
人あたり、一回につき１０μｇから１００ｍｇの範囲
で、一日一回から数回非経口投与される。もちろん前記
したように、投与量は、種々の条件により変動するの
で、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、ま
た範囲を越えて必要な場合もある。

【００２９】本発明化合物を投与する際には、経口投与
のための固体組成物、液体組成物およびその他の組成
物、非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤等として
用いられる。経口投与のための固体組成物には、錠剤、
丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。カプセ
ルには、ソフトカプセルおよびハードカプセルが含まれ
る。

【００３０】このような固体組成物においては、一つま
たはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な
希釈剤（例えば、ラクトース、マンニトール、グルコー
ス、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロー
ス、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アル
ミン酸マグネシウム等）と混合される。組成物は、常法
に従って、不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、潤滑
剤（ステアリン酸マグネシウム等）、崩壊剤（繊維素グ
リコール酸カルシウム等）、安定化剤（ヒト血清アルブ
ミン、ラクトース等）、溶解補助剤（アルギニン、アス
パラギン酸等）を含有していてもよい。

【００３１】錠剤または丸剤は、必要により白糖、ゼラ
チン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロ
ピルメチルセルロースフタレート等の胃溶性あるいは腸
溶性のフィルムで皮膜してもよいし、また２以上の層で
皮膜してもよい。さらにゼラチンのような吸収されうる
物質のカプセルも包含される。

【００３２】経口投与のための液体組成物は、薬学的に
許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリ
キシル剤等を含み、一般に用いられる不活性な希釈剤
（例えば、精製水、エタノール等）を含んでいてもよ
い。この様な組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、
懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐
剤を含有していてもよい。

【００３３】経口投与のためのその他の組成物として
は、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、それ自体
公知の方法により処方されるスプレー剤が含まれる。こ
の組成物は不活性な希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリウム
のような安定剤と等張性を与えるような安定化剤、塩化
ナトリウム、クエン酸ナトリウムあるいはクエン酸のよ
うな等張剤を含有していてもよい。スプレー剤の製造方
法は、例えば米国特許第2,868,691 号および同第3,095,
355 号明細書に詳しく記載されている。

【００３４】本発明による非経口投与のための注射剤と
しては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳
濁剤を包含する。水性または非水性の溶液剤、懸濁剤と
しては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも
一つの不活性な希釈剤と混合される。水性の希釈剤とし
ては、例えば注射用蒸留水および生理食塩水が挙げられ
る。非水性の希釈剤としては、例えばプロピレングリコ
ール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植
物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベー
ト８０（登録商標）等が挙げられる。

【００３５】このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤
剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、ヒト血清アル
ブミン、ラクトース等）、溶解補助剤（例えば、アルギ
ニン、アスパラギン酸等）のような補助剤を含んでいて
もよい。これらはバクテリア保留フィルターを通す濾
過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化される。こ
れらはまた無菌の固体組成物を製造し（例えば、凍結乾
燥法等により）、使用前に無菌の注射蒸留水、または他
の溶媒に溶解して使用することもできる。非経口投与の
ためのその他の組成物としては、一つまたはそれ以上の
活性物質を含み、常法により処方される外用液剤、軟コ
ウ、塗布剤、直腸内投与のための坐剤およびペッサリー
等が含まれる。

【００３６】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものでは
ない。

【００３７】実施例１：ｃＤＮＡライブラリー作製用ベ
クターの構築 プラスミドベクターｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）［3199ｂ
ｐ、プロメガ社(PromegaCorp.) より販売］をＨｉｎｄ
IIIで切断後、Klenow処理して再円環化した。このプラ
スミドで大腸菌を形質転換してプラスミドを回収した。
次に、回収されたプラスミドのＡａｔ II −ＮｄｅＩ断
片を切り取り、直鎖プラスミドの末端をＴ４ポリメラー
ゼを用いて平滑末端とした。この末端にＨｉｎｄ IIIリ
ンカーをライゲーションし、Ｈｉｎｄ III切断後、再び
円環化し、大腸菌に形質転換してプラスミドを回収し
た。得られたプラスミドのポリリンカー中のＳａｃＩか
らＰｓｔＩの部分を下記の合成ポリリンカー、

【００３８】

【化１】

【００３９】と入れ換えた。このようにして構築したプ
ラスミドベクター（図１に示す。）をｐＶｆＣＳ−１と
命名した。ｐＶｆＣＳ−１は多目的プラスミドベクター
として以下のような特徴を有する。 １．岡山−Berg法および Gubler-Hoffman 法が適用でき
る。 ２．培養菌当りのプラスミド収量が多い。 ３．一本鎖ＤＮＡも調製することができる。 ４．ｃＤＮＡインサートの切り出しが容易である。 ５．シークエンスのためのデレーション・ミュータント
(Deletion mutant) の作製が容易である。 ６．インビトロでの転写が可能である。

【００４０】実施例２：ｍＲＮＡの分離精製 ヒトグリア芽細胞腫細胞株Ｔ９８Ｇ（ＡＴＣＣ株番号、
ＣＲＬ−１６９０）３×１０⁷ 個を１００ユニット／ｍ
ｌのヒトＩＬ−１βで４時間刺激した後、Okayama, H.
等の方法［Methods in Enzymology, 154, 3 (1987)に記
載］に従って、ｍＲＮＡを分離した。すなわち、5.5 Ｍ
ＧＴＣ溶液（5.5 Ｍグアニジンチオシアネート、２５
ｍＭクエン酸ナトリウム、0.5 ％ソジウムラウリルサル
コシン(sodium lauryl sarcosine) で細胞を可溶化した
後、セルライゼート(cell lysate) を密度1.51のセシウ
ムトリフルオロアセテート（ＣｓＴＦＡ）溶液のクッシ
ョン上に載せて超遠心（120,000 ×ｇ、２０時間）し
て、沈殿中に1.26ｍｇの全ＲＮＡを回収した。これを、
オリゴｄＴセルロースカラムに２回通して４６μｇのｐ
ｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡを精製回収した。

【００４１】実施例３：ｃＤＮＡライブラリーの作製 ｃＤＮＡライブラリーは Gubler ＆ Hoffman法［Gene,
25, 263(1983) に記載］の変法にて作製した。実施例２
で作製したｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡ（５μｇ）から、Ｎ
ｏｔＩサイトを持つオリゴｄＴプライマーを用いて、逆
転写酵素により、ファーストストランドを合成した。続
いて、セカンドストランドを合成し、ＳａｌＩアダプタ
ーのライゲーションおよびＮｏｔＩ消化を行なった後、
ゲルろ過カラムクロマトグラフィー［Sephacryl S-500H
R (Pharmacia社より販売) カラムを用いた。］により、
アダプターとプライマーを除いて、８２０ｎｇのｃＤＮ
Ａフラクションを回収した。以上のｃＤＮＡ合成ステッ
プは、スーパースクリプトシステム（Super ScriptSyst
em 、ＢＲＬ社より販売）のキットを用いて行なった。

【００４２】一方、ベクターの調製は、実施例１で作製
したｐＶｆＣＳ−１をＮｏｔＩにより完全消化後さらに
ＳａｌＩで消化し、0.8 ％アガロース電気泳動にてバン
ドを切り出し、ガラス・パウダー法のためのキット［GE
NECLEAN II（ＢＩＯ１０１社より販売）］を用いて精製
することにより行なった。それぞれ作製したｃＤＮＡと
ベクターをライゲーションした後、Inoue, H. 等の方法
［Gene, 96, 23 (1990) に記載］で調製したＤＨ５のコ
ンピテントセルに形質転換した。その結果、平均長 1.5
ｋｂ、インディペンデントクローン数６×１０⁵ 個のｃ
ＤＮＡライブラリーが得られた。

【００４３】実施例４：クローニングとシークエンシン
グ 実施例３で作製したｃＤＮＡライブラリーより、直径１
０ｃｍのＬＢプレートに約３００個のコロニー／プレー
トの密度でクローンを播き、コロニー群からランダムに
ピックアップしてクローニングを行なった。１コロニー
から３ｍｌのＬＢ培養液で一晩培養後、培養液２００μ
ｌに７％ジメチルスルホキオシド（ＤＭＳＯ）を加え
て、−８０℃で保存した。残りの培養液から菌を分離
し、常法によりプラスミドを分離精製した。プラスミド
は図２で示される構造となっているので、Ｔ７をプライ
マーとしてシークエンスすると、クローニングされたｃ
ＤＮＡの５′側からヌクレオチド配列を読むことができ
る。ＤＮＡのシークエンシングは、Sanger, F.等のジデ
オキシ・ターミネーター法に基づいた、ＡＢＩ社(Appli
ed Biosystems Inc.) の蛍光ダイ−ターミネーターを用
いるサイクルシークエンス法により行なった。また、シ
ークエンスの読み取りには、ＡＢＩ社のＤＮＡシークエ
ンサー(Model３７３Ａ) を用いた。こうして、各クロー
ンの５′側から平均３００ベースの長さのヌクレオチド
配列が得られた。

【００４４】実施例５：パーシャルシークエンスデータ
の解析 実施例４で得られたヌクレオチドシークエンスは、Lipm
an, D. J. およびPearson, W. R.のＦＡＳＴＡプログラ
ムを用いて、既知データベース（GenBank およびＥＭＢ
Ｌ）に含まれるすべてのヌクレオチド配列に対するホモ
ロジーサーチを行なった。これにより、シークエンスし
たクローン群の中から未知シークエンスを持つクローン
を同定した。同定されたクローンのヌクレオチド配列を
可能な３つのフレームでアミノ酸配列に変換した。しか
し、クローニングされたｃＤＮＡクローンのすべてが、
ｍＲＮＡの全長をカバーしているとは限らない。全長で
なければ、Ｎ末端のアミノ酸配列部分を含んでいる可能
性は少ない。そこで、得られたＴＧ１６２５のクローン
が全長か否かを決めるために、Northern解析を行なっ
た。すなわち、グリア芽細胞腫細胞株より抽出精製した
ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡを電気泳動後、ナイロンメンブ
レン上にブロッティングした。ＴＧ１６２５のｃＤＮＡ
インサートをプローブとしてハイブリダイズさせると、
約1200ｂｐの位置に１本のバンドが観察された。ＴＧ１
６２５クローンのインサートの大きさは約1400ｂｐであ
ったので、ＴＧ１６２５はほぼ全長のｃＤＮＡであるこ
とが確かめられた。

【００４５】実施例６：ｃＤＮＡ全長のシークエンスと
オープンリーディングフレームの決定 ｃＤＮＡの全長のシークエンスは、Molecular Cloning
［Sambrook, J., Fritsch, E. F.および Maniatis, T.
著、Cold Spring Harbor Laboratory Press より1989年
に発刊］に記載の方法に従って、ランダムシークエンシ
ングを行なって決定した。

【００４６】すなわち、ＴＧ１６２５クローンよりプラ
スミドを回収し、ｃＤＮＡインサートを分離精製した。
これをライゲーションおよびフラグメンテーションし、
Ｔ４ポリメラーゼによりＤＮＡ断片の末端を平滑化し、
４００ｂｐ付近の長さのＤＮＡ断片をアガロース電気泳
動法を用いて回収した。得られたＤＮＡ断片をプラスミ
ドベクター、BLUESCRIPT II （Stratagene社より販売）
のＳｍａＩサイトにクローニングした後、大腸菌(E. Co
li) に形質転換した。２０個のコロニーをランダムにピ
ックアップし、プラスミドＤＮＡを調製後、これら２０
個のプラスミド（これらはすべてＴＧ１６２５のｃＤＮ
Ａの断片をインサートとして持っている。）のＤＮＡシ
ークエンシングを行なった。ＤＮＡのシークエンシング
とシークエンスの読み取りは実施例４に記載した方法に
より行なった。ＴＧ１６２５ｃＤＮＡ断片のシークエン
スデータは、ＤＮＡＳＩＳのＤＮＡシークエンス連結プ
ログラムを用いて、連続したシークエンスに編集し、配
列番号３に示す塩基配列を得た。このｃＤＮＡ全長シー
クエンスデータからオープンリーディングフレームを決
定し、さらにアミノ酸配列に翻訳して、配列番号１に示
す配列を得た。配列表４にＴＧ１６２５ｃＤＮＡの全塩
基配列とこれにコードされるＴＧ１６２５蛋白質のアミ
ノ酸一次配列を示した。

【００４７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１７０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ser Val Ala Gly Gly Glu Ile Arg Gly Asp Thr Gly Gly Glu Asp 1 5 10 15 Thr Ala Ala Pro Gly Arg Phe Ser Phe Ser Pro Glu Pro Thr Leu Glu 20 25 30 Asp Ile Arg Arg Leu His Ala Glu Phe Ala Ala Glu Arg Asp Trp Glu 35 40 45 Gln Phe His Gln Pro Arg Asn Leu Leu Leu Ala Leu Val Gly Glu Val 50 55 60 Gly Glu Leu Ala Glu Leu Phe Gln Trp Lys Thr Asp Gly Glu Pro Gly 65 70 75 80 Pro Gln Gly Trp Ser Pro Arg Glu Arg Ala Ala Leu Gln Glu Glu Leu 85 90 95 Ser Asp Val Leu Ile Tyr Leu Val Ala Leu Ala Ala Arg Cys Arg Val 100 105 110 Asp Leu Pro Leu Ala Val Leu Ser Lys Met Asp Ile Asn Arg Arg Arg 115 120 125 Tyr Pro Ala His Leu Ala Arg Ser Ser Ser Arg Lys Tyr Thr Glu Leu 130 135 140 Pro His Gly Ala Ile Ser Glu Asp Gln Ala Val Gly Pro Ala Asp Ile 145 150 155 160 Pro Cys Asp Ser Thr Gly Gln Thr Ser Thr 165 170

【００４８】配列番号：２ 配列の長さ：５１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATGTCTGTGG CCGGTGGGGA GATTCGTGGG GACACGGGGG GAGAGGACAC TGCTGCTCCC 60 GGCCGGTTCA GCTTCAGCCC GGAGCCCACG CTCGAGGACA TCCGCCGCCT CCATGCTGAG 120 TTTGCTGCGG AACGAGACTG GGAACAGTTC CATCAGCCTC GGAATCTCCT CCTGGCCTTG 180 GTTGGGGAAG TGGGGGAGCT GGCAGAACTC TTTCAGTGGA AAACCGATGG GGAACCTGGC 240 CCCCAAGGCT GGTCCCCCAG GGAACGGGCA GCCCTTCAAG AGGAGCTTAG TGACGTCCTC 300 ATCTACCTGG TGGCATTAGC AGCCCGCTGC CGTGTGGATC TGCCGCTAGC AGTGCTCTCC 360 AAAATGGACA TCAACCGGCG ACGCTACCCA GCCCATCTGG CCCGCAGCTC TTCCCGCAAG 420 TATACAGAAT TGCCCCATGG GGCCATCTCT GAAGACCAGG CTGTGGGGCC TGCGGACATT 480 CCCTGTGACT CCACAGGCCA GACCTCAACC TAG 513

【００４９】配列番号：３ 配列の長さ：１０７４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 GTGAAGTCGC GGTGCAGCGG TGGGCGGCAT GTCTGTGGCC GGTGGGGAGA TTCGTGGGGA 60 CACGGGGGGA GAGGACACTG CTGCTCCCGG CCGGTTCAGC TTCAGCCCGG AGCCCACGCT 120 CGAGGACATC CGCCGCCTCC ATGCTGAGTT TGCTGCGGAA CGAGACTGGG AACAGTTCCA 180 TCAGCCTCGG AATCTCCTCC TGGCCTTGGT TGGGGAAGTG GGGGAGCTGG CAGAACTCTT 240 TCAGTGGAAA ACCGATGGGG AACCTGGCCC CCAAGGCTGG TCCCCCAGGG AACGGGCAGC 300 CCTTCAAGAG GAGCTTAGTG ACGTCCTCAT CTACCTGGTG GCATTAGCAG CCCGCTGCCG 360 TGTGGATCTG CCGCTAGCAG TGCTCTCCAA AATGGACATC AACCGGCGAC GCTACCCAGC 420 CCATCTGGCC CGCAGCTCTT CCCGCAAGTA TACAGAATTG CCCCATGGGG CCATCTCTGA 480 AGACCAGGCT GTGGGGCCTG CGGACATTCC CTGTGACTCC ACAGGCCAGA CCTCAACCTA 540 GAAAGATGGC CACAGGACTT GCAACTCAGG GTGGTGTCTG AAGAGCAGAG AGTGGCCTGG 600 CCCTGGAGCC TTTTTCTAGT CTTTTCAGAA TAGATCATGG GCCTGAGGCC TCCACTTCTT 660 GAGGTCTGAG GCCCAGCAGC CTCTAGAAGG TAGCCTCCTG GTGTTTGTTC TCCCAGTAAA 720 ATGGTTTTGG GCGATAACTT CTAGATTATT CCTGGATGGC CAGGGAGGCT CTCTGTCTCA 780 GCAGGTGATG ACGGGGGTAC CAGGGGTGCC TCTGAGACCC ATTCTCGTGT TTCCCTGTTG 840 TACCTTTTGC CTGCAGGGCA GAGAGATCTG GTTTCTAGCA AATTCCCAGT AGGATGTCAT 900 GTAAGTTCCT TCCCCCTCTT AGAGATTGAA GGCTGTAAGA GTCCAGATGG TGGAGCCAGG 960 CTGTCTGGGT TCAAATGCCA TCTTTGACAC TTGCAAGCTA AATGACATTA CTCAAATTAA 1020 TCGTTCTGCA CTTCAGCTTC CTTGTCTATC AAATAAAAAG AATAGTACCT GCCC 1074

【００５０】配列番号：４ 配列の長さ：１０７４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：Homo sapiens セルライン：T98G 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：29..541 特徴を決定した方法：Ｐ 配列 GTGAAGTCGCGGTGCAGCGGTGGGCGGC ATG TCT GTG GCC GGT GGG GAG ATT CGT 55 Met Ser Val Ala Gly Gly Glu Ile Arg 1 5 GGG GAC ACG GGG GGA GAG GAC ACT GCT GCT CCC GGC CGG TTC AGC TTC 103 Gly Asp Thr Gly Gly Glu Asp Thr Ala Ala Pro Gly Arg Phe Ser Phe 10 15 20 25 AGC CCG GAG CCC ACG CTC GAG GAC ATC CGC CGC CTC CAT GCT GAG TTT 151 Ser Pro Glu Pro Thr Leu Glu Asp Ile Arg Arg Leu His Ala Glu Phe 30 35 40 GCT GCG GAA CGA GAC TGG GAA CAG TTC CAT CAG CCT CGG AAT CTC CTC 199 Ala Ala Glu Arg Asp Trp Glu Gln Phe His Gln Pro Arg Asn Leu Leu 45 50 55 CTG GCC TTG GTT GGG GAA GTG GGG GAG CTG GCA GAA CTC TTT CAG TGG 247 Leu Ala Leu Val Gly Glu Val Gly Glu Leu Ala Glu Leu Phe Gln Trp 60 65 70 AAA ACC GAT GGG GAA CCT GGC CCC CAA GGC TGG TCC CCC AGG GAA CGG 295 Lys Thr Asp Gly Glu Pro Gly Pro Gln Gly Trp Ser Pro Arg Glu Arg 75 80 85 GCA GCC CTT CAA GAG GAG CTT AGT GAC GTC CTC ATC TAC CTG GTG GCA 343 Ala Ala Leu Gln Glu Glu Leu Ser Asp Val Leu Ile Tyr Leu Val Ala 90 95 100 105 TTA GCA GCC CGC TGC CGT GTG GAT CTG CCG CTA GCA GTG CTC TCC AAA 391 Leu Ala Ala Arg Cys Arg Val Asp Leu Pro Leu Ala Val Leu Ser Lys 110 115 120 ATG GAC ATC AAC CGG CGA CGC TAC CCA GCC CAT CTG GCC CGC AGC TCT 439 Met Asp Ile Asn Arg Arg Arg Tyr Pro Ala His Leu Ala Arg Ser Ser 125 130 135 TCC CGC AAG TAT ACA GAA TTG CCC CAT GGG GCC ATC TCT GAA GAC CAG 487 Ser Arg Lys Tyr Thr Glu Leu Pro His Gly Ala Atc Ser Glu Asp Gln 140 145 150 GCT GTG GGG CCT GCG GAC ATT CCC TGT GAC TCC ACA GGC CAG ACC TCA 535 Ala Val Gly Pro Ala Asp Ile Pro Cys Asp Ser Thr Gly Gln Thr Ser 155 160 165 ACC TAG AA AGATGGCCAC AGGACTTGCA ACTCAGGGTG GTGTCTGAAG AGCAGAGAGT 593 Thr 170 GGCCTGGCCC TGGAGCCTTT TTCTAGTCTT TTCAGAATAG ATCATGGGCC TGAGGCCTCC 653 ACTTCTTGAG GTCTGAGGCC CAGCAGCCTC TAGAAGGTAG CCTCCTGGTG TTTGTTCTCC 713 CAGTAAAATG GTTTTGGGCG ATAACTTCTA GATTATTCCT GGATGGCCAG GGAGGCTCTC 773 TGTCTCAGCA GGTGATGACG GGGGTACCAG GGGTGCCTCT GAGACCCATT CTCGTGTTTC 833 CCTGTTGTAC CTTTTGCCTG CAGGGCAGAG AGATCTGGTT TCTAGCAAAT TCCCAGTAGG 893 ATGTCATGTA AGTTCCTTCC CCCTCTTAGA GATTGAAGGC TGTAAGAGTC CAGATGGTGG 953 AGCCAGGCTG TCTGGGTTCA AATGCCATCT TTGACACTTG CAAGCTAAAT GACATTACTC 1013 AAATTAATCG TTCTGCACTT CAGCTTCCTT GTCTATCAAA TAAAAAGAAT AGTACCTGCC 1073 C 1074

【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドベクターｐＶｆＣＳ−１の構築図
である。

【図２】 ヒトグリア芽細胞腫細胞株Ｔ９８Ｇ由来のｃ
ＤＮＡが挿入された組み換えＤＮＡの構築図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＵ 39/395 ＡＢＡ Ｔ ＡＤＰ Ｄ Ｃ０７Ｋ 16/18 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/12 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ (54)【発明の名称】 新規なポリペプチド、その製造方法、そのポリペプチドをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡからな るベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、そのポリペプチドの抗体、およびそのポ リペプチドまたは抗体を含有する薬学的組成物

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 実質的に純粋な形である配列番号１で示
   されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのホモロ
   ーグ、そのフラグメントまたはそのフラグメントのホモ
   ローグ。
2. 【請求項２】 配列番号１で示されるアミノ酸配列から
   なる請求項１記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】 請求項１に記載されたポリペプチドをコ
   ードするＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列番号２で示される塩基配列を有する
   請求項３記載のＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイ
   ブリダイズするフラグメント。
5. 【請求項５】 配列番号３で示される塩基配列を有する
   請求項３記載のＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイ
   ブリダイズするフラグメント。
6. 【請求項６】 請求項３から５のいずれかの項に記載の
   ＤＮＡからなる複製または発現ベクター。
7. 【請求項７】 請求項６記載の複製または発現ベクター
   で形質転換された宿主細胞。
8. 【請求項８】 請求項１または２に記載されたポリペプ
   チドを発現させるための条件下で請求項７記載の宿主細
   胞を培養することからなる該ポリペプチドの製造方法。
9. 【請求項９】 請求項１または２に記載されたポリペプ
   チドのモノクローナルまたはポリクローナル抗体。
10. 【請求項１０】 請求項１または２に記載されたポリペ
    プチドまたは請求項９記載の抗体および薬学的に許容さ
    れる賦形剤および／または担体を含有することを特徴と
    する薬学的組成物。