PT92613B - Processo para a obtencao de factor de crescimento de celulas endoteliais - Google Patents

Description

CAMPO DAS CEBOLAS. 1100 LISBOA TEL.: 88851 51 /2/3TELEX: 18356 INPI TELEFAX :87 53 08

INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

DIRECÇÃO DE SERVIÇOS DE PATENTES nAo preencher as zonas sombreadas

FOLHA DO RESUMO

Modalidade e n.° (Tj)	T D	Data do pedido: (22)	Classificação Internacional (51)
Requerente (7j) : LUDWIG sede em 1345 Avenue of América do Norte	NSTITUTE FOR CÂNCER RESEARCH, norte-americana, com the Américas, New York, New York 10105, Estados Unidos da
Inventores @: CARL-HENRIK HELDIN, CHRISTER WERNSTEDT, ULF HELLMAN residentes na Suécia e KOHEI MIYAZONO FUMIMARO TAKAKU e FUYUKI ISHIKAWA residentes no Japão
Reivindicação de prioridade(s) (30)	Figura (para interpretação do resumo)
Data do pedido	Pais de Origem	N.° de pedido
20.04.88	E.U.A.	288.056
Epígrafe: (54) MOLÉCULA DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA O FACTOR DE CRESCIMENTO DE CÉLULAS ENDOTELIAIS, VECTOR COMPREENDENDO TAL MOLÉCULA, MICROORGANISMO E CULTURA DE CÉLULAS TRANSFORMADOS COM O REFERIDO VECTOR E COMPOSIÇÕES TERAPÊUTICAS COMPREENDENDO O REFERIDO FACTOR RECOMBINANTE
Resumo: (máx. 150 palavras) (57) O presente invento diz respeito a uma molécula de ácido nucleico que codifica o factor de crescimento de células endoteliais, derivado de plaquetas, (PD-ECGF), que é um mitogénio de células endoteliais 45 kDa. De acordo com o processo do invento o referido factor é purificado até à homogeneidade a partir de plaquetas humanas. Não se liga à heparina e não estimula a proliferação de fibroblastos, ao contrário de outros mitogénios endoteliais da família do factor de crescimento de fibroblastos (FGF). O PD-ECGF parece ser o único factor de crescimento de células endoteliais em plaquetas humanas e dados recentes indicam que tem actividade ancioeénica in vitro, i.e.. a capacidade de estimular a formação de novos vasos sanguíneos e actividade quimiotáctica, in vitro. O presente invento fomece um PD-ECGF em quantidades substancialmente maiores do aquelas de que se dispunha no passado, a estrutura primária do PD-ECGF, vectores compreendendo a referida molécula de ácido nucleico e microorganismos e culturas de células transformados com o referido vector. O invento revela também uma preparação terapêutica do PD-ECGF.

ηςρ.4 factor de crescimento para células endoteliais derivado de plaquetas (PD-BCGF) é um mitogénio de células endoteliais com 45 KDa que foi purificado até à homogeneidade a partir de plaquetas humanas. Não se liga a heparina e não estimula a proliferação do fibroblastos ao contrário de outros mitogénios endoteliais da familia do factor de crescimento para fibroblastos (FGF).

PD-ECGF parece ser o único factor de crescimento para células endoteliais nas plaquetas humanas e dados recentes indicam que ele possui actividade angiogénica in vitro, i.e. a capacidade para estimular a formação de novos vasos sanguíneos e actividade quimiotática, in vitro. O presente invento proporciona um PD-ECGF em quantidades substancialmente maiores do que anteriormente, a estrutura primária do PD-ECGF, anticorpos contra PD-ECGF, clones do seu cDNA e suas variantes. 0 invento também proporciona uma preparação terapêutica de PD-ECGF.

Os factores de crescimento polipeptideos desempenham um papel importante na estimulação de proliferação de células alvo as quais estão envovlvidos nos processos celulares normais e nos estados de doença. Alguns exemplos de processos que enraivem proliferação celular são, por exemplo, substituição de tecido epidérmico e respostas do sistema imune.

A hemóstase, que consiste na prevenção da perda de sangue, é um processo contínuo que requere a subs tituição constante do tecido vascular. 0 crescimento das células endoteliais vasculares tem um papel central numa variedade de processos fisiológicos e patológicos, como seja angiogénese, cicatrizaçao de feridas, arteriosclerose e cres cimento de tumores. No caso do trauma vascular, entra em funcionamento uma série complexa de acontecimentos para man-4-

ter a hemóstase. A resposta inicial ao trauma inclui activação da obturação com plaquetas, coagulação do sangue e eventualmente recrescimento ou reparação do tecido danificado. Este passo final deve ser activado na altura e local certos e no tecido correcto. Uma função dos factores de crescimento polipeptidicos é mediar esta resposta de modo especifico relativamente à altura e ao tecido.

Os factores de crescimento peptidicos e polipeptidicos foram isolados a partir de muitas fontes. Estas incluem tecido epidérmico, tecido neutro, plaquetas tecido de placenta e outros. Estes factores peptidicos e proteicos distinguem-se por uma variedade de propriedades incluindo a especificidade das células alvo, afinidade ou interacção com heparina, propriedades secretoras e propriedades fisicoquimicas tais como peso molecular, carga, estabilidade ao fçãlor, sensibilidade ao pH e susceptibilidade aos agentes redutores.

crescimento das células endoteliais é estimulado por uma classe de factores de crescimento polipeptidicos conhecidos como factores de crescimento fibroblástico (FGFs). Estes factores mitogénicos são caracterizados pelas suas propriedades de ligação a heparina. A heparina é um agente anticoagulante poderoso normalmente encontrado em quantidades minimas no sistema circulatório, os FGFs caem em duas classes distintas de proteínas, ácidas e básicas e foram identificados em tecido neural e outros.

(Baird, et al♦, 1986; hobb et al, 1986; Thomas et al, 1986).

Recentemente, demonstrou-se que a proliferação de células endoteliais é estimulada por um novo factor de crescimento polipeptidico distinto de outros factores de crescimento polipeptidicos conhecidos deri\ados de plaquetas humanas frescas (Miyazona et al., 1985 a,b). Este

factor foi originalmente designado fector de proliferação de células endoteliais vasculares e mais tarde denominado factor de crescimento de células endoteliais derivado de plaquetas PD-ECGF.

As plaquetas são uma fonte rica de factores de crescimento para uma variedade de tecidos hemopoiéticos e outros tecidos. Os factores de crescimento derivados de plaquetas que foram identificados e caracterizados incluem factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) que estimula o crescimento de fibroblastos e de células de músculo liso vascular mas que não tem efeito sobre as células endoteliais; factor de crescimento transformante- (X- (TGF-òó ) que está esteritamente relacionado com o factor de crescimento epidérmico (EGF) e que pode estimular o crescimento de células epidérmicas mas não o de células endoteliais; factor de crescimento transformante- (TGF-β ) que estimula sinergisticamente o crescimento de fibroblastos na presença de EGF e é ainda um inibidor forte de crescimento de células endoteliais; um factor de crescimento de hepatócitos; e o factor de crescimento de células endoteliais derivadas de plaquetas (PD-ECGF), o tema deste invento.

Uma actividade promotora do crescimento foi parcialmente purificada e caracterizada por Miyazono et al (1987). As caracteristicas que se sequem foram usadas para distinguir esta actividade das previamente identificadas para outros factores de crescimento: Células de endotélio 3 vascular porcinas foram estimuladas para incorporarem H-timidina no DNA de modo dependente da dose quando do tratamento com um ljaado solúvel de plaquetas humanas frescas. O lisado de plaquetas humanas frescas. 0 lisado de plaquetas também promoveu a proliferação celulâu em cerca de 100% acima de uma cultura testemunha tratada com 1% de soró- fetal bovino.

O fraccionamento do lisado revelou que a actividade que surgiu na gama de Mr 20 000 numa coluna de filtração em gel 3

Sephadex G-75, estimulou a incorporação de H-Timidina no DNA de células do endotélio vascular porcino mas não em fibro blastos NRK, era provavelmente distinta de PDGF que migrou com uma Mr 30 000 nesta coluna e estimulou fibroblastos mas não células endoteliais, era mais potente quando preparada a partir de plaquetas frescas do que a partir de plaquetas velhas, era sensivel ao calor e aos ácidos, resistente ao agente redutor ditiotreitol e sensivel à tripsina, guanidinio -HC1, e ureia, estes dois últimos sendo desnaturantes. Quando baseado nestas caracteristicas concluiu-se que a actividade promotora do crescimento era um factor de crescimento polipeptidico distinto de qualquer um previamente identificado em plaquetas humanas.

Angiogénese é a formação de novos vasos sanguineos capilares por crescimento de vasos existentes.

É um processo importante na cicatrização de feridas e no crescimento de tumores. Foram identificados certos factores polipeptidicos que estimulam este processo devido à sua actividade mitogénica ou quimiotética para células endoteliais .

Os mitogénios são substâncias que estimulam a proliferação de célula e são geralmente pequenas moléculas tais como ésteres de forbol, polissacarideos, peptideos, proteinas ou combinação delas. Taxis é a migração dirigida de células em resposta a um estimulo ambiental. A quimiotaxis é portanto uma resposta a quimicos no ambiente. Para as células eucarióticas, os factores quimiotéticos conhecidos incluem histamina, aminoácidos, peptideos e proteinas.

Fcatores polipeptidicos que induzem respostas angiogénicas incluem FGFs, TGF- TGF-3^, factor

de necrose tumoral e angiogenina (Folkman et al 1987 a, b; Frater-Schroder et al. 1987; Leiborrich et al 1987). Estes factores apresentam efeitos múltiplos numa larga variedade de tipos celulares. Ao contrário destes factores, o factor de crescimento de células endoteliais derivado de plaquetas humanas estimula especificamente células endoteliais.

A proliferação de células endoteliais dentro de vasos sanguíneos grandes é importante para a regeneração de endotélio danificado e provavelmente desempenha um papel na presenção da arteriosclerose. A arteriosclerose é um estado em que lesões ou placas ricas em lipidos se desenvolvem nos vasos sanguíneos e podem conduzir a numerosas doenças vasculares. Pensa-se que a alteração na camada de células endoteliais seja um acontecimento precoce na arterios clerose. As plaquetas aderem às células do endotélio danifica das e libertam mitogénios para estimular a regeneração de células do músculo liso e endoteliais. PD-ECGF encontra-se entre os mitogénios que são libertados.

Nas doenças associadas à redução do número de plaquetas por exemplo trombocitopenia. PD-ECGF e outros mitogénios de plaquetas e factores quimiotáticos podem proporcionar benefícios terapêuticos. Certas drogas podem também induzir a destruição de plaquetas ou supressão. Assim, o suplemento da terapia com drogas com mitogénios de plaqiuetas pode evitar efeitos secundários indesejáveis.

A presente fonte de PD-ECGF é plaquetas humanas frescas fazendo a purificação de grandes quantidades desta proteína muito dispendiosa e pouco segura dado o sangue humano poder conter agentes infecciosos. Uma vez que PD-ECGF é sensivel ao calor, a esterilização ou pasteurização prévia do sangue destruirá a sua actividade. Para se obter quantidades de PD-ECGF para estudos e para se conseguir quantidades terapêuticas, pretende-se uma fonte mais facilmente disponivel. A clonagem do gene de PD-ECGF permitiria a construção de vectores de expressão que produziriam grandes quantidades de PD-ECGF.

As técnicas da tecnologia de DNA recombinante estão bem estabelecidas. Se bem que existam numerosos manuais que descrevem a estratégia e metodologia pa xa a clonagem de genes, muito do trabalho permanece imprevisi vel não existe ainda garantia de sucesso. Cada experiência de clonagem pode apresentar os seus problemas e pontos fracos especiais. Uma estratégia tipica para a clonagem de genes eucarióticos é isolar mRNA, transcrevê-lo em cDNA que depois é inserido num vector replicável, transformar um hospedeiro adequado com a construção e identificar o clone pretendido através de qualquer um de vários processos incluindo actividade funcional ou complementação e depiste com anticorpos ou oligonucleotideos. Um problema peculiar para alguns genes eucarióticos é encontrar um tecido num estado de desenvolvimento ou diferenciação que esteja a expressar o produto do gene pretendido, ou seja contendo o mRNA do gene pretendido. A fonte de PD-ECGF é plaquetas que são células enucleadas e portanto não contêm DNA ou mRNA. Assim, para cLonar o gene de PD-ECGF é necessário encontrar um tecido ou linha celular em cultura que produza PD-ECGF.

O presente invento compreende o factor de crescimento de células endoteliais derivado de plaquetas homogéneo e um método melhorado para a sua purificação até à homogeneidade a partir de plaquetas humanas frescas. PD-ECGF é um mitogénio de células endoteliais com 45 kDa que não se liga à heparina e que não estimula a proliferação de fibroblastos ao contrário de uma outra classe de antigénios de células endoteliais que pertence à familia de FGf. PD-ECGF possui actividade angiogénica e quimiotá-9-

tica. Existindo maiores produções de PD-ECGF pode-se obter uma sequência de aminoácidos parcial a partir de fragmentos tripticos assim como a partir de fragmentos obtidos com protease V8 e CNBR. 0 presente invento proporciona fragmentos peoteoliticos de PD-ECGF e a sua utilização na obtenção da sequência de aminoácidos de PD-ECGF e suas variantes. 0 PD-ECGF do presente invento proporciona variantes de PD-ECGF.

O presente invento relaciona-se com um polipeptideo compreendendo o factor de crescimento de células endoteliais recombinante derivado de plaquetas.

presente invento relaciona-se ainda com um anticorpo contra o factor de crescimento de células endoteliais derivado de plaquetas.

Em adição, o presente invento está relacionado com uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma molécula de DNA recombinante ou uma molécula de cDNA do factor de crescimento de células endoteliais derivado de plaquetas.

O presente invento também está relacionado com um factor de crescimento de células endoteliais derivado de plaquetas de mamifero para usar na preparação de uma composição terapêutica útil no tratamento de feridas, arteriosclerose, angiogénese ou trombocitopenia.

presente invento está ainda relacionado com um processo para a purificação de factor de crescimento de células endoteliais derivado de plaqxetas homogeneo a partir de um lisado de plaquetas caracterizado por se submeter o lisado a cromatografia de permuta catiónica, reunir as fracções activas resultantes a cromatografia de

permuta aniõnica, reunir e submeter as fracções activas xssultantes a precipitação com sulfato de amónio, reunir e submeter as fracções activas resultantes a cromatografia de permuta aniõnica, reunir e stabmfeter as fracções activas resultantes a cromatografia em aaJh.una de hidroxilapatite de alta resolução, reunir e submeter as fracções activas resultantes a cromatografia em coluna hidrófoba de alta resolução e recuperação do referido factor de crescimento de células endoteliais derivado de plaquetas homogéneo.

Fig. 1 ilustra a purificação cromatográfica de PD-ECGF humano em DEAE-Sepharose.

Fig. 2 ilustra a purificação cromatográfica de PD-ECGF humano em hidroxilapatite.

Fig. 3 ilustra a purificação cromatográfica de PD-ECGF humano numa coluna Mono Q.

Fig. 4 ilustra a purificação cromatográfica de PD-ECGF humano numa coluna TSK-64000 SW.

Fig. 5 ilustra a purificação cromatográfica de PD-ECGF humano numa coluna de Superose 12.

A) Perfil da coluna. B) Gel de SDS-poliacrilamida das fracções purificadas de PD-ECGF humawe . C) Gel de SDS-poliacrilamida de PD-ECGF puro na presença ou ausência de um agente redutor.

Fig. 6 ilustra a purificação cromatográfica de PD-ECGF humano numa coluna de hidroxilapatite de alta resolução. A) Perfil da coluna B) Análise de fracções por electroforese em gel de SDS e coloração com prata*

Fig. 7 ilustra a purificação cromatográfica de PD-ECGF humano numa coluna de alguil-Superose.

A) Perfil da coluna. B) Análise de fraeções por electroforese em gel com SDS e coloração com prata. C) Análise do material purificado por electroforese em SDS e coloração com prata em condições não redutoras.

Fig. 8 ilustra a separação de fragmen tos de peptideos tripticos de PD-ECGF humano por HPLC de fase reversa em poro apertado.

Fig. 9 mostra a sequência de aminoácidos de PD-ECGF humano obtida por sequenciação de fragmen tos peoteoliticos de PD-ECGF.

Fig. 10 ilustra uma análise de imunotransferência de um extracto de placenta humana.

Fig. 11 mostra um mapa de restrição eqtratégia de sequenciação e sequência de nucleotideos de DNA de placenta humana.

Fig. 12 ilustra (A) análise por transferência Southern de DNA humano e (B) análise por transferência Nortern de RNA de placenta.

Fig. 13 ilustra (A e B) a biossintese de PD-ECGF recombinante em células NIH 3T3 e (C) análise por imunotransferência de células NIH 3T3 que expressam PD-ECGF recombinante.

Fig. 14 mostra a resposta quimiotática a PD-ECGF por células endoteliais e células de músculo liso.

Pig. 15 ilustra (A e B) a indução de angiogénese por PD-ECGF na membrana corioalantóica de galinha e (C) inibição da indução de angiogéçese por anticorpos que reagem com PD-ECGF.

Fig. 16 ilustra a indução de angiogénese em tumores a 1-1 de ratinho transfectados com clones de cDNA expressando PD-ECGF recombinante.

As células endoteliais vasculares fazem uma monocamada funcional entre o sangue e o tecido subjacente. Numa parede de vaso normal, sabe-se que as células endoteliais existem num estado de crescimento quiescente. A proliferação das células endoteliais é um componente chave para uma série de processos biológicos tais como cicatrização de feridas, trombose, arterisclerose e crescimento de tumores. Assim, os factores gue regulam a proliferação de células endoteliais desempenham um papel importante nestas condições.

Os factores com capacidafe para estimular a formação d'<a vasos sanguineos estão apontados como agentes causadores da angiogénese de tecido normal e maligno e isto está revisto por Folksman Klagsburn (1987a) Os factores melhor catacterizados nesta categoria são FGFs gue constituem uma familia de mitogéniso de células endoteliais que se ligam a heparina originalmente isolados a partir de tecido neural mas também são encontrados em macrófagos e outros tecidos. Um outro mitogénio de células endoteliais é PD-ECGF.

A actividade promotora do crescimento de PD-ECGF pode ser testada determinando a incorporação de 3

H-timidina no DNA de células endoteliais. As células tipica

mente usadas no ensaio são células endoteliais de aorta porcina, sendo as células endoteliais da aorta bovina e as células do endotélio umbilical humano também estimuladas por PD-ECGF. No ensaio podem ser usadas outras linhas de células endoteliais estabelecidas em cultura sendo preferidas as células de aorta porcina para os ensaios de rotina.

A actividade promotora do crescimento de PD-ECGF foi também testada medindo a proliferação celular Neste ensaio, células frescas são semeadas em cultura e o número real de células presentes é determinado e comparado com uma testemunha que não recebeu PD-ECGF. As linhas celulares em culturas adequadas a este ensaio são as mesmas descritas no ensaio de incorporação de H-timidina.

Quando testado em culturas, PD-ECGF 3 nao estimula a incorporação de H-timidina no DNA nem induz proliferação celular.

PD-ECGF de plaquetas, especialmente de plaquetas humanas , foi purificado em pequenas quantidades (Miyazono et al 1987). Foi até agora caracterizado como um polipeptideo de 45 KDa que é sensivel ao calor e aos ácidos, resistente aos agentes redUores tais, como ditiotreitol e outros, e aos ácidos, resistente aos agentes redutores tais como ditiotreitol e outros, e sensivel à degradação proteolitica, especialmente pela tripsina e outras proteases serina e por várias outras proteases bem caracterizadas. A existência de maiores quantidades de PD-ECGF puro permite pelo menos obter uma sequência de aminoácidos parcial de modo a facilitar a clonagem do seu gene.

A purificação de PD-ECGF é complicada pelo facto de PD-ECGF ocorrer em pequenas quantidades

nas plaquetas e a sua actividade biológica sensivel ao calor e aos ácidos. O processo descrito por Miyazono et al (1987) é um processo de sete passos usando cromatografia convencional e Fast performance Liquid Chromatography (FPLC). 0 presente invento inclui um processo de purificação melhorado que resulta numa maior pureza e em rendimentos substaacialmente superiores de PD-ECGF.

presente processo de purificação começa com uma fracção de um lisado de plaquetas na purificação de PDGF. Esta fracção é obtida por cromatografia de permuta catiónica em CM-Sephadex. O primeiro passo é cromatografia de permuta aniónica em bloco em QAE-Sephadex.

Em seguida, as fracções reunidas são concentradas por precipitação com sulfato de amónio a cerca de 42% de saturação. O terceitro passo é também cromatografia de permuta aniónica mas em DEAE-Sepharose. Os três passos seguintes são todos cromatográficos envolvendo cromatografia de adsorção em hidroxilapatite, cromatografia de permuta aniónica em coluna Mono Q ligada a um sistema de FPLC (Pharmacia) e filtração em gel numa coluna TSK-G4000 SW. 0 passo final é cromatografia de interecção hidrofóbica numa coluna de Superose 12.

presente invento é dirigido a um processo mais rápido tendo menos passos para a purificação de PD-ECGF que resulta numa purificação de aproximadamente 1250 000 vezes com um rendimento de aproximadamente 14%, de preferência em cinco passos.

O processo é o mesmo de atrás até à cromatografia de permuta aniónica em DEAE-Sepharose inclusive. Outrasvvariações da purificação são também possiveis mesmo até esta fase. Por exemplo, o lisado de plaquetas pode ser preparado de fresco e não precisa de ser uma frac-15-

ção da purificação de um outro factor como seja PDGF. As resinas cromatográficas empregues como descrito atrás são preferidas para o processo de purificação mas podem ser substituidas por outras resinas equivalentes existentes no mercado com resultados comparáveis. A precipitação com sulfato de amónio é também feita a cerca de 42% de saturação; no entanto, uma pessoa familiarizada com a matéria pode facilmente ajustar esta quantidade conforme necessário para precipitar a quantidade máxima de actividade de PD-ECGF.

O melhoramento no processo de purificação é uma redução do número de passos após a cromatografia de permuta aniónica em DEAE-Sepharose e aceleração ao processo usando técnicas de separação cromatográfica mais rápidas que são proporcionadas por HPLC, FRPLC e similares.

O presente processo proporciona ECGF homogéneo com rendimentos elevados e evidenciando maior actividade biológica do que a previamente disponível.

Especificamente, as fracçSes obtidas a partir do passo de DEAE-Sepharose são reunidas e sujeitas a cromatografia de afinidade de alta resolução numa coluna de hidroxilapatite, Isto é seguido de um passo de purificação final usando cromatografia de intercação hidrofóbica de alta resolução. A resina preferida para este passo é alquil-Superose mas são Igualmente adequadas outras resinas hidrofóbicas. Tais resinas existem também no mercado. Alguém fanfiLiarizado com a área pode facilmente determinar outras resinas adequadas.

Num outro aspecto do presente invento são induzidos anticorpos contra PD-ECGF. Os anticorpos são úteis na identificação de uma fonte de tecidos ou células que expressem PD-ECGF, uma vez que as plaquetas são células enucleadas e portanto contêm DNA para expressão de

proteina. Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais qualquer um deles podendo ser preparados por métodos bem conhecidos.

Os anticorpos do presente invento são induzidos contra o factor de crescimento de células endoteli ais homogéneo, PD-ECGF homogéneo ou PD-ECGF recombinante.

A fonte de factor de crescimento de células endoteliais ou PD-ECGP pode ser de mamíferos ou humanos e é purificado até um nivel de homogeneidade adequado à indução de anticorpos. Os anticorpos policlonais são preparados em coelhos cabras, carneiros e roedores através da injecção de PD-ECGF puro ou parcialmente purificado no animal. Após uma série de injecções colhe-se o soro do animal e testa-se quanto â presença do anticorpo pretendido. 0 meio de identificação de um anticorpo policlonal contra PD-ECGF inclui imunotransferência, ELISA, ensaio de difusão de Ouchterlomy radioimunoensaio e outros métodos bem conhecidos no campo (ver por exemplo, Johnstone et al., 1982). No caso de imunotransferência, PD-ECGF puro migra num gel de SDS-acrilamida e depois é transferido para nitrocélulose por transferência electroforética num tampão adequado. Após bloqueio dos sitios de ligação a proteicos residuais usando qualquer um de uma série de agentes bloqueadores incluindo albumina de soro bovina, Tween-20, leite em pó desnatado e gelatina ou outros agentes bloqueadores, a atransferência é tratada com o anti-soro a ser testado. Isto é seguido de detecção 125 do anticorpo ligado por meios de detecção tais como I-Proteina A com autorradiografia ou segundos anticorpos conjugados com enzimas que dão uma côr visivel ou fluorescência quando do tratamento com o seu substracto.

Os anticorpos monoclonais contra PD-ECGF foram preparados por métodos conhecidos. Um protocolo de um método é injectar PD-ECGF puro (ou parcialmente puro)

num ratinho, remover o seu baço após uma ter sido induzida uma resposta contra o antigênío, fundir as células de baço produtoras de anticorpos com uma linha de mieloma e testar os hibridomas resultantes quanto à produção de um anticorpo que reage com PD-ECGF por despiste por meio de cultura dos hibridomas. Um método de despiste é a utilização de imunotransferências como descrito abaixo. Como alternativa o despiste pode ser feito por transferências como descrito abaixo. Como alternativa o despiste pode ser feito por transferência de pontos ou por imunofluorescência de um tecido ou linha celular que contém PD-ECGF.

O presente invento proporciona um ácido nucleico codificador do gene do factor de crescimento de células endoteliais. 0 ácido nucleico pode ser uma molécula de DNA ou de RNA, seddo especialmente preferido uma molécula de DNA complementar (cDNA). A molécula de cDNA contem a sequência de nucleotídeos codificadora de um factor de crescimento de células endoteliais humanas de mamifero. Como alternativa, o cDNA contem a sequência de nucleotídeos codificadores de PD-ECGF humano ou de mamifero. A sequência de nucleotídeos pode ser derivada da sequência de aminoácidos do PD-ECGF de placenta humana ou da sequência de aminoácidos do PD-ECGF de plaquetas humanas. PD-ECGF difere da fonte placentária em dez aminoácidos e uma única alteração de residuo de leucina para serina na produção 471.

A clonagem do gene PD-ECGF requere a identificação de uma fonte de mRNA a partir de uma linha celular ou tecido que expressa PD-ECGF devido à fonte principia de PD-ECGF são as plaquetas que são células sem núcleo. Várias linhas de células hematopoiéticas foram testadas quanto à presença de PD-ECGF usando um anticorpo policlonal ou monoclonal e imunotransferência de extractos destes tecidos. Deve-se esperar que as células hematopoiéticas também produzam PD-ECGF uma vez que estão relacionadas

\· com as plaquetas; no entanto nenhuma das linhas examinadas produziu PD-ECGF. O tecido de placentas humanas foi testado do mesmo modo e verificou-se expressar PD-ECGF. Os anticorpos policlonais com grande probabilidade darão reacção cruzada com PD-ECGF de outras fontes de mamifero. Assim, outros tecidos humanos e de mamiferos podem ser facilmente testados por estes métodos para determinar se eles expressam PD-ECGF e se proporcionam fnntes de mRNA para clonagem dc gene PD-ECGF.

mRNA poli (A) + purificado foi isolado por processos bem conhecidos. 0 método de Han (1987) é um desses métodos mas outros podem ser encontrados nos manuais de Daboratório convencionais abre tecnologia de DNA recombinante.

mRNA seleccionado é transcrito numa molécula de cDNA usando transcriptase reversa para fazer a cadeia primária, dotado de caudas oligo (dG) com transferase terminal e obtenção da molécula de cadeia dupla usando iniciadores oligo (dC). Outros métodos de preparação de cDNAs para clonagem podem também ser encontrados noa manuais de laboratório convencionais sobre tecnologia de DNA recombinante.

cDNA é inserido num vector replicável que pode incluir derivados de bacteriófagos, são especialmente preferidos os vectores do fago lambda que incluem mas não estão limitados a^gtlO e^gtll.

clone pretendido pode ser detectado por uma série de técnicas. Pode-se usar anticorpos quando um vector de expressão replicável tal como / gtll é usado na clonagem. Os oligonucleotideos marcados radioactivamente são úteris na identificação de um gene pretendido. A sequên-19-

cia para o oligonucleotideo é deduzida a partir da sequência de aminoácidos do PD-ECGF pelo método de Lathe (1985) ou por consulta do código genético para a sequência de aminoácidos dada. De preferência selecciona-se uma região da sequência de aminoácidos que utili2a o máximo de codões únicos. Os oligonucleotidicos podem ser sintetizados por métodos bem conhecidos em sintetizadores de DNA automáticos e podem ter qualquer comprimento entre cerca de 15 e cerca de 100 núcleotideos. As sequências das sondas de oligonucleotideos do presente invento estão descritas nos exemplos. A hibridação das sondas com clones portadores potenciais de inserções está atmbém bem estabelecido e os métodos para tal podem ser encontrados em manuais de laboratório convencionais sobre tecnologia de DNA recombinante.

Os clones portadores de gene PD-ECGF são sequenciados por terminação de cadeias didesoxi pelo método de Sanger ou pelo método quimico de Maxam e Gilbert.

Os clones de cDNA de PD-ECGF são úteis para a identificação de genes homólogos em mamiferos determinação da organização genómica do gene de PD-ECGF em mamiferos, identificação de produtos da transcrição do gene de PD-ECGF clonagem do gene genómico, especialmente humano e na construção de sectores de expressão para produzix PD-ECGF recombinante a partir de mamiferos, especialmente humanso. A identificação de genes homólogos e determinação da estrutura do gene genómico são feitas por hibridação Southern do DNA genómico total. O mRNA celular é analisado por transferência Northen. As técnicas de transferência Southern e Northern são largamente praticadas e a metodologia para a sua realização está disponivel nos manuais de laboratório convencionais sobre tecnologia de DNA recombinante. Para clonar o gene de PD-ECGF genómico, usa-se a tecnologia descrita neste invento excepto usar-se como fon-20-

te de DNA o DNA genomico e a sonda de hibridação ser o clone de cDNA em vez de oligonucleotideos.

A sequência de aminoácidos deduzida para PD-ECGF de placenta humana difere do PD-ECGF de plaquetas humanas em um aminoácido na posição 471 onde um residuo leucina substitui um residuo serina identificado por sequenciação de aminoácidos directa. Ele também possui mais dez aminoácidos no extremo amina da proteina. Desconteze-se se esta diferença é o resultado de um caso de processamento. Outras variantes de PD-ECGF podem ser clonadas a partir de outros tecidos tais como tecido de placenta bovina ou porcina e outros tecidos. Estas variantes são úteis na substituição de PD-ECGF humano em utilizações terapêuticas que estão descritas abaixo.

Tais vectores contêm uma ou mais marcas seleccionáveis para a manutenção do plasmideo e de elementos das sequências de DNA qB estão operacionalmete ligadas a um gene para controlar a expressão daquele gene. Estes elementos de sequências de DNA incluem promotores, elementos potenciadores, sinais de terminação da transcrição e sitios de poliadenilação. os três últimos não são sempre necessários e dependerão do vector de expressão replicável e dos sistemas hospediros que é usado para se obter a expressão. os promotores são elementos de sequências de DNA que controlam a exporessão de genes, os promotores procarióticos que são úteis incluem o promotor lac, o promotor trp, os promotores P^ e Ρ_β de lambda e o promotor da polimerase de T7. os promotores eucarióticos são também úteois no invento e incluem promotores de origem virai e promotores de levedura, especialmente LTR do Virus da leucemia de MoConey.

A expressão de PD-ECGF é obtida por subclonagem do seu gene num vector de expressão replicável. Vectores de expressão replicáveis que são adequados â expressão de PD-ECGF incluem vectores bacterianos e bacteriofagos que podem transformar tais hospedeiros tais como E. coli, B. subtilis e outros microorganismos. Muitos destes vectores são baseados em pBR322 incluindo Bluescript (adquirido à Stratagene) e são bem conhecidos na área, os vectores bacteriofagos que são usados no invento incluem lambda e M13.

Outros vectores adequados para a expressão de PD-ECGP não derivados de fontes eucarióticas.

Os vectores de expressão que funcionam em levedura e culturas celulares são usados para expressar PD-ECGP. Estes vectores incluem plasmideos de leveduras, vectores de retrovirus, vectores de BPV , vectores de baculovirus e outros vectores váxais. As células em cultura de tecidos que são usadas com vectores de expressão replicáveis eucarióticas incluem células NIH3T3, células L de ratinho, células COS-7, células HeLa e outras linhas celulares de cultura estabelecida, as células NIH 3T3 são as preferidas.

Os vectores de expressão replicáveis deste invento são feitos por subclonagem da inserção de cDNA de PL8 no vector pretendido. Neste invento, um vector de expressão replicável é o plasmideo pLY, ele possui LTR do virus da leucemia de MOConey para conduzir a transcrição de cDNA e um gene da neomicina como marca selectiva. Quando o cDNA para PD-ECGP é subclonado neste vector, faz-se o plasmideo pLPLBJ. Este vactor é usado para transformar células NIH3T3 pelo método de coprecipitação com CaPO^. A análise de um lisado celular e de meio condicionado de uma célula transformada com pLPLQS revelou actividade promotora do crescimento de células endoteliais de aorta porcina no

lisado celular mas não no meio condicionado. A actividade é inibida por anticorpos contra PD-ECGF e quando da imunotransferência com anticorpos contra PD-ECGF revela a presença de uma proteina PD-ECGF de 45 kDa.

Outros vectores de expressão replicáveis foram construídos e testados de modo semelhante.

Os familiarizados com a matéria têm à sua disposição muitas escolhas de vectores de expressão replicáveis, hospedeiros compatíveis e métodos toem conhecidos para fazer e usar 03 vectores.

Os microorganismos transformantes e células em cultura são feitos introduzido um vector de expressão replicável ao sistema por transformação. Os processos para a transformação são toem conhecidos e incluem tratamento com CaClg e electroporação de células bacterianas, co-precipitam com CaPO^, fusão de protoplastos e electropora ção para células eucarióticas. Os métodos detalhados para estas técnicas podem ser encontrados nos manuais de laboratório convencionais sobre tecnologia de DNA recombinante.

PD-ECGF homogéneo foi sequenciado ao nivel da proteina e tem a sequência:

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PD-ECGF estimula a quimiotaris e a proliferação de células endoteliais in vitro e induz angiogénese in vitro. Angiogénese, a formação de novos vasos sanguineos capilares por extensão de vasos pré-existentes é um processo importante na embriogénese, cicatrização de feridas e regeneração de orgãos. Em adição, em vários estados patológicos ocorre angiogénese aberrante, como seja no crescimento de tumores, em certas retinopatias e em artrite reumatóide. A angiogénese e um processo complexo que envolve vários passos, incluindo migração e proliferação de células endoteliais (Folkman et al. , 1987a). Foram identificados certos factores polipeptidicos que estimulam este processo, e.g. factores de crescimento de fibroblastos factor de crescimento transformante-(Z e factor de necrose tumoral e angiogenina (Folkman et al 1987 a, Frater-Schroder et al, 1987; Leibovich et al, 1987 .). Estes factores induzem a resposta angiogénica directamente devido à sua actividade mitogénica β/ou quimiotática para células endoteliais ou por mecanismos indirectos desconhecidos.

Ao contrário destes factores que têm efeitos múltiplos numa grande variedade de tipos celulares, um factor de crescimento de células endoteliais derivado de plaquetas humanas (PD-ECGF) estimula especificamente o crescimento de células endoteliais in vitro (Miyazono et al, 1987) e.g. não estimula o crescimento de fibroblastos. PD-ECGF é uma proteina de 45 KDa distinta dos factores de crescimento prévaimente conhecidos.

O factor de crescimento de células endoteliais é útil na indução de angiogénese, aceleração da cicatrização de feridas, prevenção da arteriosclerose e tratamento de trombocitopenia por administração de uma quantidade terapêutica a um mamifero. Prefere-se que PD-ECGF homogéneo ou racombinante seja administrado em quantidades terapêuticas a mamiferos incluindo humanos.

PD-ECGF também estimula a quimiotaxis de células endoteliais in vitro e induz a angiogénese in vitro em células endoteliais, especialmente a membrana coriolantóica de galinha (CAM). Os anticorpos contra o factor, que neutraliza a boa actividade mitogénica in vitro também inibiram grandemente a resposta angiogénica. Assim, PD-EEGF é um novo factor angiogénico apresentando especificidade para células alvo contra células endoteliais.

Para identificar o domínio quimiotático de PD-ECGF que induz a quimiotaxis de células endoteliais in vitro fragmentos proteoliticos, de PD-ECGF foram testados quanto à sua capacidade para induzir respostas quimiotáticas de células endoteliais como descrito. Os fragmentos proteoliticos foram preparados por hidrólise química ou enzimática de PDÉCGF, especialmente por tripsinado tipo protease serina, por protease V8 e por clivagem induzida por CNBR. Os fragmentos foram purificados por HP66 de fase reversa. Os fragmentos foram então testados em ensaios de quimiotaxis com células endoteliais de mamifer especiámente células bovinas e porcinas. 0 ensaio de quimiotaxis é o mesmo usado para testar a actividade quimiotática de PD-ECGF nativo ou recombinante.

O presente invento mostra que PD-ECGF é um factor angiogénico de um novo tipo. A estimulação do crescimento e quimiotaxis de células endoteliais são propriedades in vitro que o PD-ECGF tem em comum com outros factores de angiogénese conhecidos (e.g. os FGFs). Ao contrário destes, no entanto, PD-ECGF apresenta especificidade de células alvo para células endoteliais em ensaios de proliferação assim como de quimiotaxis. Assim, ele pode induzir especificamente e directamente respostas endoteliais que são cruciais para a angiogénese. PD-ECGF é o único mitogénio endotelial presente num lisado de plaquetas e pode assim ser um factor importante envolvido nos processos mediados por plaquetas como sejam a cicatrização de feridas e a vascularização de trombas. Em adição, ele pode ser de considerável importância como factor intralulinavel capaz de regular a renovação de células endoteliais se libertado a partir das plaquetas. A proliferação de células endoteliais dentro de vasos maiores é importante para a regeneração de endotélio danificado e portanto importante para a prevenção de arteriosclerose. A disponabilidade de PD-ECGF recombinante funciponalmente activo combinado com um método de purificação de alto rendi: mento para clones de cDNA e anticorpos específicos tornará agora possível abordar questões relacionadas com a função in vitro de PD-ECGF e proporcionar PD-ECGF suficiente para uso terapêutico.

EXEMPLOS

Culturas celulares e meios

Colheram-se células endoteliais a partir de aorta porcina fresca usando digestão com colagenase como descrito por Bogese et al (1975). A clonagem de células endoteliais foi efectuada semeando células isoladas como descrito originalmente por Puck et al (1956). As células endoteliais foram mantidas em frascos de cultura de cm em meio F-10 de Ham contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e antibióticos e subscultivadas usando 0,25% de solução de tripsina (Gibco) guando as células atingiram a confluência. Não houve evidência de transformação ou perda da monocamada endotelial nestas condições durante mais de seis meses. Obtiveram-se fibroblastos de rim de rato normal (NRK) pelo método descrito por Duc-Nguyen et al (1966) e subsultivaram-se em meio de Eagle modificação de Dubecco contendo 10% de FBS.

Determinação do número de células

Para experiências de crescimento, as células endoteliais foram subcultivadas a uma densidade de sementeira de 20 000 células/placa numa placa de cultura de tecidos de 35 mm (Corning) usando meio F-10 de Ham contendo 10% de FBS. As células foram incubadas durante 24 h para permitir a adesão e depois o meio foi mudado para o meio a testar. As células foram removidas das placas por incubação durante 15 min em tripsina-EDTA e o número de células foi determinado em duplicado. As culturas foram novamente alimentadas com meio teste fresco no Dia 4.

Preparação do lisado de plaquetas

Colheu-se sangue de voluntários normais em solução de citrato-fosfato-dextrose e obteve-se plasma fresco rico em plaquetas por centrifugação a 160 g durante 20 min a 20SC. Os quatro quintos da fracção superior do plasma rico em plaquetas foi centrifugado a 1700 g durante 20 min a 20CC e o sedimento das plaquetas foi ressuspenso em lOmM Tris-HCl (pH 7,4 mM NaCl/0,01% polietilenoglicol (PEG). As plaquetas foram lavadas duas vezes com o mesmo tampão na centrífuga e sonicada durante 1 minuto. Por este método, a contaminação com eritrócitos e leucócitos na última suspensão de plaquetas foi inferior a 0,1%. As plaquetas sonicadas foram centrifugadas a 48 000 g durante 30 min a 4í C e os sobrenadantes usados como lisado de plaquetas. A partir de 200 ml de sangue total obteve-se cerca de 2 ml de lisado de plaquetas. As outras operações foram efectuadas a 4SC, a menos que de outro modo seja especificado.

Ensaio para a actividade promotora do crescimento

A actividade da promoção do crescimento foi determinada usando células endoteliais de aorta porcina como células indicadoras, conforme foi previamente descrito (Miyazono etal, 1985 a, b). As células endoteliais cultivadas em meio F10 de Ham suplementado com 20% de soro fetal bovino (Flow Laboartories) e antibióticos, foram subcultivadas semanalmente a uma razão de 1 para 20. Para o ensaio mitogénico, as células foram tripsinizadas e novamente semeadas a uma densidade pequena (aproximadamente a lx 10 células por poço) com 500 çl de meio F-10 de Ham contendo 0,5% de soro fetal bovino e antibióticos em placas

de cultura de tecidos de 24 poços (16 mm de diâmetro, Costar). Após 24 h de incubação, as amostras a testar foram adicionadas aos poços. 18 h mais tarde, adicionou-se Γ H_7-timidina (0,2 ijCi/poço; 6,7 Ci/mM, New England Nuclear).

Após mais 4 horas, as células foram fixadas com ácido tricloroacético a 5% arrefecido em gelo (p/v) durante 20 min.

Os precipitados resultantes foram lavados extensivamente com água e solubilizados com 200 ql de IM NaOH. Após mistura à temperatura ambiente durante 20 min., adicionou-se aos -3 -» poços 200 μΐ de IM HC1. A / H_/-radioectividade num conta dor de cintilação liquida usando 20 ml de Instagel (Packard) por amostra.

Purificação do factor de crescimento de células endoteliais derivado de plaquetas a partir de plaquetas humanas

Ensaio - A actividade de factor de crescimento foi controlada através de processos de purificação usando células endoteliais de aorta porcina como células alvo conforme descrito atrás.

A actividade promotora de crescimento em fibroblastos de prepúcio humano foi testada pelo método de Betsholtz e Westermark (1984).

Geral - Durante a purificação, usou-se utensílios de plástico para reduzir a perda de activiàde por adsorção a superficies de vidro. Todas as operações foram efectuadas a 49C a menos que de outro modo seja especificado. A concentração proteica foi determiada pelo ensaio

de fixação de Bradford (1976), a menos que de outra forma seja especificada.

Preparação do lisado de plaquetas - Para a purificação do factor de crescimento de células endoteliais usou-se uma de fracção da purificação de factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) derivado de plaquetas humanas (Heldia et al., 1987). O primeiro passo na purificação de PDGF a partir de plaquetas é uma cromatografia em CM-Sephadex O PDGF catiónico foi adsorvido a esta coluna. Uma vez que o factor de crescimento de células endoteliasi em plaquetas humaas é uma proteina aniónica, ela não ficou adsorvida à coluna, de CM-Sephadex no passo inicial da purificação de PDGF (Heldin et al, 1987). Conforme esperado encontrou-se na fracção do efluente actividade promotora de crescimento para células endoteliais e usou-se como material de partida na purificação. Cerca de 15 litros da fracção não adsorvida foram processados de uma só vez; isto derivou de aproximadamente 900 1 de sangue humano fresco. A fracção não adsorvida foi guardada em recipientes de 5 litros a -20QC até durante 10 anos para ser usada.

Cromatografia em QAE-Sephadex - A fracção não adsorvida da cromatografia em CM-Sephadex foi descongelada e processada por cromatografia em QAE-Sephadex. O gel seco de QAE-Sepahdex (0,7 g/1; A-50, Pharmacia) foi adicionada e misturado por agitação durante a noite. O gel foi então deixado a sedimentar e, após a fracção não adsorvida ter sido rejeitada, verteu-se numa coluna (60 x 5 cm, Pharmacia). A coluna foi lavada com 4 1 de 75 mM NaCl em 10 mM fosfato pH 7,42 eluida com 2,5 1 de 250 mM NaCl com 10 mM fosfato pH 7,4.

O grosso da actividade ligou-ee a esta coluna e eluiu entre 75 e 250 mM NaCl a pH 7,4. Isto resultou numa purificação de 25\vezes calculada pela proteina recuperada e uma recuperação assumida neste passo de 80%.

Uma vez que a actividade promotora do crescimento no material de partida foi variável, talvez devido à presença de substâncias inibidoras (ver abaixo), o rendimento neste passo não foi determinado com precisão.

Precipitação com sulfato de amónio - Adicionou-se sulfato de amónio (247 g/1, 42% de saturação) ao eluato de cromatografia em QAE-Sephadex. Após equilibrio durante 2 h a 42C a amostra foi centrifugada a 2075 xg durante 15 min. O precipitado foi colhido por centrifugação e ressuspenso em 50mM naCl em 10 mM bis(2-hidroxietil)amino-tris-(hidroximetil) metano (Bis-Tris), pH 7,0.

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Α ρΗ neutro, 42% de saturação de sulfato de amónio precipitou cerca de 90% da actividade enquanto que apenas 9% da proteina foi coprecipitada. Este processo levou a uma purificação de 10 vezes com cerca de 700 mq de proteina permanecendo em 200 ml de volume. Cromatografia em DEAE-Sepharose - O material obtido por precipitação com sulfato de amónio (aproximadamente 700 mg de proteina no volume de 200 ml) foi tratado com 5 mM ditiotreitol à temperatura ambiente durante 2 h. A amostra foi então dialisada extensivamente contra 50 mM NaCl em 10 mM Bis-Trls PH 7,0 e aplicada a uma coluna de DEAE-Sepharose CL-6B (40 ml, Pharmacia). A coluna foi lavada com 100 ml de 50 mM NaCl em tampão 10 mM Bis-Tris, pH 7,0 e eluida com um gradien te linear (800 ml) de NaCl entre 50 e 200 mM em lOmM Bis-Tris, pH 7,0 a um fluxo de 120 ml/h. As fracçSes de 20 ral foram colhidas e analisadas quanto à proteina e actividade promotora do crescimento.

A actividade promotora do crescimento de células endoteliais eluiu a cerca de 120-150 mM de NaCl a pH 7,0. Este passo levou a uma purificação de 6x e uma recuperação de 50% (Fig. 1).

Cromatografia em hidroxilapatite

As fracções activas de cromatografia de DEAE-Sepharose (aproximadamente 60 mg de proteina) foram combinadas e aplicadas directamente numa coluna de 8 ml de hidroxilapatite (Clarkson Chemical Co., Williamsport,PA) equilibrada com 50 mM NaCl, 0 ,6mM fosfato, pH 7,4. A coluna foi lavada com 80 ml do mesmo tampão, eluida com 50 mM NaCl, 15 mM fosfato, pH 7,4 seguido de 200 mM fosfato, pH 7,Λ As fracções de 8 ml foram testadas quanto à proteina e actividade promotora do descimento.

A cromatografia em hidroxilapatite deu ainda um aumento de 4 vezes da actividade especifica (Fig 2 ). Quase toda a proteina se ligou ao gel e a actividade promotora do crescimento eluiu 15 mM fosfato, enquanto o grosso da proteina eluiu a uma concentração de fosfato superior. A recuperação da actividade foi de cerca de 55% neste passo e cerca de 8 mg da proteina.

A purificação final do factor de crescimento foi conseguida usando colunas de permuta iónica e de gel de alta resolução ligada a um sistema de cromatografia liquida de rápida resolução (FPLC).

Cromatografia em Mono Q

As fracções activas da cromatografia em hidroxilapatite foram reunidas, centrifugadas a 90 000xg durante 30 min a 4ôc e aplicadas directamente a uma coluna de Mono Q (HR 5/5 Pharmacia). Esta coluna e as duas seguintes (TSK-62 000 SW e Superose 12) foram ligadas a um aparelho de FPLC (Pharmacia) e manipulado à temperatura ambiente.

A coluna foi eluida a um fluxo de 1 ml/min com um gradiente de 0-500 mM NaCl em lOmM Bis-Tris, pH 7,0. Controlou-se a absorvância a 280 nm. Colheram-se fracções de 1 ml e testaram-se quanto à actividade promotora do crescimento.

Obteve-se um único pico de actividade de promotora do crescimento a 120 mM NaCl a pH 7,0 (Sg. 3). Este passo conduziu a uma purificação de mais 4 vezes com 50? de recuperação.

Cromatografia em gel TSK-G4000 SW

As fracções activas obtidas a partir da cromatografia em coluna Mono Q foram reunidas, liofilizade; sem diálise prévia e dissolvidas em 200 gl de água. A amostre foi então aplicada numa coluna TSK-G4000 (7,5 x 600 mm, LKB) com uma pré-coluna (coluna Ultrofac, 7,5 x 76 mm, LKB). A coluna foi equilibrada com 100 M fosfato, pH 6,5 e eluida a um fluxo de 500 μΐ/min. A absorvância do efluente da coluna foi controlada a 280 nm. Colheram-se fracções de 500 μΐ que foram testadas quanto â actividade promotora do crescimento .

resultado foi um único pico largo de actividade eluindo anomalamente tarde, numa posição correspondendo a uma Mr inferior a 12 000 (Fig. 4). A recuperação da actividade foi de 30% dando um aumento de 4 vezes na actividade especifica.

Cromatografia em gel Superose 12

As fracções activas obtidas a partir da cromatografia em TSK-G4000 SH foram reunidas, dialisadas usando tubo de diálise Spectrapor (Mr de exclusão, 3500, Spectrum Medicai Industries, Inc.) contra 100 mM NaCl, mM ácido 4-(2-hidroxietil)-l-piperazino-etanossulfónico (Hepes), pH 7,0 e depois liofilizadas. O material foi ressuspenso em 100 μΐ de água e passado numa coluna de Superose 12 (HR 10/30, Pharmacia) em 200 mM NaCl, 10 mM Hepes pH 7( A coluna foi eluida num fluxo de 400 μϊ/min e controlada com absorvância a 280 nm. Colheram-se fracções de 200 μΐ e teSkram-se quanto â actividade promotora do crescimento.

Este processo deu um único pico estreito de bioactividade com uma posição de eluição entre albumina de aro bovina e ovalbumina, bem separado da maior parte das outras proteinas (Fig. 5A). O aumento da actividade especifica foi de 12 vezes neste passo com uma recuperação de 30%, dando 2 pg de material puro. A concentração de proteína na fracção purificada foi calculada por comparação da intensidade das bandas, após electroforese em gel com dodecilsulfato de sódio (SDS) e coloração com prata, com as dos padrões ou albumina do soro bovina.

As composições proteicas das fracções

do passo de cromatografia em Superose 12 foram analisadas por electroforese em gel de SDS e coloração com prata (Fig. 5B). Uma proteína homogénea com uma Mr de 45 000 coeliu exactamente com a actividade promotora do crescimento, sugerindo que representa o factor de crescimento. Uma mobilidade semelhante foi observada quando as amostras foram analisadas em condições não redutoras (Fig. 5C) sugerindo que o factor de crescimento de células endoteliais «ferivado de plaquetas é composto por uma única cadeia polipeptidica.

Na Tabela 1 está apresentado um sumár do processo de purificação a partir de 200 g de proteina de plaquetas. 0 aumento global de actividade foi de aproximadamente 1000 000 vezes com uma recuperação de 1%.

Tabela 1

Sumário da purificação do factor de crescimento de células endoteliais derivado de plaquetas max estimulação purificação passo da purificação proteina (ug) (ng/mL) (x-vezes) rendimento (%) lisado de pia- 200 000 000 ^a 1 100 quetas (efluente de

CM-Sephadex)

QAE-Sephadex	8 000 000	1 000 000	20a	80
pptação com	700 000	100 000	200	70
sulfato de amónio
DEAE-Sepharose	60 000	17 000	1 200	36
hidroxiapatite	8 000	4 000	5 000	20
Mono Q	1 000	1 000	20 000	10
TSK-G4000 SW	70 ·	240	83 000	3
Superose 12	2b	20	1 000 000	1

a

A actividade promotora de crescimento no lisado de plaquetas foi variável, talvez devido à presença de inibidores de crescimento (ver discussão). Portanto, a actividade especifica do material de partida não pode ser determinada com precisão. A purificação nos passos QAE foi calculada como sendo de 20 vezes, baseado na quantidade de proteina recuperada e foi assumida uma recuperação de 80% da actividade neste passo.

b

Concentração proteica claculada pela intensidade relativa das bandas nos géis de SDS corados com prata.

Protocolo melhorado da purificação de PD-ECGF os passos iniciais da purificação foram efectuados como descrito atrás. Como passo seguinte usou-se a cromatografia em coluna de hidroxilapatite grau de pureza HPLC.

Cromatografia de alta resolução numa coluna de hldroxilapatite

O material obtido a partir da cromatografia em DEAE-Sepharose foi filtrado através de um filt de 0,22 gm (Millipore) e aplicado à temperatura ambiente numa coluna de hidroxilapatite de alta resolução (100 x 7,8 mm; Bio Rad) equipada com uma pré-coluna (50 x 4,0 mm; Bio

X' .·

Rad). A coluna foi pré-equilibrada com um tampão 1 mM fosfato, pH 6,8 50 mM NaCl e 0,01 mM CaCl₂ e eluida a um fluxo de 0,5 ml/min com um gradiente de 1-100 mM fosfato pH 6,8, 50 mM NaCl e 0,1 mM CaCl₂. A coluna foi então lavada com tampão 1 mM fosfato pH 6,8 e 0,01 mM CaCl₂· Colheram-se fracções de 1 ml e testaram-se quanto â actividade promo tora do crescimento em células endoteliais porcinas.

PD-ECGF ligou-se ao gel em tampão 1 mM fosfato, pH 6,8 e foi eluido com um gradiente linear de fosfato (conforme indicado na Fig. 6A). A receuparação de actividade foi de aproximadamente 32% neste passo. Fracções individuais do cromatograma foram analisadas por electroforese em gel com SDS e coloração com prata; a actividade promotora do crescimento coeliu com dois, componentes de 46 e 44 KDa e alguns outros componentes(Fig 6B).

Cromatografia numa coluna de alquil Superose

As fracções activas da cromatografia de alta resolução em hidroxilapatite foram reunidas e mistur das com igual volume de sulfato de amónio 2,8M (grau de pureza para HPLC, Bio-Rad) e tampão fosfato 100 mM, pH 6,8.

O material foi aplicado numa coluna de alquil-Superose (HR 5/5 Pharmacia) pré-equilibrada com sulfato de amónio 1,4 M (tampão fosfato 1Q0 mM, pH 6,8 e eluida com um gradiente de sulfato de amónio de 1,4 a 0M em tampão fosfato 100 mM, pH 6,8 conforme indicado na Figura 7A. O fluxo foi de 0,5 ml/min e a coluna foi manipulada à temperatura ambiente. A absorvância do efluente da coluna foi controlada a 280 nm. Colheram-se fracções de 500 -gl e testa?am-se quanto â actividade promotora do crescimento.

A purificação final foi conseguida por cromatografia hidrofófica usando FPLC. As fracções reunidas da cromatografia de alta resolução em hidroxilapatite foram aplicadas numa coluna de álquil-Superose equilibrada coáj sulfato de amónio 1,4M/tampão fosfato 100 mM pH 6,8 e eluidas com um gradiente decrescente de sulfato de amónio em tampão fosfato 100 mM, pH 6,8. Obteve-se um único pico de actividade promotora do crescimento a aproximadamente 0,8M de sulfato de amónio (Fig. 7A). O aumento da actividade especifica foi de 50 vezes neste passo, com uma recuperação de 82%., As composições proteicas de fracções individuais do cromatograma de alquil-Superose foram analisadas por electroforese em gel de SDS e coloração com prata (Fig. 7B); novamente as fracções activas continham os dois componentes principais de 46 e 44 KDa indicando gue o PD-ECGF estava essencialmente puro. Quando o material purificado foi analisado em condições não redutoras observaram-se bandas do mesmo tamanho (Fig. 7C). Ainda, observou-se com reprodutibilidade uma banda muito fraca de Mr 42 000.

A proporção destas proteinas nos géis corados com prata diferiu de preparação para preparação, mas os componentes de 46 e 44 KDa foram sempre predominantes.

Na Tabela 2 está apresentado um resuma do processo de purificação a partir de 300 g de proteína de plaquetas, correspondendo a aproximadamente 800-1000 1 de sangue humano. A partir de cada preparação obteve-se cerca de 34 yg de PD-ECGF. 0 material foi purificado 1250 00) vezes com um rendimento global de proximadamente 14%.

Os resultados representam valores médios de quatro preparações individuais.

A actividade promotora do crescimento no lisado de plaquetas foi variável, talvez devido à presença de inibidores do crescimento (Miyazono et al 1987). Portanto, a purificação na cromatografia em QAE-Sephadex foi calculada como sendo de 20 vezes com base na quantidade de proteina recupe rada e uma recuperação de 80% da actividade (Miyazono, et al., 1987).

c

A concentração proteica foi determinada por análise de aminoácidos.

Electroforese em gel com SDS

A electroforese em gel de SDS foi efectuada de acordo com o método descrito por Blobel e Dobberstein, 1975. Resumidamente as amostras foram aquecida (95°C, 3 min) com ou sem ditiotreitol 10 mM e aplicadas num gel de gradiente consistindo em 10-18% de poliacrilamida. O gel foi fixado com glutaraldeido após electroforese e depois corado com prata (18). Usaram-se os marcadores de M_r (Pharmacia) contendo fosforilase b (94 000), albumina de soro bovino (67 000), ovalbumina (43 000), anidra se carbónica (30 000), inibidor da tripsina de soja (20 100) e a -lactalbumina (14 400).

-44Análise estrutural e sequência de aminoácidos de PD-ECGF

Cerca de 40 yg de PD-ECGF puro foi reduzido e piridil-etilado e depois removido sal usando HPLC de fase reversa em poro estreito. O material foi então sujeito a digestão triptíca seguido de separação dos fragmentos numa coluna de HPLC de fase reversa com poro estreito, eluiu com 0,1% de ácido trifluoroacético com um gradiente de acetonitrilo.

Para a redução e piridil-etilação PD-ECGF foi liberto do sal numa coluna C4 e depois seco num Speedivac Concentrator e redissolvido em 200 yl de 6M guanidina-HCl, 0,25 M Tris-HCl, pH 8,5 e 2 mM EDTA contendo 100 yg de ditiotreitol. A solução foi gaseada com azoto durante 20s e deixada à temperatura ambiente durante 3 h, altura em que se adicionou 2 yl de 4-vinil-piridina. Após mais três horas à temperatura ambiente, removeu-se o sal da amostra por cromatografia na coluna C4 no sistema tampão ácido trifluoroacético/acetonitrilo. O solvente volátil foi removido como atrás e PD-ECGF foi digerido com TPCK-Trypsin (Sigma, proporção de enzima para substrato, 1/50 (p/p)) em 0,1 M bicarbonato de amónio, contendo ureia 2M durante 4 h a 37QC. Os fragmentos tripticos foram imediatamente aplicados num HPLC de fase reversa de poro estreito.

O equipamento cromatográfico consistiu num sistema de duas bandas LKB, adaptado para cromatografia de poro estreito e equipado com um detector de comprimento de sonda variável. A temperatura da coluna foi mantida a 35SC, o fluxo foi de 100 yl/min e os efluentes foram controlados a 220 nm. Colheram-se as fracções manualmente em tubos de polipropileno .

A separação dos fragmentos tripticos

de PD-ECGF está ilustrada na Figura 3Α. Aproximadamente 40 çg de PD-ECGF digerido cora tripsina foi aplicado numa coluna de fase reversa C4 (Browalae Aguapore BV-300; 2,1 x 30 nm e eluida com um gradiente linear de acetonitrilo em 0,1% de ácido trifluoroacético.

Os peptideos não homogéneos foram recromatografados em condições diferentes (estão apresentados exemplos na Fig. 8B-E), As Figuras 8B, 8D e 8E ilustram a recromatografia do material nos picos T19, T9, T5, T4,

T21, T18; e T17, T 13 respectivamente da Figura 8A. As amostras foram diluídas três vezes com 0,1% de ácido trifluoroacético e aplicadas numa coluna Browlee Spheri-5 RP-18 (2,1 x 30 nm). A coluna foi eluida com 0,1% de ácido trifluoroacético e um gradiente linear ds acetonitrilo indicado.

A Figura 8C mostra a recromatografia dos peptideos sob os picos T12, T22 da Figura 8A. A coluna usada foi a mesma da Figura 8A, mas foi eluida com 0,15 M NaCl em água Milli-Q com um gradiente de acetonitrilo conforme indicado.

Os peptideos isolados foram então sujeitos a sequenciação de aminoácidos N-terminais usando um sequenciador de fase gasosa. (Sequenciador de Proteínas Applied Biosystems, modelo 470A, com um analizador PTH em linha, modelo 120A). Obteve-se assim a informação sobre a sequência dos peptideos tripticos totais (Fig. 9). A informação sobre sequências adicionais foi obtida por sequenciação N-terminal de PD-ECGF intacto e por análise dos fragmentos obtidos por digestão com CNBr e protease V8 estafilocéccica, usando quantidades semelhantes de material de partida.

Na Fig. 9, os fragmentos tripticos estão indicados por (/...) e as designações referem-se a picos na Fig. 1 . A sequência N-terminal (/...) fragmentos da protease V8 de estafilococcus (/+++) e um fragmento CNBr (/»«) de PD-ECGF estão também indicados, assim como os residuos cisteina («) , um potencial sitio de N-glico silação (|| ) e um possivel sitio de polimorfismo (C). As repetições internas estão encimados por linhas.

Preparação de anticorpos contra PD-ECGF

Para ajudar na clonagem do cDNA de PD-ECGF, induziu-se um anti-soro policlonal especifico contra PD-ECGF e usou-se em imunotransferências para localizar uma fonte de produção de PD-ECGF.

anti-soro foi preparado diluindo PD-ECGF puro para uma concentração de 20 qig/ml em tampão fosfato 10 mM, pH 7,4 com 150 mM naCl. Em seguida dez microgramas de PD-ECGF puro foi misturado com um volume igual de adjuvante completo de Freund e injetado intramuscularmente num coelho. O coelho foi injectado 2 semanas mais tarde com 10 qg de PD-ECGF em adjuvante incompleto de Freund.

Após isto, o coelho foi injectado de 2 em 2 de 3 em 3 semanas com 5 çg ãe PD-ECGF em adjuvante incompleto de Freund. A frac ção de imunoglobulina foi purificada através da aplicação de 4 ml de soro imune a uma coluna de 2 ml de proteina A-Sepharose (Pharmacia) equilibrada com tampão fosfato 100 mM pH 7,4. A coluna foi lavada com o mesmo tampão e depois eluida com tampão citrato 50 mM, pH 3,0. O eluato da coluna foi rapidamente neutralizado com 1 M Tris-HCl, pH 7,4.

Uma vez que o PD-ECGF ocorre em plaquetas , foram testadas várias linhas de células hematopoiéticas, mas não se encontrou nenhuma que sintetizasse PD-ECGF. Noentanto surgiu uma banda forte de 45 kDa guando um extracto de placenta humana foi analisado por imunotransferência. Cortou-se placenta humana em pedaços e homogenizou-se com 4 volumes de tampão fosfato salino (PBS).

Ao homogenato adicionou-se sulfato de amónio a 28% de saturação; após centrifugação adicionou-se mais sulfato de amónio ap sobrenadante até 42% de saturação. 0 precipitado recuperado após centrifugação, foi dissolvido em PBS. Amostras de 100 ng de PD-ECGF purificado a partir de plaquetas humanas como descrito atrás e 375 gg de extracto de placenta bumana fraccionada com sulfato de amónio foram sujeitos a electrofaese em gel com SDS num gel de gradiente de 10-18% de poliacrilamida em condições redutoras e transferidas para uma membrana de nitrocelulose num tampão contendo 20% de etanol, 150 mM glicina e 20 mM Tris-HCl, pH 8,4 a 200 mA.

A membrana de nitrocelulose foi incubada em 15 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10% de albumina de soro bovina para bloquear a ligação não especifica, incubada numa diluição de 1:50 de um anti soro de coelho especifico para PD-ECGF lavada duas vezes com 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 e duas vezes com 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,05% Triton X-100. A membrana de nitrocelulose foi então incubada com proteina A estafilocóccica marcada com ^ΑΛ3Ι (5χ io³ cpm/ /ml) e lavada como descrito atrás. As transferências foram sujeitas a autoradiografia. PD-ECGF purificado a partir de plaquetas surge como um dupleto de aproximadamente 45 KDa provavelmente devido à proteolise durante a preparação.

A Figura 10 ilustra uma análise por imunotransferência de um extracto de placenta humana (faixa a) e PD-ECGF purificado a partir de plaquetas humanas (faixa b) usando anti-soro policlonal contra PD-ECGF.

Clonagem de cDNA de PD-ECGF

A. Preparação de cDNA

Constriu-se portanto uma biblioteca de cDNA em XgtlO usando RNA poli(A)+ de placenta humana.

Isolou-se RNA total a partir de uma placenta humana de 22 semanas de gestação pelo método de Ham, et al., (1987). Purificou-se RNA poli (A)+ por cromatografia numa coluna de oligo (dt). Constniu-se uma biblioteca de cDNA em / gtlO seguindo o método descrito por Watson et al (1985). com algumas modificações. Para a sintese da primeira cadeia usou-se transcripatse reversa do virus da leucemia murina (Bethesda Research Laboratory)

Após a sintese da primeira cadeia adicionou-se oligo (dG) ao seu extremo 3* por transferase terminal. A sintese da segunda cadeia foi iniciada pela adição de um iniciador externo de oligo (dC) assim como iniciadores de RNA internos feitos por RNase H.

B. Selecção de oligonucleotideos e despiste '

A informação derivada da seguenciação de aminoácidos dos peptideos foi usada para seleccionar e sintetizar cinco oligonucleotideos únicos. Cinco oligonucleotideos únicos foram deduzidos a partir da sequência de aminoácidos pelo método de Lathe (1985) e preparados por um sintetizador de DNA de Applied Biosystems 381A. As sequências de oligonucleotideos foram as seguintes:

228,

5'TGTGTGGGCCATGCCCTGGAGGTGGAGGAGGCCCTGCTGTGCATGGATGGCGCTGGCCCCCCTGACCTGCGG3'

231, 5'GTGGCTGCTGCCCTGACAGCCATGGACAAGCCCCTGGGCCGG 3';

240,

5'GGCCTGGGCCACACAGGCGGCACCCTGGACAAGCTGGAGTCCATCCCTGGCTTCAATGTGATCCAGTCCCCTGAGCAGATGCAGGTGCTG3’;

258,

5'GCCCCCCCTGCCCCTGAGGACTTCTCTGGCGAGGGCTCCCAGGGCCTGCCTGACCCC3I . f

259,

5'GTGGCTGCCCAGGGCGTGGACCCTGGCCTGGCCCGGGCCCTGTGCTCTGGCTCCCCTGCTGAGCGGCGGCAGCTGCAGCC3’.

Estes oligonucleotideos sonda foram 32 marcados colocando caudas nos extremos com um P-dCTP e transferase terminal de desoxinucleotideos ou foram usados como moldes para sintetizar cadeias complementares marcadas radioactivamente por iniciadores oligonucleotidicos, um 32

P-dCTP e fragmentos Klenow.

A biblioteca de placenta foi despis tada com sondas oligonucleotidicas individuais. Cerca de trezentos mil clones independentes da biblioteca de cDNA de placenta humana em KçtlO foram semeados e fizeram-se

réplicas dos filtros usando filtros de nylon Hybond (Amersham). Os filtros foram pré-hibridados numa solução de 20% de formamida, 5x SSC (SSC = 150 mM NaCl, 15 mM citrato de sódio) 50 mM fosfato de sódio, pH 6,8, 1 mM pirofos fato de sódio, solução de Denhardt 5x, 50 çg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado e 100 çM ATP durante 6 h a 42°C. Em seguida foram adicionados à solução sondas oligonucleotidicas marcadas e a incubação foi prolongada durante mais 12-18 h. Os filtros foram lavados quatro vezes com 0,2 x SSC em 0,1% de dodecilsulfato de sódio (SDS) durante min de cada vez. As temperaturas de lavagem variaram Q entre 37 C e 42QC de acordo com o tamanho do oligonucleotideo. Os filtros foram expostos a filmes Kodak X-Onat com intensificador Dupont Cronex durante 12-48 h.

Três de entre trezentos mil clones surgiram positivos com duas das cinco sondas, sondas 228 e 240 .

C. Subclonagem e Sequenciação

Os três clones , X PL5,\PL7 e/, PL8 fo ram isolados e as inserções de cDNA foram subclonadas. os clones originais X PL5, \ PL7 e X PL8 possuem inserções de aproximadamente 1,7, 1,0 e 1,8 kb respectivamente (Bluescript Stratagene). O mapeamento de restrição mostrou que as inserções eram colineares umas com as outras (Figura 4A). As enzimas de restrição usadas foram: B, Bam HI, K, Κρη I,

S, Sall; e Sm, Sma I.

As inserções foram também clonadas em M13 mp 18 para sequenciação. A estratégia de sequencia-51-

ção nucleotidica para a inserção / Pl8, a inserção mais longa também está apresentada na Fig. 11A. As formas de cadeia dupla de M13 foram sujeitos a delecção seguenciada usando as exonucleases III e VII seguindo o método de Yanisch-Perron, et al (1985). Os DNAs de cadeia simples foram purificados a partir de cada deletante e as sequências de núcleo tideos foram determinados pelo método de terminação didesoxi (1970). As sequências que eram dificeis de determinar por este processo foram examinadas pelo método de Maxam e Gilbert (1980).

A sequência de nucleotideos da inserção de \ PL8 e a sequência de aminoácidos deduzida do PD-ECGF está apresentada na Figura 11B. O codão de iniciação putativo está nos nucleotideos 124-126. Um codão de paragem na mesma grelha de leitura (nucleotideos 28-30) a montante do codão de iniciação está sublinhado e um codão de paragem nos nucleotideos 1570-1972 está marcado com um asterisco.

O sinal de poliadenilação (nucleotideos 1568-1573) está sublinhado com uma seta. As regiões correspondendo às sondas oligonucleotidicas preparadas, 228, 231, 240, 258 e 259 estão sublinhadas com linhas a tracejado.

Sequência de PD-ECGF

A sequenciação de nucleotideos da inserção de PL8 revelou uma região airta não traduzida 5' rica em GC, uma grelha de leitura aberta que prevê a tradução de uma proteina de 482 aminoácidos de com^riroento (M_r 49971) e uma sequência curta não traduzida 3' contendo uma cauda poli (A)⁺ (Fig. 11B). A tradução é provavelmente

iniciada em ATG nos nucleotideos 124-126;uma vez que a sequência de nucleotideos seguem as regras da iniciação da tradução, enquanto isto não acontece no ATG dos nucleotideos 136-138. Ainda, não há outros ATGs entre um codão de paragem na mesma grelha de leitura nos nucleotideos 28-30 e os nucleotideos codificadores do extremo N do PD-ECGF intacto (Fig. 9). Nos nucleotideos 1570-1572 está presente um codão de paragem (TAA). Este codão de paragem é parte do sinal de poliadenilação (nucleotideos 1568-1573). Quatorze nucleotideos a jusante deste sinal encontrou-se um grande segmento de poli (A) +. Uma sobreposição semelhante do codão de paragem e do sinal de poliadenilação foi descrita para a cadeia B da coriogonadotropina humana.

Dos 482 aminoácidos do PD-ECGF dedizidos a partir do clone de cDNA, 389 foram identificados por sequenciação de aminoácidos (Fig. 9). A sequência N-terminal do PD-ECGF começa 10 aminoácidos a jusante do sitie de iniciação da tradução proposto, indicando que a molécula sofre um processamento proteolitico limitado após a sintese. Os aminoácidos C-terminais previstos a partir da sequência de cDNA, excepto no caso dos quatro últimos, foram identificados por sequenciação de aminoácidos. Desconhece-se se PD-ECGF sofre processamento proteolitico no extremo C se assim for, são removidos no máximo quatro aminoácidos.

A M_r da proteina madura seria assim 48 000-49 000, razoávelmente de acordo com o cálculo de 45 000 obtido a partir da electroforese em gel com SDS do PD-ECGF puro.

A sequência de aminoácidos prevista a partir do clone de cDNA está perfeitamente de acordo com a sequência de aminoácidos préviamente obtida em todas as posições, excepto na posição 471, onde a sequência de nucleotideos pxarê um residuo linear, enquanto que um resíduo serina foi encontrado em dois peptideos diferentes

obtidos a partir desta região, (Fig. 9).‘È possivel que ocor ra polimorfismo nesta posição.

A comparação da sequência de PD-ECGF com as duas bases de dados PIR, EMBL e Genbank (liberta 15, 14 e 56 respectivamente) não revelou homologia notórias com outras proteínas. As repetições internas curtas na sequência foram assinaladas (encinadas por uma linha na Fig. 2). Uma característica importante da sequência é a ausência de uma sequência sinal hidrofóbica sugerindo que PD-ECGF é uma proteina secretada clássica. A sequência contem apenas um residuo de tiosina, o qual provavelmente não está exposto na superfície da molécula, uma vez que as 125 tentativas para marcar radioactivamente PD-ECGF com I usando o método da cloramina T resultou numa incorporação muito baixa da radioactividade. Existe um sitio de potencial N-glicosilação, Asn-63 (Fig. 9). O rendimento de aminoácidos PTH do correspondente peptideo tritpico descreceu dramáticamente, imediatamente antes deste resiudo (Fig. 9). Isto poderá ser devido à formação de um composto cíclico do residuo asparagina e do residuo glicina que se lhe segue, o que pode ocorrer apenas se o residuo de asparagina não estiver glicosilado, Isto, em combinação com de PD-ECFG conforme determinado por electroforese em gel com SDS, comparado com o M*. prevista a partir do clone de cDNA sugeriu que Asn-63 não seja glicosilada. Existe um total de 7 resíduos cisteina indicando que a molécula contem pelo menos um grupo 5H livre.

Transferências Southern e Northern

Para se obter informação acerca da estrutura genómica do gene de PD-ECGF humano, a análise de transferência Southern de DNA humano foi efectuada usando a inserção de çSL8 como sonda. Preparou-se DNA genómico humano de alto peso molecular a partir de leucócitos humanos normais. As amostras foram digeridas por enzimas de restrição, sujeitas a electroforese em agar e transferidas para membranas de nitrocelulose (Schleicher e Schull). Como se mostra na Fig. 12A, dez çg de DNA de placenta humana foram cortados com HindIII (faixa 1) ou Xbal (faixa 2) e depois sujeitos a electroforese em agar e hibridados com uma sonda de cDNA de PD-ECGF da inserção de pPL8. Observaram-se bandas únicas de 19 kb e 9,2 kb após digestões com HindIII e Xba I respectivamente. Isto sugere que apenas uma cópia do gene PD-ECGF esteja presente no genoma humano. De facto a análise de clones de PD-ECGF genómico humano suporta esta conclusão.

RNA poli (A)⁴* de placenta humana foi examinado por transferência Northern usando a inserção pPL5 como sonda. RNA poli (A)⁺ foi purufiçado a partir de placenta humana de 22 semah&a de gestação como descrito atrás. Um çg de RNA foi sujeito a electroforese num gel desnaturado de 0,9% de formalina e transferido para filtro de nylon” Hybond N (Amersham), A hibridação foi efectuada numa solução de 50% de formamida, 0 ,65M NaCl O,1M sódlo-Pipes, pH 6,8, 10% de dextran-sulfato, solução de Denhardt 5x, 0,1% de SDS, 5 mM EDTA e 100 çg/ml de DNA de esperma de salmão a 42SC durante 18 h e depois lavado quatro vezes com SSC 2 x, 0,2% de fosfato de sódio, 0,1% de SDS durante 20 min a 50SC.

Observou-se um único produto de transcrição com cerca de 1,8 kb (Fig. 12B). Uma vez que o clone de cDNA maior encontrado, pL8, tem uma inserção de aproximadamente 1,8 kb, ele provavelmente representa uma cópia de tamanho completo de produto da transcrição de PD-ECGF.

Expressão de cDNA de PD-ECGF

Para verificar a autenticidade do clone de cDNA e para proporcionar um vector de expressão replicável portador do gene PD-ECGF, ele foi expresso em células NIH 3T3. A inserção de pPL8 foi subclonada no vector de expressão pLJ para dar pLPL8J. Este vector tem a LTR do virus da leucémia de Molony como promotor para dirigir a transcrição do cDNA, assim como um gene de resistência à neomicina como marca selectiva, Piwnica et al, 1986. As construções pLPL8J e pLJ foram introduzidas nas células NIH 3T3 pelo método de coprecipitação com fosfato de cálcio e as linhas celulares foram seleccionadas com neomicina.

As células NIH3T3 transfectadas com pLJ ou com pLPL8J foram cultivadas até à confluência em placas de cultura de células de 10 cm em meio de Eagle modificação de Dulbaco (DNEM) suplementado com 10% de soro de vitela e antibióticos. As células foram então cultivadas durante 24 h na ausência de aro , soro em DNEM suplementado com 1% de albumina do soro 49 bovina, 7,8 yg/ml de colestero

5,5 ijg/ml de ácido oleico, 8 vg/ml de L-a-fosfatidilcolina e 0,2 mg/ml de transferina. Após colheita do meio condicionado, as células foram lavadas duas vezes em PBS e depois

raspadas para 1 ml de PBS. Após ressuspensão cuidadosa, preparou-se um lisado celular rebentando as células através de três ciclos de congelação e descongelação, segyido de centrifugação a 25 000 g durante 30 min e colheita dos sobrenadantes. Para a preparação dos lisados celulares as células foram lavadas e ressuspensas em PBS contendo fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM (Sigma), 150 UI de aprotinina (Sigma) e 10 mM EDTA. A actividade promotora do crescimento foi medida através da incorporação de H-timidina em células endoteliais de aorta porcina na ausência ou presença de 2 qg/ml do anticorpo especifico de PD-ECGF purificado por proteina A-Sepharose. Efectuou-se imunotransferência como descrito.

A análise do lisado celular e do meio condicionado de uma linha celular ytransfectada com pLPL8J, revelou actividade promotora do crescimento para células endoteliais de aorta porcina em lisado celular, mas não no meio condicionado (Fig. 13A, Β). A actividade foi completamente neutralizada por um anti-soro de coelho especifico contra PD-ECFG, indicando gue a actividade era devida à sintese de PD-ECFG funcionalmente activo pela linha celular (Fig. 13A). A linha celular NIH3T3 transfectada com pLJ não continha qualquer actividade promotora do crescimento para células endoteliais de aorta porcina. Foi ainda encontrado que o lisado celular da linha celular transfectada com pLPLSJ continha um componente de 45 KDa em experiências de imunotransferência usando o anti-soro contra PD-ECFG (fig. 130. 0 tamanho do produto era semelhante ao do PD-ECGF humano purificado a partir de plaquetas (Fig. 130. Estes resultados mostrara que a molécula de PD-ECGF purificada, sequenciada e clonada é responsável pelo efeito biológico observado sobre células endoteliais porcinas. Estes dados mostram ainda que PD-ECGF recombinante pode ser expresso em células em cultura.

Respostas quimiotáticas a PD-ECGF

Determinou-se o efeito de PD-ECGF na migração de células endoteliais de aorta bovina. (BAEC) e células de músculo liso (SMC).

Os ensaios de quimiotaxis de BAEC e SMC foram efectuados em microcâmaras de 48 poços Para a adesão de BAEC foi necessário o revestimento de filtros Nucleopore com gelatina e fibronectina. As células (18 000 BAEC, 25 000 SMC por poço) foram adicionadas aos poços superiores. Usou-se meio de Eagle modificação de Dubbecco sem soro (DMEM) para a migração de SMC, DMEM foi suplementado com 1% BSC para a migração de BAEC. O número de células que migrou durante um periodo de incubação de 5 h para a superfície inferior do filtro foi contado em três campos de alto potencial. Todas as experiências foram feitas em triplicado. Na Fig. 14A a migração dependente da dose para BAEC está indicado por círculos fechados e na ordenada esquerda e de modo semelhante para SMC por círculos abertos na ordenada direita. As testemunhas estão apresentadas no histograma I, BAEC meio apenas, II) BAEC meio mais 10 ng/ml de FGF básico, III) SMC meio apenas, IV)

SMC meio mais 5% FCS.

A Fig. 14a mostra o efeito dependente da dose de PD-ECGF na migração de células endoteliais de aorta bovina (BAECs) que na saturação (5-10 ng/ml) é comparável à potência de FGF básico como factor quimiotáctico. Metade da estimulação máxima ocorreu numa concentração de aproximadamente 1 ng/ml. Consistente com a sua especifi cidade mitogénica para células alvo endoteliais PD-ECGF não induziu migração de células de músculo liso nas condições do ensaio. As testemunhas em que se usou soro e factor

de crescimento derivado de plaquetas induziram grande migração de células de músculo liso na mesma experiência.

A análise do tabuleiro revelou que a migração de BAEC induzida por PD-ECGF é devida à migração celular dirigida (quimiotaxis) e não à migração ao acesso (quimiocinése). Os resultados estão apresentados na Fig. 14B e representam a percentagem do número de células por campo. Os desvios padrões estão abaixo de 15%. Os valores na diagonal indicam migração quimiodnética e os valores abaixo da diagonal indicam quimiotaxis.

Finalmente, os anticorpos que neutralizam a actividade mitogénica de PD-ECFG in vitro também neutralizam a actividade quimiotática (Fig. 140 indicando que o PD-ECGF é responsável por esta actividade.

A inibição da migração de BAEC usando anticorpos contra PD-ECGF foi efectuada como descrito atrás e os exemplos mostrados na Fig. 14C são 1) Testemunha,2)5 ng/ml PD-ECGF puro e 3) 5 ng/ml PD-ECGF puro mais 300 ng/ml de anticorpos ati-PD-ECGF.

propriedades angiogénlcas de PD-ECGF

O efeito de Pd-ECGF in vivo foi testado no sistema vascular em desenvolvimento da membrana corioalantoica de galinha CCAM). As substâncias a testar foram incorporadas em discos de metilcelulose (10 ql) e transplantadas para uma CAM de 9 dias de idade como descrito por Risan, et al (1986). CAMs foram analisados diária mente durante dois dias, os discos são visiveis pelas suas

reflexões brilhantes. A Fig. 15 mostra a indução de angiogénese na membrana corioalantéica de galinha por a)

PD-ECGF parcialmente purificado (purificado através do passo da hidroxilapatite, 1% puro, 1,2 mg de proteina/ml;

gl por disco de metilcelulose), b) 50 ng de PD-ECGF puro e c) PD-ECGF parcialmente puyificado (como em a)) incubado durante 20 min com anti-soro anti-PD-ECGF (2,5 gl de cada uma das soluções) (amplicação xlO ).

PD-ECGF parcialmente purificado consistentemente induziu uma resposta angiogénica forte (Fig. 15A). Ainda, PD-ECGF puro numa dose de 50 ng induziu angiogénese na CAM (Fig. 15B). Estes resultados estão resumidos na Tabela 3, Os anticorpos contra PD-ECGF inibem substancialmente a angiogénese induzida por PD-ECGF neste ensaio (Fig. 15C). Assim, a resposta angiogénica não é provavelmente devida à inflamação ou outros factores além do PD-ECGF presente na preparação.

Tabela 3

Propriedades angiogénicas de PD-ECGF na CAM

TRANSPLANTE	REACÇÃO ANGIOGÉNICA
++	+
PD-ECGF parcialmente purificado (2,5-5 φΐ/disco)	54	4	7
PD-ECGF parcialmente purificado (2,5 μΐ/disco) mais soro anti-PD-ECGF (2,5 μΐ/disco)	7	2	13
PD-ECGF puro (50 ng/disco)	11	3	1

O Número de amostras está indicado em cada coluna ++: reacção angiogénica forte +: Reacção angiogénica menos pronunciada, nalguns casos apenas alguns vasos converginam para o transplante padrão vascular não afectado

Para Investigar os efeitos in vivo de PD-ECGF, pLPLBJ e pLJ sem inserção foram transfectados por electroporação para células a 1-1. a 1-1 é uma célula NIH 3T3 transformada por H-ras humano activado e é tumorigénica em ratinhos labro. Após selecção das células a 1-1 transfectadas por resistência à G418, elas foram injectadas em ratinhos labro subcutâneamente. Em duas semanas, os tumores cresceram até 2 cm de diâmetro e foram colhidos e fixados em formaldeido. 0 exame histológico (Figura 16) revelou gue os tumores desenvolvidos a partir de a 1-1 transfectados com pLPL8J tinham vasos sanguíneos marcados ao contrário dos poucos vasos existentes nos tumores de a 1-1 transfectados com pLJ sem inserções de cDNA. Esta observação indica que PD-ECGF humano é angiogénico em ratinhos .

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Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES

   I^a. - Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada por ter a sequência de aminoácidos que se segue e todas as variantes da referida molécula de ácido nucleico que codificam o factor de crescimento de células endoteliais derivado de plaquetas (PD-ECGF), que é angiogénico e quimiotáctico, não se liga a heparina e não estimula a proliferação de fibroblastos:

   GGGCAGTGGA CCGCTGTGCG CGAACCCTGA ACCCTACGGT CCCGACCCGC GGGCGAGGCC GGGTACCTGG GCTGGGATCC GGAGCAAGCG GGCGAGGGCA GCGCCCTAAG CAGGCCCGGA 40 80 120 153 186 GCG GCC ATG CCA GCA GCC TTG ATG ACC CCG TTC GGA ACC GGG GAA CCC GCG CCT GGT GAC TCC GGG GGG AGC CAG GGA CTT CCC GAC CCT TCG CCA GAG 219 CCC AAG CAG CTC CCG GAG CTG ATC CGC ATG AAG 252 CGA GAC GGA GGC CGC CTG AGC GAA GCG GAC ATC 285 AGG GGC TTC GTG GCC GCT GTG GTG AAT GGG AGC 318 GCG CAG GGC GCA CAG ATC GGG GCC ATG CTG ATG 351 GCC ATC CGA CTT CGG GGC ATG GAT CTG GAG GAG 384 ACC TCG GTG CTG ACC CAG GCC CTG GCT CAG TCG 417 GGA CAG CAG CTG GAG TGG CCA GAG GCC TGG CGC 450 CAG CAG CTT GTG GAC AAG CAT TCC ACA GGG GGT 483 GTG GGT GAC AAG GTC AGC CTG GTC CTC GCA CCT 515 GCC CTG GCG GCA TGT GGC TGC AAG GTG CCA ATG 549 AGC GGA CGA CGT GGT CTG GGG CAC ACA GGA GGC 582 ACC TTG GAT AAG CTG GAG TCT ATT .CCT GGA TTC 615 AAT GTC ATC CAG AGC CCA GAG CAG ATG CAA GTG 648 CTG CTG GAC CAG GCG GGC TGC TGT ATC GTG GGT 681 CAG AGT GAG CAG CTG GTT CCT GCG GAC GGA ATC 714 CTA TAT GCA GCC AGA GAT GTG ACA GCC ACC GTG 747 GAC AGC CTG CCA CTC ATC ACA GCC TCC ATT CTC 780 AGT AAG AAA CTC GTG CAG GGG CTG TCC GCT CTG 813 GTG GTG GAC GTT AAG TTC GGA GGG GCC GCC GTC 846

   TTC CCC AAC CAC GAC CAG GCC CGG GAC CTG GCA 879 AAG ACG CTG GTT GGC GTG GGA GCC AGC CTA GCG 912 CTT CGG GTC GCG GCA GCG CTG ACC GCC ATG GAC 945 AAG CCC CTG GGT CGC TGC GTG GGC CAC GCC CTG 978 GAG GTG GAG GAG GCG CTG CTC TGC ATG GAC GGC 1011 GCA GGC CCG CCA GAC TTA AGG GAC CTG GTC ACC 1044 ACG CTC CGG GGC GCC CTG CTC TGG CTC AGC GGA 1077 CAC GCG GGG ACT CAG GCC CAG GCC GCT GCC CGG 1110 GTG GCC GCG GCG CTG GAC GAC GGC TCG GCC CTT 1143 GGC CGC TTC GAG CGG ATG CTG GCG GCG CAG GGC 1176 GTG GAT CCC GGT CTG GCC CGA GCC CTG TGC TCG 1209 GGA AGT CCC GCA GAA CGC CGG CAG CTG CTG CCT 1242 CGC GCC CGG GAG CAG GAG GAG CTG CTG GCG CCC 1275 GCA GAT GGC ACC GTG GAG CTG GTC CGG GCG CTG 1308 CCG CTG GCG CiG GTG CTG CAC GAG CTC GGG GCC 1341 GGG CGC AGC CGC GCT GGG GAG CCG CTC CGC CTG 1374 GGG GTG GGC GCA GAG CTG CTG GTC GAC GTG GGT 1407 CAG AGG CTG CGC CGT GGG ACC CCC TGG CTC CGC 1440 GTG CAC CGG GAC GGC CCC GCG CTC AGC GGC CCG 1473 CAG AGC CGC GCC CTG CAG GAG GCG CTC GTA CTC 1506 TCC GAC CGC GCG CCA TTC GCC GCC CCC TTG CCC 1539 TTC GCA GAG CTC GTT CTG CCG CCG CAG CAA TAA 1572 AGC TCC TTT GCC GCG AAA 1590
2. 2^a. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por codificar o factor de crescimento de células endoteliais derivado de plaquetas, tendo a sequência de aminoácidos que se segue:

   Ala Pro Pro Ala Pro Gli Asp Fen Ser Gli 10 Glu Gli Ser Gin Gli Leu Pro Asp Pro Ser 20 Pro Glu Pro Lis Gin Leu Pro Glu Leu Ile 30 Arg Met Lis Arg Asp Gli Gli Arg Leu Ser Glu Ala Asp Ile Arg

   Gli Fen Val

   Ile Gli Ala

   Glu Glu Tre

   Gin Leu Glu

   His Ser Tre

   Pro Ala Leu

   Arg Gli Leu

   Ile Pro Gli

   Leu Leu Asp

   Leu Val Pro

   Ala Tre Val

   Lis Lis Leu

   Fen Gli Gli

   Leu Ala Lis

   Val Ala Ala

   Val Gli His

   Gli Ala Gli

   Gli Ala Leu

   Ala Ala Val 50

   Met Leu Met

   Ser Val Leu 80

   Trp Pro Glu

   Gli Gli Val 110

   Ala Ala Cis

   Gli His Tre 140

   Fen Asn Val

   Gin Ala Gli 170

   Ala Asp Gli

   Asp Ser Leu 200

   Val Glu Gli

   Ala Ala Val 230

   Tre Leu Val

   Ala Leu Tre 260

   Ala Leu Glu

   Pro Pro Asp 290

   Leu Trp Leu

   Val Asn Gli

   Ala Ile Arg

   Tre Gin Ala

   Ala Trp Arg

   Gli Asp Lis

   Gli Cis Lis

   Gli Gli Tre

   Ile Gin Ser

   Cis Cis Ile

   Ile Leu Tir

   Pro Leu Ile

   Leu Ser Ala

   Fen Pro Asn

   Gli Val Gli

   Ala Met Asp

   Val Glu Glu

   Leu Arg Asp

   Ser Gli His

   Ser Ala Gin

   Leu Arg Gli 70

   Leu Ala Gin

   Gin Gin Leu 100

   Val Ser Leu

   Val Pro Met 130

   Leu Asp Lis

   Pro Glu Gin 160

   Val Gli Gin

   Ala Ala Arg 190

   Tre Ala Ser

   Leu Val Val 220

   Gin Glu Gin

   Ala Ser Leu 250

   Lis Pro Leu

   Ala Leu Leu 280

   Leu Val Tre

   Ala Gli Tre

   Gli Ala Gin 60

   Met Asp Leu

   Ser Gli Gin 90

   Val Asp Lis

   Val Leu Ala 120

   Ile Ser Gli

   Leu Glu Ser 150

   Met Gin Val

   Ser Glu Gin 180

   Asp Val Tre

   Ile Leu Ser 210

   Asp Val Lis

   Ala Arg Glu 240

   Gli Leu Arg

   Gli Arg Cis 270

   Cis Met Asp

   Tre Leu Gli 300

   Gin Ala Gin

   -4310

   Gli Ala Ala Arg Vai 320 Ala Ala Ala Leu Asp Asp Gli Ser Ala Leu 330 Gli Arg Fen Glu Arg Met Leu Ala Ala Gin 340 Gli Vai Asp Pro Gli Leu Ala Arg Ala Leu 350 Cis Ser Gli Ser Pro Ala Glu Arg Arg Gin 360 Leu Leu Pro Arg Ala Arg Glu Gin Glu Glu 370 Leu Leu Ala Pro Ala Asp Gli Tre Vai Glu 380 Leu Vai Arg Ala Leu Pro Leu Ala Leu Vai 390 Leu His Glu Leu Gli Ala Gli Arg Ser Arg 400 Ala Gli Glu Pro Leu Arg Leu Gli Vai Gli 410 Ala Glu Leu Leu Vai Asp Vai Gli Gin Arg 420 Leu Arg Arg Gli Tre Pro Trp Leu Arg Vai 430 His Arg Asp Gli Pro Ala Leu Ser Gli Pro 440 Gin Ser Arg Ala Leu Gin Glu Ala Leu Vai 450 Leu Ser Asp Arg Ala Pro Fen Ala Ala Pro 460 Leu Pro Fen Ala Glu Leu Vai Leu Pro Pro 470 Gin Gin 3^a Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a

   reivindicação 1, caracterizada por codificar o factor de crescimento de células endoteliais derivado de plaquetas, tendo a sequência de aminoácidos que se segue:

   Met Ala Ala Leu Met Tre Pro Gli Tre Gli 10

   Ala Pro Pro Ala Pro Gli Asp Fen Ser Gli Glu Gli Ser Gin Gli 20

   -5Leu Pro Asp

   Arg Met Lis

   Gli Fen Vai

   Ile Gli Ala

   Glu Glu Tre

   Gin Leu Glu

   His Ser Tre

   Pro Ala Leu

   Arg Gli Leu

   Ile Pro Gli

   Leu Leu Asp

   Leu Vai Pro

   Ala Tre Vai

   Lis Lis Leu

   Fen Gli Gli

   Leu Ala Lis

   Vai Ala Ala

   Vai Gli His

   Pro Ser Pro 30

   Arg Asp Gli

   Ala Ala Vai 60

   Met Leu Met

   Ser Vai Leu 90

   Trp Pro Glu

   Gli Gli Vai 120

   Ala Ala Cis

   Gli His Tre 150

   Fen Asn Vai

   Gin Ala Gli 180

   Ala Asp Gli

   Asp Ser Leu 210

   Vai Glu Gli

   Ala Ala Vai 240

   Tre Leu Vai

   Ala Leu Tre 270

   Ala Leu Glu

   Glu Pro Lis

   Gli Arg Leu

   Vai Asn Gli

   Ala Ile Arg

   Tre Gin Ala

   Ala Trp Arg

   Gli Asp Lis

   Gli Cis Lis

   Gli Gli Tre

   Ile Gin Ser

   Cis Cis Ile

   Ile Leu Tir

   Pro Leu Ile

   Leu Ser Ala

   Fen Pro Asn

   Gli Vai Gli

   Ala Met Asp

   Vai Glu Glu

   Gin Leu Pro

   Ser Glu Ala 50

   Ser Ala Gin

   Leu Arg Gli 80

   Leu Ala Gin

   Gin Gin Leu 110

   Vai Ser Leu

   Vai Pro Met 140

   Leu Asp Lis

   Pro Glu Gin 1780

   Vai Gli Gin

   Ala Ala Arg 200

   Tre Ala Ser

   Leu Vai Vai 230

   Gin Glu Gin

   Ala Ser Leu 260

   Lis Pro Leu

   Ala Leu Leu

   Glu Leu Ile 40

   Asp Ile Arg

   Gli Ala Gin 70

   Met Asp Leu

   Ser Gli Gin 100

   Vai Asp Lis

   Vai Leu Ala 130

   Ile Ser Gli

   Leu Glu Ser 160

   Met Gin Vai

   Ser Glu Gin 190

   Asp Vai Tre

   Ile Leu Ser 220

   Asp Vai Lis

   Ala Arg Glu 250

   Gli Leu Arg

   Gli Arg Cis 280

   Cis Met Asp

   -6290

   Gli Ala Gli Pro Pro 300 Asp Leu Arg Asp Leu Vai Tre Tre Leu Gli 310 Gli Ala Leu Leu Trp Leu Ser Gli His Ala 320 Gli Tre Gin Ala Gin Gli Ala Ala Arg Vai 330 Ala Ala Ala Leu Asp Asp Gli Ser Ala Leu 340 Gli Arg Fen Glu Arg Met Leu Ala Ala Gin 350 Gli Vai Asp Pro Gli Leu Ala Arg Ala Leu 360 Cis Ser Gli Ser Pro Ala Glu Arg Arg Gin 370 Leu Leu Pro Arg Ala Arg Glu Gin Glu Glu 380 Leu Leu Ala Pro Ala Asp Gli Tre Vai Glu 390 Leu Vai Arg Ala Leu Pro Leu Ala Leu Vai 400 Leu His Glu Leu Gli Ala Gli Arg Ser Arg 410 Ala Gli Glu Pro Leu Arg Leu Gli Vai Gli 420 Ala Glu Leu Leu Vai Asp Vai Gli Gin Arg 430 Leu Arg Arg Gli Tre Pro Trp Leu Arg Vai 440 His Arg Asp Gli Pro Ala Leu Ser Gli Pro 450 Gin Ser Arg Ala Leu Gin Glu Ala Leu Vai 460 Leu Ser Asp Arg Ala Pro Fen Ala Ala Pro 470 Leu Pro Fen Ala Glu Leu Vai Leu Pro Pro 480 Gin Gin
3. 4^a. - Vector de expressão replicável, caracterizado por compreender uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-3, que está operacionalmente ligada a uma sequência de ácido nucleico capaz de efectuar a expressão do referido factor de crescimento.
4. 5^a. - Microrganismo transformante ou uma cultura de células, caracterizados por serem transformados com o vector de expressão replicável da

   Reivindicação 4, o qual é capaz, nos referidos microrganismo transformante ou cultura de células, de exprimir o referido factor de crescimento de células endoteliais.

   -Ί
5. 6^a. - Cultura de células de acordo com a Reivindicação 5, caracterizada por compreender células NIH 3T3 transformadas.
6. 7^a. - Microrganismo de acordo com a Reivindicação 20, caracterizado por compreender uma estirpe E. coli transformada.
7. 8^a. - Polipeptídeo, caracterizado por compreender PD-ECGF, em que o referido polipeptídeo é codificado pela sequência de ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-3.
8. 9^a. - Composição terapêutica, caracterizada por compreender o factor de crescimento de células endoteliais recombinante, de acordo com a Reivindicação 8, juntamente com um veículo farmacêutico, útil no tratamento de feridas, aterosclerose, angiogénese ou trombocitopenia.
9. 10^a. - Processo para a preparação de polipeptídeo PD-ECGF recombinante, caracterizado por se cultivar uma cultura de células transfectadas, de acordo com a Reivindicação 5, e se recolher, a partir da referida cultura, o PD-ECGF expresso.

   -81 Γ. - Utilização dos polipeptídeos de acordo com a Reivindicação 8, caracterizada por os referidos polipeptídeos serem empregues na preparação de um composição terapêutica útil no tratamento de feridas, aterosclerose, angiogénese ou trombocitopenia.

   Pede a V.Exa. se digne conceder-lhe a respectiva patente de invenção