JPH07132095A - Ｄｎａおよびそのコードする蛋白質 - Google Patents

Ｄｎａおよびそのコードする蛋白質

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JPH07132095A
JPH07132095A JP5166155A JP16615593A JPH07132095A JP H07132095 A JPH07132095 A JP H07132095A JP 5166155 A JP5166155 A JP 5166155A JP 16615593 A JP16615593 A JP 16615593A JP H07132095 A JPH07132095 A JP H07132095A
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Atsushi Arai
居 淳 新
Yasukazu Nagase
瀬 安 数 長
Seiichi Mizushima
島 誠 一 水
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】血管内皮細胞に作用し、該細胞からのプロスタ
グランジンＩ２（別名；プロスタサイクリン（ｐｒｏｓ
ｔａｃｙｃｌｉｎ）、以下ＰＧＩ２と記す）産生刺激活
性を有する蛋白性生理活性物質（以下ＰＧＩ２産生刺激
因子と記す）をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを用いてＰ
ＧＩ２産生刺激因子を製造する方法、製造されたＰＧＩ
２産生刺激因子、ＰＧＩ２産生刺激因子を認識する抗体
およびその用途。 【効果】この新規な蛋白質は、ＰＧＩ２の産生を促進
し、ＰＧＩ２の持つ血小板凝集抑制作用、平滑筋弛緩作
用、胃酸分泌抑制作用に基づいて溶血性尿毒症症候群、
血栓性血小板減少性紫斑病、末梢動脈閉塞、心虚血、脳
虚血、動脈硬化、脳閉塞、高脂血症、糖尿病、心不全、
狭心症、虚血性心疾患、うっ血性心疾患、脈絡膜循環障
害、気管支疾患、胃潰瘍、妊娠子癇等の疾患に対する有
効な医薬品となる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血管内皮細胞に作用
し、該細胞からのプロスタグランジンＩ2 （別名；プロ
スタサイクリン（Ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ）、以下Ｐ
ＧＩ2 と記す）産生刺激活性を有する蛋白性生理活性物
質（以下ＰＧＩ2 産生刺激因子と記す）をコードするＤ
ＮＡ、該ＤＮＡを用いてＰＧＩ2 産生刺激因子を製造す
る方法、製造されたＰＧＩ2 産生刺激因子、ＰＧＩ2 産
生刺激因子を認識する抗体およびその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】プロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌ
ａｎｄｉｎ、ＰＧ）は１９３０年にクルツロックら［プ
ロシーディング オブ ザ ソサイエティ フォー エ
クスペリメンタル バイオロジー アンド メディスン
（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．）、
２８巻、２６８頁、１９３０年］により、精液中に存在
する子宮筋収縮活性物質として発見報告された。その後
プロスタグランジンに関する基礎的研究は急速な発展を
とげた。プロスタグランジンはヒト、動物の組織、臓器
に含まれるプロスタン酸を基本構造とする生理活性物質
の総称であり、細胞内でアラキドン酸を出発物質として
アラキドン酸カスケードと呼ばれる一連の化学反応によ
り化学構造の異なる数種のプロスタグランジンが生合成
される。それらは内分泌系、神経系、免疫系その他生体
の恒常性の維持に関与する重要な活性物質として注目さ
れており、炎症反応、血栓形成、末梢循環、動脈硬化、
老化などの諸機構に広汎に関与する［臨床科学、１７
巻、９５８頁、１９８１年］と考えられている。さら
に、プロスタグランジンは血管平滑筋に対する血管作動
性物質として重要な役割をはたしており［病態生理、２
巻、７９２頁、１９８３年］、血小板や血管壁由来の活
性型プロスタノイドであるトロンボキサンＡ2 （ＴＸＡ
2 ）［プロシーディング オブ ザ ナショナル アカ
デミー オブ サイエンス オブ ザ ユナイテッド
ステイツ オブ アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、７２巻、２９９４頁、１９７
５年］およびＰＧＩ2 ［ネイチャ−（Ｎａｔｕｒｅ）、
２６３巻、６６３頁、１９７６年］が、血小板と血管系
の生理と病態における臨床的意義において注目されてい
る。
【０００３】これらプロスタグランジンの中で、とりわ
けＰＧＩ2 は強力な血小板凝集抑制作用と血管弛緩作用
を呈し、逆の作用を有する血小板由来のＴＸＡ2 と拮抗
的に作用し生体内の恒常性（ホメオスターシス）の維持
に関与している［ブリティッシュ ジャーナル オブ
ファーマコロジー（Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃ．）、７
６巻、３頁、１９８２年］。正常血管内皮細胞は、物理
的、化学的刺激が加わると、主としてＰＧＩ2 を生成
し、血小板の活性化を抑制するのみならず自ら血管壁緊
張（トーヌス）を調節して局所循環の恒常性を維持する
機構を作動させる。すなわち、血栓症や動脈硬化症など
の血管障害の発症には、ＴＸＡ2 およびＰＧＩ2 の産生
不均衡、とりわけＰＧＩ2 の産生低下が関与している
［ブリティッシュ ジャーナル オブ ファーマコロジ
ー（Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃ．）、７６巻、３頁、１
９８２年］ことが知られている。１９７８年マックイン
タイヤーら［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２７１巻、
５４９頁、１９７８年］は流血中に血管壁でのＰＧＩ2
産生を刺激する因子が存在することを認めており、本因
子は熱に不安定な高分子物質であることを報告してい
る。その後レムッジらにより溶血性尿毒症症候群で本因
子の血中レベルが健常人と比較して低下していることが
報告されて以来［ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、２巻、
８７１頁、１９７８年］、血栓性血小板減少性紫斑病
［ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、２巻、７４８頁、１９
７９年］、鎌状赤血球性貧血［ブリティッシュ ジャー
ナル オブ へマトロジー（Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏ
ｌ．）、４８巻、５４５頁、１９８１年］、急性心筋梗
塞［コロナリー（Ｃｏｒｏｎａｒｙ）、２巻、４９頁、
１９８５年］、糖尿病等の血栓性・動脈硬化性疾患で本
因子の血中レベルの低下がその病因と密接に関与してい
ることが明らかにされている。とくに、糖尿病性血管障
害の発症・進展については、血小板由来ＴＸＡ2 の産生
亢進［トロンボシス リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅ
ｓ．）、１９巻、２１１頁、１９８０年、ジャーナルオ
ブ ラボラトリー アンド クリニカル メディスン
（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．）、９７巻、８７
頁、１９８１年］に加え、血管由来のＰＧＩ2 産生低下
が血小板凝集の亢進をひきおこすことが糖尿病患者や実
験糖尿病動物について報告されている［ランセット（Ｌ
ａｎｃｅｔ）、１巻、３２５頁、１９７９年、ランセッ
ト（Ｌａｎｃｅｔ）、２巻、１３６５頁、１９７９年、
ザ ニュウイングランド ジャーナル オブ メディス
ン（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．）３００巻、３６６
頁、１９７９年およびライフ サイエンス（Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉ．）、２３巻、３５１頁、１９７８年］。しか
も、このＰＧＩ2 産生低下は、上述の血中に存在するＰ
ＧＩ2 産生刺激活性の低下が一因である可能性が示唆さ
れている［メタボリズム（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、３
８巻、８３７頁、１９８９年、へモスタシス（Ｈａｅｍ
ｏｓｔａｓｉｓ）、１６巻、４４７頁、１９８６年およ
びダイアベティス リサーチ アンド クリニカル プ
ラクティス（Ｄｉａｂ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃ
ｔ．）、３巻、２４３頁、１９８７年］。
【０００４】上述のごとくＰＧＩ2 は血小板凝集抑制作
用を有するが、それ以外にも血管および気管支などの平
滑筋弛緩作用、胃酸分泌抑制作用等をも有する。これら
の生理作用に基づきＰＧＩ2 自体を医療用薬として開発
することが考えられるが、ＰＧＩ2 の半減期は３７℃中
性の水中で５分と極めて短く、化学的に不安定な物質で
あり、実用化に至っていない。一方、天然のＰＧＩ2 様
作用を保ちながら、化学的に安定なＰＧＩ2 類縁体を血
液凝固阻止剤、血管拡張剤等の医薬品として開発しよう
とする試みがなされている。
【０００５】しかし、生体にとっては、ＰＧＩ2 が化学
的に不安定で短寿命である方がむしろ望ましい。局所的
に産生され、かつ不要な血小板凝集抑制を防ぎながら、
作用するのがＰＧＩ2 本来の働きであるから、化学的に
安定なＰＧＩ2 類縁体を多量に与えると、細胞のＰＧＩ
2 に対する応答性が低下し、緊急の場合にＰＧＩ2 に反
応しなくなる可能性もある。実際、プロスタグランジン
Ｅ1 （ＰＧＥ1 ）や安定なＰＧＩ2 類縁体で前処理を行
うと、ある種の細胞ではＰＧＩ2 によって当然起こるべ
きｃＡＭＰの上昇がおこならくなったという例が報告さ
れている［プロスタグランジンズ（Ｐｒｏｓｔａｇｌａ
ｎｄｉｎｓ．）、１９巻、２頁、１９８０年］。
【０００６】従って、上述のようなＰＧＩ2 の作用を期
待するのであれば、化学的に安定な類縁体を用いるより
も、必要なときに必要な濃度のＰＧＩ2 を必要な部位に
産生させてやることが生体にとってより好ましいと考え
られる。生体内でのＰＧＩ2代謝は２つの因子により制
御されており、その１つはＰＧＩ2 安定化因子で近年ア
ポリポプロテインＡ−１（ＡｐｏＡ−１）であることが
同定された［ザ ジャーナル オブ クリニカル イン
ベスティゲーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．）、８２巻、８０３頁、１９８８年］。他の１つは
ＰＧＩ2 産生刺激因子（Ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ＳｔｉｍｕｌａｔｉｎｇＦａｃｔ
ｏｒ、ＰＳＦ）である。上述のごとくすでに血中にはＰ
ＧＩ2 産生刺激活性（Ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ Ｓｔ
ｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ、ＰＳＡ）が存
在することが報告されているが、その活性本体であるＰ
ＧＩ2産生刺激因子は血管内皮細胞からのＰＧＩ2 産生
を増加させ、血中のＰＧＩ2 濃度を高めることにより血
小板凝集抑制作用、平滑筋弛緩作用、胃酸分泌抑制作用
等を発揮させる。このような作用を持つＰＧＩ2 産生刺
激因子は溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑
病、末梢動脈閉塞、心虚血、脳虚血、動脈硬化、脳閉
塞、高脂血症、糖尿病、心不全、狭心症、虚血性心疾
患、うっ血性心疾患、脈絡膜循環障害、気管支疾患、胃
潰瘍、妊娠子癇等の治療に使用できると考えられる。
【０００７】さらに、前述の疾患の発症、進展に関して
ＰＧＩ2 産生刺激因子の局所における発現の増減ならび
に血中および尿中等の濃度が変化することが期待され、
こうしたＰＧＩ2 産生刺激因子の濃度変化を検出するこ
とができれば、その測定により上記疾患の診断が可能に
なると考えられる。
【０００８】本発明者らは、血中およびヒト由来培養細
胞株の培養上清中に存在するＰＧＩ2 産生刺激活性につ
いて鋭意研究を重ねた結果、正常ヒト二倍体線維芽細胞
の培養上清中にＰＧＩ2 産生刺激活性を有する物質が高
濃度に存在することを確認し、次いで、この培養上清よ
りＰＧＩ2 産生刺激因子を単離精製することに成功し、
アミノ酸配列の一部を決定した［ＰＣＴ／ＪＰ９３／０
０２９４］。しかしながら、ＰＧＩ2 産生刺激因子のよ
うな蛋白性生理活性物質を大量に入手するためには、そ
の遺伝子の単離・同定を行い、組換え技術を用いた製造
法を確立することが望まれていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上述
のような状況を鑑み、血管内皮細胞を刺激してＰＧＩ2
の産生を促進するＰＧＩ2 産生刺激因子をコードする遺
伝子を提供し、遺伝子工学的なＰＧＩ2 産生刺激因子の
大量製造方法を提供することにある。また、本発明の他
の目的は、ＰＧＩ2 産生刺激因子の作用に基づいた上述
の疾患に対する医薬組成物を提供することにある。さら
に、ＰＧＩ2 産生刺激因子に対する特異的な抗体および
該抗体を用いた上述の疾患に対する診断方法を提供する
ことも目的の一つである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上述の目的
を達成するために、さらに鋭意研究を重ねた結果、ＰＧ
Ｉ2 産生刺激因子の一部のアミノ酸配列を手がかりとし
て、正常ヒト二倍体線維芽細胞のｃＤＮＡライブラリー
を作成しＰＧＩ2 産生刺激因子のｃＤＮＡを入手し、次
いで、ＰＧＩ2 産生刺激因子の塩基配列を明らかにし、
さらにその配列から演繹されるアミノ酸配列を決定し
た。すなわち、本発明は、下記式［１］または［２］
（配列表の配列番号１または２）で表されるアミノ酸配
列をコードする塩基配列の一部または全部を含有する新
規なＤＮＡを提供する。
【００１１】式［１］ Met Glu Arg Pro Ser Leu Arg Ala Leu Leu Leu Gly Ala Ala Gly -25 -20 -15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp -10 -5 1 Thr Cys Gly Pro Cys Glu Pro Ala Ser Cys Pro Pro Leu Pro Pro 5 10 15 Leu Gly Cys Leu Leu Gly Glu Thr Arg Asp Ala Cys Gly Cys Cys 20 25 30 Pro Met Cys Ala Arg Gly Glu Gly Glu Pro Cys Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Ala Gly Arg Gly Tyr Cys Ala Pro Gly Met Glu Cys Val Lys Ser 50 55 60 Arg Lys Arg Arg Lys Gly Lys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gly Pro 65 70 75 Gly Val Ser Gly Val Cys Val Cys Lys Ser Arg Tyr Pro Val Cys 80 85 90 Gly Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Pro Ser Gly Cys Gln Leu Arg Ala 95 100 105 Ala Ser Gln Arg Ala Glu Ser Arg Gly Glu Lys Ala Ile Thr Gln 110 115 120 Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu Gln Gly Pro Ser Ile Val Thr Pro 125 130 135 Pro Lys Asp Ile Trp Asn Val Thr Gly Ala Gln Val Tyr Leu Ser 140 145 150 Cys Glu Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys 155 160 165 Val Lys Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu Leu Leu Pro 170 175 180 Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly Gly Pro Glu 185 190 195 Lys His Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser Pro Leu Ser Lys 200 205 210 Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser Asn Ser Gln Gly 215 220 225 Gln Ala Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His 230 235 240 Glu Ile Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu Leu 245 250 255 256
【００１２】式［２］ Met Glu Arg Pro Ser Leu Arg Ala Leu Leu Leu Gly Ala Ala Gly -25 -20 -15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp -10 -5 1 Thr Cys Gly Pro Cys Glu Pro Ala Ser Cys Pro Pro Leu Pro Pro 5 10 15 Leu Gly Cys Leu Leu Gly Glu Thr Arg Asp Ala Cys Gly Cys Cys 20 25 30 Pro Met Cys Ala Arg Gly Glu Gly Glu Pro Cys Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Ala Gly Arg Gly Tyr Cys Ala Pro Gly Met Glu Cys Val Lys Ser 50 55 60 Arg Lys Arg Arg Lys Gly Lys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gly Pro 65 70 75 Gly Val Ser Gly Val Cys Val Cys Lys Ser Arg Tyr Pro Val Cys 80 85 90 Gly Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Pro Ser Gly Cys Gln Leu Arg Ala 95 100 105 Ala Ser Gln Arg Ala Glu Ser Arg Gly Glu Lys Ala Ile Thr Gln 110 115 120 Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu Gln Gly Pro Ser Ile Val Thr Pro 125 130 135 Pro Lys Asp Ile Trp Asn Val Thr Gly Ala Gln Val Tyr Leu Ser 140 145 150 Cys Glu Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys 155 160 165 Val Lys Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu Leu Leu Pro 170 175 180 Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly Gly Pro Glu 185 190 195 Lys His Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser Pro Leu Ser Lys 200 205 210 Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser Asn Phe Gln Gly 215 220 225 Gln Ala Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His 230 235 240 Glu Ile Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu Leu 245 250 255 256
【００１３】さらに、下記式［３］ないし［４］（配列
表の配列番号３または４）で表される塩基配列の一部ま
たは全部を含有する新規なＤＮＡを提供する。
【００１４】式［３］ GCCGCTGCCA CCGCACCCCG CCATGGAGCG GCCGTCGCTG CGCGCCCTGC TCCTCGGCGC 60 CGCTGGGCTG CTGCTCCTGC TCCTGCCCCT CTCCTCTTCC TCCTCTTCGG ACACCTGCGG 120 CCCCTGCGAG CCGGCCTCCT GCCCGCCCCT GCCCCCGCTG GGCTGCCTGC TGGGCGAGAC 180 CCGCGACGCG TGCGGCTGCT GCCCTATGTG CGCCCGCGGC GAGGGCGAGC CGTGCGGGGG 240 TGGCGGCGCC GGCAGGGGGT ACTGCGCGCC GGGCATGGAG TGCGTGAAGA GCCGCAAGAG 300 GCGGAAGGGT AAAGCCGGGG CAGCAGCCGG CGGTCCGGGT GTAAGCGGCG TGTGCGTGTG 360 CAAGAGCCGC TACCCGGTGT GCGGCAGCGA CGGCACCACC TACCCGAGCG GCTGCCAGCT 420 GCGCGCCGCC AGCCAGAGGG CCGAGAGCCG CGGGGAGAAG GCCATCACCC AGGTCAGCAA 480 GGGCACCTGC GAGCAAGGTC CTTCCATAGT GACGCCCCCC AAGGACATCT GGAATGTCAC 540 TGGTGCCCAG GTGTACTTGA GCTGTGAGGT CATCGGAATC CCGACACCTG TCCTCATCTG 600 GAACAAGGTA AAAAGGGGTC ACTATGGAGT TCAAAGGACA GAACTCCTGC CTGGTGACCG 660 GGACAACCTG GCCATTCAGA CCCGGGGTGG CCCAGAAAAG CATGAAGTAA CTGGCTGGGT 720 GCTGGTATCT CCTCTAAGTA AGGAAGATGC TGGAGAATAT GAGTGCCATG CATCCAATTC 780 CCAAGGACAG GCTTCAGCAT CAGCAAAAAT TACAGTGGTT GATGCCTTAC ATGAAATACC 840 AGTGAAAAAA GGTGAAGGTG CCGAGCTATA AACCTCCAGA ATATTATTAG TCTGCATGGT 900 TAAAAGTAGT CATGGATAAC TACATTACCT GTTCTTGCCT AATAAGTTTC TTTTAATCCA 960 ATCCACTAAC ACTTTAGTTA TATTCACTGG TTTTACACAG AGAAATACAA AATAAAGATC 1020 ACACATCAAG ACTATCTACA AAAATTTATT ATATATTTAC AGAAGAAAAG CATGCATATC 1080 ATTAAACAAA TAAAATACTT TTTATCACAA AAAAAAAAAA AAAA 1124
【００１５】式［４］ GCCGCTGCCA CCGCACCCCG CCATGGAGCG GCCGTCGCTG CGCGCCCTGC TCCTCGGCGC 60 CGCTGGGCTG CTGCTCCTGC TCCTGCCCCT CTCCTCTTCC TCCTCTTCGG ACACCTGCGG 120 CCCCTGCGAG CCGGCCTCCT GCCCGCCCCT GCCCCCGCTG GGCTGCCTGC TGGGCGAGAC 180 CCGCGACGCG TGCGGCTGCT GCCCTATGTG CGCCCGCGGC GAGGGCGAGC CGTGCGGGGG 240 TGGCGGCGCC GGCAGGGGGT ACTGCGCGCC GGGCATGGAG TGCGTGAAGA GCCGCAAGAG 300 GCGGAAGGGT AAAGCCGGGG CAGCAGCCGG CGGTCCGGGT GTAAGCGGCG TGTGCGTGTG 360 CAAGAGCCGC TACCCGGTGT GCGGCAGCGA CGGCACCACC TACCCGAGCG GCTGCCAGCT 420 GCGCGCCGCC AGCCAGAGGG CCGAGAGCCG CGGGGAGAAG GCCATCACCC AGGTCAGCAA 480 GGGCACCTGC GAGCAAGGTC CTTCCATAGT GACGCCCCCC AAGGACATCT GGAATGTCAC 540 TGGTGCCCAG GTGTACTTGA GCTGTGAGGT CATCGGAATC CCGACACCTG TCCTCATCTG 600 GAACAAGGTA AAAAGGGGTC ACTATGGAGT TCAAAGGACA GAACTCCTGC CTGGTGACCG 660 GGACAACCTG GCCATTCAGA CCCGGGGTGG CCCAGAAAAG CATGAAGTAA CTGGCTGGGT 720 GCTGGTATCT CCTCTAAGTA AGGAAGATGC TGGAGAATAT GAGTGCCATG CATCCAATTT 780 CCAAGGACAG GCTTCAGCAT CAGCAAAAAT TACAGTGGTT GATGCCTTAC ATGAAATACC 840 AGTGAAAAAA GGTGAAGGTG CCGAGCTATA AACCTCCAGA ATATTATTAG TCTGCATGGT 900 TAAAAGTAGT CATGGATAAC TACATTACCT GTTCTTGCCT AATAAGTTTC TTTTAATCCA 960 ATCCACTAAC ACTTTAGTTA TATTCACTGG TTTTACACAG AGAAATACAA AATAAAGATC 1020 ACACATCAAG ACTATCTACA AAAATTTATT ATATATTTAC AGAAGAAAAG CATGCATATC 1080 ATTAAACAAA TAAAATACTT TTTATCACAA AAAAAAAAAA AAAA 1124
【００１６】さらに、式［１］または［２］で表される
新規なアミノ酸配列をコードするＤＮＡと相補的な塩基
配列を有するＤＮＡ、および式［３］または［４］で表
される新規なＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡ
を提供する。
【００１７】さらに、本発明は、式［１］または［２］
で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡあるいは式
［３］または［４］で表されるＤＮＡを導入して得られ
るベクターおよび該ベクターで形質転換された形質転換
体を提供する。次いで、この形質転換体を用いてＰＧＩ
2 産生刺激因子を産生する方法ならびに該操作により得
られるＰＧＩ2 産生刺激因子を提供する。
【００１８】本発明のＰＧＩ2 産生刺激因子のアミノ酸
配列は、式［１］または［２］で表されるアミノ酸配列
の一部または全部を含有する蛋白質である。好ましく
は、下記式［５］または［６］（配列表の配列番号５ま
たは６）で示されるアミノ酸配列を有する。
【００１９】式［５］ Ser Ser Ser Asp Thr Cys Gly Pro Cys Glu Pro Ala Ser Cys Pro 1 5 10 15 Pro Leu Pro Pro Leu Gly Cys Leu Leu Gly Glu Thr Arg Asp Ala 20 25 30 Cys Gly Cys Cys Pro Met Cys Ala Arg Gly Glu Gly Glu Pro Cys 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ala Gly Arg Gly Tyr Cys Ala Pro Gly Met Glu 50 55 60 Cys Val Lys Ser Arg Lys Arg Arg Lys Gly Lys Ala Gly Ala Ala 65 70 75 Ala Gly Gly Pro Gly Val Ser Gly Val Cys Val Cys Lys Ser Arg 80 85 90 Tyr Pro Val Cys Gly Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Pro Ser Gly Cys 95 100 105 Gln Leu Arg Ala Ala Ser Gln Arg Ala Glu Ser Arg Gly Glu Lys 110 115 120 Ala Ile Thr Gln Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu Gln Gly Pro Ser 125 130 135 Ile Val Thr Pro Pro Lys Asp Ile Trp Asn Val Thr Gly Ala Gln 140 145 150 Val Tyr Leu Ser Cys Glu Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu 155 160 165 Ile Trp Asn Lys Val Lys Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr 170 175 180 Glu Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg 185 190 195 Gly Gly Pro Glu Lys His Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser 200 205 210 Pro Leu Ser Lys Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser 215 220 225 Asn Ser Gln Gly Gln Ala Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val 230 235 240 Asp Ala Leu His Glu Ile Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu 245 250 255 Leu 256
【００２０】式［６］ Phe Ser Ser Asp Thr Cys Gly Pro Cys Glu Pro Ala Ser Cys Pro 1 5 10 15 Pro Leu Pro Pro Leu Gly Cys Leu Leu Gly Glu Thr Arg Asp Ala 20 25 30 Cys Gly Cys Cys Pro Met Cys Ala Arg Gly Glu Gly Glu Pro Cys 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ala Gly Arg Gly Tyr Cys Ala Pro Gly Met Glu 50 55 60 Cys Val Lys Ser Arg Lys Arg Arg Lys Gly Lys Ala Gly Ala Ala 65 70 75 Ala Gly Gly Pro Gly Val Ser Gly Val Cys Val Cys Lys Ser Arg 80 85 90 Tyr Pro Val Cys Gly Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Pro Ser Gly Cys 95 100 105 Gln Leu Arg Ala Ala Ser Gln Arg Ala Glu Ser Arg Gly Glu Lys 110 115 120 Ala Ile Thr Gln Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu Gln Gly Pro Ser 125 130 135 Ile Val Thr Pro Pro Lys Asp Ile Trp Asn Val Thr Gly Ala Gln 140 145 150 Val Tyr Leu Ser Cys Glu Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu 155 160 165 Ile Trp Asn Lys Val Lys Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr 170 175 180 Glu Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg 185 190 195 Gly Gly Pro Glu Lys His Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser 200 205 210 Pro Leu Ser Lys Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser 215 220 225 Asn Phe Gln Gly Gln Ala Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val 230 235 240 Asp Ala Leu His Glu Ile Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu 245 250 255 Leu 256 この蛋白質は、血管内皮細胞を刺激してＰＧＩ2 の産生
を促進する活性を有することで特徴づけられる。
【００２１】さらに、本発明のＰＧＩ2 産生刺激因子の
アミノ酸配列の一部または全部を抗原として得られた抗
体およびその抗体を用いた免疫学的なＰＧＩ2 産生刺激
因子の測定方法を提供する。
【００２２】また、本発明は上述のＰＧＩ2 産生刺激因
子を有効成分として含有することを特徴とする、下記疾
患に対する予防または治療用医薬組成物を提供する。溶
血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、末梢動
脈閉塞、心虚血、脳虚血、動脈硬化、脳閉塞、高脂血
症、糖尿病、心不全、狭心症、虚血性心疾患、うっ血性
心疾患、脈絡膜循環障害、気管支疾患、胃潰瘍、妊娠子
癇。
【００２３】以下本発明を詳細に説明する。すなわち、
本発明は、下記式［１］または［２］で表されるアミノ
酸配列の一部または全部を含有する蛋白質およびこれを
コードする塩基配列の一部または全部を含有するＤＮＡ
である。
【００２４】式［１］ Met Glu Arg Pro Ser Leu Arg Ala Leu Leu Leu Gly Ala Ala Gly -25 -20 -15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp -10 -5 1 Thr Cys Gly Pro Cys Glu Pro Ala Ser Cys Pro Pro Leu Pro Pro 5 10 15 Leu Gly Cys Leu Leu Gly Glu Thr Arg Asp Ala Cys Gly Cys Cys 20 25 30 Pro Met Cys Ala Arg Gly Glu Gly Glu Pro Cys Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Ala Gly Arg Gly Tyr Cys Ala Pro Gly Met Glu Cys Val Lys Ser 50 55 60 Arg Lys Arg Arg Lys Gly Lys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gly Pro 65 70 75 Gly Val Ser Gly Val Cys Val Cys Lys Ser Arg Tyr Pro Val Cys 80 85 90 Gly Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Pro Ser Gly Cys Gln Leu Arg Ala 95 100 105 Ala Ser Gln Arg Ala Glu Ser Arg Gly Glu Lys Ala Ile Thr Gln 110 115 120 Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu Gln Gly Pro Ser Ile Val Thr Pro 125 130 135 Pro Lys Asp Ile Trp Asn Val Thr Gly Ala Gln Val Tyr Leu Ser 140 145 150 Cys Glu Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys 155 160 165 Val Lys Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu Leu Leu Pro 170 175 180 Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly Gly Pro Glu 185 190 195 Lys His Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser Pro Leu Ser Lys 200 205 210 Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser Asn Ser Gln Gly 215 220 225 Gln Ala Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His 230 235 240 Glu Ile Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu Leu 245 250 255 256
【００２５】式［２］ Met Glu Arg Pro Ser Leu Arg Ala Leu Leu Leu Gly Ala Ala Gly -25 -20 -15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp -10 -5 1 Thr Cys Gly Pro Cys Glu Pro Ala Ser Cys Pro Pro Leu Pro Pro 5 10 15 Leu Gly Cys Leu Leu Gly Glu Thr Arg Asp Ala Cys Gly Cys Cys 20 25 30 Pro Met Cys Ala Arg Gly Glu Gly Glu Pro Cys Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Ala Gly Arg Gly Tyr Cys Ala Pro Gly Met Glu Cys Val Lys Ser 50 55 60 Arg Lys Arg Arg Lys Gly Lys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gly Pro 65 70 75 Gly Val Ser Gly Val Cys Val Cys Lys Ser Arg Tyr Pro Val Cys 80 85 90 Gly Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Pro Ser Gly Cys Gln Leu Arg Ala 95 100 105 Ala Ser Gln Arg Ala Glu Ser Arg Gly Glu Lys Ala Ile Thr Gln 110 115 120 Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu Gln Gly Pro Ser Ile Val Thr Pro 125 130 135 Pro Lys Asp Ile Trp Asn Val Thr Gly Ala Gln Val Tyr Leu Ser 140 145 150 Cys Glu Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys 155 160 165 Val Lys Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu Leu Leu Pro 170 175 180 Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly Gly Pro Glu 185 190 195 Lys His Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser Pro Leu Ser Lys 200 205 210 Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser Asn Phe Gln Gly 215 220 225 Gln Ala Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His 230 235 240 Glu Ile Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu Leu 245 250 255 256
【００２６】また、下記式［３］または［４］で表され
る塩基配列の一部または全部を含有するＤＮＡである。
【００２７】式［３］ GCCGCTGCCA CCGCACCCCG CCATGGAGCG GCCGTCGCTG CGCGCCCTGC TCCTCGGCGC 60 CGCTGGGCTG CTGCTCCTGC TCCTGCCCCT CTCCTCTTCC TCCTCTTCGG ACACCTGCGG 120 CCCCTGCGAG CCGGCCTCCT GCCCGCCCCT GCCCCCGCTG GGCTGCCTGC TGGGCGAGAC 180 CCGCGACGCG TGCGGCTGCT GCCCTATGTG CGCCCGCGGC GAGGGCGAGC CGTGCGGGGG 240 TGGCGGCGCC GGCAGGGGGT ACTGCGCGCC GGGCATGGAG TGCGTGAAGA GCCGCAAGAG 300 GCGGAAGGGT AAAGCCGGGG CAGCAGCCGG CGGTCCGGGT GTAAGCGGCG TGTGCGTGTG 360 CAAGAGCCGC TACCCGGTGT GCGGCAGCGA CGGCACCACC TACCCGAGCG GCTGCCAGCT 420 GCGCGCCGCC AGCCAGAGGG CCGAGAGCCG CGGGGAGAAG GCCATCACCC AGGTCAGCAA 480 GGGCACCTGC GAGCAAGGTC CTTCCATAGT GACGCCCCCC AAGGACATCT GGAATGTCAC 540 TGGTGCCCAG GTGTACTTGA GCTGTGAGGT CATCGGAATC CCGACACCTG TCCTCATCTG 600 GAACAAGGTA AAAAGGGGTC ACTATGGAGT TCAAAGGACA GAACTCCTGC CTGGTGACCG 660 GGACAACCTG GCCATTCAGA CCCGGGGTGG CCCAGAAAAG CATGAAGTAA CTGGCTGGGT 720 GCTGGTATCT CCTCTAAGTA AGGAAGATGC TGGAGAATAT GAGTGCCATG CATCCAATTC 780 CCAAGGACAG GCTTCAGCAT CAGCAAAAAT TACAGTGGTT GATGCCTTAC ATGAAATACC 840 AGTGAAAAAA GGTGAAGGTG CCGAGCTATA AACCTCCAGA ATATTATTAG TCTGCATGGT 900 TAAAAGTAGT CATGGATAAC TACATTACCT GTTCTTGCCT AATAAGTTTC TTTTAATCCA 960 ATCCACTAAC ACTTTAGTTA TATTCACTGG TTTTACACAG AGAAATACAA AATAAAGATC 1020 ACACATCAAG ACTATCTACA AAAATTTATT ATATATTTAC AGAAGAAAAG CATGCATATC 1080 ATTAAACAAA TAAAATACTT TTTATCACAA AAAAAAAAAA AAAA 1124
【００２８】式［４］ GCCGCTGCCA CCGCACCCCG CCATGGAGCG GCCGTCGCTG CGCGCCCTGC TCCTCGGCGC 60 CGCTGGGCTG CTGCTCCTGC TCCTGCCCCT CTCCTCTTCC TCCTCTTCGG ACACCTGCGG 120 CCCCTGCGAG CCGGCCTCCT GCCCGCCCCT GCCCCCGCTG GGCTGCCTGC TGGGCGAGAC 180 CCGCGACGCG TGCGGCTGCT GCCCTATGTG CGCCCGCGGC GAGGGCGAGC CGTGCGGGGG 240 TGGCGGCGCC GGCAGGGGGT ACTGCGCGCC GGGCATGGAG TGCGTGAAGA GCCGCAAGAG 300 GCGGAAGGGT AAAGCCGGGG CAGCAGCCGG CGGTCCGGGT GTAAGCGGCG TGTGCGTGTG 360 CAAGAGCCGC TACCCGGTGT GCGGCAGCGA CGGCACCACC TACCCGAGCG GCTGCCAGCT 420 GCGCGCCGCC AGCCAGAGGG CCGAGAGCCG CGGGGAGAAG GCCATCACCC AGGTCAGCAA 480 GGGCACCTGC GAGCAAGGTC CTTCCATAGT GACGCCCCCC AAGGACATCT GGAATGTCAC 540 TGGTGCCCAG GTGTACTTGA GCTGTGAGGT CATCGGAATC CCGACACCTG TCCTCATCTG 600 GAACAAGGTA AAAAGGGGTC ACTATGGAGT TCAAAGGACA GAACTCCTGC CTGGTGACCG 660 GGACAACCTG GCCATTCAGA CCCGGGGTGG CCCAGAAAAG CATGAAGTAA CTGGCTGGGT 720 GCTGGTATCT CCTCTAAGTA AGGAAGATGC TGGAGAATAT GAGTGCCATG CATCCAATTT 780 CCAAGGACAG GCTTCAGCAT CAGCAAAAAT TACAGTGGTT GATGCCTTAC ATGAAATACC 840 AGTGAAAAAA GGTGAAGGTG CCGAGCTATA AACCTCCAGA ATATTATTAG TCTGCATGGT 900 TAAAAGTAGT CATGGATAAC TACATTACCT GTTCTTGCCT AATAAGTTTC TTTTAATCCA 960 ATCCACTAAC ACTTTAGTTA TATTCACTGG TTTTACACAG AGAAATACAA AATAAAGATC 1020 ACACATCAAG ACTATCTACA AAAATTTATT ATATATTTAC AGAAGAAAAG CATGCATATC 1080 ATTAAACAAA TAAAATACTT TTTATCACAA AAAAAAAAAA AAAA 1124
【００２９】本発明の蛋白質であるＰＧＩ2 産生刺激因
子のｃＤＮＡを得るためには、一般的な遺伝子工学的手
法が用いられる。すなわち、本発明のＰＧＩ2 産生刺激
因子のアミノ酸配列を明らかにし、それを基にＤＮＡプ
ローブを作製し、適当なｃＤＮＡライブラリー、好まし
くは正常ヒト二倍体線維芽細胞より得られたｍＲＮＡか
ら作製されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングす
ることにより本発明のＰＧＩ2 産生刺激因子のｃＤＮＡ
を得ることができる。また、精製されたＰＧＩ 2 産生刺
激因子を用いて、あるいはアミノ酸配列解析または遺伝
子配列解析により決定されたアミノ酸配列の一部を合成
ペプチドとして合成しこれを用いてウサギ、マウス等を
免疫し抗体を得た後、この抗体を用いてｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングすることも可能である。
【００３０】好ましくは下記の方法により本発明のＰＧ
Ｉ2 産生刺激因子をコードするｃＤＮＡを取得すること
ができる。正常ヒト二倍体線維芽細胞から全ＲＮＡを調
製し、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を調製する。例
えば、全ＲＮＡの調製は、一般的なグアニジンチオシア
ネート法、ＡＧＰＣ法または熱フェノール法により可能
である。またｍＲＮＡは、全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セ
ルロースやポリＵ−セファロース等を用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーをカラム法やバッチ法で実施す
ることにより調製できる。次いで、逆転写酵素を用いて
１本鎖ｃＤＮＡを合成し、次いでＤＮＡポリメラーゼを
用いて２本鎖ｃＤＮＡとした後、各種プラスミドベクタ
ー、例えばプラスミドｐＵＣベクター、プラスミドｐＥ
Ｆ−ＢＯＳ［ヌクレイック アシッド リサーチ（Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、１８巻、５３２２頁、
１９９０年］等に導入し、大腸菌を形質転換する。ある
いはクローニング用ファージベクターλｇｔ１０、λｇ
ｔ１１等に導入し、インビトロパッケージングして大腸
菌に感染させる。こうしてｃＤＮＡライブラリーを作製
する。ｃＤＮＡは、グブラーとホフマンの方法［ジーン
（Ｇｅｎｅ）、２５巻、２６３頁、１９８３年］等に従
って合成することができる。市販されているｃＤＮＡ合
成キット（アマシャム社製、ベーリンガー社製、インヴ
ィトロジェン社製）を用いてもよい。上述のｃＤＮＡ
は、リンカーを付加すること等によってプラスミドベク
ターもしくはファージベクターへ導入できる。使用する
リンカーは、特に限定されるものではないが、プラスミ
ドｐＥＦ−ＢＯＳを用いる場合にはＢｓｔＸＩリンカー
が好ましい。リンカーの付加、プラスミドおよびファー
ジベクターへのｃＤＮＡの導入は、市販のライゲーショ
ンキット（宝酒造社製）を用いても可能である。形質転
換する大腸菌は通常用いられる株であれば特に限定され
るものではないが、ＨＢ１０１、ＤＨ５およびＭＣ１０
６１／Ｐ３が好ましい。λｇｔ１０をファージベクター
として用いた場合は、ＮＭ５１４が特に好ましい。ｃＤ
ＮＡを導入したプラスミドＤＮＡは、エレクトロポレー
ション法または塩化カルシウム法等により大腸菌へ導入
することができる。インビトロパッケージングは市販の
インビトロパッケージングキット（ストラタジーン社
製、アマシャム社製）を用いて行うこともできる。
【００３１】本発明のＰＧＩ2 産生刺激因子をコードす
るｃＤＮＡは、一般的なｃＤＮＡスクリーニング法を組
み合わせることにより単離可能である。例えば、得られ
た部分アミノ酸配列［ＰＣＴ／ＪＰ９３／００２９４］
に基づいてＤＮＡプローブを作製し直接ｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングするか、ＰＣＲプライマーを作
製しＰＣＲ法で増幅したＤＮＡ断片を有するクローンを
選択する方法等が考えられる。またｃＤＮＡを発現させ
ることのできるライブラリー、例えばλｇｔ１１ファー
ジベクターを用いて作製したライブラリーを用いる場合
には上述の方法で得た抗体を用いて目的のクローンを選
択することができる。ＣＯＳ細胞を宿主としてプラスミ
ドベクターｐＥＦ−ＢＯＳ等を用いて作製したライブラ
リーを用いる場合は、培養上清中に検出されるＰＧＩ2
産生刺激活性を指標として目的のクローンを選択するこ
とができる。
【００３２】得られた目的のクローン中に含まれるｃＤ
ＮＡの塩基配列はジデオキシターミネーション法により
決定できる。決定されるＤＮＡ配列の好適な例は下記式
［３］または［４］で示される。
【００３３】式［３］ GCCGCTGCCA CCGCACCCCG CCATGGAGCG GCCGTCGCTG CGCGCCCTGC TCCTCGGCGC 60 CGCTGGGCTG CTGCTCCTGC TCCTGCCCCT CTCCTCTTCC TCCTCTTCGG ACACCTGCGG 120 CCCCTGCGAG CCGGCCTCCT GCCCGCCCCT GCCCCCGCTG GGCTGCCTGC TGGGCGAGAC 180 CCGCGACGCG TGCGGCTGCT GCCCTATGTG CGCCCGCGGC GAGGGCGAGC CGTGCGGGGG 240 TGGCGGCGCC GGCAGGGGGT ACTGCGCGCC GGGCATGGAG TGCGTGAAGA GCCGCAAGAG 300 GCGGAAGGGT AAAGCCGGGG CAGCAGCCGG CGGTCCGGGT GTAAGCGGCG TGTGCGTGTG 360 CAAGAGCCGC TACCCGGTGT GCGGCAGCGA CGGCACCACC TACCCGAGCG GCTGCCAGCT 420 GCGCGCCGCC AGCCAGAGGG CCGAGAGCCG CGGGGAGAAG GCCATCACCC AGGTCAGCAA 480 GGGCACCTGC GAGCAAGGTC CTTCCATAGT GACGCCCCCC AAGGACATCT GGAATGTCAC 540 TGGTGCCCAG GTGTACTTGA GCTGTGAGGT CATCGGAATC CCGACACCTG TCCTCATCTG 600 GAACAAGGTA AAAAGGGGTC ACTATGGAGT TCAAAGGACA GAACTCCTGC CTGGTGACCG 660 GGACAACCTG GCCATTCAGA CCCGGGGTGG CCCAGAAAAG CATGAAGTAA CTGGCTGGGT 720 GCTGGTATCT CCTCTAAGTA AGGAAGATGC TGGAGAATAT GAGTGCCATG CATCCAATTC 780 CCAAGGACAG GCTTCAGCAT CAGCAAAAAT TACAGTGGTT GATGCCTTAC ATGAAATACC 840 AGTGAAAAAA GGTGAAGGTG CCGAGCTATA AACCTCCAGA ATATTATTAG TCTGCATGGT 900 TAAAAGTAGT CATGGATAAC TACATTACCT GTTCTTGCCT AATAAGTTTC TTTTAATCCA 960 ATCCACTAAC ACTTTAGTTA TATTCACTGG TTTTACACAG AGAAATACAA AATAAAGATC 1020 ACACATCAAG ACTATCTACA AAAATTTATT ATATATTTAC AGAAGAAAAG CATGCATATC 1080 ATTAAACAAA TAAAATACTT TTTATCACAA AAAAAAAAAA AAAA 1124
【００３４】式［４］ GCCGCTGCCA CCGCACCCCG CCATGGAGCG GCCGTCGCTG CGCGCCCTGC TCCTCGGCGC 60 CGCTGGGCTG CTGCTCCTGC TCCTGCCCCT CTCCTCTTCC TCCTCTTCGG ACACCTGCGG 120 CCCCTGCGAG CCGGCCTCCT GCCCGCCCCT GCCCCCGCTG GGCTGCCTGC TGGGCGAGAC 180 CCGCGACGCG TGCGGCTGCT GCCCTATGTG CGCCCGCGGC GAGGGCGAGC CGTGCGGGGG 240 TGGCGGCGCC GGCAGGGGGT ACTGCGCGCC GGGCATGGAG TGCGTGAAGA GCCGCAAGAG 300 GCGGAAGGGT AAAGCCGGGG CAGCAGCCGG CGGTCCGGGT GTAAGCGGCG TGTGCGTGTG 360 CAAGAGCCGC TACCCGGTGT GCGGCAGCGA CGGCACCACC TACCCGAGCG GCTGCCAGCT 420 GCGCGCCGCC AGCCAGAGGG CCGAGAGCCG CGGGGAGAAG GCCATCACCC AGGTCAGCAA 480 GGGCACCTGC GAGCAAGGTC CTTCCATAGT GACGCCCCCC AAGGACATCT GGAATGTCAC 540 TGGTGCCCAG GTGTACTTGA GCTGTGAGGT CATCGGAATC CCGACACCTG TCCTCATCTG 600 GAACAAGGTA AAAAGGGGTC ACTATGGAGT TCAAAGGACA GAACTCCTGC CTGGTGACCG 660 GGACAACCTG GCCATTCAGA CCCGGGGTGG CCCAGAAAAG CATGAAGTAA CTGGCTGGGT 720 GCTGGTATCT CCTCTAAGTA AGGAAGATGC TGGAGAATAT GAGTGCCATG CATCCAATTT 780 CCAAGGACAG GCTTCAGCAT CAGCAAAAAT TACAGTGGTT GATGCCTTAC ATGAAATACC 840 AGTGAAAAAA GGTGAAGGTG CCGAGCTATA AACCTCCAGA ATATTATTAG TCTGCATGGT 900 TAAAAGTAGT CATGGATAAC TACATTACCT GTTCTTGCCT AATAAGTTTC TTTTAATCCA 960 ATCCACTAAC ACTTTAGTTA TATTCACTGG TTTTACACAG AGAAATACAA AATAAAGATC 1020 ACACATCAAG ACTATCTACA AAAATTTATT ATATATTTAC AGAAGAAAAG CATGCATATC 1080 ATTAAACAAA TAAAATACTT TTTATCACAA AAAAAAAAAA AAAA 1124
【００３５】本発明のＤＮＡ配列は、本発明のＰＧＩ2
産生刺激因子をコードするもので、式［３］または
［４］で表されるＤＮＡ配列の一部であっても良いし全
部であってもよい。また、式［３］または［４］で表さ
れるＤＮＡ配列を一部に含むものであってもよい。
【００３６】本発明のＤＮＡ配列は、ＲＮＡを鋳型とし
て合成しても良いし、有機化学的に合成してもよい。ま
た、ＰＣＲ法で増幅させて得てもよい。一般に、遺伝子
組換え技術分野では、遺伝暗号が縮重しているため、そ
の遺伝子のＤＮＡ配列で規定される少なくとも一つの塩
基を他の塩基に置換することができる。この場合、遺伝
子から産生される蛋白質のアミノ酸配列は変わらない。
従って、本発明のＤＮＡ配列は、また、遺伝暗号の縮重
に起因する一部塩基の変化した塩基配列をも含んでい
る。この場合、置換により得られたＤＮＡ配列のコード
するアミノ酸配列は、式［１］または［２］で示すアミ
ノ酸配列である。
【００３７】本発明では、式［１］または［２］で表さ
れるアミノ酸配列をコードするＤＮＡと相補的なＤＮＡ
配列および式［３］または［４］のＤＮＡ配列と相補的
なＤＮＡ配列を提供することも可能であり、この場合、
相補的なＤＮＡ配列は、これらのＤＮＡ配列全体と相補
的なものであっても良いし、一部と相補的なものであっ
てもよい。また、相補的ＤＮＡ配列を一部に含むもので
あってもよい。また、本発明のＤＮＡはそれと相補的な
ＤＮＡと結合して２本鎖ＤＮＡを形成しても良いし、互
いに相補的な１本鎖ＤＮＡ単独であってもよい。
【００３８】本発明は、式［３］または［４］で表され
るＤＮＡ配列より導かれるアミノ酸配列、式［１］また
は［２］で示される新規な蛋白質を提供する。
【００３９】式［１］ Met Glu Arg Pro Ser Leu Arg Ala Leu Leu Leu Gly Ala Ala Gly -25 -20 -15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp -10 -5 1 Thr Cys Gly Pro Cys Glu Pro Ala Ser Cys Pro Pro Leu Pro Pro 5 10 15 Leu Gly Cys Leu Leu Gly Glu Thr Arg Asp Ala Cys Gly Cys Cys 20 25 30 Pro Met Cys Ala Arg Gly Glu Gly Glu Pro Cys Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Ala Gly Arg Gly Tyr Cys Ala Pro Gly Met Glu Cys Val Lys Ser 50 55 60 Arg Lys Arg Arg Lys Gly Lys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gly Pro 65 70 75 Gly Val Ser Gly Val Cys Val Cys Lys Ser Arg Tyr Pro Val Cys 80 85 90 Gly Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Pro Ser Gly Cys Gln Leu Arg Ala 95 100 105 Ala Ser Gln Arg Ala Glu Ser Arg Gly Glu Lys Ala Ile Thr Gln 110 115 120 Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu Gln Gly Pro Ser Ile Val Thr Pro 125 130 135 Pro Lys Asp Ile Trp Asn Val Thr Gly Ala Gln Val Tyr Leu Ser 140 145 150 Cys Glu Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys 155 160 165 Val Lys Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu Leu Leu Pro 170 175 180 Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly Gly Pro Glu 185 190 195 Lys His Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser Pro Leu Ser Lys 200 205 210 Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser Asn Ser Gln Gly 215 220 225 Gln Ala Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His 230 235 240 Glu Ile Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu Leu 245 250 255 256
【００４０】式［２］ Met Glu Arg Pro Ser Leu Arg Ala Leu Leu Leu Gly Ala Ala Gly -25 -20 -15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp -10 -5 1 Thr Cys Gly Pro Cys Glu Pro Ala Ser Cys Pro Pro Leu Pro Pro 5 10 15 Leu Gly Cys Leu Leu Gly Glu Thr Arg Asp Ala Cys Gly Cys Cys 20 25 30 Pro Met Cys Ala Arg Gly Glu Gly Glu Pro Cys Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Ala Gly Arg Gly Tyr Cys Ala Pro Gly Met Glu Cys Val Lys Ser 50 55 60 Arg Lys Arg Arg Lys Gly Lys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gly Pro 65 70 75 Gly Val Ser Gly Val Cys Val Cys Lys Ser Arg Tyr Pro Val Cys 80 85 90 Gly Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Pro Ser Gly Cys Gln Leu Arg Ala 95 100 105 Ala Ser Gln Arg Ala Glu Ser Arg Gly Glu Lys Ala Ile Thr Gln 110 115 120 Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu Gln Gly Pro Ser Ile Val Thr Pro 125 130 135 Pro Lys Asp Ile Trp Asn Val Thr Gly Ala Gln Val Tyr Leu Ser 140 145 150 Cys Glu Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys 155 160 165 Val Lys Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu Leu Leu Pro 170 175 180 Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly Gly Pro Glu 185 190 195 Lys His Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser Pro Leu Ser Lys 200 205 210 Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser Asn Phe Gln Gly 215 220 225 Gln Ala Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His 230 235 240 Glu Ile Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu Leu 245 250 255 256
【００４１】また、本発明の蛋白質は、式［１］または
［２］の一部であってもよいし、全部であってもよい。
また式［１］または［２］で表されるアミノ酸配列を一
部に含むものであってもよい。特に式［１］または
［２］で表されるアミノ酸配列からシグナルペプチドを
除いた成熟蛋白質を表す式［５］または［６］で表され
るアミノ酸配列の一部を含むものであっても良いし、全
部を含むものであっても良い。
【００４２】式［５］ Ser Ser Ser Asp Thr Cys Gly Pro Cys Glu Pro Ala Ser Cys Pro 1 5 10 15 Pro Leu Pro Pro Leu Gly Cys Leu Leu Gly Glu Thr Arg Asp Ala 20 25 30 Cys Gly Cys Cys Pro Met Cys Ala Arg Gly Glu Gly Glu Pro Cys 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ala Gly Arg Gly Tyr Cys Ala Pro Gly Met Glu 50 55 60 Cys Val Lys Ser Arg Lys Arg Arg Lys Gly Lys Ala Gly Ala Ala 65 70 75 Ala Gly Gly Pro Gly Val Ser Gly Val Cys Val Cys Lys Ser Arg 80 85 90 Tyr Pro Val Cys Gly Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Pro Ser Gly Cys 95 100 105 Gln Leu Arg Ala Ala Ser Gln Arg Ala Glu Ser Arg Gly Glu Lys 110 115 120 Ala Ile Thr Gln Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu Gln Gly Pro Ser 125 130 135 Ile Val Thr Pro Pro Lys Asp Ile Trp Asn Val Thr Gly Ala Gln 140 145 150 Val Tyr Leu Ser Cys Glu Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu 155 160 165 Ile Trp Asn Lys Val Lys Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr 170 175 180 Glu Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg 185 190 195 Gly Gly Pro Glu Lys His Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser 200 205 210 Pro Leu Ser Lys Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser 215 220 225 Asn Ser Gln Gly Gln Ala Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val 230 235 240 Asp Ala Leu His Glu Ile Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu 245 250 255 Leu 256
【００４３】式［６］ Phe Ser Ser Asp Thr Cys Gly Pro Cys Glu Pro Ala Ser Cys Pro 1 5 10 15 Pro Leu Pro Pro Leu Gly Cys Leu Leu Gly Glu Thr Arg Asp Ala 20 25 30 Cys Gly Cys Cys Pro Met Cys Ala Arg Gly Glu Gly Glu Pro Cys 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ala Gly Arg Gly Tyr Cys Ala Pro Gly Met Glu 50 55 60 Cys Val Lys Ser Arg Lys Arg Arg Lys Gly Lys Ala Gly Ala Ala 65 70 75 Ala Gly Gly Pro Gly Val Ser Gly Val Cys Val Cys Lys Ser Arg 80 85 90 Tyr Pro Val Cys Gly Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Pro Ser Gly Cys 95 100 105 Gln Leu Arg Ala Ala Ser Gln Arg Ala Glu Ser Arg Gly Glu Lys 110 115 120 Ala Ile Thr Gln Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu Gln Gly Pro Ser 125 130 135 Ile Val Thr Pro Pro Lys Asp Ile Trp Asn Val Thr Gly Ala Gln 140 145 150 Val Tyr Leu Ser Cys Glu Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu 155 160 165 Ile Trp Asn Lys Val Lys Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr 170 175 180 Glu Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg 185 190 195 Gly Gly Pro Glu Lys His Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser 200 205 210 Pro Leu Ser Lys Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser 215 220 225 Asn Ser Gln Gly Gln Ala Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val 230 235 240 Asp Ala Leu His Glu Ile Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu 245 250 255 Leu 256
【００４４】本発明の蛋白質は、ＰＧＩ2 産生刺激活性
を有することで特徴づけられるが、この活性の測定方法
は、以下の方法により実施できる。
【００４５】すなわち、ウシ胸部大動脈内膜より剥離法
にて採取した血管内皮細胞を１０％ウシ胎児血清含有ダ
ルベッコ改変イーグル培地で継代培養し、飽和細胞密度
に達するまで培養した後、測定試料を添加し６０分間イ
ンキュベーション後、上清中のＰＧＩ2 の安定代謝産物
である、
【００４６】
【化１】 （以下、６−ケト−ＰＧＦ１αと記す）を測定すること
によりＰＧＩ2 産生量を求めることができる。この測定
には市販の６−ケト−ＰＧＦ１α測定用キットを用いて
もよい。
【００４７】一般的にポリペプチドは自然の変異によ
り、または人工的変異により、その本来の機能を変化さ
せることなく、アミノ酸配列またはポリペプチドの構造
の一部を変異せしめることが可能である。従って、本発
明のＰＧＩ2 産生刺激因子は、前述のすべてのアミノ酸
配列の相同変異体に相当する構造の配列を含有すること
も可能である。
【００４８】本発明のＰＧＩ2 産生刺激因子をコードす
る配列表の配列番号７または３のＤＮＡを含むプラスミ
ド（それぞれｐＭ９５０またはｐＭ９５３、ｐＭ９５４
に対応する）で形質転換された大腸菌［ＤＨ５（ｐＭ９
５０）、ＤＨ５（ｐＭ９５３）およびＤＨ５（ｐＭ９５
４）］は、それぞれ工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託［寄託番号：微工研菌寄第１３１７２号（FERM P
-13172、寄託日 平成４年９月２１日）］、［寄託番
号：FERM P-13672（寄託日 平成５年６月３日）］、
［寄託番号：FERM P-13673（寄託日 平成５年６月３
日）］されている。
【００４９】本発明のＰＧＩ2 産生刺激因子を遺伝子工
学的に得るには、一般的に使用されている宿主−ベクタ
ー系を用いることができる。例えば宿主として大腸菌を
用いる場合は、プロモーターとしてＬａｃＵＶ５、トリ
プトファンプロモーターやλＰL プロモーター等を含有
する発現ベクターが使用可能である。また、λファージ
系のベクターであるλｇｔ１１を用いて、β−ガラクト
シダーゼとの融合蛋白質として得ることもできる。さら
に、哺乳動物培養細胞を宿主として使用することもで
き、サル由来ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター由来
ＣＨＯ細胞、マウス由来３Ｔ３細胞あるいはヒト由来線
維芽細胞等が好適である。これらを宿主とする場合に
は、プロモーターとして、ＳＶ４０初期プロモーター、
アデノウイルス主要後期プロモーターあるいはβ−アク
チンプロモーターやポリペプチド鎖伸長因子プロモータ
ー等を含有する発現ベクターが使用できる。
【００５０】これらの宿主−ベクター系を用いた場合、
各々の宿主が好適に増殖し得る条件下で培養し、かつ、
各々のプロモーターが機能するような条件を与えること
によって、本発明のＰＧＩ2 産生刺激因子を得ることが
できる。ＰＧＩ2 産生刺激因子の発現は、後述の酵素免
疫測定法（ＥＩＡ）にて発現を確認することができる。
【００５１】上述のようにして得られた本発明のＰＧＩ
2 産生刺激因子を下記の方法により精製することができ
る。すなわち、本発明のＰＧＩ2 産生刺激因子を含む培
養液をアフィニティークロマトグラフィー、例えばヘパ
リン（ＨＥＰＡＲＩＮ）−５ＰＷまたはＰＧＩ2 産生刺
激因子に対する抗体を結合させたカラム等に吸着させ、
塩化ナトリウムの直線濃度勾配法にて溶出することによ
り単離することが可能である。
【００５２】本発明のＰＧＩ2 産生刺激因子を認識する
抗体は、適切な抗原で適切な動物を免疫することにより
作製することができる。抗原としては、式［５］または
［６］で示される蛋白質であってもよいし、そのペプチ
ド断片であってもよい。また、免疫に用いる動物は、マ
ウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等が好ましく、さら
にマウスを用いると単クローン性抗体を得ることも可能
である。抗体の用途としては、アフィニティークロマト
グラフィー、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、
免疫学的診断法等があげられる。さらに、免疫学的診断
法においては、イムノブロット法、放射免疫測定法、酵
素免疫測定法、蛍光あるいは発光測定法より適宜選択が
できる。
【００５３】本発明は、さらにＰＧＩ2 が血小板凝集抑
制作用、平滑筋弛緩作用、胃酸分泌抑制作用等を有する
ことから、下述の各種疾患の予防および治療に対して有
効な、本発明のＰＧＩ2 産生刺激因子を少なくとも１つ
の有効成分として含有する医薬組成物を提供することが
できる。溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑
病、末梢動脈閉塞、心虚血、脳虚血、動脈硬化、脳閉
塞、高脂血症、糖尿病、心不全、狭心症、虚血性心疾
患、うっ血性心疾患、脈絡膜循環障害、気管支疾患、胃
潰瘍、妊娠子癇。
【００５４】本発明のＰＧＩ2 産生刺激因子の投与量
は、患者の性別、年齢、体重、疾患の種類やその病態あ
るいは投与剤型により適宜変動するが、有効投与量は１
日当り１ｎｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１０ｎｇ〜２
００μｇ／ｋｇである。
【００５５】本発明の医薬組成物の剤型は、その疾患の
病巣に有効量を供給できるものであればいかなるもので
もよく、例えば、錠剤、粉末剤、散剤、カプセル剤、軟
膏剤、噴霧剤あるいは注射剤等が挙げられる。また、本
発明の医薬組成物は、その薬理学的特性を損なわない限
り、一般的に使用される製剤学的混合物である賦型剤、
安定化剤あるいは溶解補助剤等を含有していてもよい。
賦型剤等の具体例としては、リンガー液、リン酸緩衝
液、ヒト血清アルブミン、水解ゼラチン、ショ糖、デキ
ストラン、ポリエチレングリコール等があり、剤型によ
り、適宜選択使用される。
【００５６】
【実施例】以下に本発明を実施例をもってより具体的に
示すが、これは本発明の実施態様の一つの例示であり、
本発明はこれに限定されるものではない。なお、実施例
中の学術用語、略号等は特に断らない限り当該技術分野
で一般的に使用されているものに従った。また、遺伝子
操作に関わる基本的操作は、マニアティスら ”モレキ
ュラークローニング ア ラボラトリーマニュアル”コ
ールド スプリングハーバー ラボラトリー １９８９
年、村松正實編 ”ラボマニュアル遺伝子工学”丸善
１９８８年等を参考にして実施した。さらに、蛋白質精
製に関わる基本的操作は、日本生化学会編 ”新生化学
実験講座第１巻 蛋白質Ｉ 分離・精製・性質” 東京
化学同人 １９９０年を参考にして実施した。各種機
器、試薬等の使用方法は各々附属の使用説明書に従っ
た。
【００５７】（実施例１） ｃＤＮＡライブラリーの作
製 工程１ 正常ヒト二倍体線維芽細胞の調製 正常ヒト二倍体線維芽細胞を１５％ウシ胎児血清含有ダ
ルベッコ改変イーグル培地にて４．８×１０4 細胞／ｍ
Ｌに調製した。この細胞懸濁液３Ｌを回転培養容器に植
え込み、５％炭酸ガス−９５％空気下、３７℃にて培養
した。細胞植え込み３日後に培養液を新鮮な１５％ウシ
胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地３Ｌに交換
し、さらに培養を２日間継続した。次いで、培養液を除
去し、Ｃａ2+、Ｍｇ2+不含ダルベッコ−リン酸生理食塩
溶液を用いて細胞を洗浄した後、フェノールレッド不含
のダルベッコ改変イーグル培地３Ｌを添加し、３７℃、
２４時間培養を継続した。次いで、培養液を除去し、Ｃ
ａ2+、Ｍｇ2+不含生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））
を用いて細胞を洗浄し、７本の回転培養容器から８×１
０9 個の細胞を得た。
【００５８】工程２ 全ＲＮＡの調製 正常ヒト二倍体線維芽細胞より、コムシズンスキ（Chom
czynski,P ）ら［アナリティカル バイオケミストリ
（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１６２巻、１５６
頁、１９８７年］のＡＧＰＣ（Ａｃｉｄ Ｇｕａｎｉｄ
ｉｎｉｕｍ Ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−Ｐｈｅｎｏｌ−
Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）法に従い、ＲＮＡを調製した。
すなわち、工程１で得られた約１×１０9 個の細胞に６
０ｍＬの４Ｍグアニジンチオシアネート溶液（２５ｍＭ
クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．５％ザルコシ
ルおよび０．１Ｍ ２−メルカプトエタノール含有）を
添加し、強く振とうした。さらに、１／１０容の２Ｍ酢
酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、６０ｍＬの水飽和フェノ
ール、１／５容のクロロホルム−イソアミルアルコール
混液（４９：１）を順時添加混合し、さらに１０秒間強
く振った後、１５分間氷中に放置した。４℃で約７００
０×ｇ、２０分間遠心後、水層を新しいチューブに移し
た。得られた水層と等量の１００％イソプロパノールを
添加し、−２０℃で終夜放置した。４℃で約７０００×
ｇ、３０分間遠心後、得られたペレットを約５０ｍＬの
４Ｍグアニジンチオシアネート溶液（２５ｍＭクエン酸
ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．５％ザルコシルおよび
０．１Ｍ ２−メルカプトエタノール含有）で溶解し、
約５０ｍＬのイソプロパノールを添加した。−２０℃で
１時間放置後、４℃、約７０００×ｇで３０分間遠心し
た。ペレットを約３０ｍＬの０．５ｍＭ ＥＤＴＡに溶
解後、常法に従って塩化ナトリウム存在下でエタノール
を添加してＲＮＡを沈澱させ、約９ｍｇの全ＲＮＡを得
た。
【００５９】工程３ ポリ（Ａ）+ ＲＮＡの調製 オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用い、全ＲＮＡより
ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを分離した。すなわち、オリゴ（ｄ
Ｔ）セルロース樹脂５００ｍｇを２００ｍＭトリス−塩
酸緩衝溶液（ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、４００
ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳ含有）に懸濁
し、約２ｍＬ容量のカラムを作製した。工程２で得られ
た全ＲＮＡを３．５ｍＬの０．５ｍＭ、ＥＤＴＡに溶解
し、６５℃で５分間熱処理した後、急冷し、等量の４０
０ｍＭトリス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．５、４０ｍＭ
ＥＤＴＡ、８００ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．２％Ｓ
ＤＳ含有）を加えた。上述の２００ｍＭトリス−塩酸緩
衝溶液（ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、４００ｍＭ
塩化ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳ含有）で平衡化し
たオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにこの溶液をアプラ
イし、ＲＮＡを吸着させた。１０ｍＬの１００ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．５、１０ｍＭＥＤＴＡ、２
００ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳ含有）で
このカラムを洗浄した。次いで、１０ｍＬの滅菌蒸留水
でポリ（Ａ）+ ＲＮＡを溶出後、常法に従い塩化ナトリ
ウム存在下でエタノールを加えポリ（Ａ）+ ＲＮＡを沈
澱させた。ポリ（Ａ）+ ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）約２７０μ
ｇを得た。
【００６０】工程４ ２本鎖ｃＤＮＡの合成 グブラーとホフマンの方法［ジーン（Ｇｅｎｅ）、２５
巻、２６３頁、１９８３年］を改良したシステムに基づ
いて構成されているｃＤＮＡ合成システムキット（アマ
シャム社製）を用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【００６１】このｃＤＮＡ合成システムキットに添付の
５×１本鎖ｃＤＮＡ合成反応用バッファー、ピロリン酸
ナトリウム溶液、ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビタ
ー、デオキシヌクレオシド三リン酸混液、９２５ＫＢｑ
の［α32Ｐ］ｄＣＴＰ溶液、オリゴ（ｄＴ）プライマー
を順々に混合した。この溶液に、工程３で得られた１０
μｇのポリ（Ａ）+ ＲＮＡ溶液を加えて静かに混和後、
２００Ｕの逆転写酵素を添加した。反応溶液は１００μ
Ｌとした。静かに混和後、４２℃で４０分間インキュベ
ートした。
【００６２】上述のｃＤＮＡ合成システムキットに添付
の２本鎖ｃＤＮＡ合成反応用バッファー、８Ｕの大腸菌
リボヌクレアーゼＨ、２３０Ｕの大腸菌ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ、３．７ＭＢｑの［α32Ｐ］ｄＣＴＰ溶液を順々
に添加し、滅菌水で総量５００μＬに調製し静かに混和
した。このチューブを１２℃で６０分間、次いで２２℃
で６０分間反応させた後、さらに７０℃で１０分間イン
キュベートした。
【００６３】反応液を氷浴中に戻して２０ＵのＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼを添加し静かに混和後、３７℃で１０分
間反応させた。反応液に２０μＬの０．２５Ｍ ＥＤＴ
Ａ（ｐＨ８．０）を加えて反応を停止させ、常法に従っ
てフェノール／クロロホルム抽出後、酢酸アンモニウム
存在下でｃＤＮＡをエタノール沈澱させ、この結果２．
３μｇの２本鎖ｃＤＮＡを得た。
【００６４】工程５ ＢｓｔＸＩリンカーの付加 インヴィトロジェン社製ＢｓｔＸＩリンカーを２本鎖ｃ
ＤＮＡに付加した。方法はＤＮＡライゲーションキット
（宝酒造社製）を用い、添付マニュアルに従って実施し
た。すなわち、工程４で合成した２本鎖ｃＤＮＡ約５０
０ｎｇに約５００ｎｇのＢｓｔＸＩリンカーを加えた溶
液１５μＬ（１００ｍＭトリス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ
７．６）、５ｍＭ塩化マグネシウム、３００ｍＭ塩化ナ
トリウム含有）を用意した。次に、１５μＬの酵素溶液
（ＤＮＡライゲーションキットＢ液、以後、Ｂ液と称す
る）を加えよく混合し、１０℃で３時間反応させた。７
０℃で１０分間熱処理し、酢酸アンモニウム存在下でエ
タノール沈澱させた。次に、低融点アガロースゲルで電
気泳動を実施し、５００ｂｐ以上の画分を集め、６５℃
で熱処理することによりゲルを溶解後、フェノール／ク
ロロホルム抽出後塩化ナトリウム存在下でエタノール沈
澱させた。最終的に約１００ｎｇのリンカー付加ｃＤＮ
Ａを回収した。
【００６５】工程６ ｃＤＮＡのベクターへの導入 ｃＤＮＡは、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社
製）を用いてプラスミドベクターへ導入した。すなわ
ち、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ［ヌクレイック アシッ
ド リサーチ（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、
１８巻、５３２２頁、１９９０年］を制限酵素ＢｓｔＸ
Ｉで消化し、ラージフラグメントを回収した。この様に
して調製した１００ｎｇのベクターと工程５で得られた
リンカー付加２本鎖ｃＤＮＡ約２０ｎｇを含むＤＮＡ溶
液４．５μＬに３６μＬの反応用バッファー（ＤＮＡラ
イゲーションキットＡ液）を加えよく混合した。次い
で、４．５μＬの酵素溶液（Ｂ液）を加えよく混合し、
１６℃で一晩反応させた。酢酸アンモニウム存在下でプ
ラスミドをエタノール沈澱させ、２０μＬのＴＥ溶液に
溶解した。
【００６６】工程７ ｃＤＮＡライブラリーの作製 ＤＮＡは、エレクトロポレーション法を用いて大腸菌へ
導入した。エレクトロポレーション法は、ドワーら［ヌ
クレイック アシッド リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．）、１６巻、６１２７頁、１９８８年］の
方法に従って実施した。
【００６７】大腸菌ＭＣ１０６１／Ｐ３をシングルコロ
ニーから１０ｍＬのＬ−ブロスに植菌し、終夜培養し
た。１０ｍＬの終夜培養液を１ＬのＬ−ブロスに植菌
し、ＯＤ600nm ＝約０．５になるまで３７℃で培養し
た。培養液を氷冷した後、約７０００×ｇにて４℃１５
分間遠心し集菌した。上清をデカンテーションにて除去
した後、１Ｌの氷冷滅菌水に再懸濁した。約７０００×
ｇにて４℃１５分間遠心した後、上清を除去し、さらに
５００ｍＬの氷冷滅菌水に懸濁し、約７０００×ｇにて
４℃１５分間遠心後上清を除去した。２０ｍＬの氷冷１
０％グリセロールに再懸濁し、約３５００×ｇにて４℃
１５分間遠心後上清を除去した。２ｍＬの氷冷１０％グ
リセロールに細胞を再懸濁し４０〜５０μＬずつ１．５
ｍＬチューブに分注した。大腸菌を含む１０％グリセロ
ール溶液をドライアイス入りエタノールで急冷凍結し、
−７０℃前後で凍結保存した。
【００６８】上記の凍結保存チューブ１２本中の溶液を
氷上で融解後、チューブ１本当たり、工程６で作製した
ＤＮＡ溶液１μＬを添加した。ＤＮＡ−大腸菌混合液を
キュベット（電極間距離０．１ｃｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社
製）に移した後、エレクトロポレーションの条件（ジー
ンパルサー、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、キャパシタンス：２
５μＦ、電圧：１．８ｋＶ、パルスコントローラー：２
００Ω）を設定し、パルスを１回かけ、１ｍＬのＳＯＣ
培地をキュベット内に加え大腸菌を懸濁した。懸濁液を
培養チューブに移し１時間培養後、５０μｇ／ｍＬのア
ンピシリン含有ＬＢプレートに適量まき、３７℃で１晩
培養した。上記操作により形質転換体約６０万クローン
を得た。
【００６９】（実施例２） ＰＧＩ2 産生刺激因子をコ
ードするｃＤＮＡの取得 工程１ プライマーの作製 参考例２で決定した部分アミノ酸配列のうち式［７］
（配列表の配列番号８）で示される２０アミノ酸配列の
Ｎ端およびＣ端のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列
を、３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（アプライドバイオシ
ステムズ社製）を用いてホスホアミダイド法にて合成し
た。すなわち、Ｎ端の一部分のアミノ酸をコードするＤ
ＮＡとして下記式［８］（配列表の配列番号９）で示さ
れる２０塩基からなるＤＮＡの混合物を、またＣ端の一
部分のアミノ酸をコードするＤＮＡの相補鎖配列として
下記式［９］（配列表の配列番号１０）で示される２０
塩基からなるＤＮＡの混合物を作製した。
【００７０】 式［７］ Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu Ile Pro Val Lys Lys Gly 1 5 10 15 Glu Gly Ala Glu Leu 20 上記ＤＮＡ混合物をプライマーとして実施例１の工程３
で調製したポリ（Ａ）+ ＲＮＡを鋳型にＲＴ−ＰＣＲ法
を実施した。
【００７１】すなわち、Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔTM
ＰｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ライ
フテックオリエンタル社製）を用い、添付マニュアルに
従って、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。ポリ（Ａ）+ ＲＮ
Ａ ３μｇにオリゴ（ｄＴ）、１０×合成バッファー、
ｄＮＴＰ混合液、ＤＴＴ、６０００Ｕの逆転写酵素を加
え、全量を６００μＬとし、４２℃で２時間、次いで９
０℃で５分間インキュベートした。氷上で急冷し、６０
Ｕ（３０μＬ）のＲＮａｓｅＨを添加し、３７℃で２０
分間インキュベートした。
【００７２】２０μＬの反応終了液に１μｇのセンスプ
ライマー、１μｇのアンチセンスプライマー、８μＬの
１０×ＰＣＲバッファー（１００ｍＭトリス−塩酸緩衝
溶液（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ塩化カリウム、１５ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、０．０１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチ
ン）、２．５ＵのＡｍｐｌｉ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼを添加し、全量を１００μＬとした。ＤＮＡ Ｔｈ
ｅｒｍａｌ ＣｙｃｌｅｒTM（パーキン エルマー シ
ータス インスツルメント社製（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍ
ｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））にセッ
トし、９４℃で１分、５５℃で２分および７２℃で３分
の反応を３０回繰り返した。次に反応産物を１０％ポリ
アクリルアミドゲルで電気泳動し、５９ｂｐ付近にバン
ドが出現することを確認した。次いで得られた５９ｂｐ
付近の増幅産物ＤＮＡ断片を常法に従い抽出し、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼを用いて常法に従い末端を平滑化し、
プラスミドｐＵＣ１１８のＳｍａＩサイトにクローニン
グした。ＤＮＡ断片の塩基配列は後述のシークエンシン
グ法に従い決定した。その配列を下記式［１０］（配列
表の配列番号１１）に示す。 式［１０］ 5'-ATTACGGTGG TTGATGCGTT ACATGAAATA CCAGTGAAAA 10 20 30 40 AAGGCGAAGG CGCCGAATT-3' 50 59
【００７３】式［１０］で示された塩基配列のうち１１
〜３０までの塩基配列をもつ２０塩基のＤＮＡ断片（式
［１１］（配列表の配列番号１２）と３１〜５０までの
塩基配列に相補的な２０塩基のＤＮＡ断片（式［１２］
（配列表の配列番号１３）を上述の方法と同様の方法で
合成し、以下ＰＣＲ法によるスクリーニング用プライマ
ーとして使用した。 式［１１］ 5'-TTGATGCGTTACATGAAATA-3' 式［１２］ 5'-CCTTCGCCTTTTTTCACTGG-3'
【００７４】工程２ ＰＣＲ法による正常ヒト二倍体線
維芽細胞のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング 実施例１で得られた形質転換体を１プールあたり約１４
０００クローンを含むように分割し、これを４６プール
作製し、各々をアンピシリン５０μｇ／ｍＬ含有ＬＢ培
地３ｍＬに植菌し、３７℃で終夜振とう培養した。プラ
スミドＤＮＡの抽出はモレキュラークローニング ア
ラボラトリーマニュアル（コールド スプリング ハー
バー ラボラトリー １９８９年）の方法に従って実施
した。すなわち、１．５ｍＬの培養液を微量高速遠心機
にて５０００ｒｐｍで３分間遠心し上清を除去した後、
沈澱を１００μＬの懸濁溶液（５０ｍＭグルコース、１
０ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭトリス−塩酸緩衝溶液（ｐ
Ｈ８．０）含有）に懸濁し、室温で５分間放置した。氷
中で２００μＬアルカリ溶液（０．２Ｎ 水酸化ナトリ
ウムおよび１％ＳＤＳ含有）を加え、穏やかに混合し、
氷中に５分間放置した。次に、１５０μＬの氷冷酢酸カ
リウム溶液を加え、良く混合し、氷中に５分間放置し
た。微量高速遠心機にて４℃、１２０００ｒｐｍで５分
間遠心後、上清を他のチューブに移し、４００μＬフェ
ノール−クロロホルム溶液を加え、良く撹拌した後、微
量高速遠心機にて１２０００ｒｐｍで５分間遠心した。
水層に２容量（約８００μＬ）のエタノールを加え、混
合した後、室温で２分間放置した。１２０００ｒｐｍで
５分間遠心後、上清を完全に除去し、沈澱を７０％エタ
ノールで洗浄後、乾燥させ、２０μｇ／ｍＬ ＲＮａｓ
ｅＡを含む５０μＬのＴＥ溶液に溶解した。得られたプ
ラスミドＤＮＡ溶液２．５μＬを制限酵素ＸｂａＩで３
７℃、１時間処理し、切断した。
【００７５】次いでＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｒｅａ
ｇｅｎｔ Ｋｉｔ（パーキン エルマー シータス イ
ンスツルメント社製（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅ
ｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））を用いて、上記Ｄ
ＮＡ溶液を含む反応溶液２０μＬ（１０ｍＭトリス−塩
酸緩衝溶液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、
１．５ｍＭ塩化マグネシウム、各２００μＭ ｄＮＴ
Ｐ、１０ｎｇ／ｍＬセンスプライマー、１０ｎｇ／ｍＬ
アンチセンスプライマーおよび０．０２５Ｕ／μＬのＡ
ｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ）を調製し、Ｇ
ｅｎｅ ＡｍｐTMＰＣＲシステム９６００（パーキン
エルマー シータス インスツルメント社製（Ｐｅｒｋ
ｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
ｓ））にセットし、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒お
よび７２℃で１分の反応を２５回繰り返した。次に反応
産物を１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、４
０ｂｐ付近にバンドが検出されたものを陽性と判断し
た。１つの陽性プールのプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ
５を形質転換し、得られた形質転換体を１プールあたり
約１８００クローンを含むように分割し、これを１５プ
ール作製し、前述の方法と同様にＤＮＡを調製し、ＰＣ
Ｒ法により４０ｂｐ付近にバンドが検出されるものを陽
性と判断した。以下本操作を繰り返し、計６回のスクリ
ーニングで２つの陽性クローンを同定した。
【００７６】（実施例３） 塩基配列の決定 塩基配列の決定は、ラボマニュアル遺伝子工学（村松正
實編、丸善 １９８８年）に記載された方法に従って実
施した。すなわち、実施例２で得られた陽性クローンの
プラスミドＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩで消化し、切り出
されたＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで消化したｐＵＣ
１１９と混合し、前述のライゲーションキットを用いて
ライゲーションした。この操作により得られたプラスミ
ドをｐＭ９５０とｐＭ９５１と命名した。大腸菌ＪＭ１
０９をｐＭ９５０およびｐＭ９５１で形質転換した後、
常法に従い１本鎖ＤＮＡを調製した。ＤＮＡシーケンサ
ー（３７３Ａ、アプライドバイオシステムズ社製）を用
い、添付マニュアルに従って調製された１本鎖ＤＮＡ各
々の塩基配列を決定した。
【００７７】その結果、プラスミドｐＭ９５０とｐＭ９
５１にそれぞれ含まれる本発明のＰＧＩ2 産生刺激因子
をコードする塩基配列を配列表の配列番号７と１４とに
示した。またそのＤＮＡ配列より演繹されるアミノ酸配
列を配列表の配列番号１５または１６に示した。
【００７８】（実施例４） λファージｃＤＮＡライブ
ラリーの作製 λファージｃＤＮＡライブラリーの作製は、ｃＤＮＡク
ローニングシステムλｇｔ１０（アマシャム社製）を用
い、添付マニュアルに従って実施した。
【００７９】工程１ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ−Ｋｐｎ
Ｉ−ＮｃｏＩアダプターの付加 実施例１の工程４と同様な方法でオリゴ（ｄＴ）プライ
マーのかわりにランダムプライマーを用いて２本鎖ｃＤ
ＮＡを得た。ここで合成した２本鎖ｃＤＮＡ１．２μｇ
を２７μＬの滅菌純水に溶かし、４μＬのＬ／Ｋ緩衝
液、５μＬのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ−Ｎｃ
ｏＩアダプターおよび４μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼを添
加した。静かに混和し、１５℃で一晩反応させ、Ｅｃｏ
ＲＩ−ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ−ＮｃｏＩアダプターを合
成した２本鎖ｃＤＮＡに付加した。反応後、ＮＩＰ５１
７カラムでゲル濾過を行い、５００ｂｐ以上の画分を集
めた。次に、３５０μＬのｃＤＮＡ、４０μＬのＬ／Ｋ
緩衝液および１０μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
をこの画分に添加し、３７℃で２時間反応させた。エタ
ノールでＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ−ＮｃｏＩ
アダプターの付加されたｃＤＮＡを沈澱させ、最終的に
約１５０ｎｇのリン酸化アダプター付加ｃＤＮＡを得
た。
【００８０】工程２ ｃＤＮＡのベクターへの導入 ｃＤＮＡクローニングシステムλｇｔ１０（アマシャム
社製）に添付のＥｃｏＲＩ消化したλｇｔ１０の１μｇ
に、２本鎖ｃＤＮＡ２０ｎｇを加え、１μＬのＬ／Ｋ緩
衝液、１μＬの純水および１μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ
を添加後、静かに混和した。反応溶液総量は１０μＬと
し、１５℃で一晩反応させた。これを２反応実施した。
【００８１】工程３ ｉｎ ｖｉｔｒｏ パッケージン
グ 工程２で得られた組換えファージＤＮＡをインビトロパ
ッケージングキット（ストラタジーン社製）を用いて、
添付マニュアルに従いパッケージングした。すなわち、
工程２で調製した組換えファージＤＮＡ溶液各５μＬ
を、２５μＬのパッケージングエキストラクトに加え、
２２℃、２時間インキュベートし、ファージ粒子混合液
を得た。
【００８２】工程４ ｃＤＮＡライブラリーの作製 工程３で得られたファージ粒子混合液をＳＭ緩衝液で５
×１０4 ｐｆｕ／２００μＬに希釈した。０．４％マル
トースを含むＬ培地でＯＤ600nm ＝０．５まで培養した
５０ｍＬの大腸菌ＮＭ５１４培養液を４℃で９００×ｇ
で遠心した。得られた沈澱を１５ｍＬの１０ｍＭ硫酸マ
グネシウム溶液に懸濁した。このＮＭ５１４懸濁液２０
０μＬと前述のファージ希釈液２００μＬとを混合し、
３７℃１５分間インキュベート後、ソフトアガロース
（０．７％アガロース／Ｌ培地）１０ｍＬと混合し、１
５ｃｍ径のＬプレート上に重層した。これを３７℃で１
０時間インキュベートした。すなわち、１プレート当た
り５万クローン、計１２プレートで６０万クローンから
なるλファージｃＤＮＡライブラリーを得た。
【００８３】（実施例５） λファージｃＤＮＡライブ
ラリーのスクリーニング 工程１ 標識プローブの作製 標識プローブの作製はランダムプライマーＤＮＡラベリ
ングキット（宝酒造社製）を用い、添付マニュアルに従
って実施した。ｐＭ９５１を制限酵素ＰｖｕIIおよびＳ
ｍａＩで処理し、得られた２６５ｂｐのＤＮＡ約１００
ｎｇを回収し、２０μＬのＴＥに溶解した。この溶液８
μＬと２μＬのランダムプライマーとを混合し、９５℃
で３分間インキュベートした後、５分間氷冷した。その
溶液に２．５μＬの１０×反応緩衝液、２．５μＬのｄ
ＮＴＰ混合液、１．８５ＭＢｑの［α32Ｐ］ｄＣＴＰ溶
液、４μＬの滅菌純水および１μＬのＫｌｅｎｏｗフラ
グメントを加え、３７℃で２時間インキュベートした。
その後６５℃で５分間インキュベートした後、反応液を
ニックカラムＧ−５０（ファルマシア社製）でゲルろ過
して分画し、各画分の放射活性を測定した。
【００８４】工程２ λファージｃＤＮＡライブラリー
のスクリーニング λファージｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、
常法に従い、プラークハイブリダイゼーション法により
行った。
【００８５】実施例４で得られたλッファージｃＤＮＡ
ライブラリーの上にＨｙｂｏｎｄＮフィルター（アマシ
ャム社製）を重ね、レプリカフィルターを作製した。得
られたレプリカフィルターを１．５Ｍ塩化ナトリウム含
有０．５Ｍ水酸化ナトリウムで５分間アルカリ変性処理
し、１．５Ｍ塩化ナトリウム含有０．５Ｍトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．０）で２分間の中和処理を２回行い、２
×ＳＳＣで洗い、風乾した。これに、ＵＶ照射機（ＵＶ
ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒTM２４００、ストラタジー
ン社製）にて０．７２ＪのＵＶを照射し、ＤＮＡを固定
した。この方法で作成したレプリカフィルター１２枚を
５０ｍＬのプレハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳ
ＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、５０％ホルムアミ
ド、０．１％ＳＤＳ、２５０μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮ
Ａ）に浸し、４２℃で一晩インキュベートした。その
後、このフィルターを５０ｍＬのハイブリダイゼーショ
ン溶液（６×ＳＳＰＥ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、５
０％ホルムアミド、０．１％ＳＤＳ、１０％硫酸デキス
トラン、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡと工程１で得
られた放射活性５×１０7 ｃｐｍ標識のプローブを加え
たもの）に浸し、４２℃で一晩インキュベートした。ハ
イブリダイゼーション終了後、２×ＳＳＣ／０．１％Ｓ
ＤＳを用いて室温で２０分間３回洗浄した。次いで０．
１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを用いて４４℃で３０分間
２回洗浄した。さらに、０．１×ＳＳＣを用い室温で１
０分間１回洗浄し、風乾した。オートラジオグラフィー
にて放射活性の検出を行い、１０個の陽性クローンが検
出された。この１０個の陽性クローンを単離するため、
２次スクリーニングを本工程と同様の方法で実施し、８
個の陽性クローンを単離した。
【００８６】（実施例６） 塩基配列の決定 実施例５の工程２で得られた８個の陽性ファージクロー
ンの内、最長のｃＤＮＡを有するクローンのＤＮＡを制
限酵素ＢａｍＨＩで消化した。切り出されたｃＤＮＡ断
片を制限酵素ＢａｍＨＩで消化したｐＵＣ１１８と混合
し、前述のライゲーションキットを用いてライゲーショ
ンした。得られたプラスミドの塩基配列の決定は、実施
例３と同様の方法で実施した。本発明のＰＧＩ2 産生刺
激因子をコードするＤＮＡ配列を配列表の配列番号３お
よび４に示し、また、そのＤＮＡ配列より演繹されるア
ミノ酸配列を配列表の配列番号１および２に示した。配
列表の配列番号３に示すＤＮＡを含むプラスミドをｐＭ
９５２と命名した。
【００８７】（実施例７） ＣＯＳ細胞での発現 工程１ 発現ベクターの構築 発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ［ヌクレイック アシッド
リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｄｓ Ｒｅｓ．）、１８
巻、５３２２頁、１９９０年］２μｇをＢｓｔＸＩで消
化後、ラージフラグメントを回収し、その半量と下記式
［１３］および［１４］（配列表の配列番号１７および
１８）の合成ＤＮＡ各１μｇをＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造社製）を用いてライゲーションし、発現ベ
クターｐＥＦ−ＢＯＳ−ＫＳを得た。 式［１３］ 5'- CTGGTCGACGGATCCCGGGTACCAGCACA-3' 式［１４］ 3'-ACACGACCAGCTGCCTAGGGCCCATGGTC -5'
【００８８】次に、ｐＭ９５２を制限酵素ＮｃｏＩで消
化後、約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収し、得られた
ＤＮＡ断片をＤＮＡブランチングキット（宝酒造社製）
を用いて平滑化した。発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｋ
Ｓを制限酵素ＳｍａＩで消化後、ラージＤＮＡ断片を回
収した。平滑化したＤＮＡ断片とＤＮＡライゲーション
キット（宝酒造社製）を用いてライゲーションを行い、
発現ベクターｐＭ９５３を得た（図１）。
【００８９】工程２ 発現ベクターｐＭ９５３のＣＯＳ
細胞への導入 発現ベクターのＣＯＳ細胞への導入は、ソムポイラック
（Ｓｏｍｐｏｙｒａｃ）らの方法［プロシーディング
オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンス
オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、
７８巻、７５７５頁、１９８１年］を参考にして実施し
た。
【００９０】１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地２ｍ
Ｌに３×１０5 のＣＯＳ細胞が含まれるように調製し、
３．５ｃｍ シャーレに撒き、５％炭酸ガス存在下、３
７℃で２０〜２４時間培養した。培地をアスピレーター
を用いて除去し、ＤＭＥ培地により細胞を３回洗浄し
た。
【００９１】次に、ＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラン混合
液を調製した。すなわち、０．５μｇのｐＭ９５３を含
有する１０μＬのＴＥ溶液、７μＬの２０ｍｇ／ｍＬ
ＤＥＡＥデキストラン溶液、３５μＬの１Ｍトリス−塩
酸溶液（ｐＨ７．４）および６４８μＬのＤＭＥ培地を
混合した。次に、ＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラン混合液
をＣＯＳ細胞の上に静かに重層し、５％炭酸ガス存在
下、３７℃で４時間培養した。ＤＮＡ−ＤＥＡＥデキス
トラン混合液を静かにピペットマンにて除去した後、Ｄ
ＭＥ培地にて細胞を洗浄し、新たにＤＭＥ培地を添加し
た。５％炭酸ガス存在下、３７℃で９６時間培養後、実
施例１１に示すＥＩＡ法で測定し、ＰＧＩ2 産生刺激因
子の発現を確認した。
【００９２】（実施例８） ＣＨＯ細胞での発現 工程１ 発現ベクターの構築 実施例７の工程１で構築した発現ベクターｐＭ９５３を
制限酵素ＸｂａＩとＮｏｔＩで消化後、約１．２Ｋｂの
ＤＮＡ断片を回収した。ｄｈｆｒ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏ
ｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）発現単位を有し、かつ
ＥＦプロモーターによって外来遺伝子の発現を制御でき
る発現ベクターの外来遺伝子挿入部位に、ＤＮＡライゲ
ーションキット（宝酒造社製）を用いてこのフラグメン
トをライゲーションし、目的の発現ベクターｐＭ９５４
を得た（図２）。
【００９３】工程２ 発現ベクターｐＭ９５４のＣＨＯ
細胞への導入 発現ベクターのＣＨＯ細胞への導入は、エレクトロポレ
ーション法を用いた。すなわち、ジーンパルサー（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ社製）を用い、キュベット（電極間距離０．
４ｃｍ）中で、ＣＨＯ細胞４．０×１０6 およびｐＭ９
５４ ２０μｇを含むシュクロース含有リン酸緩衝液
に、電圧０．４０ｋＶ／ｍ、キャパシタンス２５μＦ
の、電気パルスを与えた。得られたｐＭ９５４／ＣＨＯ
培養上清を実施例１１に示すＥＩＡ法で測定し、ＰＧＩ
2 産生刺激因子の発現を確認した。発現株については、
メソトレキセート（日本レダリー社製）によって遺伝子
増幅を行い、高発現株を選択した。
【００９４】（実施例９） ＰＧＩ2 産生刺激因子の精
製 工程１ 実施例７の工程２に準じて作製したｐＭ９５３／ＣＯＳ
細胞の培養上清６００ｍＬを限外ろ過膜ＹＭ１０（分画
分子量１０ｋＤａ）をセットした限外ろ過装置（ダイア
フロー、グレース・ジャパン社製）を用いて濃縮した。
２０ｍＬまで濃縮した時点で遠心分離し、２０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した。その
後、０．２２μｍフィルター（マイレクスＧＶ、日本ミ
リポア社製）にてろ過した。
【００９５】工程２ 工程１に従って作製したｐＭ９５３／ＣＯＳ細胞の培養
上清を、あらかじめ２０ｍＭトリス−塩酸−０．１Ｍ塩
化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したヘパリ
ン（ＨＥＰＡＲＩＮ）−５ＰＷ（東ソー社製）アフィニ
ティーカラムに吸着させた後、２０ｍＭトリス−塩酸
（ｐＨ７．５）をベースに塩化ナトリウムを添加した溶
出液において０．１〜１．０Ｍの塩化ナトリウムの直線
濃度勾配をつけて溶出させ、吸光波長２８０ｎｍで溶出
プロファイルを測定した。溶出した各フラクションにつ
いて実施例１１に示すＥＩＡ法にてＰＧＩ2 産生刺激因
子の濃度を測定し、０．３〜０．６Ｍの塩化ナトリウム
匂配濃度のときに溶出されたＰＧＩ2 産生刺激因子を有
する画分をプールした。
【００９６】工程３ 工程２で得られた溶出画分を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７．５）に対して透析し、あらかじめ同緩衝液
にて平衡化した抗体カラムにかけた。抗体カラムは、実
施例１０で作製したＰＧＩ2 産生刺激因子の抗血清をベ
ーカーボンドＡＢｘカラム（ジェー・ティー・ベーカー
社製）で精製し、ホルミル−セルロファイン（生化学工
業株式会社製）に結合させて作製した。溶出画分中のタ
ンパクを吸着させた後、４．５Ｍ塩化マグネシウム／５
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．４）にて吸着タン
パクを溶出した。吸着タンパクを非還元条件下における
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した結果、ＰＧＩ2 産
生刺激因子がほぼ単一に精製されていることが確認され
た（図３）。
【００９７】（実施例１０） 抗体の作製方法 式［７］のＣ末端１２アミノ酸のＮ端にシステインを付
加した計１３アミノ酸をペプチド自動合成機（４３０Ａ
型 アプライドバイオシステム社製）を用いて合成し
た。合成ペプチドのＮ末端のシステインを介してキャリ
アータンパクであるＫＬＨ（キーホールリンペットヘモ
シアニン）に結合させ、免疫用抗原を作製した。
【００９８】動物はニュージーランドホワイト種雌ウサ
ギを用いた。免疫方法は、ソフロニエウ（M.V.Sofronie
w ）らの方法［フレセニウス ゼイツスリフト フュア
アナリティ ケミイ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｚ．Ａｎ
ａｌ．Ｃｈｅｍ．）、２９０巻、１６３頁、１９７８
年］に準じて行った。すなわち、免疫用抗原と完全フロ
イントアジュバント（ＦＣＡ、ディフコ ラボラトリー
社製）または不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ、
ディフコ ラボラトリー社製）を１：１（ｖ／ｖ）で十
分に混合し乳化させた。これをウサギの背部皮内２０ヶ
所以上に反復投与し、免疫した。２週間おきに５回免疫
した後に動物の全血液を採血し、抗血清を得た。なお、
得られた抗血清は使用時まで−４０℃で保管した。
【００９９】（実施例１１） 酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ） 反応系としては、プレートに固相化した抗原と標識抗体
との反応をサンプル中の抗原により阻止することによっ
て定量する拮抗阻害系を用いた。すなわち、１０倍希釈
の形質転換体培養上清を９６穴培養皿に１００μＬ／穴
ずつ添加し、４℃で１晩または５６℃で３０分間反応さ
せ、その後洗浄して抗原を固相化した。これに０．５％
ＢＳＡ／ＰＢＳを１５０μＬ／穴ずつ添加し、２５℃で
１．５時間以上反応させ、洗浄してブロッキングをし
た。次にあらかじめ４μｇ／ｍＬのホースラディッシュ
ペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）で標識した抗ＰＧＩ2 産
生刺激因子抗体１１０μＬとサンプル１１０μＬとを混
合し、２５℃で１時間プレインキュベーションした。こ
の溶液を１００μＬ／穴ずつ添加し、２５℃で２時間反
応させた。さらに３ｍｇ／ｍＬのオルトフェニレンジア
ミン（ＯＰＤ）／０．０２７％Ｈ2 Ｏ2 ／マッキルベイ
ン緩衝液（ｐＨ５．０）（ＭＣＢ）を１００μＬ／穴ず
つ添加し、１０分間反応させて発色させ、２Ｎ硫酸を１
００μＬ／穴ずつ添加し、反応を停止させた。発色は４
９０ｎｍの吸光度で測定した。
【０１００】（実施例１２） 毒性試験 実施例９で得られた本発明のＰＧＩ2 産生刺激因子を用
いてマウスにおける毒性試験を実施した。すなわち、６
週齢のＩＣＲマウス雌雄各々５匹に対して実施例９で得
られたＰＧＩ2 産生刺激因子を、１日１回１週間連日静
脈内投与した。投与期間中を通して各動物個体の一般性
状を観察した。本試験では最高投与量群である１０ｍｇ
／ｋｇ群でもいずれの動物においても死亡例は観察され
ず、一般性状においても変化はみられなかった。
【０１０１】（実施例１３） 注射用溶液製剤の調製 実施例９で得られた本発明のＰＧＩ2 産生刺激因子１０
０ｍｇを１０ｍｇ／ｍＬの水解ゼラチンを含有する生理
食塩液１００ｍＬに溶解し、ポアサイズ０．２２μｍの
フィルター（マイレックスＧＶ ミリポア社製）を用い
てろ過滅菌した。これを無菌的に２ｍＬずつガラスバイ
アルに分注後密栓し、注射用溶液製剤とした。
【０１０２】（実施例１４） 注射用凍結乾燥製剤の調
製 実施例９で得られた本発明のＰＧＩ2 産生刺激因子１０
０ｍｇを１００ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンを含有
する１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１００ｍＬに溶解
し、ポアサイズ０．２２μｍのフィルター（マイレック
スＧＶ ミリポア社製）を用いてろ過滅菌した。これを
無菌的に３ｍＬずつガラスバイアルに分注し、凍結乾燥
後に密栓して、注射用凍結乾燥製剤とした。
【０１０３】
【参考例】
（参考例１）下記の方法で、培養上清を作製し、ＰＧＩ
2 産生刺激因子の精製を行い、ＰＧＩ2 産生刺激因子を
得た。なお、ＰＧＩ2 産生刺激活性の測定は後述の方法
で行った。
【０１０４】（１） 正常ヒト二倍体線維芽細胞の培養
上清の作製 正常ヒト二倍体線維芽細胞を１５％ウシ胎児血清含有ダ
ルベッコ改変イーグル培地にて４．８×１０4 細胞／ｍ
Ｌに調製した。この細胞懸濁液３Ｌを回転培養容器に植
え込み、５％炭酸ガス−９５％空気下、３７℃にて培養
した。細胞植え込み３日後に培養液を新鮮な１５％ウシ
胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地３Ｌに交換
し、さらに培養を２日間継続した。次いで、培養液を除
去し、Ｃａ2+、Ｍｇ2+不含ダルベッコ−リン酸生理食塩
溶液を用いて細胞を洗浄した後、フェノールレッド不含
のダルベッコ改変イーグル培地３Ｌを添加し、３７℃、
２日間培養した。培養液を回収後、２．５μｍのフィル
ター（ＣＮカートリッジ ３０インチ、ミリポア社製）
にてろ過し細胞片を除去した。次いでホローファイバー
モジュール（モルセップファイバーＦＳ−１０ ６ｋＤ
ａ カットオフ、ダイセル化学工業社製）、分画分子量
１０ｋＤａの限外ろ過カセット（オメガミニセット、富
士フィルター工業社製）による２段階の濃縮操作にて濃
縮した。この濃縮液を分画分子量３．５ｋＤａの透析チ
ューブ（スペクトラム社製）を用いて、２０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に対して４℃で１晩透析し
た。同じ組成の新たな緩衝液に対してさらに４℃で８時
間透析し、１．２μｍフィルター（ディエフエイ アセ
ンブリ、日本ポール社製）、０．２２μｍフィルターシ
ステム（コーニング社製）で順次ろ過した。
【０１０５】（２） ＰＧＩ2 産生刺激因子の精製 工程１ （１）に従って作製した正常ヒト二倍体線維芽細胞の培
養上清を、予め２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
８）で平衡化したＤＥＡＥ−５ＰＷ（東ソー社製）陰イ
オン交換クロマトカラムにアプライして上清中の成分を
吸着させた。２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
８）をベースとして作製した０〜１．０Ｍの塩化ナトリ
ウムの直線濃度勾配溶出液にて吸着成分を溶出させ、２
８０ｎｍで各画分の吸光度を同時に測定した。溶出した
各画分のＰＧＩ2 産生刺激活性を後述の方法に従って測
定し、５０〜１５０ｍＭの塩化ナトリウム濃度の溶出液
で溶出されたＰＧＩ2 産生刺激活性を有する画分をプー
ルした（図４）。
【０１０６】工程２ 工程１で得られた活性画分を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）に対して透析し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）で平衡化したヘパリン（ＨＥＰＡＲＩＮ）−
５ＰＷ（東ソー社製）アフィニティーカラムに活性成分
を吸着させ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）をベ
ースとして塩化ナトリウムを添加した溶出液において０
〜１．０Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配をつけて溶
出させ、溶出プロファイルを２８０ｎｍの吸光度で測定
した。溶出した各画分のＰＧＩ2産生刺激活性を測定
し、４５０〜５００ｍＭの塩化ナトリウム匂配濃度のと
きに溶出されたＰＧＩ2 産生刺激活性を有する画分をプ
−ルした（図５）。
【０１０７】工程３ 工程２で得られた活性画分をセントリコン−１０（アミ
コン社製）にて濃縮した。予め１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）で平衡化したプロテイン−パック（ＰＲ
ＯＴＥＩＮ−ＰＡＫ）３００（日本ミリポア リミテッ
ド ウォーターズクロマトグラフィー事業部）のカラム
２本を連結し、濃縮画分をゲルろ過し、吸光波長２８０
ｎｍで溶出プロファイルを同時に測定した。溶出後の各
画分のＰＧＩ2 産生刺激活性を測定したところ、活性は
分子量３０ｋＤａ付近に認められた（図６）。図６中の
数字は分子量（ｋＤａ）、Ｖｔは充填剤の総体積、Ｖｏ
は排除体積を表す。
【０１０８】工程４ 工程３で得られた活性画分を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）で平衡化したＩＧＦ−アフィニティーカラム
にかけた。ＩＧＦ−アフィニティーカラムとしては、ア
フィプレップ１０（日本バイオラッドラボラトリース社
製）に組換えＩＧＦ−Ｉをリガンドとして結合させた耐
圧カラムを作製し、本実験に用いた。活性成分を吸着さ
せた後、吸着成分を０．５Ｍ酢酸で溶出した。吸着画分
と非吸着画分のＰＧＩ2 産生刺激活性を測定したとこ
ろ、ＰＧＩ2 産生刺激活性は、非吸着画分に認められ
た。
【０１０９】工程５ 工程４で得られた活性画分を０．１％トリフルオロ酢酸
含有１０％アセトニトリル水溶液で平衡化したＣ4 逆相
ＨＰＬＣカラム（ウォーターズ社製）にかけた。カラム
に吸着した成分は０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニ
トリル溶液の１０〜６０％アセトニトリルの直線濃度勾
配溶出液にて溶出した。本発明のＰＧＩ2 産生刺激因子
は単一なピークとして溶出された。
【０１１０】（参考例２） 正常ヒト二倍体線維芽細胞
由来のＰＧＩ2 産生刺激因子の物性の測定 分子量の測定 参考例１の工程５で得られた本発明のＰＧＩ2 産生刺激
因子の分子量を、非還元条件下におけるドデシル硫酸ナ
トリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）で求めたところ、分子量約３３ｋＤａに単一
のバンドとして認められた（図７）。図７はＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥの泳動後の参考写真の模式図であり、参考写真を
添付する。図７中、ラインＡおよびＣは既知分子量を持
つ標準試料のバンドであり、ラインＢは本発明のＰＧＩ
2 産生刺激因子のバンドである。また、数字は標準試料
の分子量（ｋＤａ）を表す。
【０１１１】アミノ酸配列の解析 参考例１の工程５で得られた本発明のＰＧＩ2 産生刺激
因子を、トリプシンで消化して、ペプチドフラグメント
とした。これらのフラグメントを各々０．１％トリフル
オロ酢酸水溶液で平衡化したＣ8 逆相ＨＰＬＣカラム
（セパレーションズグループ社製）にかけ、０．０８％
トリフルオロ酢酸／アセトニトリル溶液の０〜１００％
アセトニトリルの直線濃度勾配溶出液にて溶出させた。
自動気相シークエンサー（アプライドバイオシステムズ
４７７Ａ−１２０Ａ）を用い、エドマン分解により各々
のペプチドフラグメントのアミノ酸配列を決定した。
【０１１２】次いで、本発明のＰＧＩ2 産生刺激因子を
還元カルボキシメチル化し、Ｃ8 逆相ＨＰＬＣカラム
（日本ウォーターズ社製）で脱塩した。次いでエンドプ
ロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（プロテアーゼＶ８）で消化し
てペプチドフラグメントとした。これらのフラグメント
を上記の方法と同様に処理し、各々のペプチドフラグメ
ントのアミノ酸配列を決定した。
【０１１３】得られたアミノ酸配列を下記式［７］およ
び［１５］〜［２５］（配列表の配列番号８および１９
〜２９）に示す。 式［７］ Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu Ile Pro Val Lys Lys Gly 1 5 10 15 Glu Gly Ala Glu Leu 20 式［１５］ Ser Xaa Xaa Asp Thr Xaa Gly Pro 1 5 8 式［１６］ Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys Val Lys 1 5 10 15 Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu 20 25 式［１７］ Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly 1 5 10 15 Gly Pro Glu 式［１８］ Cys His Ala Ser Asn Ser Gln Gly Gln Ala Ser Ala Ser Ala Lys 1 5 10 15 Ile Thr Val Val 19 式［１９］ Ala Ile Thr Gln Val Ser Lys 1 5 式［２０］ Gly His Tyr Gly Val Gln Arg 1 5 式［２１］ Thr Glu Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr 1 5 10 15 Arg 16 式［２２］ Gly Ala Glu Leu 1 4 式［２３］ Lys Ala Ile Thr Gln Val Ser Lys Gly Thr Xaa Glu 1 5 10 12 式［２４］ Xaa Glu Pro Xaa Gly Gly Gly Gly Ala Gly Arg Gly Tyr Xaa Ala 1 5 10 15 Pro Gly 17 式［２５］ Gln Gly Pro Ser Ile Val Thr Pro Xaa Lys Asp Ile 1 5 10 12
【０１１４】（参考例３） ＰＧＩ2 産生刺激活性の測
定 血管内皮細胞はウシ胸部大動脈内膜より剥離法にて採取
した。次いで得られた血管内皮細胞を１０％ウシ胎児血
清を含む１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／
ｍＬストレプトマイシン含有ダルベッコ改変イーグル培
地中、５％炭酸ガス−９５％空気下、３７℃にて継代培
養した。培地は週２回交換し、５〜１０代継代した。血
管内皮細胞を０．０５％トリプシン処理し、細胞浮遊液
を得た。
【０１１５】次いで、１０％ウシ胎児血清含有ダルベッ
コ改変イーグル培地１ｍＬの入った２４穴培養皿に血管
内皮細胞を移し、５×１０4 細胞／穴まで培養した。１
０％以下の各種の測定試料を含むダルベッコ改変イーグ
ル培地５００μＬを添加し、３７℃で６０分間インキュ
ベーションした。
【０１１６】培養上清からの６−ケト−ＰＧＦ１αの抽
出と精製はジャッフェらの方法［ザジャーナル オブ
クリニカル インベスティゲーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｉｎｖｅｓｔ．）、５２巻、３９８頁、１９７３年］を
改良して行った。培養上清１ｍＬに０．１Ｎ塩酸１．５
ｍＬを加え、５ｍＬ酢酸エチルで２度抽出した。窒素ガ
ス下で酢酸エチルを蒸発させ、残渣をエタノールに再溶
解しアッセイ試料とした。アッセイに使用するまでこの
試料は−２０℃で保存した。４０℃でエタノールを蒸発
させ、残渣を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、１Ｍ
塩化ナトリウム、１％ゼラチン含有）に溶解した。
【０１１７】６−［ 3Ｈ］ケト−ＰＧＦ１αと抗６−ケ
ト−ＰＧＦ１α抗体を用いたニューイングランドヌクレ
アー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）社製
の６−ケト−ＰＧＦ１α測定用ラジオイムノアッセイキ
ットを用い、添付マニュアルに従い６−ケト−ＰＧＦ１
αの濃度を測定した。ＰＧＩ2 産生量は、１０4 細胞が
１時間当たりに産生する６−ケト−ＰＧＦ１α産生量
（ｐｇ／１０4 細胞／時間）により求めた。
【０１１８】
【発明の効果】本発明は新規なＤＮＡを提供する。この
ＤＮＡは、それを用いて、それがコードする新規な蛋白
質を遺伝子工学的手法により発現させることができ、こ
の新規な蛋白質はＰＧＩ2 の産生を促進し、ＰＧＩ2 の
持つ血小板凝集抑制作用、平滑筋弛緩作用、胃酸分泌抑
制作用に基づいて溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減
少性紫斑病、末梢動脈閉塞、心虚血、脳虚血、動脈硬
化、脳閉塞、高脂血症、糖尿病、心不全、狭心症、虚血
性心疾患、うっ血性心疾患、脈絡膜循環障害、気管支疾
患、胃潰瘍、妊娠子癇等の疾患に対する有効な医薬品と
なる。
【０１１９】
【配列表】
配列番号 ：１ 配列の長さ：２８２ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Glu Arg Pro Ser Leu Arg Ala Leu Leu Leu Gly Ala Ala Gly -25 -20 -15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp -10 -5 1 Thr Cys Gly Pro Cys Glu Pro Ala Ser Cys Pro Pro Leu Pro Pro 5 10 15 Leu Gly Cys Leu Leu Gly Glu Thr Arg Asp Ala Cys Gly Cys Cys 20 25 30 Pro Met Cys Ala Arg Gly Glu Gly Glu Pro Cys Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Ala Gly Arg Gly Tyr Cys Ala Pro Gly Met Glu Cys Val Lys Ser 50 55 60 Arg Lys Arg Arg Lys Gly Lys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gly Pro 65 70 75 Gly Val Ser Gly Val Cys Val Cys Lys Ser Arg Tyr Pro Val Cys 80 85 90 Gly Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Pro Ser Gly Cys Gln Leu Arg Ala 95 100 105 Ala Ser Gln Arg Ala Glu Ser Arg Gly Glu Lys Ala Ile Thr Gln 110 115 120 Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu Gln Gly Pro Ser Ile Val Thr Pro 125 130 135 Pro Lys Asp Ile Trp Asn Val Thr Gly Ala Gln Val Tyr Leu Ser 140 145 150 Cys Glu Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys 155 160 165 Val Lys Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu Leu Leu Pro 170 175 180 Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly Gly Pro Glu 185 190 195 Lys His Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser Pro Leu Ser Lys 200 205 210 Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser Asn Ser Gln Gly 215 220 225 Gln Ala Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His 230 235 240 Glu Ile Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu Leu 245 250 255 256
【０１２０】配列番号 ：２ 配列の長さ：２８２ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Glu Arg Pro Ser Leu Arg Ala Leu Leu Leu Gly Ala Ala Gly -25 -20 -15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp -10 -5 1 Thr Cys Gly Pro Cys Glu Pro Ala Ser Cys Pro Pro Leu Pro Pro 5 10 15 Leu Gly Cys Leu Leu Gly Glu Thr Arg Asp Ala Cys Gly Cys Cys 20 25 30 Pro Met Cys Ala Arg Gly Glu Gly Glu Pro Cys Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Ala Gly Arg Gly Tyr Cys Ala Pro Gly Met Glu Cys Val Lys Ser 50 55 60 Arg Lys Arg Arg Lys Gly Lys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gly Pro 65 70 75 Gly Val Ser Gly Val Cys Val Cys Lys Ser Arg Tyr Pro Val Cys 80 85 90 Gly Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Pro Ser Gly Cys Gln Leu Arg Ala 95 100 105 Ala Ser Gln Arg Ala Glu Ser Arg Gly Glu Lys Ala Ile Thr Gln 110 115 120 Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu Gln Gly Pro Ser Ile Val Thr Pro 125 130 135 140 145 150 Cys Glu Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys 155 160 165 Val Lys Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu Leu Leu Pro 170 175 180 Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly Gly Pro Glu 185 190 195 Lys His Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser Pro Leu Ser Lys 200 205 210 Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser Asn Phe Gln Gly 215 220 225 Gln Ala Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His 230 235 240 Glu Ile Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu Leu 245 250 255 256
【０１２１】配列番号 ：３ 配列の長さ：１１２４ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２３．．８６８ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：２３．．１００ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１０１．．８６８ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GCCGCTGCCA CCGCACCCCG CCATGGAGCG GCCGTCGCTG CGCGCCCTGC TCCTCGGCGC 60 CGCTGGGCTG CTGCTCCTGC TCCTGCCCCT CTCCTCTTCC TCCTCTTCGG ACACCTGCGG 120 CCCCTGCGAG CCGGCCTCCT GCCCGCCCCT GCCCCCGCTG GGCTGCCTGC TGGGCGAGAC 180 CCGCGACGCG TGCGGCTGCT GCCCTATGTG CGCCCGCGGC GAGGGCGAGC CGTGCGGGGG 240 TGGCGGCGCC GGCAGGGGGT ACTGCGCGCC GGGCATGGAG TGCGTGAAGA GCCGCAAGAG 300 GCGGAAGGGT AAAGCCGGGG CAGCAGCCGG CGGTCCGGGT GTAAGCGGCG TGTGCGTGTG 360 CAAGAGCCGC TACCCGGTGT GCGGCAGCGA CGGCACCACC TACCCGAGCG GCTGCCAGCT 420 GCGCGCCGCC AGCCAGAGGG CCGAGAGCCG CGGGGAGAAG GCCATCACCC AGGTCAGCAA 480 GGGCACCTGC GAGCAAGGTC CTTCCATAGT GACGCCCCCC AAGGACATCT GGAATGTCAC 540 TGGTGCCCAG GTGTACTTGA GCTGTGAGGT CATCGGAATC CCGACACCTG TCCTCATCTG 600 GAACAAGGTA AAAAGGGGTC ACTATGGAGT TCAAAGGACA GAACTCCTGC CTGGTGACCG 660 GGACAACCTG GCCATTCAGA CCCGGGGTGG CCCAGAAAAG CATGAAGTAA CTGGCTGGGT 720 GCTGGTATCT CCTCTAAGTA AGGAAGATGC TGGAGAATAT GAGTGCCATG CATCCAATTC 780 CCAAGGACAG GCTTCAGCAT CAGCAAAAAT TACAGTGGTT GATGCCTTAC ATGAAATACC 840 AGTGAAAAAA GGTGAAGGTG CCGAGCTATA AACCTCCAGA ATATTATTAG TCTGCATGGT 900 TAAAAGTAGT CATGGATAAC TACATTACCT GTTCTTGCCT AATAAGTTTC TTTTAATCCA 960 ATCCACTAAC ACTTTAGTTA TATTCACTGG TTTTACACAG AGAAATACAA AATAAAGATC 1020 ACACATCAAG ACTATCTACA AAAATTTATT ATATATTTAC AGAAGAAAAG CATGCATATC 1080 ATTAAACAAA TAAAATACTT TTTATCACAA AAAAAAAAAA AAAA 1124
【０１２２】配列番号 ：４ 配列の長さ：１１２４ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２３．．８６８ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：２３．．１００ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１０１．．８６８ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GCCGCTGCCA CCGCACCCCG CCATGGAGCG GCCGTCGCTG CGCGCCCTGC TCCTCGGCGC 60 CGCTGGGCTG CTGCTCCTGC TCCTGCCCCT CTCCTCTTCC TCCTCTTCGG ACACCTGCGG 120 CCCCTGCGAG CCGGCCTCCT GCCCGCCCCT GCCCCCGCTG GGCTGCCTGC TGGGCGAGAC 180 CCGCGACGCG TGCGGCTGCT GCCCTATGTG CGCCCGCGGC GAGGGCGAGC CGTGCGGGGG 240 TGGCGGCGCC GGCAGGGGGT ACTGCGCGCC GGGCATGGAG TGCGTGAAGA GCCGCAAGAG 300 GCGGAAGGGT AAAGCCGGGG CAGCAGCCGG CGGTCCGGGT GTAAGCGGCG TGTGCGTGTG 360 CAAGAGCCGC TACCCGGTGT GCGGCAGCGA CGGCACCACC TACCCGAGCG GCTGCCAGCT 420 GCGCGCCGCC AGCCAGAGGG CCGAGAGCCG CGGGGAGAAG GCCATCACCC AGGTCAGCAA 480 GGGCACCTGC GAGCAAGGTC CTTCCATAGT GACGCCCCCC AAGGACATCT GGAATGTCAC 540 TGGTGCCCAG GTGTACTTGA GCTGTGAGGT CATCGGAATC CCGACACCTG TCCTCATCTG 600 GAACAAGGTA AAAAGGGGTC ACTATGGAGT TCAAAGGACA GAACTCCTGC CTGGTGACCG 660 GGACAACCTG GCCATTCAGA CCCGGGGTGG CCCAGAAAAG CATGAAGTAA CTGGCTGGGT 720 GCTGGTATCT CCTCTAAGTA AGGAAGATGC TGGAGAATAT GAGTGCCATG CATCCAATTT 780 CCAAGGACAG GCTTCAGCAT CAGCAAAAAT TACAGTGGTT GATGCCTTAC ATGAAATACC 840 AGTGAAAAAA GGTGAAGGTG CCGAGCTATA AACCTCCAGA ATATTATTAG TCTGCATGGT 900 TAAAAGTAGT CATGGATAAC TACATTACCT GTTCTTGCCT AATAAGTTTC TTTTAATCCA 960 ATCCACTAAC ACTTTAGTTA TATTCACTGG TTTTACACAG AGAAATACAA AATAAAGATC 1020 ACACATCAAG ACTATCTACA AAAATTTATT ATATATTTAC AGAAGAAAAG CATGCATATC 1080 ATTAAACAAA TAAAATACTT TTTATCACAA AAAAAAAAAA AAAA 1124
【０１２３】配列番号 ：５ 配列の長さ：２５６ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Ser Ser Asp Thr Cys Gly Pro Cys Glu Pro Ala Ser Cys Pro 1 5 10 15 Pro Leu Pro Pro Leu Gly Cys Leu Leu Gly Glu Thr Arg Asp Ala 20 25 30 Cys Gly Cys Cys Pro Met Cys Ala Arg Gly Glu Gly Glu Pro Cys 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ala Gly Arg Gly Tyr Cys Ala Pro Gly Met Glu 50 55 60 Cys Val Lys Ser Arg Lys Arg Arg Lys Gly Lys Ala Gly Ala Ala 65 70 75 Ala Gly Gly Pro Gly Val Ser Gly Val Cys Val Cys Lys Ser Arg 80 85 90 Tyr Pro Val Cys Gly Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Pro Ser Gly Cys 95 100 105 Gln Leu Arg Ala Ala Ser Gln Arg Ala Glu Ser Arg Gly Glu Lys 110 115 120 Ala Ile Thr Gln Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu Gln Gly Pro Ser 125 130 135 Ile Val Thr Pro Pro Lys Asp Ile Trp Asn Val Thr Gly Ala Gln 140 145 150 Val Tyr Leu Ser Cys Glu Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu 155 160 165 Ile Trp Asn Lys Val Lys Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr 170 175 180 Glu Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg 185 190 195 Gly Gly Pro Glu Lys His Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser 200 205 210 Pro Leu Ser Lys Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser 215 220 225 Asn Ser Gln Gly Gln Ala Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val 230 235 240 Asp Ala Leu His Glu Ile Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu 245 250 255 Leu 256
【０１２４】配列番号 ：６ 配列の長さ：２５６ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Phe Ser Ser Asp Thr Cys Gly Pro Cys Glu Pro Ala Ser Cys Pro 1 5 10 15 Pro Leu Pro Pro Leu Gly Cys Leu Leu Gly Glu Thr Arg Asp Ala 20 25 30 Cys Gly Cys Cys Pro Met Cys Ala Arg Gly Glu Gly Glu Pro Cys 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ala Gly Arg Gly Tyr Cys Ala Pro Gly Met Glu 50 55 60 Cys Val Lys Ser Arg Lys Arg Arg Lys Gly Lys Ala Gly Ala Ala 65 70 75 Ala Gly Gly Pro Gly Val Ser Gly Val Cys Val Cys Lys Ser Arg 80 85 90 Tyr Pro Val Cys Gly Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Pro Ser Gly Cys 95 100 105 Gln Leu Arg Ala Ala Ser Gln Arg Ala Glu Ser Arg Gly Glu Lys 110 115 120 Ala Ile Thr Gln Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu Gln Gly Pro Ser 125 130 135 Ile Val Thr Pro Pro Lys Asp Ile Trp Asn Val Thr Gly Ala Gln 140 145 150 Val Tyr Leu Ser Cys Glu Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu 155 160 165 Ile Trp Asn Lys Val Lys Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr 170 175 180 Glu Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg 185 190 195 Gly Gly Pro Glu Lys His Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser 200 205 210 Pro Leu Ser Lys Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser 215 220 225 Asn Phe Gln Gly Gln Ala Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val 230 235 240 Asp Ala Leu His Glu Ile Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu 245 250 255 Leu 256
【０１２５】配列番号 ：７ 配列の長さ：５５７ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 GGTCATCGGA ATCCCGACAC CTGTCCTCAT CTGGAACAAG GTAAAAAGGG GTCACTATGG 60 AGTTCAAAGG ACAGAACTCC TGCCTGGTGA CCGGGACAAC CTGGCCATTC AGACCCGGGG 120 TGGCCCAGAA AAGCATGAAG TAACTGGCTG GGTGCTGGTA TCTCCTCTAA GTAAGGAAGA 180 TGCTGGAGAA TATGAGTGCC ATGCATCCAA TTTCCAAGGA CAGGCTTCAG CATCAGCAAA 240 AATTACAGTG GTTGATGCCT TACATGAAAT ACCAGTGAAA AAAGGTGAAG GTGCCGAGCT 300 ATAAACCTCC AGAATATTAT TAGTCTGCAT GGTTAAAAGT AGTCATGGAT AACTACATTA 360 CCTGTTCTTG CCTAATAAGT TTCTTTTAAT CCAATCCACT AACACTTTAG TTATATTCAC 420 TGGTTTTACA CAGAGAAATA CAAAATAAAG ATCACACATC AAGACTATCT ACAAAAATTT 480 ATTATATATT TACAGAAGAA AAGCATGCAT ATCATTAAAC AAATAAAATA CTTTTTATCA 540 CAAAAAAAAA AAAAAAA 557
【０１２６】配列番号 ：８ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu Ile Pro Val Lys Lys Gly 1 5 10 15 Glu Gly Ala Glu Leu 20
【０１２７】配列番号 ：９ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ
【０１２８】配列番号 ：１０ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ
【０１２９】配列番号 ：１１ 配列の長さ：５９ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＰＣＲ産物 配列 5'-ATTACGGTGG TTGATGCGTT ACATGAAATA CCAGTGAAAA 10 20 30 40 AAGGCGAAGG CGCCGAATT-3' 50 59
【０１３０】配列番号 ：１２ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 5'-TTGATGCGTTACATGAAATA-3'
【０１３１】配列番号 ：１３ 配列の長さ：２０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 5'-CCTTCGCCTTTTTTCACTGG-3'
【０１３２】配列番号 ：１４ 配列の長さ：８０２ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 GCAGCCGGCG GTCCGGGTGT AAGCGGCGTG TGCGTGTGCA AGAGCCGCTA CCCGGTGTGC 60 GGCAGCGACG GCACCACCTA CCCGAGCGGC TGCCAGCTGC GCGCCGCCAG CCAGAGGGCC 120 GAGAGCCGCG GGGAGAAGGC CATCACCCAG GTCAGCAAGG GCACCTGCGA GCAAGGTCCT 180 TCCATAGTGA CGCCCCCCAA GGACATCTGG AATGTCACTG GTGCCCAGGT GTACTTGAGC 240 TGTGAGGTCA TCGGAATCCC GACACCTGTC CTCATCTGGA ACAAGGTAAA AAGGGGTCAC 300 TATGGAGTTC AAAGGACAGA ACTCCTGCCT GGTGACCGGG ACAACCTGGC CATTCAGACC 360 CGGGGTGGCC CAGAAAAGCA TGAAGTAACT GGCTGGGTGC TGGTATCTCC TCTAAGTAAG 420 GAAGATGCTG GAGAATATGA GTGCCATGCA TCCAATTCCC AAGGACAGGC TTCAGCATCA 480 GCAAAAATTA CAGTGGTTGA TGCCTTACAT GAAATACCAG TGAAAAAAGG TGAAGGTGCC 540 GAGCTATAAA CCTCCAGAAT ATTATTAGTC TGCATGGTTA AAAGTAGTCA TGGATAACTA 600 CATTACCTGT TCTTGCCTAA TAAGTTTCTT TTAATCCAAT CCACTAACAC TTTAGTTATA 660 TTCACTGGTT TTACACAGAG AAATACAAAA TAAAGATCAC ACATCAAGAC TATCTACAAA 720 AATTTATTAT ATATTTACAG AAGAAAAGCA TGCATATCAT TAAACAAATA AAATACTTTT 780 TATCACAAAA AAAAAAAAAA AA 802
【０１３３】配列番号 ：１５ 配列の長さ：１００ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys Val Lys 1 5 10 15 Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu Leu Leu Pro Gly Asp 20 25 30 Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly Gly Pro Glu Lys His 35 40 45 Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser Pro Leu Ser Lys Glu Asp 50 55 60 Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser Asn Phe Gln Gly Gln Ala 65 70 75 Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu Ile 80 85 90 Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu Leu 95 100
【０１３４】配列番号 ：１６ 配列の長さ：１８２ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Ala Gly Gly Pro Gly Val Ser Gly Val Cys Val Cys Lys Ser 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Val Cys Gly Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Pro Ser Gly 20 25 30 Cys Gln Leu Arg Ala Ala Ser Gln Arg Ala Glu Ser Arg Gly Glu 35 40 45 Lys Ala Ile Thr Gln Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu Gln Gly Pro 50 55 60 Ser Ile Val Thr Pro Pro Lys Asp Ile Trp Asn Val Thr Gly Ala 65 70 75 Gln Val Tyr Leu Ser Cys Glu Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val 80 85 90 Leu Ile Trp Asn Lys Val Lys Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg 95 100 105 Thr Glu Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr 110 115 120 Arg Gly Gly Pro Glu Lys His Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val 125 130 135 Ser Pro Leu Ser Lys Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala 140 145 150 Ser Asn Ser Gln Gly Gln Ala Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val 155 160 165 Val Asp Ala Leu His Glu Ile Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala 170 175 180 Glu Leu
【０１３５】配列番号 ：１７ 配列の長さ：２９ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 5'-CTGGTCGACGGATCCCGGGTACCAGCACA-3'
【０１３６】配列番号 ：１８ 配列の長さ：２９ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 (5'-CTGGTACCCGGGATCCGTCGACCAGCACA-3')
【０１３７】配列番号 ：１９ 配列の長さ：８ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【０１３８】配列番号 ：２０ 配列の長さ：２５ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile Trp Asn Lys Val Lys 1 5 10 15 Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu 20 25
【０１３９】配列番号 ：２１ 配列の長さ：１８ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly 1 5 10 15 Gly Pro Glu
【０１４０】配列番号 ：２２ 配列の長さ：１９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Cys His Ala Ser Asn Ser Gln Gly Gln Ala Ser Ala Ser Ala Lys 1 5 10 15 Ile Thr Val Val 19
【０１４１】配列番号 ：２３ 配列の長さ：７ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【０１４２】配列番号 ：２４ 配列の長さ：７ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【０１４３】配列番号 ：２５ 配列の長さ：１６ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Glu Leu Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr 1 5 10 15 Arg
【０１４４】配列番号 ：２６ 配列の長さ：４ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【０１４５】配列番号 ：２７ 配列の長さ：１２ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Ala Ile Thr Gln Val Ser Lys Gly Thr Xaa Glu 1 5 10
【０１４６】配列番号 ：２８ 配列の長さ：１７ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Xaa Glu Pro Xaa Gly Gly Gly Gly Ala Gly Arg Gly Tyr Xaa Ala 1 5 10 15 Pro Gly
【０１４７】配列番号 ：２９ 配列の長さ：１２ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gln Gly Pro Ser Ile Val Thr Pro Xaa Lys Asp Ile 1 5 10
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＣＯＳ発現ベクターｐＭ９５３を説明する模
式図である。
【図２】 ＣＨＯ発現ベクターｐＭ９５４を説明する模
式図である。
【図３】 ゲル電気泳動の結果を示す図面代用写真であ
って、ｐＭ９５３／ＣＯＳ細胞培養上清精製サンプルの
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図４】 ＤＥＡＥ−５ＰＷ陰イオン交換クロマトグラ
フィーによる溶出パターンを示すグラフである。
【図５】 ヘパリン−５ＰＷアフィニティークロマトグ
ラフィーによる溶出パターンを示すグラフである。
【図６】 プロテイン−パックゲルろ過カラムクロマト
グラフィーによる溶出パターンを示すグラフである。
【図７】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる実験結果を示す模式
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/435 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】配列表の配列番号１または２記載のアミノ
    酸配列をコードする塩基配列の一部または全部を含有す
    るＤＮＡ。
  2. 【請求項２】配列表の配列番号３または４記載の塩基配
    列の一部または全部を含有するＤＮＡ。
  3. 【請求項３】請求項１または２のいずれかに記載のＤＮ
    Ａと相補的な塩基配列を有するＤＮＡ。
  4. 【請求項４】請求項１ないし３のいずれかに記載のＤＮ
    Ａを含有するベクター。
  5. 【請求項５】請求項１ないし３のいずれかに記載のＤＮ
    Ａを含有する形質転換体。
  6. 【請求項６】請求項４に記載のベクターで形質転換され
    た形質転換体。
  7. 【請求項７】宿主細胞が、ＣＯＳ細胞である請求項５記
    載の形質転換体。
  8. 【請求項８】宿主細胞が、ＣＨＯ細胞である請求項５記
    載の形質転換体。
  9. 【請求項９】配列表の配列番号１または２記載のアミノ
    酸配列の一部または全部を含有する蛋白質。
  10. 【請求項１０】前記アミノ酸配列の一部を含有する蛋白
    質が成熟蛋白質である請求項９記載の蛋白質。
  11. 【請求項１１】血管内皮細胞に作用し、該細胞からのプ
    ロスタグランジンＩ2 （ＰＧＩ2 ）の産生を刺激する活
    性を有する請求項９または１０に記載の蛋白質。
  12. 【請求項１２】請求項５ないし８のいずれかに記載の形
    質転換体を培養することからなる請求項９ないし１１の
    いずれかに記載の蛋白質の製造方法。
  13. 【請求項１３】請求項９ないし１１のいずれかに記載の
    蛋白質の一部または全部を抗原として得られる抗体。
  14. 【請求項１４】請求項１３に記載の抗体を用いる請求項
    ９ないし１１のいずれかに記載の蛋白質の免疫学的測定
    方法。
  15. 【請求項１５】請求項９ないし１１のいずれかに記載の
    蛋白質を有効成分として含有することを特徴とする、下
    記疾患のいずれか少なくとも１つの疾患に対する治療用
    医薬組成物。溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性
    紫斑病、末梢動脈閉塞、心虚血、脳虚血、動脈硬化、脳
    閉塞、高脂血症、糖尿病、心不全、狭心症、虚血性心疾
    患、うっ血性心疾患、脈絡膜循環障害、気管支疾患、胃
    潰瘍、妊娠子癇。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP1140137A2 (en) * 1998-12-18 2001-10-10 Scios Inc. Method for detection and use of differentially expressed genes in disease states
EP1524524A1 (en) * 1998-12-18 2005-04-20 Scios Inc. Methods for detection and use of differentially expressed OSF-2 in diagnosis of cardiac hypertrophy
US7109030B2 (en) 2000-03-31 2006-09-19 Nuvelo, Inc. Methods of therapy and diagnosis using insulin-like growth factor binding protein-like polypeptides and polynucleotides
WO2001073022A1 (fr) * 2000-03-29 2001-10-04 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Gene associe a la glomerulonephrite proliferative
JPWO2002081515A1 (ja) * 2001-04-03 2004-07-29 協和醗酵工業株式会社 インスリン様増殖因子結合蛋白質
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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