JPH02288897A - 内皮細胞増殖因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 血小板由来内皮細胞増殖因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｔｈ
ｒｉｖｅｄｇｎｄｏｔｈｅｌｔａｌ　　ｃａｌｌ　ｇｒ
ｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ＋ＦＤＥＣＧＦ’ｆｉま、ヒト
血小板から均一にまで精製されたところの４５ＫＤαの
内皮細胞マイトジェンである。それは繊維芽細胞増殖因
子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏ
ｒ。

ＥＧＦ）ファミリーの他の内皮細胞マイトジェンと異な
り、ヘパリンに結合しないと共に繊維芽細胞の増殖の刺
激もしない。ＦＤ−ＥＣＧＦは、ヒト血小板中に見出さ
れる唯一の内皮細胞増殖因子のようであり、最近のデー
タは、それがｉｎ　ｖｉｔｒｏで脈管形成活性、すなわ
ち、１ｎｖｉｔｒｏで新しい血管の形成を刺激する能力
及びケモタクテイツク活性を持っていることを示してい
る。本発明は、均一なＰＤ−ＥＣＧＦを実質的に過去の
いかなるものよりもより高い収量で提供すると共に、Ｆ
Ｄ−ＥＣＧＦの一次構造、ＰＤ−ＥＣＧＦに対する抗体
、ＦＤ−ＥＣＧＦのｃＤＮＡのクローン及びそのＦＤ−
ＥＣＧＦの異体を提供する。本発明はまたＦＤ−ＥＣＧ
Ｆ’ｒ：含有する治療用組成物を提供する。

（発明の背景及び従来技術） ポリペプチドの増殖因子を＼正常の細胞の過程及び病的
状態の双方に関係したターゲット細胞の増殖刺激におい
て重要な役割を演じている。細胞増殖の関与した過程の
例としては、例えば表皮組織の置き換わり過程や免疫応
答系があげられる。失血を防ぐところの止血過程は、血
管組織の定常的に置き換えが必要であるような連続的な
プロセスである。血管の内皮細胞の増殖は、脈管の形成
、特に血管の形成、傷口の治癒、動脈硬化、特にアテロ
ーム性動脈硬化及び腫瘍の増殖のような各種の生理的過
程及び病的過程において中心的な役割をはたしている。

血管が傷害を受けた場合には、止血をなすため一連の複
雑な過程が引き起こされる。先ずその傷害に応答して血
小板による血栓過程が活性化され、次に血液凝固過程が
なされ、最終的に傷害を受けた組織が再び増殖して修復
されることになる。この最終ステップは、適切な時に、
適切な場所でそして適切な組織で活性化されなければな
らない。ポリペプチドの増殖因子の一つの役割は、この
反応を適切な時に組織特異的に媒介することである。

ペプチド及びポリペプチドの増殖因子は、多くのものを
原料として単離されてさた。

これら原料としては、上皮細胞組織、神経組織（ｎｅｕ
ｔｒａｌｔｉｎｓ％Ｃ〕、血小板、胎絃組織及びその他
のものがあげられる。これらのペプチド及びタンパク質
のファクターは、ターゲットセルに対する特異性、ヘパ
リンとの親和性またはヘパリンとの反応性、分泌性、そ
して分子量、荷電状態、熱安定性、ｐＨに対する感受性
及び還元剤に対する応答性のような物理化学的特性をは
じめとした各種の性質によって区別される。

内皮細胞の増殖は、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）とし
て知られる一群のポリペプチドの増殖因子によって刺激
される。これらのマイトジェン様因子は、ヘパリンに対
する結合性で特徴づけられている。ヘパリンは、循環系
中に僅かな量普通に見出される強力な抗血液凝固剤であ
る。そのＦＧＦは二種の異なったクラスのタンパク質、
すなわち酸性のものと塩基性のものに区分けされ、神経
組織及び他の組織のうちで固定されてきた（Ｂａｉｒｄ
　ｇｔ　　ｃｃｊ、、１９８６；’Ｌｒｏｂｂ　　ａｔ
　　ａｔ、、１９８６　’、Ｔｈｏｍａｓ　　ａｔ　　
ｃＬｌ、１９８６）。

最近、新鮮なヒト血小板由来の他の公知のポリペプチド
の増殖因子と明らかに異なるところの新規なポリペプチ
ドの増殖因子によって内皮細胞の増殖が刺激されること
が示された（Ｍｉｙａｔｏｓｏ　　ａｔ　　ａｌ、＋１
９８５ａ　、　ｂ　）。この因子はもともとは血管内皮
細胞増殖因子（ｖａｓｅｘｌａｒｇｎｄｏｔｈｇｌｉａ
ｌ　　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｆａｃ
ｔｏｒ）と呼ばれたが、後に血小板由来内皮細胞増殖因
子（ＰＤＥＣＧＦ）と改称された。

血小板は、各種の造血組織及びその他の組織に対する増
殖因子に富んだ原料である。これまで同定され、その特
性が示されている血小板由来増殖因子には、繊維芽細胞
及び血管の平滑筋細胞の増殖を刺激するが、内皮細胞に
は何の作用も及ぼさない血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ
）；上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）に密接に関係し、上皮
細胞の増殖を刺激するが内皮細胞の増殖は刺激しないト
ランスホーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）；ＥＧＦ
の存在下に繊維芽細胞の増殖を相乗的に刺激し、さらに
内皮細胞の増殖を阻害する能力を持つトランスホーミン
グ成長因子−β（ＴＧＦ−β）；肝細胞増殖因子；そし
て本発明の目的物である血小板由来内皮細胞増殖因子（
ＦＤ−ＥＣＧＦ）があげられる。

Ｍｔｙａｚｏｓｏ　　ａｔ　　ａｌ、　（１９８７）に
よって増殖促進活性は部分的に精製され、その特性が示
されている。次のような性質が従来同定された増殖因子
の活性とは区別するのに使用せられる； 培養せられたブタ血管内皮細胞を、新鮮なヒト血小板の
可溶性ライゼートで処理すると、その量に応じてＤＮＡ
中への３Ｈ・チミジンの取り込みを刺激する。該血小板
ライゼートは、１チ胎児牛血清で処理されたコントロー
ルカルチャーよりも約１００％細胞の増殖を促進させへ
そのライゼートを分画すると、活性はＳｇｐｈａｄｅｚ
　Ｇ　−７５ゲルテ過カラムのＭｙ　２０，０００の領
域に現われ、ブタ血管内皮細胞で３ＨチミジンのＤＮＡ
内への取り込みを刺激するが、ＮＨＫ繊維芽細胞ではそ
のようなことはなく；同じカラムにかげた時Ｍｒ　３０
，０００のところにあって、繊維芽細胞は刺激するが内
皮細胞は刺激しないところのＰＤＧＦとは多分に明確に
異なっており；古くなった血小板からよりもむしろ新鮮
な血小板から調製されるとより活性があり：熱及び酸に
よって容易に変化をうけ；還元剤ジチオスレイトールに
抵抗性を有し；トリプシン、グアニジニウムＭＣＩＩＩ
び尿素（後２者は変性剤である）に感受性であることが
示された。これらの特性にもとすいて、その増殖促進活
性は、ヒト血小板において以前に同定されているいかな
るものとも明確に異なるポリペプチド増殖因子であると
結論づけられた。

脈管形成（あるいは血管形成）とは、既存の血管から新
しい毛細血管を芽を出すように形成する現象のことであ
る。

それは傷の治癒及び腫瘍の生育にあたり重要な過程であ
る。

ある橿のポリペプチド因子が、内皮細胞に対するマイト
ジェン作用あるいはケモタクティック作用によってこの
過程を刺激することが示されている。

マイトジェンとは、細胞の増殖を刺激する物質のことで
、それは通常ホルボールエステル類、ポリサッカライド
ペプチド、タンパク質またはそれらの配合物のような小
さな分子であるものである。タキシスＣＴａｘｉｓ）と
は、その周囲の状況に応答しての細胞の指向性の移動の
ことである。このようにケモタキシス（ｃｈｇｔｐｈｏ
ｔａｚｉａ）とは囲りにある化学物質に応答する反応で
ある。真核細胞に関しては、公知のケモタクテイツク因
子としては、ヒスタミン、アミノ酸、ペプチド及びタン
パク質があげられる。

血管形成反応を起こさせるところのポリペプチド因子と
しては、ＦＧＦ類、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ツウモア
ヌクレオシスファクター（ＴＮＦ）及びアンギオゲニン
（Ｆｏｌｋｔｎａｎ　ｇｔ　　ａｌ、、　１９８７ａ　
、　ｂ　：ＦｒａｔｍｒＳｃｈｒｏｄａｒ　ａｔ　　ａ
ｌ、、　１９８７　：Ｌａ１ｂｏｖｉｃｈ　ｇｔ　　ａ
Ｌ、＊１９８７）があげられる。これらの因子は、広範
囲の各種のタイプの細胞に複数の作用を示す。これらの
ファクタと異なり、ヒト血小板由来内皮細胞増殖因子は
、内皮細胞を特異的に刺激する。

比較的大きな血管の内側にある内皮細胞の増殖は、傷害
を受けた内皮の再生にとって重要であり、多分動脈硬化
症の予防において役割をはたしている。動脈硬化症、特
にアテローム性動脈硬化症（＼　リビッドに富んだ病変
あるいはプラークが血管上にひろがるような症状であり
、無数の血管の病気に導び（ものである。内皮細胞層に
おける変化が、そのアテローム性動脈硬化のはじめに起
こることであると考えられている。血小板は傷害を受け
た内皮細胞に付着し、マイトジェンを放出して内皮細胞
及び平滑筋細胞双方の再生を刺激する。ＦＤ−ＥＣＧＦ
は、それら放出されるマイトジェンの一つである。

＝２０− 血小板数の減少にともなった病気、例えば血小板減少症
においては、ＦＤ−ＥＣＧＦや他の血小板マイトジェン
及びケモタクテツク因子を提供することは病気治療の上
で有用である。またある種の薬は血小板の破壊をもたら
したり、血小板を抑制したりする。かくして、薬物での
治療の際に血小板マイトジェンを補ぎなうことは副作用
を抑えることになる。

ＦＤ−ＥＣＧＦの現在の原料は新鮮なヒト血小板であり
、このタンパク質を多量に精製して得ることを高価なも
のとしており、さらにヒト血液は感染性の物質が含まれ
る可能性があり、危険が太きい。ＦＤ−ＥＣＧＦは、熱
によって変化を受は易いので、従来の血液の殺菌法ある
いは無菌化法ではその活性が破壊される。更なる研究の
ための大量のＦＤ−ＥＣＧＦを得るため及び、治療に使
用できる量を供給するためには、より容易に利用できる
原料が望まれている。

該ＦＤ−ＥＣＧＦ遺伝子のクローニングは発現ベクター
の構築を可能にし、その発現ベクターは大量のＦＤ−Ｅ
ＣＧＦを得ることを可能にする。

組換えＤＮＡ技術は確立されたものである。無数のマニ
ュアルが利用可能であり、遺伝子をクロー二／グするに
あたっての手段方法がその中で解説されているけれども
、多くのことが予測できないこととして残されている：
未だ必ずしも成功が約束されているものでもない。各ク
ローニングの実験においてはそれぞれ特定の問題がある
。真核細胞の遺伝子をクローニングするにあたっての典
型的な方法は、ｒｎ　ＲＮ　Ａを単離し、それをｃ　Ｄ
　Ｎ　Ａに逆転写し、そのｃＤＮＡを複製可能なベクタ
ーに挿入し、適当な宿主をその構築物でトランスホーム
し、所望のクローンを機能活性あるいは相補性といった
ような多くの方法のいずれか及び抗体あるいはオリゴヌ
クレオチドを用いたスクリーニングで同定する。ある種
の真核細胞の遺伝子に特有な問題は、所望の遺伝子生産
物を発現している分化あるいは進化の状態にある組織を
見出すこと、すなわち、所望の遺伝子からの、４ＲＮＡ
を得ることにある。ＰＤ−ＥＣＧＦ源の血小板は、核の
ない細胞であり、１）ＨＡもｔｎ　ＲＡ’　Ａも含有し
ていない。それゆえ、ＰＤ−ＥＣＧＦの遺伝子をクロー
ン化するためには、ＦＤ−ＥＣＧＦを産生ずる組織また
は培養セルラインを見出す必要がある。

本発明は、均一な血小板由来内皮細胞増殖因子及び新鮮
なヒト血小板から均一な程度までそのものを精製するた
めの改良された方法を含むものである。ＰＩ）−ＥＣＧ
Ｆは、４５ＫＤａＬの内皮細胞マイトジェンで、それは
ＦＧＦファミリーに属する他のクラスの内皮細胞マイト
ジェンと異なり、ヘパリンに結合しないと共に繊維芽細
胞の増殖を刺激しない。ＰＤ−ＥＣＧＦは、脈管、特に
血管形成活性及びケモタクテイック活性を有する。利用
可能なＰ　Ｄ　−ＥＣＧＦを比較的大量に得、部分的な
アミノ酸配列をトリプシン処理したフラグメント並びに
Ｖ８−プロテアーゼ及びＣＮＢ　ｒで誘導せられたフラ
グメントから得ることができる。本発明は、ＰＤ−ＥＣ
ＧＦのタンパク質分解により得たフラグメント及びＰＤ
−ＥＣＧＦ及びその変異体のアミノ酸配夕０を得るため
のそれらの使用法を提供する。本発明のＦＤ−ＥＣＧＦ
しま、ＰＤ−ＥＣＧＦの変異体を与える。

本発明は、組換え血小板由来内皮細胞増殖因子を包含す
るポリペプチドに関する。

本発明は、更に血小板由来内皮細胞増殖因子に対する抗
体に関する。

更に、本発明は、血小板由来内皮細胞増殖因子の組換え
ＤＮＡ分子またはｃ、ＤＮＡ分子を含む核酸分子に関す
る。

本発明は、また咽乳動物の血小板由来内皮細胞増殖因子
を活性成分として含有する傷病、動脈硬化症、脈管形成
症あるいは血小板減少症治療用組成物に関する。

本発明は、更に、血小板ライゼートを陽イオン交換クロ
マトグラフィーにかけ、得られた活性フラクションを陰
イオン交換クロマトグラフィーにかけ、得られた活性フ
ラクションを硫酸アンモニウム（硫安）分画にかけ、得
られた活性フラクションを陰イオン交換クロマトグラフ
ィーにかけ、得られた活性フラクションをハイ・パーフ
ォーマンス（高性能）ヒト頴キシアパタイトカラムクロ
マトグラフィーにかけ、得られた活性フラクションを、
−・イ・パーフォ−ランス疎水性カラムクロマトグラフ
ィーにかけ、均一な血小板由来内反細胞増殖因子を回収
することからなる血小板ライゼートからの均一な血小板
由来内皮細胞増殖因子の精製法に関する。

血管の内皮細胞は、血液とそこに横たわる組織との間の
機能的な単層を形成している。正常な血管壁では、内皮
細胞は生育休止状態にあることが知られ℃いる。内皮細
胞の増殖は、傷の修復、血栓症、アテローム動脈硬化症
及び腫瘍の生育のような生物学的プロセスの多くにおい
て中心的なコンポネントである。このように、内皮細胞
の増殖を制御する因子は、これらの条件で主要な役割を
演じている。

血管の形成を刺激する能力を有する因子は、通常の悪性
腫瘍組織の血管形成における原因物質とみられている。

そしてこれはＦｏｌｋｓｍａｎ及びＫｌａｇｓｂｓｒｎ
　（１９８７α）によって考察されている。このカテゴ
リーにはいる最もよく特性が示されている因子は、ＦＧ
Ｆ類で、もともとは神経組織から単離された一群のヘパ
リン結合性の内皮細胞マイトジェンであるが、マクロフ
ァージ及び他の組織でも見出される。別の内反細胞マイ
トジェンが、ＦＤ−ＥＣＧＦである。

ＰＤ−ＥＣＧＦ増殖促進活性は、内皮細胞におい−ｃ３
ＨチミジンのＤＮＡ内への取り込みを測定することによ
りアッセイされる。アッセイに使用される代表的な細胞
は、ブタ大動脈内皮細胞（ｐｏｒｃｉｎｅ　ａｏｒ百ｃ
　　ｇｎｄｏｔｈｅＬｉａｌｃａｌｌ）及びウシ大動脈
内皮細胞であり、ヒトの屓帯内皮細胞もＰＤ−ＥＣＧＦ
によって刺激をうける。他の確立され、培養されている
内皮細胞セルラインがアッセイにおいて使用できるが、
ブタ大動脈細胞が通常のアッセイにおいては好ましい。

ＰＤ−ＥＣＧＦの増殖促進活性はまた、細胞の増殖度を
測定してアッセイできる。このアッセイにおいては、新
鮮な細胞を培地にプレートし、実際に存在する細胞数を
、ＰＤ−ＥＣＧＦ処理してないコントロールのそれと比
較測定する。この方法に適した培養セルラインは、３Ｂ
−チミジン取り込みアッセイ法において記載したような
ものと同じものがあげられる。

ＦＧＦカルチャーにおいてアッセイした場合には、ＰＤ
ＥＣＧＦはＤＮＡ中への３Ｂ−チミジンの取り込みを刺
激もしないし、細胞の増殖を誘導もしない。

血小板、特にヒト血小板がらのＰＤ−ＥＣＧＦは、極（
僅かな量が精製化された（Ｍｉｙａｚｏｎｏ　　ａｔ　
ａｌ、Ａ９８７）０それが４５ＫＤａｌのポリペプチド
であり、熱及び酸により変化を受は易（、ジチオスレイ
トール及びその他のような還元剤に抵抗性であり、タン
パク質分解処理、特にトリプシン及び池のセリンプロテ
アーゼ、及び艮（その性質がわかつ℃いる多くのプロテ
アーゼのいずれに対しても感受性であるということを特
徴づけることはとてもできなかった。

大量の純粋なＰＤ−ＥＣＧＦを利用可能としたことによ
り、少くとも部分的なアミノ酸配列を得ることを可能と
し、その遺伝子のクローニングを可能とした。

ＰＩ）−ＥＣＧＦは血小板中には少量あるのみであり、
その生物活性は、熱及び酸で変わり易いことから、ＰＤ
ＥＣＧＦの精製は難しいことである。Ｍｉｙａｚｏｎｏ
　　ａｔａＬ、（１９８７）によって記載された方法は
、慣用のクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラ
フィー（ＦＰＬＣ）の両方を用いた７段の工程のもので
ある。

本発明は、より高い純度と実質的により大きな収量でＰ
Ｄ−ＥＣＧＦを得るための改良された精製法を意図した
ものである。

本発明の精製法は、ＰＤＧＦ精製における血小板ライゼ
ートの副生フラクションを出発原料とするものである。

このフラクションは、ＣＭ　−５ｅｐｈａｄｅｚ上の陽
イオン交換クロマトグラフィーによって得られるもので
ある。最初のステップは、バッチでＱＡＥ　−５ｅｐｈ
ａｄｔｒｘの陰イオン交換クロマトグラフィー処理する
ものである。次に、プールされたフラクションを硫酸ア
ンモニウム沈殿法で約４２％の飽和度で濃縮する。第３
ステツプは、ＤＥＡＥ−５６ｐｈ（Ｌｒ０８−　上での
陰イオン交換クロマトグラフィ処理である。次の３つの
ステップは、１−べてクロマトグラフィー処理であり、
それはヒドロキシアパタイト上の吸着クロマトグラフィ
ー、ＦＰＬＣ系（Ｐｈａｒｍａｃｉ（Ｌ）を備えたＭｏ
７１ｏ　Ｑ　　カラム上の陰イオン交換クロマトグラフ
ィー及びＴＳＫ−Ｇ４０００ＳＷカラム上のケルｐ過を
含むものである。

最終のステップは、Ｓｒｂｐｅｒｏｓｇ　　１２カラム
上の疎水性相互作用クロマトグラフィーである。

本発明は、好ましくは５つのステップで約１，２５０．
０００倍精製すると共に約１４％の収率を得るところの
より少ない工程で、より迅速な方法でＰＤ−ＥＣＧＦの
精製スる方法に向けられたものである。

本方法は、ＤＥＡＥ　−Ｓｅｐｈａｒｏｓｇ　　陰イオ
ン交換クロマトグラフィーまでは上記した方法と同じも
のである。他の精製法の改変はこの工程までは可能であ
る。例えば、血小板ライゼートは新しく調製されること
ができ、ＰＤＧＦのような別の因子の精製にあたっての
副生フラクションである必要はない。上記のようにして
使用されるクロマトグラフィー用樹脂は、精製法に好ま
しいものであるが、他の同等の市販されている樹脂を代
わりに用いて相当する結果が得られる。硫酸アンモニウ
ム沈殿法も約４２％飽和度で行なわれる；しかしながら
、当業者は、最大波のＰＤ−ＥＣＧＰ’活性を沈殿させ
るのに必要な童に容易にその量を合わせることができる
。

精製方法のうちの改良点は、多くのステップのうちで還
元処理があることで、続いて１）ＥＡＥ　−Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｇ　隈イオン交換クロマトグラフィーを行ない、
セして１ｉＰＬｃ。

ＦＬＰＬＣ等で行なわれるところのより迅速なりロマト
グラフイー分離法によってその方法をスピードアップさ
れる。

本方法は、以前に利用しうろよりもより託い収率そし℃
より高い生物活性を示す均一なＥＣＧＦを提供すること
である。

特に、ＤＥ　ＡＥ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅ工程から得ら
れるフラクションはプールされ、ヒドロキシアパタイト
のハイ・パーホーマンス親和クロマトグラフィーにかげ
られる。これは続い℃ハイ・パーホーマンノ疎水性相互
作用クロマトグラフィーを用いての最終精製法にかけら
れる。このステップで好ましい樹脂はアルキル−５ｒｂ
ｐａｒｏｓｅであるが、他の疎水性樹脂も使用できる。

そのような１１脂は市販品から入手しうる。当業者は容
易に他の適当な樹脂を選択して決めることができる。

本発明は、さらに、ＰＤ−ＥＣＧＦに対する抗体にも間
開する。抗体は、ＰＤ−ＥＣＧＦを発現している組織あ
るいは細胞源を同定するのに有用である。これは血小板
は脱核細胞であるのでタンパク質発現のためのＤＮＡを
含有し℃いないからである。抗体はポリクローナルでも
モノクローナルでもよく、いずれも公知の方法により作
製しつる。

本発明の抗体は、均一な内皮細胞増殖因子、均一なＰＤ
−ＥＣＧＦあるいは組換えＰＤ−ＥＣＧＦに対して作製
される。内皮細胞増殖因子又はＰＤ−ＥＣＧＦ源とし℃
は咽乳動物あるいはヒトからのものでよく、抗体を作製
するのに適当な程度にまで精製される。ポリクローナル
抗体は、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ゲラ菌類において、純
粋なあるいは部分的に精″！ＲされたＦＤ−ＥＣＧＦを
動物に注射して作製される。所定の一連の注射の後、動
物から血清を得、所望の抗体の存在をテストする。ＰＤ
−ＥＣＧＦに対するポリクローナル抗体の同定法として
は、イムノブロツテイング、ＥＬＩＳＡ、オータロ＝　
−（ＯｗｃｈｔｔｒｒＬ−ｏｎｙ）拡散アッセイ法、ラ
ジオイムノアッセイ法及び当該分野で良く知られた他の
方法があげられる。（参照、例えば、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ
ｅｅｔ　ａｔ、、１９８２） イムノブロッティングの場合には、純粋なＦ　Ｄ　−Ｅ
Ｃ’ＧＦは、５ＤＳ−アクリルアミドゲルにかげられ、
次に適当な緩衝液中で電気泳動的にトランスファーして
ニトロセルロースに移す。残りのタンパク質の結合サイ
トを牛血清アルブミン、Ｔｗｓａｎ−２０、脱脂ドライ
ミルク、及びゼラチンまたは他のブロッキング試薬を含
有するブロッキング試薬のいずれかでブロックした後、
プロットを試験されるべき抗血清で処理する。次に１２
５Ｉ−プロティンＡとオートラジオグラムあるいは酵素
結合第二抗体と酵素の基質でそれで処理すると可視性の
色または螢光を与えるもののような検知手段により結合
した抗体を検知する。

ＰＤ−ＥＣＧＦに対するモノクローナル抗体は公知の方
法で作製することができる。この方法のアウトラインは
、純粋（または部分的に純粋）なＰＤ−ＥＣＧＦをマウ
スに注射し、その抗原に対する反応を高めた後に肺臓を
取り出し、その抗体産生肺臓細胞とミエローマ細胞セル
ラインとを融合し、得られたハイブリドーマ培養液をス
クリーニングしてＰＤ−ＥＣＧＦと反応する抗体を産生
ずるハイブリドーマを選別することからなる。そのスク
リーニング法としては、上記したイムノブロッティング
を用いるのがあげられる。別の方法としては、ドツトブ
ロッティング法またはＦＤ−ＥＣＧＦを含有する組織ま
たは細胞の免疫螢光法によって行なうことができる。

本発明は、内反細胞増殖因子の遺伝子をコードする核酸
を提供する。該核酸はＤＮＡまたはＲＮＡ分子で、特に
好ましくは相補的なりＩＶＡ分子（ｃＤＮＡ）でありう
る。該ｃＤＮＡ分子は、哺乳動物またはヒトの内皮細胞
増殖因子をコードするヌクレオチド配列を含有するもの
である。更には、該ｃ　Ｉ）　＃　Ａは、哺乳動物又は
ヒトのＰＤ−ＥＣＧＦをコードするヌクレオチド配列を
含むものである。該ヌクレオチド配列は、ヒト胎盤ＰＤ
−ＥＣＧＦのアミノ酸から誘導することができるか、あ
るいはヒト血小板ＰＤ−ＥＣＧＦのアミノ酸配列から誘
導することができる。ＰＩ）−ＥｃＧＦは、胎盤からの
ものと１０個のアミノ酸だけ及び４７１番目のロイシン
がセリンに唯一個変化している点で異なる。

ＰＤ−ＥＣＧＦをクローニングするためには、核のない
ところの細胞である血小板がＰＩ）−ＥＣＧＦの主な原
料であることからＰＤ−ＥＣＧＦを発現し℃いるセルラ
インまたは組織から−ＲＮＡ＠を同定することが必要で
ある。い（つかの造血細胞セルラインについて、ポリク
ローナル抗体またはモノクローナル抗体と、これら組織
の抽出液のイムノブロッティングを用いてＰＩＪ）−Ｅ
ＣＧＦの存在をテストする。造血細胞は血小板に関連性
があるのでそれらが同様にＦＤ−ＥＣＧＦを産生じてい
るであろうと期待される；しかしながら、調べたセルラ
インのうちにはＰ　Ｄ　−ＥＣＧＦを産生しているもの
は一つもなかった。同様にして、ヒト胎盤組繊をテスト
し、ＰＤ−ＥＣＧＦの発現を見出した。

ポリクローナル抗体は、他の哺乳動物からのＰ　Ｄ　−
ＥＣＧＦと交差反応することが期待される。こうして、
ヒト及び哺乳動物からの他の組織はこれらの方法によっ
て簡単にテストされて、ＰＤ−ＥＣＧＦを発現し℃いろ
か否かそしてＰＤ−ＥＣＧＦ遺伝子をクローニングする
ための濯ＲＮＡ源となるか否かを決めることができる。

精製されたｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡ　　は公知の方法
で単離される。ＨａｎＣ１９８７）の方法はそのような
方法の一つであり、他の方法は組換えＤＮＡ技術の標準
的な実験マニュアルのうちに探し出すことができる。

選択されたｍＲＮＡは、逆転写酵素（リバーストランス
クリプターゼ）を用いてｃＤＮＡ分子に転写され、第一
の鎖を作製し、ターミナルトランスフェラーゼでもって
オリゴ（ｄＧ）のティリングをし、オリゴ（ｄＣ）プラ
イヤーによるプライム処理により二重鎖分子を完成する
。クローニング用のｃＤＮＡを作製するための別の方法
は、組換えＤＮＡ技術の標準的な実験マニアルのうちに
探し出すことができる。

該ｃＤＮＡは、バタテリオファージ誘導体、特に好まし
くは、ラムダ７アージベクターを包含していてよい複製
可能なベクター中に挿入され、そのようなベクターとし
てはλｇｔ１０及びλｇｔｌｌが含まれるがそれには限
定されない。

所望のクローンは多くの方法により検知しうる。λｇｔ
１１のような複ｊ！！可能な発現ベクターがクローニン
グに使用された場合には抗体を使用することができる。

放射能で標識化されたオリゴヌクレオチドは所望の遺伝
子を同定するのに有用である。オリゴヌクレオチドの配
列は、Ｌａｔｈｅ（１９８５）の方法によっであるいは
与えられたアミノ酸配列の遺伝子コードの検討によって
ＰＤ−ＥＣＧＦのアミノ酸配列から推定される。

好ましくは、アミノ酸配列の領域は、独特のコドンを使
用ｊることか一番多くなるように選択される。オリゴヌ
クレオチドは、自動ＤＮＡ合成装置を使用しての公知の
方法で合成されることができ、そして約１５個〜約１０
０個のヌクＶオテドのいずれであってもよい。本発明の
オリゴヌクンオテドプローブの配列は実施例にあげられ
ている。該プローブのインサート部を持っていると思わ
れるクローンとのハイブリターイゼーション法は確立さ
れており、そのための方法は組換えＤＮＡ技術の標準的
な実験マニアルのうに探し出すことができる。

ＰＤ−ＥＣＧＦ遺伝子をもつクローニングは、Ｓａｎｇ
ｅｒの方法に従ったジデオキシチエインターミネーショ
ン法あるいはＭａｚａｍ及びＧｉｌｂｇｒｔの化学的方
法によって配列を決められる。

ＰＤ−ＥＣＧＦのｃＤＮＡクローンは、哺乳動物中の似
たような遺伝子を同定するのや、哺乳動物中のＦＤ−Ｅ
ＣＧＦ遺伝子のゲノム構造を決定するのや、ＦＤ−ＥＣ
ＧＦ遺伝子トランスクリプトを同定するのや、ゲノム遺
伝子、特にヒトのゲノム遺伝子をクローニングするのや
、発現ベクターを構築して哺乳動物、特にヒトの組換え
ＦＤ−ＥＣＧＦを産生させるのに有用である。類縁性の
ある遺伝子を同定したり、ゲノム遺伝子の構造を決定す
ることは、全部のゲノムＤＮＡのサザンハイブリタ゛イ
ゼーションによって行なわれる。細胞のｍＲＮＡはノー
ザンブロッティングによって分析される。サザンブロッ
テインク及びノーザンフロッテイングの両方の方法は広
範囲に使用され、そのための手法は組換えＤＮＡ技術の
標準的な実験マニュアルの中から利用し℃用いられる。

ゲノムＰＤ−ＥＣＧＦ遺伝子をクローン化するためには
、ＤＲＡ源がゲノムＤＮＡであって、ハイブリダイゼー
ションプローブがオリゴヌクレオチドよりは、ＤＮＡク
ローンであることを除いて本発明で記載された方法が使
用せられる。

ヒト胎盤ＰＤ−ＥＣＧＦの推定されたアミノ酸配タリは
、ヒト血小板ＰＤ−ＥＣＧＦとは４７１番目のアミノ酸
が１個異なっており、直接のアミノ酸シークエンシング
で同定されたセリン残基がロイシンに置き換えられてい
る。それはまたタンパク質のアミン木端に１０個のさら
なるアミノ酸を含有している。この差異はプロセッシン
グの結果にもとずくのかどうかは不明である。ＰＤ−Ｅ
ＣＧＦの他の変異体は、ウシまたはブタの胎盤組織及び
他の組織のような他の組織を出発物質としてクローン化
されうる。これらの変異体は、下記に記載するところの
治療上での用途でヒトＰＤ−ＥＣＧＦと置き換えるのに
有用である。

かようなベクターは、その遺伝子を発現するのを制御す
るための遺伝子に操作可能に結合せられたプラスミド及
びＤＮＡ配列エレメントを維持するための１つまたはそ
れ以上の選択可能なマーカーを有し℃いる。これらのＩ
ＪＨＶＡ配列エレメントトシテハ、フロモーター、エン
ノ・ンサーエレメント、転写終止シグナル及びポリアデ
ニル化サイトがあげられる。後の三つは常に必要という
わけではないが、発現を得るのに使用せられる複製可能
な発現ベクター及び宿生系に依存している。プロモータ
ーとは、遺伝子の発現をコントロールするＤＮＡ配列エ
レメントのことである。使用して有用な原核細胞プロモ
ーターとし℃は、ｌａｃブロモター、ｔｒｐプロモータ
ー、ラムダのＰＬ及びＰＲジブロモー、Ｔ７ボリメラー
ゼプロモーターがあげられる。真核細胞のプロモーター
も本発明において有用であり、ウィルス由来のプロモー
ター、酵母のプロモーター、特にＭｏ　Ｌ　ｏｎｙ白血
病ウィつスＬＴＲがあげられる。

ＰＤ−ＥＣＧＦの発現は、その遺伝子を複製可能なベク
ター中にサブクローン化することにより得られる。ＰＤ
−ＥＣＧＦの発現に適した複製可能な発現ベクターは、
Ｅ。

ｃｏＬｉ、Ｂ、５ｘｂｔｉｔｉｓ及びその他の微生物の
ような宿主をトランスホームできる細菌のベクター及び
バクテリオファージのベクターがあげられる。これらの
ベクタの多くは、ｐＢＲ３２２を基にしており、それに
はＢＬｗｇ８ｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇａｎｇから入
手可能）が含まれ、当該分野で知られたものが多（ある
。

本発明で使用されるバクテリオファージにはラムタ゛及
びＭ１３があげられる。

ＦＤ−ＥＣＧＦ発現のための他の適当なベクターは、真
核細胞から誘導して得られる。酵母及びセルカルチャー
内で機能する発現ベクターは、ＦＤ−ＥＣＧＦｆ２ｒ：
発現するのに用いられる。これらのベクターとしては、
酵母プラスミド、レトロウィルスベクター、ＢＰＶべ／
ｙメタ−バキュロウィルス（ｂａｃｌＬＬｌｏｖｉｒｓ
ｓ）ベクター及び他のウィルス由来ベクターがあげられ
る。真核細胞用複製可能な発現ベクターと共に使用せら
れる組織培養細胞としては、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、マウス
Ｌ細胞、ＣＯ５−７細胞、Ｈｅ、Ｌａ細胞及び他の株化
培養セルラインがあげられ、Ｎｌ１ｉ３Ｔ３細胞が好ま
しい。

本発明の複製可能な発現ベクターは、ＰＬ８からのｃ　
Ｄ　＃　Ａインサート部を所望のベクター中ヘサブクロ
ーン化して作製される。本発明において、複製可能な発
現ベクターの一つとして、プラスミドｐＬＪ　があげら
れ、それはｃＤＮＡの転写を誘導するＭｏ　ｌ　ｏｎｙ
白血病ウィつスＬ　Ｔ　Ｒ及び選択マーカーとしてのネ
オマイシン遺伝子を含有している。ＦＤ−ＥＣＧＦのｃ
ＤＮＡをこのベクターの中にサブクローン化すると、プ
ラスミドｐＬＰＬＦ３Ｊが作製される。このベクターは
、ＣａＰＯ，共沈法によりｔｖＩＨ３Ｔ３細胞をトラン
スホームする。ｐＬＰＬＢＪでトランスホームされた一
つの細胞の細胞ライゼート及びコンディションドメデイ
ウムの分析は、ブタ大動脈内皮細胞に対する増殖促進活
性は、細胞ライゼートのうちにあり、コンディションド
メデイウム中にはなかった。活性はＰＤ−ＥＣＧＦ抗体
により阻害され、ＰＤ−ＥＣＧＦ抗体とのイムノブロッ
ティングで、４５ＫＤａｌの組換えＰＤ−ＥＣＧＦｐ：
ｙバク質を示している。

他の複製可能なベクターは、同様にして構築され、テス
トされる。当業者は、適宜入手しうる複製可能な発現ベ
クター、交換可能な宿主及びベクターケ作製したり使用
するための公知の方法を選択して使用することができる
。

トランスホーマント微生物及び培養細胞は、複製可能な
発現ベクターをその系内にトランスホームすることによ
って導入して作製しろる。トランスホームの方法として
は当該分野で良く知られたものがあるが、そのようなも
のとしては、ｃａｃｉ２処理法及び細菌細胞の電気穿孔
法、ｃａｐｏ。

共沈法、プロトプラスト融合法及び真核細胞の電気穿孔
法があげられる。これらの方法の詳細は組換え１）ＩＶ
Ａ技術の標準的な実験マニアルのうちから見っけ出すこ
とができる。

均一なＦＤ−ＥＣＧＦは、タンパク貿かもその配夕１」
が決定され、次なる配列乞有している： ＡＰＰＡＰＧＤＦＳ ＧＥＧＳＱＧＬＰＤＰＳＰＥＰＫＱＬＰＥＬＩＲＭＫＲ
ＤＧＧＲＬＳＥＡＤＩＲＧＦＶＡＡＶＶＩＪＧＳＡＱＧ
ＡＱＩＧＡＭＬＭＡＩＲＬＲＧＭＤＬＥＥＴＳＶＬＴＱ
ＡＬＡＱＳＧＱＱＬＥＷＰＥＡＩＶＲＱＱＬＶＤＫＨ５
ＴＧＧＶＧＤＫＶＳＬＶＬＡＰＡＬＡＡＣＧＣＫＶＰＭ
ＩＳＧＲＧＬＧＨＴＧＧＴＬＤＫＬＥＳＩＰＧＦＮＶＩ
ＱＳＰＥＱＭＱＶＬＬＤＱＡＧＣＣＩＶＧＱＳＥＱＬＶ
ＰＡＤＧＩＬＹＡＡＲＤＶＴＡＴＶＤＳＬＰＬＩＴＡＳ
ＩＬＳＫＫＬＶＥＧＬＳＡＬＶＶＤＶＫＦＧＧＡＡＶＦ
ＰＮＱＥＱＡＲＥＬＡＫＴＬＶＧＶＧＡＳＬＧＬＲＶＡ
ＡＡＬＴＡＭＤＫＰＬＧＲＣＶＧＨＡＬＥＶＥＥＡＬＬ
ＣＭＤＧＡＧＰＰＤＬＲＤＬＶＴＴＬＧＧＡＬＬＷＬＳ
ＧＨＡＧＴＱＡＱＧＡＡＲＶＡＡＡＬＤＤＧＳＡＬＧＲ
ＦＥＲＭＬＡＡＱＧＶＤＰＧＬＡＲＡＬＣ５ＧＳＰＡＥ
ＲＲＱＬＬＰＲＡＲＥＱＥＥＬＬＡＰＡＤＧＴＶＥＬＶ
ＲＡＬＰＬＡＬＶＬＨＥＬＧＡＧＲ５Ｊ（ＡＧＥＰＬＲ
ＬＧＶＧＡＥＬＬＶＤＶＧＱＲＬＲＲＧＴＰＷＬＲＶｌ
ｉＲｌ）ＧＰＡＬＳＧＰＱＳＲＡＬ（，１ＥＡＬＶＬＳ
ｌ）ＲＡＰＦＡＡ組換えＰＤ−ＥＣＧＦは、ＤＮＡ配列
からその配夕３決定がなされ、該遺伝子は、ＰＩ）−Ｊ
！、ＣＧＦをコードしているヌクＶオチド配列を有し、
その横には対応する配夕］」が示しである： む　６◇　＊’ｂ　　Ｈ３〜θ　−θ−３゜ｂ−４′１
１！　　−さ　智−咄０１鵠　鳴θ　ト０＼０［Ｆ］（
→めミ七大む−むζ ＼　へ◇　リ　嘘ｅ　岐　１３　　ｅｓ＜ｂ　　ｓＯト
閃〜Ｊ　−ａ　３−ａ　ｉ、　Ｑｌ［Ｆ］鳴ト智（＼−
Ｏ功大じＯθ→゛ｂ　大θ→ ’Ｏｃ３３　　＃Ｃ−りａ、、）ｓ３　　ｎｏ　　達’
ｘ　　−ｂ　−＼　−１−１輌　暢じ　ト　閃　喝−６
めスＯＯむ−し情トドじ５８＼ 偽Ｏｏ　θ 恥　５　＆＋　） 内　む　膓　θ ６　じ ＋ｊ　５ ス　七 −１，）　　ｏＣ５ｇ　　θ　− ＆−リ　Ｉ−ス　〜　ト　智 内　（へ　し　め　む　→ 一一一０４−◇喰ろミ 智ζ鳴ＣＪ−−１−ａ −七一大−シ情うめ ｏ’５ｃｓ３　　ロＯ論功　リ１６ ｋ　ＣＪ−４ＣＪ　ｈ　Ｃ５〜◇〜−〜ス（！１大ＣＪ
　孤８３め大め大 ◇　ミ　◇ −鳴　む む　−〇 ト、−（ −ｈ　− 〇　じ　Ｃ む　Ｏ（＋） ◇　ｌ−８ （膓　む ヘト−ｃ、！：Ｉ偽Ｏ−一一む−◇暢 句　θ　ト　め　ト　大　Ｎ　功　ト　ろ　１−　凌大
シζｂスめΦ◇＼（大−〜 Ｐｕ−ＥＣＧＦは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで内反細胞に対し
ケモタキッス及び増殖刺激をし、ｉｎで１ｔｒｏで脈管
形成、特に血管形成を誘導する。

血管形成、すなわち、そこにある血管からの新しい毛細
血管の出芽による形成は、胚形成、傷の治癒、器の再成
にとって重要な過程である。加えて、ある種の病状、す
なわち、＠房の生長、ある種の網膜障害、リューマチ性
関節炎のような場合には異常な血管形成が起きる。血管
形成は複雑な過程であり、内反細胞の移動及び増殖を含
むいくつかのステップからなっている（　ＦｏＬｋｍｃ
ｖｎ　ａｔ　ａＬ　、。

１９８７α）、ある棟のポリペプチド因子が、この過程
を刺激することが確められている。例えば、繊維芽細胞
増殖因子、トランスホーミング生長因子−α、トランス
ホーミング生長因子−β、ツウモアネクロシスファクタ
ー、アンギオゲニン（ＦｏＬｋｍａｎ　ａｔ　ａｌ、＋
　　１９８７　ａ　、Ｆｒａｔａｒ−５ｃｈｒｏｄｅｒ
　　ａｔ　　ａｌ、＋　１９８７　；　Ｌｇｉｂｏｖｉ
ｃｈ　　ａｔ　ａｌ、。

１９８７）。

これらの因子は、直接に内反細胞に対するマイトジェン
作用及び／又はケモタクテツク作用によるかあるいは未
だ不明の間接的なメカニズムで血管形成を導びへ広範囲
の各種の細胞に複数の作用を及はすこれらの因子と異な
り、ヒト血小板由来内反細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ
）は、ｉｎ　ｗｊｔｒｏで特異的に内反細胞の増殖を刺
激する（Ｍｉｖａｉｏｎｏ、ｅｔ　ａＬ、、　１９８７
　）、例えば、繊維芽細胞の増殖は刺激しない。ＰＩ）
−ＥＣＧＦは、便来知られている増殖因子と明確に異な
る４５ＫＤαのタンノくり質である。

内反細胞増殖因子は、血管形成の誘導、傷の治癒の促進
、動脈硬化症、特にアテローム性動脈硬化症の予防及び
血小板減少症の治療に有用で、補乳動物にその有効量を
投与して行なわれる。ヒトを含めた哨乳動物に均一また
は組換えＰＤ−ＥＣＧＦのその治療有効量を投与して行
なうのが好ましい。

ＰＤ−ＥＣＧＦはまたｉｎτ１ｔｒｏで内皮細胞のケモ
タキシスを刺激し、ｉｎ　ｖｉｔｒＯで内皮細胞におい
て、特にヒョコ漿尿膜（ｃｈｉｃｋ　ｃｈｏｒｉｏ　ａ
ｌＬａｎｔｏｉｃｍｅｍｂｒａｎｅ　　；　ＣＡＭ　）
において血管形成を誘導する。この因子に対する抗体は
、ｉｎ　τ１ｔｒｏでのマイトジェン活性を中和し、ま
た非常に血管形成反応を阻害する。かくして、ＰＤ−Ｅ
ＣＧＦは、内皮細胞に対し℃ターゲットセル特異性を示
す新規な血管形成因子である。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏで内皮細胞ケモタキシスを誘導すると
ころのＰＤ−ＥＣＧＦのケモククティックドメインを同
定するために、ＦＤ−ＥＣＧＦのタンパク質分解フラグ
メントについて記載したようにして内皮細胞Ｑ）ケモタ
クティク反応を誘導する能力があるのか否かをテストし
た。タンパク質分解したフラグメントをｐｎ−Ｅｃｃｐ
ｔｔ４素的なまたは化学的な加水分解によって、特にセ
リ／プロテアーゼ様のトリジン／により、Ｖ８プロテア
ーゼによりそしてＣＮｆ３ｒ誘導開裂法により製造され
る。フラグメントは逆相〃Ｐ６６によって精製する。次
にそのフラグメントを哺乳動物の麦皮細胞を用いて、特
にウシ及びブタの細胞を用いて、ケモタキシスアツセイ
法でテストする。ケモタキシスアツセイ法は、天然のＰ
Ｄ−ＥＣＧＦまたは組換えＰ　Ｄ　−ＥＣＧＦのグモタ
キシス活性のテストに用いたのと同じものである。

本発明は、ＰＤ−ＥＣＧＦが新しいタイプの血管形成因
子であることを示している。内皮細胞の増殖及びケモタ
キシスの刺激はｉｎ　ｖｉｔｒｏでの性質で、ＰＤ−Ｅ
ＣＧＦは他の公知の血管形成因子と共通している（例、
ＦＧＦ類）。

これに対し℃、ＰＩＪ−ＥＣＧＦは、増殖アッセイ並び
にケモタキシスアツセイにおいて内皮細胞に対してター
ゲットセル特異性を示す。かくして、それは血管形成に
とって重要な内皮細胞の反応を特異的に且つ直接に誘導
できる。

ＰＤ−ＥＣＧＦは、血小板ライゼート中に存在する唯一
つの内皮細胞マイトジェンであり、傷の治癒や血栓部の
新しい血管の形成のような血小板により仲介される過程
に関係した重要な因子でありうる。加え℃、血小板から
放出されると内皮細胞の交代を調節することのできる管
内にある因子としてかなり重要である。より大きな血管
の内側での内皮細胞の増殖は傷害を受けた内皮の再生に
とって重要であり、多分アテローム性動脈硬化を予防す
るにも重要である。

機能的に活性なＦ　Ｄ　−Ｅ　Ｃ’　Ｇ　Ｆを高収率で
提供しつると共にｃＤＮＡクローン及び特異抗体を利用
しうるようにしたことは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＦＤ−
ＥＣＧＦの機能に関する問題を研究することを可能にし
、治療用に充分な量のＰＤ−Ｅｃａｐの供給を可能にす
る。

実施例 セルカルチャー及び培地 Ｂｏｏｙｓｇ　　ａｔ　ａＬ、　（１９７５）によって
記載されたようにしてコラゲナーゼダイジエスション法
を用いて新鮮なブタの大動脈から内皮細胞を採取した。

Ｐｗｃｋ　　ｅｔ　　ａｔ。

（１９５６）によって最初に記載されたようにしてシン
グルセルプレーテング法によりその内皮細胞のクローニ
ングを行なった。そり内皮細胞は、１０チの胎児牛血清
（ＦＢＳ）及び抗生物質を含有する１ａｄｓ　Ｆ−１０
培地中２５ｃｍ２培養フラスコ内で維持し、コンフルエ
ントな状態に達した時に０．２５％トリプシン溶液（Ｇ
ｉｂｃｏ　）を用いて継代培養した。この条件下に６か
月以上の間そのモルイヤーの内皮細胞に形質転換あるい
は損失のような風は全くなかった。

ＩＪ）ｒｂｃ　−Ｎｇｂｙｇｎ　ａｔ　ａｔ、　（１９
６６）によりｆｉ己載された方法によって正常ラット腎
臓（ＮＨＫ）繊維芽細胞を得て、１０％ＦＢ、５を含有
するＤｗ　ｌ　ｂ　ｇ　ＣＣＯの修飾Ｅａｇｌｅ培地中
で継代培養した。

細胞数の測定 増殖実験の間、１０％ＦＢＳな含有するｉｌａｍ’ｓ　
　Ｆ〜１０培地を用いて３５−１１１１１１織培養皿（
Ｃｏｒｎｉｎｇ　）中で内皮細胞を２０，０００　ｃｅ
ｌｌ／デイツ７ユのプレーテング密度で継代培養した。

該細胞は２４時間培養し、接着を許し、次に培地を試験
培地で交換した。該細胞’（ｆｆトリプシン−ＥＤＴＡ
で１５分間インキュベートして培養皿から取り出し、細
胞数を２回測定した。該セルカルチャーは、第４白目に
再度新鮮な試験培地に交換せられる。

血小板ライセードの調製 正常人から血液をクエン酸−リン酸−デキストロース溶
液中に採取し、２０℃で２０分間１６０ｙに遠心して新
鮮血小板に富んだ血漿を得た。２０℃で２０分間血小板
に富んだ血漿のτの上層部を１７００Ｆに遠心し、該血
小板ペレットを１０　ｍＭＴｒｉｓ　ＨＣＩ！（ｐＨ７
，４）／　１５０　ｒｎＮＮａＣ１３／　０．０１％ポ
リエチＬ／７グリ：７−ル（ＰＥＧ）液中に懸濁した。

該血小板を同じ緩衝液で２回速ノしして洗い、１分間超
音波処理した。この方法により、最終的な血小板懸濁液
中に混在する赤血球及び白血球の曾を０１％より少なく
した。超音波処理した血小板を４°Ｃで３０分間４８．
０ＯＯｙで遠心し、その上清液を血小板ライセードとし
℃用いた。２００彪の全血から約２ｍｌの血小板ライセ
ードを得た。１ｍに特に説明しない限り、以下の各操作
は４°Ｃで行なわれる。

増殖促進活性の測定 従来技術に記載されているようにしてＣＭｉｙａｚｏｎ
。

ｅｔ　ｃＬｊ、＋　１９８５α、ｂ）、ブタの大動脈の
内皮細胞を指示細胞として増殖促進活性を測定した。１
０％胎児牛血ｉ（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒα１ｏｒｉｅｓ
　）及び抗生物質を加えたＨａｍ’ｓ　　Ｆ　−１０培
地中で培養された内皮細胞を１週間ごとにｌ：２０の比
率で継代培養した。マイトジェン活性測定のためには、
該細胞はトリプシン処理され、２４−ウェル組織培養プ
レート（直径１６闘、Ｃｏｓ　ｔａｒ）中に０５％胎児
牛血清及び抗生物質を含有しているＨａ’ｓ　　Ｆ−１
０培地５００μｌを用いて、ばらばらに（約ｌＸｌ０’
ｃａｌｌ／ウエル）再ブレーティングした。２４時間の
培養の後、各ウェルに試験サンプルを加えた。１８時間
後、〔３Ｂ〕−チミジン＜０．２μＣｉ／ウェル；　６
．７　Ｃ４／１ｎＪ（。

Ｒａｗ　Ｅｎｇｔａｎｄ　ＩＶｌＬｃｌａａｒ）を加え
た。史に４時間した後、２０分間水冷５％（Ｗ／Ｖ））
’Ｊクロロ酢酸で該細胞を固定した。得られた沈殿を水
で徹底的に洗い、２００μｌのｉｎ　　ＮａＯＨで可溶
化した。２０分間室温で混合した後、２００μｅの１Ｍ
Ｈｃｌ！をウェルの中に加えた。２Ｑｒｎｌｌｎｓｔａ
ｇｅｌ　（Ｐａｃｋａｒｄ　）　／サンプルを用いて〔
３ｕ〕放射活性を液体シンチレーションカウンター中で
測定した。

ヒト血小板からの血小板由来内皮細胞謂殖因子の精製ア
ッセイ法−一増殖因子活性は、精製工程を通して上記し
たようにターゲット細胞としてブタの大動脈内皮細胞を
用いてモニターした。

ヒト内皮の繊維芽細胞に対する増殖促進活性は、Ｂｅｔ
ｓｈｏｌｔｔ及びＷｅｓｔｅｒｍａｒｋ　（１９８４）
による方法によつ℃アッセイした。

一般的事項一精製の間、ガラス表面に吸着されて活性が
失われるのを減少させるためプラスチック製の器具が使
用された。すべての操作は、他に特に説明しないかき゛
す４°Ｃで行なわれた。タンパク質濃度は、他に特に説
明しないかぎりＢｒａｄｆｏｒｃｌ　　（１９７６）の
染色固定アンセイ法によって測定せられた。

血小板ライゼートの調製 内皮細胞増殖因子の精製のためには、ヒト血小板からの
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の精製法から得られる
副生フラクション（Ｈｇｌｄｉｎ　ａｔ　ａｌ、、　　
１９８７）が用いられた。血小板ペレットからのＰＤＧ
Ｆの精製の第１段のステップは、ＣＭ−セファデックス
のクロマトグラフィーである。陽イオン性のＰＤＧＦを
このカラムに吸着させる。

ヒト血小板中の内皮細胞増殖因子は、陰イオン性タンパ
ク質であるので、ＰＤＧＦの精製（１：ｈＬｄｉｎ　ａ
ｔ　ａｔ、。

１９８７）における最初のステップのＣＭ−セファデッ
クスカラムには吸着されなかった。期待されたように、
流出したフラクションに内皮細胞に対して増殖促進活性
があることが見出され、その精製法における出発物質と
して用いられた。約１５１の吸着されなかったフラクシ
ョンを同時に処理した；このものは約９００Ａ’の新鮮
ヒト血液から得られたものである。使用まではその吸Ｈ
されなかったフラクションは５１の容器中で一２０℃で
１０年までの間貯蔵しうる。

ＱＡＥ−セファデックスクロマトグラフィーＣＭ−セフ
ァデックスクロマトグラフィーより得られた吸着されな
かったフラクションを融解し、ＱＡＥ−セファデックス
クロマトグラフィーにかけた。乾燥ＱＡＥ−セファデッ
クスゲルＣ０，７！／１１　；Ａ−５０、Ｐｈａｒｒｎ
ａｃｉａ）を加え、１晩振りながら混合した。次にその
ゲルを沈殿させ、吸着しなかったフラクションを捨てて
後、それをカラム（６０Ｘ　５ｃｒｎ、　Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）に注ぎ入れた。該カラムを１０ｍ＃リン酸塩液
、７）Ｈ７，４中の７５　ｍＭ　ＮａＣ１ｊ液４ｊで洗
い、１０ｍＭリン酸塩液、７）Ｈ７，４中の２５０９ｒ
ＬＭ　ＮａＣ７１液２５１で溶出した。

大部分の活性がこのカラムに結合し、ｐＨ７，４で７５
ｒ／ＬＭ〜２５０ｍ＆のＮａＣ１１の間で溶出した。こ
れは回収されたタンパク質からみて２５０倍の精製にあ
たり、この工程では８０％の回収率と想定された。出発
物質中の増殖促進活性はいろいろと異なり、そしてそれ
は多分阻害物質の存在（下記参照）によると思われるの
で、この段階での収率は正確には決められない。

硫酸アンモニウム沈殿法 硫酸アンモニウム（２４７り／Ｅ、４２チ飽和）をＱＡ
Ｅ−セファデックスクロマトグラフィーの溶出液に加え
た。

４℃で２時間平衡化させた後、そのサンプルを２，０７
５　Ｘノで１５分間遠心した。沈殿を遠ノしり、て集め
、１０ｍ＆ビス（２−とドロキシエチル）アミノ−トリ
ス（ヒドロキンメチル）メタ７　（Ｂｉｇ　−Ｔｒｉｓ
）、ｐＨ７，０液中の５０ｍＭ５ａｃ　１１液中に再懸
濁した。

中性のｐｕでは、約９０％の活性がｍＷアンモニウムの
４２％飽和で沈殿せしめられたが、タンパク質はほんの
９チか沈殿せられたのみであった。この工程で１０倍積
装せられ、容量２００成で約７００１ｎ９のクンバク質
な得た。

ＤＥｑＥ−セファロースクロマトグラフィー硫安沈殿法
により得られた物質（２００廐の容量中に約７００〜の
タンパク質を官むもの）を、室温で２時間５ｍＭのジテ
オスフイトール液で処理した。次にサンプルを徹底的に
１０ｍＭ　　Ｈｉｓ　−１’ｒｉｓ液、７）ｌｉ７．０
中の５０ｍＭ、ＮａＣ１液に対して透析し、次にｕｚＡ
ｌ！、−セファロースＣＬ　−６Ｂ　（４０ｍ１３　；
　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムにかけた。該カラムを、
１０　ｍＭ　　Ｂｉｓ　−１’ｒｉｓｆｌｉ衝液ｐＨ７
，０中の５０　ｍＭ　ＩＪａＣ１ｌ液１０（ＩＡ’で洗
い、ｌ　２０ｎｒ／　ｈｒ　）流速で、１０ｍＭ　　Ｂ
ｉｓ　−Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，０中の５０〜２００ｍＭ
のＮａＣ１１液のりニア−グラジェント（ｓｏｏｌｍ）
により溶出した。２０劾づつ７ラクシヨンを集め、タン
パク質及び増殖促進活性について分析した。ｐＨ７，０
で約１２０−１５０　ｍＭ　Ｌｆ）ＮａＣ１３のところ
に該内皮細胞増殖促進活性が溶出した。この工程はさら
に６倍の精製をなし、５０％の回収率であった（区１１
）。

ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーＤＥＡＥ−セ
ファロースクロマトグラフィーかも得られた活性フラク
ション（Ｆ１６０〜のタンパク質重）を−緒にし、５０
ｍＭ　　ＮａＣｌ、０．６ｗ＆リン酸塩液ｐＨ７，４テ
平衡化したヒドロキシアパタイト（（：’　ｔａｒｋｓ
ｖｎ　ＣｈａｒｎｉｃａｌＣｏ、；Ｗｉｔｔｉａｍｓｐ
ｏｒｔ、ＦＡ）の８ｍｌカラムに直接かけた。

該カラムを８０ｍ１の同じ緩衝液で洗い、５０　ｍＭ　
　ＩＶａＣ１３，１５ｍ＆リン酸塩液、ｐＨ７４で、次
に２００ｍ＆リン酸塩液、ｐＨ７，４で溶出した。８ｄ
づつ分画してタンパク質及び増殖促進活性についてアッ
セイした。

ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーでさらに比７
占性で４倍＾のられた（図２）。該ケルにほとんどすべ
てのタンパク質が結合し、該増殖促進活性は１５鵠Ｍリ
ン酸塩液で浴出したが、大部分のクンバク質は、より高
いリン酸塩液のところで浴出した。該活性の回収率はこ
の工程で約５５％であり、約８ｍ９のクンバク質が残っ
ていた。

該増殖因子の最終的な精製は、高速液体クロマトグラフ
ィー（ｆａｓｔ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　　Ｌｉｑｕ
ｉｄ、　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒαｐ五Ｖ；ＦＰＬＣ）装
置に装備されたイオン父換クロマトグラフィーカラム及
び回分解能ゲルクロマトグラフィーカラムを用い１行１
まわれた。

Ｍｏｎｏ　Ｑクロマトグラフィー 該ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーからの活性
フラクションをプールし、４℃で３０分間９０．０ＯＯ
ＸＰで遠心し、Ｍ□Ｂ□　Ｑ　　カラム（ｌｉ　／＜　
５　／　５、Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ　）に直接かけた。

このカラム及び次に記載の二つのカラム（ＴＳＫ−Ｇｒ
　０００　　ＳＷ及びＳｗｐｅｒｏＳｒ　１２　）は、
Ｉ’　Ｐ　Ｌ　Ｃ装置に装備され、室温でその操作がな
された。該カラムを１ｍｌ／ｒｎｉｎの流速で、１０　
ｒｎＭ　　Ｂｉｓ　−Ｔｒｉｓ　。

ｐＨ７，０中の０−５００　ｔｎＭノＮａＣ１（１：）
！　ラ’）エフ　トニカけて浴出した。２８０　ｎｍの
吸光度でモニターした。フラクションを１１ｒＬｅづつ
集め、増殖促進活性について試験した。

増殖促進活性のシングルピークが、ｐＨ７，０で１２０
ｍＭＮａＣ１ｊのところで得られた（図３）。この工程
で更に４倍精製され、回収率は５０％であった。

ＴＳＲ−Ｇ４０００　　ＳＩＦゲルクロマトグラフィー
Ｍｏｎｏ　Ｑ　　カラムクロマトグラフィーから得られ
た活性フラクションをプールし、前もって透析すること
な（凍結乾燥し、２００μｇの水に溶解した。次にその
一部分を前処理用カラム（プレカラム）（Ｕｌｔｒｏｐ
ａｃカラム、７，５Ｘ　７５ｍｍ％ＬＫＢ　）を備えた
ＴＳＫ−Ｇ４０００　ＳＷ　　カラム（７，５Ｘ　６０
０ｍｕ、　ＬＫＢ　）にかけた。１１００ｙａリン戯塩
欣、ｐＨ６，５でもってそのカラムを平衡化し、流速５
００μｍ３７ｍ１ｎで溶出した。カラムからの溶出液を
２８０μｍの吸光度でモニターした。５００μｇづつ各
フラクションを集め、増殖促進活性を試験した。

例外的に遅（溶出し、１２，０００より小さなＩｄｒに
和尚する位置に単一の幅広い活性のピークを得た（図４
）。該活性の回収率は４０％で、比活性は４倍あがった
。

５〜ｐａｒｏｓｇ　　１２ゲルクロマトグラフィＴＳＫ
−Ｇ４０００　　ＳＷ　クロマトグラフィーかも得られ
た活性フラクションをプールし、Ｓｐｇｃｔｒａｐｏｒ
透析チューブ（Ｍｒカットオフ、３，５００、Ｓｐｓｃ
ｔｒｂｒｌＬｍＭｅｄｉｃａｌ　　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ
ｓ、１１Ｌｃ、）を用いて１００ｍ−ＭＮａＣＩｌ、１
０？７ＬＭ　　４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピ
ペラジン−エタンスルホン酸（Ｈａｐｇｓ）液、ｐＨ７
，０に対して透析し、凍結乾燥した。該物質を、１００
μｇの水に再懸濁し、２００　ｔｎＭ　　ＮａＣＩｊ、
１０ｍＭ　　Ｉ：ｂｐｇｓ、ｐＨ７，０中のＳｘｐｇｒ
０８ｅ　１２カラム（〃Ｒ１０／３０゜Ｐｈａｔ−毒α
ｃｉα）にかけた。該カラムを４００μｅ／惜ｉｎの流
速で溶出し、２８０　ｎｗｃの吸光度でモニターした。

フラクションを２００μｇづつ集め、増殖促進活性をア
ッセイした。

この方法で、牛血溝アルフミン及びオボアルブミンの間
に浴出する単一のシャープな活性のピークを得、大部分
のタンパク質からは良好に分離せられた（図、５Ａ）。

この工程で比活性は１２倍に−められ、回収率は３０％
で、２μノの純物質を得た。純化されたフラクション中
のタンパク質濃度は、ドデシル硫酸ナトリウムゲル（Ｓ
ＤＳ）−ゲル電気泳動した後銀染色したバンドの強度を
、牛血清アルブミンの標準物のそれと比較し℃推定され
た。

５ｓｐａｒｏｓｅ　　１２クロマトグラフイー工程から
のフラクションのタンパク實組成は、５ＤＳ−ゲル電気
泳動後銀染色することにより分析した（図５Ｂ）。その
増殖促進活性をともなって醇出したＡｉｒ　４５，００
０の均一なタンパク質は、それが増殖因子であることを
示している。ザンプルを非還元条注下に分析して同様な
移動度のところに観察され（図、５Ｃ）、そのことは血
小板からの内皮細胞増殖因子は単一のポリペプチド鎖か
らなっていることを示唆している。２００ｙの血小板タ
ンパク質からの精製法のまとめを表１に示す。通しでの
活性の上昇は約１，０００，０００倍で、回収率は１％
であった。

ＰＤ−ＥＣＧＦの精製のための改良法 精製工程のはじめのステップは上記したようにして行な
われだ。七の矢の工程としてＨＰＬＣ用ヒドロキシアノ
くタイトカラムでのクロマトグラフィーを使用した。

ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィーより得られ
た物質を０，２２μｍのフィルター（Ｍｉ　Ｌ　ｌ　１
ｐｏｒｅ　）を通して濾過し、室温で、保護用カラム（
５０Ｘ４．Ｏ闘：Ｂｉｏ−Ｉイαｄ）ヲＫａ工たノ・イ
パーホーマンスヒドロキシアノ々タイトカラム（１００
Ｘ７．８ｍｉ；＃＜Ｏ／（ａ４）にかける。該カラムを
１愼Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ６，８，５０ｔｎＭ　　Ｎ
ａＣｌ３及び０．０１　ｍＭ　ＮａＣｌ３２であらかじ
め平衡化し、ｏ、５ｍｌ／ｍ１ｎｃＤ流速で１−１００
ｍＭリン酸塩、ｐＨ６，８，５０ｍＭ　ＮａＣ１；及び
０．０１　ｍＭ　　ＣａＣ１１２のグラジェントでもっ
て溶出した。次に該カラムを１Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ
６，８及び０．０１　ｍＭ　ＣａＣｌ３．で洗った。フ
ラクションを１ゴづつ集め、ブタ内皮細胞に対する増殖
促進活性をテストした。

Ｐ　Ｄ　−Ｅ　ＣＧ　Ｆ　ｋｔ　１　ｍ　Ｍ　’Ｊ　７
酸塩緩’ｉｆＳ　液、ｐＨ６，８中のゲルに結合し、リ
ン酸塩のりニア−グラジェントで溶出した（図６Ａに示
されている）。この工程での活性の回収率は約３２％で
あった。クロマトグラフィーより得られるそれぞれの分
画は、ｓｎｓゲル電気泳動及び銀染色によって分析した
；増殖促進活性は、二つのコンポーネント４６ＫＤα及
び４４Ａ４ＪｃＬ並びにいくらかの他のコンポーネント
と共に溶出し℃いた（図、６Ｂ）。

アルキル−５ｓ　　ａｒｏｓｅカラムでのクロマトグラ
フイーハイパーホーマンスヒドロキシアパタイトクロマ
トグラフイーから得られた活性フラクションをプールし
、等容量０２８８Ｍ硫酸７ンモ＝ウム＠（ＨＰＬＣ用、
Ｂｉｒ４−　Ｒａｄ）及び１００　ｍＭ　Ｉ）ン酸塩緩
ｔｆｊ液、ｐＨ６，８と混合した。該物質をアルキル−
５ｒｂｐｅｒｏｓｅカラム（ＩＩ　Ｒ５／　５、Ｐｈａ
デ惧ａｃｉａ）Ｃあらかじめ１４Ｍ硫酸アンモニウム／
１００ｍＭＪン酸塩緩衝液、ｐＨ６，８で平衡化された
もの〕にかけ、図７Ａに示のされ℃いるように１００　
ｍＭ　’）ン酸塩緩衝液中の１．４〜ＯＭの硫酸アンモ
ニウムのグラジェントでもって溶出した。流速は０．５
Ｎ／ｍＬｎで、核力ラムは室温で操作された。カラムの
流出液を２８０　ｎｍの吸光度でモニターした。フラク
ションを５００１１１３づつ集め、増殖促進活性をアッ
セイした。

最終的な精製は、ＦＰＬＣを用いた疎水性クロマトグラ
フィーによつ１行なった。ハイ・パーホーマンスヒドロ
キシアパタイトクロマトグラフィーから得られたフラク
ションを集めたものを、１．４Ｍ硫酸アンモニウム７１
００ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ６，８で平衡化したアル
キル−５ｘｐｙｏｓａカラムにかけ、１００　ｍＭ　ｌ
）ン酸塩緩衝液、ｐｉｔ　６．８中の硫酸アンモニウム
の濃度の減少するダラシエンドでもつ℃溶出し總約０．
８Ｍの硫酸アンモニウムのところで増殖促進活性の単一
のピークが得られた（図７Ａ）。この工程で比活性は５
０倍に上昇し、８２％の回収率を得た。アルキル−δ１
Ｌｐａｒｏｓｅのそれぞれのフラクションのタンパク質
組成は、ＳＤＳゲル電気泳動した後銀染色することによ
り分析した（区、７Ｂ）；書び活性フラクションは王に
二つのコンボーネン）４６ＫＤａ及び４４ＫＤαを含有
しており、それはＰＤ−ＥＣＧＦは実質的に純粋である
ことを示している。精良された物質を非還元条件下に分
析すると、同じ大きさのバンドが観察された（図７Ｃ）
。さらに、Ｍｒ４２．０００の非常に薄いバンドが再現
可能に観察された。銀染色されたゲル中のこれらタンパ
ク質の比率は、峙製物ごとに異なっていたが、４６Ｋｌ
）αコンポーネント及び４４ＫＤａコンポーネントは富
に主なものであった。

３００ｙの血小板タンパク質（約８００−１００（ｌの
ヒト血液に相当）から出発しての精製法のまとめを表２
に示しである。

それぞれの調製におい℃約３４μノの純粋なＰＩ）−Ｅ
ＣＧＦが得られた。該物質は全工程を通して１，２５０
，０００倍に精製され、約１４％の収率で得られた。

５ＤＳ−ゲル電気泳動 ５ｎｓ−ケル電気泳動は、Ｂｌｏｂａｌ及びＤｏｂｂｇ
ｒｓｔｅｉｎ。

１９７５によって記載された方法に従つ１行なわれた。

簡単に説明すると、サンプルは１０ｍＭのジチオスレイ
トルと共にあるいはそれなしで加熱（９５℃、３分間）
され、１０−１８％ポリアクリルアミドからなるグラジ
ェントゲルにかけられる。該ゲルは電気泳動した後銀染
色し、ついでグルタルアルデヒドで固定される（１８）
。Ｍτマーカ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）として、ホスホリ
ラーゼｂ　Ｃ９４，０００）、牛血清アルブミン（６７
，０００）、オボアルブミン（４３，０００＞、カルボ
ニックアンヒドラーゼ（ｃａｒｂｏｎ　ｉ　ｃｃＬｎｈ
ｙｄｒａｓａ）　（３０，０００）、大豆トリプシンイ
ンヒビター（２０，１００）及びα−ラクトアルフミン
（１４，４００）を含むものを使用した。

約４μノの純ＰＤ−ＥＣＧＦを還元し、ピリジルエチル
化し、次に細孔逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃを用いて脱塩した。次
に該物質をトリプシンで消化し、得られたフラグメント
を細孔逆相１１ＰＬｃカラムにかけ、アセトニトリルの
グラジェントをつけた０、１％トリフルオロ酢酸で溶出
して分離した。

還元及びピリジルエチル化に関して、ＦＤ−ＥＣＧＦは
まずＣ４カラムチ脱塩され、次に５ｐａａｄｉｖａｃ　
ＣｏｎｃｇｎｔταｔＯｒ中で礼燥し、１００μノのジ
チオスレイトールを含有する６Ｍグア＝ジ：ｙ−ＢＣｌ
２．０．２５＆　　ｉ’ｒｉｓ　−＃ＣＬ　ｐｌｉ　８
．５＆ヒ２ｍＭ’　　ＥＤＴ　ＡＯ）２００　μｉｔ中
に再溶解した。該溶液を２０８間窒素でもってフラッシ
ュし、３時間室温に放置し、その時に２μｇの４−ビニ
ル−ピリジンを加えた。室温で更に３時間して後そのサ
ンプルをトリフルオロ酢酸／アセトニトリル緩衝液系中
のＣ４カラムクロマトグラフィーによって脱塩した。上
記のようにして揮発性溶媒を除き、ＰＤ−ＥＣＧＦをＴ
ＰＣＫ−トリプ７ンＳｉｇ倶α；酵素：基質の比率−１
１５０（Ｗ／Ｗ））の０．１Ｍ重炭酸アンモニウム液（
２Ｍ尿素含有）でもって３７°Ｃで４時間消化した。ト
リプシン処理フラグメントをただちに、細孔逆相ＨＰＬ
Ｃにかけた。クロマトグラフィー用装置は、波長可変性
の検出器を備え、細孔のクロマトグラフィーに適したデ
ュアルポンプＬＫＢクステムからなるものである。カラ
ム温度は３５℃に保持され、流速は１００μＩ！／１ｎ
ｉｎであり、流出液は２２０　ｎｍでモニターされた。

ポリエチレンチューブ中に手動でも分画を集めた。

トリプシン処理されたｐＤ−ＥｃＧｐの各７ラグメント
の分離は図８Ａに示しである。約４０μノのトリプシン
消化されたＰＤ−ＥＣＧＦをＣ４逆相カラＡ　（Ｂ　ｒ
ｏｗ＠　ｌ　ｇ　ｇＡｑ％ａｐｏｒｇ　ＢＵ−３００：
　２．ｌＸ３０ｍ１＋）にかけ、０．１％トリフルオロ
酢酸液中のアセトニトリルのリニアーグラジェントで溶
出した。

均一でないペプチド類は、異なった条件下に再度クロマ
トグラフィーにかけた（図ＢＢ−Ｈにはその例が示しで
ある）；図８Ｂには、因８ＡのビークＴ１９、Ｔ９、Ｔ
５の、そして図８Ｄには図８ＡのビークＴ４、Ｔ２１、
Ｔ１１３の、そして図８ＥＶＣは図８ＡのビークＴ７、
Ｔ１３の再クロマトグラフィーがそれぞれ示しである。

サンプルは０．１％トリフルオロ酢酸で３倍に希釈し、
Ｂｒｏｗｎｌｅａ　５ｐｈｅτ１−５Ｒ，Ｐ−１８カラ
ム（２，１ｘ　３０ｍｘ）にかげた。該カラムを０１１
％トリフルオロ酢酸液及びそこに示され℃いるアセトニ
トリルのリニアーグラジェントで溶出した。図８０は、
図８ＡのビークＴ１２．１°２２の中のペプチドの書ク
ロマトグラフィーを示している。使用されたカラムは、
図８Ａにおけるものと同じものであるが、溶出はそこに
示されたアセトニトリルのグラジェントを有するｈｉｉ
ｔｌｉ−Ｑ水中の０．１５Ｍ　　ＮａＣｌ３液で行なツ
タ。

次に単一のペプチドとなったものを、気相シークエンサ
ーを用いたＮ−末端アミノ酸のシーフェンシングにかげ
た。

（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔ＠ｍｓ　　ＰｒＯ
ｔｍｉ％　　Ｓｍｑｓａｎｃａｒ。

情ｏｄｇｌ　　４７０　Ａ、オンラインＰＴＨ−アナラ
イザーｍｏｄｅｌ　　１２０Ａ装備）。全部のトリプシ
ン処理によるペプチドからその配列についての情報が得
られた（図９）。更なる配列につい℃の情報は、もとの
ＦＤ−ＥＣＧＦのＮ−末端のシーフェンシングによった
り、また同様な量の出発物質を用いると共にスタフィロ
コッカスのＶ８プロテアーゼのＣＩＶＢデによる分解に
より得られたフラグメントの分析によつ℃得られた。

図９において、（／・・・）は、トリプシン処理により
得たフラグメントを示し、記号は図１のビークに相当す
るものである。Ｎ−末端のシーフェンシングは（／−一
〇で、スタフィロコッカスプロテアーゼＶ８フラグメン
ト法は（／十＋十）で、ＰＤ−ＥＣＧＦのＣＮＢｒ　　
７ラグメント法は（／−−＝）で、示され、そしてンス
テイ／残基は（−）で、Ｎ−グリコシレージョン可能な
部位は（＃）で、多形（ｐｏ　ｘ　ｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
）の可能な部位は（）で示されている。分子内の繰り返
しは、上側の線で示されている。

ＰＤ−ＥＣＧＦに対する抗体の作製 ＰＤ−ＥＣＧＦのｃＤＮＡをクローニングするのに役立
つように、ＰＤ−ＥＣＧＦに対する特異的なポリクロー
ナルな抗血清を作製し、ＦＤ−ＥＣＧＦ（１）＃生源を
つきとめるためのイムノブロッティングに使用した。

該抗血清は次のようにして作製された。まず純Ｆ　Ｄ　
−ＥＣＧＦを、１５０　ｍＭ’　ＮａＣｌ３を含有する
１０ｍ＃リン酸塩緩衝液、ｐＨ７，４中に２０μｍ／ｍ
ｌの濃度となるまで希釈した。次に、１０μノの純ＰＤ
−Ｅ（、’ＧＦを等容重の）ロイントの完全アジュバン
トと混合し、ウサギの筋肉内に江射した。２週間後に７
０インドの不完全アジュノくント中のｌθμノのＦＤ−
ＥＣＧＦでもってウサギの免疫反応を高めた。その後２
−３週問おきにフロイントの不完全アジュバント中の５
μＰ　ＰＩ）−ＥＣＧＦで処理して、ウサギの免疫反応
を増強した。免疫グロブリンフラクションを、１００ｍ
＆リン酸塩緩衝液、ｐＨ７，４で平衡化したプロティン
Ａ−５ｅｐｈａｒｏｓｓ　　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の
２−のカラムに免疫によって得た血清４−をかけること
によって精製した。該カラムは同じ緩衝液で洗い、次に
５０ｍＡｆクエン酸塩緩衝液、ｐＨ３，０で溶出した。

カラムからの溶出液をすぐさ−ｆ、１Ｍ　　Ｔｒｉｓ　
−１１ｃ１３．　　ｐＨ７，４で中和した。

ＰＤ−ＥＣＧＦは血小板由来であめことから、いくつか
の造血細胞セルラインについてテストしたが、いずれも
ＦＤ−ＥＣＧＦの合成は認められなかった。しかしなが
ら、ヒトターム（ｔｅｒｍ）胎盤をイムノブロッティン
グにより分析したところ強い４５　ＫＤａバンドが認め
られた。ヒトターム胎盤を切りきざみ、４倍容量のリン
酸塩緩衝液生理食塩液（ＰＢＳ）と共にホモジュナイズ
した。

該ホモシュネートに硫酸アンモニウムを加えて２８％飽
和とし、遠心した後その上清液に硫酸アンモニウムを加
えて４２％飽和とした。遠心することにより回収された
沈殿を、ＰＢＳに溶解した。前記したようにしてヒト血
小板から精製されたｐｎ−ＥｃＧｐのザンプル１００ｎ
ｙと、３７５μノの硫安分画により得られたヒト胎盤抽
出液とを、還元条件下に１０−１８％のグラジェントの
ポリアクリルアミドゲルでの５ＤＳ−ゲル電気泳動にか
け、２０％エタノール、１５Ｑｍ＆グリシン及び２０ｍ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ　−１１Ｃ１４゜ｐＨ８，４を含有する
緩衝液中で２００ｍＡでもってニトロセルロースメンブ
レンにトランスファーさせた。該ニトロセルロースメン
ブレンを、１５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ
　−ＨＣｌ３．　ｐＨ７，４，１０％牛血清アルブミン
中でインキュベートし℃非特異的な結合をブロックし、
次にウサギのＰＤ−ＥＣＧＦ％異抗血清の１＝５０希釈
液中でインキュベートし、１５０ｍＡｉＩ’ＪａＣ１１
，１０ｔｎＭ　　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ、ｐＨ’７．４で
もつ１２回洗滌し、次に１５０惰ＭＮａＣ１３％ｌ　Ｏ
ｍＭ　　Ｉ’ｒｉｓ−ＢＣｌ％ｐＨ７，４，０，０５％
Ｔｒｉｃｏｎ　Ｘ　−１００でもって２回洗った。次に
ニトロセルロースメンブレンを１２Ｉ１１−標識化スタ
フィロコッカスのプロティンＡ　（５Ｘ　１０１１ｃｐ
恒／ａＪ　）とインキュベートし、上記したようにして
洗滌した。プロットをオートラジオグラフィーにかけた
。血小板から精製されたｐｖ−ＥｃＧＦは約４５ＫＩ）
αのダブレットとして現われ、それは多分調製の間での
蛋白分解によるものである。

図１０に、ＦＤ−ＥＣＧＦに対するポリクローナルな抗
血清を用いたヒト胎盤抽出液（レーンα）及びヒト血小
板から精製されたＰＤ−ＥＣＧＦ（Ｖ−ンｂ）のイムノ
プロット分析を示す。

かくして、ヒト胎盤からの７）ＯＮ／（Ａ）＋ＲＮＪを
用いてｃＤＮＡライブラリーをλ（７ｔｌｏ　　中に構
築した。

Ｈａｎ、ａｔ　ａｔ、、　　（１，９８７）の方法によ
って妊娠２２週のヒト胎盤から全ＲＮＡを単離した。次
にオリゴ（ｄＴ）カラムのクロマトグラフィーによって
ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡｋ精製した。帽ｘｔｓｏｎ　　ａ
ｔ　ａに、、（１９８５）によって記載された方法に幾
分かの改良を加えたものに従って、ｃ　ＤＮＡライブラ
リーを％Ｃ＋ｏのうちに構築した。最初のストランドを
合成するために、クローン化されたネズミ白血病ウィル
ス逆転写酵素（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）が用いられた。第一のストラン
ドの合成に続いて、ターミナルトランスフェラーゼによ
ってその３′床端にオリゴｄ（Ｇ）を付加した。二番目
のＤＮＡ鎖の合成は、オリゴ（ｄＣ）を外からプライマ
ーとして加えるか、あるいは＃　ａ８．　Ｈによって作
られたその系内に存在するＲＮＡをプライマーとして用
いて行なわれた。

Ｂ、オリゴヌクレオチドの選択及びスクリーニングペプ
チドのアミノ酸配列の決定を行なうことによって得られ
た情報から５個のユニークなオリゴヌクレオチドを選択
し合成して用いた。５個のそのオリゴヌクレオチドは、
Ｌａｃｈｇ　　（１９８５）の方法により該アミノ酸配
列から推測され、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔａｍ
ｓ　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈａｓｉｔａｒ３第１Ａによって
合成された。そのオリゴヌクレオチド配列は、次のよう
なものである： ２２８゜ ５’　ＴＧＴＧＴＧＧＧＣＣＡＴＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧ
ＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＡＴＧＧＡ
ＴＧＧＣＧＣＴＧＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＧＧ
３’２３１゜ ５’　ＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＴＧＡＣＡＧＣＣＡ
ＴＧＧＡＣＡ−ＡＧＣＣＣＣＴＧＧＧＣＣＧＧ３’　；
２４０゜ ５’　ＧＧＣＣＴＧＧＧＣＣＡＣＡＣＡＧＧＣＧＧＣＡ
ＣＣＣＴＧＧ−ＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＣＣＡＴＣＣ
ＣＴＧＧＣＴＴＣＡＡ−ＴＧＴＧＡＴＣＣＡＧＴＣＣＣ
ＣＴＧＡＧＣＡＧＡＴＧＣＡＧ−ＧＴＧＣＴＧ３’； ５８Ｉ ５’　ＧＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＴ
ＴＣＴＣＴＧ−ｃｃＧＡＧＧＧｃＴｃｃｃＡＧＧＧＣＣ
ＴＧＣＣＴＧＡＣＣＣＣ３′； ２５９゜ ５’　ＧＴＧＧＣＴＧＣＣＣｑＧＧＧｃＧＴＧＧ、ｑｃ
ｃｃＴＧＧｃｃ−ＴＧＧＣＣＣＧＧＧＣＣＣＴＧＴＧＣ
ＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＣ−ＴＧＣＴＧＡＧＣＧＧＣＧＧ
ＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＣ３’これらのオリゴヌクレオチ
ドプローブは、４Ｐ−ｄｃＴＰ及びデオキシヌクレオチ
ドターミナルトランスフェラーゼを用いてのエンド−テ
ーリング法により標識化されたり、鋳型として用いられ
、そのオリゴヌクレオチドプライマー”Ｐ−ｄｃＴＰ及
びクレノー７ラグメントを用いて放射性物質で標識化さ
れた相補鎖を合成するのに用いられた。

それぞれのオリゴヌクレオチドプローブでもって胎盤ラ
イブラリーをスクリーニングした。ヒト胎盤２．ｔ、ｏ
ｃＤＮＡライブラリーからの約３００，０００個の独立
の関係にあるクローンをプレートにまきｓ　Ｈｙｂｏｎ
ｄ　Ｎナイロンフィルり（Ａｍ８ｒ８ｈ（Ｌｔｎ　）を
用いてフィルターレプリカを作製した。該フィルターを
２０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（ＳＳＣ＝１５０ｍＭ
　　ＩＶａＣ１！、　　１５ｍＭクエン酸ナトリウム）
、５０惧Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６，８，１惧Ｍビロ
リン酸ナトリウム、５ＸＬ）ｇｔ循α？Ｉｄ　ｔ’ｓ溶
液、　５０μノ／ｄ変成サケ精子ＤＮＡ及び１００μＭ
　　ＡＴＰＯ溶液中で６時間４２℃でプレハイブリダイ
ゼーションした。次に、標識化され℃いるオリゴヌクレ
オチドプローブを該溶液中に加え、更に１２−１８時間
インキュベーションを続ける。

フィルターを０１％ドデシル硫酸ナトリウム＜５ＵＳ）
液中の０．２　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃでもってそれぞれ２０分
間かげ″Ｃ４回洗滌した。洗滌時の温度はオリゴヌクレ
オチドの長さに応じて３７℃〜４２℃というように変え
た。次にフィルターを１２〜４８時間１）ｒｂｐｏｎｔ
　Ｃｒｏｎａｘ　１ｎｔｅｎｓｉｆｉｅｒを［ｆるＫｏ
ｄａ、ｋ　Ｘ　−ＯｇｌαｔＡＲフィルムにさらした。

３００．０００個のクローンのうちの３個が５個のプロ
ーブのうちの２個、すなわちプローブ２２８及びプロー
ブ２４０と反応した。

Ｃ，サブクローニング及びシーフェンシング３個のクロ
ーン、すなわち、λＰＬ５、λＰＬ７及びλＰＬ８を単
離し、ｃＤＮＡインサート部をサブクローンした。もと
のクローン、λＰＬ５、λＰＬ７及びλＰＬ８は、それ
ぞれ約１．７Ｋｂ、　　約１．　ＯＫｂ及び１．１３　
Ｋｂのインサート部を有していた（　Ｂｔｓａｓｃｒｉ
ｐｔ、　ｓｔｒａｔｅｇａｎｇ　）。制限酵素によるマ
ツピングは、そのインサート部分は互いにコリニア＜ｃ
ｏｌｉｎ−αｒ）であることを示しでいた（図１ＩＡ）
。

使用された制限酵素は次のものである：　Ｂ　、　Ｂａ
ｍＨ１；’　Ｔ　ＫｐｎＩ　Ｉ　Ｓｒ　Ｓａｔ　ｌ　ｐ
　、Ｓｒｎ、　５ｔｒｈａ　ｌ　。

該インサート部は、シーフェンシングのためにＭ１３ｍ
ｐ１８に入れられてクローン化された。λｐｒ、Ｂイン
サート部、すなわち最も長いインサート部のヌクレオチ
ド配夕１」決定の方法は、図１１，４に示されている。

Ｙａｎｉｓｃｈ　−１１ｒｒｏ？Ｌ、ａｔ　ａｔ、（１
９３５）の方法に従つ（エキソヌクレアーゼ■及び■を
用いて二重鎖のＭ２Ｓを順番に切断した。各切断片から
単鎖のＤＮＡを精製し、ジデオキシターミネーション法
（１９７０）によってヌクレオチド配列を決定した。こ
の方法で決定することの困難な配列はＭａｘａｒｎ　−
Ｇ１１ｂａｒｔ法（１９８０）によって調べた。

λＰＬ８インサート部リスクＶオチド配列及び推定され
るＦＤ−ＥＣＧＦのアミノ酸配列を図１１Ｂに示す。予
測される開始コドンは１２４−１２６番目のヌクレオチ
ドのところにある。開始コドンの上流側のフＶ−ム内終
止コドン（ｉｎ−ｆｒａｒｎｇ　　５ｔｏｐ　ｃｏｄｏ
ｎ）　（ヌクレオチド２８３０）は下線を付され℃いる
もので、ヌクＶオテド１５７０−１５７２番目の終止コ
ドンはアスタリスクでしるしか付げられている。ポリア
デニル化シグナル（ヌクレオチド１５６８−１５７３）
は、矢印付きの下線を付されている。

作製されたオリゴヌクレオチドプローブ２２８．２３１
．２４０．２５８及び２５９に相当する領域は、点線で
アンダーラインされている。

ＰＤ−ＥＣＧＦの配列 λＰＬ８インサート部のヌクレオチド配列の決定により
、短かいＧＣに富んだ５′−非翻訳領域、４８２個のア
ミノ酸を有するタンパク質（Ｍ’ｙ　４９．９７１　）
が翻訳されることが予測されるオープンリーディングフ
レームｐｏｌｙ（Ａ）　　フィルを含有する短かい３′
−非翻訳配タリ部を示している。翻訳は多分１２４−１
２６番目のヌクレオチド部分のＡＴＧで開始される。と
いうのはその周辺のヌクレオチド配列は、ａ訳ｆ７）イ
ニシェーションルールにかなったものであるからである
。一方１３６−１３８番目のヌクレオチド部のＡＴＧは
このルールにかなったものではない。さらに、２８３０
番目のヌクレオチド部のフＶ−ム内終止コドンと、もと
（１ｎｔａｃｔ）のＰＤ−ＥＣＧＦのＮ−末端を：’−
Ｆｊるヌクレオチドとの間に何ら別のＡＴＧが存在しな
い（図９）。

１５７０−１５７２番目のヌクレオチド部には終止コド
ン（ＴＡＡ）が存在する。この終止コドンは、ポリアデ
ニル化７グナル（ヌクレオチド１５６ｇ−１５７３）の
一部である。この７グナルから１４個下流のヌクレオチ
ドは、長く拡がるｐｏＬｖｃＡ）　　であることが見出
された。同様な終止コド／やポリアデニル化シグナルの
亘なりは、ヒト繊毛コナドトロビンＢ−鎖に報告されて
いる。

ｃＤＮＡクローンから推定されたＰＩ）−ＥＣ０１７０
４８２個のアミノ酸のうち、３８９個はアミノ酸シーク
エンシングによって同定されていた（図９）。ＰＩＪ−
ＥｃＧＦのＮ末端の配タリは、予測される翻訳開始部よ
／′）１０個のアミノ酸分だげ下流側から始まっている
が、このことは、その分子は合成された後限定的なタン
パク質分解のプロセッシングを受けることを示している
。ｃＤＮＡ配列から予測されるＣ−末端のアミノ酸は、
最後の４個を除いてアミノ酸シークエンシングによつ℃
同定されていた。ＰＤ−ＥＣＧＦがＣ−床端でスブロテ
オリティック（５ｐｒｏｃａｏｔｙｔｉｃ）なプロセッ
シングを受けるかどうかわからないが、もし受けるとす
るなら最大４個のアミノ酸が除去される。かくして、成
熟タンパク質のＡｎｙは４８，６００−４９，０００と
いうことになり、純粋なＰＤ−ＥＣＧＦの５ｎｓ−ゲル
電気泳動により得られた推定値４５．０００とよく一致
する。

ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンから予測されたアミノ酸配列は
、４７１番目を除いてすべての部位で先に得られていた
アミノ酸配タリと完全に一致していた。その４７１番目
は、ヌクレオチド配夕Ｕからはロイシン残基と予測され
たが、この領域部分から得られた２種の異なるペプチド
の双方ともにそこはセリン残基であることが見出された
（図９）。この位置で多形現象（ｐｏｔｙｍｏｒｐｈｉ
ｏｔｎ）で起きている可能性がある。

ＰＤ−ＥＣＧＦの配列なＰＩＲデータベース、ＥＭＢ　
Ｌデータベース及びＧｇｎｂａｎｋデータベース（それ
ぞれ１５．１４及び５６を貨し出している）の配列と比
較したが他のタンパク質とはいかなる類縁性もなかった
。その配列中短かい内部での繰り返しく　１ｎｔｅｒｎ
ａｌ　　ｒｅｐｅａｔ）に注意すべきである（図９中の
上側に引かれた線の部分）。その配列の一つの特徴は、
疎水性のシグナル配列がないことで、それはＰＤ−ＥＣ
ＧＦは、従来の分泌性タンパク質ではないことを示唆し
ている。その配列のうちには、チロシン残基はたった一
個含まれ℃いるのみであり、それは多分分子の表面には
露出していない。というのは、クロラミンＴ法を用いて
１２５ＩでＰＤ−ＥＣＧＦを放射能で標識しようという
試みは、非常に低度の放射活性のとり込みしρ・もたら
さないからである。１個のＮ−グリコシレージョン可能
な部位すなわちＡｓｎ−６３がある（図９）。相当する
トリプシン処理されたペプチドのＰＴＨ−アミノ酸の収
率はこの残基の直前で極端に低い（図９）。これはアス
パラギン残基と次のグリシン残基との環状化合物の形成
による可能性があり、その形成は、アスパラギン残基が
グリコジル化されていない場合にのみ起こる。このこと
は、５ＤＳ−ゲル電気激動によって測定されたＰＤ−Ｅ
ＣＧＦのＭ、をｃＤＮＡクローンから予測されるｌｄｒ
と比較し℃みたものをも考慮すると、Ａｓｎ−６３はグ
リコジル化されていないことを示唆している。ンステイ
ン残基は全部で７個あり、それは少なくとも１個の遊離
のＳＲ基が分子中にあることを示している。

ヒ）ＰＤ−ＥＣＧＦ遺伝子のゲノム構造についての情報
を得るために、プローブとしてｐＰＬ　８のインサート
部を用いてヒ）ＤＮＡのサザンブロツテング分析を行な
った。正常なヒト白血球から大きな分子量を有するヒト
のゲノムＤＮＡを調製した。サンプルを制限酵素で分解
し、寒天中で電気泳動にかけ、次にニトロセルロースメ
ンブレンにプロットした（Ｓｃｈｌｇｔｔｈｅｒ及びＳ
ｃｈｗｌｌ）、図１２Ａに示されているように、１０μ
Ｖのヒト胎盤ＤＮＡをＨｉ％ｄ■（レーン１）またはＸ
ｂｃＬ■（し−ン２）でもって切断し、次に寒天中で電
気泳動にかけ、ｐＰＬ　　８のインサート部からのＦＤ
−ＥＣＧＦ　ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた
。それぞれＨｉｎｄ■及びＸｂａＴＩＣよる分解により
、１９Ｋｂ及び９．２Ｋｂの単一のバンドが観察された
。これはヒトゲノム中にはＦＤ−ＥＣＧＦ遺伝子のコピ
ーは唯一っであることを示唆している。実際、ヒトゲノ
ムＦＤ−ＥＣＧＦクローンの分析はこの結論をサポート
している。プローブとしてｐＰＬ　５のインサート部を
用いてヒト胎盤ｐｏｌｖｃＡ）＋ＲＮＡをノーザンブロ
ツテイングによって調べた。上記したようにして、ｐｏ
　ｌ　ｙ　（Ａ）＋ＲＨＡは、妊娠２２週のヒト胎盤か
ら精製された。１μｍ０ＲＮＡを０．９％ホルマリン変
性ゲル中で電気泳動し、Ｈｙｂｏ％ｄＮナイロンフィル
タ（Ａｍｍｒｓ五α惧）にプロットしプこ。５０チホル
ムアミド、０．６５Ｍ　ＮａＣ１，０，１Ｍナトリウム
Ｐｉｐｅｓ　、ｐＨ６，８，１０チデキストランサルフ
エート、５×Ｄｇ％ｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．１％ＳＤ
Ｓ、５ｍＭＡ７ＤＴＡ及び１００μｆ／１ｎＩ！サケ精
子ＤＮＡの溶液中で４２℃、１８時間ハイブリダイゼシ
ョンを行ない、次に２　ｘ　ｓｓｃ、　０，２％リン酸
ナトリウム、０．１％ＳＤＳ液で４回２０分間５０℃で
洗滌した。

約１．８Ｋｂの単一のトランスクリプトが観察された（
図、１２Ｂ）。ｐＰＬ　８は約１．８Ｋｂのインサート
部を有しており、最大の長さを有するｃＤＮＡクローン
が見つげられていたことから、それはＰＤ−ＥＣＧＦ）
ランスクリプトの全長のコピーを表わしている可能性が
高い。

そのｅＤＮＡがまさしく目的のものであることを確認し
、そしてそのＦＤ−ＥＣＧＦ遺伝子を持つ複製可能な発
現ベクターを提供する目的で、ＮＩＨ３Ｔ３細胞中での
発現を行なった。ｐＰＬ　８のインサート部をｐＬＪ発
現ベクター中にサブクローニングし、ｐＬＰＬ８Ｊを得
た。このベクターはプロモーターとしてＭｏ　ｌ　ａｎ
ｙ白血病ウィルスのＬＴＲを有しており、ｃＤＮＡの転
写を誘導し、さらに選択マーカーとしてネオマイシン抵
抗性遺伝子を有している（Ｐｉｗｎｉｃａａｔ　ａｔ、
、１９８６）。カルシウム・リン酸共沈法によってＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞中ＶＣｐＬＰＬ８Ｊ及びｐｒ、、ｒ構築物
をとり込ませ、セルラインをネオマイシンでもって選択
した。

ｐＬＪあるいはｐＬＰＬ８Ｊでトランスフェクトされた
ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、１０％十皿清及び抗生物質を添加
したＤｗｌｂｇｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭ
ＥＭ）中で１０ｃ１ｎの細胞培養血中にコンフルエント
になるまで生育させる。

次にその細胞を１％牛血清アルブミン、７．８μｆ／Ｉ
ＲＩコレステロール、５．５μｆ／ｍｌオレイン酸、８
μ？／ｍｌのＬ−α−ホスファチジルコリン及び０．２
ｍｇ／ｚｎｌのトランスフェリンを添加したＤＭＥＭ中
で血清なしの条件下に２４時間培培養た。コンディショ
ンドメディウムを集めた後、細胞をＰＢＳで２回洗い、
次に１ｍｌのＰＢＳ中にかきとる。次に注意深（再懸濁
し、凍結及び融解を３回繰り返して細胞を破砕して細胞
ライゼートを調製し、次に３０分間２５．０００ｒで遠
心し、上清液を採取した。細胞ライゼトの調製に関して
は、細胞は洗滌され、１ｍＭフェニルメチルスルホニル
フルオライド（Ｓｉｇｍα）、１５０ＫＩＵ７プロチニ
ン（Ｓｉｇｒｎα）及び１０ｍｕＥＤＴＡを含有するＰ
ＥＳ中に再懸濁した。増殖促進活性は、プロティンＡＳ
ｇｐｈａｒｏａａにより精製されたＰＤ−ＥＣＧＦの２
μｆ／ｄ！の存在下あるいはそれなしでのブタ大動脈の
内皮細胞中へのｓＨ−チミジンの取り込みによって測定
された。上記したようにしてイムノブロツテングはおこ
なわれた。

ｐＬＰＬ８Ｊでトランスフェクトされた１個のセルライ
ンの細胞ライゼート及びコンディションドメデウムの分
析の結果は、ブタ大動脈内皮細胞に対する増殖促進活性
は、細胞ライゼート中には見られたが、コンディション
ドメディウム中には見られなかった（図１３Ａ、Ｂ）。

該活性は、ＦＤ−ＥＣＧＦに対するウサギの特異抗血清
によって完全に中和され、このことは、該活性が、該細
胞による機能的に活性なＦＤ−ＥＣＧＦの合成によるも
のであることを示している（図１３Ａ）。ｐＬＪでトラ
ンスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞のセルラインは、
ブタ大動脈内皮細胞に対するいかなる増殖促進活性も有
していなかった。ｐＬＰＬ８Ｊでトランスフェクトされ
たセルラインの細胞ライゼートは、ＦＤ−ＥＣＧＦに対
する抗血清を用いたイムノブロッティング試験により４
５ＫＤαのコンポネントを有していることが見出された
（図１３Ｃ）。この生成物の大きさは、血小板から精製
されたヒ）ＰＤ−ＥＣＧＦのそれと同様のものであった
。これらのデータは、ブタ内皮細胞に対して生物的な活
性を示していることが観察されたもの＆東精製され、そ
の配列が決定され、クローン化されたところのＰＤＥＣ
ＧＦ分子によるものであることを示している。更にこれ
らのデータは、組換えＦＤ−ＥＣＧＦは培養細胞中で発
現され得ることも示している。

ＰＤ−ＥＣＧＦに対するケモタクテイクな反応牛大動脈
内皮細胞ＣＢＡＥＣ）及び平滑筋細胞（ＳＭＣ）の移動
に対するＦＤ−ＥＣＧＦの作用を測定した。

ＢＡＥＣ及びＳＭＣのケモタクテイスアツセイは、４８
ウエルのミクロチェンバー中で行なわれた。ＢＡＥＣの
接着のためにはＮｘｃｌｅｏｐｏｒｅフィルターをゼラ
チン及びフィブロネクチンでコートすることが必要であ
る。細胞（１８，０００ＢＡＥＣ，２５，０００ＳＭＣ
／ウェル）を上側のウェルに加えた。血清を含まないＤ
ｕｌｂａｃｃｏ’ｓ修飾Ｅａ　ｇ　ｌ　＃’ｌｌ培地（
ＤＭＥＭ）をＳＭＣの移動のために加え、１％ＦＢＳを
添加したＤＭＥＭをＢＡＥＣの移動のために加えた。５
時間のインキュベーションの間にそのフィルターの下側
の表面に移動した細胞の数を、三つの高電圧湯中で測定
した。すべての実験は三回行なった。図１４Ａ中、及び
左側の座標軸は、その用量に依存したＢＡＥＣの移動量
を示し、Ｏ及び右側の座標軸はその用量に依存したＳＭ
Ｃの移動量を示す。コントロールは棒グラフで示してあ
り、Ｉ）ＢＡＥＣ培地のみ、ＩＩ）ＥＡＥＣ培地＋１０
％ｆ／ＩＬｌ塩基性ＦＧＦ、ｍ）ＳＭＣ培地のみ、■）
ＳＭｃ培地＋５４ＦＣ８である。

図１４ｇは、子犬動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）の移動に与
えるＰＤ−ＥＣＧＦの用量に依存した効果を示しており
、それは飽和（５−１０％ｒ／ｄ）したところでは、ケ
モタクテイク因子としての塩基性ＦＧＦの力価に匹敵し
ている。約ｌｓｆ／ｌｌｕの濃度で最大の場合の半分の
刺激が生ずる。アッセイ条件下ではＰＤ−ＥＣＧＦは、
内皮細胞に対するマイトジェン様ターゲットセル特異性
と同様に平滑筋細胞の移動を誘導しなかった。

血清を用いたコントロール及び血小板由来増殖因子では
同様の実験で平滑筋細胞の移動が強（誘導された。

チエツクボート分析は、ＥＡＥＣのＦＤ−ＥＣＧＦによ
り誘導された移動は、方向付ゆられた細胞の移動（ケモ
タキシス（Ｃｈｇｍｏｔａｘｉｓ））であり、ランダム
な移動（クモキネシス（Ｃｈｔｒｍｏｋｉｎｅｓｉｓ）
）でないことを示して（・る。図１４Ｂにそのデータが
示してあり、それは細胞数％／ｆｉｅｌｄを表わしてい
る。標準偏差は１５チより少ない。その対角ｉ上の値は
クモキネシスの移動を示し、その対角線の下側の値はケ
モタキシスのものを示している。

最後にｉｎ　τｔｔｒａでのＦＤ−ＥＣＧＦのマイトジ
ェン活性を中和する抗体は、ケモタキシスの活性を中和
しく図１４Ｃ）、それはこの活性はＰＤ−ＥＣＧＦにも
とづくものであることを示している。

ＦＤ−ＥＣＧＦ抗体を用いてのＢＡＥＣの移動の阻害は
上記したようにして行なわれ、その例が図１４（１’に
示されており、１）はコントロール、２）は５ｖｔ／ｒ
ｔｒｌの純粋なＦＤ−ＥＣＧＦで、３）は５％ｆ／ゴの
純粋なＦＤ−ＥＣＧＦ＋３００＊ｆ／ｍｌの抗ＦＤ　−
ＥＣＧ　Ｆ抗体である。

ＦＤ−ＥＣＧＦの匍管形成能 ｉｎτｉｖｏでのＦＤ−ＥＣＧＦの作用を、ヒョコ漿尿
膜（ＣＡＭ沙血管条を用いてテストした。テスト物質を
メチルセルロースのディスク（１０μ２）中にしみ込ま
せ、Ｒ１５ａｔ＊、ａｔ　　ａｔ、（１９８６）によっ
て記載されたようにして９日令のＣＡＭ上に移植した。

２日間毎日ＣＡＭを分析した。デスクは光の反射によっ
て見ることができる。

図１５は、ａ）部分的に精製されたＰＤ−ＥＣＧＦ（ヒ
ドロキシアパタイトの工程を行なって精製されたもの、
純度１チ、タンパク質１．２ａｖ／ｄ；５μｔ／メチル
セルロースディスク）、ｂ）５０ｓりの純粋ｔｒＰＤ−
ＥＣＧＦ及びＣ）部分的に精製されたＦＤ−ＥＣＧＦＣ
ａ）におげろと同じもの）を抗−ＰＤ−ＥＣＧＦ抗四清
（各２．５ｐＬの溶液）と２０分間インキュベートした
ものによるヒョコ漿尿膜上の血管形成の誘導を示してい
る（倍率×１０）。

部分的に精製されたＦＤ−ＥＣＧＦは、終始強い血管形
成性を示した（図１５Ａ）。さらに５０％ｉの純粋なＰ
ＤＥＣＧＦはＣ’ＡＭにおいて血管形成活性を示した（
図１５Ｂ）。これらの結果を表３にまとめて示す。ＦＤ
−ＥＣＧＦに対する抗体はこのアッセイにおいてＦＤ−
ＥＣＧＦにより誘導される血管形成を非常に阻害した（
図１５Ｃ）。かくしてその血管形成反応はその製剤中に
存在するＦＤ−ＥＣＧＦ以外の炎症または他の因子に起
因するとすることは困難である。

表３ 移植片 血管形成反応 ＋＋十− ＦＤ−ＥＣＧＦ（２，５−５ｗＬ／ｄｉｓｋ）（２，５
ｕ　ｔ／　ｄ　ｉ　ｓ　ｋ　）純ＦＤ−ＥＣＧＦ Ｃ５Ｏｎ？／ｄｉｓｋ） 各欄中にサンプル数を示す ＋十二強い血管形成反応 ＋：認められるが弱い血管形成反応、ある場合にはほん
の僅かの血管が移植片に向っているのみ：血管のパター
ンに変化なし ＦＤ−ＥＣＧＦのｉｎ　ｖｉｖｏでの効果を研究するた
め、ｐＬＰＬＢＪ及びｐＬＪをインサートすることなし
に電気穿孔法（ａｌａｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によ
ってｃＬｌ−１細胞にトランスフェクトした。（Ｚｌ−
１細胞は、ヒト活性化ＩＩ−ｒａｓによってトランスホ
ームされたＮＩＨ３Ｔ３Ｍ胞で、ヌードマウス中で腫瘍
を形成する。トランスフェクトされたα１−１細胞を０
４１８抵抗性によって選別し、次にヌードマウスの皮下
に注射した。２週間後、腫瘍は直径約２ｃｒｎに生長し
、それを収穫して、ホルムアルデヒドで固定した。

組織学的に検査したところ（図１６）、ｐＬＰＬＢＪで
トランスフェクトされたα１−１細胞からの腫瘍は、血
管が著しく発達していたが、（ＨＤＩＶＡインサート部
を持たないｐＬＪでトランスフェクトされたα１−１か
らの腫瘍ではほんのわずかな血管があったのみである。

これはヒトＦＤ−ＥＣＧＦがマウスにおい℃血管形成性
を待つことを示している。

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Ａ、８４：５２７７−５２第１゜ Ｅａｎ、Ｊ　、Ｈ，＋Ｓｔｒａｔｏｗａ、Ｃ，＆　　Ｒ
ｕｔ　ｔｅｒ＊ＡＶ、Ｊ　、（１９８７ンＢｉｏｃｈａ
ｍｉｓｔｒｙ　　２６　：　１６１７−１６２５　。

Ｂ　ｅ　ｔｄｉｎ、　Ｃ、−Ｈ、、Ｊ　ｏｈｎｇ　ｓ　
ｏｎ、Ａ、　＋Ｅｔｔ　、　Ｂ、　、Ｗｅｎｎｇｒｇｒ
ａｎ＋５１ＲＯｎ？Ｌ　８　Ｌ　ｒ　（Ｌ　？Ｌ　ｄ　
ｒ　Ｌ　−ＨＨｃＬ’ｒｎ’ｒｎ（Ｌ　ＣＡ　ｇ　ｒ　
＋　Ａ、＋ＦａｓＬｄｇｒｓ、Ｂ、＋Ｗａｓｔｅｓｏｎ
＋Ａ、＆Ｗｅｓｔａｍαｒｋ＋Ｂ、（１９８７）Ｍｇｔ
ｈｏｄｓ　　ＥｎｔｙｍｏＬ、　　１４７　：３−１３
゜ Ｊｏｈｎｓｔｏｎｍ、Ａ、Ｐ、　＆　ＴｈｏｒｐｇｒＲ
，（１９８２）ｉｍｍｓｎｏｃｈａｍｉｓｔｒｙ　ｉｎ
　ＰｒａｃｔｉｃｇｒＢｔａｃｋｗｇｌＬ　５ｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ　ＰＳｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ。

０ｚｆｏｒｃｔ。

Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈ、Ｓ、Ｊ、、Ｐｏ１ｖｅｒｉｎｉｆ
、Ｊ、、ＳｈｇｐａｒｄｒＢ　、Ｍ−ｌＷｉ　ｓ　ｇｔ
ｎａｎ、　Ｄ、Ｍ　、　、　Ｓル１ｖｏｒｙ、Ｖ、　＆
６３２゜ Ｌｏｂｂ、Ｒ−Ｒ，、Ｈａｒｐｅｒ、Ｊ　、Ｗ、　＆　
Ｆａｔｔ、Ｊ　、Ｆ、（１９８６）Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、１５４：　１−１４　。

Ｍｉｙａｔｏｎｏ、に、　、Ｏｋａｂｇ　、Ｔ　、　、
Ｕｒａｂａ　、Ａ、　、Ｙａｍａｎａｋａ。

Ｍ、＆　Ｔａｋａｋｗ、Ｆ、（１９８５ａ）Ｂｉｏｃｈ
ａｍ。

Ｂｉｏ　　ｈ　　ｓ、Ｒｅｒ３．ｃｏｍｍ、　１２６　
：　８３−８８　。

Ｍｉｙａｚｏｎｏ、に、＊０ｋａｂｅ、Ｔ、、１ｓｈｉ
ｂａｓｈｉ、Ｓ、。

Ｕｒａｂｇ、Ａ、、＆　ＴａｋａｋｌＬ、Ｉ’、（１９
８５ｂ）Ｅｚｐ。

ＭｉｙａｔｏｎｏｒＫ、、Ｏｋａｂｇ、Ｔ、、Ｕｒａｂ
ｅ、Ａ、、Ｔａｋａｋｕ、Ｆ。

＆　Ｅｅｌｄｉｎ、Ｃ，Ｊｌ、（１９８７）　Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈａｍ。

２６２：４０９８−４１０３゜ Ｐｉｗｎｉｃａ−Ｆｏｒｍｓ、Ｅ、ｍｔ　　ａＬ　、　
（１９’８６　）　Ｍｏｌ　。

ＣｅＬＩ　　ＢｉｏＬ、６　：　２０３３−２０４０　
。

Ｐｗｃｋ、ｉ’、Ｔ、、Ｍａｒｃｓｓ、Ｐ、１．＆　Ｃ
１５ｃｉｕｒａ、Ｓ、Ｊ。

（１９５６）Ｊ、Ｅｚｐ、Ｍｅｄ、１０３：２７３゜Ｔ
ｈｏｍａ、ｓ、に、Ａ、＆　Ｇｉｍａｎｇｚ−ＧａＬｌ
ｅｇｏｒＧ、（１９８６）１’ｒｅｎｄ、ｓ　Ｂｉｏｃ
ｈｇｍ、Ｓｃｉ、ｌ　］　　：　第１　８４　。

Ｗａｔｓｏｎ、Ｃ，Ｊ、＆　Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｊ、Ｆ、
（１９８５）Ｉｎ７９　８８　、ＩＲＬ　　Ｐｒ５ｓｓ
、０ｚｆｏｒｄ。

Ｙａｎｉｓｃｈ−ＰａｒゾロＴＬ、Ｃ，、Ｖ％ｍ’Ｌｒ
α、ノ、＆　Ｍａｓｓｉｎｇ。

１、（１９８５）Ｇａｎｇ　　３３：１０３　１１９　
。

【図面の簡単な説明】

図１は、ＤＥＡＥ　−Ｓｇｐｈａｒｏｓａ　　上でのヒ
トＦＤ−ＥＣＧＦのクロマトグラフィーによる精製を示
す。 図２は、ヒドロキシアパタイト上でのヒトＦＤ−ＥＣＧ
Ｆのクロマトグラフィーによる精製を示す。 図３は、Ｍｏ？Ｌｏ　Ｑカラム上でのヒトＦＤ−ＥＣＯ
ＦＦ）クロマトグラフィーによる精製を示す。 図４は、ＴＳＫ−Ｇ４０００　　Ｓｒカラム上でのヒト
ＰＤＥＣＧＦのタロマドグラフィーによる精製を示す。 図５は、Ｓｓｐａｒｏｓｇ　　１２カラム上でのヒトＰ
Ｄ−ＥＣＧＦのクロマトグラフィーによる精製を示す。 Ａ）カラムの溶出パターン。Ｂ）精製されたヒトＰＤ−
ＥＣＧＦフラクシンのＳＤＳポリアクリルアミドゲル。 Ｃ）還元剤存在及び不存在下での純粋ＰＤ−ＥＣ’ＧＦ
のＳＤＳポリアクリルアミドゲル。 図６はハイ・パーホーマンスヒドロキシアパタイトヵラ
ム上でのヒトｐＤ−ＥＣＧＦのクロマトグラフィーによ
る精製を示す。Ａ）カラムの溶出パターン。Ｂ）ＳＤＳ
ゲル電気泳動後銀染色し℃のフラクションの分析。 図７は、アルキル５ｓｃｐａｒｏｓａカラム上でのヒト
ＰＤ−ＥＣＧＦのクロマトグラフィーによる精製を示す
。Ａ）カラムの溶出パターン。Ｂ）Ｓｌ）Ｓゲル電気泳
動後銀染色し℃のフラクションの分析。Ｃ）ＳＤＳ電気
泳動恢銀染色し℃の非還元条件下での精製された物質の
分析。 図８は、細孔逆相ＥＰＬＣによるトリプシン処理したヒ
トＦＤ−ＥＣＧＦから得られたペプチドフラグメントと
の分離を示す。 図９は、ＰＤ−ＥＣＧＦのタンパク質分解により得られ
たフラグメントのシーフェンシングによって得られたヒ
トＰｎ−ＥＣＧＦのアミノ酸配列を示す。 図１Ｏは、ヒト胎盤抽出液のイムノプロット分析を示す
。 図１１は、ヒト胎盤ＤＮＡの制限酵素マツプ・シーフェ
ンシング法及びヌクレオチド配列を示す。 図１２は、（Ａ）ヒトＤＩＶＡのサザンプロット分析及
び（Ｂ）胎盤ＲＩＶＡのノーサンプロット分析を示ス。 図１３は、（Ａ及びＢ）ＮＩ１１３Ｔ３細胞中での組換
えＰｎ−ＥＣＧＦの生合成＆Ｃ）；ＣＣ）Ｍ換えＰＩ）
−ＥＣＧＦｋ発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞のイムノプ
ロット分析を示し℃いる。 図１４は、ＰＤ−ＥＣＧＦに対する内皮細胞及び平滑筋
細胞のグモタクティックな反応を示している。 図１５　ハ、　　（Ａ　及（ＪＢ　）　ヒョコ漿尿Ｈｔ
ｉ上ノＰ　Ｄ　−ＥＣＧＦによって誘導される血管形成
性及び（リ　ＰＤ−ＥＣＧＦと反応する抗体による血管
形成誘導の阻害を示し℃いる。 図１６は、組換えＰＤ−ＥＣＧＦを発現するｃＤＮＡク
ローンでトラ７スフェクトされたマウスα１−１腫瘍に
おける血管形成誘導についてのものである。 出　　願 人 リサーチ　コーポレーション Ｂ ＦＩＧ、５Ｂ ＴＴ ＋ ＤＴＴ（十） 時間 ＤＴＴ（ ＦＩＧ、１２Ａ ＦＩＧ、Ｉ３（物１） 、ｆｆ［ｒえＴてサックちしく戸う ＦＩＧ、１２Ｂ 一 ｂｃ 号 ｏ−ｏｐｌ”、す１つ１−Ｊ９ ｃｘ　　目　ｇｖ！　ｇ’ｔ：　　。 ｐｔｑｒｙつヨＶ９ ｐ（ｊｌｌチク：ＩＶＵ’、、； ｐ　８　目　８Ｉ４？Ｓ　　胃　０ Ｕす吋ｒ弄士のＩ？削王 手 続 補 正 書 平成２年２月８日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、血小板由来内皮細胞増殖因子からなるポリペプチド
   。 ２、該血小板由来内皮細胞増殖因子が、デスＭＡＡＬＭ
   ＴＰＧＴＧ−内皮細胞増殖因子である請求の範囲第１項
   に記載のポリペプチド。 ３、該内皮細胞増殖因子が、哺乳動物またはヒトのもの
   である請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。 ４、次なるアミノ酸配列を含有する請求の範囲第１項ま
   たは第２項に記載の組換えポリペプチド： 【遺伝子配列があります。】 ５、次なるアミノ酸配列を含有する請求の範囲第２項に
   記載の組換えポリペプチド： 【遺伝子配列があります。】 ６、該アミノ酸配列の第４７１番目のロイシンが、セリ
   ンに置き換えられている請求の範囲第１項から第５項ま
   でのいずれか一つに記載のポリペプチド。 ７、請求の範囲第１項から第６項までのいずれか一つに
   記載の血小板由来内皮細胞増殖因子のフラグメントを含
   有するポリペプチド。 ８、該フラグメントが、酵素による分解によつて得られ
   たものである請求の範囲第７項に記載のポリペプチド。 ９、該酵素による分解が、トリプシン、キモトリプシン
   、ペプシン、スブチリシン、Ｖ８プロテアーゼまたはそ
   れらの混合物によつてなされたものである請求の範囲第
   ８項に記載のポリペプチド。 １０、該内皮細胞増殖因子の化学的な開裂あるいは自然
   に起こる開裂により得られたものである請求の範囲第７
   項に記載のポリペプチド。 １１、該内皮細胞増殖因子が、組換えによるもの、ある
   いは天然由来のものである請求の範囲第９項から第１０
   項までのいずれか一つに記載のポリペプチド。 １２、血小板由来内皮細胞増殖因子に対する抗体。 １３、該抗体が、ポリクローナルなものあるいはモノク
   ローナルなものである請求の範囲第１２項に記載の抗体
   。 １４、該内皮細胞増殖因子が、組換えによるものである
   請求の範囲第１２項または第１３項に記載の抗体。 １５、血小板由来内皮細胞増殖因子をコードする組換え
   ＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子を含有する核酸分子。 １６、請求の範囲第１項から第６項までのいずれか一つ
   に記載の内皮細胞増殖因子のアミノ酸配列をコードする
   ヌクレオチド配列を含有する組換えＤＮＡ分子またはｃ
   ＤＮＡを含有している核酸分子。 １７、次なるヌクレオチド配列を含有する請求の範囲第
   １５項に記載の核酸分子： 【遺伝子配列があります。】 １８、該内皮細胞増殖因子の発現をなしうる核酸配列に
   操作可能に結合せられてなる請求の範囲第１５項から第
   １７項までのいずれか一つに記載の核酸分子を含有して
   いる複製可能な発現ベクター。 １９、該内皮細胞増殖因子をその中で発現させることが
   できるところの請求の範囲第１８項に記載の複製可能な
   発現ベクターで形質転換されたトランスホーマント微生
   物またはトランスホーマントセルカルチヤー。 ２０、形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３細胞である請求の範
   囲第１９項に記載のセルカルチャー。 ２１、形質転換されたＥ．Ｃｏｌｉ株である請求の範囲
   第１９項に記載の微生物。 ２２、哺乳動物の血小板由来内皮細胞増殖因子を活性成
   分として含有する傷病、動脈硬化症、脈管形成症、ある
   いは血小板減少症治療用組成物。 ２３、該内皮細胞増殖因子が、組換えによるものである
   請求の範囲第２２項に記載の組成物。 ２４、血小板ライゼートを陽イオン交換クロマトグラフ
   ィーにかけ、得られた活性フラクシヨンを陰イオン交換
   クロマトグラフィーにかけ、得られた活性フラクシヨン
   を硫安分画にかけ、得られた活性フラクシヨンを陰イオ
   ン交換クロマトグラフィーにかけ、得られた活性フラク
   シヨンをハイパーフオーマンスヒドロキシアパタイトカ
   ラムクロマトグラフイーにかけ、得られた活性フラクシ
   ヨンをハイパーフオーマンス疎水性カラムクロマトグラ
   フィーにかけ、均一な血小板由来内皮細胞増殖因子を回
   収することを特徴とする血小板ライゼートからの均一な
   血小板由来内皮細胞増殖因子の精製方法。