JPH08508511A

JPH08508511A - 副行循環の改善への血小板由来成長因子の使用

Info

Publication number: JPH08508511A
Application number: JP6524579A
Authority: JP
Inventors: コウル，ロジヤー・カーリル
Original assignee: ワシントン・ユニバーシテイー
Priority date: 1993-04-29
Filing date: 1994-04-29
Publication date: 1996-09-10
Also published as: AU6778794A; WO1994025056A2; WO1994025056A3; CA2161669A1; US6086866A; EP0697883A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、虚血症または虚血性壊死の危険の有る組織への副行循環を改善する非侵襲的方法を提供する。患部組織への直接循環の低下を惹起する閉塞血管の区域または該血管を囲繞する区域にＰＤＧＦ群に属する成長因子を適用することによって副行循環が改善できる。本発明は、ＰＤＧＦ群に属する成長因子を用いて一つ以上の分離血管を吻合させる方法も提供する。好ましくは成長因子は、（一つ以上の）分離血管の、虚血症の危険の有る器官の組織にただ一つの分離血管を付着させる区域にかまたは該区域の周囲に位置する（一つ以上の）端部に局所投与する。

Description

【発明の詳細な説明】副行循環の改善への血小板由来成長因子の使用背景ヒトの血小板由来成長因子（“ＰＤＧＦ”）は血清中に存在する、結合組織細胞に作用する主要な有糸分裂誘発性成長因子であると考えられる。ＰＤＧＦの有糸分裂誘発活性は多くの研究で実証されており、それらの研究はＰＤＧＦが、動脈平滑筋細胞、線維芽細胞系及び神経膠細胞における有糸分裂誘発に肯定的に影響することを明示した。Ｄｅｕｅｌ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６（１７），ｐｐ．８８９６−８８９９，１９８１参照。例えばＨｅｌｄｉｎ等，Ｊ．ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．１０５，ｐ．２３５，１９８０（脳神経膠細胞）；Ｒａｉｎｅｓ及びＲｏｓｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，ｐ．５１５４，１９８２（サル動脈平滑筋細胞）も参照されたい。ＰＤＧＦは、線維芽細胞、平滑筋細胞、単球及び顆粒球に作用する化学誘引物質であるとも考えられる。結合組織創傷の部位において有糸分裂を誘発する能力と、前記創傷の部位に線維芽細胞を誘引する能力との両方を明らかに有することから、ＰＤＧＦは傷害された、もしくは外傷を受けた結合組織を修復する治療に用いられる特別の潜在能力を有すると考えられる。ＰＤＧＦ群に属する他の成長因子に、血管内皮細胞成長因子（“ＶＥＧＦ”；時に“血管透過性因子”もしくは“ＶＰＦ”とも呼称）及び胎盤成長因子（“ ＰＬＧＦ”）が含まれる。Ｔｉｓｃｈｅｒ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６５（３），ｐｐ．１１９８−１２０６，１９８９及びＭａｇｌｉｏｎｅ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８，ｐｐ．９２６７−９２７１，１９９１をそれぞれ参照されたい。ＶＥＧＦ及びＰＬＧＦはいずれも、ＰＤＧＦ群の一員であるこれらの成長因子の各モノマー単位のＰＤＧＦ相同領域に現われる８個の高度に保たれたシステイン残基からジスルフィド結合ダイマーを形成する。Ｔｉｓｃｈｅｒ等及びＭａｇｌｉｏｎｅ等の上掲文献参照。また、ＶＥＧＦ及びＰＬＧＦのレセプターはＰＤＧＦレセプターと同じレセプター亜群に属する。従って、“比較的新しく”ＰＤＧＦ群の一員となったこれらの成長因子はＰＤＧＦほど広範に研究されてはいないが、創傷の修復に用いる治療物質として潜在的に有用であると考えられる。天然のＰＤＧＦは、２本のペプチド鎖即ち“Ａ”鎖及び“Ｂ”鎖を有するジスルフィド結合ダイマーであり、その際Ａ鎖はＢ鎖と約６０％相同である。天然ＰＤＧＦは３種のダイマー形態のうちのいずれか、即ちＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマー、ＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーまたはＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマーの形態で見出される。Ｈａｎｎｉｎｋ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６，ｐｐ．１３０４−１３１４，１９８６参照。ＰＤＧＦ−ＡＢが主要な天然形態として同定されているが、創傷治癒研究において最も広範に用いられているのはＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーである。生物活性ダイマーの各モノマーサブユニットは、Ａ鎖モノマーとＢ鎖モノマーとのいずれであるかに関係なく８個のシステイン残基を有する。これらのシステイン残基のうちの幾つかが、ダイマーを一体に保持する鎖間ジスルフィド結合を構成する。ヒト血小板中に見出されるＰＤＧＦ−Ｂは、２４１アミノ酸前駆ポリペプチドからの１０９アミノ酸開裂生成物（ＰＤＧＦ−Ｂ₁₀₉）として同定されている。Ｊｏｈｎｓｓｏｎ等，ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ３（５），ｐｐ．９２１−９２８，１９８４参照。この１０９アミノ酸相同配列は、ｃ−ｓｉｓによってコードされるＰＤＧＦ−Ｂ前駆タンパク質の１０９アミノ酸開裂生成物に一致し、多くの人々によってヒトのＰＤＧＦの成熟形態であると考えられている。ｃ−ｓｉｓによってコードされる前駆タンパク質との相同性は、２４１アミノ酸前駆タンパク質のアミノ酸８２から始まってアミノ酸１０９個分続く。ｃ−ｓｉｓによってコードされるＰＤＧＦ−Ｂ前駆タンパク質の最初の１１９個のアミノ酸に対応する別の形態のＰＤＧＦ−Ｂ（ＰＤＧＦ −Ｂ₁₁₉）も、トランスフェクトされた哺乳動物宿主においてｃ−ｓｉｓ遺伝子の全体が発現する場合の、ｃ−ｓｉｓによってコードされる前駆タンパク質の主要な開裂生成物として同定されている。米国特許第５，１４９，７９２号参照。ＰＤＧＦをヒト及び／または動物の切創及び皮膚潰瘍を含めた皮膚創傷に適用すると、このような創傷が治癒する速度が加速されることが判明している。Ｐｉｅｒｃｅ等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７，ｐｐ．９７４−９８７，１９８８（ラットの切創）；Ｒｏｂｓｏｎ等，ＴｈｅＬａｎｃｅｔ３３９，ｐｐ．２３ −２５，１９９２（ヒトの皮膚潰瘍）参照。ＰＤＧＦは創傷治癒の加速において、創傷床における一時性マトリックスの沈着を剌激することによって機能すると考えられている。Ｐｉｅｒｃｅ等，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ１４０（６），ｐｐ．１３７５−１３８８，１９９２参照。ＰＤＧＦは上記一時性マトリックスの沈着と結び付いた支持的血管形成を間接的に剌激するとも考えられる。Ｐｉｅｒｃｅ等の上掲文献参照。しかし、この程度の支持的血管形成では、ＰＤＧＦが単独で虚血性創傷の治癒を著しく加速するには不十分である恐れが有る。更に重要なことに、ＰＤＧＦは壊死の危険の有る虚血組織において副行循環を創出する能力を示していない。現在、虚血性壊死の危険の有る組織への副行循環を実現する最良の方法は外科的吻合術またはバイパス手術である。内視鏡技術の進歩により、幾つかの心臓外科的処置を胸腔鏡を用いて行なうことが可能となったが（Ｍａｃｋ等，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．５６，ｐｐ．７３９−７４０，１９９３；Ｈａｚｅｌｒｉｇｇ等，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．５６，ｐｐ．７９２−７９５，１９９３；Ｆｒｕｍｉｎ等，ＰＡＣＥ１６，ｐｐ．２５７−２６０，１９９３）、冠動脈バイパス移植を心肺バイパス無しで胸腔鏡を用いて行なうことは、冠動脈吻合術を拍動する心臓上で確実かつ安全に行なえるようにならないうちは可能でない。即ち、虚血症の危険の有る組織において副行循環を創出する確立された非侵襲的処置は存在しない。それにもかかわらず、始原的（ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｃａｌ）な血管形成因子と看做される線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）が虚血性心疾患の治療において示唆されており、またこの成長因子は心筋梗塞に起因する諸状態を緩和することが示唆されている。米国特許第４，２７８，３４７号及び同第４，２９６，１００号をそれぞれ参照されたい。Ｙａｎａｇｉｓａｗａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７，ｐｐ．１４０１−１４０３，１９９２も塩基性ＦＧＦを近位冠循環に注入して、冠動脈閉塞の際の心筋梗塞の大きさの減少を証明した。このアプローチはしかし、アテローム性動脈硬化症の疾患過程によって既に低下しているまさにその冠循環における良好な血流に頼るものである。Ｕｎｇｅｒ等，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６４，Ｈ１５６７−Ｈ１５７４，１９９３は、内乳血管を左心室心筋中に移植し、それと共に移植血管の遠位端に酸性ＦＧＦを注入したところ、ヘパリン注入のみによって達成したものを越える有益な効果は得られなかったと報告している。本発明は、虚血症または虚血性壊死の危険の有る組織において副行循環を改善する非侵襲的方法を提供することを目的とする。本発明はまた、血管の吻合を実現する非侵襲的方法の提供も目的とする。非外科的なバイパス移植方法の提供も本発明の目的である。発明の概要本発明は、閉塞した血管または閉塞の危険の有る血管の区域における、または該区域の周囲での副行循環を、ＰＤＧＦ群に属する成長因子の適用によって改善する非侵襲的方法を提供する。本発明はまた、ＰＤＧＦ群に属する成長因子を用いて血管を吻合させる方法も提供する。この吻合術は二つの分離（ｄｉｖｉｄｅｄ）血管同士の再結合か、またはただ一つの分離血管の、虚血症の危険の有る組織の循環床への結合を含み得る。組織成長因子は、患部虚血組織の区域への局所投与によってかまたは全身注入によって投与し得る。一つ以上の血管の吻合が望ましい場合、成長因子は吻合させたい血管にか、または分離血管が虚血症の危険の有る組織に付着する部位の区域もしくは該部位の周囲の区域に直接投与し得る。図面の簡単な説明図１はＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉のための核酸コーディング配列を示す説明図である。図２は実施例５に提示した、ＰＤＧＦの予防投与後３日目のグループのラットから得た皮弁の代表例の血管造影図である。図３は実施例５に提示した、ＰＤＧＦの予防投与後４日目のグループのラットから得た皮弁の代表例の血管造影図である。図４は実施例５に提示した、ＰＤＧＦの予防投与後７日目のグループのラットから得た皮弁の代表例の血管造影図である。図５は実施例５のラットの皮弁組織の副行循環による潅流を通常の皮膚潅流と比較して示すグラフである。図６は実施例５のラットの皮弁組織の生存率を示すグラフである。図７Ａは造影溶液注入後その場で撮影した実施例６の対照血管の写真である。図７Ｂは造影溶液注入後その場で撮影した実施例６の、ＰＤＧＦ−Ｂで治療した血管の写真である。図８はＰＤＧＦ−ＢＢによって誘発する心臓外から冠動脈への血管吻合の実験モデルの説明図である。図９はＰＤＧＦ−ＢＢ治療が左前下行動脈の急性閉塞後の生存率及び梗塞を起こさなかった個体の生存率に及ぼす影響を示す棒グラフである。図１０はＰＤＧＦ−ＢＢ治療が左前下行動脈の急性閉塞後の梗塞の大きさに及ぼす影響を示す棒グラフである。図１１は実施例７のウサギの各グループから得た左心室の代表例の肉眼的病変横断面の写真である。図１２Ａは実施例７の対照グループの微小血管造影図である。図１２Ｂは実施例７の、ＰＤＧＦ−ＢＢで治療したグループの微小血管造影図である。発明の詳細な説明本発明は、ＰＤＧＦ群に属する成長因子の適用によって副行循環を改善し、及び／または血管を吻合させる方法を提供する。本発明の理解の一助とするべく、本明細書中に用いる語を次のように定義する。 “直接循環”という語は、組織への循環系の主要な直接的動脈のうちの一つによる当該組織への血液の潅流（例えば冠動脈から心臓への潅流；大腿動脈から脚への潅流）が実現する血流を意味する。 “副行循環”という語は、直接循環以外に由来する血流を意味する。 “低下した直接循環”という語は、血管の閉塞によって損なわれた直接循環を意味する。閉塞は、動脈遮断及び血管の分離を含めた幾つかの原因のうちのいずれかの結果として生起し得る。通常、直接循環が少なくとも約５０％損なわれて低下すると組織は壊死の危険に晒され始める。本明細書中に用いた血管の“閉塞”という語は、その（一つ以上の）極限位置まで閉塞した血管による正常な血流の制限度を意味する。閉塞は血管の狭窄の結果として（例えば動脈遮断、結紮）、または血管の切断（分離）に起因して生起し得る。 “改善された副行循環”という語は、患部虚血組織の生存能力を維持するのに十分なレベルまで高められた副行循環を意味する。 “吻合させる”または“吻合術”という語は、血管の一部もしくは枝同士を、血液が一方の血管から他方へと自由に流れることを可能にするように癒合させることを意味する。吻合とは例えば、二つの分離血管同士の癒合かまたはただ一つの分離血管と組織の循環床との癒合の意味でもあり得る。 “分離血管”という語は切断された血管を意味する。血管は（例えば外傷により）偶発的に切断されたり、（例えば身体上の別の部位に再建移植する“皮弁” の外科的除去のために）外科的処置によって意図的に切断されたりすることが有る。 “治療有効”量という語はＰＤＧＦ、またはＰＤＧＦ群に属する他の成長因子の、その他の（即ちＰＤＧＦ群に属さない）成長因子の不在下にヒトまたは動物被検者において改善された副行循環を実現するように決定した量を意味する。本明細書中に用いた“ＰＤＧＦ”という語は、還元または非還元であったり、生物活性または不活性であったり、対応する天然ポリペプチドと実質的に同じ有糸分裂誘発活性、化学走化活性、酵素活性及び／または他の検出可能な生物活性を有する組み換え体その他であったりする類似体を含めたＰＤＧＦモノマー及び／またはダイマーの任意の組み合わせを意味する。“ＰＤＧＦ”という語は特に、天然ＰＤＧＦのアミノ酸配列に一つ以上のアミノ酸の数及び／または種類の改変を加えたＰＤＧＦ類似体を包含するものとする。本明細書中に用いた“ＶＥＧＦ”という語は、還元または非還元であったり、生物活性または不活性であったり、対応する天然ポリペプチドと実質的に同じ有糸分裂誘発活性、化学走化活性、酵素活性及び／または他の検出可能な生物活性を有する組み換え体その他であったりする類似体を含めたＶＥＧＦモノマー及び／またはダイマーの任意の組み合わせを意味する。“ＶＥＧＦ”という語は特に、天然ＶＥＧＦのアミノ酸配列に一つ以上のアミノ酸の数及び／または種類の改変を加えたＶＥＧＦ類似体を包含するものとする。本明細書中に用いた“ＰＬＧＦ”という語は、還元または非還元であったり、生物活性または不活性であったり、対応する天然ポリペプチドと実質的に同じ有糸分裂誘発活性、化学走化活性、酵素活性及び／または他の検出可能な生物活性を有する組み換え体その他であったりする類似体を含めたＰＬＧＦモノマー及び／またはダイマーの任意の組み合わせを意味する。“ＰＬＧＦ”という語は特に、天然ＰＬＧＦのアミノ酸配列に一つ以上のアミノ酸の数及び／または種類の改変を加えたＰＬＧＦ類似体を包含するものとする。 “ＰＤＧＦ前駆タンパク質”という語は、ｃ−ｓｉｓによってコードされる２４１アミノ酸前駆タンパク質の、該ポリペプチドをより短いその成熟形態（例えばＰＤＧＦ−Ｂ₁₀₉及びＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉）へとプロセッシングする前の完全な状態を意味する。本発明によれば、ＰＤＧＦ群に属する成長因子は低下した直接循環の部位において、または該部位の周囲において機能的副行循環を改善するのに用い得ることが判明した。副行循環の改善は新血管形成の結果として、及び／または血管の吻合によって実現し得る。即ち本発明は、ヒトまたは動物被検者の低下した直接循環によって生じる虚血組織への副行循環を、ヒトまたは動物被検者にＰＤＧＦまたはＰＤＧＦ群に属する他の成長因子を治療有効量で投与することにより改善する方法を提供する。直接循環の低下を招く医学的条件及び疾患状態は多数存在する。例えば心筋梗塞、卒中及び間歇破行は、心臓、脳及び下肢それぞれの主要動脈による血液供給がアテローム性動脈硬化症によって制限された結果としての直接循環低下の例である。直接循環が低下した状態は当然ながら、直接循環の低下によって生じる虚血組織への血流を増加させる循環の幾分制限された副行化を惹起する。しかし、この通常の生体応答は、虚血組織における機能的副行循環の創出にはしばしば不十分である。副行循環を十分に改善しないと虚血組織は死ぬ、即ち壊死するかもしれず、壊死した組織は除去しなければならない。心筋梗塞の場合、心臓が機能を停止して死に至る恐れが有る。四肢への直接循環が低下した場合は、患部四肢が壊疽となって切断の必要が生じかねない。このように、壊死の危険の有る虚血組織の場合は常に、虚血組織への、及び該組織中での副行循環を急速に改善することがきわめて重要である。“危険”組織への副行循環を急速に改善させることの重要性は、脳組織が該組織への血液供給を僅か１５分間断たれただけで死ぬという事実を考え合わせることで最も良く理解できる。心臓組織は、該組織への血液供給を断たれた場合２時間まで生存し得るが、この時点以後は機能を停止する。身体の他の組織は通常、壊死が始まる前に４〜６時間より長くは持ちこたえられない。即ち、ほとんどの場合本発明の方法を用いて、壊死の危険の有る虚血組織への循環、または単に虚血症の危険の有る組織への循環さえも、例えば（心疾患治療のための）心臓バイパス及び（下肢の虚血性疾患の治療のための）脚移植片を用いる従来の外科的処置を行なうのと類似の方法で予防的に改善することが好ましい。危険と判断され、従って本発明の方法による予防的治療を受ける候補となる組織は、副行循環を改善する従来の外科的処置のために現在組織を同定するのとほぼ同様にして同定される。臨床の実地において、ＰＤＧＦ群に属する成長因子は例えば患部虚血区域への局所投与によって、あるいはまた全身注入によって投与し得るが、局所投与が好ましい。このような成長因子適用は、例えば再建プロセスにおいて身体の別の部分から組織を除去し、これを再建部位に移植する“皮弁”手術の際に行なう。移植組織片の再建部位に治療有効量の成長因子を投与すると副行循環が改善され、それによって“皮弁”組織は該組織自体の再建部位における副行血液供給をより急速に展開し得るようになり、よってこの種の再建手術の成功率は劇的に上昇する。再建“皮弁”手術の場合、成長因子の反復投与によるか、徐放性賦形剤の利用によるか、またはこれらの両方によって成長因子を連続的に適用することが有利であり得る。分離血管の吻合を実現することが望ましい場合は、ＰＤＧＦ群に属する成長因子を吻合前または吻合時の結紮血管の端部に投与し得る。例えば、直接循環を担う動脈（例えば冠動脈）の切迫閉塞に起因する虚血症または虚血性壊死の危険の有る心臓組織に関しては、治療有効量のＰＤＧＦ群に属する成長因子を内視鏡を用いて投与し、それによって近傍の身体部分から意図的に分離した血管（例えば内乳動脈）を心臓の血管に結合させることにより副行循環を予防的に改善し得、即ち心臓組織への副行循環を改善して、はるかに侵襲的な従来の心臓バイパス手術の必要性を排除する。拍動する心臓での再血管新生が、直接的かつ外科的な冠動脈吻合術、心肺バイパスまたは正中幹切開創に頼ることなく上記のように内視鏡を用いて可能であることによって、現行の冠動脈バイパス移植に伴う問題は著しく低減される。しかし、二つの分離血管を吻合処置で再結合させる必要は無い。実際、バイパス移植では、ただ一つの分離血管（即ちバイパス移植血管）を虚血症の危険の有る器官の組織の循環床に複数箇所で吻合させることがしばしば好ましい。分離した移植血管を器官の循環床に上記のようにして吻合させることが望ましい場合は、移植血管をまず所期の分離地点において結紮し、焼灼し、または実質的に閉塞させてから分離し、一方の分離端部を患部器官の組織に単に付着させる。移植処置中の任意時点に治療有効量のＰＤＧＦ群に属する成長因子を、移植血管付着部位にかまたは該部位の近傍に適用する。患部器官の組織への移植血管の付着は、当業者に公知の任意方法で実現し得る。好ましくは、器官組織中にトンネルを形成してその中に移植血管を設置するか、または移植血管を器官組織中に埋設することによって付着を実現する。成長因子の適用はバイパス移植血管の、該移植血管がその中に配置された組織の循環床との結合を誘発する。移植血管の結紮部は典型的には付着後に壊死し、血液が移植血管から該血管の壊死先端を経てか、または壊死端部近傍に“ 出現”した複数の血管を経て患部器官の循環床の血管へと流れることを可能にする。このように、移植を行なううえで患部器官の血管の分離は必要ない。投与するべきＰＤＧＦ群に属する成長因子の治療有効量はきわめて様々であり、成長因子を虚血組織における副行循環の向上のために適用するか、それとも血管を吻合させるというより急がれる目的のために適用するかに依存する。適用目的が前者である場合、（一つ以上の）患部組織における虚血症の位置及び程度などの事情が成長因子の治療有効量の決定に影響する。ほとんどの事例において、患部組織中に所望レベルの機能的副行循環を確立するには成長因子をただ１回の短期適用により投与すれば十分であるが、場合によっては成長因子の適用を数日間、または何週間にもわたって継続しなければならないことも有る。継続治療は成長因子の反復適用によって、及び／または徐放性賦形剤の使用によって達成可能である。血管を吻合させるべきである場合は、吻合させたい血管部位の位置及び間隔を成長因子の治療有効量決定の要因として考慮しなければならない。吻合が所望である場合、治療有効量の成長因子をただ１回の適用で投与することが好ましい。この目的のために成長因子をただ１回の適用で投与する時は、徐放性賦形剤を用いて成長因子を投与することが好ましい場合も有る。副行循環を向上させるべくＰＤＧＦ群に属する成長因子を体外から適用するための組成物は、当業者によって容易に確認される。当然ながら、治療有効量決定の場合と同様に、成長因子の好ましい投与経路は治療する状態と共に様々である。成長因子を純粋な、または実質的に純粋な化合物として投与することは可能であるが、医薬配合物もしくは医薬製剤として提供する方が好ましい。ヒト以外の動物とヒトとの両方に用いられる本発明の配合物は、先に述べたＰＤＧＦ群に属する成長因子を治療有効量で、該成長因子のための医薬的に許容可能な１種以上のキャリヤ、及び場合によっては他の治療成分と共に含有する。（１種以上の）キャリヤは、配合物の他の成分と適合し得、かつ配合物のレシピエントに有害でないという意味において“許容可能”でなければならない。望ましくは、配合物は酸化または還元剤、及びペプチドと不適合であることが知られている他の物質を含有するべきでない。配合物は単位投与形態で適宜提供し得、かつ当業者に良く知られた任意の方法で調製可能である。いずれの方法も活性成分と、１種以上の付加的成分を成すキャリヤとを一緒にするステップを含む。通常は、成長因子を液体キャリヤ、半液体キャリヤもしくは微細固体キャリヤ、またはこれらの任意の組み合わせと均一かつ緊密に混合させることによって配合物を調製する。先に指摘したように、ＰＤＧＦ群には、いずれも当業者に公知であるＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ及びＰＬＧＦが含まれる。副行循環の向上及び／または血管の吻合に用いる成長因子はＰＤＧＦ群に属する任意の生物活性成長因子とし得るが、当該成長因子がＰＤＧＦであれば好ましい。ＰＤＧＦは、生物活性であるかぎりダイマー形態であってもモノマー形態であってもよい。好ましいＰＤＧＦ形態はＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーである。ＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーの好ましい形態には、ＰＤＧＦ−ＢＢ₁₀₉ホモダイマー、ＰＤＧＦ−ＢＢ₁₁₉ホモダイマー、及びこれらの組み合わせ（例えばＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉ホモダイマー）が含まれる。好ましいＰＤＧＦは通常、当業者に公知である幾つかの組み換えタンパク質製造方法のうちのいずれかによって製造し得る。多くの場合、ＰＤＧＦのためのコーディング配列は既に入手可能であり得る。当然ながら、ＤＮＡ配列決定装置を用いて所望のＰＤＧＦコーディング配列を合成することも可能である。ＰＤＧＦのためのコーディング配列の生成に用いる特定方法は通常、出発物質の入手可能性を含めた幾つかの実際的な要件によって定まる。所望形態のＰＤＧＦのためのコーディング配列を構築したら該配列をベクターに挿入し、このようにして得られたベクターを用いて適当な宿主細胞を、当業者に公知の標準的な技術によってトランスフェクトする。例えば、上記のようなサブユニットのためのコーディング配列で酵母または真核宿主細胞をトランスフェクトし、その結果生じた生成物を細胞培養物から回収し得、または前記配列で大腸菌宿主細胞をトランスフェクトし、その後ＰＤＧＦを折り畳んで生物活性タンパク質生成物を生じさせ得る。例えばＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーの場合、最初にｖ−ｓｉｓ遺伝子を修飾してヒトの同等遺伝子ｃ−ｓｉｓを得るか、またはｃ−ｓｉｓを出発物質として用いることが可能である。あるいは他の場合には、ＰＤＧＦ−ＢＢコーディング配列を合成し得、または最初にｃ−ｓｉｓ遺伝子もしくは修飾ｖ−ｓｉｓ遺伝子をカルボキシル末端近傍の適当な制限部位において切断し、次にＰＤＧＦ前駆タンパク質コーディング配列のカルボキシル末端を所望の終結位置に、用いる特定のベクター及び宿主細胞にとって好ましいコドンを用いて再形成し得る。ｃ−ｓｉｓ遺伝子または修飾ｖ−ｓｉｓ遺伝子をアミノ末端近傍の適当な制限部位において切断することも可能であり、その際アミノ末端は所望の開始位置に、やはり選択したベクター及び宿主細胞系にとって好ましいコドンを用いて再形成する。換言すれば、好ましいＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーなどのＰＤＧＦの生成には合成法と、天然の出発物質のｉｎｖｉｔｒｏ突然変異誘発とのいかなる組み合わせも用い得る。本発明の融合ダイマーの生成にとって好ましい宿主細胞系は細菌宿主細胞であり、好ましくは大腸菌である。本明細書中に述べた特定の発現系に加えて、本発明は他の系も考慮し、それらの系は例えばプロテアーゼ開裂部位の修飾、及び／または宿主細胞による本発明の融合ダイマー産生のレベルを高めるための代替先導配列の使用を非限定的に包含する。その真の範囲を請求の範囲各項に示した本発明の理解の一助とするべく、以下に実施例を提示する。いかなる形態のＰＤＧＦも本発明の考慮下に有るが、以下の実施例ではＰＤＧＦ−ＢＢ₁₁₉を用いた。ここに示した操作は本発明の精神から逸脱せずに変形可能であると理解される。実施例１ＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉コード配列の構築出発物質としてｖ−ｓｉｓ遺伝子を用いて、図３に示されているＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉ コード配列を構築した。Ａ．アミノ酸１０１及び１０２の変換１μｇのプラスミドｐＣ６０、ＳＶ肉腫レトロウイルスゲノム（Wong-Staalら，Science，213，226-228（1981））を、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩ及びＸｂａＩで消化し、次いで、Maniatisら，Molecular Cloning−A Laboratory Ma nual，Cord Spring Harbor Laboratory（1982）に記載の手順に従って、得られた１１８３塩基対フラグメントを低融点アガロースゲル中で電気泳動で分離して精製した。次いで精製されたフラグメントをゲルから切り出した。同時に、０．２μｇのＭ１３ｍｐ１９ＤＮＡもＳａｌＩ及びＸｂａＩで消化し、同様に７２４５塩基対の大バンドを低融点ゲルから単離した。切り出された両方のゲルスライスを６５℃で融解し、次いで３７℃に冷却した。７２４５塩基対のＭ１３ｍｐ１９フラグメントを含むゲル全体と１１８３塩基対のｖ−ｓｉｓフラグメントを含むゲル４分の１とを混合し、Struhl，Biotechniques，3，452-453（198 5）に従って連結した。連結されたＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉＸ１２株ＴＧ１に形質転換し、透明プラークを選択し、液体培養中で増殖させた。Ｍ１３ｍｐ１９ベクター中の１１８３塩基対のｖ−ｓｉｓフラグメントの存在をＲＦ形態のファージＤＮＡの形成及び制限地図分析により確認した（Messingら，Nucl．Acids Res. ，9，309-321（1981））。このようにして得られたＭ１３ｍｐ１９／ｖ−ｓｉｓファージを液体培養中で増殖させ、一本鎖ＤＮＡを単離した（Messingら，前出）。このＤＮＡをオリゴヌクレオチド指向in vitro突然変異誘発用の鋳型として用いて、１０１残基のアミノ酸及び１０７残基のアミノ酸を対応するＰＤＧＦ−Ｂアミノ酸に変換した。即ち、イソロイシン１０１をコードするＡＴＡコドンをＡＣＡ（トレオニンをコードする）に変換し、アラニン１０７をコードするＧＣＴコドンをＣＣＴ（プロリンをコードする）に変換した。１０μｇのＭ１３ｍｐ１９／ｖ−ｓｉｓ一本鎖ＤＮＡを、配列：を有するリン酸化オリゴヌクレオチド８ｐｍｏｌでアニーリングした。この配列は、ｖ−ｓｉｓ遺伝子のヌクレオチドの４２８３〜４３１６（Devare ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，79，3179-3183（1982）のナンバリングシステム）と相同である。オリゴヌクレオチドの下線を付した塩基は、ｖ−ｓｉｓからヒトＰＤＧＦ−Ｂ配列への改変を示す。突然変異オリゴヌクレオチド上でＤＮＡ合成を開始し、チオヌクレオチド三リン酸を用いて完全な突然変異鎖をＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントと合成し、次いでＴ４ＤＮＡリガーゼと連結した。全ての残留一本鎖鋳型Ｍ１３ｍｐ１９／ｖ−ｓｉｓＤＮＡをニトロセルロースフィルター上で濾過して取り除いた。非突然変異鎖を制限エンドヌクレアーゼIIIと共にインキュベートして切断した。次いで、鋳型として突然変異鎖を用いて、切断された非突然変異鎖をデオキシヌクレオチド三リン酸と再重合させた。その結果、最終産物中の両ＤＮＡ鎖は目的の突然変異体を含んでいた。該ＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉＫ１２株ＴＧ１に形質転換した。プラークを選択し、液体培養中で増殖させ、一本鎖ＤＮＡを単離した。該ＤＮＡを、 Sangerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，74，5463-5467（1977）の方法に従って配列し、目的の突然変異体が得られたことを確認した。Ｂ．アミノ酸６及び７の変換次の段階で、突然変異されたｖ−ｓｉｓ遺伝子の５′−末端を、ｖ−ｓｉｓ由来のアミノ酸６及び７をヒトＰＤＧＦ−Ｂ形態に変えた合成ＤＮＡフラグメントで置換した。この合成フラグメントもまた、ヒトＰＤＧＦ−Ｂのセリン１に対するコドンの直前の翻訳開始ＡＴＧコドン、並びにＥ．ｃｏｌｉリボソームに結合させるための配列及び目的のＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター（以下に説明する）に連結させるための制限部位を提供した。合成ＤＮＡフラグメントを、ｖ−ｓｉｓ遺伝子のヌクレオチド４０６１（Devareらのナンバリングシステム，前出）に位置するＢｇｌII部位に連結した。Ｍ１３ｍｐ１９ベクター内に存在するＢｇｌII部位はこの段階を複雑化且つ干渉するので、先ず、突然変異ｖ−ｓｉｓ遺伝子を、ＢｇｌII部位を含まない市販のプラスミドベクターｐＵＣ１８に移動させた。Ｍ１３ｍｐ１９／ｖ−ｓｉｓ突然変異ＲＦＤＮＡをＳａｌII及びＢａｍＨ１で切断し、得られた１１９３塩基対フラグメントを低融点アガロースゲルを用いた電気泳動により単離した。このフラグメントを、これもＳａｌII及びＢａｍＨ１で切断されたプラスミドｐＵＣ１８に連結した。連結されたＤＮＡを市販のＥ．ｃｏｌｉＫ１２株ＤＨ５で形質転換し、形質転換細胞をアンピシリンの存在下の増殖により選択した。コロニーを選択し、液体培養中で増殖させ、単離されたプラスミドＤＮＡをｖ−ｓｉｓ挿入物の存在について制限地図により分析した。ｐＵＣ１８／ｖ−ｓｉｓ突然変異ＤＮＡを、突然変異ｖ−ｓｉｓ挿入物のすぐ上流のｐＵＣ１８のポリリンカーで切断するＨｉｎｄIII、及び成熟タンパク質産物であるアミノ酸番号２４に対応するヌクレオチド４０６１（Devareらのナンバリングシステム、前出）のｖ−ｓｉｓＤＮＡ内で切断するＢａｌIIで切断した。この反応から得られた３３６５塩基対の大フラグメントを低融点アガロースゲル中の電気泳動により単離した。該フラグメントを、以下の配列：を有する合成二本鎖ＤＮＡフラグメントに連結した。この合成ＤＮＡフラグメントは、その上流（左）末端にＨｉｎｄIII「付着」端を、またその下流（右）末端にＢｇｌII「付着」端を含んでいる。さらに、ＸｂａＩ部位（ＴＣＴＡＧＡ）がＨｉｎｄIII「付着」端のすぐ下流の合成ＤＮＡ内に存在することにより、以下に説明する発現ベクターのＸｂａＩ部位に連結すべくＸｂａＩによる制限が可能になる。連結されたＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉＫ１２株ＤＨ５で形質転換し、形質転換細胞をアンピシリン含有培地上で増殖させて選択した。得られたコロニー由来のプラスミドＤＮＡを合成ＤＮＡフラグメントの存在について制限地図により分析した。この時点で、ｐＵＣ１８／ｖ−ｓｉｓ構造は、突然変異ｖ−ｓｉｓ遺伝子を含んでおり、アミノ酸番号６、６、１０１及び１０７はヒトＰＤＧＦ形態に置換されており、その５′末端はセリン１の直前のＡＴＧコドンによる翻訳を開始するように改変されていた。Ｃ．アミノ酸１１４の変換及びアミノ酸１２０における停止コドンの位置決め次の段階では、アミノ酸１１４のコドンをＡＣＴからＧＧＴに変え、最終タンパク質産物中でグリシンをリシンに置換した。さらに、ＧＣＣがｖ−ｓｉｓのアラニンをコードするコドン番号１２０を、翻訳停止コドンであるＴＡＡで置換した。得られたこの構造のタンパク質産物は残基１１９のアルギニンで終っている。コドン番号１１２に位置するＳｍａＩ部位の後に合成ＤＮＡフラグメントを挿入することにより両置換を１段階で行った。上記で産生したｐＵＣ１８／ｖ−ｓｉｓ突然変異体ＤＮＡを、ｖ−ｓｉｓ配列中のヌクレオチド４３２４（Devareらのナンバリングシステム，前出）で切断するＳｍａＩ、及びｖ−ｓｉｓ挿入物のすぐ下流のｐＵＣ１８のポリリンカーで切断するＥｃｏＲＩで切断した。ｖ−ｓｉｓタンパク質及び３′−非翻訳配列をコードする、ＳｍａＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間の小フラグメント（５１０塩基対）を低融点アガロースゲル上の電気泳動により除去した。大フラグメント（約３５３０塩基対）を以下の配列：を有する合成ＤＮＡフラグメントに連結した。１１４位の新規なグリシン残基をコードするＧＧＴコドン及び１２０位に導入されたＴＡＡ停止コドンには上記で下線が付されている。この合成ＤＮＡフラグメントは、その上流（左）にＳｍａＩでｖ−ｓｉｓ突然変異体配列を切断して形成したブラント末端に連結するためのブラント末端、及びその下流（右）末端にＥｃｏＲＩでｐＵＣ１８ポリリンカーを切断して形成したＥｃｏＲＩ末端に連結するためのＥｃｏＲＩ「付着」端を含んでいる。連結されたＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉＫ１２株ＤＨ５で形質転換し、形質転換細胞をアンピシリン含有培地上で増殖させて選択した。得られたコロニー由来のプラスミドＤＮＡを合成ＤＮＡフラグメントの存在について制限地図により分析した。実施例２Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＤＧＦ−ＢＢ₁₁₉ホモダイマーの発現完全形の突然変異ｖ−ｓｉｓ遺伝子をｐＵＣ１８から取り出し、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＣＦＭ１１５６に連結した。プラスミドｐＣＦＭ１１５６ＰＬは公知のプラスミドｐＣＦＭ８３６から製造する。プラスミドｐＣＦＭ８３６の製造は米国特許第４，７１０，４７３号に記載されており、該特許明細書の関連部分、特に実施例１〜７は、本明細書に参考として組み込むものとする。ｐＣＦＭ１１５６及びｐＣＦＭ８３６を製造するためには、２つの内在性ＮｄｅＩ制限部位を切断し、露出した末端をＴ４ポリメラーゼで充填し、充填された末端をブラント末端連結する。次いで得られたプラスミドをＣｌａＩ及びＫｐｎＩで消化し、切り出したＤＮＡフラグメントを以下の配列：のＤＮＡオリゴヌクレオチドで置換する。ｐＣＦＭ１１５６ベクターは、上流のＸｂａＩ部位といくつかの下流制限部位のうちの一つとの間に外来遺伝子挿入用領域を含んでいる。この場合は、下流ＥｃｏＲＩ部位を用いた。上記で産生したｐＵＣ１８／ｖ−ｓｉｓ突然変異ＤＮＡをＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、３８３塩基対の小フラグメントを低融点アガロースゲル上の電気泳動により単離した。このフラグメントを、これもＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩで切断されたｐＣＦＭ１１５６ＤＮＡに連結した。連結されたＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ株ＦＭ−５（ＡＴＣＣ番号６８５４５）で形質転換し、形質転換細胞をカナマイシン含有培地上で増殖させて選択した。得られたコロニー由来のプラスミドＤＮＡを、挿入されたＤＮＡフラグメントの存在について制限地図により分析した。最終発現プラスミドは、メチオニンから始まり、次いでヒトＰＤＧＦ−Ｂ配列のアミノ酸１−１１９が続くタンパク質をコードする挿入ＤＮＡ配列を含んでいた。合成後には、原核Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞からＮ末端メチオニンが除去され、それによって産生した最終タンパク質はヒトＰＤＧＦ−Ｂのアミノ酸１−１１９に対応する。目的とする光学密度の培養物が得られるまで発現プラスミドを含む細菌細胞を２８〜３０℃で増殖させ、次いで培養物を４２℃で、その後数回増殖させることにより、１１９アミノ酸ＰＤＧＦ−Ｂタンパク質を発現させた。実施例３ＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーの精製及び復元先ず、ＰＤＧＦ−ＢＢ₁₁₉を含む実施例２のＥ．ｃｏｌｉ発酵培地由来の細胞を約３容量（湿潤重量／容量）の水に懸濁し、次いで９０００ｐｓｉのガウリン（Gaulin）ホモジナイザーに３回通過させた。追加の４容量の水を加え、次いでホモジナイズされた細胞を５０００×ｇで１時間４℃で遠心し、上清を廃棄した。得られた沈降物（ＰＤＧＦ−ＢＢ₁₁₉を含む抱合体）を、細胞ペレットの重量の２．５倍の６Ｍのグアニジン−ＨＣｌ中に懸濁した。β− メルカプトエタノールを加えて、濃度を約０．１４％（ｖ／ｖ）にし、懸濁液を周囲温度で３０分間混合した。この混合物を９容量の１１ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に加え、周囲温度で約２０時間混合を継続した。酢酸を加えてｐＨを約４に調整し、濾過して清澄化した。得られた濾液を水で２倍に希釈し、次いで、１０ｍＭのトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．７）で平衡にしたＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラム（Pharmacia Biotech，Piscataway，New Jersey）に充填した。充填したカラムを、（１）１０ｍＭのトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．７）、次いで（２）１０ｍＭのトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．７）、０．３ｍＭの塩化ナトリウム、さらに（３）１０ｍＭのトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５Ｍの塩化ナトリウムで洗浄した。ＰＤＧＦ−ＢＢ₁₁₉を含む最終洗浄液中のフラクションをプールし、２０％エタノール、１０ｍＭのトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．７）で平衡にしたＶｙｄａｃＣ４カラムに加えた。該カラムを１０容量の２０％エタノール、０．４ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．７）、次いで２５％のエタノール、０．３５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．７）で洗浄した。ＰＤＧＦを含む最終洗浄液中のフラクションをプールし、０．５％（ｖ／ｖ）の酢酸で酸性化し、次いでＡｍｉｃｏｎＹＭ（登録商標）１０限外濾過メンブラン（Amicon Inc.，Danvers，Massachusetts）を用い、約６容量の０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）で透析した。実施例４単層コラーゲンフィルムの製造実施例３由来の精製且つ復元されたＰＤＧＦ−ＢＢ₁₁₉を含む単層コラーゲンフィルムを国際特許公開ＷＯ／９２／２２３０４号に記載の手順に従って製造した。溶液流延法により可溶コラーゲン溶液からコラーゲンフィルムを形成した。可溶コラーゲンはSemax Co．（Frazer，Pennsilvania）から購入した。このコラーゲンはウシ由来のものであり、９９％のＩ型コラーゲンと１％のIII型コラーゲンとを含んでいる。該コラーゲンの分子量は３００Ｋダルトンであり、密度は０．００４ｇ／ｃｃである。該コラーゲンの抗原性は、テロペプチドが該コラーゲンから除去されているので最小である。先ず、可溶コラーゲンを０〜５％の酢酸溶液に１８〜７０℃で溶解して４％コラーゲン溶液を調製した。可塑剤のグリセロール（コラーゲンの乾燥重量の約２０％）を添加した後で、該溶液にエタノールを加え、溶剤蒸発工程を容易にした。アルコールの量は溶液の量の約２０％であった。次いで溶液を遠心して、溶解していない物質を除去した。実施例３由来の精製且つ復元されたＰＤＧＦ−ＢＢ₁₁₉を含む溶液を４％可溶コラーゲン溶液に加えた。得られたＰＤＧＦ−ＢＢ₁₁₉を含むコラーゲン溶液をＴｅｆｌｏｎ（登録商標）表面上に流延し、フィルムの重量が一定になるまで（約１〜３日間）室温で乾燥させて、ＰＤＧＦ−ＢＢ₁₁₉ホモダイマー３６０μｇを含むコラーゲンフィルムを形成した。同じようにして追加量の４％コラーゲン溶液を調製したが、次の実験用の陰性対照として用いるためにＰＤＧＦを添加せずに調製した。実施例５ＰＤＧＦによる副行循環の誘発 McKeeら，Plast．Reconstr．Surg.，67，200-204（1981）及びTsurら，Plast Reconstr．Surg.，66，85-93（1980）の虚血誘発血管形成のラット皮弁モデルは一般的に、壊死の危険がある虚血組織における副行循環を改善するＰＤＧＦの能力を示すために行われるが、但し、ラット上に形成された腹側皮弁への上腹部血管は初期には無傷に保たれており、ＰＤＧＦの予防的適用後にも皮弁に対する直接循環が継続して得られる。皮弁への直接循環は後に第２の処置における上腹部血管の結紮により弱められる。第２の処置の間に血液供給を閉鎖する前に、実施例４由来のコラーゲンウエファーを用いて外科的に形成された皮弁にＰＤＧＦを予防的に投与した。７０匹の雄フィッシャー（Fisher）ラットを腹膜内にペントバルビトール（１２〜２１ｍｇ）を投与して麻酔し、追加用量を用いて維持した。左鼡径部及び腹部を剃って脱毛し、当該技術において公知の標準法を用いて動物をボードの上に乗せた。鋳型を用い、上腹部軸面皮弁を、その基底縁を鼡径部上に内側縁を正中線にして、３×６ｃｍの大きさでマークした。同じ手順を右鼡径部と腹部で繰り返して、各ラット上で腹部皮弁を形成した。次いで皮弁を鋭角に剥離して腹部表面の両側で皮弁を持ち上げ、皮弁と腹部の間の血管全てを分断した。この時点では、Petry及びWortham，Plast．Reconst r．Surg.，74，410-413（1984）によって記載されているように、皮弁はまだ無傷に保たれている上腹部脈管から直接循環により潅流されていた。実施例４由来の２×５ｃｍのＰＤＧＦ−ＢＢ₁₁₉含有コラーゲンウエファーを各ラットの一方の皮弁の下に挿入し、陰性対照のコラーゲンウエファーを他方の皮弁の下に挿入した。コラーゲンウエファーを挿入した後で、両方の皮弁を注意深く絹糸縫合して所定位置に縫合し戻した。この処置により、上腹部血管からの直接血液流が閉鎖される前に投与されたＰＤＧＦによる予防作用が可能であった。ＰＤＧＦの予防的投与の後、種々の時点において皮弁への直接循環を弱めるように考案された第２の処置を第１の処置の１、２、３、４、５、７又は１０日後に行った。ラットの鼡径部の上腹部血管肉茎に通常の麻酔をして、鼡径部の両側を露出し、次いで絹糸結紮して、皮弁への直接循環を完全に途絶させた。ナトリウムフルオレセインを注射し、２０分後に、Grahamら，Plast．Reconstr．Surg. ，71，726-831（1983）の手順に従って皮膚蛍光定量指数（ＤＦＩ）を測定した。標準的な面積測定分析法を用いて、３日後に生存している皮膚領域を評価した。次いで大動脈にカニューレ挿入し、ヘパリン処理した温塩水２０ｍｌを脈管構造に通し、その後で、Rees及びTaylor，Plast ．Reconstr．Surg.，77，141-145（1986）に記載のようにして、酸化鉛、塩水及びゼラチンの混合物を注射した。皮弁領域を切除し、一晩冷蔵してから放射線写真を撮影した。３日グループのラットの試料は、ＰＤＧＦ処理皮弁の組織生存率が増大したことを示した。図２に示されている３日グループから採取した試料の典型的血管造影図は、ＰＤＧＦ処理皮弁を潅流する早期小血管が著しく増加したことを表している。４日グループでは、ＰＤＧＦ処理皮弁の殆どが完全な生存を達成するに十分な腹部からの新規な循環を発生させた。小血管の増加のみを示した３日グループのラットから採取した皮弁とは異なり、４日グループのラットから採取したＰＤＧＦ処理皮弁の微小血管造影図は、対照面と比べて腹部から皮弁への大血管の連結を表していた。４日グループの血管造影図を図３に示す。この造影図は、ＰＤＧＦ処理皮弁上に多数の成熟機能性新規血管が存在することを示しており、且つ以前には分断されていた血管の末端が皮弁の縁にわたって再連結されているのが認められる。５日グループでは、対照皮弁はいまだ有意な壊死を有しており、これは、潅流が不適切であったことを示しており、一方ＰＤＧＦ処理皮弁は完全な生存を示した。図４に示されている７日グループの典型造影図は、ＰＤＧＦ処理皮弁において、さらに多くの新規な血管の形成及び縁から血管への連結を示している。この実験の結果を図５及び図６に示すグラフに要約する。図５のグラフは、正常な皮膚潅流に対するＰＤＧＦ誘発副行循環による皮弁組織の潅流を示している。ＰＤＧＦ処理皮弁は、５日目までに対照の潅流量のほぼ２倍を発生させた。１０日目では、ＰＤＧＦを用いた皮弁組織の予防的処理により、組織が正常な血液流を超える血液流（１１５％）を得たのに反し、非処理対照側は正常な血液流の８４．５％に過ぎなかった。図６の皮弁生存グラフは、４日目に、ＰＤＧＦ処理により皮弁の８５％の生存が可能になったが、対照皮弁は生存が４９％に過ぎなかったことを示している。実施例６ＰＤＧＦを用いた新生血管３０匹の隔離された（retired）ルイスラットの２つの脈管末端間に単一の大口径脈管の再生を誘発するＰＤＧＦ −ＢＢの能力を調べるために、表在大腿動脈のセグメントを焼灼し、切除して、３〜４ｍｍのギャップを形成した。実施例３由来のＰＤＧＦ−ＢＢ又はＰＤＧＦ −ＢＢの失活突然変異細胞２００μｌを２つに分断された血管の末端間の組織に注射し、各動物を動物自身の対照として用いた。２週間目及び３週間目に、乳液ラテックスの注射、直接観察、ミクロアンギオグラフィー（Rees及びTaylor，Pl ast．Reconstr．Surg.，77，141-145（1986））、腐食円柱及び連続組織学的切開法により、血管連続性の復元を評価した。２週間後、ＰＤＧＦ−ＢＢ処理グループでは、血管の３３％（１２匹中４匹）が再確立された連続性を有していたが、対照グループでは血管は全く再生されなかった（ｐ＜０．０５）。図７Ａに示されているように、３週間後、ＰＤＧＦ−ＢＢグループの動脈は１００％（１８中１８）再生され、開放性血管が再確立されていたが、対照グループでは血管は全く再連結されていなかった（ｐ＜０．０００１）。組織学的評価を行ったところ、再生された動脈は、完全な内皮層が平滑筋組織で取り囲まれているのが認められた。血管の直径は、初期の大腿動脈のサイズに等しく、これは、機能的血管の再生応答を示している。図７Ｂに示されているように、新規動脈のセグメントが、切断された血管の血栓症罹患末端近くの枝管として「芽生え」ているように見え、外科的静脈組織片バイパスに類似した形でギャップをブリッジしていた。実施例７ＰＤＧＦを用いた心臓の血行再開この実施例は、外科的吻合又は心肺バイパスに頼ることなく、ＰＤＧＦ−ＢＢの脈管由来の作用と心臓外血管の心筋層への移植とを併せて行った、拍動する心臓上での心臓の血行再開を示すものである。ケタミン（１５ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内注射して、ニュージーランド産白ウサギ（３．５〜４ｋｇ）を麻酔した。ウサギに経口挿管し、１００％酸素を用いて機械的に換気した。各外科的処置の間を通して前胸部の心電図（ＥＣＧ）を記録した。実験全体にわたり、NIHの「Guide for the Care and Use of Laboratory Animals」（NIH Publication No．86-23，1985年再版）に従った。滅菌外科手術条件下に、上腹部／内部乳房血管を上腹部及び下胸部壁から自由に両側で解剖した。左開胸を切開して血管束を胸窩内に導入した。左前下行冠状動脈（ＬＡＤ）の中間部に近接した左心室心筋層を通るトンネルを形成した。該トンネルを介して、結紮した血管末端が心筋層の表面に近接するようにして血管束を入れた（図８）。０．５ｍｌ量の溶液を、移植した血管を取り囲む心筋層組織内に注射した。該溶液は、１ｍｇ／ｍｌ濃度の実施例３の組換えＰＤＧＦ−ＢＢを含む（処理）か又は含まない（処理した対照）リン酸緩衝塩水を含んでおり、ブラインドベース及びランダムベースで投与した。開胸を閉じる前に、４−０結紮糸を、移植した血管に近接するＬＡＤの周りに、結び目を作らずに通した。第２の手術の際に容易に引き寄せられるように、結ばれていない端部を胸壁の皮下組織中に埋めた。胸膜スペース中の残留空気の排気に用いる小型胸管の上の層で胸部を閉じ合わせた。最初の手術後２週間して、ウサギを再麻酔し、結ばれていない結紮糸の端部を引き寄せた。直接結紮してＬＡＤを閉じ合わせた。それぞれ１４匹の２つのグループ（処理グループ及び処理した対照グループ）からなる合計２８匹のウサギを用いた。追加の８匹のウサギに血管移植又は心筋層注射をせずにＬＡＤの結紮を行い、非処理対照グループとして用いた。ＬＡＤを結紮してから４日後に、生存している動物の移植血管を介して造影剤を注射して微小血管造影を行った。視覚化するために手術用顕微鏡を用いて、両方の内乳動脈に、３０ゲージのカテーテルを挿入した。血管にヘパリン処理した塩水を通した後、酸化鉛／ゼラチン放射線不透過性溶液２０ｍｌを注射した。心臓及び移植血管を胸部から取り出し、４℃で一晩放置し、１２ｍＡ、２５ｋＶで０．２０秒間の定常（stationary）乳房撮影法を用いてＸ線撮影し、解像力を最大にした（Rees及びTaylor，Plast．Reconstr．Surg.，77，141-145（1986））。トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）を用いる組織化学的染色法を用いて、梗塞領域を同定した（Lieら，J．Thorac．Cardiovasc，Surg.，69，599 -605（1975））。左心室を横に切断して３ｍｍ厚さのスライスを作成し、コンピューター化面積計算法及び三次元復元により梗塞の程度（非染色組織）を測定した。次いでスライスを緩衝ホルマリン中で液浸定着させた後で、ヘマトキシリン及びエオシン染色を用いる組織学的分析用に処理した。２グループ間の生存動物の比率をフィッシャー完全試験（Fisher exact test）で比較した。スチューデントｔ−試験により生存動物の梗塞域の平均量をグループ間で比較した。非処理対照動物のうち僅か５０％（８匹中４匹）だけがＬＡＤをきつく結紮しても生き延びた。ＥＣＧにより、重症の心筋層損傷を示す大きなＳＴセグメントの上昇が明らかにされた。ＰＤＧＦ−ＢＢ処理をせずに心臓外血管を移植したもの（処理対照グループ）では生存率は変わらず、処理対照グループの５７％（１４匹中８匹）が生存した。処理対照動物のＥＣＧは、非処理対照動物と同様であったが、８匹の処理対照動物中４匹が生存し、ＳＴの上昇は１０〜１５分以内に基線に戻った。移植した血管の周りをＰＤＧＦ−ＢＢ処理したもの（処理グループ）では、生存率は９３％（１４匹中１３匹；ｐ＜０．０５）まで著しく改善された。処理グループ中の全生存動物では、１０〜１５分以内にＳＴセグメントの上昇が基線に戻ることが示された。非処理対照動物全てに心筋梗塞が見られたが、処理対照グループ（ＰＤＧＦで処理せずに血管移植したグループ）の８匹の生存動物中４匹には梗塞が見られなかった（ｐ＜０．５）。対比的に、図９の棒グラフに見られるように、ＰＤＧＦ−ＢＢ処理した生存動物１３匹中１１匹には梗塞が見られなかった（ｐ＜０．０１、対照グループに対して）。図１０の棒グラフに見られるように、非処理心臓及びビヒクルを注射した心臓のどちらと比較してもＰＤＧＦ−ＢＢを注射した心臓では梗塞の平均域（左心室全体の百分率として）が著しく小さかった。各グループのウサギ由来の左心室の代表的な病理学的断面図が図１１に示されており、該図において、非染色（白）領域は梗塞領域を表している。図１２Ａに示されているように、処理対照グループの移植血管を介した微小血管造影図は、心臓表面への開放血管を示しているが、冠状動脈の血行（矢印で示されている心臓外血管肉茎）は充填されていない。対比的に、図１２Ｂに示されているように、ＰＤＧＦ−ＢＢを注射した心臓（処理グループ）についてのＬＡＤ分布領域において冠状脈管構造が高度に充填されていた。組織学的分析により、移植血管とＬＡＤとの間の連絡が確認された。配列リスト（1）一般情報（i）出願人：ワシントン大学（ii）発明の名称：復行循環の改善への血小板由来成長因子の使用（iii）配列数：５（iv）連絡用住所：（A）宛て名人：Amgen Inc．（B）番地：1840 Dehavilland Dr．（C）市：Thousand Oaks （D）州：California （E）国：USA （F）郵便番号：91320-1789 （v）コンピューター解読形態：（A）メディアタイプ：ディスケット、3.5インチ、 DS，1.4MB （B）コンピューター：Apple，Macintosh （C）操作システム：Macintosh OS 7.0 （D）ソフトウエア：Microsoft Word Version 5.0 （vi）最近の出願データ：（A）出願番号：08/055,062 （B）出願日：29-APR-1993 （C）分類：不明（2）配列番号１についての情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：34塩基（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：他の核酸（ix）配列の記載：配列番号１：（3）配列番号２についての情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：98塩基（上部鎖）（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：他の核酸（ix）配列の記載：配列番号２：（4）配列番号３についての情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：30塩基（下部鎖）（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：他の核酸（ix）配列の記載：配列番号３：（5）配列番号４についての情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：55塩基（上部鎖）（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：他の核酸（ix）配列の記載：配列番号４：（6）配列番号５についての情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：386塩基（上部鎖）（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の種類：他の核酸（ix）配列の記載：配列番号５：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．直接循環の低下したヒトまたは動物被検者の組織への副行循環を、前記ヒトまたは動物被検者にＰＤＧＦ群に属する成長因子を治療有効量で投与することにより改善する方法。２．ＰＤＧＦ群に属する成長因子が血小板由来の成長因子であることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．直接循環の低下した組織が心臓組織であることを特徴とする請求項２に記載の方法。４．直接循環の低下した組織が脳組織であることを特徴とする請求項２に記載の方法。５．直接循環の低下した組織が四肢に局在する組織であることを特徴とする請求項２に記載の方法。６．四肢が下肢であることを特徴とする請求項５に記載の方法。７．直接循環の低下した組織が再建外科的処置で移植した組織であることを特徴とする請求項２に記載の方法。８．治療有効量のＰＤＧＦを所与の期間にわたって投与することを特徴とする請求項２に記載の方法。９．ＰＤＧＦを徐放性賦形剤を介して投与することを特徴とする請求項８に記載の方法。１０．徐放性賦形剤がコラーゲン賦形剤であることを特徴とする請求項９に記載の方法。１１．治療有効量のＰＤＧＦをただ１回の適用で投与することを特徴とする請求項２に記載の方法。１２．ヒトまたは動物被検者において分離血管を吻合させる方法であって、ヒトまたは動物被検者の前記血管の分離端部にかまたは該端部の周囲にＰＤＧＦ群に属する成長因子を治療有効量で投与することを含む方法。１３．ＰＤＧＦ群に属する成長因子が血小板由来の成長因子であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。１４．ＰＤＧＦを前記血管の前記分離端部に直接投与することを特徴とする請求項１３に記載の方法。１５．ＰＤＧＦを内視鏡を用いて投与することを特徴とする請求項１４に記載の方法。１６．バイパスを移植する方法であって、分離血管の結紮端部を虚血症の危険の有る器官の組織に付着させ、血管付着区域にかまたは該区域の周囲にＰＤＧＦ群に属する成長因子を適用することを含む方法。１７．ＰＤＧＦ群に属する成長因子が血小板由来の成長因子であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。１８．器官が心臓であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。１９．ＰＤＧＦ群に属する成長因子が血小板由来の成長因子であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。２０．分離血管が内乳動脈であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。２１．ＰＤＧＦを内視鏡を用いて適用することを特徴とする請求項１９に記載の方法。